CA1330769C

CA1330769C - Procede pour extraire selectivement les metallo- proteines du lactoserum par adsorption et elution

Info

Publication number: CA1330769C
Application number: CA000570296A
Authority: CA
Inventors: Jacques Frankinet; Andre Peyrousset; Francois Spring
Original assignee: Societe National Elf Aquitaine; Entremont SA
Current assignee: Societe National Elf Aquitaine; Entremont SA
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1994-07-19
Anticipated expiration: 2011-07-19
Also published as: ES2024682B3; FI93163C; IE61993B1; DK332988A; IL86713A; FI882918A; AU604332B2; CN1020396C; DK332988D0; EP0298875A1; AR246166A1; JP2710283B2; GR3002578T3; ZA884267B; AU1813688A; IL86713A0; DK173506B1; US4946944A; FI93163B; FI882918A0

Abstract

. PROCEDE POUR EXTRAIRE SELECTIVEMENT LES METALLOPROTEINES DU LACTOSERUM PAR ADSORPTION ET ELUTION. Procédé pour extraite sélectivement les métallo protéines du lactosérum, par adsorption sur un support minéral poreux sous forme de grains, puis élution des métallo-protéines ainsi adsorbées au moyen de solutions, caractérisé en ce que les parois desdits grains sont recouverts d'une couche de polysaccharides aminés, présentant en surface des groupements fonctionnels acides.

