CA1327968C - Heparines de bas poids moleculaire, a structure reguliere leur preparation et leurs applications biologiques - Google Patents
Heparines de bas poids moleculaire, a structure reguliere leur preparation et leurs applications biologiquesInfo
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- CA1327968C CA1327968C CA000564296A CA564296A CA1327968C CA 1327968 C CA1327968 C CA 1327968C CA 000564296 A CA000564296 A CA 000564296A CA 564296 A CA564296 A CA 564296A CA 1327968 C CA1327968 C CA 1327968C
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Abstract
HEPARINES DE BAS POIDS MOLECULAIRE, A STRUCTURE REGULIERE LEUR PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES Les compositions de l'invention sont formées de fragments d'héparine renfermant essentiellement des enchaînements disaccharidiques correspondant aux régions régulières de l'héparine et possèdant un PM de 4800 à 9000. Ces compositions sont utilisables pour la régulation des systèmes physiologiques.
Description
~6~279~
HEPARINES DE BAS POIDS MOLECULAIRE A STRUCTURE REGULIERE
LEUR PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES
___________________________ __________________________ L'invention a pour objet des héparines de bas PM à structure régulière, leur procédé de préparation et leurs appllcations biologiques.
Elle vise plus spécialement des héparines de bas PM présentant une activ.ité dans le domaine de la régulation de certains systèmes physiologiques tout en étant pratiquement totalement dépourvues de l'activité
anticoagulante s'exerçant via l'antithrombine III
(ATIII).
Il est connu que l'héparine possède une activi-té anticoagulante s'exerc,ant principalement via l'anti-thrombine III (ATIII).
Les travaux ef-fectués sur les relations struc-ture/activité de l'héparine ont montré que ce type d'ac-tivité anticoagulante se trouve tout particulièrement correlée aux régions dites irrégulières de l'héparine, plus spécialement la région correspondant au pent-asaccharide de structure DEFGH, décrit dans la demande FR
HEPARINES DE BAS POIDS MOLECULAIRE A STRUCTURE REGULIERE
LEUR PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES
___________________________ __________________________ L'invention a pour objet des héparines de bas PM à structure régulière, leur procédé de préparation et leurs appllcations biologiques.
Elle vise plus spécialement des héparines de bas PM présentant une activ.ité dans le domaine de la régulation de certains systèmes physiologiques tout en étant pratiquement totalement dépourvues de l'activité
anticoagulante s'exerçant via l'antithrombine III
(ATIII).
Il est connu que l'héparine possède une activi-té anticoagulante s'exerc,ant principalement via l'anti-thrombine III (ATIII).
Les travaux ef-fectués sur les relations struc-ture/activité de l'héparine ont montré que ce type d'ac-tivité anticoagulante se trouve tout particulièrement correlée aux régions dites irrégulières de l'héparine, plus spécialement la région correspondant au pent-asaccharide de structure DEFGH, décrit dans la demande FR
2.535.324, de formule :
r~~ eor r ~ ~~~ ~ ~
D ~ ~ C
lL 3 2 ~ 9 6 ~
On sait également que certaines activités de l'héparine ou de fragments d'héparine peuvent être maintenues jusqu'à un certain degré en l'absence du site de liaison à l'AT III ou lorsque celui-ci est modifié, les structures responsables de telles activités n'étant cependant pas connues.
Ainsi Folkman et al (Science Yol. 221 - 1983 -p. 719-725) ont rapporté une action inhibitrice de l'angiogénèse pour des mélanges d'hexasaccharides dépourvus d'activité anticoagulante, utilisés en association avec des corticoides.
Rarnowsky et al ont effectué des expériences sur des héparines O-désulfatées et ~-désulfatées et ont montré qu'elles possèdaient toujours dans une certaine proportion, mais à un moindre degré, les activités inhibitrices de l'héparine standard sur la prolifération des cellules musculaires lisses.
: .:
En outre, une activité anti-complément de l'héparine, independante de l'activité anticoagulante, a été mise en évidence.
D'autres travaux 0l1t montré que l'activité
anticoagulante de l'héparine pouvait être modifiée en effectuant des coupures au niveau des carbones C2-C3 des acides uroniques non sulfatés à l'aide de periodate de sodium.
Ainsi,Fransson et Lewis ont décrit, dans Febs.
Letters, vol. 97, n- 1, p. 119 - 123, 1979, des condi-tions opératoires consistant à soumettre l'héparine à
l'action du periodate, soit à pH 3, à 4' C, soit à pH 7, à 37' C. Les chaînes d'héparine obtenues sont oxydées sélectivement au niveau des acides D-glucuronique dans le premier cas, alors qu'une oxydation au niveau de tous les motifs acides uroniques non sulfatés est obtenue avec le deuxième type de conditions.
Les chaines résultantes sont réduites par NaBH4 ;~
-:
., .. - . . . .
': ; :
~ 3279~
.......
ou fragmentées selon un processus de ~ élimination en milieu alcalin.
Les auteurs concluent que l'oxydation et le clivage des motifs acide D-glucuronique se traduisent par une légère diminution de poids moléculaire mais une rétention de l'activité anticoagulante.
Au contraire, la coupure à pH 7 et à 37- C des acides D-glucuroni~ue et L-iduronique non sulfatés entraîne la suppression de l'activité anticoagulante et une plus forte fragmentation de la molécule.
Dans un article paru dans Carbohydrate Research 36, p. 339-34a, 1974, Fransson a rapporté l'oxydation periodique des motifs uroniques dans le der~atane sulfate à divers pH, à 4~ C ou 37' C.
L'auteur indique qu'en procédant à pH 5, les coupures au niveau des acides glucuroniques ne se font que dans une proportion inférieure à 5~~0 et qu'en procédant à pH 3, ces coupures ne se font pas du tout.
Ces résultats apparaissent donc contraires à ceux obtenus avec l'héparine pour laquelle à pH 3, les coupures se font préférentiellement au niveau des acides D-glucu- ~
roniques.
L'action du periodate a également été rapportée par Casu et al. dans Arzneim. Forsch./Drug Res. 36 (1) n-4, p. 637-642, 1986.
Selon cet article, différentes préparations d'héparine sont soumises à une oxydation periodique (pH
5,3 à 4-C durant 24 h.) coupant entre les carbones en positions 2 et 3 de tous les acides uroniques non sulfatés. A titre de référence, une préparation est soumise à une étape ultérieure d'hydrolyse acide partielle et les fragments obtenus sont dialysés.
Cette étape d'hydrolyse acide partielle conduit à une fragmentation importante des chaînes et à une ' destruction au moins p~rtielle de groupes fonctionnels, ~3~'79~8 comme l'indique Fransson dans Carbohydr. Res. 80, 131-145 (1980).
De plus, selon cette méthode, on obtient obli-gatoirement un mélange de chaines de PM variés dans un intervalle large, en particulier de nombreux di, tetra et hexasaccharides.
Or, les lnventeurs ont mis en évidence que pour l'obtention de compositions pharmaceutiques stables, utilisables en thérapeutique pour la régulation de certains systèmes physiologiques, les caractéristiques suivantes, en combinaison, sont essentielles :
longueur des fragments; taux de charge; absence du site de liaison à l'ATIII, afin d'éviter les effets indésirables liés à une activité
anticoagulante.
L'étude des processus de coupure à l'aide d'acide periodique et des moyens de fragmentation les ont conduits à constater qu'en réalisant l'oxydation perio-dique dans des conditions opératoires spécifi~ues, mais également en mettant en oeuvre une combinaison d'étapes particulières, il est possible d'obtenir une composition de fragments d'héparine de bas ~M, mals dans un ; .,, . :, ~
intervalle favorable, dépourvus du site de liaison à
l'ATIII et ce, tout en conservant au moins la majeure partie de leurs groupes fonctionnels.
L'invention a donc pour but de fournir des compositions d'héparine qui, aux doses actives, soient dotées de propriétés pharmacologiques de grand interet, sensiblement équivalentes à celles de l'héparine,sans présenter les inconvénients d'être dotées de propriétés anticoagulantes.
Elle vise également à fournir un procédé de fragmentation de l'héparine permettant d'obtenir des fragments de PM donné, dépourvus cependant du site de liaison à l'ATIII et dont le taux de charge correspond sensiblement à celui des séquences correspondantes dans ' . ":
1327~68 1 :
les chaines d'héparine naturelle. :
L'invention vise également les applications de ces compositions pour l'élaboration de médicaments actifs - :
notamment sur la régulation de certains systèmes physiologiques.
Les compositions de l'invention sont carac-térisées par le fait qu'elles sont essentiellement formées de fragments dépourvus d'enchaînements disaccharidiques du type acide uronique non sulfaté-glucosamine N-sulfate, ces fragments répondant à
la formule générale I suivante :
R-(X-Y)n-R' (I) :
dans laquelle - X représente soit un motif acide iduronique sulfaté de formule I r o ~ COO~
~0 ~
soit, à raison de 1 motif pour 2 chaines au moins, un :
motif acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique) non sulfaté ouvert entre les carbones en positions 2 et 3, de formule III :
', 1 .
00~ ~ ':
~ . .
~0 ,.
(111) , ' ' ,' ~J\
CH20;H C~120H
' :
: . . : . . :, .
~L327~8 - Y représente un motif D-glucosamine de formule IV : .
ro~3 r~ (Iv) ~0 ~ i~
. R1 étant un atome d'hydrogène ou un groupe -SO3 .
R2, un groupe -5O3 ou -CO-CH3, la proportion des groupes -SO3 étant d'environ au moins 9O~~OI et . R3, étant un groupe -SO3 ou un atome d'hydrogène, la proportion des groupes -SO3 étant d'environ au moins ~ ;~
70~, ~ R représente un atome d'hydrogène ou un motif :
r OR3 ;
ro~ '",:~:
R~O ~ ~ :
2 ~ ;
. R1 à R3 étant tels que définis ci-dessus, et . R4 représentant un atome d'hydrogène ou un résidu 25 d'acide uronique, ~ ~ :
- R' représente soit un atome d'hydrogène, soit un motif -:~
acide uronique ~aturel,soit un résidu d'acide uronique -~
modifié au cours de l'oxydation periodique et dont les : '~
fonctions aldéhydes ont été réduites en alcools, avec 30 7 ~ n ~ 15, pour les espèces majoritaires, ce qui corres- . :
pond a des chaînes de PM de 4800 à 9Q00 environ, et ses ~-sels pharmaceutiquement acceptables~
On notera que les motifs X ouverts sont des motifs qui, au cours de l'étape de bêta-élimination en pH
, . .
.. . ::
~32~68 alcalin, sont rest~s intégrés dans l'enchainement glycosamino-glycanique. Il s'agit soit d'un acide D-glucuronique non sulfaté, soit d'acide L-iduronique non sulfaté, dont les liaisons entre les carbones en positions 2 et 3 ont été coupées.
Les compositions de l'invention telles que caractérisées en HPLC déterminée avec une colonne TSK
2000~SW couplée à un détecteur photométrique à 205 nm, en utilisant Na2S04 0,5M comme solvan~, avec un débit de 1 10 mltmin~ présentent :
- un poids moléculaire moyen de l'ordre de 6000-7000 Da, plus précisément de 5800 à 7000 Da, notamment de l'ordre de 6000 Da, 70~~ des espèces étant compris entre 4aoo et 9000 daltons et 90~~0 entre 3600 et 11000 Da, - un poids moléculaire au sommet du pic de l'ordre de 6000 à 6500 Da, plus précisément de 5500 à 6500 na, notamment de l'ordre de 5500 à 6000 Da, - moins de 5~-0 de chaines inférieures à des dodécasac-charides, ~ moins de 53 de chaînes au-delà de 11.000.
Selon un autre aspect, le5 compositions d'heparine de l'invention sont telles qu'obtenues par fractionnement, à l'aide d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'un mélange résultant de la dépolymérisation de I'héparine par action d'une base ~orte sur des chaines d'héparine soumises au pxéalable à l'action de periodate, la dépolymérisation ~tant suivie d'une réduction des groupements aldehyde formés lors de l'oxydation periodique.
D'une manière avantageuse,les compositions de l'invention présentent un rapport des taux de groupes sulfate S03 et de groupes carboxyle C00 par mole compris entre 2,2 et 2,8. Ce rapport est notamment de 2,4. Ce taux élevé par rapport aux valeurs moyennes des chaînes d'héparine xésulte dela structure des chaines ~'.~
. 1 ': . . :
. : . - .. , . . ~ ~ . .
13279~8 d'h~parines de bas poid~ mol~culaire selon l'invention, qui sont constituee~ pour l'essentiel d'unités disac-charidiques trisulfat~es. Ces hepa~ines de bas PM sont dites ~ structure re~uli~re compte tenu de la pr~sence de ces unit~s disaccharidiques et en r~f ~rence ~ la litterature sclentifique (PERLIN A.S., CASU, B.
SANDERSON, GR. ~220 MHz ~pectra of heparin, chondroitins and other ~ucopolysaccharide~. Can. J. Chem. 1970;
48:2260-8).
