CA2201399A1 - Adenovirus defectifs comprenant un gene therapeutique et un gene immunoprotecteur - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux dérivés des adénovirus, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne plus particulièrement des adénovirus défectifs dont le génome comprend un premier ADN recombinant contenant un gène thérapeutique et un second ADN recombinant contenant un gène immunoprotecteur.

Description

W 096tl2030 2 ~ ~ 1 3 ~ /rh~5,~1326 ADENOVIRUS DEFECTIFS COMPRENANT UN GENE THERAPEUTIQUE ET
UN GENE IMMUNOPROTECTEUR

La présente invention cnn~n~ de nou~ v~;l~ viraux, leur pr~palalion et leur u~ilisation en ll~àp,e g~niql~. Elle CQ~ e é.~l~m~nt les coll,pasi~ions }~ ti~ue~e cc...~ ..l lesdits v~ul~ virau~ Plus particulièrement, la présente 5 i~lv~Loll c~-~u~ des adénovirus recQmbin~nte cornme vecteurs pour la thérapie g~ ique.
La thérapie génique cQnC l~ à corriger une ~lefi~ience ou une ~nom~lie (m1~t~ti-~n, ~A~l~ion ~he~ e~ etc) par introcl-lctic)n d'une inform~tinn génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette if ~ ;on génétique peut être introduite soit 10 in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule mo lifj~e étant alors réintroduite dans l'a~,P~;.c...e, soit direc~m~nt in vivo dans le tissu appfoprié. Dans ce second cas, di~ ll~s t~hn;lues ~ parmi lesquellee des techniques diverses de transfection ;"~ dee ~...pl~ d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines m)cl~ires (Kaneda et al., S~i~nce 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., P~AS 84 (1987) 7413), l'emploi de 1;POSQ~S (Fraley et aL, J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus f~Ce~l....t'l-t, l'ernploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une ;v~ pl~...ell~se à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, dir[é~nLs v~s ont été testés pour leur cdl~ac;lé à inÇe~er certaines populations20 QP~ ~s. En particulier, les ie~viLus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-~sociPs, et les ad~nov~s.
Parmi ces virus, les adénov..us prPsPnt~nt certaines propriétés i,llérr,ssAnles pour une l1tiliQ~ir~n en thérapie génique. Notamment ils ont un spectre d'hôte assez large, sont ~r~h' . .l'~ r des cellules ql~iP~sc-pntes et ne s'intègrent pas au ~nf~me

2~ de la cellule infectée. Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb envirc~n. Leur ~Pnorne col~ nd n~ ---P--I une séquence i~lvel~éerépétée (lTR) à leur ~Ah~lllilé, une séquence d'Pnr~rs;~ti~ n, des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1). Les rD;n~ ..x gènes précoces sont les gènes El (Ela et Elb), E2, E3 et E4. Les princ~ir~t1x gènes tardifs sont les gènes Ll à L5.
CQn~rte tenu des propriétés des adénovirus .~ I;onl~ep~Q ci-dessus, ceux-ci ont déJà été u~lisés pour le IL~n~,feLl de gènes in vivo. A cet effet, Lrre~n~s vecteurs dérivés des adénovirus ont été piep~" ~COl~ dirr~ 7 gènes (B-gal, OTC, cc-lAT, cytokines, etc). Dans ~ c ne de ces coh~-,l.u~,lions, l'adénc)vi~s a été mo~ifié de ~ ~ .

WO 96/12030 2 ~ ~ 1 39 9 PCT/FR95/01326 e à le rendre ;-~c~1 lP~ de ~q~ dans la cellule infectée. Ainsi, les cor~u;ions ~ite~s dans l'art ~nterie -~ sont des adénovirus délétés des régions El (Ela et/ou Elb) et evPntl1~P~ m~nt E3 au niveau clP~equellp~s est insérée une seq~1Pnce d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Cholidhul~ et al., Gene 50 (1986) 161).
Cepen~1Anl, comme pour tous les virus connl.e, l'~ .aLon d'un adénov,. us sauvage induit une réponse ;.. ~ e (Routes et al., J. Virol.
65 (1991) 1450). Cette immvn~i~it~ a e~lPm~nt été obse~v~e c~l-.e~.,l;v~."ent à
l;on d'adénov~is rec~mhin~nte déÇe~tiîs pour la l~plic~l;on (Yang et al., PNAS (1994) 4407). L'un des roles majeurs du système ;.. ~I.n;L~ con~;~le en effet à
détruire les élPmPnte non-soi ou soi-altéré. L'~A...;ni;,l.aLion-d'un vecteur de thérapie génique d'origine adénovirale introduit des motifs non-soi dans l'or~,,..-;~n.e De meme, les cellules ulr~Lées par un tel vecteur et ~ nL de ce fait un gène L~,e,a~eulique eYo~PnP deviennent des P1PmPnte soi-altérés. Il est donc normal que le système 15 ;-...----n;~ réagisse contre ces vecteurs et cellules ;nr~ees comme s'il s'agissait de corps étrangers. Cette réponse ;....n ..;1~ contre les oellules infectées con;~ ve un obst~ble majeur au développement ~ces v~;le~ viraux pu~,le (i) en in~ nt une destruction des oellules infectées elle limite la durée d'~A~I~sion du gène thé,~peulique et donc l'effet thé~pelulique, (ii) elle induit ~llr~ .,1 une réponse 20 ;..~ lo~e i,n~,lanle, et (iii) elle entra~ne l'P-limin~ti-~n rapide des oellules infec~éee après des injestions repPtéP~. Ainsi, l'expression de la ~e~l~cto~ ~ codée par un adénovirus recQmhin~nt ~I--.;n.~ é dans le muecle de souris irnm~ln~p~ le~e est réduite à des ~U~UA ...;n;-.. .. 40 jours après l'injection (Kass-Eisler et al., PNAS 90 (1993) 11498). De même, rtA~;on de gène llal~rélés par des adéllvv,l~e dans le foie est ei~ificr~l;ve;lllent réduite après 4 moi~e (Li et al., Hum. Gene Ther. 4 (1993) 403) et l'~A~ssion du facteur IX l~relé par adénovirus dans des hépatQcytes de chiens h~.norl.;lPs disparait 100 jours après l'injection (Kay et al., PNAS 91 (1994) 2353).
Il semble donc que i'P~ploit~ti~n en thérapie génique de v~;l~s dérivés des 30 adénovirus ;l~liq.JP la p~cihilité de réduire la lépoQse ;~rn~ è contre ces v~u,~ ou les oellules infP~t~P$~ Ceci con~tihle pf~i~---~nL l'objet de la p~se,lle invention. La présente invention c~nr~ne en effet de nol veau~ vecteurs dérivés des adénovirus p~;nl;~n~ une imm1ln~i~it~ très réduite voire sl rP~; ~ Les vecteurs 22J13`,~9 de l'invention sont donc particuliele-lænl ap~ priés pour des ~plir~tion.e de thérapie g~l~ique, nc.~ ,.., .,l chez l'h-)mm~
Un pl~nier objet de la p,eseI,le il~v~nli~n con~ne un adénovirus défectif dont le ~nome co,l,~l~nd un premier ADN recrmhin~nt c~ lenA~I un gène s ll.e.~ l;q ~e et un second ADN recomhin~nt cc~ntPn~nt un gène ;.. -~-oprotecteur.
La présente il~v~nlion découle en partie de la mise en évidence qu'il est poQsihle d'incolpo~l plusieurs gènes d'intérêt dans des adénovirus, et d'obtenir une t;Al,l~sion im~l~nle de ces dirrel~,l~ gènes dans les cellules infectées. La p~se"le invention découle é~lPrnPnt de la collshu~lion de v~leul~ adénoviraux c~p~hles 10 d'inco~po~er plusieurs gènes IhP~ l;ques dans des c~n-litit ne pçrmPtt~nt leur t;A~ ssion optim~lp~ Elle découle encore de la mise en évidence que la co-expression, dans la cellule infectée, de certains gènes est capable d'induire un effet immnnc)pr~tecteur et ainsi de faire écl~apper les v~;leul~ de rinvention et/ou les cellules infectées au système ;.. ~ ;~. La présente invention fournit ainsi des5 Vl~;leul;j viraux prés~nt~nt des propriétés imml~nolc~qlnP.s et th~ pei~l;ques tout à fait av~nta~eP,s en vue de leur ~Itili.e~tiQn en thérapie génique ou c~ ire.

L~s ADN recomhin~nte selon la ~ sente invention sont des fr~gmPnte d'ADN
c )nten~nt le gène c~nQ;~éré (thél~peulique ou immllnQp~vlecleu~) et év~ntuellPm~Pnt 20 des signaux permett~nt son eA~Iession, cor~lluils in vitro puis ins~es dans le ~nC)me de l'adénovirus. Les ADN re~nmhin~nte utilisés dans le cadre de la présente illv~ Lion peuvenl être des ADN con.l l~ment~ire$ (ADNc), des ADN ~onomiques (ADNg), ou des constructions hybrides c~neiet~nt par ~Ypmple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plllQ;~lr.e introns. Il peut é~lPm~nt s'agir de séq~lences ~ylllL~:liques ou 25 s~l~y..ll.~ ue-e. Ces ADN peUVt~lll être d'origine hllm~in~, ~nim~h, végétale, b~c~PIiennP" virale, etc. De manière particuliè~llæl,l avantageuse, on utilise des ADNc ou des ADNg.
L'insertion des gènes c~nQ;derés sous forme d'ADN r~mhin~nte selon -l'inv~Lon offre une plus grande flPYihili~ dans la co~h,lction dcs ^1Pn~virus~ et 30 permet un m~illPIlr contrôle de l'eAp~ion desdits gènes.
Ainsi, les ADN recomhin~nte (et donc les deux gènes d'intérêt) incorpol~s dans les v~;le~ adénovirauY selon la présente invention ~venl être ~gPnc~s de dirr~ es manières.

wo 96/12030 2 ~ ~ 3 -~ 9 PCTIFR95/01326 ILs ~e.lt tout d'abûrd être insérés en un même site du ~nom~ de l'adénovirlLs, ou en des sites dir~ls, sP~ n~ s. En particulier, les ADN
rP~mhin~nt.C peUV~ être inséres au moins en partie au niveau des régions El, E3 et/ou E4 du ~PnomP~ de radénuvl~us, en ~I r~- ~Pnt ou en su~plPm~nt de s~ s 5 virales.
~ s p~vt:lll en~suite compûller chacun un promoteur transcriptionnel, identique ou dirri:lell~ Cette c~nfi~-~ation pennet d'obtenir des ~ ,eauA d'~A~;ûQ
supérieurs, et offre un m~lleur contrôle de l'~.~p,~;on des gènes. Dans ce cas, les deux gènes peuvt:llt être insérés dans la même orie~ ;Qn ou dans les oriPnt~ti~nc 0 opposées.
Ils peUV~ e~lP.mPnt COI~ ;Iu~ une entité ~ c~ ;onnP-lle unique. Dans cette confi~lr~tion, les deux ADN re~mhin~ntc sont contigus et pocitic~nnp~s de telle sorte que les deux gènes soient sous le contrôle d'un prornot~lr unique, et ~lonnP,nt lieu à un ARN prPmp-cca~pr unique. Cette disl)osilion est av~nta~e puisqu'elle permet15 d'utiliserun seul ~u~no~ ;p~
Enfin, l'emploi d'ADN rec~mhin~nt.c selon rinv~lt;ol~ permet d'utiliser des promoteurs hal~scl;~ plc de nature dil~ , et nolA~...nent des pn~moleurs forts ou faibles, régulés ou c~ ,f;r~ tissu-sperifi~ue~s ou ubiqliil~s, etc.
Le choix des ,ci~ d'~ ~"~sion et de la p~Citic~n n~s~;live des ADN
20 recomhin~nt.c est particulie~-lænl iln~o,l~,l pour obtenir une eA~ion élevée du gène thé,a~e~lique et un effet immlmoprotecteur ."~,~.