Description

- 133~7~9 PROCEDE POUR EXTRAIRE SELECTIVEMENT LES METALLO- :
PROTEINES DU LACTOSERUM PAR ADSORPTION ET ELUTION.
L'invention concerne un procédé pour extraire sé-5 lectivement certaines proteines du lactosérum, à savoirles métallo- protéines, notamment celles qui fixent le fer, telles que la lactoferrine, la transferrine et la lactoperoxydase~
Comme on le sait, il existe plusieurs milliers de protéines. Le lactosérum en contient des centaines, dont quelques traces de métallo-protéines.
Par "métallo-protéines", on désigne des protéines 15 qui présentent une bonne affinité pour les métaux, no-tamment pour le fer. Ces protéines sont de plus en plus recherchées non seulement pour leur intérêt nutrition-nel, notamment comme apporteur biologique de fer chez les nourrissons (pour la lactoferrine~, mais surtout 20 pour leurs propriétés pharmacologiques, notamment comme agents antibactériens.
On connait d~jà plusieurs procédés d~extraction des protéines du lactosérum.
Dans le document GB-A-871 541, on a proposé d'ex-traire les protéines en général par mise en contact avec une résine échangeuse d'ions constituée par une base inerte (terres de diatomées), de grande surface spécifi-30 que, revêtue d~un gel échangeur (copolymère styrène-divinylbenzène). Cette technique ancienne permet d'ex-traire les prot~ines en bloc, sans s~lectivité.
Dans le document FR-A-2 505 615 (correspondant 35 connu US-A-4 436 658), on a proposé de récup~rer sélec-tivement les métallo-protéines recherchées, à savoir la lactoferrine et la lactoperoxydase, en percolant tout d'abord le lactosérum sur un support solide rigide, tel que notamment de la silice en milieu faiblement basique 5 (pH de 7,9 ~ 8,5), puis en éluant les protéines adsor-bées au moyen d~une solution acide. Ce procédé donne d'excellents résultats pour ce qui concerne l'extraction sélective. Mais il ne s'est guère développé, car le lactosérum traité prend immédiatement un caractère basi-10 que, qui le rend alors impropre à la consommation anima-le, sauf traitement ultérieur onéreux.
Dans le document FR-A-2 359 634 (correspondant américain connu US-A-4 100 149), on a proposé de mettre 15 en contact le lactosérum avec une résine échangeuse de cations constituée par un support minéral poreux, de granulométrie appropriée (silice sphérique), revetu d'un film de polymère synthétique réticulé portant des grou-pements échangeurs de cations représentés par des fonc-20 tions acides, telles que carboxylique, sulfonique ouphosphonique. Cette solution permet de récupérer des métallo-protéines mais associées à une très forte pro-portion d~immunoglobulines (voir notamment exemple 3 de ce brevet US-A-4 100 149 et exemple 7 ci-25 après). En outre, le rendement d~extraction en m~tallo-protéines est faible et le degré de puret~ de ces pro-téines est jugé insuffisant sur le plan économique, sauf encore à effectuer des traitements ultérieurs donc oné-reux.
Dans le document FR-A-2 319 299 (correspondants connus GB-A-l 544 867 et US-A-4 673 734), on a préconisé
d'extraire les protéines en général, dont on sait qu'il y en a plusieurs milliers, en les mettant en contact 35 avec un support minéral poreux revêtu en surface par un r~ r ~
biopolymère polysaccharique aminé. Cette solution qui donne d~excellents résultats pour la purification ou la séparation des macromolécules biologiques, telles que les gamma-globulines, l~hémoglobine, l~albumine, est 5 inopérante sur le lactosérum, car on fixe alors l'essen-tiel des protéines, mais on laisse passer les protéines à caractère cationique telles que les métallo-protéines.
De la sorte, cette technique ne peut pas convenir à la séparation sélective de ces métallo-protéines à partir 10 du lactosérum.
L~invention pallie ces inconvénients. Elle vise un procédé d~extraction des métallo-protéines du lactosé-rum, notamment celles fixant le fer, par adsorption sur 15 un support solide, puis ensuite élution des protéines adsorbées. Elle vise plus particulièrement un procédé
qui soit sélectif, économique et facile à mettre en oeuvre et surtout qui permette de récupérer vraiment sélectivement et économiquement les métallo-protéines 20 depuis le lactosérum, sans modifier celui-ci, c'est-à-dire tout en le laissant parfaitement utilisable, notam-ment dans l'alimentation animale, à la fois comme élé-ment nutritionnel et comme apporteur d'énergie, ce que l'on ne savait pas faire jusqu'alors.
,~ r~ ~r~
Ce proc~dé pour extraire ces métallo-protéines du lactosérum par adsorption sur un support minéral poreux sous forme de grains, puis élution des protéines ainsi adsorbées au moyen de solutions, se caractérise en ce 5 que les parois desdits grains sont recouvertes d'une couche de polysaccharide aminé, présentant en surface des groupements fonctionnels acides.
Dans la suite de la description et dans les re-~0 vendications, par ~oly~accharides aminés", on désigne amine un biopolymère~ayant un caractère cationique, tel que le dextrane, l'amidon, la cellulose, l'argose et les autres sucres en -oses. Selon l'invention, ces biopolymères présentent en outre des groupements fonctionnels acides, 15 tels que notamment carboxyliques ou sulfoniques.
En d'autres termes, l'invention consiste pour l'ex-traction spécifique des métallo-protéines depuis le lactosérum, dont on sait qu~il contient des centaines de 20 protéines, ~ avoir sélectionné un support minéral po-reux, tel ~ue par exemple de la silice, dont la carac-téristique essentielle est, d~une part, d~etre recouvert non plus d'un polymère synthétique mais d'un biopoly-mère particulier ~ savoir un polysaccharide aminé, ;
25 alors que l'on savait (FR-A-2319299) que ce type de biopolymère à caract~re cationique ne convenait pas pour cette extraction, et d~autre part, de présenter des groupements acides, alors que l'on savait par ailleurs (FR-A-2359634) que ces groupements acides conduisaient à
30 une sélectivité médiocre sur le plan industriel, du fait d'un rendement et d~une pureté jugés insuffisants. ~
- .
Alors que l'état de la technique dissuadait d'uti-liser des biopolymères, l'invention consiste justement à
35 avoir constaté de mani~re totalement inattendue que ~ ~3~
l'utilisation de biopolymères spécifiques, greffés en l'occurence par des groupements acides, permet non seu-lement d~extraire sélectivement les métallo-protéines du lactosérum, mais surtout de bien les séparer des imuno-5 globulines et enfin d~opérer avec un rendement et undegré de pureté nettement améliorés et dans des condi-tions compatibles avec un processus industriel. Cette sélection est d'autant plus surprenante que rien dans l'état de la technique donnait à l'homme de métier 10 l'idée de combiner les enseignements d'un matériau à
caractère cationique avec un autre matériau à caractère anionique, ces éléments étant contradictoires par na-ture.
Il est d~autant plus surprenant que l'on puisse 15 obtenir ce succès en enrobant des grains poreux de si-lice au moyen d~un polysaccharide greffé par des groupe-ments acides et ce, pour obtenir une telle s~électivité, alors que l'on savait que ce type de résine échangeuse de cations pr~sentant des fonctions acides était prohibé
20 (voir document précité FR-A-2 359 654 page 1 lignes 17 et suivantes) comme résine échangeuse de cations pour les protéines (préjugé d~ordre technique vaincu).
Ainsi, l'invention réside dans une sélection par-ticulière pour une sélectivité précise dans une large 25 famille, alors que l'état de la technique dissuadait une telle sélection qui permet de résoudre avantageusement et économiquement un problème, tout en réduisant les coûts de fabrication et en augmentant la productivité.
D~une manière tout à fait inattendue, les Deman-30 deurs ont constaté que le choix de ces grains minérauxporeux spécifiques permettent :
- d'une part, d~améliorer considérablement le ren-dement d'extraction (deux fois plus) ;
- d'autre part et surtout, d'extraire spécifique-35 ment et s~lectivement et avec facilité les métallo-pro-1 3~
téines recherchées du lactos~rum, sans qu~elles soient mélangées à d'autres protéines, et ce avec un rendement et un degré de pureté très nettement améliorés (écono-mies de temps et de moyens et gain de productivité) ;
- enfin, ne pas affecter le lactosérum traité qui reste ainsi intégralement apte à la consommation et garde toute sa valeur nutrionnelle.