L'invention vise ~gale~ent les sels de ces ~;
compositions, en particulier les sels de sodium, . ~;
potassium, cal~iu~ et ~agnésiu~ ainsi que le~ els de cations organiques physiologi~ue~ent acceptables. ~ :
L'invention a ~gale~ent pour objet un procéde de pr~paration de composition~ d~ fra~m~nts d' h~par.ine tels ~ue définis ci-dessus, COMprenant l'oxydation m~nag~e de l'heparine ~ l'aide de p~riodat~
Le procédé de la pr2sente invention e3t caractérisé en ce que : -a) on traite une solution aqueuse d ' h~parine ~ une con-cen~ration finale de 0,5 à 5~ ~p~v) avec de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 ~ 4~ (plv), ~ un pH de 4,5 ~ 6,5, ~ une temp~rature de O ~ 10- C; ~
b) on traite le~ chaInes d'h~parine ainsi obtenue~ ave~ .' une base ~orte, selon une ~uantit~ conduisant ~ une molarit~ finale en base de O,l ~ 0,3 N environ, ~ un pH
sup~rieur ~ ll environ;
c) on traite 18s fragments de d~polym~risation ainsi obte~u~ avec un agent r~ducteur;
~) après ~ ination ~ventuelle de l'a~ent r~ducteur en exc~, on pr~cipite le~ fragments r~duit~, apr~s addition d'un sel min~ral, ~ l'aide d'un solvant alcoolique;
e) on traite une solution aqueuse du précipit~ ainsi ob-tenu additionne d'un sel ~ineral par de l'alcool pour iner les fragments de tr~ bas poids mol~culaire;
f~ on recupère le produit pr~cipit~ ainsi form~ et on transforme, ~ventuellement, le sel correspondant à la ~ 3~79~
base forte utilisée, en un autre sel pharmaceutiquement acceptable.
On notera que l'étape e correspond à un fractionnement afin d'éliminer certains chaines et non à
une précipitation globale.
Plus particulièrement, ce procéde comprend en comblnaison les étapes suivantes :
- l'oxydation ménagée de l'héparine réalisée en faisant réagir de l'héparine, en solution aqueuse à une concen-tration finale de 0,5 à 5~~0 (p/v) avec un sel de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 a 4~~0 (p/v), à un pH situé entre 4,5 et 6,5, de préférence à un pH de 5, à une température de O à 10'C, durant environ 15 à 48 h, à l'abri de la lumière, - la dépolymérisation des chaines d'héparine obtenues, par addition d'une base forte telle que la soude, à un pH
supérieur à 11 environ, notamment compris entre 11 et 12, avantageusmeent de 11,2 à 11,6 de préférence aux environs de 11,5;
- la réduction des fragments de dépolymérisation à l'aide d'un agent réducteur et, après élimination, le cas échéant, de l'agent réducteur n'ayant pas réagi, - la récupération des fra~ments d'héparine réduits, par précipitation à l'aide d'un solvant dans lequel ils sont insolubles, - l'isolement des fragments recherchés par fractionnement à l'aide d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'une solution aqueuse obtenue en remettant en solution dans lleau le précipité précédemment isolé et en récupérant le précipité formé.
La réalisation de la dépolymérisation suivant un processus particulier, combinée à l'utilisation dans le procédé de l'invention, d'une étape de fractionnement, permet d'isoler une composition de fragments répondant à
' ~327~
' .
~o ~ .
un profil thérapeutique particulier et possédant notam-ment un indice thérapeutique satisfaisant.
Dans l'étape d'oxydation periodique, on utilise de préférence, l'héparine et le sel de l'acide periodique selon des quantités conduisant à des concentrations fina-les respectives de 1,5 à 5~0 et de 1,5 ~~O à 2,5 ~0 (p/v).
Le sel de l'acide periodique est constitué
avantageusement par du métaperiodate de sodium.
Pour éliminer le periodate résiduel, on -effectue une dialyse avec des boyaux de dialyse ayant une porosité de 3 à 4000 Da, pendant environ 15 h. ~
On peut également procéder par chromatographie -sur résine échangeuse d'anions par exemple sur une résine ~ -telle que celle commercialisée sous la marque Amberlite IRA~ 400, cette résine étant utilisée en quantité
suffisante pour retenir le periodate résiduel et les dérivés du periodate formés au cours de la réaction, soit 1/6 à 1l8 du volume réactionnel par exemple. Cette procédure plus rapide que la dialyse, de grande reproductibilité~ permet de procéder à la bêta-élimination à partir de conditions facilement standardisées. ~' Selon un mode préferé de réalisation de l'in-vention, on met l'héparine en solution dans de l'eau, plus spécialement de l'eau déminéralisée, à 4~ C, à une concentration d'environ 5~ (p/v), on ajoute un sel d'acide periodique tel que du métaperiodate de sodium de manière à obtenir une concentration finale d'environ 2~~
(p/~). Le pH de la solution est immédiatement ajusté à 5 à l'aide d'acide chlorhydrique dilué ou de soude diluée.
La solution est abandonnée à l'obscurité, à + .
4' C, de préférence 24 heures.
Afin d'éliminer le periodate résiduel, on effectue une dialyse avec des boyaux de dialyse ayant une ~.7P
., . . . , . ~ - . , .
~'' 132796~
porosité de 3 à 4000 Da, pendant environ 15 heures, contre de l'eau déminéralisee courante.
Les chaines d'héparine obtenues sont soumises à
une étape de dépolymérisation en milieu basique.
A cet effet, on ajoute une base forte, plus spécialement une lessive concentrée de soude, de manière à obtenir une molarité finale en base de 0,2 N.
La solution basique obtenue est soumise à
agitation 2 heures à température ambiante.
On soumet alors les fragments de dépolymé-risation de l'héparine à une étape de réduction afin de transformer les groupes aldéhyde résultant de la coupure de la liaison entre les carbones C2 et C3 des motifs uro~
niques. - ~, On utilise un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium, à raison de 50 mg par gramme d'héparine engagée, et on maintient l'agitation 6 heures à température ambiante.
L'agent réducteur n'ayant pas réagi est détruit par abaissement du pH à 4 à l'aide d'acide, par exemple de l'acide chlorhydrique, avantageusement sous agitation vigoureuse, pendant environ 15 minutes.
Les fragments d'héparine réduits sont récupérés par précipitation.
Avantageusement, on ajuste le pH à 7 à l'aide d'une base, notamment de la soude concentrée, puis on ajoute 20 y/litre de sel minéral et on effectue une précipitation à l'aide de 1,5 volume d'alcool.
Le sel minéral utilisé est avantageusement constitué par du chlorure de sodium. Pour la précipi-tation alcoolique, on a recours de préférence à de l'éthanol.
Le précipité formé est récupéré par centrifu-gation, lavé avec un solvant dans lequel il est ~327~6~
insoluble, tel que l'éthanol, et séché à 40' C, sous '~
vide -Pour isoler de ce précipité les fragments de l'invention, on a recours à une étape de fractionnement. ~ -On réalise avantageusement un fractionnement alcoolique en procédant comme suit Le précipité de fragments d'héparine est remis ~ ~
en solution dans de l'eau, plus spécialement de l'eau ~ :
déminéralisée, à température ambiante à savoir de l'ordre de 18 à 20' C, de manière à obtenir une concentration de , :: ~
5~~0 (p/v).
On ajoute un sel minéral, tel que le chlorure de sodium, en quantité suffisante pour avoir une concentration finale de 1~. Le pH de la solution est ajusté à 3,5 par de l'acide, par exemple de l'acide chlo~
rhydrique dilué. ; ~' On ajoute alors sous agitation modérée 0,85 volume d'un solvant dans lequel les fragments recherchés sont insolubles, tel que l'éthanol.
L'ensemble est laissé au repos environ 10 heures à 18-20- C.
Le précipité est recueilli par centrifugation, ~;
lavé avec un solvant tel que l'éthanol et séché sous vide à 40- C pendant 24 heures.
Ce précipité peut éventuellement être soumis à
une étape de purification supplément~ir~ après remise en solution dans de l'eau déminéralisée, par une chromatograhie sur une résine échangeuse d'anions, telle qu'une résine Amberlite IRA 400, OH ayant un volume de l'ordre du 1/10 du volume réactionnel, afin d'éliminer d'éventuelles impuretés.
Il est constitué d'un mélange de fragments d'héparine dont la majorité des espèces a un PM compris entre ~800 à 9000 Da environ.
~32~68 Le produit ainsi obtenu peut, le cas échéant, être transformé en un autre sel pharmaceutiquement acceptable, tel qu'un sel de calcium, un sel de potassium ou un sel de magnésium, selon les méthodes connues.
Les compositions d'héparine de l'invention, essentiellement formées de fragments de poids moléculaire d'environ 4800 à 9000, dépourvus du site de liaison à
l'ATIII, permettent de mettre à profit des propriétés pharmacologiques de grand intéret, qui sont rattachées 10 aux régions régulières de l'héparine. Ces composi-tions aux doses actives n'ont qu'une très faible activité anti-coagulante.
L'étude de leurs propriétés pharmacologiques a ainsi montré que ces compositions exercent un effet inhibiteur sensiblement équivalent à celui de l'héparine sur la croissance des cellules musculaires lisses.
Diverses expériences ont permis de mettre en évidence d'autres effets inhibiteurs, en particulier vis-à-vis de l'activation du complément, et des réactions 20 inflammatoires d'hypersensibilité de type retardé, ainsi que vis-à-vis de l'activite enzymatique de l'héparanase.
Elles peuvent exercer également une action potentialisatrice et stabilisante vis-à-vis de certains facteurs de croissance cellulaire.
Ces compositions sont, en outre, dotées d'une grande innocuité et sont particulièrement stables.
Eiles sont ainsi particulièrement appropriées pour constituer des principes actifs de médicaments.
L'invention a donc pour objet des préparations 30 pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'une composition essentiellement ~ormée de fragments d'hépaxine, tels que définis ci-des-sus, en association avec un véhicule pharmaceutique.
Compte tenu de leurs propriétés, les médica-ments de l'invention sont utilisables tout spécialement ~ 1 .: . ~ : : .
r~; 1327~6~3 ~
dans les indications thérapeutiques suivantes :
- prévention de la prolifération des cellules musculaires lisses au cours des angioplasties, - accélération de la réparation tissulaire, notamment lors de maladies cutanées, - prévention de l'extension de lésions athérogènes évo-lutives et des phénomènes de dégénérescence arteriosclé-rotique, - prévention des états de chocs, ~
- prévention de certains développements métastasiques. ' ;
Les préparations pharmaceutiques de l'invention sont administrables sous différentes formes.
Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des gélules, tablettes, comprimés, pilules, liposomes. Ces préparations ren-ferment avantageusement de 50 mg à 5 g par unité de prise, de préférence 200 à 250 mg pour les gélules, tablettes et pilules. ~.
En conséquence, les formes d'administration dépendent essentiellement de la dose à administrer. Les gélules, tablettes et pilules seront d'une utilisation pratique pour l'administration de faibles doses. Pour l'administration de doses plus élevées, les solutés buvables pourront être d'une utilisation plus pratique.
D'autres formes d'administration de l'invention sont constituées par des sprays, des aérosols, des pom-mades ou des crèmes.
L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'intramusculaire ou sous-cutanée.
Ces solutions renferment avantageusement de 10 à 150 mg/ml environ de principe actif lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée ou de 10 à
100 mglml environ, lorsqu'elles sont destinés à l'i-... . ~ : .
' ' ~ , ~ '' ' :' ,': ' " ~ . .
1327~8 jection intraveineuse ou à la perfusion.
A titre indicatif, afin d'illustrer l'inven-tion, on indique, ci-après, un exemple de posoloqie utilisable chez l'homme : cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient d'environ 500 mg/prise, par voie sous-cutanée, deux à trois fois par jour. Par voie intraveineuse, on administre environ 1000 mg/j, sachant que, par perfusion, les quantités injectées peuvent etre de plusieurs dizaines de ml. Ces administra-tions sont effectuees de manière discontinue à interval-les réguliers, ou continues par perfusion.
L'invention concerne encore le~ réactifsbiologiques dont les principes actifs sont constitu~s par les compositions de fra~ents d'héparine telles que définies plus haut. Ces réactifs biologiques peuvent etre utilisés comme re~érences ou ~talons dans des ~tudes comparatives dans différents systèmes physiologiques dans la régulation des~uelles les GAGs sont impliqués D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui s~ivent et en se réferant aux ~igures 1 à 5, - les figures 1 et 3 d'une part et 2 et 4 d'autre part, représentan~ les courbes HPLC respec~iveMent d'un mélange de dépolymérisation réduit et d'une composition selon l'invention, - la figure 5, le spectre RMN du 3C d'une composition selon l'invention.
EXEMPL~ 1 : Procédé d'obtention d'une composition de fragments d'héparine.
1/ - Cou~_e des chaines d'héDarine a l'aide d acide~periodi~ue g d'héparine injectable de mucus de porc, sous forme de sel de sodium, titrant 157 uI/mg dans le dosage Codex et 155 u/mg dans le dosage anti-facteur Xa de Yin et al; sont mis en solution dans 250 ml d'eau ,:
~ ~ *GAGs: glycos~noglycanes .. :-;
r~ 132796~
~:' 16 ~
déminérallsée à 4-C. Le pH de la solution est ajusté à ; ~.
5,0 par de l'acide chlorhydrique concentré. 10 g de métaperiodate de sodium (NaI04, PM : 213,89) en solution dans 250 ml d'eau déminéralisée à 4- C sont ajoutés sous agitation modérée. Le pH de l'ensemble est ajusté à 5,0 par de l'acide chlorhydrique concentré. La solution est abandonnée 24 heures, à l'obscurité, en chambre froide à
+ 4'C.
2/ - Elimination du Periodate residuel On répartit ensuite la solution réactionnelle dans 3 boyaux de dialyse NOJAX 40 R, (porosité de 3 à
4000 Da) et on la soumet à une dialyse 15 heures contre de l'eau déminéralisée courante.
r~~ eor r ~ ~~~ ~ ~
D ~ ~ C
lL 3 2 ~ 9 6 ~
On sait également que certaines activités de l'héparine ou de fragments d'héparine peuvent être maintenues jusqu'à un certain degré en l'absence du site de liaison à l'AT III ou lorsque celui-ci est modifié, les structures responsables de telles activités n'étant cependant pas connues.
