CA2464196A1 - Procede d'enrichissement de cellules souches keratinocytaires - Google Patents
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- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
Abstract
L'invention concerne un procédé d'enrichissement d'une population de cellule s souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de kératinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées da ns l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à envir on 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par trypsination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.
Description
PROCEDE D'ENRICHISSEMENT DE CELLULES SOUCHES
KERATINOCYTAIRES
L'invention a pour objet un procédé d'enrichissement de cellules souches kératinocytaires.
L'invention a également pour objet des cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel d'expansion élevé.
Le tissu hématopoïétique et la peau présentent des similitudes au niveau de leur organisation. Il s'agit de systèmes biologiques dynamiques et hiérarchisés, dans lesquels de grandes quantités de cellules matures sont continuellement produites et renouvelées, durant toute la vie de l'individu. Les cellules qui les composent peuvent être .
schématiquement classées dans 3 compartiments selon leur stade d'évolution. Cependant, il n'existe pas de frontières nettement définies entre ces compartiments, chacun d'eux étant en réalité constitué
1 S d'un continuum de cellules au degré de maturation variable, et donc très hétérogène.
Un premier compartiment est composé de .cellules matures différenciées dont le potentiel de prolifération est très limité ou nul (lymphocytes, macrophages, mégacaryocytes, érythrocytes ; kératinocytes des couches suprabasales de l'épiderme).
Un deuxième compartiment englobe une population de cellules qui possèdent un potentiel de prolifération variable mais limité qu'elles perdent progressivement en s'engageant vers la différenciation (progéniteurs et précurseurs hématopoïétiques ;
kératinocytes en phase transitoire d'amplification).
Un troisième compartiment est constitué de cellules rares situées en amont dans la hiérarchie de ces systèmes. Il englobe les cellules souches (cellule souche hématopoïétique ;
cellule souche kératinocytaire) notamment caractérisées par le fait que, bien que demeurant majoritairement dans un état de quiescence, ces cellules possèdent un potentiel d'expansion à
long terme très important, mais aussi notamment caractérisées par leur capacité
d'autorenouvellement.
Le phénotype des cellules souches kératinocytaires n'étant encore qu'imparfaitement caractérisé, ces cellules demeurent à ce jour difficiles à purifier, difficiles à sélectionner, et par conséquent on ne dispose à ce jour d'aucun procédé efficace d'enrichissement de cellules souches kératinocytaires.
L'un des buts de l'invention est de proposer un procédé efficace, permettant d'obtenir une population de cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel d'expansion à long terme élevé.
L'un des buts de l'invention est de fournir une population de cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel de prolifération supérieur d'au moins environ 100 fois au potentiel de prolifération des cellules souches kératinocytaires obtenues par les procédés classiques.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de kératinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ S mn à
environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la 1 S récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par tryspination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.
Par « population de cellules souches kératinocytaires » on désigne une population de kératinocytes possédant un potentiel d'expansion à long terme élevé, incluant des cellules clonogéniques, et capable de reconstruire un épiderme.
Par « préparation de kératinocytes », on désigne l'ensemble des kératinocytes obtenus à
partir d'un prélèvement cutané ou d'autres sources possibles de cellules souches capables de générer de la peau (par exemple follicule pileux).
L'adhésion se fait par dépôt de la préparation de kératinocytes sur un substrat d'adhésion auquel un composant de matrices extracellulaires est adsorbé.
Les cellules non adhérées au substrat d'adhésion sont éliminées par lavage.
Par « composant de matrices extracellulaires », on désigne notamment des molécules telles que les collagènes, la laminine, la fibronectine, les protéoglycanes (1 à 7).
L'adhésion des cellules peut être notamment vérifiée en réalisant des lavages dans des conditions classiques du substrat d'adhésion. Les cellules adhérentes sélectionnées ne sont pas décollées par ce moyen.
KERATINOCYTAIRES
L'invention a pour objet un procédé d'enrichissement de cellules souches kératinocytaires.
L'invention a également pour objet des cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel d'expansion élevé.
Le tissu hématopoïétique et la peau présentent des similitudes au niveau de leur organisation. Il s'agit de systèmes biologiques dynamiques et hiérarchisés, dans lesquels de grandes quantités de cellules matures sont continuellement produites et renouvelées, durant toute la vie de l'individu. Les cellules qui les composent peuvent être .
schématiquement classées dans 3 compartiments selon leur stade d'évolution. Cependant, il n'existe pas de frontières nettement définies entre ces compartiments, chacun d'eux étant en réalité constitué
1 S d'un continuum de cellules au degré de maturation variable, et donc très hétérogène.
Un premier compartiment est composé de .cellules matures différenciées dont le potentiel de prolifération est très limité ou nul (lymphocytes, macrophages, mégacaryocytes, érythrocytes ; kératinocytes des couches suprabasales de l'épiderme).
Un deuxième compartiment englobe une population de cellules qui possèdent un potentiel de prolifération variable mais limité qu'elles perdent progressivement en s'engageant vers la différenciation (progéniteurs et précurseurs hématopoïétiques ;
kératinocytes en phase transitoire d'amplification).
Un troisième compartiment est constitué de cellules rares situées en amont dans la hiérarchie de ces systèmes. Il englobe les cellules souches (cellule souche hématopoïétique ;
cellule souche kératinocytaire) notamment caractérisées par le fait que, bien que demeurant majoritairement dans un état de quiescence, ces cellules possèdent un potentiel d'expansion à
long terme très important, mais aussi notamment caractérisées par leur capacité
d'autorenouvellement.
Le phénotype des cellules souches kératinocytaires n'étant encore qu'imparfaitement caractérisé, ces cellules demeurent à ce jour difficiles à purifier, difficiles à sélectionner, et par conséquent on ne dispose à ce jour d'aucun procédé efficace d'enrichissement de cellules souches kératinocytaires.
L'un des buts de l'invention est de proposer un procédé efficace, permettant d'obtenir une population de cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel d'expansion à long terme élevé.
L'un des buts de l'invention est de fournir une population de cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel de prolifération supérieur d'au moins environ 100 fois au potentiel de prolifération des cellules souches kératinocytaires obtenues par les procédés classiques.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de kératinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ S mn à
environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la 1 S récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par tryspination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.
Par « population de cellules souches kératinocytaires » on désigne une population de kératinocytes possédant un potentiel d'expansion à long terme élevé, incluant des cellules clonogéniques, et capable de reconstruire un épiderme.
Par « préparation de kératinocytes », on désigne l'ensemble des kératinocytes obtenus à
partir d'un prélèvement cutané ou d'autres sources possibles de cellules souches capables de générer de la peau (par exemple follicule pileux).
L'adhésion se fait par dépôt de la préparation de kératinocytes sur un substrat d'adhésion auquel un composant de matrices extracellulaires est adsorbé.
Les cellules non adhérées au substrat d'adhésion sont éliminées par lavage.
Par « composant de matrices extracellulaires », on désigne notamment des molécules telles que les collagènes, la laminine, la fibronectine, les protéoglycanes (1 à 7).
L'adhésion des cellules peut être notamment vérifiée en réalisant des lavages dans des conditions classiques du substrat d'adhésion. Les cellules adhérentes sélectionnées ne sont pas décollées par ce moyen.
2
3 PCT/FR02/03738 Si la durée de l'adhésion est inférieure à 5 mn, le rendement de récupération est faible, par exemple inférieur à 1% par rapport à l'ensemble des cellules contenues dans la préparation de kératinocytes.
Si la durée de l'adhésion est supérieure à 30 mn, la séparation est peu discriminative, par exemple au moins 30% des cellules contenues dans la préparation de kératinocytes sont récupérées.
Le décollement a lieu dans des conditions permettant de maintenir une bonne viabilité
des cellules, c'est à dire de conserver l'ensemble des cellules vivantes (>97%
de cellules vivantes après décollement).
La viabilité des cellules peut être notamment déterminée la méthode d'exclusion au bleu Trypan (8).
Le procédé de l'invention permet avantageusement d'obtenir une population de cellules adhérentes présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 109.
L'expression « population de cellules adhérentes présentant un potentiel d'expansion supérieur à environ 109 » signifie. que la population en question peut être amplifiée d'un facteur supérieur à environ 109 et donc générer environ 109 fois plus d~e cellules qu'il en a été
utilisé pour initier les cultures.
Le potentiel d'expansion est estimé par la mise en oeuvre de cultures à long terme (supérieures à 100 jours) permettant d'établir une courbe d'expansion cumulée (par référence à
la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le pourcentage de cellules adhérentes représente environ 5 % à
environ 20 %, notamment environ 10 %, des cellules contenues dans la préparation de kératinocytes.
Un autre mode de réalisation avantageux concerne un procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de kératinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à
environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par tryspination, notamment. à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 70% des cellules adhérentes exprimant la chaîne a6 des intégrines.
L'expression de la chaîne a6 des intégrines est notamment déterminée par marquage immunophénotypique et analyse par cytométrie en flux.
Selon un mode de réalisation de l'invention les cellules adhérentes expriment fortement la chaîne a6 des intégrines.
L'expression « expriment fortement la chaîne a6 des intégrines » signifie que l'intensité
moyenne de fluorescence est supérieure à 55 au jour 1, selon les données d'un F.A.C.S.
VANTAGE Becton Dickinson.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans le procédé selon l'invention, la population de cellules adhérentes comprend des cellules clonogéniques, notamment à raison d'au moins environ 1 %, notamment à raison d'au moins 2 % par rapport aux cellules adhérentes.
Par « cellules clonogéniques », on désigne des cellules possédant la capacité
de donner naissance à un clone cellulaire.
On peut vérifier le caractère de clonogénicité des cellules par la mise en oeuvre d'un test de culture à court terme (de 6 à 12 jours) (par référence à la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
L'étape de pré-enrichissement du procédé de l'invention permet d'obtenir des cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x lOlo L'expression « cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 101° » signifie que les cellules clonogéniques contenues dans la population de cellules adhérentes possèdent en moyenne la capacité de générer une filliation d'au moins environ 5 x 101° kératinocytes.
Seules les cellules clonogéniques participent effectivement à l'expansion.
Comme indiqué ci-dessus, étant donné qu'environ 1% à 2% des cellules de la population adhérente sont clonogéniques, il en résulte que le potentiel d'expansion de ces cellules clonogéniques est environ 50 à 100 fois supérieur à celui estimé à l'échelle de la population cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé d'enrichissement selon l'invention, comprend, après l'étape de pré-enrichissement, une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique sur les cellules adhérentes et récupération de la fraction de cellules adhérentes qui représente environ 20 %
à environ 50 des cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique,
Si la durée de l'adhésion est supérieure à 30 mn, la séparation est peu discriminative, par exemple au moins 30% des cellules contenues dans la préparation de kératinocytes sont récupérées.
Le décollement a lieu dans des conditions permettant de maintenir une bonne viabilité
des cellules, c'est à dire de conserver l'ensemble des cellules vivantes (>97%
de cellules vivantes après décollement).
La viabilité des cellules peut être notamment déterminée la méthode d'exclusion au bleu Trypan (8).
Le procédé de l'invention permet avantageusement d'obtenir une population de cellules adhérentes présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 109.
L'expression « population de cellules adhérentes présentant un potentiel d'expansion supérieur à environ 109 » signifie. que la population en question peut être amplifiée d'un facteur supérieur à environ 109 et donc générer environ 109 fois plus d~e cellules qu'il en a été
utilisé pour initier les cultures.