Cette sélection permet en outre d'opérer dans des 10 conditions de pH voisines de la neutralité, notamment dans des conditions qui permettent de recueillir sélec-tivement et économiquement lesdites métallo-protéines sous forme soluble.
On pourrait penser que la sélection de l'invention 15 est un mélange des enseignements antérieurs. D~une part, ces enseignements se contredisent et d'autre part et surtou~, on sait qu'un produit chimique n'est pas un mélange de ses différents constituants.
Avantageusement, en pratique :
- le polysaccharide recouvrant les parois des grains minéraux est du dextrane ou un dérivé du dextra-ne, tel qu'un dérivé aminé ;
- de pr~férence, on fait appel à des composés du 25 type diéthylaminoéthyldextrane (DEAE) de poids molécu-laire d~au moins 104, de préférence 105 à lOG daltons ;
- les groupements acides sont des groupements car-boxyliques ou sulfoniques ; avantageusement, ces groupe-ments acides sont fixés au biopolymère saccharide par 30 des radicaux divalents hydrocarbonés, notamment par des groupements alkylènes, tels que méthylène ou propylène ;
- les grains min~raux poreux sont avantageusement des oxydes min~raux, tels que de préférence.des grains sph~riques de silice, obtenus notamment par pyrogénisa-35 tion ;
!;- - , . ... , " . ~ ~ , . ,; . . ' ~ i - ~33~ ~ ~9 - les grains de silice sont des grains sphériques dont :
. la granulométrie est comprise entre dix et mille micromètres, de préférence compris entre cent et trois cent micromètres ;
. la surface spécifique est comprise entre un et quatre cents m2/g, de préférence com-pris entre quinze et deux cents m2/g ;
. le diamètre moyen des pores est compris entre cinq et deux cents nm ;
- dans une vaxiante, le lactosérum est traité
d'abord par un premier passage sur des grains de silice d'un premier groupe du type en question contenant des groupements acides échangeurs de cations faibles, tels 15 que notamment des groupements carboxyliques et ce, pour retenir la lactoferrine, puis dans un second temps, le lactosérum ainsi traité passe en série sur des grains d'un second groupe comprenant des groupements acides échangeurs de cations forts, tels que notamment des 20 groupements acides sulfoniques, et ce pour retenir la lactoperoxydase ;
; - le lactosérum est un lactosérum doux, c'est-~-dire dont le pH est compris entre 6,3 et 6,6 ; dans une variante, on péut faire appel à un lactosérum acide, 25 c'est-~-dire à un lactosérum dont le pH est compris entre 4,3 et 4,6.
~;
~:~ La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des 30 exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre : indicatif et non limitatif, ~ l~appui de la figure uni-que annexée qui est une représentation schématique som-maire d~une installation conforme pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
3 ~
Exemple 1 :
Dans un réservoir (1), on introduit quatre cent litres de lactosérum (2) doux de fromagerie (pH 6,4) que l'on agite lentement pour le maintenir homogène. De -5 manière connue, on refroidit ce lactosérum à une tempé-rature comprise entre 3 et 8~C. Ce lactosérum (2) con-tient par litre environ 74,6 mg de lactoferrine et 50,5 mg de lactoperoxydase.
Dans un réservoir (3), on introduit vingt litres d'une première solution (4), contenant environ trois grammes par litre (g/l) de chlorure de sodium (pH neu-tre).
Dans la colonne (5), on place quatre kilos de grains sph~riques de silice (6) poreuse commercialisée par IBF-Biotechnics sous la marque déposée "CM-SPHERO-DEX-LS" ayant une granulométrie comprise entre 100 et 300 microns, un diamètre de pore voisin de 100 nm, une 20 surface spécifique d~environ 25 m2/g et dont les parois des pores sont recouvertes d'une fine couche continue de DEAE dextrane, greffée par des groupements acides car-boxyliq~es.
Dans un premier temps, on laisse tout d'abord s'écouler le lactosérum (2) du réservoir (1) sur la silice (6) en quatre heures trente minutes.
Le lactosérum trait~ (7) est récupéré dans un ré-30 servoir (8), puis est envoyé en (9) pour être concentré
et séché de manière usuelle. Ce lactosérum dont le pH
n'a pas éte modifié contient encore la plus grande par- : ;
tie des protéines. De la sorte, il peut être utilisé tel que dans l'alimentation animale comme apport nutrition-35 nel. ;;-"'~
13 ~ 3 g Lorsque tout le lactosérum (2) a traversé la silice (6), on bascule la vanne (10) pour envoyer sur la colon-ne adsorbée désignée par la référence (11) les vingt litres de la première solution (4) de lavage à pH neu-5 tre.
La silice (6) a adsorbé les métallo-protéines re-cherchées du lactosérum (2).
Une fois que la solution de lavage (4) est passée, on introduit dans le réservoir (3) une seconde solution saline (12) de quinze litres, contenant treize grammes par litre de chlorure de sodium.
On laisse cette seconde solution (12) s'écouler librement sur la colonne (11) adsorbée. Par la vanne (13), on récupère le liquide de lavage dans le bac (14).
On lave ensuite la silice adsorbée (6,11) au moyen d'une troisième solution saline (32) de quatorze litres à
20 45 g/l de chlorure de sodium envoyée depuis le réser-voir (3) et que l'on récupère dans un bac séparé (15).
Le contenu du bac (14) est envoyé dans un autre bac (20), puis de là dans un appareil d~ultra-filtration 25 (21), où l'on in~ecte de l'eau de dialyse (31) pour diminuer la teneur en minéraux. On fait passer le con-tenu sur des membranes oryaniques (33) de diamètre de pores 104 daltons à une température comprise entre 12 et 50~C.
On envoie ensuite le contenu du bac (15) dans le bac (20), et on procède de la même manière.
.... .
~ 3 ~
10 ' Les permeats obtenus sont récupérés en (34), notam-ment pour être réutilis~s dans d~autres élutions.
Les retentats (22) sont récupérés en sortie de 5 l'appareil (21) d~ultra-filtration. Grâce à une vanne (23), ces retentats (22) peuvent être envoyés :
- soit à un appareil de lyophilisation (24) où on récupère,les métallo-protéines recherchées en bloc ;
- soit à une tour de séchage (35) où on les récu-10 père également en bloc ;
- soit de préférence à un appareil de fractionne-ment par chromatographie (25) d'~change d'ions sur un gel organique du type commercialisé par IBF BIOTECHNIX
sous la marque d~posée "SP-TRISACRYL LS~ pour être frac-15 tionné dans chacune des deux protéines recherchées,respectivement la lactoferrine (26) et la lactoperoxy-dase (27).
On procède ensuite à un lavage de la silice (6) par 20 l'eau (29) envoyée depuis le réservoir (3). Ce lavage est suivi d~un autre lavage acide (solution N/10 d'acide chlorydrique). La silice (6) est enfin reg~néree par une ,~:;.
percolation de vingt litres d~une solution d'acétate de sodium à pH 5.5.
Ainsi, pour quatre cent litres de lactosérum (2) de départ, on obtient : ,;i - d'une part, pratiquement quatre cent litres de lactosérum extrait (9) apte à être utilisés directement ; --dans l'alimentation animale ayant toute sa valeur nutri- ~
30 tionnelle ; ~ -, - d'autre part : . :
. 23,6 grammes de lactoferrine, soit un taux d~extraction de 79 % avec un degré de pureté : -., par rapport aux autres protéines présentes dans cette solution d'au moins 80 % ;
::
:
. 2,8 grammes de lactoperoxydase, soit un taux d'extraction de 14 % avec un degré de pureté
supérieur à 50 %.
Exemple 2 :
On répète l'exemple 1 en injectant dans l'eau de dialyse (31) une solution aqueuse à deux grammes par litre (2 g/l) d'ammonium sulfate de fer stabilisé par l'acide ascorbique. On sature ainsi en fer les protéines recherchées, ce qui augmente leur efficacit~ nutrition-10 nelle.
Exemple 3 :
On répète l'exemple 1 aux variantes ci-après.
On remplace tout d~abord la silice (6) par une même quantité de grains de silice poreuse, commercialisée sous la dénomination SP-SPHERODEX-LS (marque déposée), dont les parois sont recouvertes d'une couche de DEAE
dextrane, greffée par des goupements sulfo-propyle et 20 dont les caractéristiques physiques sont voisines de celles des grains de l'exemple 1.
On traite 306 litres d~un lactos~rum doux de froma-gerie de pH 6,4 contenant 46,2 mg/l de lactoferrine et 25 44,7 mg/l de lactoperoxydase. Le débit est réglé à cent litres/heure. Dans le réservoir (3), on introduit dix-sept litres d'une première solution (4) contenant trois grammes/litre de chlorure de sodium.
L'éluat (12) est constitué par vingt-huit litres d~une solution saline à 15 g/l de chlorure de sodium et permet de récupérer en (14) 1,23 g de lactoferrine et 0,6 g de lactoperoxydase.
Y~
~ 3 ~