Ainsi Folkman et al (Science Yol. 221 - 1983 -p. 719-725) ont rapporté une action inhibitrice de l'angiogénèse pour des mélanges d'hexasaccharides dépourvus d'activité anticoagulante, utilisés en association avec des corticoides.
Rarnowsky et al ont effectué des expériences sur des héparines O-désulfatées et ~-désulfatées et ont montré qu'elles possèdaient toujours dans une certaine proportion, mais à un moindre degré, les activités inhibitrices de l'héparine standard sur la prolifération des cellules musculaires lisses.
: .:
En outre, une activité anti-complément de l'héparine, independante de l'activité anticoagulante, a été mise en évidence.
D'autres travaux 0l1t montré que l'activité
anticoagulante de l'héparine pouvait être modifiée en effectuant des coupures au niveau des carbones C2-C3 des acides uroniques non sulfatés à l'aide de periodate de sodium.
Ainsi,Fransson et Lewis ont décrit, dans Febs.
Letters, vol. 97, n- 1, p. 119 - 123, 1979, des condi-tions opératoires consistant à soumettre l'héparine à
l'action du periodate, soit à pH 3, à 4' C, soit à pH 7, à 37' C. Les chaînes d'héparine obtenues sont oxydées sélectivement au niveau des acides D-glucuronique dans le premier cas, alors qu'une oxydation au niveau de tous les motifs acides uroniques non sulfatés est obtenue avec le deuxième type de conditions.
Les chaines résultantes sont réduites par NaBH4 ;~
-:
., .. - . . . .
': ; :
~ 3279~
.......
ou fragmentées selon un processus de ~ élimination en milieu alcalin.
Les auteurs concluent que l'oxydation et le clivage des motifs acide D-glucuronique se traduisent par une légère diminution de poids moléculaire mais une rétention de l'activité anticoagulante.
Au contraire, la coupure à pH 7 et à 37- C des acides D-glucuroni~ue et L-iduronique non sulfatés entraîne la suppression de l'activité anticoagulante et une plus forte fragmentation de la molécule.
Dans un article paru dans Carbohydrate Research 36, p. 339-34a, 1974, Fransson a rapporté l'oxydation periodique des motifs uroniques dans le der~atane sulfate à divers pH, à 4~ C ou 37' C.
L'auteur indique qu'en procédant à pH 5, les coupures au niveau des acides glucuroniques ne se font que dans une proportion inférieure à 5~~0 et qu'en procédant à pH 3, ces coupures ne se font pas du tout.
Ces résultats apparaissent donc contraires à ceux obtenus avec l'héparine pour laquelle à pH 3, les coupures se font préférentiellement au niveau des acides D-glucu- ~
roniques.
L'action du periodate a également été rapportée par Casu et al. dans Arzneim. Forsch./Drug Res. 36 (1) n-4, p. 637-642, 1986.
Selon cet article, différentes préparations d'héparine sont soumises à une oxydation periodique (pH
5,3 à 4-C durant 24 h.) coupant entre les carbones en positions 2 et 3 de tous les acides uroniques non sulfatés. A titre de référence, une préparation est soumise à une étape ultérieure d'hydrolyse acide partielle et les fragments obtenus sont dialysés.
Cette étape d'hydrolyse acide partielle conduit à une fragmentation importante des chaînes et à une ' destruction au moins p~rtielle de groupes fonctionnels, ~3~'79~8 comme l'indique Fransson dans Carbohydr. Res. 80, 131-145 (1980).
De plus, selon cette méthode, on obtient obli-gatoirement un mélange de chaines de PM variés dans un intervalle large, en particulier de nombreux di, tetra et hexasaccharides.
Or, les lnventeurs ont mis en évidence que pour l'obtention de compositions pharmaceutiques stables, utilisables en thérapeutique pour la régulation de certains systèmes physiologiques, les caractéristiques suivantes, en combinaison, sont essentielles :
longueur des fragments; taux de charge; absence du site de liaison à l'ATIII, afin d'éviter les effets indésirables liés à une activité
anticoagulante.
L'étude des processus de coupure à l'aide d'acide periodique et des moyens de fragmentation les ont conduits à constater qu'en réalisant l'oxydation perio-dique dans des conditions opératoires spécifi~ues, mais également en mettant en oeuvre une combinaison d'étapes particulières, il est possible d'obtenir une composition de fragments d'héparine de bas ~M, mals dans un ; .,, . :, ~
intervalle favorable, dépourvus du site de liaison à
l'ATIII et ce, tout en conservant au moins la majeure partie de leurs groupes fonctionnels.
L'invention a donc pour but de fournir des compositions d'héparine qui, aux doses actives, soient dotées de propriétés pharmacologiques de grand interet, sensiblement équivalentes à celles de l'héparine,sans présenter les inconvénients d'être dotées de propriétés anticoagulantes.
Elle vise également à fournir un procédé de fragmentation de l'héparine permettant d'obtenir des fragments de PM donné, dépourvus cependant du site de liaison à l'ATIII et dont le taux de charge correspond sensiblement à celui des séquences correspondantes dans ' . ":
1327~68 1 :
les chaines d'héparine naturelle. :
L'invention vise également les applications de ces compositions pour l'élaboration de médicaments actifs - :
notamment sur la régulation de certains systèmes physiologiques.
Les compositions de l'invention sont carac-térisées par le fait qu'elles sont essentiellement formées de fragments dépourvus d'enchaînements disaccharidiques du type acide uronique non sulfaté-glucosamine N-sulfate, ces fragments répondant à
la formule générale I suivante :
R-(X-Y)n-R' (I) :
dans laquelle - X représente soit un motif acide iduronique sulfaté de formule I r o ~ COO~
~0 ~
soit, à raison de 1 motif pour 2 chaines au moins, un :
motif acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique) non sulfaté ouvert entre les carbones en positions 2 et 3, de formule III :
', 1 .
00~ ~ ':
~ . .
~0 ,.
(111) , ' ' ,' ~J\
CH20;H C~120H
' :
: . . : . . :, .
~L327~8 - Y représente un motif D-glucosamine de formule IV : .
ro~3 r~ (Iv) ~0 ~ i~
. R1 étant un atome d'hydrogène ou un groupe -SO3 .
R2, un groupe -5O3 ou -CO-CH3, la proportion des groupes -SO3 étant d'environ au moins 9O~~OI et . R3, étant un groupe -SO3 ou un atome d'hydrogène, la proportion des groupes -SO3 étant d'environ au moins ~ ;~
70~, ~ R représente un atome d'hydrogène ou un motif :
r OR3 ;
ro~ '",:~:
R~O ~ ~ :
2 ~ ;
. R1 à R3 étant tels que définis ci-dessus, et . R4 représentant un atome d'hydrogène ou un résidu 25 d'acide uronique, ~ ~ :
- R' représente soit un atome d'hydrogène, soit un motif -:~
acide uronique ~aturel,soit un résidu d'acide uronique -~
modifié au cours de l'oxydation periodique et dont les : '~
fonctions aldéhydes ont été réduites en alcools, avec 30 7 ~ n ~ 15, pour les espèces majoritaires, ce qui corres- . :
pond a des chaînes de PM de 4800 à 9Q00 environ, et ses ~-sels pharmaceutiquement acceptables~
On notera que les motifs X ouverts sont des motifs qui, au cours de l'étape de bêta-élimination en pH
, . .
.. . ::
~32~68 alcalin, sont rest~s intégrés dans l'enchainement glycosamino-glycanique. Il s'agit soit d'un acide D-glucuronique non sulfaté, soit d'acide L-iduronique non sulfaté, dont les liaisons entre les carbones en positions 2 et 3 ont été coupées.
Les compositions de l'invention telles que caractérisées en HPLC déterminée avec une colonne TSK
2000~SW couplée à un détecteur photométrique à 205 nm, en utilisant Na2S04 0,5M comme solvan~, avec un débit de 1 10 mltmin~ présentent :
- un poids moléculaire moyen de l'ordre de 6000-7000 Da, plus précisément de 5800 à 7000 Da, notamment de l'ordre de 6000 Da, 70~~ des espèces étant compris entre 4aoo et 9000 daltons et 90~~0 entre 3600 et 11000 Da, - un poids moléculaire au sommet du pic de l'ordre de 6000 à 6500 Da, plus précisément de 5500 à 6500 na, notamment de l'ordre de 5500 à 6000 Da, - moins de 5~-0 de chaines inférieures à des dodécasac-charides, ~ moins de 53 de chaînes au-delà de 11.000.
Selon un autre aspect, le5 compositions d'heparine de l'invention sont telles qu'obtenues par fractionnement, à l'aide d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'un mélange résultant de la dépolymérisation de I'héparine par action d'une base ~orte sur des chaines d'héparine soumises au pxéalable à l'action de periodate, la dépolymérisation ~tant suivie d'une réduction des groupements aldehyde formés lors de l'oxydation periodique.
D'une manière avantageuse,les compositions de l'invention présentent un rapport des taux de groupes sulfate S03 et de groupes carboxyle C00 par mole compris entre 2,2 et 2,8. Ce rapport est notamment de 2,4. Ce taux élevé par rapport aux valeurs moyennes des chaînes d'héparine xésulte dela structure des chaines ~'.~
. 1 ': . . :
. : . - .. , . . ~ ~ . .
13279~8 d'h~parines de bas poid~ mol~culaire selon l'invention, qui sont constituee~ pour l'essentiel d'unités disac-charidiques trisulfat~es. Ces hepa~ines de bas PM sont dites ~ structure re~uli~re compte tenu de la pr~sence de ces unit~s disaccharidiques et en r~f ~rence ~ la litterature sclentifique (PERLIN A.S., CASU, B.
SANDERSON, GR. ~220 MHz ~pectra of heparin, chondroitins and other ~ucopolysaccharide~. Can. J. Chem. 1970;
48:2260-8).
L'invention vise ~gale~ent les sels de ces ~;
compositions, en particulier les sels de sodium, . ~;
potassium, cal~iu~ et ~agnésiu~ ainsi que le~ els de cations organiques physiologi~ue~ent acceptables. ~ :
L'invention a ~gale~ent pour objet un procéde de pr~paration de composition~ d~ fra~m~nts d' h~par.ine tels ~ue définis ci-dessus, COMprenant l'oxydation m~nag~e de l'heparine ~ l'aide de p~riodat~
Le procédé de la pr2sente invention e3t caractérisé en ce que : -a) on traite une solution aqueuse d ' h~parine ~ une con-cen~ration finale de 0,5 à 5~ ~p~v) avec de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 ~ 4~ (plv), ~ un pH de 4,5 ~ 6,5, ~ une temp~rature de O ~ 10- C; ~
b) on traite le~ chaInes d'h~parine ainsi obtenue~ ave~ .' une base ~orte, selon une ~uantit~ conduisant ~ une molarit~ finale en base de O,l ~ 0,3 N environ, ~ un pH
sup~rieur ~ ll environ;
c) on traite 18s fragments de d~polym~risation ainsi obte~u~ avec un agent r~ducteur;
~) après ~ ination ~ventuelle de l'a~ent r~ducteur en exc~, on pr~cipite le~ fragments r~duit~, apr~s addition d'un sel min~ral, ~ l'aide d'un solvant alcoolique;
e) on traite une solution aqueuse du précipit~ ainsi ob-tenu additionne d'un sel ~ineral par de l'alcool pour iner les fragments de tr~ bas poids mol~culaire;
f~ on recupère le produit pr~cipit~ ainsi form~ et on transforme, ~ventuellement, le sel correspondant à la ~ 3~79~
base forte utilisée, en un autre sel pharmaceutiquement acceptable.
On notera que l'étape e correspond à un fractionnement afin d'éliminer certains chaines et non à
une précipitation globale.
Plus particulièrement, ce procéde comprend en comblnaison les étapes suivantes :
- l'oxydation ménagée de l'héparine réalisée en faisant réagir de l'héparine, en solution aqueuse à une concen-tration finale de 0,5 à 5~~0 (p/v) avec un sel de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 a 4~~0 (p/v), à un pH situé entre 4,5 et 6,5, de préférence à un pH de 5, à une température de O à 10'C, durant environ 15 à 48 h, à l'abri de la lumière, - la dépolymérisation des chaines d'héparine obtenues, par addition d'une base forte telle que la soude, à un pH
supérieur à 11 environ, notamment compris entre 11 et 12, avantageusmeent de 11,2 à 11,6 de préférence aux environs de 11,5;
- la réduction des fragments de dépolymérisation à l'aide d'un agent réducteur et, après élimination, le cas échéant, de l'agent réducteur n'ayant pas réagi, - la récupération des fra~ments d'héparine réduits, par précipitation à l'aide d'un solvant dans lequel ils sont insolubles, - l'isolement des fragments recherchés par fractionnement à l'aide d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'une solution aqueuse obtenue en remettant en solution dans lleau le précipité précédemment isolé et en récupérant le précipité formé.
La réalisation de la dépolymérisation suivant un processus particulier, combinée à l'utilisation dans le procédé de l'invention, d'une étape de fractionnement, permet d'isoler une composition de fragments répondant à
' ~327~
' .
~o ~ .
un profil thérapeutique particulier et possédant notam-ment un indice thérapeutique satisfaisant.