Le potentiel d'expansion est estimé par la mise en oeuvre de cultures à long terme (supérieures à 100 jours) permettant d'établir une courbe d'expansion cumulée (par référence à
la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le pourcentage de cellules adhérentes représente environ 5 % à
environ 20 %, notamment environ 10 %, des cellules contenues dans la préparation de kératinocytes.
Un autre mode de réalisation avantageux concerne un procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de kératinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à
environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par tryspination, notamment. à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 70% des cellules adhérentes exprimant la chaîne a6 des intégrines.
L'expression de la chaîne a6 des intégrines est notamment déterminée par marquage immunophénotypique et analyse par cytométrie en flux.
Selon un mode de réalisation de l'invention les cellules adhérentes expriment fortement la chaîne a6 des intégrines.
L'expression « expriment fortement la chaîne a6 des intégrines » signifie que l'intensité
moyenne de fluorescence est supérieure à 55 au jour 1, selon les données d'un F.A.C.S.
VANTAGE Becton Dickinson.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans le procédé selon l'invention, la population de cellules adhérentes comprend des cellules clonogéniques, notamment à raison d'au moins environ 1 %, notamment à raison d'au moins 2 % par rapport aux cellules adhérentes.
Par « cellules clonogéniques », on désigne des cellules possédant la capacité
de donner naissance à un clone cellulaire.
On peut vérifier le caractère de clonogénicité des cellules par la mise en oeuvre d'un test de culture à court terme (de 6 à 12 jours) (par référence à la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
L'étape de pré-enrichissement du procédé de l'invention permet d'obtenir des cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x lOlo L'expression « cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 101° » signifie que les cellules clonogéniques contenues dans la population de cellules adhérentes possèdent en moyenne la capacité de générer une filliation d'au moins environ 5 x 101° kératinocytes.
Seules les cellules clonogéniques participent effectivement à l'expansion.
Comme indiqué ci-dessus, étant donné qu'environ 1% à 2% des cellules de la population adhérente sont clonogéniques, il en résulte que le potentiel d'expansion de ces cellules clonogéniques est environ 50 à 100 fois supérieur à celui estimé à l'échelle de la population cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé d'enrichissement selon l'invention, comprend, après l'étape de pré-enrichissement, une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique sur les cellules adhérentes et récupération de la fraction de cellules adhérentes qui représente environ 20 %
à environ 50 des cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique,
4 ladite expression étant mesurée par cytométrie de flux, cette fraction étant désignée par fraction « récepteur mitogénique fable ».
L'étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique permet de séparer les cellules adhérentes en 2 fractions une fraction désignée par fraction « récepteur mitogénique f°rt » qui exprime le plus fortement le récepteur mitogénique et l'autre désignée par fraction «
récepteur mitogéniquefa'b~e » qui contient 20 % à 50 % des cellules adhérentes exprimant le plus faiblement le récepteur mitogénique.
Les résultats obtenus ont démontré de manière reproductible que les kératinocytes les plus primitifs qui possèdent le potentiel d'expansion le plus important sont significativement enrichis dans la fraction récepteur mitogéniquefa'b~e.
Par « récepteur mitogénique », on désigne un récepteur capable d'induire l'entrée en mitose et donc de stimuler la prolifération cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans le procédé
d'enrichissement selon l'invention, le récepteur mitogénique est choisi dans le groupe comprenant les récepteurs de facteurs de croissance capables d'induire la prolifération de cellules souches kératinocytaires et notamment le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF-R), et le récepteur du facteur de croissance kératinocytaire (KGF-R).
Par « récepteur de facteurs de croissances capables d'induire la prolifération des cellules souches kératinocytaires », on désigne tout récepteur dont le ligand est un facteur de çroissance capable de stimuler (entrée en mitose et la prolifération des cellules souches kératinocytaires.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le pourcentage de cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique est d'environ 2 % à environ 5 %, par rapport aux cellules contenues dans la préparation de kératinocytes.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le récepteur mitogénique est EGF-R.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend - une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion sur collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide
L'étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique permet de séparer les cellules adhérentes en 2 fractions une fraction désignée par fraction « récepteur mitogénique f°rt » qui exprime le plus fortement le récepteur mitogénique et l'autre désignée par fraction «
récepteur mitogéniquefa'b~e » qui contient 20 % à 50 % des cellules adhérentes exprimant le plus faiblement le récepteur mitogénique.
Les résultats obtenus ont démontré de manière reproductible que les kératinocytes les plus primitifs qui possèdent le potentiel d'expansion le plus important sont significativement enrichis dans la fraction récepteur mitogéniquefa'b~e.
Par « récepteur mitogénique », on désigne un récepteur capable d'induire l'entrée en mitose et donc de stimuler la prolifération cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans le procédé
d'enrichissement selon l'invention, le récepteur mitogénique est choisi dans le groupe comprenant les récepteurs de facteurs de croissance capables d'induire la prolifération de cellules souches kératinocytaires et notamment le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF-R), et le récepteur du facteur de croissance kératinocytaire (KGF-R).
Par « récepteur de facteurs de croissances capables d'induire la prolifération des cellules souches kératinocytaires », on désigne tout récepteur dont le ligand est un facteur de çroissance capable de stimuler (entrée en mitose et la prolifération des cellules souches kératinocytaires.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le pourcentage de cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique est d'environ 2 % à environ 5 %, par rapport aux cellules contenues dans la préparation de kératinocytes.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, le récepteur mitogénique est EGF-R.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend - une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion sur collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide
5 de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, - une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-Rfaible, Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend - une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion sur collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 70% desdites cellules adhérentes exprimant la chaîne a6 des intégrines, - une étape d'enrichissement par détection du~~niveau d'expression du récepteur EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-Rfaible.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend - une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion d'une préparation de kératinocytes sur un composant de matrices eXtracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 70% desdites cellules adhérentes exprimant la chaîne a6 des intégrines, - une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-Rfaible, Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend - une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion sur collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 70% desdites cellules adhérentes exprimant la chaîne a6 des intégrines, - une étape d'enrichissement par détection du~~niveau d'expression du récepteur EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-Rfaible.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon l'invention comprend - une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion d'une préparation de kératinocytes sur un composant de matrices eXtracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ 70% desdites cellules adhérentes exprimant la chaîne a6 des intégrines, - une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes
6 présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-Rfaible, Dans lé procédé d'enrichissement selon l'invention, la fraction EGF-Rfa'nte présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 101°.
L'expression « fraction EGF-Rfa'b~e présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 101° » signifie que la population de cellules adhérentes peut être amplifiée d'un facteur supérieur à environ 101° et donc générer environ 101°
fois plus de cellules qu'il en a été
utilisé pour initier les cultures.
Le potentiel d'expansion est estimé par la mise en oeuvre de cultures à long terme permettant d'établir une courbe d'expansion cumulée (par référence à la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, la fraction EGF-Rfa'b~e comprend des cellules clonogéniques, notamment au moins environ 1 % et notamment au moins environ 2 % par rapport aux cellules contenues dans la fraction EGF-R faib~e Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 1011 L'expression « cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 101 ~ » signifie que les cellules clonogéniques contenues dans la population de cellules adhérentes EGF-Rfa'b1e possèdent en moyenne la capacité
de générer une filliation d'au moins environ 5 x 1011 kératinocytes.
Environ 1 % à 2% des cellules de la fraction EGF-R faible sont clonogéniques, et il en résulte que le potentiel d'expansion de ces cellules est environ 50 à 100 fois supérieur à celui estimé à (échelle de la fraction cellulaire.
L'invention concerne également un procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprenant la mise en culture de la fraction « récepteur mitogénique faib~e »
obtenue selon le procédé défini ci-dessus, avec une densité d'ensemencement d'environ 2 500 à environ 7 000 cellules/cm2, pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi d'un décollement dans des conditions permettant le détachement des cellules dans des conditions n'altérant pas leur viabilité, et d'un repiquage, les étapes de décollement et de repiquage successives ayant lieu lorsque la densité cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / cm2.
L'expression « fraction EGF-Rfa'b~e présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 101° » signifie que la population de cellules adhérentes peut être amplifiée d'un facteur supérieur à environ 101° et donc générer environ 101°
fois plus de cellules qu'il en a été
utilisé pour initier les cultures.
Le potentiel d'expansion est estimé par la mise en oeuvre de cultures à long terme permettant d'établir une courbe d'expansion cumulée (par référence à la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement selon l'invention, la fraction EGF-Rfa'b~e comprend des cellules clonogéniques, notamment au moins environ 1 % et notamment au moins environ 2 % par rapport aux cellules contenues dans la fraction EGF-R faib~e Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 1011 L'expression « cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 101 ~ » signifie que les cellules clonogéniques contenues dans la population de cellules adhérentes EGF-Rfa'b1e possèdent en moyenne la capacité
de générer une filliation d'au moins environ 5 x 1011 kératinocytes.
Environ 1 % à 2% des cellules de la fraction EGF-R faible sont clonogéniques, et il en résulte que le potentiel d'expansion de ces cellules est environ 50 à 100 fois supérieur à celui estimé à (échelle de la fraction cellulaire.
L'invention concerne également un procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprenant la mise en culture de la fraction « récepteur mitogénique faib~e »
obtenue selon le procédé défini ci-dessus, avec une densité d'ensemencement d'environ 2 500 à environ 7 000 cellules/cm2, pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi d'un décollement dans des conditions permettant le détachement des cellules dans des conditions n'altérant pas leur viabilité, et d'un repiquage, les étapes de décollement et de repiquage successives ayant lieu lorsque la densité cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / cm2.
7 La densité d'ensemencement doit être telle que l'expansion cellulaire obtenue entre 2 repiquages successifs soit la plus importante possible, c'est à dire que le nombre de cellules puisse par exemple être multiplié par environ au moins 15 lorsque les kératinocytes sont en phase de croissance exponentielle (expansion cellulaire supérieure à environ 15).
Si la densité d'ensemencement est inférieure à 2 500 cellules / cm2 ou si elle est supérieure à 7 000 cellules / cmz, l'expansion cellulaire obtenue entre 2 repiquages successifs (lorsque les cellules sont en phase de croissance exponentielle) est inférieure à 15 et donc non optimale.
On décolle les cellules lorsque le nombre de cellules obtenu est d'environ 120 cellules / cmz afin d'éviter que les cultures atteignent un état de confluence, un tel état entraînant un engagement des cellules vers la différentiation et conduisant à
un arrêt de la prolifération.
A la suite du décollement, on effectue un repiquage des cultures qui sont réensemencées à une densité comprise entre environ 2 500 et 7 000 cellules / cmz.
Les étapes de décollement et de repiquage successifs sont effectués lorsque la densité
cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / ces?.
Le procédé de culture s'arrête lorsque le potentiel d'expansion de la population cellulaire testée est épuisé : la culture entre dans un état de sénescence et cesse spontanément de proliférer.
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé de culture de cellules souches kératinocytaires selon l'invention, l'étape de décollement a lieu dans des conditions permettant d'une part le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 % et d'autre part le détachement de cellules les plus difficiles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA
0,02 %.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprend la mise en culture de la fraction EGF-R faible définie ci-dessus, avec une densité d'ensemencement d'environ 2500 à environ 7000 cellules/cm2 pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi du décollement dans des conditions permettant le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, à l'aide de trypsine 0,05 % +
EDTA 0,02 % et le détachement des cellules les plus difficiles à détacher à
l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA 0,02 %, et suivi du repiquage des cellules souches obtenues.