Cc.mme gène thP.~ ue u1ili.c~hle pour la co,~,l~;lion des v~leu.~ de la présente i"v~ ioll, on peut citer tout gène codant pûur un produit ayant un effet 25 th~lapelllique. Le p~oduit ainsi codé peut être une ~téine, un pepti~e, un ARN, etc.
S'~gi~nt d'un produit protéique, il peut être h~molo~e v~à-vis de la oellule cible (c'est-à-dire un produit qui est n~rm~lPmPnt PYrrimP dans la oellule cible lorsque oelle-ci ne ples~llle aucune p~tholc~ie). Dans ce cas, l'e~ion d'une protéine permet par . ~;...p1e de pallier une eA~ ion ;~ fr;~.le dans la oellule ou 30 l'~ssion d'une protéine lna~ive ou faiblement active en raison d'une m<Ylifi~h-)n, ou encore de s~p~;...~r ladite plul~ e. Le gène thP~ ue peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cP~ ire, ayant une st~hilite accrue, une activité m~lifi ~, etc. Le produit protéique peut é~lPmpnt être hétérologue vis-à-vis de la oellule cible.
Dans ce cas, une pn~l~ine ~-ln;..~ee peut par ~..ple ComI)lLetp~ ou appoiler une ~ZO 1 399 Wo 96/12030 Pcr~Rsslol326 activité déficiente dans la oell-we, lui p~.. ~ de lutter contre une pathologie, ou ~in~..l~ une ~lse ;.~ æ
Panni les p~dwL~ protéiques ~c~ ;ques au sens de la p~ le i~lv~nlio~l, on peut citer plus particuliè~ nl les eY~y~ncs, les dérivés ~llin~, les hormones, les lymrh~rin~: int~lellhnPs, "ll~rél~,ls, TNF, etc (FR 9203120), les [acl~ de nce, les ne~ ~ ou leurs plCC~ ou e~ ,l.es de ~ cse~ les fac~,..~ trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléi~u~h;ne, etc; les apolipop~léilles: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (F~ 93 05125), la J~ l~ne ou une miniJ~ vpl~.ne (FR 9111947), la p~léille CFTR
10 associée à la mucon~close, les gènes s~,pp,c~ de ~ .P!~.`i: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des ra_lcu.~ iq!les dans la co~-l~ticn: Facteurs VII, VIII, IX, les gènes il~le~vènanl dans la lép~iOn de l'ADN, etc.
Comme indiqué plus haut, le gène Illélapelltique peut é~l~mrnt être un gène 15 ou une séquence ~nti~n.~, dont l~e~ion dans la cellule cible permet de contrôler l'ê~.~ion de gènes ou la h~nscripLion d'ARNm ~-lh)l~ires~ De telles séquences peuvelltJ par ~Y~mrlP, être ~ ~.;lP~ dans la cellule cible en ARN cQmrl.o...~ s d'ARNm c~ ires et bloquer ainsi leur ~ducticn en p~lé~le, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les ~ colllpreAnent é~lPrn~nt les séquences 20 codant pour des ribozymes, qui sont r~p~hl~s de détruire sélectivement des ARN
ciUes (EP 321 201).
- C~mm~ indiqué plus haut, le gène theI~i)eulique peut é~lrmrnt comporter un ou pll-~~-~ gènes codant pour un peptide ~ntigrnique, capable de générer chezl'homme ou ranimal une ~éponse ;.. ln;l~;.e. Dans ce mode particulier de mise en25 oeuvre, rinvention pennet donc la r~li~tic-N soit de vaccins soit de tr~it~rnPnt.
imm~moth~a~liques appliqués à l'homme ~)u à l'animal, llol~-n.n~ contre des m-ic~or~ r~s, des virus ou des c~nr~ Il peut s'agir nol~ l de peptides nillues ~ec ;r;quæ du virus d~pstein Barr, du nrus HlV, du virus de l'hépatite B(EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore sperifiques de tumeurs (EP 259 30 212). Dans ce mode de ré~li~tion, aucune ,e~llse ;~ e ne sera générée contre le vinLs ve~ OU la oellule ir~fectée, mais l'~nhgrne selPchc~nne sera produit et seul sll~hle d'être ;....n...,~g~n~
Les gènes Ih~ ~pe.,l;lves peuvellt être d'o~igine hllm~ine, ~nim~le~ végét~lr, nn~, virale, etc. Ils p~uvellt être obtrm)s par toute technique connue de Wo 96/12030 2 2~ 1 3~ 9 PCT~R95/01326 l~omme du métier, et ~ h..~ nl par qih1a~ de banques, par synthèse chimique, ou encore par des mét~od~ mixtes ;.~h-~..l la m~ifi~tion ~himi~lue ou ~ e de seq.l~nces obl ~1l)es par ~ih1age de b&~ques.
Le gène imm-mop,o~ utilisé dans le cadre de la pn~nl~ illV~lliOl~ peut 5 être de dir~,~ types. Plus p~ nl;~11em~nt, la dem~n(1~esse a ~ ;nl~ nl montré
que l'l)tili~3tion d'un gène dont le produit agit sur l'activité du r~mpleYe majeur d'hi~.Y\p~l;hi1ité (MHC) ou sur l'activité des cyl~ines p~...ell~;l de reduire con~i~l~h~ nt, voire de supp~ ær toute réaction ;.""~ ;~ à l'encontre du vecteur ou des oellules infectées. Les vb.;leul~ ainsi obtenus sont particulièrement 10 av~nt~P~Y puisqu'ils pos.sè~Pnt une durée d'action beaucoup plus longue in vivo et donc un effet thP,~pe. .l ;que plus impo~ , qu'ils sont dépoL,i v,ls d~effet ;nnA~ lo;~
et imm--nogpnp~ et qu'ils peuvelll être utilisés avec un nombre d'injections réduit.
Les oe11111Ps p~se--l~l- ;CPS de l'~ntigPnP p~Pnlf~-,l des peptides ~ntigPni~lues à
leur s~rf~x en ~ n- avec des mo1Pr~1Pc du complexe majeur 15 d'hi~Qao~p~l;hilit de dasse I (MHC-I). Les réce~ "s des oellules T .;~lo.dques (CTL) recl nn~i~-l les complexes formés entre lesdites mo1~11Pc MHC classe I et lesdits peptides ~nti~pni~lues. Cette l~nnAi~nce induit la mort des cellules par les CI'L. La ~ AnAe~ a mA;n~n~nt montré qu'il est possible de co-exprimer dans un vecteur-adénoviral un gène thé,a~eulique et un gène capable d'altérer l'æ.~ession des 20 mc1~-1P~ MHC-I, et que cette co~ ssion produit un effet thé,apel,lique durable sand ré~Gsion~ ;n~ ln;l~ c ou infl~mmAtoire. Panni les gènes dont le produit agit sur - l'activité du o~mr1PY~ majeur d'hi~~ ;bi1ité, on préfère utiliser dans le cadre de r~nvt;lltion des gènes dont le produit irdlibe au moins partipllpmp-nt l'~n~ion des protéines du MHC ou la p~--l~ ntigenique. A titre d'~ p1r~ re:~es~ on peut 25 citer c~l ~ins gènes c~ dans la région E3 de l'adénovirus, le gène ICP47 du virus de l~erpès, ou le gène UL18 du cy~mégalovin~s.
La région E3 du gPn-lmP de l'adénovirus contient différentes phases de lecture qui, par épi~sage ~ ;f, lonnPnt n~ n~e à des protéines dirré,t:nles. Parmi celles-ci, la p~v~é,ne Gpl9k (ou E3-19k) est une protéine tr~n~ nh.~ ;.e ~lycu~ylée 30 ky~ ee dans la mPmh~n~ du reti~111lm çn~ cmique (RE). Cette protéine con~end un ~---h;ne luminal liant les m(l1~11~ du MHC-I et une eA~
c~p1~emique C-t~mins1e capable de lier les microt l~)1e-s (ou la tubuline), qui agit pour ancrer la plul~le gpl9k dans la m~mh~n~ du RE. Gpl9k est ainsi capable Wo 96/12030 PCT/FR95/01326 d'e...~ r l'~ion des m~ ,c MHC-I à la surface des oellules par in~ ion et s~ n au niveau du RE. C~p~n~1~n~, en l'ahs~nce de l~pli~ n virale, la p,o~ e gpl9k est faiblement .-1..;...~ par les ad~lovl.us. Le promoteur natif co-~;e~1 en effet ce,l~;ns ~ m~ntc de ré~ tion tels que des él~m~ntC de liaison de 5 type NF-kB qui limit~nt les a n-liticn.c d'~A~,ession de cette pl~ ~. Par ~ill~-r~, l'~;on de la gpl9k est é~l~m~nt c~n-l;l;onl-~ à la ré~li~ti-m d'un épissage nA~;r. L'in~cl; n dans les v~;~,"s de l'illv~l~ioll d'un ADN recombinant co..l~n~nl une séq,lel~ce (ADNc de p~elér~nce) codant pour la gpl9k perrnet de contrôler et d'~l;.n;~r l'~ ;on de ladite protéine. En particulier, remploi de 0 prc motel~s c n~ et la suppr~ion des autres phases de lecture permet d'~l-g...~ ,.e,ll l'~p~s~;on de cette protéine et de ~ cl~ir de la ~PpenrlAnre vis-à-vis de la ~pl;c~;oll virale et la présence d'PlPmPnt~ cle~ . Ceci permet de ~ e,~ particuli~ll-~-~ avantageuse de ~ er cnn~;d~ablement la lyse par les CTL des oellules in~ æs et ainsi d'~u~ ..ler et de prolonger la production in 15 vivo du gène th~ eul;que. Les PYemrlP-~ de la présente dPm~n~lP décrivent n.~l..n n~..l la co~huction d'un adénovirus défectif portant un ADN recomhin~nt )r~n&lll un gène marqueur sous contrôle du promoteur RSV et un second ADN
recrmhin~nt portant une séquence codant pour la protéine gpl9k sous contrôle du promoteur cc.l~ ;r RSV (Ad-Bgal-gpl9k). Les résultats présentés démontrent que 20 les oellules il.~es par ce vecteur PyprimPnt la B-g~l~ctos;d~e à des niv~ux aussi élevés que des oellules infectées par un adénovirus ccntPn~nt uniquement le gène B-gal. Ceci montre que la plesel~ce du second ADN recomhin~nt n'affecte pas les n.~&u~ d'~ion du premier. Ensuite les résultats présentés montrent que les oellules infectées par radénvv.lus Ad-Bgai-gpl9k sont protégées contre la lyse par les 25 CTL, ce qui n'est pas le cas des oellules infectées par un adénovirus Ad-Bgal. De plus, la présence du second ADN recomhin~nt dans les vesteurs de l'invention inhihe r eyr~n~ n clonale de lymphocytes dirigés contre les cellules irfectées. Les vecteurs de l'lnv~ntion in~--i~nt donc une ré~ ~ion ~i~ifir~tive de la réponse ;.~ ...n;l~;~ par les CII contre les CPl pc infectées.
D'autres plul~ es codées par la région E3 du ~enome de l'adél~ovi~us telles que les pr~ es 10,4k et 14,~k p~..l~nl certaines propriétés il.lél~ es en vue deleur inco~l)ol~lioll dans les V~~ de l'invention.
Le gène ICP47 du virus de l'herpès :~.eY co~ e un autre gène ;... --o~rotecteur particulièl~nel.l inlél~ssa,~l au sens de la présente invention. Les ~20~99 Wo 96/12030 ~ Pcr~ss/0l326 oellules ~f~s par le virus de l'herpès ~mr1~x p~s~ nl une ~ n. e à la lyse induite par les CIL. Il a été montré que cette ~~ nl~ pOu~ail être collfSee par le gène ICP47, qui est capable de réduire l'~;on des mo1P~11ee MHC-I à la surface des çP11l~1ps L'inc~ n du gène ICP47 dans un ADN r~c mbin~nt selon 5 rillv~~ n permet e~1Pm~nt aux virus recomhin~nte de rinvention d'écl~apper au système ;.n.~
Le gène UL18 du cytcme~k~virus cnn~ v~ un autre ~enl~le préféré de gène immuno~lolec~ selon rinvention. Le produit du gène UL18 est capable de lierla B2-microglobuline (Bro~ne et al. Nature 347 (1990) 770). La B2-microglohuline est 10 rune des chaines des m~ e MHC-I. L'inco~po~alion du gène UL18 dans un ADN
--- recomh~in~nt selon rinv~.lioll permet ainsi de ~l;""~lJ~r le nombre de mo1~-1Pe de B2-microglob~line fo~ ;on~ e dans les cellules infectées par les virus de rinvention, et donc de ~ ;nl~ les c~parit~S de ces cellules à produire des molé~ulee MHC-I
compl~tee et fon~ nnellee. Ce type de construction permet donc de protéger les 15 cellules infectées de la lyse par les CTL.
Comme indiqué ci-avant, le gène imml)noplol~teu. utilisé dans le cadre de la présente inve~ n est, dans un autre mode de ré~lie~tion préféré, un gène dont leproduit agit sur l'activité ou les voies de si~li~tion des cy-toki~ee Les cytokines c ~r~ ent une famille de protéines sécrétées qui ~gi~e~nt comme des m~l,e~lles de 20 ei~li~ti~n pour le ~y~ e ;.~.~..~..;ls.;r~. Elles peuvelll attirer les oellules de ri.~ e, les activer, induire leur prolifération et même agir d~ e..~ sur les cellules infectées pour les tuer.
Parmi les gènes dont le produit agit sur ractivité ou les voies de ,ei~1ic~ti~n des cyt-~l inPs, on peut citer les gènes ,nlet ~ l sur la synthèse des cytnt in~e, ou 25 dont le produit est capable de séque~lLel les cytol~nes, d'~nt~ niePr leur activité ou d'interférer avec les voies de ~ li~tion- interoellulaires. A titre d'PY~mr1e îéLell~iels, on peut citer en particulier le gène BCRFl du virus d'F.rstein Barr, les gènes crmA et crmB du virus de cowpo~, les gènee B15R et B18R du virus de la vaccine, le gene US28 du cytomeg~1QvinLe, les gènes E3-14,7, E3-10,4 et E3-14,5 de 30 l'adér.~v~s.
Le gène B15R du virus de la vaccine code pour une protéine soluble capable de lier l';nl~.lP-.,kin~-lB (la forme sécrétée de rint~rlel~kin~ l), etainsi d'e...lxi he~ cette cytokine de se lier à ses réceple~ ires. L'interleuWne-l est en effet l'une des WO 96/12030 ~ 3 9 9 PcrlFR95/01326 p~n~ièles ~l~ines pr~duites en ièponse à une agression ~nti~énique~ et elle joue un r~le tres inll)o~ dans la ~i~sli~hl n du stsème ;~ n~ è au début de l'infecti~n La pf~ihilite dll~ca~poîeL le gène B15R dsns un V~UL selon l'invention permet aV~nt~ 1 de réduire l'activité de l'IL lB, no~ ..l sur l'a livalion des cellules ;,~.. ~n;L?;.eS, et de ce fait de pl~leger ~ lPm~nt les oellules inçêe~es par les virus de l'invention contre une léponse ;............ ..~ Ai~e im~la"le. Des gènes homologues au gène B15R peuvenl ég~lPm~nt être utilisés, têl que le gène --- du virus de c~. p~JA.
De la même manière, le gène B18R du virus de la vaocinê code pour une p~lê~e homolo~l~ au récepl~u~ de rint-p~rle- '~ine-6. Ce gène, ou tout h(lmQlogue 10 f~nrtic)nnPl, est é~lem~nt Iti~ hle dans les væl~u ~ de rifiv~lion pour inhiber la liaison de l'int~lP~inP-6 sur son recepte~lr cPlh1l~ire et ainsi réduire loç~lPmPnt la eponse;.~.... n;~;.e.
Toujours de la même façon, le gène crmB du virus de cow~x peut être av~nt~ ~se~nP~-~ utilisé. Ce gène code en effet pour une p~teil~e sécrétée capable de - lS lier le INF et d'entrer en col-~t;l;~n avec les lécepleu,~ du INF à la surface des cP~ LPs. Ce gène permet donc, dans les virus de l`invention, de ~l;,,,;n~r lor~lpmpnt la conn~ lion de TNF actif ~, ~cept;hle de dé~re les oellules infect~Ps. D'autres gènes codant pour des protéines ç~r~hles de lier le TNF et d'inhiber au moins partiellement sa liaison sur ses léce~êul~ peuvenl ég~lPmPnt être utilisés.
Le gène cnnA du virus de C<~A code lui pour une pn~lé~e ayant une activité d'inhibiteur de p~léases du type s~ ..;nl~, qui est r~p~ble d'inhiber la ~y~ se de l'intPrle~ e-lB. Ce gène peut donc être utilisé pour ~1;..;n~Jer lor~l~rnPnt la con-~--l-a~ion en int~rl~P1lkin~1 et ainsi réduire le développement de la ~éponse ;-e et ;~ è.
Le gène BCRFl du virus d'Epstein Barr code pour un analogue de l'intP-rlp~ n~ 10. Le produit de ce gène est Ime ;ylc~ e capable de ~ la ,éponse ;~ A;ne et de ~h~ngPr sa sperificitP, tout en in~ ;.~nl la pf~lilélalion des lymphocytes B.
Le gène US28 du cytcmP~lovirus code pour une protéine h-)molo~lP~ au récepteur de la protéine ;.. ll~.. ~lo:-e des macrophages la (MIP-la). Cette p~léinê
est donc capable d'a~r comme c~....~l;lPtlr des récep~s du MIP, et do~c d'inhiber son activité 10r~1PmPnt Le produit des gènes E3-14,7, E3-10,4 et E3-14,5 de l'adén.~ us est capable de bloquer la b~n~ On du signal intercçl~ ire médié par certaines c-ytolrines 35 Lorsque les ~;y~;r~s se lient à leur re~ept~l~ à la surface d'une oellule infectée, un 2~13~
wo 96112030 PcrlFR95/01326 signal est l.i...'..~ au noyau pour induire la mort cP~ ire ou stoper la sylltl~èse protéique. C'est le cas en particulier du facteur de né~se des l~ --s (TNF).
L'inc~pol~Lon des gènes E3-14,7, E3-10,4 et/ou E3-14,5 dans un ADN re~...hin~nl selon l'il,vt:,llion en vue de leur eA~ ess~on c4~ ;ve ou régulée permet de bloquer la 5 xi~li~tir n interc~lh~l~ire induite par le TNF, et ainsi de protéger les cellules l.~e~;l~es par les virus n~co.nl-i~ de l'invention des effets toxiques de cette cytokine.
Une ;,-hih;l;.-~- locale et l~ e peut être particulieic,l,c,ll av~nt~g~.~e.
Celle-ci peut être obtenue n-~t~ par le choix des siEn~1lx d'eA~ion parti~ rs (prl~mot~l~ cytokine-~ -d~ x par. o ~r'e) comme indiqué ci-après.
Il est ~n~ndl~ que d'autres gènes homolo~l~s ou ayant des propriétés f~nrti-~nn~ similatres pCUvelll être utilisés pour la co~ .;lion des v~l~s de l'invention. Ces dir~i~lctlls gènes peuvellt être obt~ilus par toute technique connue de l'homme du métier, et n par ~ihlage de banques, par ~ylllh~ cl~i."iq~e, ouencore par des ..~lh~s mnxtes ;n~ 1 la m~ifi~ti-~n rhimi~ ou er~y,llalique de 1S séquences o~l~nue-s par ~ihl~ge de hA ques. En outre, ces difri~ gènes peuven être utilisés seuls ou en co...l-in~ (s).
L'un des autres aspects ull~l l&lls de la p~csel~le invention c~n~. ne le choix des promoteurs ll~n~ ,l;r~nn~1Q utilisés pour diriger l'~A~ion des gènes. C~mme indiqué ci-avant, il peut être particulièrement ~.~.pO~ d'utiliser un promoteur capable 20 d'~p~;...~r c~-~ ;vement le gène placé sous son contrôle. Ceci est le cas par emrle du gène gpl9k ou d'un h~-molo~le, si l'on souh~ite obtenir une immllnop~tion i~l~ll&l~. En ,~ cl~e, pour contrôler l'~sio~l d'un gène ;...m..~ p~te~ ~q~QQqnt sur ractivité des cytokines, une e~l~s;on régulée peut être so!-h~ b'^ En ce qui c~n~ ne r~c~ion du gène th~A~ l;que, le choix des 25 Qi~lq~l~r d'~ ~ion dépend de la nature du produit thé,~peulique, de la p~thologie cc nCç~née et du tissu ciblé.
Les p~.nolev.~ l)hliQq~ pour la construction des ADN rec~mhin~ntQ. de l'invention peUVt;lll être les ylc~ le!l :~ qui sont naturellPm~nt ~spf n~h'-s de 11~A~LC~;On du gène ~ -ev~ ue ou immlmop-ole.~ r c~nQ;~i~é lorsque ceux-ci 30 sont s~ ~ce~;hles de f~n~`ti()nn~ dans la cellule inÇ~;l~e. C~epenfiAnl il s'agit pl~r~ rn~nt de seq~ ces d'origine dirr~l~ (~spon~h'es de l'eA~>lession d'aulres pl~ ;n~s~ ou même ~y..l~ ;T~s), en particulier pour contrôler r~ion du gène i~ no~ ~1e~. N~ n...~l, il peut s'agir de séquences pr~motric~s de gènes 2201 39~
Wo 96/12030 Pcr~Rsslol326 euc~oles ou nrau,Y Par ~Yemp1c il peut s'agir de séquences p~u~lot~ices issues du ~nomP de la oellule que l'on désire inf~. De même, il peut s'agir de séquenc~c promotriees issues du ~ QO~e d'un virus, y a3...~ l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par r-~..ple les promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En 5 outre, ces séq lellces d'eA~ion peuv~ être mylifié~s par ~ ition de se~J~nc~s d'a.;livalio,~, de rP~ tion, ou pPrm~ nt une eA~ion tissu-sp~ifique. Par ~illP~
lorsque l'ADN reccmhin~nt ne compollè pas de séquences d'eA~e~ion, il peut être inséré dans le ~o...P du virus défectif en aval d'une telle séquence. Un promoteur préféré pour la ré~li~ti-ln des vecteurs de l'invention est con.~tit1)é par le LTR du virus 10 du sar~o",e de rous (LTR-RSV). Ce pl~ leur étant con.~ r et fort, permet dindu.,e une ;nln~ ~lop..~læs~l;on par la gpl9k i,npo,lanle. Des promoteurs ~ ;rêles peuvelll é~lPmPnt p~esenter un grand intérêt, tels que le promoteur des gènes PGK, alhumine, etc. Il peut être particulièrement inlé,~sanl d'utiliser des promoteurs regulés ou tissu-sp~fi-lues de manière à pouvoir cibler la synthèse des produits 15 ~h~ ei.l;ques et/ou imml.nop,olP~Iæ...~. En partic~ , pour l'eA~sion d'un gène ;,.,.,...~protecteur inhih~nt l'activité des cyf~k-inPs, il peut être particulièrement av~nt~g~x d'utiliser un promoteur in-luchhle pour obtenir un effet loe~li.eé~ Des promoteurs in~ hh1 , sont par ex~mple des promoteurs induits par des cytokines, de telle sorte que l'effet imm..noprotecteur ne se produise qu'en réponse à une réaction 20 ;~
Par ~ill~lne, l'ADN rec~ mhin~nt peut é.~l~-m~nt colllpo,ler une seqll~nr,e signal ~iri~nt le produit synthhiee dans les voies de sécrétion de la oellule cible.
Cette séq,lel ce signal peut être la séq,~ence signal naturelle du gène c~n~ ré
(ll,e,a~eulique ou ;....~ -oprotecteur) le cas érhP~nt, mais il peut é~l~m~nt s'agir de 2s toute autre séquence signal fon~ionnelle, ou d'une séquence signal arhfieipll~