Dans l'étape d'oxydation periodique, on utilise de préférence, l'héparine et le sel de l'acide periodique selon des quantités conduisant à des concentrations fina-les respectives de 1,5 à 5~0 et de 1,5 ~~O à 2,5 ~0 (p/v).
Le sel de l'acide periodique est constitué
avantageusement par du métaperiodate de sodium.
Pour éliminer le periodate résiduel, on -effectue une dialyse avec des boyaux de dialyse ayant une porosité de 3 à 4000 Da, pendant environ 15 h. ~
On peut également procéder par chromatographie -sur résine échangeuse d'anions par exemple sur une résine ~ -telle que celle commercialisée sous la marque Amberlite IRA~ 400, cette résine étant utilisée en quantité
suffisante pour retenir le periodate résiduel et les dérivés du periodate formés au cours de la réaction, soit 1/6 à 1l8 du volume réactionnel par exemple. Cette procédure plus rapide que la dialyse, de grande reproductibilité~ permet de procéder à la bêta-élimination à partir de conditions facilement standardisées. ~' Selon un mode préferé de réalisation de l'in-vention, on met l'héparine en solution dans de l'eau, plus spécialement de l'eau déminéralisée, à 4~ C, à une concentration d'environ 5~ (p/v), on ajoute un sel d'acide periodique tel que du métaperiodate de sodium de manière à obtenir une concentration finale d'environ 2~~
(p/~). Le pH de la solution est immédiatement ajusté à 5 à l'aide d'acide chlorhydrique dilué ou de soude diluée.
La solution est abandonnée à l'obscurité, à + .
4' C, de préférence 24 heures.
Afin d'éliminer le periodate résiduel, on effectue une dialyse avec des boyaux de dialyse ayant une ~.7P
., . . . , . ~ - . , .
~'' 132796~
porosité de 3 à 4000 Da, pendant environ 15 heures, contre de l'eau déminéralisee courante.
Les chaines d'héparine obtenues sont soumises à
une étape de dépolymérisation en milieu basique.
A cet effet, on ajoute une base forte, plus spécialement une lessive concentrée de soude, de manière à obtenir une molarité finale en base de 0,2 N.
La solution basique obtenue est soumise à
agitation 2 heures à température ambiante.
On soumet alors les fragments de dépolymé-risation de l'héparine à une étape de réduction afin de transformer les groupes aldéhyde résultant de la coupure de la liaison entre les carbones C2 et C3 des motifs uro~
niques. - ~, On utilise un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium, à raison de 50 mg par gramme d'héparine engagée, et on maintient l'agitation 6 heures à température ambiante.
L'agent réducteur n'ayant pas réagi est détruit par abaissement du pH à 4 à l'aide d'acide, par exemple de l'acide chlorhydrique, avantageusement sous agitation vigoureuse, pendant environ 15 minutes.
Les fragments d'héparine réduits sont récupérés par précipitation.
Avantageusement, on ajuste le pH à 7 à l'aide d'une base, notamment de la soude concentrée, puis on ajoute 20 y/litre de sel minéral et on effectue une précipitation à l'aide de 1,5 volume d'alcool.
Le sel minéral utilisé est avantageusement constitué par du chlorure de sodium. Pour la précipi-tation alcoolique, on a recours de préférence à de l'éthanol.
Le précipité formé est récupéré par centrifu-gation, lavé avec un solvant dans lequel il est ~327~6~
insoluble, tel que l'éthanol, et séché à 40' C, sous '~
vide -Pour isoler de ce précipité les fragments de l'invention, on a recours à une étape de fractionnement. ~ -On réalise avantageusement un fractionnement alcoolique en procédant comme suit Le précipité de fragments d'héparine est remis ~ ~
en solution dans de l'eau, plus spécialement de l'eau ~ :
déminéralisée, à température ambiante à savoir de l'ordre de 18 à 20' C, de manière à obtenir une concentration de , :: ~
5~~0 (p/v).
On ajoute un sel minéral, tel que le chlorure de sodium, en quantité suffisante pour avoir une concentration finale de 1~. Le pH de la solution est ajusté à 3,5 par de l'acide, par exemple de l'acide chlo~
rhydrique dilué. ; ~' On ajoute alors sous agitation modérée 0,85 volume d'un solvant dans lequel les fragments recherchés sont insolubles, tel que l'éthanol.
L'ensemble est laissé au repos environ 10 heures à 18-20- C.
Le précipité est recueilli par centrifugation, ~;
lavé avec un solvant tel que l'éthanol et séché sous vide à 40- C pendant 24 heures.
Ce précipité peut éventuellement être soumis à
une étape de purification supplément~ir~ après remise en solution dans de l'eau déminéralisée, par une chromatograhie sur une résine échangeuse d'anions, telle qu'une résine Amberlite IRA 400, OH ayant un volume de l'ordre du 1/10 du volume réactionnel, afin d'éliminer d'éventuelles impuretés.
Il est constitué d'un mélange de fragments d'héparine dont la majorité des espèces a un PM compris entre ~800 à 9000 Da environ.
~32~68 Le produit ainsi obtenu peut, le cas échéant, être transformé en un autre sel pharmaceutiquement acceptable, tel qu'un sel de calcium, un sel de potassium ou un sel de magnésium, selon les méthodes connues.
Les compositions d'héparine de l'invention, essentiellement formées de fragments de poids moléculaire d'environ 4800 à 9000, dépourvus du site de liaison à
l'ATIII, permettent de mettre à profit des propriétés pharmacologiques de grand intéret, qui sont rattachées 10 aux régions régulières de l'héparine. Ces composi-tions aux doses actives n'ont qu'une très faible activité anti-coagulante.
L'étude de leurs propriétés pharmacologiques a ainsi montré que ces compositions exercent un effet inhibiteur sensiblement équivalent à celui de l'héparine sur la croissance des cellules musculaires lisses.
Diverses expériences ont permis de mettre en évidence d'autres effets inhibiteurs, en particulier vis-à-vis de l'activation du complément, et des réactions 20 inflammatoires d'hypersensibilité de type retardé, ainsi que vis-à-vis de l'activite enzymatique de l'héparanase.
Elles peuvent exercer également une action potentialisatrice et stabilisante vis-à-vis de certains facteurs de croissance cellulaire.
Ces compositions sont, en outre, dotées d'une grande innocuité et sont particulièrement stables.
Eiles sont ainsi particulièrement appropriées pour constituer des principes actifs de médicaments.
L'invention a donc pour objet des préparations 30 pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'une composition essentiellement ~ormée de fragments d'hépaxine, tels que définis ci-des-sus, en association avec un véhicule pharmaceutique.
Compte tenu de leurs propriétés, les médica-ments de l'invention sont utilisables tout spécialement ~ 1 .: . ~ : : .
r~; 1327~6~3 ~
dans les indications thérapeutiques suivantes :
- prévention de la prolifération des cellules musculaires lisses au cours des angioplasties, - accélération de la réparation tissulaire, notamment lors de maladies cutanées, - prévention de l'extension de lésions athérogènes évo-lutives et des phénomènes de dégénérescence arteriosclé-rotique, - prévention des états de chocs, ~
- prévention de certains développements métastasiques. ' ;
Les préparations pharmaceutiques de l'invention sont administrables sous différentes formes.
Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des gélules, tablettes, comprimés, pilules, liposomes. Ces préparations ren-ferment avantageusement de 50 mg à 5 g par unité de prise, de préférence 200 à 250 mg pour les gélules, tablettes et pilules. ~.
En conséquence, les formes d'administration dépendent essentiellement de la dose à administrer. Les gélules, tablettes et pilules seront d'une utilisation pratique pour l'administration de faibles doses. Pour l'administration de doses plus élevées, les solutés buvables pourront être d'une utilisation plus pratique.
D'autres formes d'administration de l'invention sont constituées par des sprays, des aérosols, des pom-mades ou des crèmes.
L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'intramusculaire ou sous-cutanée.
Ces solutions renferment avantageusement de 10 à 150 mg/ml environ de principe actif lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée ou de 10 à
100 mglml environ, lorsqu'elles sont destinés à l'i-... . ~ : .
' ' ~ , ~ '' ' :' ,': ' " ~ . .
1327~8 jection intraveineuse ou à la perfusion.
A titre indicatif, afin d'illustrer l'inven-tion, on indique, ci-après, un exemple de posoloqie utilisable chez l'homme : cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient d'environ 500 mg/prise, par voie sous-cutanée, deux à trois fois par jour. Par voie intraveineuse, on administre environ 1000 mg/j, sachant que, par perfusion, les quantités injectées peuvent etre de plusieurs dizaines de ml. Ces administra-tions sont effectuees de manière discontinue à interval-les réguliers, ou continues par perfusion.
L'invention concerne encore le~ réactifsbiologiques dont les principes actifs sont constitu~s par les compositions de fra~ents d'héparine telles que définies plus haut. Ces réactifs biologiques peuvent etre utilisés comme re~érences ou ~talons dans des ~tudes comparatives dans différents systèmes physiologiques dans la régulation des~uelles les GAGs sont impliqués D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui s~ivent et en se réferant aux ~igures 1 à 5, - les figures 1 et 3 d'une part et 2 et 4 d'autre part, représentan~ les courbes HPLC respec~iveMent d'un mélange de dépolymérisation réduit et d'une composition selon l'invention, - la figure 5, le spectre RMN du 3C d'une composition selon l'invention.
EXEMPL~ 1 : Procédé d'obtention d'une composition de fragments d'héparine.
1/ - Cou~_e des chaines d'héDarine a l'aide d acide~periodi~ue g d'héparine injectable de mucus de porc, sous forme de sel de sodium, titrant 157 uI/mg dans le dosage Codex et 155 u/mg dans le dosage anti-facteur Xa de Yin et al; sont mis en solution dans 250 ml d'eau ,:
~ ~ *GAGs: glycos~noglycanes .. :-;
r~ 132796~
~:' 16 ~
déminérallsée à 4-C. Le pH de la solution est ajusté à ; ~.
5,0 par de l'acide chlorhydrique concentré. 10 g de métaperiodate de sodium (NaI04, PM : 213,89) en solution dans 250 ml d'eau déminéralisée à 4- C sont ajoutés sous agitation modérée. Le pH de l'ensemble est ajusté à 5,0 par de l'acide chlorhydrique concentré. La solution est abandonnée 24 heures, à l'obscurité, en chambre froide à
+ 4'C.
2/ - Elimination du Periodate residuel On répartit ensuite la solution réactionnelle dans 3 boyaux de dialyse NOJAX 40 R, (porosité de 3 à
4000 Da) et on la soumet à une dialyse 15 heures contre de l'eau déminéralisée courante.
3/ - Dépolymér sation en milieu basique Aux 780 ml de solution obtenue après dialyse, sont ajoutés 16 ml de soude 10 N, et l'ensemble est soumis à agitation 3 heures à température ambiante (de l'ordre de 18-21-C)
4/ - Réduction 500 mg de borohydrure de sodium (NaBH4, PM :
37,83~ sont alors ajoutés et la solution est agitée de nouveau 4 heures à température ambiante. Son pH est ensuite amené à 4 à l'aide d'acide chlorhydrique concen-tré. Après 15 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 7 à -~
l'aide de soude concentrée.
Aux 820 ml de solution ainsi obtenue sont ajoutés 16,4 g de NaCl puis 1270 ml d'éthanol.
- L'ensemble est laissé au repos 3 heures, puis centrifugé à 2500 t/minute pendant 20 minutes. ;
Le précipité est recueilli, remis en suspension dans 200 ml d'ethanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax ~ et finalement récupére par filtration sur buchner fritté.
Il est alors séché sous vide à 40-C pendant 5 heures.
On récupère ainsi 8,9 g de produit interm-~27~g :;:
diaire ayant les propriétés suivantes :
- dosage Codex : 8 uI/mg - dosage APTT : 7 uI/mg - dosage Anti-Xa : 8 u/mg .
La répartition moléculaire de la composition est rapportée sur la figure 1 qui correspond à la courbe HPLC determinée dans les conditions évoquées page 6.
37,83~ sont alors ajoutés et la solution est agitée de nouveau 4 heures à température ambiante. Son pH est ensuite amené à 4 à l'aide d'acide chlorhydrique concen-tré. Après 15 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 7 à -~
l'aide de soude concentrée.
Aux 820 ml de solution ainsi obtenue sont ajoutés 16,4 g de NaCl puis 1270 ml d'éthanol.
- L'ensemble est laissé au repos 3 heures, puis centrifugé à 2500 t/minute pendant 20 minutes. ;
Le précipité est recueilli, remis en suspension dans 200 ml d'ethanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax ~ et finalement récupére par filtration sur buchner fritté.
Il est alors séché sous vide à 40-C pendant 5 heures.
On récupère ainsi 8,9 g de produit interm-~27~g :;:
diaire ayant les propriétés suivantes :
- dosage Codex : 8 uI/mg - dosage APTT : 7 uI/mg - dosage Anti-Xa : 8 u/mg .
La répartition moléculaire de la composition est rapportée sur la figure 1 qui correspond à la courbe HPLC determinée dans les conditions évoquées page 6.
5/ - F ctionnement alcoolique Ces 8,9 grammes sont dissous dans environ 120ml d'eau déminéralisée à température ambiante. On ajoute 1,78 grammes de NaCl et le pH de la solution est abaissé
à 3,5 à l'aide d'a~ide chlorhydrique. Le volume de la solution est ajusté à 178 ml à l'aide d'eau déminéra-lisée. 151 ml d'éthanol pur sont ajoutés sous agitation.
L'agitation est maintenue 15 minutes après la fin de ~ :
l'addition puis l'ensemble est laissé au repos 10 heures, à température ambiante.