Le deuxième éluat (32) est constitué par vingt-sept litres ~ 45 g/l de chlorure de sodium et permet de récu-pérer en (15) 2,7 g de lactoferrine et 5,1 g de lactope-roxydase.
Enfin, on traite par un autre éluat (30) constitué
par vingt et un litres contenant 60 g/l de chlorure de sodium. On obtient 4,0 g de lactoferrine.
Ainsi, on a pu récupérer :
. 7,93 g de lactoferrine (rendement : 57 %), . 5,7 g de lactoperoxydase (rendement : 42 %l-Exemple 4 :
On répète l'exemple 1 en remplaçant le lactosérum ' doux de fromagerie par 198 litres de lactosérum acide de,~' ' cas~ïnerie de pH : 4,5, contenant 84,0 mg/l de lactofer-rine et 37,0 mg/l de lactopéroxydase.
On règle le débit de passage du lactosérum sur les , grains de silice à groupements carboxyliques à cent -'',-litres/ heure. ' ' ""."'"
Comme précédement, on lave avec vingt litres d'une 25 solution (4) contenant 3 g/l de chlorure de sodium. , i ' La première élution (12) est effectuée au moyen ~ '~
d'une solution de vingt litres contenant 15 g/l de chlo-rure de sodium. On obtient 2,08 g de lactoferrine et '~ '~
30 1,6 g de lactoperoxydase.
La deuxième élution (32) est effectuée au moyen d'une solution de trente et un litres contenant 45 g/l de chlorure de sodium. On obtient 3,7 g de'lactoferrine.
3 ~