Comme indiqué ci-avant, di~e,e"les configurations peuvent être envisagées pour la ré~li.e~ti~n des vècte~ de l'inventio~L Les væ~læ,~ de l'invention peuvelll tout d'ahord co..l~ir les deux gènes sous forme d'une entité transcriptionnelle unique. Dans 30 cette crnfi~ation, les deux ADN recomhin~nt~ sont contigus, di~oses de telle sorte que les deux gènes soient sous le contrôle d'un promoteur unique, et ~onn~nt lieu à un ARN pr~me~eag~ unique. Cette c~nfi~l~ation est ln~,~s~lle puisqu'elle permet d'utiliser un seul promoteur transcriptionnel pour réguler l'eA~ession des 2 gènes. Par ~ill~...e, cette entité t~ scl~;onn~lle unique peut être incorporée dans le vecteur 35 ad~no~ l dans les deux oriPnt~tionS po~eihl~, ~201399 wo 96/12030 PCT~95/01326 Av~nta~r ~P...~..I les deux ADN recomhin~nt.~ c- nti~nn~nt leur propre plomole~ h~ ;onn~l Cette cl nfi~ration perrnet d'obtenir des n d'e,~ion s~ ri~rs, et offre un m~ lr contrôle de l'~s;on des gènes. Dans ce cas, les deux ADN reccmhin~nt~ peuvelll être insérés dans la même oriçnt~tic~n ou 5 dans les cri~nt~ffcn~ opposées, dans un même site du ~nc)m~ de l'adénovllus ou en des sites dirré~.,~.
P~t~élr~ m~nt, les ADN recombinants sont insérés, au moins en partie, au niveau des régions El, E3 ou E4 du genom~ de l'adénovirus. Lorsqu'ils sont insérés en deux sites dir~el~lL~, on préfère dans le cadre de l'invention utiliser les régions El et 10 E3 ou El et E4. Les ~Yçmples moll~ en effet que cette org~ ;on permet une e~lé~iOn élevée des deux gènes, sans llllel~én~noe entre les deux. Av~nt~..~...~-~, les ADN r~.nl-ilunl~ sont insérés en rPmpl~c~m~-nt de sequences virales.
Un mode particulièlel..enl préféré de mise en oeuvre de la plesenle invention cc~n~i~te en un adé~ vilus défectif cGIn~nl un p~llier ADN recomhin~nt cc.n~çn~..L
15 un gène th~ ,l;que et un second ADN re~mhin~nt conlen~.l un gène immlmopn~lçcle~, dans lequel les~ux ADN rec~mhin~nt~ sont insérés au niveau de la région El.
Un mode particuliè~emelll préféré de mise en oeuvre de la p~senle invention ccn~;cte en un adeil~ vi-us défectif COIII~ un plellli~r ADN re~mhin~nt CJnlen~nl 20 un gène th~ xul;que, inséré au niveau de la région El,et un second ADN
recomhin~nt c~ n~nl un gène immtlnc~oleeleuf~ inséré au niveau de la région E3.
Comme indiqué ci-avant, les adénovirus de la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont in~ ~r~kle.s de se repliquer de facon ~.,IQnO...e dans la oellule c;ble. Gén~~ nt le g~nom~ des adénovirus défectifs selon la pleSellLe 25 invention est donc dépoulvu au moins des sequences n~Q~;~eS à la lepli-~l;on dudit virus dans la oellule infectée. Ces régions peuvenl être soit ~limin~-s (en tout ou en partie), soit l~dues non-fon~ti~nn~ s~ soit s~bsti~ s par d'autres séquences et no~ eft par les gènes thélapeuliques. Le caractère défectif des adénovirus de l'invention est un e~ nt llll~ll~ll, puisqu'il assure la non ~;.~.";.~ n des vecteurs 30 de l'--lvelllion après ~ln~ ion.