L'invention concerne une composition de cellules souches telles qû'obtenues par mise en oeuvre de l'étape de pré-enrichissement telle que définie ci-dessus.
Si la densité d'ensemencement est inférieure à 2 500 cellules / cm2 ou si elle est supérieure à 7 000 cellules / cmz, l'expansion cellulaire obtenue entre 2 repiquages successifs (lorsque les cellules sont en phase de croissance exponentielle) est inférieure à 15 et donc non optimale.
On décolle les cellules lorsque le nombre de cellules obtenu est d'environ 120 cellules / cmz afin d'éviter que les cultures atteignent un état de confluence, un tel état entraînant un engagement des cellules vers la différentiation et conduisant à
un arrêt de la prolifération.
A la suite du décollement, on effectue un repiquage des cultures qui sont réensemencées à une densité comprise entre environ 2 500 et 7 000 cellules / cmz.
Les étapes de décollement et de repiquage successifs sont effectués lorsque la densité
cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / ces?.
Le procédé de culture s'arrête lorsque le potentiel d'expansion de la population cellulaire testée est épuisé : la culture entre dans un état de sénescence et cesse spontanément de proliférer.
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé de culture de cellules souches kératinocytaires selon l'invention, l'étape de décollement a lieu dans des conditions permettant d'une part le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 % et d'autre part le détachement de cellules les plus difficiles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA
0,02 %.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprend la mise en culture de la fraction EGF-R faible définie ci-dessus, avec une densité d'ensemencement d'environ 2500 à environ 7000 cellules/cm2 pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi du décollement dans des conditions permettant le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, à l'aide de trypsine 0,05 % +
EDTA 0,02 % et le détachement des cellules les plus difficiles à détacher à
l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA 0,02 %, et suivi du repiquage des cellules souches obtenues.
L'invention concerne une composition de cellules souches telles qû'obtenues par mise en oeuvre de l'étape de pré-enrichissement telle que définie ci-dessus.
8 L'invention concerne également une composition de cellules souches telles qu'obtenues par mise en oeuvre du procédé selon l'invention L'invention concerne également une composition de cellules kératinocytaires souches comprenant des cellules souches kératinocytaires, (CSK), possédant un potentiel d'expansion S égal ou supérieur à 101°.
L'invention concerne également une composition de CSK telle que définie ci-dessus, dans laquelle les CSK sont viables.
L'invention concerne également une composition de cellules souches telle que définie ci-dessus, contenant des CSK à la surface desquelles le niveau d'expression d'un récepteur mitogénique est faible, le qualificatif « faible » étant défini de manière relative par rapport au profil d'expression du récepteur mitogénique observé dans la dite composition de CSK.
L'invention concerne une composition de cellules souches telle que définie ci-dessus, dans laquelle le niveau d'expression du récepteur de fEGF (EGF-R) est faible.
L'invention concerne l'utilisation d'une cômposition de cellules kératinocytaires souches telle que définie ci-dessus, pour la reconstruction de peau.
Un mode de réalisation détaillé de l'invention est décrit ci-après.
I/ Pré-sélection d'une population cellulaire de cellules « adhérentes », gui représente 10% des kératinocytes totaux et englobe l'essentiel des CSKs.
1- Sélection des cellules de la population de cellules « adhérentes » : La méthode de sélection repose sur la capacité d'adhésion des kératinocytes. Le substrat d'adhésion choisi est un support de plastique sur lequel du collagène de type I est adsorbé. On dépose les préparations de kératinocytes issus de prélèvements cutanés sur le substrat d'adhésion, puis on procède à une incubation à 37°C pendant un temps court. Les cellules n'ayant pas adhéré au support sont prélevées, puis les cellules adhérentes sont décollées par trypsination douce et récupérées séparément. Il a été déterminé qu'une durée d'incubation de 12 minutes est adaptée à la sélection d'une population enrichie en cellules capables d'initier une expansion cellulaire in vitro. Les cellules ayant adhéré sont désignées par « adhérentes ».
2 - Caractéristiques phénotypiques des cellules de la population de cellules « adhérentes » : Des analyses de l'expression de molécules de surface impliquée dans l'adhésion cellulaire ont été réalisées par cytométrie en flux sur la population non fractionnée, ainsi que sur la population de cellules adhérentes et sur la population de cellules non-
L'invention concerne également une composition de CSK telle que définie ci-dessus, dans laquelle les CSK sont viables.
L'invention concerne également une composition de cellules souches telle que définie ci-dessus, contenant des CSK à la surface desquelles le niveau d'expression d'un récepteur mitogénique est faible, le qualificatif « faible » étant défini de manière relative par rapport au profil d'expression du récepteur mitogénique observé dans la dite composition de CSK.
L'invention concerne une composition de cellules souches telle que définie ci-dessus, dans laquelle le niveau d'expression du récepteur de fEGF (EGF-R) est faible.
L'invention concerne l'utilisation d'une cômposition de cellules kératinocytaires souches telle que définie ci-dessus, pour la reconstruction de peau.
Un mode de réalisation détaillé de l'invention est décrit ci-après.
I/ Pré-sélection d'une population cellulaire de cellules « adhérentes », gui représente 10% des kératinocytes totaux et englobe l'essentiel des CSKs.
1- Sélection des cellules de la population de cellules « adhérentes » : La méthode de sélection repose sur la capacité d'adhésion des kératinocytes. Le substrat d'adhésion choisi est un support de plastique sur lequel du collagène de type I est adsorbé. On dépose les préparations de kératinocytes issus de prélèvements cutanés sur le substrat d'adhésion, puis on procède à une incubation à 37°C pendant un temps court. Les cellules n'ayant pas adhéré au support sont prélevées, puis les cellules adhérentes sont décollées par trypsination douce et récupérées séparément. Il a été déterminé qu'une durée d'incubation de 12 minutes est adaptée à la sélection d'une population enrichie en cellules capables d'initier une expansion cellulaire in vitro. Les cellules ayant adhéré sont désignées par « adhérentes ».
2 - Caractéristiques phénotypiques des cellules de la population de cellules « adhérentes » : Des analyses de l'expression de molécules de surface impliquée dans l'adhésion cellulaire ont été réalisées par cytométrie en flux sur la population non fractionnée, ainsi que sur la population de cellules adhérentes et sur la population de cellules non-
9 adhérentes (Fi ure 9 . On a observé que la population de cellules adhérentes est significativement enrichie en cellules exprimant la chaîne a6 des intégrines (CD49f) (environ 70% des cellules présentent l'intégrine a6 à leur surface), critère associé
aux kératinocytes les plus primitifs, alors que la population de cellules non adhérentes en est moins riche (environ 30% des cellules présentent l'intégrine a6 à leur surface). Une expression des chaînes a2 et ~i 1 des intégrines est détectée de manière moins spécifique à la surface des cellules issues des populations totales (non-fractionnées), adhérentes, et non adhérentes.
3 - Caractéristigues fonctionnelles des cellules de la population de cellules « adhérentes » : Une statistique effectuée sur plusieurs prélèvements indépendants (n>5 expériences) montre que la population de cellules adhérentes ne représente que
aux kératinocytes les plus primitifs, alors que la population de cellules non adhérentes en est moins riche (environ 30% des cellules présentent l'intégrine a6 à leur surface). Une expression des chaînes a2 et ~i 1 des intégrines est détectée de manière moins spécifique à la surface des cellules issues des populations totales (non-fractionnées), adhérentes, et non adhérentes.
3 - Caractéristigues fonctionnelles des cellules de la population de cellules « adhérentes » : Une statistique effectuée sur plusieurs prélèvements indépendants (n>5 expériences) montre que la population de cellules adhérentes ne représente que
10,4% des kératinocytes totaux, mais présente un enrichissement important en cellules clonogéniques (Figure lA). En effet, la réalisation de tests clonogéniques à court terme (6 jours) sur ces deux populations de cellules indique que 2,3% des kératinocytes issus de la population de cellules non-adhérentes en 12 minutes possèdent la capacité de générer des clones sur un support de plastique alors que seulement 0,2% des céllules de la population des cellules non-adhérentes sont clonogéniques Fi ure 1B .
Le contenu de chacune des populations de cellules sélectionnées par la méthode d'adhésion rapide sur collagène de type I en kératinocytes possédant un fort potentiel d'expansion, propriété plus représentative de la fonction physiologique des CSKs, a été
évalué. Les résultats obtenus à partir de plusieurs prélèvements indépendants (n>S
expériences) montrent que les cellules les plus primitives, qui expriment le plus fort potentiel de prolifération à long terme, sont enrichies dans la population de cellules adhérentes Fi ure ~. En effet, les cellules contenues dans cette population permettent d'obtenir une expansion cumulée supérieure à celle de la population totale. En revanche, la population des cellules non adhérentes apparaît majoritairement constituée de kératinocytes plus tardifs, et n'exprime qu'un potentiel de prolifération plus réduit.
lo II/ Tri d'une fraction de cellules dites « adhérentes EGF-Rfa'bie » qui représente 20% à 45% des cellules de la population de cellules « adhérentes », donc 2% à
4,5% des kératinocytes totaux, et englobe l'essentiel des CSKs.
1- Fraction de cellules composée de 45% des cellules de la population de cellules « adhérentes » exprimant le glus faiblement fEGF-R : La population composée des cellules adhérentes en 12 minutes sur collagène de type I a tout d'abord été séparée en 2 fractions de taille équivalente sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R détectable à
leur surface. La fraction qualifiée de « EGF-Rfa'bte » contient 45% des kératinocytes adhérents exprimant le plus faiblement l'EGF-R et la fraction qualifiée de « EGF-Rf°rt »
contient 45% des kératinocytes adhérents exprimant le plus fortement ce récepteur (Fi ure 3 .
Ces expériences ont été réalisées sur plusieurs prélèvements indépendants (n>5). Les résultats obtenus démontrent de manière reproductible que les kératinocytes les plus primitifs qui possèdent le potentiel d'expansion le plus important sont significativement enrichis dans la fraction EGF-Rfa'bie (Fi ure 4 . Ceci corrèle.avec l'observation microscopique des cellules à différents temps de culture, qui révèle une production de kératinocytes de petitè taille indifférenciés à
plus long terme dans les cultures initiées à partir de la fraction EGF-Rfaib~e Fi ure 5 , critère associé aux kératinocytes primitifs (9).
2 - Fraction composée de 20% des cellules de la population de cellules «
adhérentes »
exprimant le plus faiblement fEGF-R : La population de cellules adhérentes a finalement été
séparée en 4 fractions de taille équivalente sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R
détectable à la surface des cellules.
Quatre fractions de représentativité égale et comprenant chacune 20% des cellules de cette population ont été définies comme fractions « EGF-R-~+ », « ÉGF-R~ », «
EGF-R~ », et « EGF-R~ » (Fi ure 6 : les fractions dites « EGF-R-~+ » et « EGF-R~ » sont incluses dans la fraction EGF-Rfa'ble et contiennent chacune 20% des cellules de la population adhérente ; les fractions dites ,« EGF-R+~ » et « EGF-R++~ » sont incluses dans la fraction EGF-Rf°n et contiennent chacune 20% des cellules de la population adhérente. On a observé
une proportionnalité inverse entre le niveau d'expression de l'EGF-R à la surface des cellules ainsi sélectionnées, et leur potentiel de prolifération à long terme (Fi ure 7 . En effet, l'expansion cumulée la plus importante est obtenue à partir de la fraction EGF-R-~+ alors que la valeur obtenue à partir de la fraction EGF-R~ s'avère la moins élevée. Les fractions m EGF-R~ et EGF-R~ se comportent de manière intermédiaire (n>3 expériences indépendantes réalisées).