Le précipité formé est recueilli par centrifu- :
gation 20 minutes à 2500 t/min. Il est remis en suspen-sion dans 150 ml d'éthanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax, 20 récupéré par filtration sur buchner fritté, lavé par 300 : :
ml d'éthanol pur et finalement séché sous ~ide à 40-C
pendant 24 heures. ~:
On récupère ainsi 5,0 g sous forme de poudxe blanche 5,0 g du produit IC 1772 ayant les caracté-risti~ues suivantes :
- titre Codex : 11 uI/mg - :
- titre APTT : 9 uI/mg ~.
- titre Anti-Xa : 12 u/mg La distribution moléculaire de la composition :~ u~
obtenue apparaît à l'examen de la figure 2 qui correspond à la courbe HPLC, déterminée dans les conditions ci-dessus~
AnalYse en RMN du 13C -Le spectre RMN pour le carbone 13 est représe- -~
:~
:
: .
:'' . . ~
, .; . . ., , ~ . . .
'' 1327~8 té sur la figure 5. Ce spectre a été réalisé sur une so-lution, du composé dissous dans de l'oxyde de deutérium, à 25MH~, à 35- C. Les déplacements chimiques sont mesurés par rapport au méthanol (51,6ppm).
L'examen de ce spectre montre qu'il présente les signaux caractéristiques d'un enchainement de disaccharides du type acide 2-0-sulfo-~ iduronique (1->4) 6-0-sulfo-N-sulfo-~-D-glucosamine (1->4) On constate en particulier la présence des segments des carbones anomères, à 101,7 ppm (acide 2-0-sulfo-~-L-iduronique) alors que les signaux caractéris-tiques des acides D-glucuronique et L-iduronique (104,5 ppm) non sulfatés ne sont pas présents, contrairement au spectre d'une préparation d'héparine dans laquelle il5 peuvent représenter jusqu'à 30 à 40~0 du total des signaux des acides uroniques.
Dans la région des C-2 de glucosamine, seul le signal à 60,5 ppm (C-2 de la N-sulfo-glucosamine) est présent. Le signal caractéristique de la N-acétyl-gluco-samine (56,4 ppm) est à peine décelable alors qu'il figure dans l'héparine de départ.
Dans la région des C-6 de glucosamine (62,5 pour C-6-OH et 69 pour C-6-05). On constate la présence des deux signaux des espèces non sulfatée et sulfatée.
Il est important de noter que le rapport d'in-25tensité des signaux à 99,4 ppm et 101,7 ppm est égal à 1 ce qui confirme la seule présence d'acide ~-O-sulfo-L-iduronique.
On décèle la présence de quelques résidus de N-acétyl-glucosamine. De même, le si~nal du NHAc (24,6 ppm) apparaît.
Analvse conductimétr que :
~ e degré de sulfatation déterminé par conduc-timétrie est de 2,3. Le nombre de charges par unite disa-ccharidique est de 3,3.
~ 7 9 6 8 EXEMPLE 2 :
1/ - 200 g d'héparine injectable, sel de sodium, titrant 154 uI/mg dans le dosage Codex et 158 u/mg dans le dosage anti-facteur Xa sont mis en solution dans 5 litres d'eau déminéralisée, à + 4-C.
I,e pH de la solution est ajusté à 5,0 par HCl concentré. On ajoute alors sous agitation modérée :
200 9 de metaperiodate de sodium en solution dans S
litres d'eau déminéralisée à + 4-C. Le pH de l'ensemble est de nouveau ajusté à 5,0 par HCl concentré.
La solution obtenue est laissée 24 heures à
l'obscurité, en chambre froide ~ 4'C, sous agltation modérée.
2/ - Elle est ensuite répartie dans SO boyaux de dialyse et dialysée 14 heures contre de l'eau déminéralisée courante, à température ambiante.
3/ - A l'issue de cette dialyse, on récupère 14,5 litres de solution à laquelle on ajoute 116 g de soude pure en pastilles. On agite la solution ainsi obtenue 3 heures à
température ambiante.
4/ - 10 g de borohydrure de sodium sont ensuite ajoutés et l'agitation est poursuivie pendant 4 heures.
Le pH de la solution est abaisse à 4 à l'aide d'HCl concentré, pendant 15 minutes, puis il est de nouveau réajusté à 7 par de la soude concentrée;
Le volume de la solution ainsi obtenue est de 15,2 litres. On ajoute alors 304 grammes de NaCl puis 22,8 litres d'éthanol.
L'ensemble est laissé au repos 48 heures à
température ambiante. ~e surnageant limpide est siphonné, le précipité est recueilli, remis en suspension dans 3 litres d'éthanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax, et récupéré
par filtration sur verre fritté.
Il est finalement séché sous vide à 40-C pe~
..
13279~$
dant 15 heures.
On récupère 181 grammes de fragments d'héparine ayant les caractéristiques suivantes :
- dosage Codex : 10 uI/mg - dosage APTT : 9 uI/mg - dosage Anti-Xa : 9 u/mg répartition moléculaire : voir figure 3.
5/ - Ces 181 grammes sont dissous dans environ 3 l.itres d'eau déminéralisée, à température ambiante.
On ajoute 36,2 grammes de NaCl et le pH de la solution est ajusté à 3,5 par HCl concentré.
Le volume de la solution est ajusté à 3,62 litres à l'aide d'eau déminéralisée. On ajoute sous agitation modérée 3,077 litres d'ethanol pur. L'agitation est maintenue 15 minutes après la fin de l'addition et l'ensemble est laissé au repos 10 heures à température ambiante. Le précipité formé est recueilli par centrifu-gation 20 minutes à 2500 t/min. Il est remis en suspen- ; ~-sion dans 2 litres d'éthanol pur, broyé à l'Vltra-20 Turrax, récupéré par filtration sur fritté, lavé par 3 litres d'éthanol pur et finalement séché sous vide, à
40-C, pendant 24 heures.
On obtient finalement 104 grammes de poudre blanche ayant les caractéristiques suivantes :
- titre Codex : 13 uI/mg - titre APTT : 10 uI/mg - titre Anti-Xa : 13 u/mg répartition moléculaire : voir figure 4.
EXEMPLE 3 :
1/ - Coupure des chalnes d'héparine à l'aide d'acide periodique -45 g d'héparine injectable de mucus de porc, sous forme de sel de sodium, sont mis en solution dans 600 ml d'eau déminéralisée. 18 g de métaperiodate de sodium en solution dans 200 ml d'eau déminéralisée, à
5-C, sont ajoutés sous agitation modérée. On ajuste le pH
à 5 par addition de HCl concentré et le volume réactionnel est amené à 900 ml avec de l'eau distillée.
La solution est maintenue pendant 24 à 26 heures, à
l'obscurité, en chambre froide ~O-10'C). Le précipité
formé est éliminé par filtration.
2/ - Elimination du ~eriodate résiduel Les 900 ml de la réaction d'oxydation de l'héparine sont percolés sur une résine échangeuse d'ions Amberlite IRA 400, Cl tRohm and Haas Company, USA) ~yant un volume de 1/8ème du volume réactionnel (110 ml), en 2 heures.
La colonne est rincee par 225 litres d'eau déminéralisée. Ce rinçage est combiné à la solution percolée. On obtient ainsi 1125 ml de solution débarrassée du periodate et de l'iodate. L'absence de periodate est contrôlée par titrimétrie. La courbe de titration de 5 ml de la solution d'oxyhéparine par 2,5 ml de soude 1 N permet de visualiser l'absence de periodate. Le periodate en solution se traduirait par une inflexion caractéristique pour un pKa d'environ 7,8.
3/ - Dépolvmérisation en milieu basique La bêta-élimination est initiée en ajoutant de la soude 10 N par étapes jusqu'à obtention d'un pH de 11,5. La réaction se poursuit pendant 1 heure à
température ambiante (18-23'C) sous agitation.
4/ - Réduction On ajoute alors du borohydrure de sodium à
raison de 10 g par 100 g de mat.ière pre~ière engagée.
Cette réduction est realisée pendant au moins heures sous agitation. L'agent réducteur en excès est ensuite éliminé par addition de 25 g/l de NaCl puis le pH
de la solution est ajusté à 4 à l'aide de HCl concentré.
La solution est ensuite ajustée à un pH neutre à l'aide de NaOH concentrée.
~ . - : . .: . . .: . .
\
22 13279~
On précipite le produit en ajoutant 1,5 volume d'éthanol pur. Le précipité est décanté pendant 48 à 72 heures, puis déshydraté à l'éthanol et séché sous vide à
40-C pendant 12 heures.
5/ - Fractionnement alcoolique Le produit est repris dans de l'eau déminéra-lisée (180 ml pour 10 g d'héparine engagée). On ajoute 2g de NaCl pour 10 g. Le pH est ajusté à 3,5 et la solution complétée en eau déminéralisée au volume de 200 ml pour 10 g engagés.
On ajoute 0,85 volume d'éthanol pur sous agitation lente. Le précipité est laissé à décanter pendant 48 à 72 heures. Le précipité est repris, déshydraté à l'éthanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax (R) et séché à 40-C. Le produit se présente sous forme d'une poudre blanche. Le produit soluble dans l'alcool a éte analysé en HPLC. On a constat~ que les oligosacchar.ides ont un poid~ moléculaire moyen de l'ordre de 3500.
à 3,5 à l'aide d'a~ide chlorhydrique. Le volume de la solution est ajusté à 178 ml à l'aide d'eau déminéra-lisée. 151 ml d'éthanol pur sont ajoutés sous agitation.
L'agitation est maintenue 15 minutes après la fin de ~ :
l'addition puis l'ensemble est laissé au repos 10 heures, à température ambiante.
Le précipité formé est recueilli par centrifu- :
gation 20 minutes à 2500 t/min. Il est remis en suspen-sion dans 150 ml d'éthanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax, 20 récupéré par filtration sur buchner fritté, lavé par 300 : :
ml d'éthanol pur et finalement séché sous ~ide à 40-C
pendant 24 heures. ~:
On récupère ainsi 5,0 g sous forme de poudxe blanche 5,0 g du produit IC 1772 ayant les caracté-risti~ues suivantes :
- titre Codex : 11 uI/mg - :
- titre APTT : 9 uI/mg ~.
- titre Anti-Xa : 12 u/mg La distribution moléculaire de la composition :~ u~
obtenue apparaît à l'examen de la figure 2 qui correspond à la courbe HPLC, déterminée dans les conditions ci-dessus~
AnalYse en RMN du 13C -Le spectre RMN pour le carbone 13 est représe- -~
:~
:
: .
:'' . . ~
, .; . . ., , ~ . . .
'' 1327~8 té sur la figure 5. Ce spectre a été réalisé sur une so-lution, du composé dissous dans de l'oxyde de deutérium, à 25MH~, à 35- C. Les déplacements chimiques sont mesurés par rapport au méthanol (51,6ppm).
L'examen de ce spectre montre qu'il présente les signaux caractéristiques d'un enchainement de disaccharides du type acide 2-0-sulfo-~ iduronique (1->4) 6-0-sulfo-N-sulfo-~-D-glucosamine (1->4) On constate en particulier la présence des segments des carbones anomères, à 101,7 ppm (acide 2-0-sulfo-~-L-iduronique) alors que les signaux caractéris-tiques des acides D-glucuronique et L-iduronique (104,5 ppm) non sulfatés ne sont pas présents, contrairement au spectre d'une préparation d'héparine dans laquelle il5 peuvent représenter jusqu'à 30 à 40~0 du total des signaux des acides uroniques.
Dans la région des C-2 de glucosamine, seul le signal à 60,5 ppm (C-2 de la N-sulfo-glucosamine) est présent. Le signal caractéristique de la N-acétyl-gluco-samine (56,4 ppm) est à peine décelable alors qu'il figure dans l'héparine de départ.
Dans la région des C-6 de glucosamine (62,5 pour C-6-OH et 69 pour C-6-05). On constate la présence des deux signaux des espèces non sulfatée et sulfatée.
Il est important de noter que le rapport d'in-25tensité des signaux à 99,4 ppm et 101,7 ppm est égal à 1 ce qui confirme la seule présence d'acide ~-O-sulfo-L-iduronique.
On décèle la présence de quelques résidus de N-acétyl-glucosamine. De même, le si~nal du NHAc (24,6 ppm) apparaît.
Analvse conductimétr que :
~ e degré de sulfatation déterminé par conduc-timétrie est de 2,3. Le nombre de charges par unite disa-ccharidique est de 3,3.
~ 7 9 6 8 EXEMPLE 2 :
1/ - 200 g d'héparine injectable, sel de sodium, titrant 154 uI/mg dans le dosage Codex et 158 u/mg dans le dosage anti-facteur Xa sont mis en solution dans 5 litres d'eau déminéralisée, à + 4-C.
I,e pH de la solution est ajusté à 5,0 par HCl concentré. On ajoute alors sous agitation modérée :
200 9 de metaperiodate de sodium en solution dans S
litres d'eau déminéralisée à + 4-C. Le pH de l'ensemble est de nouveau ajusté à 5,0 par HCl concentré.
La solution obtenue est laissée 24 heures à
l'obscurité, en chambre froide ~ 4'C, sous agltation modérée.
2/ - Elle est ensuite répartie dans SO boyaux de dialyse et dialysée 14 heures contre de l'eau déminéralisée courante, à température ambiante.
3/ - A l'issue de cette dialyse, on récupère 14,5 litres de solution à laquelle on ajoute 116 g de soude pure en pastilles. On agite la solution ainsi obtenue 3 heures à
température ambiante.