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_ 2~0 1 399 Wo 96/12030 PCT~R95/01326 Dans un mode de ré~li.eation préféré, les adénovirus de l'invention col..prennent les séquences lTR et une séquence perme1Pnt rçn~ap~;d~tion, et po~ une ~lélétir~n de tout ou partie du gène El.
Les séquences illvel~é-es répétées (IIR) c~ ent l'origine de répli~tinn des 5 adén.vi.us. Elles sont l~li~e aux e~l èl~ és 3' et 5' du ~nome viral (Cf figure 1), d'où elles peuvelll être isolées ~i~m~nt selon les techniques classiques de kiolo~ie m~ ine cn~ ee de l'homrne du métier. La séquence nucléotidique des séq,lences lTR des adél~vin~ h -. ..~ e (en particulier des sél.~ly~es Ad2 et Ad5) est décrite dans la lilLél~lu~e, ainsi que des adénc v~us canins (n~ .n.n~..L CAVl et CAV2).
10 C~ ..l l'adéll~,vi,us Ad5 par eY~mrle, la séquence ITR gauche collespol~d à la région c~ reA&Ill les nn~l~oti-lP~s 1 à 103 du g~nme La sé~quence d'en-~r~ tion (é~ m~nt ~é-ei~e séquence Psi) est n~cçss~ire à l'çn~r~ tinn de l'ADN viral. Cette région doit donc être p~senLe pour p~- ...ell.e la p,~-al~nn d'adén.,v~us recnmhin~nte défectifs selon l'inventiorL La sé~q1~en~
15 d'~n~ c;~ n est loc~liQ~e dans le g~nome des adénovirus, entre l'~TX gauche (5') et le gène El (Cf figure 1). Elle peut être isolée ou synthPtiQ~e ~h~;r;~:rll~m~nt par les techniques ~ eQ;l~lçe de bic'~gie mole~ ire La séquence nucléo~diques de la séquence d'~-n~rQ;~t~c-n des adénovirus hllm~in.e (en particulier des séruly~es Ad2 et Ad5) est décrite dans la L~ ure, ainsi que des adénovirus canins (not~mmpnt CAYl20 et CAV2). Co~ P~ l'adénovirus Ad5 par eY~nrle la séquence d'en~a~;~l~tion cofrespol~d à la région COIllp~ll~ll les m1CbotiA~s 194 à 358 du genome Plus pl~é~l;ell~m~nt~ les adénovirus de l'inv~llioll comp,el~l~enl les séq~lenoes lTR et une séquenoe pellnel~nl l'~n~a~;~l~tion, et poQ~s~ent une ~el~tion 25 de tout ou partie des gènes El et E4.
Dans un mode particuliè,en~enl préféré de ré~lieatic)n, le ~nom~ des adénovirus selon l'illvelllion est délété de tout ou partie des gènes El, E3 et E4, et, encore plus plérele~.l;ell~m~nt de tout ou partie des gènes El, E3, L5 et E4.
Les adénovirus de l'invention peuvent être préparés à partir d'adénovirus 30 d'ori~in~s d;vel~es. Il existe en effet dirrélenls sér.~ly~s d'adénovims, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui p~ese~ onl une o,~ ;.~l;on génétique co---r~-ible. Ainsi, les ~n.~ m~ntc décrits dans la plesenle dem~ntle pe~venl être ~i~.m~.nt ~p~duils par l'h-~mme du métier pour tout type d'adénovirus.