Ces résultats expérimentaux valident la possibilité d'utiliser un récepteur de facteur de croissance mitogénique (récepteur à tyrosine kinase de l'EGF) comme marqueur phénotypique pour sélectionner une fraction de kératinocytes significativement enrichie en CSKs.
III/ Evaluation optimale du potentiel d'expansion à long terme des populations de kératinocytes sélectionnées.
1- Trypsination ménagée des cellules lors des repiquages successifs :
L'objectif est de limiter le stress occasionné aux cellules lors des décollements et repiquages successifs des cultures à long terme, problème qui pourrait conduire à une sous estimation de leur potentiel.
On effectue tout d'abord un traitement protéolytique ménagé (trypsine 0,05%-EDTA 0,02%) qui permet le décollement d'une partie des cellules tout en évitant de les soumettre à un traitement protéolytique trop drastique qui pourrait altérer leur viabilité.
Les cellules les plus difficiles à détacher pour lesquelles la protéolyse douce s'est avérée inefficace sont ensuite soumises à un traitement protéolytique plus fort (trypsine 0,25%-EDTA 0,02%), ce qui permet finalement de récupérer (ensemble de la population. Une étude comparative de l'impact de différentes méthodes de décollement sur la viabilité des cellules a été réalisée.
2 - Densité d'ensemencement des flacons de culture adaptée pour une expansion optimale des kératinoc es : Afin d'évaluer quelles densités d'ensemencement sont compatibles avec une bonne mise en évidence du potentiel d'expansion des cellules testées, lors de l'initiation des cultures à long terme ainsi qu'à chaque repiquâge successif, on a réalisé
des expériences sur une durée de 7 jours. Celles-ci ont permis de déterminer que des densités d'ensemencement comprises entre 2500 et 7000 cellules / cm2 sont les plus adaptées puisqu'elles permettent d'obtenir une expansion cellulaire d'un facteur 15 à
20, alors que des densités d'ensemencement inférieures et supérieures donnent de moins bons résultats.
Figures lA et 1B : Représentativité et clonogénicité des populations cellulaires de cellules « adhérentes » et de cellules « non adhérentes ».
Les figures lA et 1B montrent l'enrichissement en cellules clonogéniques obtenu après sélection par la méthode d'adhésion sur collagène de type I.
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été
séparés en une population cellulaire dite « adhérente » et une population dite « non adhérente » par une étape d'adhésion de 12 minutes sur du collagène de type I. La représentativité de chaque fraction par rapport à la population cellulaire totale a été évaluée, ainsi que leur contenu en kératinocytes clonogéniques.
Sur la figure lA, on a représenté le pourcentage de cellules constituant la population de cellules adhérentes par rapport aux cellules totales (colonne hachurée) et le pourcentage de cellules constituant la population de cellules non adhérentes par rapport aux cellules totales (colonne pleine).
Sur la figure 1B, on a représenté le pourcentage de cellules clonogéniques respectivement dans la population de cellules adhérentes (colonne hachurée) et dans la population de cellules adhérentes (colonne pleine). y Les résultats obtenus montrent que la population cellulaire dite « adhérente »
est significativement enrichie en cellules clonogéniques, puisqu'elle ne représente que 10% des kératinocytes totaux mais contient un pourcentage de cellules clonogéniques 10 fois plus élevé que celui de la population dite « non adhérente ».
Figure 2 : Comparaison du potentiel d'expansion des kératinocytes contenus dans la population non fractionnée, des populations de cellules « adhérentes » et «
non adhérentes ». ' Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été
séparés en une population cellulaire dite « adhérente » et une population dite « non adhérente » par une étape d'adhésion de 12 minutes sur du collagène de type I. Les cellules contenues dans les 2 populations, ainsi que celles de la population totale non fractionnée, ont été
soumises à un test de culture à long terme (nombre total cumulé de cellules produites), afin de comparer leur potentiel d'expansion.
On a représenté en abscisses le temps (exprimé en nombre de jours) et en ordonnées l'expansion cumulée (nombre de cellules produites au jour X / nombre de cellules au jour 1).
La courbe avec des carrés noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la population totale, celles avec des triangles à partir des cellules de la population adhérente (12 minutes sur collagène I) et celles avec des ronds à partir des cellules de la population non-adhérente ( 12 minutes sur collagène I).
Les résultats obtenus montrent que la population cellulaire dite « adhérente »
contient l'essentiel des cellules primitives à fort potentiel d'expansion, alors que la population cellulaire dite « non adhérente » est majoritairement composée de kératinocytes plus tardifs qui n'expriment qu'un potentiel d'expansion réduit.
Figures 3A et 3B : Séparation de la population de kératinocytes de cellules « adhérentes » en 2 fractions sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R.
Des kératinocytes de la fraction dite « adhérente », pré-enrichie en cellules primitives par une étape d'adhésion sur collagène de type I, ont été marqués par un anticorps fluorescent dirigé contre l'EGF-R (anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de l'EGF-R). Le signal a été analysé de manière semi-quantitative par cytométrie en flux:
La figure 3A présente un profil de marquage représentatif de fEGF-R obtenu à
partir de kératinocytes de la fraction adhérente (surface la plus sombre), ainsi que le profil contrôle correspondant (surface la plus claire). L'axe des abscisses représente l'intensité de fluorescente mesurée par cytométrie en flux et exprimée en échelle logarithmique. L'axe des ordonnées représente la distribution des cellules analysées en fonction de (intensité du signal fluorescent mesuré.
La figure 3B permet de visualiser la distribution Gaussienne du niveau d'expression de l'EGF-R à la surface des kératinocytes de la fraction adhérente (axes des abscisses et ordonnées identiques à ceux de la figure 3A). Les résultats obtenus montrent une distribution du signal suffisamment étalée pour permettre le tri de cellules exprimant soit faiblement fEGF-R, soit fortement ce récepteur. Le profil présenté illustre une séparation de la population adhérente en 2 fractions : l'une, dite « EGF-Rfa'6~e », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rf°n », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à
leur surface.
Figure 4 : Comparaison du potentiel d'expansion à long terme des kératinocytes contenus dans les fractions de phénotype " EGF-Rfa~ble " et " EGF-Rf°rc ".
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en 2 fractions : l'une, dite « EGF-Rfa,bie », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rf°rt », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. Le potentiel d'expansion à
long terme (nombre total cumulé de cellules produites) de ces 2 fractions a été comparé.
L'axe des abscisses correspond au temps de culture exprimé en jours et l'axe des ordonnées à l'expansion cumulée déjà définie.
La courbe avec des carrés noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la fraction EGF-Rfa;bie et celle avec des losanges à partir des cellules de la fraction EGF-Rf°'~.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-Rfa'b~e »
contient l'essentiel des cellules primitives à fort potentiel d'expansion, alors que les cellules de la fraction cellulaire dite « EGF-Rf°'~' » possèdent un potentiel d'expansion moins important.
Figures SA, SB, SC et SD : Cultures issues des fractions " EGF-Rfa'bie " et " EGF-Rfort "~
La figure SA correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfa'b~e (Jour 34 de culture) La figure SB correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rf°n (Jour 34 de culture) La figure SC correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfa'ble (Jour 70 de culture) La figure SD correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rf°rt (Jour 70 de culture) Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en deux fractions : fane, dite « EGF-Rfa'b~e », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rf°rt », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. La production de cellules de petite taille, critère associé aux CSKs, a été suivie au cours du temps par observation microscopique dans les cultures issues de chacune de ces 2 fractions.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-Rfa'b~e »
assure une production plus prolongée de cellules primitives de petite taille que la fraction cellulaire dite « EGF-Rf°rt ».
Figure 6 : Séparation de la population de kératinocytes « adhérente » en 4 fractions sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R.
Des kératinocytes de la population dite « adhérente », pré-enrichie en cellules primitives par une étape d'adhésion sur collagène de type I, ont été marqués par un anticorps fluorescent dirigé contre fEGF-R (anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de l'EGF-R). Le signal a été analysé de manière semi-quantitative par cytométrie en flux.
L'axe des abscisses représente l'intensité de fluorescente mesurée par cytométrie en flux et exprimée en échelle logarithmique. L'axe des ordonnées représente la distribution des cellules analysées en fonction de (intensité du signal fluorescent mesuré.
Le profil de cytométrie en flux présenté illustre une séparation de la population adhérente en 4 fractions : les fractions dites « EGF-R-~+ » et « EGF-R++ »
sont incluses dans la fraction EGF-Rfa'b~e et contiennent chacune 20% des cellules de la population adhérente ; les fractions dites « EGF-R+++ » et « EGF-R++++ » sont incluses dans la fraction EGF-Rf°rt et contiennent chacune 20% des cellules de la population de cellules adhérentes.
Figure 7 : Comparaison du potentiel d'expansion à long terme des kératinocytes contenus dans les fractions de phénotype " EGF-R-~+ ", " EGF-R++ ", " EGF-R+++
", et " EGF-R+++'~ ".
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en 4 fractions : 2 fractions extrêmes contenant respectivement 20% des cellules exprimant le plus faiblement et fortement fEGF-R, « EGF-R-~+ » et « EGF-R++++ », ainsi que 2 fractions présentant des marquages intermédiaires « EGF-R++ » et « EGF-R+++ ~~. Le potentiel d'expansion à long terme de ces 4 fractions a été comparé (nombre total cumulé
de cellules produites).
La courbe avec des triangles noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la fraction EGF-R-~+, celle avec des losanges à partir des .cellules de la fraction EGF-R++, celle avec des ronds à partir des cellules de la fraction EGF-R+++, celle des carrés à partir des cellules de la fraction EGF-R++++.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-R-~+ »
est la plus enrichie en cellules primitives possédant un fort potentiel d'expansion à long terme.
FiEUres 8A, 8B, 8C et 8D : Capacité des cellules primitives Adh+~"+EGF-Rfaibie à générer in vitro un épiderme pluristrati~é.
Le substrat de culture utilisé est un derme humain dévitalisé et exempt d'épiderme, préparé suivant la méthode décrite par Régnier et al., (1981) (10). Les kératinocytes issus des différentes sous-populations, Adh+++EGF-Rf°rc (4 ou 7 passages successifs de cultures) ou Adh+++EGF-Rfa'bte (4 ou 7 passages successifs de cultures), ont été déposés sur ce substrat dermique et cultivés pendant 6 jours dans du milieu DMEM/Ham F12 (invitrogen), contenant 10% de sérum de veau foetal (Invitrogen) ; 10 ng/ml d'EGF (BD Biosciences, USA) ;
0,4 ~g/ml d'hydrocortisone (Sigma Chemical Co) ; 10-6 M de isoprotérénol (Sigma Chemical Co.) ; 5 pg/ml de transfernne (Sigma Chemical Co.) ; 2x10-9 M de triiodothyronine (Sigma Chemical Co.) ; 1,8x10 M d'adénine (Sigma Chemical Co.), et 5 p.g/ml d'insuline (Sigma Chemical Co.). Les cultures ont ensuite été placées à l'interface air-liquide et poursuivies en absence d'isoprotérénol, de transfernne, de trüothyronine et d'adénine.