4/ - 10 g de borohydrure de sodium sont ensuite ajoutés et l'agitation est poursuivie pendant 4 heures.
Le pH de la solution est abaisse à 4 à l'aide d'HCl concentré, pendant 15 minutes, puis il est de nouveau réajusté à 7 par de la soude concentrée;
Le volume de la solution ainsi obtenue est de 15,2 litres. On ajoute alors 304 grammes de NaCl puis 22,8 litres d'éthanol.
L'ensemble est laissé au repos 48 heures à
température ambiante. ~e surnageant limpide est siphonné, le précipité est recueilli, remis en suspension dans 3 litres d'éthanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax, et récupéré
par filtration sur verre fritté.
Il est finalement séché sous vide à 40-C pe~
..
13279~$
dant 15 heures.
On récupère 181 grammes de fragments d'héparine ayant les caractéristiques suivantes :
- dosage Codex : 10 uI/mg - dosage APTT : 9 uI/mg - dosage Anti-Xa : 9 u/mg répartition moléculaire : voir figure 3.
5/ - Ces 181 grammes sont dissous dans environ 3 l.itres d'eau déminéralisée, à température ambiante.
On ajoute 36,2 grammes de NaCl et le pH de la solution est ajusté à 3,5 par HCl concentré.
Le volume de la solution est ajusté à 3,62 litres à l'aide d'eau déminéralisée. On ajoute sous agitation modérée 3,077 litres d'ethanol pur. L'agitation est maintenue 15 minutes après la fin de l'addition et l'ensemble est laissé au repos 10 heures à température ambiante. Le précipité formé est recueilli par centrifu-gation 20 minutes à 2500 t/min. Il est remis en suspen- ; ~-sion dans 2 litres d'éthanol pur, broyé à l'Vltra-20 Turrax, récupéré par filtration sur fritté, lavé par 3 litres d'éthanol pur et finalement séché sous vide, à
40-C, pendant 24 heures.
On obtient finalement 104 grammes de poudre blanche ayant les caractéristiques suivantes :
- titre Codex : 13 uI/mg - titre APTT : 10 uI/mg - titre Anti-Xa : 13 u/mg répartition moléculaire : voir figure 4.
EXEMPLE 3 :
1/ - Coupure des chalnes d'héparine à l'aide d'acide periodique -45 g d'héparine injectable de mucus de porc, sous forme de sel de sodium, sont mis en solution dans 600 ml d'eau déminéralisée. 18 g de métaperiodate de sodium en solution dans 200 ml d'eau déminéralisée, à
5-C, sont ajoutés sous agitation modérée. On ajuste le pH
à 5 par addition de HCl concentré et le volume réactionnel est amené à 900 ml avec de l'eau distillée.
La solution est maintenue pendant 24 à 26 heures, à
l'obscurité, en chambre froide ~O-10'C). Le précipité
formé est éliminé par filtration.
2/ - Elimination du ~eriodate résiduel Les 900 ml de la réaction d'oxydation de l'héparine sont percolés sur une résine échangeuse d'ions Amberlite IRA 400, Cl tRohm and Haas Company, USA) ~yant un volume de 1/8ème du volume réactionnel (110 ml), en 2 heures.
La colonne est rincee par 225 litres d'eau déminéralisée. Ce rinçage est combiné à la solution percolée. On obtient ainsi 1125 ml de solution débarrassée du periodate et de l'iodate. L'absence de periodate est contrôlée par titrimétrie. La courbe de titration de 5 ml de la solution d'oxyhéparine par 2,5 ml de soude 1 N permet de visualiser l'absence de periodate. Le periodate en solution se traduirait par une inflexion caractéristique pour un pKa d'environ 7,8.
3/ - Dépolvmérisation en milieu basique La bêta-élimination est initiée en ajoutant de la soude 10 N par étapes jusqu'à obtention d'un pH de 11,5. La réaction se poursuit pendant 1 heure à
température ambiante (18-23'C) sous agitation.
4/ - Réduction On ajoute alors du borohydrure de sodium à
raison de 10 g par 100 g de mat.ière pre~ière engagée.
Cette réduction est realisée pendant au moins heures sous agitation. L'agent réducteur en excès est ensuite éliminé par addition de 25 g/l de NaCl puis le pH
de la solution est ajusté à 4 à l'aide de HCl concentré.
La solution est ensuite ajustée à un pH neutre à l'aide de NaOH concentrée.
~ . - : . .: . . .: . .
\
22 13279~
On précipite le produit en ajoutant 1,5 volume d'éthanol pur. Le précipité est décanté pendant 48 à 72 heures, puis déshydraté à l'éthanol et séché sous vide à
40-C pendant 12 heures.
5/ - Fractionnement alcoolique Le produit est repris dans de l'eau déminéra-lisée (180 ml pour 10 g d'héparine engagée). On ajoute 2g de NaCl pour 10 g. Le pH est ajusté à 3,5 et la solution complétée en eau déminéralisée au volume de 200 ml pour 10 g engagés.
On ajoute 0,85 volume d'éthanol pur sous agitation lente. Le précipité est laissé à décanter pendant 48 à 72 heures. Le précipité est repris, déshydraté à l'éthanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax (R) et séché à 40-C. Le produit se présente sous forme d'une poudre blanche. Le produit soluble dans l'alcool a éte analysé en HPLC. On a constat~ que les oligosacchar.ides ont un poid~ moléculaire moyen de l'ordre de 3500.
6/ - Purification Le produit obtenu à l'étape précédente est mis en solution à SD~ dans de l'eau déminéralisée et est purifié sur une colonne échangeuse d'anions Amberlite IRA
400, OH (1/10- du volume réactionnel).
Le produit est ensuite testé pour ses caractéristiques :
. Taux de sulfatati~n (déterminé selon Helbert J.R. ~t Marini M.A., Biochemistry, 1963, 2, 1101-1106).
Le rapport S03/COO est de 2,2 à 2,4.
. Activités anti-IIa et anti-Xa :
- TCK (1) : 4 u/mg - USP (2) : 13 u/mg Activité anti-IIa (3) ; 12 u/mg - Activité anti-Xa (4) (Yin et Wessler): 8 u/mg - Activité anti-Xa (sur substrat chromogène -. " . . , ~32~
S 2222 en système purifié) : 1 u/mg Les ref~rences des systèmes utilisés pour effectuer les mesures sont les suivantes : -~
(1) : R.R. Proctor et S. Rapaport - AM. J. Clin. .
Pathol., 1961,36 , 212-219.
(2) : XXIe Pharmacopée américaine.
~3) : Mesurée par l'allongement du temps de thrombine.
(4) : E.T. Yin, 5. Wessler, J.V. Butler - J. Lab. Clin.
Med., 1973, 81, 298-310.
:
MISE E~ EVIDENCE DE CYCLES D'ACI_ES URONIOUES O~VERTS
ENTRE C2 ET C3 : ~.
La dégradation de Smith à pH 3 et 100- C ~
pendant 1 heure d'une solution à 5~~0 d'IC 1772 provoque la .~.
coupure spécifique des chaines oligosaccharidiques au ~
niveau des acides uroniques ouverts entre C2 et C3. Il en ~:
résulte une baisse du poids moléculaire moyen du produit, .
observée par gel filtration sur TSK 2000 avec détection :~
réfractométrique.
Les résultats sont exprimés de la manière ~ :
suivante : ~ .
- Mna représente le "number average molecular weight" tel que défini par W.W. YAU, J.J. KIRKLAND et D.D. ~LY ~in Modern size-exclusion liquid chromatrography, Wiley :
Interscience Publication) du produit testé tel que;
- Mnb représente le "number average molecular weight " .
après que l'on ait procédé à la dégradation de Smith comme indiqué ci-dessus;
- (Mrla/Mn~,) - 1 donne le nombre de sites sensibles à
cette dégradation de Smith par chaine oligosaccharidique, ce qui équivaut au nombre d'acides uroniques ouverts entre CZ et C3.
L'essai a été réalisé sur deux lots de produits IC 1772 : :
. . . : . ~ ~
, ,~ :
. - . . .
,: ' : ' ~ ~ 3279~
Mna 5503 5573 Mnb 3896 3745 (Mna/Mnb) - 1 0,4 0,5 On constate donc que, dans les conditions de l'analyse IC 1772 contient un acide uronique ouvert toutes les deux chaînes, au moins.
':
/ , ~;~
/ :
-~2796~
2 5 :
On rapporte, ci-après, les résultats obtenus concernant:
1. Les activités anti-IIa et anti-Xa, in 5 vitro, dans dif~erents systèmes.
2. Les temps de coagulation par la throm-bine (TCT).
1/ - Activités anti-IIa et anti-Xa, in vitro _. . , ~
IC 1772 Héparine ESSAI u/mg Standard u/mg ~
_ _ ::
Activite anti-IIa3 16 160 Activite anti-IIa (sur substrat36 160 chromogène S 2238 en système puri~ié) ;
Activité anti-IIa (sur substrat 1 160 - ;
chromogène S 2238 en système plasmatique) Activite anti-Xa4 (Yin et 12 - 15 160 Wessler) Activité anti-Xa (sur substrat 2 - 3 160 chromogène S 2222 en système purifié) Activité anti-Xa (sur substrat 5 - 10 160 chromogène S 2222 en système plasmatique) _ . .
Les réferences des systèmes utilisés pour effectuer les mesures sont les suivantes:
1/ R.R. Proctor et S. Rapaport - Am. J. Clin. Pathol., 1961, 36, 212-219.
2/ XXIème Pharmacopée américaine.
3/ Mesurée par l'allongement du temps de thrombine.
4/ E.T. Yin, S. Wessler, J.V. Butler, J. Lab. Clin~
Med., 1973, 81, 298-310.
~L327~8 2/ -TCT :
On rapporte dans le tableau 1 ci-après, les résultats sous forme de temps de coagulation exprimé en secondes, de 3 essais effectués avec les 3 types de plas-mas utilisés pour étudier l'activité APTT. Le contrôle est effectué en milieu plasmati~ue normal. Les résultats correspondent à la moyenne de deux essais indépendants.
TA~LEAU 1 ~g/ml Plasma normal Plasmas déplétés en ATIII HC II ATIII et HCII
2,5 36 26 24 22 300 300 ~0 22 On constate aux doses de 5 et surtout 10 ug/ml un allongement du temps de thrombine qui semble dépendre de HCII.
- INHIBITION DE LA PROLIFERATION DES CELLULFS MUSCULAIRES
LISSES (CML) IN VITRO.
Modèle exPérimentaL :
Les cellules musculaires lisses tCML) pro-viennent d'un segment abdominal de l'aorte de rat Sprague Dawley. De petits morceaux de media sont mis en culture en milieu RPMI-1640 additionné de 20~o de sérum de veau foetal (SVF). Au bout de 1 à 2 semaines, les CML migrent hors des tissus et commencent à proliférer.
5-8.103 CM1 sont mises en culture dans des plaques multi-puits. Après 24 heures, on arrête leur croissance par un lavage suivi de l'addition de milieu RPMI ~ 2% de plasma déplaquetté (ou RPMI -~ 0,4~~ de SVF) pendant 72 heures.
Les cellules sont alors replacées pendant 5 à 7 jours en milieu RPMI additionné de 20% de SVF avec ou sans le composé à tester, ce dernier à différentes ~3279~8 concentrations.
La croissance nette des CML, dans les essais témoins ou additionnés des produits à tester, est obtenue en soustrayant le nombre de cellules au départ du nombre de cellules à la fin de l'expérience (mesure en duplicate par compteur Coulter).
Le ~~ d'inhibition est donné pa~ la formule suivante :
10 ~ d~inh~bit~on ~ ~l crolssance nette des cellules testees . ~ . X 1 00 croissance nette des cellules t~mo~ns ~:
(voir Castellot et al., J. Cell. Biol., 102, 1986, 151979-1984).
Les résultats obtenus selon la concentration de IC 1772 en culture sont les suivants (à titre comparati~
on rapporte les valeurs d'inhibition obtenues avec l'héparine).
Ouantité de Produitinhibltion ~;
IC 1772 Héparine 1 ~g/ml culture 25% 20%
10 ~g/ml " ; 45~o 60%
25100 ~g/ml " 70~ 80%
On constate une activité dans ce modèle expéri~
mental très proche de celle de l'héparine standard.
- INHIBITION DE LA PROLIFERATION DES CEL~ULES MUSCULAIRES
LISSES (CML) IN VIVO : MODELE DU CATHETER BALLON.
Modèle exPérimental :
L'expérience est menée sur des rats mâles Sprague Dawley âgés de 5 mois et pesant environ 500 g. ~ -Les animaux sont anesthesiés et l'endothélium de l'artère carotide gauche est dénudé par le passage ~-~32~8 . ...
intraluminal d'un cathéter ballon à embolectomie introduit dans la branche externe de la carotide.
Le produit à tester ou une solution témoin stérile est administré en infusion continue dans de la solution lactosée de Ringer dans la veine jugulaire gauche (utilisation d'une pompe osmotique à infusion (Alzet) placée sur le dos de l'animal). Le traitement est poursuivi pendant 4 semaines à raison de 2,5 ul/heure. La dose administrée a été de 1 mg/kg/heure.
Après 28 jours les animaux sont anesthésiés et les artères carotides prélevées. A 17, 9 et 1 heure avant l'anesthésie, les animaux reçoivent une injection intra~
péritonéale de thymidine tritiée.
Les résultats sont exprimés par le contenu en D~A dans les carotides droite (CD) lésées et gauche (CG) non lésées selon le mode de calcul suivant ~
..