WO 96/12030 ~ ~' G 1 3 9 9 pcr~Rsslol326 Plus particuliè~l.e,ll, les adénovirus de l'invention peu~e.,l être d'origine h.~ ;ne, snimsl~, ou rni~te (h.. ~;ne et snimA1~).
Con~rn~nt les adén ~viLus d'ongine 1~ , on préfère u~liser ceux classés dans le groupe C. Plus pl~fél~ ;e11çm~nt parmi les dill~L~Il~ se~ly~es d'adéllc)vLLus 5 h1lmsin, on préfère utiliser dans le cadre de la p~senle lllv~lLon les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).
Comme indiqué plus haut, les adénovirus de rinvention peUV~lll é~E~A1ÇmÇnt être d'origine Anim~le, ou colllpoLIer des séquences issues d'adélh~vulls d'origine ~nimAle La ~lemAn~leresse a en effet montré que les adénovirus d'~igine ~nimA4 sont 10 rApahlç~ d'infecter avec une grande effi-~a~hé les oellules h...~A;næs, et qu'ils sont incapables de se propager dans les oellules hi..nA;n.~s dans lesquelles ils ont été testés (Cf dçmAnd~ FR 93 05954). La d~m~ndç~e a ég.Al~ nt montré que les adénovirus d'origine ~nimAl~ ne sont n..11qm~nt ~ans-compl~ s par des adénovirus d'origine 11..~nA;~ ce qui élimine tout risque de l~o.nb;n~;~nn et de prop-s-g~ti~ n in vivo, en 15 présence d'un adénovirus hllmAin, pouvdnl conduiLe à la ~(,....~;Qn d'une particule infecti~e. L'~1ti1i~tion d'adélloviLus ou de régions d'ad~i~ov;Lus d'origine ~nimAl~ est donc particulièn~llwnl avantageuse puisque les risques inhérents à l'llt;~Ati~n de vinLs comme V~. L~j en th~rApie génique sont encore plus faibles.
Les adé~ vi~us d'origine animale uhli.~l-'e~ dans le cadre de la plese.lle 20 invention peuvenl être d'origine canine, bovine, murine, (~Yemrle: Mavl, Beard et al., Virology 75(1990)81), ovine, porcine, aviaire ou encore simi~nn~ (~Yemrle: SAV).Plus particulièrement, parmi les adénovirus aviaires, on peut citer les sél~ ly~s 1 à 10 ~c~qihl~ à rATCC, comme par ~Y~mple les souches Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280),P7-A (ATCC VR-827), ~H-2A (ATCC VR-828),J2-A
25 (ATCC VR-829),T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) ou encore les souches ,efér~ncées ATCC VR-831 à 835. Parmi les adénovirus bovins, on peut utiliser les dilfelcll~ sérotypes connus, et not~mm~nt ceux disponibles à l'ATCC (types 1 à 8)sous les l~r~ ~sATCC VR-313, 314, 639-642, 768 et 769. On peut é~ mP.nt citer les adénovi~s murins FL(ATCC VR-550) et E20308(ATCC VR-, 528),radénovirus ovin ~e 5 (ATCC VR-1343),ou type 6 (ATCC VR-1340);
radénovirus porcin 5359), ou les adénovirus simiens tels que n~ .. enl les adénovi~s ~f~ncée à rATCC sous les numé~s VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
De pi~fé ~,lce, panni les dirîél~,l~ adénovirus d'origine ~lim~ on ut;lise 35 dans le cadre de l'inventio~ des adénovirus ou des régions d'adél~ovuls d'origine 220 1 3c~q canine, et ....~ toutes les so~ch~s des adénovirus CAV2 [souche m~nh~tt~n ou A26/61 (ATCC VR-800) par e-e..~ J. Les adénuvilus canins ont fait l'objet de nombreuses études ~llu~Lu~les. Ainsi, des cartes de Iestri~tic n c-mp1ètes des adénovirus CAV1 et CAV2 ont été ~é~ntes ~l~n~ l'art ~ntonel.r (Spibey et al., J. GeIL
5Virol. 70 (1989) 165), et les gènes Ela, E3 ainsi que les séquences ITR ont été clonés ~~
et séquencés (voir n.~ L Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
Les adénovirus reCom~n~nt~ défectifs selon l'~lv~nlion pellvelll être p~p~s de dir~e~,les fac,ons.
10Une P~ L~ mét~ole CO~ à ll~r~c~r l'ADN du virus l~o,llbinanl ~efe~tif p~pa~ in ntro (soit par ligature, soit sous forme de pl~mi(le) dans une lignée ire colll~t~ e, c'est-à-dire portant en t~ns toutes les fon~ n~ npoe~s~;les à lacomple.n~ n du virus défectif. Ces fonction~ sont pn~é.en~;~llem~nt intégrées dans le ~nome de la oellule, ce qui pennet d'éviter les risques de recomb;n~;~on, et 15confère une st~hi1ité accrue à la lignée oe~
Une s~n~le approche conC~ à co-transfecter dans une lignée c~ ire appplu~liée l'ADN du virus re~mbin~nt défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de r1~m;~e) et l'ADN d'un virus helper. Selon cette met~e~ il n'est pas n~?ce-~i~;~ de disposer d'une lignée c~ ire co...l~le..le capable de complem~nt~r 20 toutes ~les fon~ ticm.~ défectiv~s de l'adénovirus r~omhin~nt Une partie de ces ..~
fon~ti~n~ est en effet a~mr' ne~læ~e par le virus helper. Ce virus helper doit lui-même être défec~if et la lignée cell~ ire porte en trans les fonctions n~;-es à sa c mplPmPnt3ti~m Parmi les lignées ~lhll~ires llti~ b'-, not~mm-o-nt dans le cadre de cette sec~n~e appf~le, on peut citer .~ul~ nt la lignée de rein elll~l~/ul~l~aile 25 hllm~in 293, les cellules KB, les cellules Hela, MDCK, GHK, etc (Cf ~Y~mples).
F.n~lite, les vecteurs qui se sont mllltirli~s sont récupérés, purifiés et ~mplifi~s selon les techniques classiquo de biolo~e mol~ll~ire.

Selon une va~ de mise en oeuvre, il est po~ihle de pr~pa~r in vitro, soit 30 par ligature, soit sous forme de p1~mi~e~ l'ADN du virus recomhin~nt défectif portant les deletion~ app~pl;ées et les deux ADN recomhin~nt~. Comme indiqué ci-avant, les væleul~ de rl~lv~lLiûll po~è~lent aV~nt~ nt une ~1elPsion de tout ou partie de certains gènes viraux, n~ .n~ des gènes E1, E3, E4 et/ou L5. Cette délétion peutco~r~spo~dre à tout type de s~p~r~ion arr~l le gène c~n~ideré. ~ peut s'agir 35 no1~ nt de la ~u~r~ssiorl de tout ou partie de la régic~n codante dudit gène, et/ou 22~ 1 399 Wo 96/12030 PcrlFR9Sl01326 de tout ou partie de la région promotrir~ de la ll~nscril)tion dudit gène. La su~ples~ion est ~n~l~nPnt réalisée sur l'ADN du virus recomhin~nt défectif, par rY~nple par fliges~i~n au moyen d'~y~ s de r~icti~n app~pliées, puis ligature, selon les b~hni~l~es de biologie mcl cul~ire, ainsi qu'illustré dans les ~Y~mrl~ Les ADN
5 1~l h; ~ xu~ t ensuite être insérés dans cet ADN par clivage eYLcyll~lique puis ligature, au niveau des régions sel~tionnp~s et dans l'~;e~ ;c)n rhoi~;e L'ADN ainsi obtenu, qui porte donc les del~tic)n~ ap~.~,p~iées et les deux ADN recomhin~nt~, pennet de générer dir~n ~l l'adénovirus re~omh~in~nt défe~f portant lesdites ~ oti~n~ et ADN rec ~mhin~ntc Cette première ~ianle est 10 particuliè~lne..l adaptée à la ré~li~tio~ d'ade~ us recombin~nts dans le~ ~ les gènes sont ~ f~s~-e sous forme d'une unité L., .~Yi~ ;p~ nnp-lle unique ou, sous contrôle de p.~ JLæ~ i séparés mais insérés en un même site du g~nome Il est e~1PmPnt po~ihle de p ep~:er le virus re~cmhin~nt en deux étapes, 15 pe~...el~ rillh~i~1;nn s ,~-~.v~ des deux ADN re~mhin~nte. Ainsi, l'ADN d'un pl~uli~r virus recombin~nt portant les ~1Plétinne app~p~iées (ou une partie ~les(lit~s ~elétinn~) et un des ADN recomhin~nte est conshuil~ par ligature ou sous forme de pl~mirle Cet ADN est ensuite utilisé pour générer un premier vin~s l~on~h;n~nL
portant lesdites ~lP4tinne et un ADN recomhin~nt L'ADN de ce premier virus est 20 ensuite isolé et co~ fæL~ avec un second pl~emi~e ou l'ADN d'un second virus recnmhin~nt défectif portant le ~ n-~ ADN recombinant, les ~ tione appl~priées (partie non p.~ Le sur le p~lnier vims), et une région permett~nt la recomhin~isnn hnmologlt~ Cette ~ xiame étape génère ainsi le virus ,~-..hi~ défectif portant les deux ADN r~nmhin~nts Cette ~aLia.,l~ de p~p&~ion est particulièrement 25 appl~pliée pour la p~ph-~l;on de virus recomhin~nt~ portant deux ADN re~mhinants ins~ée en deux régions différentes du génome de l'adénovirus.
La plés~n~ i..v~-~ion co~ce~ ne é~l~m~nt toute com~ition pharm~ceutique coll~ un ou plusieurs adénovirus défectifs tels que décrits précédemm~nt Lescc.n~los;l;nn~ pl~ ce,~l;ql1es de rin-v~ltion peuvelll être formulées en vue d'une 30 n~n~;n;~ ~;on par voie topique, orale, p&ènleldle~ n~le~ inllav~ e, inl.i..n~ ire~ sous~lt~nee, intrac~ll~ire, ~ e~ ...;que, etc.
~ cré~l;e1hom~nt~ la composition rh3..~r~ul;tlue conl;~-~.l des véhiculesph~-m~,ceul;~ e...f~ acceptables pour une form~ tion injectable. Il peut s'agir en par~culier de so1utinn~ salines (phnsph~te mnnoso1ique, ~li~iq~le~ chlorure de 2~0 1 39q Wo 96/12030 PcTlFRs~lol326 s~it~n, pvl~ , c~ lrn ou m~ -, etc, ou des mP1~n~s de tels sels), stériles, isotoniques, ou de cc,.~ n~ sèches, l~OfAn~ l ly~hili~es, qui, par ~clrliti-)n selon le cas d'eau ~t--1i.e~ ou de sérum phy~ o~lue, p~ ...ell~--l la co~ ;lu~ n de solutés injectables.
Les doses de virus lltili.~ pour l'injection peuv~lt être adaptées en ron~ion de dirr~ p&alll~c~S, et nvl~----n~nt en fonction du mode d'~l---;n;-~aLon utilisé, de la pAthologie COIloe~ e, du gène à ~.p~;..,~r, ou encore de la durée du l~
~ ellee. D'une --al~i~e ~PnP~le, les adéllvv-lus recombin~nt.~ selon l'invention sont fnnm11~ et A~n~;n;~ s sous forme de doses co-n~ ;~s entre 104 et 1014 pfu/ml, et de 10 p~félence 106 à 101 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") cGl~espond au pollvoir infectieux d'une sol1~ti~ n de virus, et est r1el~...;ne par infection d'une culture oellt-l~ire appr~p~iée, et mesure, génér~lPm~-nt après 5 jours, du nombre de plages de oellules infectées. Les techniques de ~elP~ ...;Il u;cn du titre pfu d'une soluticm virale sont bien ~-mPntpçs dans la lill~
Les adénovirus de l'invention peuven~ être utilisés pour-le trAitement ou la plévelllion de nombreuses pAtholo~s. Selon le gène théld~eutique inséré, les adénovirus de l'invention peuvenl être utilisés no~ nt pour le tr~it~m~nt ou la pf~v~lltion des m~ c g~n~ti~ e~s (~ phie, fibrose cystique, etc), des nn~lAtli~sneuro~lé~n~. alives (Al,l~ , p~-k;ne~n, ALS, etc), des pathologies hypelpn~ lives (c~n~r.e., restçnose, etc), des p~th~logie~e. liées aux désordres de la coa~ ticn ou aux ~Lpop .~ n~mips~ des pAtho]ogi~s liées aux infections virales (hep~l;le,2, SIDA, etc), etc.
La plésenle invention sera plus a~mr1il~ ..l décnte à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être cnne;~3~rés comme ill~alils et non l;...;l~l;rx.
25 ~ ~ende des fi~ures Figure 1: O~ n g~nPti~le de l'adénovirus Ad5. La séquence comrlete de l'Ad5est ~iiepQnihle sur base de ~l~nn~s et permet à l~omme du métier de sP1e~ti~nn~r ou de créer tout site de restn~tion~ et ainsi d'isoler toute région du génome.
Flgure 2: Carte de res~iction de l'adén~vuus CAV2 souche ~nhAttAn (d'après 30 Spibey et al précité).
Figure 3: CO~I1 u~,~ion du vecteur pAD5-gpl9k-Bgal.
Flgure 4: Co~ u~;lion de l'adénovirus Ad-gpl9k-Rg~ F.1 ,~E3.