L'analyse histologique des épidermes reconstruits a été effectuée 7 jours plus tard.
(N.B. Adh+++ signifie qu'il s'agit de kératinocytes issus de la population adhérente suite au pré-enrichissement).
La figure 8A montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e au passage 4. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 wm, est graduée tous les 10 pm.
La figure 8B montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rf°n au passage 4. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 ~m,.est graduée tous les 10 pm.
La figure 8C montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e au passage 7. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 pm, est graduée tous les 10 ~.m.
La figure 8D une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rforc au passage 7. L'épiderme obtenu est dégénératif.
L'échelle représentée, de taille maximale 100 gym, est graduée tous les 10 pm.
Les résultats montrent que le potentiel organogénique de la sous-population Adh~EGF-Rfa'b~e est plus durable que celui des kératinocytes de la sous-population Adh+~EGF-Rf°n.
Figures 9A, 9B et 9C : phénotypage par cytométrie en flux de la population non fractionnée de kératinocytes et des fractions adhérentes et non-adhérentes obtenue après le pré-enrichissement.
Les marquages immuno-phénotypiques sont réalisés sur des échantillons de 50 cellules en suspension dans du PBSBSA à 0,2%. Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines "
issues de la même espèce que les anticorps utilisés pour les marquages (Rat y globulin ou Mouse y globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à
4°C en présence d'un anticorps anti-CD49f FITC (intégrine chaîne a6) produit chez le rat (marquage) (anti-human CD49f FITC rat IgG2a ; GoH3 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (rat IgG2a-FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark) ; d'un anticorps anti-CD49b-PE
(intégrine chaîne a2) produit chez la souris (marquage) (anti-human CD49b-PE
mouse IgGza ;
12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG2~ PE isotypic control; 6155-178 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ; d'un anticorps anti-CD29-PE (intégrine chaîne (31) produit chez le la souris (marquage) (anti-human CD29-FITC mouse IgGI ; 4B4 clone, Coulter Corp., Miami, FL, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG~-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Les cellules sont ensuite lavées en PBSBSA avant d'être analysées par cytométrie en flux. Pour chaque échantillon, les statistiques sont effectuées sur au moins 10 000 événements comptabilisés.
La Figure 9 représente le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (avant passage sur collagène, colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique des intégrines a6, a2 et (31. Ces résultats sont les moyennes et les écarts types obtenus pour 3 expériences indépendantes.
La Figure 9A montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'int~grine a6.
La Figure 9B montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'intégrine a2.
La Figure 9C montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 mina sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'intégrine (31.
Les résultats montrent qu'environ 70% des cellules de la population de cellules adhérentes expriment l'intégrine a6 alors qu'environ 40% des cellules de la population non-fractionnée expriment cette intégrine et que seulement environ 30% des cellules de la population non-adhérente l'expriment.
EXEMPLES
I/ Isolement des kératinocytes à partir d'un prélèvement cutané (prépuce).
Après élimination du tissu sous-cutané à l'aide d'un scalpel, le prélèvement cutané est découpé en fragments d'environ Smm x Smm, puis décontaminé par un traitement antibiotique (Gentamycine (Life Technologies Ltd, Paisley, Scotland), 3 bains successifs de minutes dans du milieu de culture DMEM (Life Technologies Ltd, Scotland)).
Pour permettre la séparation du derme de l'épiderme, le prélèvement est ensuite soumis à un traitement protéolytique (dispase (Boehringer, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, 10 Germany) 1 nuit à 4°C, puis 30 minutes à 37°C). Les fragments d'épiderme séparés du tissu dermique sont placés dans une solution de trypsine 0,05%-EDTA 0,02%
(Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) (15 minutes à 37°C). La préparation est agitée périodiquement pour favoriser la dissociation des cellules. L'effet de la trypsine est ensuite neutralisé par l'ajout d'un milieu de culture contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF) (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) (DMEM+10%SVF). La suspension cellulaire est homogénéisée, puis lavée dans du milieu de culture pour kératinocytes (Keratinocyte growth medium, KGM) (KGM Bullet Kit, BioWhittaker, Clonetics Corp., San Diego, CA, USA). Les cellules en suspension sont comptées au microscope à l'aide d'une cellule de Malassez. La viabilité des échantillons est estimée par la méthode d'exclusion au bleu Trypan (Life Technology, Cergy Pontoise Cedex, France).
II/ Enrichissement d'une préparation de kératinocytes en cellules primitives de la couche basale de l'épiderme.
La couche basale de l'épiderme contient les kératinocytes les plus primitifs dits " souches ". Ces cellules peuvent être séparées des kératinocytes plus matures sur la base de leur propriété d'adhésion rapide. Cette étape permet un pré-enrichissement de la préparation en cellules primitives.
La suspension cellulaire est placée dans des flacons de culture « recouverts »
avec du collagène de type I (solution de collagène I (Sigma Chemical Co Ltd, Irvine, LTK) diluée d'un facteur 2 dans du PBS, déposée pendant 45 minutes dans les flacôns, puis séchage après élimination du surplus), à une densité de 200 000 cellules/cm2. Après 12 minutes, les kératinocytes n'ayant pas adhéré sont éliminés par lavage en tampon PBS. Les cellules adhérentes ainsi sélectionnées sont détachées du support par une trypsination douce (trypsine 0,05%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 3 à 5 minutes à 37°C). Après neutralisation de la trypsine (DMEM+10%SVF), les cellules sont récupérées, lavées, puis remises en suspension dans du milieu KGM. La fraction des cellules adhérentes sélectiônnée par cette méthode représente environ 10% des kératinocytes totaux de l' épiderme.
III/ Tests clonogénigues à court terme.
Les kératinocytes sont cultivés dans du milieu KGM à faible densité (1600, 3200 et/ou 4800 cellules/cm2) afin d'obtenir des clones bien individualisés et aisément observables au microscope. Le milieu de culture est renouvelé 3 fois par semaine jusqu'à
l'arrêt des expériences (6 à 12 jours). Les clones sont alors fixés et colorés, puis comptés et classés suivant le nombre de cellules qui les composent.
Pour la coloration, les préparations sont tout d'abord fixées pendant 30 minutes à
température ambiante avec de la formaline (aldéhyde formique en solution 35%) (Merck, Darmstadt, Germany) diluée à 10% dans du tampon PBS (BioWhittaker Inc., Walkersville, MA, USA), puis lavées 2 fois à l'eau. Les cellules sont ensuite incubées pendant 2 minutes avec de l'hématoxyline filtrée (coloration des noyaux) (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA). Après rinçage à l'eau, les préparations sont séchées à l'air, puis incubées pendant 5 minutes dans de l'éosine (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA) à 1% dans du tampon PBS.
Elles sont à nouveau lavées à l'eau, puis séchées.
IV/ Phénotyua~e par cytométrie en flux de la population non-fractionnée de kératinocytes, des fractions adhérentes et non-adhérentes obtenues après le pré-enrichissement.
Les marquages immuno-phénotypiques sont réalisés sur des échantillons de 50 cellules en suspension dans du PBS/BSA à 0,2%. Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines "
issues de la même espèce que les anticorps utilisés pour les marquages (Rat y globulin ou Mouse y globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à
4°C en présence d'un anticorps anti-CD49f FITC (intégrine chaîne a6) produit chez le rat (marquage) (anti-human CD49f FITC rat IgG2a ; GoH3 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (rat IgG2~ FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark); d'un anticorps anti-CD49b-PE
(intégrine chaîne a2) produit chez la souris (marquage) (anti-human CD49b-PE
mouse IgG2a ;
12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgGZa-PE isotypic control; 6155-178 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ; d'un anticorps anti-CD29-PE (intégrine chaîne (31) produit chez le la souris (marquage) (anti-human CD29-FITC mouse IgG~ ; 4B4 clone, Coulter Corp., Miami, FL, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG~-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Les cellules sont ensuite lavées en PBSBSA avant d'être analysées par cytométrie en flux. Pour chaque échantillon, les statistiques sont effectuées sur au moins 10 000 événements comptabilisés.
Les résultats présentés dans la Figure 9 indiquent que la population de cellules adhérentes sur le collagène de type I exprime fréquemment l'intégrine a6 (environ 70% des cellules positives) par rapport à la population non-fractionnée (environ 40%
des cellules positives) et à la population non-adhérente (environ 30% des cellules positives). La population de cellules adhérentes présente donc un enrichissement significatif en intégrines de type a6 par rapport à la population non fractionnée. J'ar comparaison, les intégrines a2 et (31 ne sont pas des marqueurs adaptés pour l'évaluation de l'enrichissement obtenu car la majorité des cellules des trois populations (non-fractionnée, adhérente, non-adhérente) exprime ces intégrines.
V/ Marguage du récepteur de l'EGF (EGF-R1 pour analyse et tri par cytométrie en flux.
Les cellules en suspension sont centrifugées et reprises dans du tampon PBS
contenant 0,2% de sérum albumine bovine (BSA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) (PBSBSA 0,2%). Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines de rat " (Rat y globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10 minutes à
4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 4°C
en présence d'un anticorps anti-EGF-R (domaine extracellulaire) non conjugué produit chez la souris (marquage) (anti-human EGF-R mouse IgGZb; EGFR1 clone, Dako, Glostrup, Denmark) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype que l'anticorps anti-EGF-R (contrôle isotypique) (mouse IgG2b isotypic control, Immunotech, Marseille, France). Après 2 lavages successifs en PBSBSA 0,2%, les cellules sont incubées en présence d'un anticorps secondaire produit chez le rat et couplé à la phyco-érythrine (PE), capable de reconnaître les anticorps de souris (Rat anti-Mouse IgGza+b-PE, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) (30 minutes à
4°C). Les cellules sont à nouveau lavées 2 fois, avant d'être utilisées pour le tri par cytométrie en flux (FACS Vantage, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
On a séparé la population de kératinocytes adhérents en fractions présentant différents niveaux d'expression de l'EGF-R et trié les cellules qu'elles contiennent afm de les caractériser d'un point de vue fonctionnel.
VI/ Evaluation du potentiel d'expansion à long terme des fractions de kératinocytes triées par cytométrie en flux.
Les cellules de chaque sous-population, triées par cytométrie en flux, sont soumises à
un test fonctionnel permettant d'évaluer leur capacité d'expansion à long terme (propriété
associée aux cellules les plus primitives dites "souches") Après estimation de la viabilité par la méthode d'exclusion au bleu Trypan, 60 cellules de chaque sous-population sont ensemencées dans des flacons de culture non "recouverts", d'une surface de 25 cmz. Le milieu de culture (KGM) -ést changé
3 fois par semaine. Les cellules sont décollées de leur support, comptées et réensemencées à raison de 60 000 cellules viables par flacon de 25 cm2 lorsque les cultures atteignent 70-80% de confluence, afm d'éviter que les cellules ne s'engagent vers la différenciation suite à des phénomènes d'inhibition de contact. Le décollement des cellules est réalisé en 2 étapes successives. Il s'agit tout d'abord d'une trypsination douce (trypsine 0,05%-EDTA 0,02%
(Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 3 à 5 minutes à
37°C) qui permet de détacher environ 80% des cellules. Les cellules les plus difficiles à détacher pour lesquelles la protéolyse douce s'est avérée inefficace sont ensuite soumises à
une trypsination plus forte (trypsine 0,25%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant S minutes à 37°C) qui permet de récupérer l'ensemble de la population cellulaire.