DNA~ animaux tralt~s Inhibit~on (~) ~ 1 DNA~ an~maux contr~le X lO0 DNACG- DNACD
DNA~
DNACD
':
(voir A.W. Clowes et M.M. Clowes, Labor. Investig., 1985, 52 (6), ~12-616). :: ~ :
Résultats :
Dans un premier essai portant sur 10 animaux, on constate avec le produit testé IC 1772 une inhibition proche de celle de l'héparine d'environ 50%.
~
~ : ,... .
-~ ~3279~8 .
29 ~ -~
. INHIBITION DU SYSTEME ~U COMPLEMENT
L'héparine inhibe la génération de la C3 con-vertase amplificatrice alterne du complément, en inhibant la formation du complexe bimoléculaire entre les protéines C3b et B.
L'effet de l'héparine et du produit IC 1772 sur la liaison C3b-B a été étudié en utilisant des protéines ~arquées à 25I (125I-B) et des érythrocytes de moutons porteurs de protéine C3b (ESC3b).
On appelle IC50 la concentration d'héparine ou de l'oligosaccharide testé nécessaire pour inhiber 50~0 de la formation du complexe C3b-B.
Cette mesure est faite in vitro, da~s un système de protéines purif iées .
. Svstème ex~érimental On incube des EsC3b (0,75-2,5 x 107) dans différentes concentrations de I-B dans un tampon ~-véronal contenant 0,1~ de gélatine et 5mM Mg2 pendant 30 mn à 30' C.
Des échantillons de 70 ~l, en double poux chaque réaction, sont déposés sur 300 ~l d'un mélange de dibutylphtalate tMerck-Clevenot, France) et dinonylph-talate (Co~er, Paris) (7:3 v/v) dans des tubes de poly-propylène de 0,5 ml.
Les tubes sont centrifugés pendant une minute à ;
8000 g dans un microfuge Beckman (Beckman, Paris), puis coupés juste au-dessus des precipités. La radioactivité
du ligand lié est comptée.
Le produit IC 1772 a été dosé comparative~ent à
l'héparine. Les résultats exprimés en IC 50 sont les suivants :
~ C 1772 : 0,4 ~g/ml Héparine standard : 0,5 ~g/ml , . . .
,. .
- Temps de saiqnement :
Le produit est administré chez le lapin par voie intraveineuse à la dose de 5 mg/kg, 15 minutes et une heure avant l'expérience.
Le modèle expérimental est celui de Cade, tel que décrit par Cade et al dans Thromb. Res. 35, 613-625, 1986.
Les essais effectués montrent que le produit n'entraîne aucune augmentation du temps de saignement à
la dose de 5 mg/kg par voie intraveineuse.
- Etude de l'activité ~ntithrombotique de IC 1772 Le modèle utilisé est le suivant :
Les animaux sont anesthésiés avec 70 mg/kg de Ketaset ( ) (Bristol Lab, Syracuse, NY) par voie intramusculaire. Par une technique chirurgicale, on isole une longueur de 2 cm sur les veines jugulaires droite et gauche. On injecte par voie intraveineuse dans la veine marginale de l'oreille le produit à tester, 5 minutes exactement avant l'injection d'une substance thrombogénique, par exemple un mélange de complexe concentré prothrombonique et de venin de vipère venum (PCC/RVV). Au bout de 20 secondes on effectue la ligature de la veine jugulaire, et après 10 mn de stase, on retire les segments de veine que l'on place dans le sérum physiologique, puis on évalue le degré de formation de caillot selon une échelle de O à 4 (4 représente un caillot unique sans érythrocytes libres) (FAREED, J.
WALENGA, J.M., KIUMAR, 2. and ROCK, A. "A modified stasis thrombosis model to study the antithrombotic actions of heparin and its fractions. Sem. Thromb. Hemost. 11(2), 155-175, 1985).
IC 1772, administrë par voie intraveineuse, à
la dose de 1 mg/kg à un groupe de 10 lapins, a montré une très bonne activité antithrombotique chez tous les anlmaux.
400, OH (1/10- du volume réactionnel).
Le produit est ensuite testé pour ses caractéristiques :
. Taux de sulfatati~n (déterminé selon Helbert J.R. ~t Marini M.A., Biochemistry, 1963, 2, 1101-1106).
Le rapport S03/COO est de 2,2 à 2,4.
. Activités anti-IIa et anti-Xa :
- TCK (1) : 4 u/mg - USP (2) : 13 u/mg Activité anti-IIa (3) ; 12 u/mg - Activité anti-Xa (4) (Yin et Wessler): 8 u/mg - Activité anti-Xa (sur substrat chromogène -. " . . , ~32~
S 2222 en système purifié) : 1 u/mg Les ref~rences des systèmes utilisés pour effectuer les mesures sont les suivantes : -~
(1) : R.R. Proctor et S. Rapaport - AM. J. Clin. .
Pathol., 1961,36 , 212-219.
(2) : XXIe Pharmacopée américaine.
~3) : Mesurée par l'allongement du temps de thrombine.
(4) : E.T. Yin, 5. Wessler, J.V. Butler - J. Lab. Clin.
Med., 1973, 81, 298-310.
:
MISE E~ EVIDENCE DE CYCLES D'ACI_ES URONIOUES O~VERTS
ENTRE C2 ET C3 : ~.
La dégradation de Smith à pH 3 et 100- C ~
pendant 1 heure d'une solution à 5~~0 d'IC 1772 provoque la .~.
coupure spécifique des chaines oligosaccharidiques au ~
niveau des acides uroniques ouverts entre C2 et C3. Il en ~:
résulte une baisse du poids moléculaire moyen du produit, .
observée par gel filtration sur TSK 2000 avec détection :~
réfractométrique.
Les résultats sont exprimés de la manière ~ :
suivante : ~ .
- Mna représente le "number average molecular weight" tel que défini par W.W. YAU, J.J. KIRKLAND et D.D. ~LY ~in Modern size-exclusion liquid chromatrography, Wiley :
Interscience Publication) du produit testé tel que;
- Mnb représente le "number average molecular weight " .
après que l'on ait procédé à la dégradation de Smith comme indiqué ci-dessus;
- (Mrla/Mn~,) - 1 donne le nombre de sites sensibles à
cette dégradation de Smith par chaine oligosaccharidique, ce qui équivaut au nombre d'acides uroniques ouverts entre CZ et C3.
L'essai a été réalisé sur deux lots de produits IC 1772 : :
. . . : . ~ ~
, ,~ :
. - . . .
,: ' : ' ~ ~ 3279~
Mna 5503 5573 Mnb 3896 3745 (Mna/Mnb) - 1 0,4 0,5 On constate donc que, dans les conditions de l'analyse IC 1772 contient un acide uronique ouvert toutes les deux chaînes, au moins.
':
/ , ~;~
/ :
-~2796~
2 5 :
On rapporte, ci-après, les résultats obtenus concernant:
1. Les activités anti-IIa et anti-Xa, in 5 vitro, dans dif~erents systèmes.
2. Les temps de coagulation par la throm-bine (TCT).
1/ - Activités anti-IIa et anti-Xa, in vitro _. . , ~
IC 1772 Héparine ESSAI u/mg Standard u/mg ~
_ _ ::
Activite anti-IIa3 16 160 Activite anti-IIa (sur substrat36 160 chromogène S 2238 en système puri~ié) ;
Activité anti-IIa (sur substrat 1 160 - ;
chromogène S 2238 en système plasmatique) Activite anti-Xa4 (Yin et 12 - 15 160 Wessler) Activité anti-Xa (sur substrat 2 - 3 160 chromogène S 2222 en système purifié) Activité anti-Xa (sur substrat 5 - 10 160 chromogène S 2222 en système plasmatique) _ . .
Les réferences des systèmes utilisés pour effectuer les mesures sont les suivantes:
1/ R.R. Proctor et S. Rapaport - Am. J. Clin. Pathol., 1961, 36, 212-219.
2/ XXIème Pharmacopée américaine.
3/ Mesurée par l'allongement du temps de thrombine.
4/ E.T. Yin, S. Wessler, J.V. Butler, J. Lab. Clin~
Med., 1973, 81, 298-310.
~L327~8 2/ -TCT :
On rapporte dans le tableau 1 ci-après, les résultats sous forme de temps de coagulation exprimé en secondes, de 3 essais effectués avec les 3 types de plas-mas utilisés pour étudier l'activité APTT. Le contrôle est effectué en milieu plasmati~ue normal. Les résultats correspondent à la moyenne de deux essais indépendants.
TA~LEAU 1 ~g/ml Plasma normal Plasmas déplétés en ATIII HC II ATIII et HCII
2,5 36 26 24 22 300 300 ~0 22 On constate aux doses de 5 et surtout 10 ug/ml un allongement du temps de thrombine qui semble dépendre de HCII.
- INHIBITION DE LA PROLIFERATION DES CELLULFS MUSCULAIRES
LISSES (CML) IN VITRO.
Modèle exPérimentaL :
Les cellules musculaires lisses tCML) pro-viennent d'un segment abdominal de l'aorte de rat Sprague Dawley. De petits morceaux de media sont mis en culture en milieu RPMI-1640 additionné de 20~o de sérum de veau foetal (SVF). Au bout de 1 à 2 semaines, les CML migrent hors des tissus et commencent à proliférer.
5-8.103 CM1 sont mises en culture dans des plaques multi-puits. Après 24 heures, on arrête leur croissance par un lavage suivi de l'addition de milieu RPMI ~ 2% de plasma déplaquetté (ou RPMI -~ 0,4~~ de SVF) pendant 72 heures.
Les cellules sont alors replacées pendant 5 à 7 jours en milieu RPMI additionné de 20% de SVF avec ou sans le composé à tester, ce dernier à différentes ~3279~8 concentrations.
La croissance nette des CML, dans les essais témoins ou additionnés des produits à tester, est obtenue en soustrayant le nombre de cellules au départ du nombre de cellules à la fin de l'expérience (mesure en duplicate par compteur Coulter).
Le ~~ d'inhibition est donné pa~ la formule suivante :
10 ~ d~inh~bit~on ~ ~l crolssance nette des cellules testees . ~ . X 1 00 croissance nette des cellules t~mo~ns ~:
(voir Castellot et al., J. Cell. Biol., 102, 1986, 151979-1984).
Les résultats obtenus selon la concentration de IC 1772 en culture sont les suivants (à titre comparati~
on rapporte les valeurs d'inhibition obtenues avec l'héparine).
Ouantité de Produitinhibltion ~;
IC 1772 Héparine 1 ~g/ml culture 25% 20%
10 ~g/ml " ; 45~o 60%
25100 ~g/ml " 70~ 80%
On constate une activité dans ce modèle expéri~
mental très proche de celle de l'héparine standard.
- INHIBITION DE LA PROLIFERATION DES CEL~ULES MUSCULAIRES
LISSES (CML) IN VIVO : MODELE DU CATHETER BALLON.
Modèle exPérimental :
L'expérience est menée sur des rats mâles Sprague Dawley âgés de 5 mois et pesant environ 500 g. ~ -Les animaux sont anesthesiés et l'endothélium de l'artère carotide gauche est dénudé par le passage ~-~32~8 . ...
intraluminal d'un cathéter ballon à embolectomie introduit dans la branche externe de la carotide.
Le produit à tester ou une solution témoin stérile est administré en infusion continue dans de la solution lactosée de Ringer dans la veine jugulaire gauche (utilisation d'une pompe osmotique à infusion (Alzet) placée sur le dos de l'animal). Le traitement est poursuivi pendant 4 semaines à raison de 2,5 ul/heure. La dose administrée a été de 1 mg/kg/heure.
Après 28 jours les animaux sont anesthésiés et les artères carotides prélevées. A 17, 9 et 1 heure avant l'anesthésie, les animaux reçoivent une injection intra~
péritonéale de thymidine tritiée.
Les résultats sont exprimés par le contenu en D~A dans les carotides droite (CD) lésées et gauche (CG) non lésées selon le mode de calcul suivant ~
..
DNA~ animaux tralt~s Inhibit~on (~) ~ 1 DNA~ an~maux contr~le X lO0 DNACG- DNACD
DNA~
DNACD
':
(voir A.W. Clowes et M.M. Clowes, Labor. Investig., 1985, 52 (6), ~12-616). :: ~ :
Résultats :
Dans un premier essai portant sur 10 animaux, on constate avec le produit testé IC 1772 une inhibition proche de celle de l'héparine d'environ 50%.
~
~ : ,... .
-~ ~3279~8 .
29 ~ -~
. INHIBITION DU SYSTEME ~U COMPLEMENT
L'héparine inhibe la génération de la C3 con-vertase amplificatrice alterne du complément, en inhibant la formation du complexe bimoléculaire entre les protéines C3b et B.
L'effet de l'héparine et du produit IC 1772 sur la liaison C3b-B a été étudié en utilisant des protéines ~arquées à 25I (125I-B) et des érythrocytes de moutons porteurs de protéine C3b (ESC3b).
On appelle IC50 la concentration d'héparine ou de l'oligosaccharide testé nécessaire pour inhiber 50~0 de la formation du complexe C3b-B.
Cette mesure est faite in vitro, da~s un système de protéines purif iées .
. Svstème ex~érimental On incube des EsC3b (0,75-2,5 x 107) dans différentes concentrations de I-B dans un tampon ~-véronal contenant 0,1~ de gélatine et 5mM Mg2 pendant 30 mn à 30' C.
Des échantillons de 70 ~l, en double poux chaque réaction, sont déposés sur 300 ~l d'un mélange de dibutylphtalate tMerck-Clevenot, France) et dinonylph-talate (Co~er, Paris) (7:3 v/v) dans des tubes de poly-propylène de 0,5 ml.