Ainsi, on récupère :
. 5,78 g de lactoferrine (rendement 35 ~), . 1,6 g de lactoperoxydase (rendemnt 22 ~).
Exemple 5 :
On r~pète l'exemple 3 avec 180 litres de lactosérum acide de caséïnerie (pH = 4,5) contenant 87 mg/l de lactoferrine et 33 mg/l de lactoperoxydase.
La solution de lavage saline (4) contient douze litres à 3 g/l de chlorure de sodium.
La première élution (12) est effectuée au moyen d'une solution de trente huit litres contenant 15 g/1 de 15 chlorure de sodium. On obtient 1,3 g de lactoferrine et 0,16 g de lactoperoxydase.
La seconde élution (32) est effectuée au moyen de vingt huit litres d~une solution à ~5 g/l de chlorure de 20 sodium. On obtient 3,0 g de lactoferrine et 3,9 g de lactoperoxydase On r~cupère ainsi :
. 4,3 g de lactoferrine (rendement : 27 ~), . 4,06 g de lactoperoxydase (rendement : 69 %).
ExemPle 6 :
Cet exemple illustre un traitement selon l'inven-tion effectué par passage du même lactosérum sur deux 30 colonnes en série contenant chacune un type différent de grains de silice dont les parois sont recouvertes d'une couche de polysaccharide aminée.
Sur une première colonne contenant quatre kilos de 35 grains de silice CM SPHERODEX LS identiques à ceux de l'exemple 1 (groupements carboxyliques), on percole en deux heures et demi 250 litres d~un lactosérum doux de fromagerie contenant 81,5 mg/l de lactoferrine et 52,0 mg/l de lactoperoxydase.
S
On stocke le lactosérum ainsi traité dans un réser-voir approprié, puis on lave la silice (6,11) avec quinze litres d~une solution aqueuse (4) contenant 3 g/l de chlorure de sodium.
On élue ensuite tout d'abord avec une première solution (12) de quinze litres ~ 13 g/l de chlorure de sodium et on recueille une solution contenant 1,87 g de lactoperoxydase et 0,85 g de lactoferrine, puis au moyen 15 d'une seconde élution (32) de seize litres à 45 g/l de chlorure de sodium permettant de recueillir alors 19,0 g de lactoferrine.
On a donc recueilli ainsi :
. 19,85 g de lactoferrine (rendement : 98 ~) . 1,87 g de lactoperoxydase (rendement : 14 %).
Les 250 litres de lactosérum stockés déj~ traités sont ensuite percolés sur une seconde colonne contenant 25 2,5 kilos de grains SP SPHERODEX LS (groupements sulfo.
propyle), identiques aux grains de l'exemple 3 avec un débit de 100 litres/heure.
Ce lactosérum qui ne convient pratiquement plus de 30 lactoferrine, contient encore 42,1 mg/l de lactopero-'xydase.
Après percolation, on lave la colonne avec une solution de 20,5 litres de chlorure de sodium à 3 g/l.
~ 3 3 ~ ~ ~ 9 lS
On ~lue ensuite par trente sept litres d'une solu-tion de chlorure de sodium ~ 15 g/l et on obtient 1,7 g de lactoperoxydase.
On élue ensuite par une solution de dix-huit litres à 45 g/l de chlorure de sodium et on obtient 9,3 g de lactoperoxydase.
On a donc obtenu par ce deuxième traitement onze 10 grammes (llg) de lactoperoxydase soit la quasi-totalité
contenue dans le lactosérum initial (11 + 1,87 = 12,87 pour 13 gtl).
En d~autrestermes, les deux opérations successives 15 de percolation du lactos~rum sur deux types de grains de silice diff~rents, permettent donc d~extraire la quasi-totalité de la lactoferrine et de la lactoperoxydase présentes dans le lactosérum initial.
Exemple 7 :
On répète l'exemple 1 en remplaçant la silice "CM-SPHERODEX-LS" par une silice poreuse ~hydrophile~ de mêmes caract~ristiques physiques qu'~ l'exemple 1.
Cette silice poreuse hydrophile est recouverte d'un 25 polymère acrylique synthétique greff~ par des groupe-ments acides carboxyméthyl, conformément aux enseigne-ments du document FR-A-2 359 634 cit~s dans le préam-bule.
Sur 2,5 kilos de cette silice, on fait passer trois centS litres de lactosérum doux (pH 6,4) avec un d~bit de 75 litres/heure contenant 50,2 mg/l de lactoferrine et 33,8 mg/l de lactoperoxydase.
~3~
"