A chaque passage, l'expansion cumulée obtenue est calculée pour chaque culture (nombre de cellules produites au jour X / nombre de cellules ensemencées au jour 1). Les expériences sont poursuivies jusqu'à épuisement du potentiel de prolifération des cellules. Les résultats sont présentés sous la forme d'une courbe d'expansion cumulée qui permet de visualiser le potentiel de prolifération total de chacune des sous-populations cellulaires testées.
VII/ Capacité des cellules souches épidermigues sélectionnées à générer in vitro un épiderme reconstruit.
Une autre caractéristique des kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e qui a été
évaluée est leur potentiel organogénique, c'est à dire leur capacité à générer in vitro un épiderme pluristratifié
S (N.B. Adh+++ signifie qu'il s'agit de kératinocytes issus de la population adhérente suite au pré-enrichissement). Des kératinocytes des sous-populations Adh+++EGF-Rf°'~' et Adh+++EGF-Rfa'b~e ont été cultivés durant 7 passages successifs. A chaque passage, une partie des cellules amplifiées a été prélevée pour être ensemencée sur un substrat dermique. Aux passages précoces (passage 4), les kératinocytes issus des cultures initiées avec des cellules Adh+++EGF-Rf°'~' et avec des cellules Adh+++EGF-Rfai»~e ont montré une bonne capacité à
produire un épiderme de bonne qualité (Figure 8A, Figure 8B). Dans les deux cas, l'histologie est caractéristique d'un épiderme correctement formé et differencié: I) une couche basale contenant des cellules polygonales orientées perpendiculairement au substrat dermique, II) 3 a 4 couches de cellules spineuses, III) 4 a 6 couches de cellules -granuleuses, et IV) un stratum corneum compact composé de cellules cornées anucléées. A un nombre de passages plus élevé (passage 7), il a été observé que seulement les kératinocytes issus de la sous-population Adh+++EGF-Rfaib~e demeurent capables de générer un épiderme (Figure 8C), les cultures issues de la sous-population Adh+++EGF-Rf°rt ne produisant plus qu'un épiderme dégénératif (Figure 8D). Ces résultats démontrent le potentiel organogénique de la sous-population Adh~+EGF-Rfa'b~e plus durable que celui des kératinocytes de la sous-population Adh+++EGF-Rf°n.
REFERENCES
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Le contenu de chacune des populations de cellules sélectionnées par la méthode d'adhésion rapide sur collagène de type I en kératinocytes possédant un fort potentiel d'expansion, propriété plus représentative de la fonction physiologique des CSKs, a été
évalué. Les résultats obtenus à partir de plusieurs prélèvements indépendants (n>S
expériences) montrent que les cellules les plus primitives, qui expriment le plus fort potentiel de prolifération à long terme, sont enrichies dans la population de cellules adhérentes Fi ure ~. En effet, les cellules contenues dans cette population permettent d'obtenir une expansion cumulée supérieure à celle de la population totale. En revanche, la population des cellules non adhérentes apparaît majoritairement constituée de kératinocytes plus tardifs, et n'exprime qu'un potentiel de prolifération plus réduit.
lo II/ Tri d'une fraction de cellules dites « adhérentes EGF-Rfa'bie » qui représente 20% à 45% des cellules de la population de cellules « adhérentes », donc 2% à
4,5% des kératinocytes totaux, et englobe l'essentiel des CSKs.
1- Fraction de cellules composée de 45% des cellules de la population de cellules « adhérentes » exprimant le glus faiblement fEGF-R : La population composée des cellules adhérentes en 12 minutes sur collagène de type I a tout d'abord été séparée en 2 fractions de taille équivalente sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R détectable à
leur surface. La fraction qualifiée de « EGF-Rfa'bte » contient 45% des kératinocytes adhérents exprimant le plus faiblement l'EGF-R et la fraction qualifiée de « EGF-Rf°rt »
contient 45% des kératinocytes adhérents exprimant le plus fortement ce récepteur (Fi ure 3 .
Ces expériences ont été réalisées sur plusieurs prélèvements indépendants (n>5). Les résultats obtenus démontrent de manière reproductible que les kératinocytes les plus primitifs qui possèdent le potentiel d'expansion le plus important sont significativement enrichis dans la fraction EGF-Rfa'bie (Fi ure 4 . Ceci corrèle.avec l'observation microscopique des cellules à différents temps de culture, qui révèle une production de kératinocytes de petitè taille indifférenciés à
plus long terme dans les cultures initiées à partir de la fraction EGF-Rfaib~e Fi ure 5 , critère associé aux kératinocytes primitifs (9).
2 - Fraction composée de 20% des cellules de la population de cellules «
adhérentes »
exprimant le plus faiblement fEGF-R : La population de cellules adhérentes a finalement été
séparée en 4 fractions de taille équivalente sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R
détectable à la surface des cellules.
Quatre fractions de représentativité égale et comprenant chacune 20% des cellules de cette population ont été définies comme fractions « EGF-R-~+ », « ÉGF-R~ », «
EGF-R~ », et « EGF-R~ » (Fi ure 6 : les fractions dites « EGF-R-~+ » et « EGF-R~ » sont incluses dans la fraction EGF-Rfa'ble et contiennent chacune 20% des cellules de la population adhérente ; les fractions dites ,« EGF-R+~ » et « EGF-R++~ » sont incluses dans la fraction EGF-Rf°n et contiennent chacune 20% des cellules de la population adhérente. On a observé
une proportionnalité inverse entre le niveau d'expression de l'EGF-R à la surface des cellules ainsi sélectionnées, et leur potentiel de prolifération à long terme (Fi ure 7 . En effet, l'expansion cumulée la plus importante est obtenue à partir de la fraction EGF-R-~+ alors que la valeur obtenue à partir de la fraction EGF-R~ s'avère la moins élevée. Les fractions m EGF-R~ et EGF-R~ se comportent de manière intermédiaire (n>3 expériences indépendantes réalisées).
Ces résultats expérimentaux valident la possibilité d'utiliser un récepteur de facteur de croissance mitogénique (récepteur à tyrosine kinase de l'EGF) comme marqueur phénotypique pour sélectionner une fraction de kératinocytes significativement enrichie en CSKs.
III/ Evaluation optimale du potentiel d'expansion à long terme des populations de kératinocytes sélectionnées.
1- Trypsination ménagée des cellules lors des repiquages successifs :
L'objectif est de limiter le stress occasionné aux cellules lors des décollements et repiquages successifs des cultures à long terme, problème qui pourrait conduire à une sous estimation de leur potentiel.
On effectue tout d'abord un traitement protéolytique ménagé (trypsine 0,05%-EDTA 0,02%) qui permet le décollement d'une partie des cellules tout en évitant de les soumettre à un traitement protéolytique trop drastique qui pourrait altérer leur viabilité.
Les cellules les plus difficiles à détacher pour lesquelles la protéolyse douce s'est avérée inefficace sont ensuite soumises à un traitement protéolytique plus fort (trypsine 0,25%-EDTA 0,02%), ce qui permet finalement de récupérer (ensemble de la population. Une étude comparative de l'impact de différentes méthodes de décollement sur la viabilité des cellules a été réalisée.
2 - Densité d'ensemencement des flacons de culture adaptée pour une expansion optimale des kératinoc es : Afin d'évaluer quelles densités d'ensemencement sont compatibles avec une bonne mise en évidence du potentiel d'expansion des cellules testées, lors de l'initiation des cultures à long terme ainsi qu'à chaque repiquâge successif, on a réalisé
des expériences sur une durée de 7 jours. Celles-ci ont permis de déterminer que des densités d'ensemencement comprises entre 2500 et 7000 cellules / cm2 sont les plus adaptées puisqu'elles permettent d'obtenir une expansion cellulaire d'un facteur 15 à
20, alors que des densités d'ensemencement inférieures et supérieures donnent de moins bons résultats.
Figures lA et 1B : Représentativité et clonogénicité des populations cellulaires de cellules « adhérentes » et de cellules « non adhérentes ».
Les figures lA et 1B montrent l'enrichissement en cellules clonogéniques obtenu après sélection par la méthode d'adhésion sur collagène de type I.
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été
séparés en une population cellulaire dite « adhérente » et une population dite « non adhérente » par une étape d'adhésion de 12 minutes sur du collagène de type I. La représentativité de chaque fraction par rapport à la population cellulaire totale a été évaluée, ainsi que leur contenu en kératinocytes clonogéniques.
Sur la figure lA, on a représenté le pourcentage de cellules constituant la population de cellules adhérentes par rapport aux cellules totales (colonne hachurée) et le pourcentage de cellules constituant la population de cellules non adhérentes par rapport aux cellules totales (colonne pleine).
Sur la figure 1B, on a représenté le pourcentage de cellules clonogéniques respectivement dans la population de cellules adhérentes (colonne hachurée) et dans la population de cellules adhérentes (colonne pleine). y Les résultats obtenus montrent que la population cellulaire dite « adhérente »
est significativement enrichie en cellules clonogéniques, puisqu'elle ne représente que 10% des kératinocytes totaux mais contient un pourcentage de cellules clonogéniques 10 fois plus élevé que celui de la population dite « non adhérente ».
Figure 2 : Comparaison du potentiel d'expansion des kératinocytes contenus dans la population non fractionnée, des populations de cellules « adhérentes » et «
non adhérentes ». ' Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été
séparés en une population cellulaire dite « adhérente » et une population dite « non adhérente » par une étape d'adhésion de 12 minutes sur du collagène de type I. Les cellules contenues dans les 2 populations, ainsi que celles de la population totale non fractionnée, ont été
soumises à un test de culture à long terme (nombre total cumulé de cellules produites), afin de comparer leur potentiel d'expansion.
On a représenté en abscisses le temps (exprimé en nombre de jours) et en ordonnées l'expansion cumulée (nombre de cellules produites au jour X / nombre de cellules au jour 1).
La courbe avec des carrés noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la population totale, celles avec des triangles à partir des cellules de la population adhérente (12 minutes sur collagène I) et celles avec des ronds à partir des cellules de la population non-adhérente ( 12 minutes sur collagène I).
Les résultats obtenus montrent que la population cellulaire dite « adhérente »
contient l'essentiel des cellules primitives à fort potentiel d'expansion, alors que la population cellulaire dite « non adhérente » est majoritairement composée de kératinocytes plus tardifs qui n'expriment qu'un potentiel d'expansion réduit.
Figures 3A et 3B : Séparation de la population de kératinocytes de cellules « adhérentes » en 2 fractions sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R.
Des kératinocytes de la fraction dite « adhérente », pré-enrichie en cellules primitives par une étape d'adhésion sur collagène de type I, ont été marqués par un anticorps fluorescent dirigé contre l'EGF-R (anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de l'EGF-R). Le signal a été analysé de manière semi-quantitative par cytométrie en flux:
La figure 3A présente un profil de marquage représentatif de fEGF-R obtenu à
partir de kératinocytes de la fraction adhérente (surface la plus sombre), ainsi que le profil contrôle correspondant (surface la plus claire). L'axe des abscisses représente l'intensité de fluorescente mesurée par cytométrie en flux et exprimée en échelle logarithmique. L'axe des ordonnées représente la distribution des cellules analysées en fonction de (intensité du signal fluorescent mesuré.