Wo 96/12030 22~ 1 3 9 9 PcrlFRsslol326 Techniques ~énérales de b~ ~ie moleculaire Les mPfl~ es ~ e~ m~nt 1ut~ éP-e en bio'~ie m~e~l~ire telles que les e~tion.e pl~p~alivæs d'ADN ~ n~;diq.~e, la cenlrifugation d'ADN pl~emi~lique en ~tii~nt de chlorure de cesium, l'électrophorese sur geLs d'agarose ou d'ac~ ,de, la 5 purification de fr~m~nte d'ADN par électro1utinn, les e~ctic~n de pluléines auphénol ou au phénol-chlo,urc",l.e, la p~;p;~ )n d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isoplopallol, la l~ n~ n dans Fe~l~;cl~ ~ coli, etc ... sont bien CQt~nll~S de l~omme de métier et sont abrn-1~m~nt decrit~s dans la lil~,~l~ [M~ni~he T. et al., "Mole~ r C1oning, a Labo,alcl~ Manual", Cold Spring Harbor Labold~,y,10 Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molocl~ Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~emitl~s de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine ~ ciale (RethPeda Research Labf). ~ n~e).
Pour les ligatures, les fr,sEmPnte d'ADN peuvel~l être séparés selon leur taille15 par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mPlsn~ phénoVchlon~fo"lle, ~c;pi~s à l'éthanol puis incubés en~p,~nce de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les l~....Y.~ stiC nc du f~lmi~ce1lr.
Le ~.,\pl;~Ee des ~:~I,e,llilés 5' p~...;n~?n~!,5 peut être erfe~lué par le fragment de Klenow de l'ADN Poly,~é,ase I d'E. coli (Riol-slls) selon les sp~fi~stions 20 du follmi~e~P1~. La destruction des t~ ,ilés 3' ~ ;npnlps est ~ffe. l.~ée en présence de l'ADN Polylll~,ase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les ,ecolnnla~-lstinn.e du fahri~snt La destruction des e~ éllli~s 5' proe...;l-~ .lP-s est effectuée par un traitpmpnt mPns.~é par la mlc1Ps~cp S1.
La mut~sgpn~se dirigée in vitro par oli~ ~xynucléotides ~yl~ iques peut 25 être effectuée selon la mPth~e développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utiliQ-snt le kit ~i~trih1lP par ~ n~
L~s. ~pl;r;~l;nn en~y...~l;que de frgmPntc d'ADN par la technique dite de PCR
_Lolymérase-catalyzed Çhain Beaction~ Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être 30 errP~uée en utili.csnt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les speçifi~,s~tic n.c du f,shricsnt La vPrifi~sti~n des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en l)tiliQsnt le kit rii.ctrihuf~ par ,A.. ~l,~.,, ~201 39~
Wo 96/12030 Pcr~R95/01326 ! i~éec cellul&;r~s utilisées Dans les ~ pl~ qui sl~ivent, les lignées cPlhll~ires suiv~lles ont ou peuvenl être utili~es:
- Lignée de rein eml~y~nnai.e humain 293 (~h~m et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Cette lignée conl;P-~I n~ .. t, intégrée dans son gPnomP" la partie gauche du génome de l'adénoviruc hllm~in Ad5 (12 %).
- Lignée de cellules h~ n~s KB: Issue d'un carcinome PpitlPrmique h~ in, cette lignée est a~eccible à l'ATCC (ref. CCL17) ainsi que les cnn~itirnS permettant sa culture.
lo - Lignée de cellules 1~ nP~s Hela: Issue d'un c~ o,l,e de l'Ppithelil.m hl~ in, cette lignée est ~cce-~cib]e à l'ATCC (ref. CCL2) ainsi que les c~n~ition~
pf rmPtt~nt sa culture.
- Lignée de cellules canines MDCK: Les c~n~liti~m~ de culture des cellules MDCK ont été ~ritPs not~mmPnt par ~r~ et al., ~rienre 44 (1988) 9.
- Lignée de oellules gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624).
Cette lignée est con~ih~e de oellules Hela portant le gène E2 d'adénovi~ ls sous le controle du LTR de MMTV.
EXEMPLES
E~ lc 1. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant un 20 gène thérapeutique (le gène LacZ de E~ coli) sous le contrôle du promoteur duLTR du RSV et le gène gpl9k sous le controle du ~ D...steur du LTR du RSV, tous deux insérés au niveau de la région El.
Ces adénovirus ont été construits par recombinaison homologue entre un p~ e portant la partie gauche de l'adénovirus Ad5, les deux ADN recomhin~nt.~ et25 une région de l'adénov.lus Ad5 (correspondant à la protéine IX) et l'ADN d'un adénovirus défec~f portant diUé~:.llesfle4tic n~
1. Construction du ve~,~eur pAD5-g~19k-Rg~l (fi ure 3) 1.1. Construc~on du p1~mide pGEM-gpl9k Le pl~ pAD5-gpl9k-Bgal c~ntient une séquence d'ADNc codant pour la 30 protéine gpl9k d'adénovirus. Ce plqcmid~ a été construit com ne suit. Le fra~nent XbaI du g~nome de l'adénuvilus Ad5 sauvage cont~n~nt la région E3 a été isolé et wo 96/12030 2 2 ~ 1 3 9 9 PCT/FR95/01326 cloné au site collGspondant du r1~cmi-1e pGEM (Promega) pour générer le p~ e pGEM-E3. Le fragm~nt Hin~ la séquence co~1~nte de la gpl9k (nucléotides 28628 à 29634 de l'adén~vi-us Ad5 sauvage) a ensuite été isolé à partir du pl~emi~le pGEM-E3. Les e~llGl~ Gs de ce f~m~nt ont été iG~dues ~lancl~Gs par action du 5 fr~m~nt de Iaenow de rADN PO1YI1lG1~ I d'E. coli (Cf techniques générales de biologie mo1~-1~ire), puis le f~gm~nt obtenu a été cloné au site SmaI du p1~emir pGEMzf+ (Promega).
Le p1~emide obtenu a été désigné pGEM-gpl9k (figure 3).

1.2. Co~ .;lion du vecteur pAD5-gpl9k-Bgal Cet ~ e~ ,1e décrit la col~h~l.;Lion d'un p19emirle co.~ nl UA les deux ADN
re~omh-n~nt.e coll.~Gnant leur propre promoteur, la partie gauche du g~onome de l'adél~vlll.s et une partie suppl~ ;. e (pf~téine pIX) perme~nt la recombin~i~n 15 homo1O~Ie Ce vecteur a été col~uil à partir du p1~emide pAd.RSV~Gal comme suit.

Le rl~cmi~le pAd RSV~Gal cnnti~nt dans l'oriçnt~tion 5'->3', - le fr~gment Pn~ correspondant à l~w~h~ é gauche de l'adén~Jv~us Ad5 COnl~l`eA~l~: la séquence ITR, l'origine de rép1iratic)n, les signaux d'Pn~ s;~tion et 20 l'~mrlifi~t~.r ElA;
- le gène codant pour la ~ ~e;~;e SOUS le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sa~ome de Rous), - UA second fragmPnt du gPnomP~ de l'adénovirus Ad5, qui permet la r~...l-;n~i~c.n h~molo~uP. eAtre le p1~emi~le pAd RSV~Gal et l'adél~c,vilus dl324. Le 25 pl~smiAe pAd RSV~Gal a été décrit par Stratford-Pe~Tir?l)dP~t et al. ~J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).