Après ~lutions, on obtient :
- d'une part, trois cent litres de lactosérum (9) utilisable comme élement nutritionnel pour le bétail ;
- d'autre part :
. cent vingt grammes de protéines diverses contenant essentiellement des immunoglobu-lines, . 7,1 g de lactoferrine (rendement : 47 %
contre 79 % ~ l'exemple 1, avec un degré de pureté inférieur à 40 % contre 80 %, . 0,9 g de lactoperoxydase (rendement : 9 %
contre 14,9 ~), avec un degré de pureté
: inférieur à 30 % contre 50 % à l~exemple 1.
De la sorte, cette lactoferrine et cette lactopero-xydase sont essentiellement mélangées à une très forte proportion d~immunoglobulines, d~où il faut les séparer.
En d'autres termes, non seulement le rendement de 20 cet état de la technique est nettement inférieur en m~tallo-protéines, mais également le taux de pureté de ces métallo-protéines est moindre, ce qui nécessite alors des opérations ultérieures de purification.
ExemPle 8 :
On répète l'exemple 1 avec une silice poreuse iden-tique à celle mise en oeuvre à l'exemple 1, mais recou-verte d~un film de diéthylaminoéthyldextrane (DEAE), commercialisé par IBF-BIOTECHNICS sous la dénomination 30 DEAE SPHERODEX-LS (enseignements du brevet US-A-4 673 ' 734).
On fixe alors l'essentiel des protéines du lactosé-rum à l'exclusion de la lactoferrine et de la lactopero-xydase recherchées qui se trouvent entraînées avec le 35 lactosérum (9).
.:
11 3 ~ ~ 7 ~