Les tubes sont centrifugés pendant une minute à ;
8000 g dans un microfuge Beckman (Beckman, Paris), puis coupés juste au-dessus des precipités. La radioactivité
du ligand lié est comptée.
Le produit IC 1772 a été dosé comparative~ent à
l'héparine. Les résultats exprimés en IC 50 sont les suivants :
~ C 1772 : 0,4 ~g/ml Héparine standard : 0,5 ~g/ml , . . .
,. .
- Temps de saiqnement :
Le produit est administré chez le lapin par voie intraveineuse à la dose de 5 mg/kg, 15 minutes et une heure avant l'expérience.
Le modèle expérimental est celui de Cade, tel que décrit par Cade et al dans Thromb. Res. 35, 613-625, 1986.
Les essais effectués montrent que le produit n'entraîne aucune augmentation du temps de saignement à
la dose de 5 mg/kg par voie intraveineuse.
- Etude de l'activité ~ntithrombotique de IC 1772 Le modèle utilisé est le suivant :
Les animaux sont anesthésiés avec 70 mg/kg de Ketaset ( ) (Bristol Lab, Syracuse, NY) par voie intramusculaire. Par une technique chirurgicale, on isole une longueur de 2 cm sur les veines jugulaires droite et gauche. On injecte par voie intraveineuse dans la veine marginale de l'oreille le produit à tester, 5 minutes exactement avant l'injection d'une substance thrombogénique, par exemple un mélange de complexe concentré prothrombonique et de venin de vipère venum (PCC/RVV). Au bout de 20 secondes on effectue la ligature de la veine jugulaire, et après 10 mn de stase, on retire les segments de veine que l'on place dans le sérum physiologique, puis on évalue le degré de formation de caillot selon une échelle de O à 4 (4 représente un caillot unique sans érythrocytes libres) (FAREED, J.
WALENGA, J.M., KIUMAR, 2. and ROCK, A. "A modified stasis thrombosis model to study the antithrombotic actions of heparin and its fractions. Sem. Thromb. Hemost. 11(2), 155-175, 1985).
IC 1772, administrë par voie intraveineuse, à
la dose de 1 mg/kg à un groupe de 10 lapins, a montré une très bonne activité antithrombotique chez tous les anlmaux.
Claims (22)
1. Composition d'héparines de bas poids moléculaire, pratiquement totalement dépourvue d'activité
anticoagulante, caractérisée en ce qu'elle est essentiel-lement formée de fragments dépourvus d'enchaînements disaccharidiques du type acide uronique non sulfaté-glucosamine N-sulfate, ces fragments répondant à
la formule générale I suivante :
R-(X-Y)n-R' (I) dans laquelle - X représente soit un motif acide iduronique sulfaté de formule II :
soit, à raison de 1 motif pour 2 chaînes au moins, un motif acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique) non sulfate, ouvert entre les carbones en positions 2 et 3, de formule III :
(III) - Y représente un motif D-glucosamine de formule IV :
(IV) . R1 étant un atome d'hydrogène ou un groupe -SO3-. R2, un groupe d'environ au moins 90%, et . R3, étant un groupe -SO3- ou un atome d'hydrogène, la proportion des groupes -SO3- étant d'environ au moins 70%, - R représente un atome d'hydrogène ou un motif:
(V) . R4 à R3 étant tels que définis ci-dessus, et . R4 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'acide uronique.
-R' représente soit un atome d'hydrogène, soit un motif acide uronique naturel, soit un résidu d'acide uronique modi-fié au cours de l'oxydation périodique et dont les fonctions aldéhydes ont été réduits en alcools, avec 7 ? n ? 15, pour les espèces majoritaires, ce qui correspond à des chaînes de PM de 4800 à 9000 environ, et ses sels pharmaceutiquement acceptables.
anticoagulante, caractérisée en ce qu'elle est essentiel-lement formée de fragments dépourvus d'enchaînements disaccharidiques du type acide uronique non sulfaté-glucosamine N-sulfate, ces fragments répondant à
la formule générale I suivante :
R-(X-Y)n-R' (I) dans laquelle - X représente soit un motif acide iduronique sulfaté de formule II :
soit, à raison de 1 motif pour 2 chaînes au moins, un motif acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique) non sulfate, ouvert entre les carbones en positions 2 et 3, de formule III :
(III) - Y représente un motif D-glucosamine de formule IV :
(IV) . R1 étant un atome d'hydrogène ou un groupe -SO3-. R2, un groupe d'environ au moins 90%, et . R3, étant un groupe -SO3- ou un atome d'hydrogène, la proportion des groupes -SO3- étant d'environ au moins 70%, - R représente un atome d'hydrogène ou un motif:
(V) . R4 à R3 étant tels que définis ci-dessus, et . R4 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'acide uronique.
-R' représente soit un atome d'hydrogène, soit un motif acide uronique naturel, soit un résidu d'acide uronique modi-fié au cours de l'oxydation périodique et dont les fonctions aldéhydes ont été réduits en alcools, avec 7 ? n ? 15, pour les espèces majoritaires, ce qui correspond à des chaînes de PM de 4800 à 9000 environ, et ses sels pharmaceutiquement acceptables.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente en moyenne
3,3 charges par unités disaccharidiques.
3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente, en HPLC déterminée avec une colonne TSK 2000 SW couplée à un détecteur photométrique 205 nm, en utilisant Na2SO4 0,5M comme solvant, avec un débit de 1 ml/min:
- un poids moléculaire moyen de l'ordre de 6000 à
7000 Da, 70% des espèces étant comprises entre 4800 et 9000 daltons, et 90% entre 3600 et 11000 Da, - un poids moléculaire au sommet du pic de l'ordre de 6000 à 6500 Da, - moins de 5% de chaînes inférieures à des dodécasaccharides, - moins de 5% de chaînes au-delà de 11.000.
3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente, en HPLC déterminée avec une colonne TSK 2000 SW couplée à un détecteur photométrique 205 nm, en utilisant Na2SO4 0,5M comme solvant, avec un débit de 1 ml/min:
- un poids moléculaire moyen de l'ordre de 6000 à
7000 Da, 70% des espèces étant comprises entre 4800 et 9000 daltons, et 90% entre 3600 et 11000 Da, - un poids moléculaire au sommet du pic de l'ordre de 6000 à 6500 Da, - moins de 5% de chaînes inférieures à des dodécasaccharides, - moins de 5% de chaînes au-delà de 11.000.
4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit poids moléculaire moyen est de l'ordre de 5800 à 7000 Da.
5. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit poids moléculaire moyen est de l'ordre de 6000 Da.
6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit poids moléculaire au sommet du pic est de l'ordre de 5500 à 6500 Da.
7. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit poids moléculaire au sommet du pic est de l'ordre de 5500 à 6000 Da.
8. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le spectre RMN est conforme à
celui de la figure 5.
celui de la figure 5.
9. Composition formée de fragments d'héparine selon l'une quelconque des revendication 1 à
8, obtenus par fractionnement, à l'aide d'alcool en présence d'un sel minéral, d'un mélange résultant de la dépolymérisation de l'héparine par action d'une base forte sur des chaînes d'héparine soumises au préalable à l'action de periodate, suivie d'une réduction des groupements aldéhyde formés lors de l'oxydation periodique .
8, obtenus par fractionnement, à l'aide d'alcool en présence d'un sel minéral, d'un mélange résultant de la dépolymérisation de l'héparine par action d'une base forte sur des chaînes d'héparine soumises au préalable à l'action de periodate, suivie d'une réduction des groupements aldéhyde formés lors de l'oxydation periodique .
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que les fragments qu'elle renferme se présentent sous la forme de sels de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium.
11. Procédé de préparation de compositions d'héparines de bas PM telles que définies dans la revendication 1, caractérisé en ce que:
a) on traite une solution aqueuse d'héparine à une concentration finale de 0,5 à 5% (p/v) avec de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 à 4% (p/v) à un pH de 4,5 à 6,5 à une température de 0 à 10°C;
b) on traite les chaînes d'héparine ainsi obtenues avec un base forte à une molarité finale en base de 0,1 à 0,3 N, à un pH supérieur à 11 environ;
c) on traite les fragments de dépolymérisation ainsi obtenus avec un agent réducteur;
d) après élimination éventuelle de l'agent réducteur en excès, on précipite les fragments réduits après addition d'un sel minéral à l'aide d'un solvant alcoolique;
e) on traite une solution aqueuse du précipité ainsi obtenu additionné d'un sel minéral, par de l'alcool;
f) on récupère le produit précipité ainsi formé et on transforme éventuellement le sel correspondant à la base forte utilisée dans un autre sel pharmaceutiquement acceptable.
a) on traite une solution aqueuse d'héparine à une concentration finale de 0,5 à 5% (p/v) avec de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 à 4% (p/v) à un pH de 4,5 à 6,5 à une température de 0 à 10°C;
b) on traite les chaînes d'héparine ainsi obtenues avec un base forte à une molarité finale en base de 0,1 à 0,3 N, à un pH supérieur à 11 environ;
c) on traite les fragments de dépolymérisation ainsi obtenus avec un agent réducteur;
d) après élimination éventuelle de l'agent réducteur en excès, on précipite les fragments réduits après addition d'un sel minéral à l'aide d'un solvant alcoolique;
e) on traite une solution aqueuse du précipité ainsi obtenu additionné d'un sel minéral, par de l'alcool;
f) on récupère le produit précipité ainsi formé et on transforme éventuellement le sel correspondant à la base forte utilisée dans un autre sel pharmaceutiquement acceptable.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison les étapes suivantes:
- l'oxydation ménagée de l'héparine réalisée en faisant réagir de l'héparine, en solution aqueuse à une concentration finale de 0,5 à 5% (p/v) avec un sel de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 à
4% (p/v) à un pH situé entre 4,5 et 6,5, à une température de 0 à 10°C, durant environ 15 à 48 h. à
l'abri de la lumière, - la dépolymérisation des chaînes d'héparine obtenues, par addition d'une base forte selon une quantité conduisant à une molarité finale en base de 0,1 à 0,3 N environ, à un pH supérieur à 11 environ, - la réduction des fragments de dépolymérisation à
l'aide d'un agent réducteur et, après élimination éventuelle de l'agent réducteur en excès, - la récupération des fragments d'héparine réduits par précipitation à l'aide d'un milieu solvant dans lequel ils sont insolubles, - l'isolement des fragments recherchés par fractionnement à l'aide d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'une solution aqueuse obtenue en remettant en solution dans l'eau le précipité précédemment isolé et en récupérant le précipité formé
- l'oxydation ménagée de l'héparine réalisée en faisant réagir de l'héparine, en solution aqueuse à une concentration finale de 0,5 à 5% (p/v) avec un sel de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 à
4% (p/v) à un pH situé entre 4,5 et 6,5, à une température de 0 à 10°C, durant environ 15 à 48 h. à
l'abri de la lumière, - la dépolymérisation des chaînes d'héparine obtenues, par addition d'une base forte selon une quantité conduisant à une molarité finale en base de 0,1 à 0,3 N environ, à un pH supérieur à 11 environ, - la réduction des fragments de dépolymérisation à
l'aide d'un agent réducteur et, après élimination éventuelle de l'agent réducteur en excès, - la récupération des fragments d'héparine réduits par précipitation à l'aide d'un milieu solvant dans lequel ils sont insolubles, - l'isolement des fragments recherchés par fractionnement à l'aide d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'une solution aqueuse obtenue en remettant en solution dans l'eau le précipité précédemment isolé et en récupérant le précipité formé
13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que dans l'étape d'oxydation periodique, on utilise l'héparine et le sel de l'acide periodique selon des quantités conduisant à des concentrations finales respectives de 1,5% à 5% et de 1,5 à 2,5% (p/v).
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11, 12 ou 13, caractérisé en ce qu'on réalise l'étape d'oxydation periodique à pH 5, à 4°C.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11, 12 ou 13, caractérisé en ce que le sel de l'acide periodique est du metaperiodate de sodium.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11, 12 ou 13, caractérisé en ce que, pour éliminer le periodate résiduel, on effectue une dialyse avec des boyaux de dialyse ayant une porosité de 3 à
4000 Da, pendant environ 15 h.
4000 Da, pendant environ 15 h.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11, 12 ou 13, caractérisé en ce que la récupération des fragments d'héparine réduits est réalisée en ajustant le pH à 7, puis après addition d'un sel minéral, en ajoutant un alcool.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit sel minéral est du NaCl.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11, 12 ou 13, caractérisé en ce qu'on dissout, à raison de 5% (p/v), les fragments précipités réduits d'héparine dans de l'eau additionnée d'un sel minéral, afin d'avoir une concentration finale de 1%, le pH de cette solution ayant été ajusté à 3,5, et qu'on ajoute 0,85 volume d'un solvant alcoolique.
20. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme une quantité efficace d'une composition selon la revendication 1, en association avec un véhicule pharmaceutique.
21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une solution concentrée, injectable, stérile, contenant de 10 à 150 mg/ml environ, lorsqu'elle est destinée à l'injection sous-cutanée, ou de 10 à 100 mg/ml environ, lorsqu'elle est destinée à
l'injection intraveineuse ou à la perfusion.
l'injection intraveineuse ou à la perfusion.
22. Réactif biologique, utilisé comme référence ou étalon dans des études comparatives de différents systèmes physiologiques dans la régulation desquels les glycosaminoglycanes sont impliqués, caractérisé en ce que le principe actif est constitué
par la composition de fragments d'héparine selon la revendication 1.
par la composition de fragments d'héparine selon la revendication 1.
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