La figure 3B permet de visualiser la distribution Gaussienne du niveau d'expression de l'EGF-R à la surface des kératinocytes de la fraction adhérente (axes des abscisses et ordonnées identiques à ceux de la figure 3A). Les résultats obtenus montrent une distribution du signal suffisamment étalée pour permettre le tri de cellules exprimant soit faiblement fEGF-R, soit fortement ce récepteur. Le profil présenté illustre une séparation de la population adhérente en 2 fractions : l'une, dite « EGF-Rfa'6~e », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rf°n », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à
leur surface.
Figure 4 : Comparaison du potentiel d'expansion à long terme des kératinocytes contenus dans les fractions de phénotype " EGF-Rfa~ble " et " EGF-Rf°rc ".
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en 2 fractions : l'une, dite « EGF-Rfa,bie », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rf°rt », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. Le potentiel d'expansion à
long terme (nombre total cumulé de cellules produites) de ces 2 fractions a été comparé.
L'axe des abscisses correspond au temps de culture exprimé en jours et l'axe des ordonnées à l'expansion cumulée déjà définie.
La courbe avec des carrés noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la fraction EGF-Rfa;bie et celle avec des losanges à partir des cellules de la fraction EGF-Rf°'~.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-Rfa'b~e »
contient l'essentiel des cellules primitives à fort potentiel d'expansion, alors que les cellules de la fraction cellulaire dite « EGF-Rf°'~' » possèdent un potentiel d'expansion moins important.
Figures SA, SB, SC et SD : Cultures issues des fractions " EGF-Rfa'bie " et " EGF-Rfort "~
La figure SA correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfa'b~e (Jour 34 de culture) La figure SB correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rf°n (Jour 34 de culture) La figure SC correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfa'ble (Jour 70 de culture) La figure SD correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rf°rt (Jour 70 de culture) Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en deux fractions : fane, dite « EGF-Rfa'b~e », contient 45% des cellules adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rf°rt », contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. La production de cellules de petite taille, critère associé aux CSKs, a été suivie au cours du temps par observation microscopique dans les cultures issues de chacune de ces 2 fractions.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-Rfa'b~e »
assure une production plus prolongée de cellules primitives de petite taille que la fraction cellulaire dite « EGF-Rf°rt ».
Figure 6 : Séparation de la population de kératinocytes « adhérente » en 4 fractions sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R.
Des kératinocytes de la population dite « adhérente », pré-enrichie en cellules primitives par une étape d'adhésion sur collagène de type I, ont été marqués par un anticorps fluorescent dirigé contre fEGF-R (anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de l'EGF-R). Le signal a été analysé de manière semi-quantitative par cytométrie en flux.
L'axe des abscisses représente l'intensité de fluorescente mesurée par cytométrie en flux et exprimée en échelle logarithmique. L'axe des ordonnées représente la distribution des cellules analysées en fonction de (intensité du signal fluorescent mesuré.
Le profil de cytométrie en flux présenté illustre une séparation de la population adhérente en 4 fractions : les fractions dites « EGF-R-~+ » et « EGF-R++ »
sont incluses dans la fraction EGF-Rfa'b~e et contiennent chacune 20% des cellules de la population adhérente ; les fractions dites « EGF-R+++ » et « EGF-R++++ » sont incluses dans la fraction EGF-Rf°rt et contiennent chacune 20% des cellules de la population de cellules adhérentes.
Figure 7 : Comparaison du potentiel d'expansion à long terme des kératinocytes contenus dans les fractions de phénotype " EGF-R-~+ ", " EGF-R++ ", " EGF-R+++
", et " EGF-R+++'~ ".
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-enrichis en cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis séparés en 4 fractions : 2 fractions extrêmes contenant respectivement 20% des cellules exprimant le plus faiblement et fortement fEGF-R, « EGF-R-~+ » et « EGF-R++++ », ainsi que 2 fractions présentant des marquages intermédiaires « EGF-R++ » et « EGF-R+++ ~~. Le potentiel d'expansion à long terme de ces 4 fractions a été comparé (nombre total cumulé
de cellules produites).
La courbe avec des triangles noirs correspond aux résultats obtenus à partir des cellules de la fraction EGF-R-~+, celle avec des losanges à partir des .cellules de la fraction EGF-R++, celle avec des ronds à partir des cellules de la fraction EGF-R+++, celle des carrés à partir des cellules de la fraction EGF-R++++.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-R-~+ »
est la plus enrichie en cellules primitives possédant un fort potentiel d'expansion à long terme.
FiEUres 8A, 8B, 8C et 8D : Capacité des cellules primitives Adh+~"+EGF-Rfaibie à générer in vitro un épiderme pluristrati~é.
Le substrat de culture utilisé est un derme humain dévitalisé et exempt d'épiderme, préparé suivant la méthode décrite par Régnier et al., (1981) (10). Les kératinocytes issus des différentes sous-populations, Adh+++EGF-Rf°rc (4 ou 7 passages successifs de cultures) ou Adh+++EGF-Rfa'bte (4 ou 7 passages successifs de cultures), ont été déposés sur ce substrat dermique et cultivés pendant 6 jours dans du milieu DMEM/Ham F12 (invitrogen), contenant 10% de sérum de veau foetal (Invitrogen) ; 10 ng/ml d'EGF (BD Biosciences, USA) ;
0,4 ~g/ml d'hydrocortisone (Sigma Chemical Co) ; 10-6 M de isoprotérénol (Sigma Chemical Co.) ; 5 pg/ml de transfernne (Sigma Chemical Co.) ; 2x10-9 M de triiodothyronine (Sigma Chemical Co.) ; 1,8x10 M d'adénine (Sigma Chemical Co.), et 5 p.g/ml d'insuline (Sigma Chemical Co.). Les cultures ont ensuite été placées à l'interface air-liquide et poursuivies en absence d'isoprotérénol, de transfernne, de trüothyronine et d'adénine.
L'analyse histologique des épidermes reconstruits a été effectuée 7 jours plus tard.
(N.B. Adh+++ signifie qu'il s'agit de kératinocytes issus de la population adhérente suite au pré-enrichissement).
La figure 8A montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e au passage 4. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 wm, est graduée tous les 10 pm.
La figure 8B montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rf°n au passage 4. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 ~m,.est graduée tous les 10 pm.
La figure 8C montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e au passage 7. L'épiderme obtenu est correctement formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 pm, est graduée tous les 10 ~.m.
La figure 8D une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rforc au passage 7. L'épiderme obtenu est dégénératif.
L'échelle représentée, de taille maximale 100 gym, est graduée tous les 10 pm.
Les résultats montrent que le potentiel organogénique de la sous-population Adh~EGF-Rfa'b~e est plus durable que celui des kératinocytes de la sous-population Adh+~EGF-Rf°n.
Figures 9A, 9B et 9C : phénotypage par cytométrie en flux de la population non fractionnée de kératinocytes et des fractions adhérentes et non-adhérentes obtenue après le pré-enrichissement.
Les marquages immuno-phénotypiques sont réalisés sur des échantillons de 50 cellules en suspension dans du PBSBSA à 0,2%. Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines "
issues de la même espèce que les anticorps utilisés pour les marquages (Rat y globulin ou Mouse y globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à
4°C en présence d'un anticorps anti-CD49f FITC (intégrine chaîne a6) produit chez le rat (marquage) (anti-human CD49f FITC rat IgG2a ; GoH3 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (rat IgG2a-FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark) ; d'un anticorps anti-CD49b-PE
(intégrine chaîne a2) produit chez la souris (marquage) (anti-human CD49b-PE
mouse IgGza ;
12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG2~ PE isotypic control; 6155-178 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ; d'un anticorps anti-CD29-PE (intégrine chaîne (31) produit chez le la souris (marquage) (anti-human CD29-FITC mouse IgGI ; 4B4 clone, Coulter Corp., Miami, FL, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG~-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Les cellules sont ensuite lavées en PBSBSA avant d'être analysées par cytométrie en flux. Pour chaque échantillon, les statistiques sont effectuées sur au moins 10 000 événements comptabilisés.
La Figure 9 représente le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (avant passage sur collagène, colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique des intégrines a6, a2 et (31. Ces résultats sont les moyennes et les écarts types obtenus pour 3 expériences indépendantes.
La Figure 9A montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'int~grine a6.
La Figure 9B montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'intégrine a2.
La Figure 9C montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population non fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 mina sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique de l'intégrine (31.
Les résultats montrent qu'environ 70% des cellules de la population de cellules adhérentes expriment l'intégrine a6 alors qu'environ 40% des cellules de la population non-fractionnée expriment cette intégrine et que seulement environ 30% des cellules de la population non-adhérente l'expriment.
EXEMPLES
I/ Isolement des kératinocytes à partir d'un prélèvement cutané (prépuce).
Après élimination du tissu sous-cutané à l'aide d'un scalpel, le prélèvement cutané est découpé en fragments d'environ Smm x Smm, puis décontaminé par un traitement antibiotique (Gentamycine (Life Technologies Ltd, Paisley, Scotland), 3 bains successifs de minutes dans du milieu de culture DMEM (Life Technologies Ltd, Scotland)).
Pour permettre la séparation du derme de l'épiderme, le prélèvement est ensuite soumis à un traitement protéolytique (dispase (Boehringer, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, 10 Germany) 1 nuit à 4°C, puis 30 minutes à 37°C). Les fragments d'épiderme séparés du tissu dermique sont placés dans une solution de trypsine 0,05%-EDTA 0,02%
(Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) (15 minutes à 37°C). La préparation est agitée périodiquement pour favoriser la dissociation des cellules. L'effet de la trypsine est ensuite neutralisé par l'ajout d'un milieu de culture contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF) (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) (DMEM+10%SVF). La suspension cellulaire est homogénéisée, puis lavée dans du milieu de culture pour kératinocytes (Keratinocyte growth medium, KGM) (KGM Bullet Kit, BioWhittaker, Clonetics Corp., San Diego, CA, USA). Les cellules en suspension sont comptées au microscope à l'aide d'une cellule de Malassez. La viabilité des échantillons est estimée par la méthode d'exclusion au bleu Trypan (Life Technology, Cergy Pontoise Cedex, France).
II/ Enrichissement d'une préparation de kératinocytes en cellules primitives de la couche basale de l'épiderme.
La couche basale de l'épiderme contient les kératinocytes les plus primitifs dits " souches ". Ces cellules peuvent être séparées des kératinocytes plus matures sur la base de leur propriété d'adhésion rapide. Cette étape permet un pré-enrichissement de la préparation en cellules primitives.
La suspension cellulaire est placée dans des flacons de culture « recouverts »
avec du collagène de type I (solution de collagène I (Sigma Chemical Co Ltd, Irvine, LTK) diluée d'un facteur 2 dans du PBS, déposée pendant 45 minutes dans les flacôns, puis séchage après élimination du surplus), à une densité de 200 000 cellules/cm2. Après 12 minutes, les kératinocytes n'ayant pas adhéré sont éliminés par lavage en tampon PBS. Les cellules adhérentes ainsi sélectionnées sont détachées du support par une trypsination douce (trypsine 0,05%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 3 à 5 minutes à 37°C). Après neutralisation de la trypsine (DMEM+10%SVF), les cellules sont récupérées, lavées, puis remises en suspension dans du milieu KGM. La fraction des cellules adhérentes sélectiônnée par cette méthode représente environ 10% des kératinocytes totaux de l' épiderme.