Le p1~mi(l~P pAd RSV~Gal a tout d'abord été coupé par les e ~y,.les EagI et ClaI. Ceci génère UA premier fr~grrh~nt portant llvl~-r....Pnt la partie gauche de 30 radélx,vil.ls Ad5 et le promoteur du LTR du RSV. Parallèlement, le r1~emi-1e pAd RSV~Gal a é~lp-m~pnt été coupé par les er~yllles EagI et XbaI. Ceci génère un ~le~ ;e.. e type de fragment portant l~li~.. Pnt le promoteur du LTR du RSV, le gène LacZ, et un f~ment du ~nome de l'adénvv~s Ad5, qui permet la recomhin~i~on h~m~lo~lP~ Les fr~ nt~ ClaI-EagI et EagI-XbaI ont ensuite été ligaturés en p~ ce du fr~mPnt XbaI-ClaI du p1~emi~1e pGEM-gpl9k (exemple 1.1) portant la Wo 96112030 PcrlFRs~lol326 séq~lellce cod~nte de la gpl9k (Cf figure 3). Le v~eur ainsi obtenu, désigné pAD5-gpl9k-Bgal, Cl nl;f~n~ donc - le f~mPnt PvuII co respolldant à le~l~n~ilé gauche de l'adénovil~,s Ad5 COlllln~hll: la séquence ITR, l'origine de replir~ti~n, les S~ x d'çnr~p~ tisn et 5 1~A.~P1;r;~ ElA;
- la séquence codant pour la gpl9k sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sa~ll~e de Rous);
- le gène codant pour la ~g~ t~s;~e sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du s~cme de Rous), et, - un second fragment du ~nome de l'adénovirus Ad5, qui permet la r~ml-;n~ h~molc~

2. Col~llu.;lion des adénovirus ræol..bin~nlx 2.1. Col~hu~ion d'un adénovirus recsmhin~nt délété dans la région El, portant les deux ADN recrmhin~nt.~ insérés dans la même orientation, au niveau de la région El.
Le vecteur pAD5-gpl9k-Bgal a été line~ri.ee et cot.d,~r~cté avec un ve~leur adénoviral ~r;r~ dans le gène El, dans les oellules helper (lignée 293) ap~oL ~ll en 20 trans les fonrtinn~ codées par les régions El (ElA et ElB) d'adénovirus.
Plus pr~ l'adén~viLu~ Ad-gpl9k-Rg~ F.1 est obtenu par ~on~h;nA;.q~.n h ImoIo~ue in vivo entre l'adénovirus Ad-RSVBgal (Cf S~ ronl-Pç~rir~ Pt et al citée plus haut) et le vecteur pAD5-gpl9k-~gal, selon le protocole suivant: le p1~m;~1P~ pAD5-gpl9k-Bgal, l;n~ e par XmnI, et l'adénovirus Ad-25 RSVBgal, lin~A~i~e par renzyme ClaI, sont co-1ransfectés dans la lignée 293 en pr~sence de phosrh~te de c~lril1nn~ pour permPt~e la recomhin~i~on homologue. Les adénovirus ~mhin~nt~ ainsi générés sont ensuite sélectionnés par pl.rifi(~tion sur plaque. Après ico~e-npnt l'ADN de l'adé~ s rec~ mhin~nt est ~mplifiP, dans la lignée cf~lh~l~ire 293, ce qui conduit à un sl~rn~P~nt de culture contPn~nt l'adénovirus 30 défectif recomhin~nt non purifié ayant un titre d'el~v.l~n 1010 pfu~ml. ~ ` ~Les particules virales sont ~PnP~lPmPnt ~l~ifi~ par ce~ irugation sur gradient de chlorure de césium selon les tech~iques conn~ (voir nOI~.. Pnt Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-gpl9k-~g~ Fl peut être conservé à
~0C dans 20 % de glycerol.

wo 96/12030 2 2 ~1 1 3 ~ 9 PcrlFR95101326 2.2. Cor~ ~ion d'un adénovirus re~omhinAnt délété dans les régions E1 et E3, portant les deux ADN rec lmhin~ntc inserés dans la même .. ;....I~.t;~m, au niveau de la région E1 (figure 4).
Le vecteur pAD5-gp19k-Bgal a été l;nPA~;~e et c~ ~;lé avec un v~;~
5 adénoviral (lPfiri~nt dans les gènes E1 et E3, dans les oellules helper (lignée 293) a~pollanl en trans les fcn~ n~ codées par les régions E1 (ElA et ElB) d'adénovirus.
Plus prér~ n~nl l'adénovirus Ad-gp19k-RgAlJ~F.1~E3 a été obtenu par rewml-;nA;~on homolo~le in vivo entre l'adél~vi,~.s mutant Ad-dll324 ~-;. . ~nA~p~y~
et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pAD5-gp19k-Bgal, selon le protocole suivant:
lO le pl~mirle pAD5-gpl9k-~gal et l'adé~ vi,us Ad dl1324, l;~ ;~ par l'enzyme ClaI, ont été c~transfectés dans la lignée 293 en p.~nce de pho,srh~te de c~l~inm, pour p~....ell.e la recomhinA;~- n homologue. Les adénov~ls recombin~nt~ ainsi générés ont ensuite été s~l~tionnes p_r pttrifj~ti~n sur plaque. Après i~lem~nt l'ADN de l'adénuvi,us recomhin~nt est ~mplifie dans la lignée ~llnl~ire 293, ce qui conduit à un 15 stlrnagP~nt de culture cr~ n~nl l'adé~ v~us défect~f r~mhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 101 pfu/ml.
Les particules vi~les sont générAlPm~-nt p.. ifi~s par centrifugation sur ~r~iPnt de chlorure de césium selon les techniques conn ~fS (voir no~ -n-Pnt Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Le ,~nome de l'adénovirus recomh-n~nt a ensuite été
20 vérifié par analyse en southern blot. L'adé~ vi,us Ad-gp19k-Rg~ F.1,~E3 peut être col~sel~ à -80C dans 20 % de glycérol.

Exemple 2: Mise en c. ~ence en culture cellulaire de la fo.-t;onnalité des adénovirus de l'invention 2s 1. T.~lsc.i~ulion de la gpl9k dans les fibroblastes 3T3.

L'ap~;l;on de ~ codant pour la gpl9k dans les cellules infectées par radén~,vilus Ad-gpl9k-~g~ F1~E3 a été clPmcn1rée par analyse en Nor~ern blot 30 des ARN cPllt1l~ires totaux. Pour cela, 5.106 oellules 3T3 ont ëté infectéès avec 40 pu/oellule de virus. Au bout de 36 heures, les ARN cPll~ ires totaux ont été
~ cuperés au moyen de RNAzol (Cinna/Ri~ Y), pLecipil~s puis ~s~ nrlll~ dans de reau. 10 ~lg ont ensuite été déposés sur gel de fcJ~ lPhyde co~ nAnl 1,5~o d'agarose. Les ARN ont ensuite été dénalu~es en p,~ence de NaOH 0,05M, puis 35 h~r~s sur un SUPPOLl de nylon (Hybond+ .Am~h~m) par transfert c~pill~ire avec 22C 1 3q9 Wo 96/l2030 P~llrl~ssl~l326 20xSSC. La mPmhrPn~P de nylon a été pré-hybridée en milieu 6xSSC, 5x De~ L~
0,5% SDS, 100 ~g d'ADN de sperme de s~ on dénaturé pPn~l~nt 2 h à 60 C. Une sonde c~llesp~l danl à l'ADN de la région E3 de radel~iLus AdS l~uée au 32p en ~1tili~nt le kit MegaP~ime (~.. ~l.~.. ,) a ensuite été ajoutée à la soluti~ n et laissée 5 pour l~ ion p~.n~ toute la nuit. Après l~ nl la mPmb~ne a été lavée deux fois dans un milieu 2x SSC, 0,1% SDS à ~lll~lalu~e ~mhi~nte~ puis deux foisdans un milieu 0,1x SSC, 0,5% SDS à 45C, puis enfin dans un milieu 0,1x SSC à
le"l~lalu-~ ~mhi~nte et exposée.
Les résultats obtenus montrent l'apparition d'une bande de 1,6 kb dans les 10 cellules ll.r~es par l'adénovirus Ad-gpl9k-Rg~ F.l,A~3. Cette bande co~r~spond à
un ARNm CC~ AanI la séquence codant pour la gpl9k et allant jusqu'au site polyA
situé dans le promoteur RSV contrôlant la l~ sc~Lon du gène LacZ. EA revanche, aucune bande équivalente n'est ~Ptectée dans les cellules infectées par l'adénovirus Ad-B-gal.
2. Expression d'une ~pl9k fsnctionnelle La fnn~on~lite de la gpl9k produite par les cellules infectées par l'adén.,~ s Ad-gpl9k-Rg~l,AF1,~E3 a été vérifiée par mesure, en test ELISA, de 20 l'~l)~ion de la B2-microglobuline à la surface des CPlltllP~C La B2-microglobuline est une p,~ l~ine non-tr~n~mPm~ lo~.~li~ à la surface des cellules en association avec les m~l~llp~s MHC-I, et qui est nP~P~;~ à la p~se.~l~l;on de l'antigène à la surface des oeplllllp-s- En particulier, elle est nP~-;.e pour le repli~Pm~nt correct des m~llPs MHC-I et pour la p~esP~ - des pepti~ps ~ntigpniques à la surface des 25 oePlltllP-c, et cnn.~ e de ce fait un bon l"~.leu~ de la fc~nr~ti~nn~lité des mol MHC-I.
Les oellules 3T3-Bal~c à c~ ee ont été infectées avec 200 pfu/cellule d'Ad-gp19k-Rg~lrAF.1 ,~E3, puis in~b~?s 40 h à 37C, sous ~..osphPre htlmitle~ 5%
C02, dans du m;lieu DMEM co..~n~ l 10% de sérum de veau fétal. Les cellules ont30 ensuite été récnltee~s dans un tampon PBS 20mM EDTA, et mises en s~ .C;on dans du m-ilieu DMEM 10% SVF. 105 oellules sont ensuite inll~duilæs dans chaque puitsd'une plaque 96 puits. Les plaques sont centrifugées à 250 g pen~nt 3 min puis in~lhe~ 6 heures. Les puits sont ensuite lavés avec du tampon PBS 1% ~1hlmin~ deboeuf (SAB) puis in~-~s avec une ~ ti. n au 500ème d'anticorps de l,.oulon anti-35 B2-microglobuline ~he Rin~ing Site, Ri-min~h~m, UK) dans 1% SAB-PBS pendant ~2~ 9 wo 96/12030 P~llrl~s5~l326 20 min à 37C. Les cellules ont ensuite été lavées dans 1% SAB-PBS puis fixées dans un tampon PBS 0,37% f~mqkl~hyde, 0,2~o glutaraldéhyde, lavées 2 fois et inruhée~avec une ~ ti~ n au 35 OOOème dans 1% SAB-PBS d'un ~éme anlico~s anti-mouton conjugué à la phospll~lA~ alcaline (PA) (Sigma) ~A~ heure à 4C. Les plaques 5 sont ensuite lavées 3 fois dans 1% SAB-PBS. L'activité PA a ensuite été tl~tectée en ili~qnt le kit PA substrat (Biorad). La densité optique des puits lue à 450 nm, la DO
n~y~n~ e et l'écart type ont été cq-lclllPs Les résultats obtenus montrent que ril~e,~ioll par l'Ad-gp19k-Rg,ql,~F.1,AE3 induit une rédvcti.nn de 40~o environ de rintensité du signal R2-microglobuline de 0 surface révélé par le test ELISA, par rapport à l'effet produit par l'adéll~vifus Ad-Bgal.
Ces résultats inAi~ nt clairement que rAd-gpl9k-Rg~ F.1 /~E3 induit la production d'une pl~léine gp19k fonrtionn~lle, et que oelle~i induit une baisse ~iEnifi~tive de l'e~,~ssion des moléc~ s MHC-I à la surface des c~ s.