Ce deux derniers exemples illustrent parfaitement l'effet surprenant de la sélection selon l'invention.
L'utilisation de silice recouverte d'un biopolymère 5 aminé mais non greffé ne donne pas les résultats recher-chés, à savoir l'extraction spécifique de la lactofer-rine et de la lactoperoxydase.
La mise en oeuvre de ces mêmes grains sphériques de 10 silice mais revê~us d'un polymère synthétique présentant des groupements fonctionnels acides, permet de recueil-lir les métallo-protéines, mais combinées à d'autres protéines et avec un rendement et un degré de pureté
nettement insuffisants (voir exemple 7 ci-dessus).
Le procédé d~extraction de la lactoferrine et de la lactoperoxydase selon l'invention se disti~gue des pro-cédés proposés jusqu'alors, essentiellement par :
- l'extraction sélective de ces deux protéines 20 recherchées mais difficiles jusqu~alors à extraire, car pr~sentes en trop faible quantité et mélangées à d'au-tres protéines ;
- la simplicité de mise en oeuvre ;
- le rendement d~extraction particulièrment élevé
25 (près de deux fois plus élevé) que les rendements de l'état de la technique, voire notamment exemples 7 et 8;
- la pureté des métallo-protéines extraites ~levées du fait sans doute de la meilleure spécificité d~extrac-tion.
Les métallo-protéines récupérées de la sorte, à
savoir notamment celles qui fixent le fer, telles que la lactoferrine et la lactoperoxydase, peuvent être utili-sées avec succès dans les applications connues ~ ce jour, telles que par exemple :
3~7~

en nutrition animale pour la protection du tube digestif et le rôle de facteur de croissance ;
dans le domaine vétérinaire pour l'activité anti-infectieuse intestinale et au niveau mammaire ;
dans le domaine diététique et de la nutrition humaine, notamment comme vecteur de fer ;
dans le domaine pharmaceutique : ophtalmologie, ~.
gastro-entérologie, paradontologie, dermatolo-gie, gynécologie..
.
~; '

Claims

19 Les réalisations de l'invention au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est reven-diqué sont définies comme suit:

1/ Procédé pour extraire sélectivement la lactoferrine et la lactopéroxydase du lactosérum, par adsorption sur un support minéral poreux sous forme de grains, puis élution des métallo-protéines ainsi adsorbées au moyen de solutions, caractérisé en ce que les parois desdits grains sont recouvertes d'une couche de polysaccharides aminés, présentant en surface des groupements fonctionnels acides carboxyliques ou sulfoniques.

2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide aminé recouvrant les parois des grains minéraux est du dextrane.

3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le dextrane est du diéthylaminoéthyldextrane.

4/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les groupements acides sont fixés au polysaccharide aminé par des radicaux divalents hydrocarbonés.

5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les radicaux divalents hydrocarbonés sont des groupements alkylènes.

6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les grains minéraux poreux sont des grains sphériques de silice dont:
- la granulométrie est comprise entre dix et mille micromètres;
- la surface spécifique est comprise entre un et quatre cents m2/g;
- le diamètre moyen des pores est compris entre cinq et deux cents nanomètres.

7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le lactosérum est traité tout d'abord par passage sur des grains de silice dont lesparois sont recouvertes d'une couche de polysaccharides aminés présentant en surface des groupements carboxyliques, puis en ce que le lactosérum ainsi traité passe en série sur des grains de silice dont les parois sont recouvertes d'une couche de polysaccharides aminés présentant en surface des groupements acides sulfoniques.

8/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lactosérum est un lactosérum doux.