15 Exemple 3. Effet im...~ ote~te~- des adi,..ovi. Is de l'i~v~.~lion

3.1. Sensibilité aux CTL stimules in vivo par l'adénovirus Ad-Rg~l Cet t~ ..plc montre que les oellules infectées par l'~dé~ V.IuS Ad-gpl9k-~gAl"~F.l "~E3 sont protégées de la lyse par les CTL par rapport aux oellules .l~e~es par un adénovirus Ad-Bgal.
Des souris DBA/2 (H-2d) ont reçu une première inje~ion illll~veinel~se de 108 pfu de virus Ad-Bgal, suivie, 3 ~n.~;ne.s après, d'une nouvelle injection .nl~ o~ de la même q~nLilé de virus. Les souris ont été s~crifi~ 2 s~.nAin~s après (au plus tôt), leur rate broyée et les oellules de la rate sont mises en s~ ~nsion dans 10ml de RPMI 1640 (Gibco) cc.~le~ 10~o de SFV décomp"-"~ ;se, 50~g/ml de ~ ycine, 100 U/ml de p~ni~llin~, 100 ~/ml de kanamycine et 100 ~lg/ml de ge Itanlyc,ne. Les cellules ainsi obtenues (lymphocytes CTL) ont alors été in~bé~ en p~sence de cellules 3T3 infectées par l'adénovirus Ad-Bgal. Ceci conduit à une lyse de 40~o environ des oellules colorées (i.e. ~Ire~es). En revancl~e, ces mêmes cellules (lymphocytes CTL) n'ont p~atiquement aucun effet sur les fibroblastes non infectés ni sur les fibroblastes infe~,~és par l'adéllovil~.s Ad-gpl9k-RgPl,~F.l,~E3. Ces résultats montrent bien que rincol~dtion dans les V~UIS de rinvention d'un ADN
rec- mhin~nt capable de p~du~ la gpl9k induit une immllnopn~ l;on des oellules infectées.

WO96/12030 2201 3~q PCr~95/01326 3.2. ~S~sibilité aux CTL st mulPs m nvo par l'adénc,v,lus Ad-~p19k-~l AFl AF.~
Cet ~ r~ie montre que les oellules ;..r~t~s par radél~ovi,~s Ad-gpl9k-R~lJ\F.1,~E3 sont protégées de la lyse par les CTL par rapport aux oellules infectées 5 par un adénovirus Ad-Bgal.

Les cellules de la rate de souris ayant reçu des injection d'Ad-gpl9k-R~l,AF.l,~F3 ont été p~pal~ccs dans les conditions A~iteS ci-dessus. Dans les c nAitions ~p~rit~ps ci-dessus, ces CTL stim~llP~ en présence de oellules 3T3 infectées 10 par Ad-gpl9k-~g~l,AF.1,~E3 n';~ pas de lyse dP~Aitçs cpllllles~ ni des fibroblastes non-infectés, ni des fibroblastes in[e~,~és par l'Ad-Bgal. Par ailleurs, il a été
vérifié que cette ~hsPn~e de lyse n'était pas due à une faible viabilité des c~ lP,s. Pour cela, les mêmes lymphocytes ont été st~ml)l~ ensuite en présence de oellules 3T3infectées par rAd-Bgal, dans le but d~ pl;r;~ tous les clones anti-BGal ou anti 1~ adenovirus. Les lymphocytes ainsi obtenus sont c~p~hlP~ de lyser les oellules 3T3 infectées par l'Ad-Bgal, de la même manière que ceux prélevés des souris ayant recu l'Ad-Bgal. Ces résultats montrent clairement (i) que les vecteurs de l'inventio~int11ti.c~nt une imm~nopf~t~;lion des oellules infectées, puisqu'aucun CTL s~ifi.lue effl~ ace n'est généré, et (ii), que si certains lymphocytes anti-vecteur sont générés dar~s 20 les rates de souris inje~e~ par Ad-gpl9k-Rg~ F.l,~E3, l'~~ ion des ~nti~PnPc pendant la stimt.l~ti~n ex vivo est i~ rri~ pour induire une e~p~n~ n clonale deoes lylllphoc~es n~e~ire à la lyse des cellules cibles "~ es.
Exemple 3. Construction d'adénovirus recombinants défectifs comp ~,.ant un gène thérapeutique sous le co~t~ ol~ d'un p. v~ol~ur inséré w nivew de la région25 El et le gène gpl9k sous le contrôle du l~-v .lote~lr du LIR du RSV inséré au niveau de la région E3.
Ces adénovirus ont été con~uils par recomb,naison homologue entre un rADN d'un ~l~lier virus défectif portant le premier ADN ~comhin~nt (gène thé,~eulique + promoteur) inséré au niveau de la région El et l'ADN d'un deuxième 30 adénovims défectif portant le ~le~ me ADN recombin~nt (gpl9k + promoteur RSV) inséré au niveau de la région E3.

1. Con~ ~ion du vin~s défectif portant le deuxième ADN recombinant (gpl9k + plv-nole~ RSV) inséré au niveau de la région E3 22û1 399 Wo 96/12030 ~ FR95l0l326 Ce virus a été construit à partir de radén~v~u~ Addl324 (Th;~ al)pa~a et al., Cell 31 (1982) 543). Ce virus porte une ~ fion au niveau de la région E1 et au niveau de la région E3 (fragment XbaI-EcoRI délété). L'ADN du virus Addl324 a été
5 isolé et punfié. Cet ADN est ensuite coupé par les ~r.lles XbaI et EcoRI. Un fr~gment XbaI-EcoRI est ensuite issu du rls~rni-le pAd-gp19k-Bgal portant la séqllence codant pour la gpl9k sous contrôle du promoteur RSV, puis inséré au niveau desits sites dans l'ADN de Addl324 ouvert comme précé~lemm~nt L'ADN ainsi obtenu comporte donc une ~ ti~n au niveau de la région E1 et 0 un ADN recombinAnt au niveau de la région E3 portant le gène gpl9k sous contrôle du RSV.

2. Co~ u~ion des adénovirus portant les deux ADN recombinants.
L'ADN du virus recomhin~nt préparé ci-dessus et l'ADN d'un adénovirus 15 r~mhinAnt portant un gène th~ ;que au niveau de la région E1, lin~Ari.ce par RAm~T, sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphAte de cAl~ rn, pour p~rmettre la recom~ Ai~l homologue. Les adénovirus rec-~mbinAnt.~ ainsi générés ont ensuite été s~ nn~ par pllrific~tion sur plaque. Après isolement, l'ADN de radénovil~ls re~mhinAnt est Amrlifié dans la lignée c~ llAire 293, ce qui 20 conduit à un s~rnA~nt de culture conl~n~ l'adénovirus défectif recomhinAnt non purLfié ayant un titre d'environ 101 pfu/m1.
Les particules virales sont générAl~m~nt pl-rifi~S par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques conm~s (voir notAmm~nt Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
Bien que les ~Y~mpl~ ci-dessus decrivenl plus particulièrement l'empli du gène gpl9k, il est f~nl~n~ que les approches décrites dans les exemrl~s ci-dessus peuv~nl être répétées par l~omme du métier en 1~tili~nt d'autres gènes thé~peu~iques, d'autres gènes immlmoprote~ rs~ d'autres pl~...ole!~s et d'autres sites d'insertion 30 dans le ~n~me de l'adénovirus.

Claims (24)

REVENDICATIONS

1. Adénovirus défectif dont le génome comprend un premier ADN
recombinant contenant un gène thérapeutique et un second ADN recombinant contenant un gène immunoprotecteur dont le produit inhibe au moins partiellementl'expression des protéines du complexe majeur d'histocompatibilité MHC ou la présentation anti-génique, ou agit sur l'activité ou les voies de signalisation des cytokines.

2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que les deux ADN
recombinants constituent une entité transcriptionnelle unique.

3. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que les deux ADN
recombinants comportent chacun un promoteur transcriptionnel, identique ou différent.

4. Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que les deux ADN
recombinants sont insérés dans la même orientation.

5. Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que les deux ADN
recombinantssont insérés dans les orientations opposées.

6. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que les deux ADN recombinants sont insérés dans un même site du génome, de préférence auniveau des régions E1, E3 ou E4.

7. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce que les deux ADN
recombinants sont insérés au niveau de la région E1 .

8. Adénovirus selon l'une des revendications 1, 3, 4 et 5 caractérisé en ce que les deux ADN recombinants sont insérés en des sites différents du génome.

9. Adénovirus selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'un des ADN
recombinants est inséré au niveau de la région E1 et l'autre au niveau de la région E3 ou E4.

10. Adénovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, et en ce qu'il porte une délétion de tout ou partie des gènes E1 et E4.

11. Adénovirus selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, et en ce qu'il porte unedélétion de tout ou partie des gènes E1, E3 et E4.

12. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que son génome est délété de tout ou partie des gènes E1, E3, L5 et E4.

13. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est d'origine humaine, animale, ou mixte.

14. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine humaine sont choisis parmi ceux classés dans le groupe C, de préférence parmi les adénovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).

15. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que les adénovirus d'origine animale sont choisis parmi les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, ovine, porcine, aviaire et simienne.

16. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène thérapeutique code pour une protéine thérapeutique.

17. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que le gène thérapeutique code pour un ARN thérapeutique.

18. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisé en ce que le gène immunoprotecteur est choisi parmi le gène de la gp19k de l'adénovirus, le gène ICP47 du virus de l'herpes, ou le gène UL18 du cytomégalovirus.

19. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisé en ce que le gène immunoprotecteur dont le produit agit sur l'activité ou les voies de signalisation des cytokines est choisi parmi le gène BCRF1 du virus d'Epstein Barr, les gènes crmA
et crmB du virus de cowpox, les gènes B15R et B18R du virus de la vaccine, le gène US28 du cytomégalovirus et les gènes E3-14,7, E3-10,4 et E3-14,5 de l'adénovirus.

20. Adénovirus défectif caractérisé en ce qu'il comprend un premier ADN
recombinant comprenant un gène thérapeutique et un deuxième ADN recombinant comprenant le gène codant pour la gp19k, tous deux insérés au niveau de la région E1 du génome de ladénovirus.

21. Adénovirus selon les revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que le ou les promoteurs transcriptionnels sont choisis parmi les promoteurs mammifères, eucaryotes ou viraux.

22. Adénovirus selon la revendication 21 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs des gènes E1A, MLP, CMV, RSV, PGK, albumine, et les promoteurs induits par des cytokines.

23. Composition pharmaceutique comprenant au moins un adénovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à 22.

24. Composition pharmaceutique selon la revendication 23 comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.