III/ Tests clonogénigues à court terme.
Les kératinocytes sont cultivés dans du milieu KGM à faible densité (1600, 3200 et/ou 4800 cellules/cm2) afin d'obtenir des clones bien individualisés et aisément observables au microscope. Le milieu de culture est renouvelé 3 fois par semaine jusqu'à
l'arrêt des expériences (6 à 12 jours). Les clones sont alors fixés et colorés, puis comptés et classés suivant le nombre de cellules qui les composent.
Pour la coloration, les préparations sont tout d'abord fixées pendant 30 minutes à
température ambiante avec de la formaline (aldéhyde formique en solution 35%) (Merck, Darmstadt, Germany) diluée à 10% dans du tampon PBS (BioWhittaker Inc., Walkersville, MA, USA), puis lavées 2 fois à l'eau. Les cellules sont ensuite incubées pendant 2 minutes avec de l'hématoxyline filtrée (coloration des noyaux) (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA). Après rinçage à l'eau, les préparations sont séchées à l'air, puis incubées pendant 5 minutes dans de l'éosine (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA) à 1% dans du tampon PBS.
Elles sont à nouveau lavées à l'eau, puis séchées.
IV/ Phénotyua~e par cytométrie en flux de la population non-fractionnée de kératinocytes, des fractions adhérentes et non-adhérentes obtenues après le pré-enrichissement.
Les marquages immuno-phénotypiques sont réalisés sur des échantillons de 50 cellules en suspension dans du PBS/BSA à 0,2%. Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines "
issues de la même espèce que les anticorps utilisés pour les marquages (Rat y globulin ou Mouse y globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à
4°C en présence d'un anticorps anti-CD49f FITC (intégrine chaîne a6) produit chez le rat (marquage) (anti-human CD49f FITC rat IgG2a ; GoH3 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (rat IgG2~ FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark); d'un anticorps anti-CD49b-PE
(intégrine chaîne a2) produit chez la souris (marquage) (anti-human CD49b-PE
mouse IgG2a ;
12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgGZa-PE isotypic control; 6155-178 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ; d'un anticorps anti-CD29-PE (intégrine chaîne (31) produit chez le la souris (marquage) (anti-human CD29-FITC mouse IgG~ ; 4B4 clone, Coulter Corp., Miami, FL, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG~-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Les cellules sont ensuite lavées en PBSBSA avant d'être analysées par cytométrie en flux. Pour chaque échantillon, les statistiques sont effectuées sur au moins 10 000 événements comptabilisés.
Les résultats présentés dans la Figure 9 indiquent que la population de cellules adhérentes sur le collagène de type I exprime fréquemment l'intégrine a6 (environ 70% des cellules positives) par rapport à la population non-fractionnée (environ 40%
des cellules positives) et à la population non-adhérente (environ 30% des cellules positives). La population de cellules adhérentes présente donc un enrichissement significatif en intégrines de type a6 par rapport à la population non fractionnée. J'ar comparaison, les intégrines a2 et (31 ne sont pas des marqueurs adaptés pour l'évaluation de l'enrichissement obtenu car la majorité des cellules des trois populations (non-fractionnée, adhérente, non-adhérente) exprime ces intégrines.
V/ Marguage du récepteur de l'EGF (EGF-R1 pour analyse et tri par cytométrie en flux.
Les cellules en suspension sont centrifugées et reprises dans du tampon PBS
contenant 0,2% de sérum albumine bovine (BSA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) (PBSBSA 0,2%). Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma globulines de rat " (Rat y globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10 minutes à
4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 4°C
en présence d'un anticorps anti-EGF-R (domaine extracellulaire) non conjugué produit chez la souris (marquage) (anti-human EGF-R mouse IgGZb; EGFR1 clone, Dako, Glostrup, Denmark) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype que l'anticorps anti-EGF-R (contrôle isotypique) (mouse IgG2b isotypic control, Immunotech, Marseille, France). Après 2 lavages successifs en PBSBSA 0,2%, les cellules sont incubées en présence d'un anticorps secondaire produit chez le rat et couplé à la phyco-érythrine (PE), capable de reconnaître les anticorps de souris (Rat anti-Mouse IgGza+b-PE, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) (30 minutes à
4°C). Les cellules sont à nouveau lavées 2 fois, avant d'être utilisées pour le tri par cytométrie en flux (FACS Vantage, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
On a séparé la population de kératinocytes adhérents en fractions présentant différents niveaux d'expression de l'EGF-R et trié les cellules qu'elles contiennent afm de les caractériser d'un point de vue fonctionnel.
VI/ Evaluation du potentiel d'expansion à long terme des fractions de kératinocytes triées par cytométrie en flux.
Les cellules de chaque sous-population, triées par cytométrie en flux, sont soumises à
un test fonctionnel permettant d'évaluer leur capacité d'expansion à long terme (propriété
associée aux cellules les plus primitives dites "souches") Après estimation de la viabilité par la méthode d'exclusion au bleu Trypan, 60 cellules de chaque sous-population sont ensemencées dans des flacons de culture non "recouverts", d'une surface de 25 cmz. Le milieu de culture (KGM) -ést changé
3 fois par semaine. Les cellules sont décollées de leur support, comptées et réensemencées à raison de 60 000 cellules viables par flacon de 25 cm2 lorsque les cultures atteignent 70-80% de confluence, afm d'éviter que les cellules ne s'engagent vers la différenciation suite à des phénomènes d'inhibition de contact. Le décollement des cellules est réalisé en 2 étapes successives. Il s'agit tout d'abord d'une trypsination douce (trypsine 0,05%-EDTA 0,02%
(Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 3 à 5 minutes à
37°C) qui permet de détacher environ 80% des cellules. Les cellules les plus difficiles à détacher pour lesquelles la protéolyse douce s'est avérée inefficace sont ensuite soumises à
une trypsination plus forte (trypsine 0,25%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant S minutes à 37°C) qui permet de récupérer l'ensemble de la population cellulaire.
A chaque passage, l'expansion cumulée obtenue est calculée pour chaque culture (nombre de cellules produites au jour X / nombre de cellules ensemencées au jour 1). Les expériences sont poursuivies jusqu'à épuisement du potentiel de prolifération des cellules. Les résultats sont présentés sous la forme d'une courbe d'expansion cumulée qui permet de visualiser le potentiel de prolifération total de chacune des sous-populations cellulaires testées.
VII/ Capacité des cellules souches épidermigues sélectionnées à générer in vitro un épiderme reconstruit.
Une autre caractéristique des kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e qui a été
évaluée est leur potentiel organogénique, c'est à dire leur capacité à générer in vitro un épiderme pluristratifié
S (N.B. Adh+++ signifie qu'il s'agit de kératinocytes issus de la population adhérente suite au pré-enrichissement). Des kératinocytes des sous-populations Adh+++EGF-Rf°'~' et Adh+++EGF-Rfa'b~e ont été cultivés durant 7 passages successifs. A chaque passage, une partie des cellules amplifiées a été prélevée pour être ensemencée sur un substrat dermique. Aux passages précoces (passage 4), les kératinocytes issus des cultures initiées avec des cellules Adh+++EGF-Rf°'~' et avec des cellules Adh+++EGF-Rfai»~e ont montré une bonne capacité à
produire un épiderme de bonne qualité (Figure 8A, Figure 8B). Dans les deux cas, l'histologie est caractéristique d'un épiderme correctement formé et differencié: I) une couche basale contenant des cellules polygonales orientées perpendiculairement au substrat dermique, II) 3 a 4 couches de cellules spineuses, III) 4 a 6 couches de cellules -granuleuses, et IV) un stratum corneum compact composé de cellules cornées anucléées. A un nombre de passages plus élevé (passage 7), il a été observé que seulement les kératinocytes issus de la sous-population Adh+++EGF-Rfaib~e demeurent capables de générer un épiderme (Figure 8C), les cultures issues de la sous-population Adh+++EGF-Rf°rt ne produisant plus qu'un épiderme dégénératif (Figure 8D). Ces résultats démontrent le potentiel organogénique de la sous-population Adh~+EGF-Rfa'b~e plus durable que celui des kératinocytes de la sous-population Adh+++EGF-Rf°n.
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Claims (23)
1. Procédé d'enrichissement d'une population de cellules souches kératinocytaires, à
partir d'une préparation de kératinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à
environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré
sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par trypsination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.
partir d'une préparation de kératinocytes, comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ 5 mn à environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à
environ 20 mn, avantageusement 12 mn, et la récupération des cellules souches ayant adhéré
sur le susdit composant de matrices extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir la viabilité des cellules souches ayant adhéré, notamment par trypsination, notamment à l'aide de trypsine 0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.
2. Procédé d'enrichissement selon la revendication 1, dans lequel la population des cellules adhérentes présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à
environ 10 9.
environ 10 9.
3. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel le pourcentage de cellules adhérentes représente environ 5 % à environ 20 %, notamment environ 10 %, des cellules contenues dans la préparation de kératinocytes.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel environ 70 % des cellules adhérentes exprime la chaîne a6 des intégrines.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la population de cellules adhérentes comprend des cellules clonogéniques, notamment à raison d'au moins environ 1 %, notamment à raison d'au moins environ 2 % par rapport aux cellules adhérentes.
6. Procédé selon la revendication S, dans lequel les cellules clonogéniques présentent un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 × 10 10.
7. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant, après l'étape de pré-enrichissement, une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique sur les cellules adhérentes et récupération de la fraction de cellules adhérentes qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique, ladite expression étant mesurée par cytométrie de flux, cette fraction étant désignée par fraction « récepteur mitogénique faible ».
8. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le récepteur mitogénique est choisi dans le groupe comprenant les récepteurs de facteurs de croissance capables d'induire la prolifération de cellules souches kératinocytaires et notamment le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF-R), et le récepteur du facteur de croissance kératinocytaire (KGF-R).
9. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel le pourcentage de cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du récepteur mitogénique est d'environ 2 % à environ 5 %, par rapport aux cellules contenues dans la préparation de kératinocytes.
10. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel le récepteur mitogénique est EGF-R.
11. Procédé d'enrichissement selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant - une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par adhésion sur collagène d'une préparation de kératinocytes, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, - une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-R faible.
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération de la fraction de cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules adhérentes présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant désignée par EGF-R faible.
12. Procédé d'enrichissement selon la revendication 11, dans lequel la fraction EGF-R faible présente un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 10 10.
13. Procédé d'enrichissement selon la revendication 12, dans lequel la fraction EGF-R faible comprend des cellules clonogéniques, notamment au moins environ 1 %
et notamment au moins environ 2 % par rapport aux cellules contenues dans la fraction EGF-R
faible
et notamment au moins environ 2 % par rapport aux cellules contenues dans la fraction EGF-R
faible
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel les cellules clonogéniques présentent un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 10 11.
15. Procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprenant la mise en culture de la fraction « récepteur mitogénique faible » obtenue selon les revendications 7 à 14, avec une densité d'ensemencement d'environ 2 500 à environ 7 000 cellules/cm2, pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi d'un décollement dans des conditions permettant le détachement des cellules dans des conditions n'altérant pas leur viabilité, et d'un repiquage, les étapes de décollement et de repiquage successives ayant lieu lorsque la densité cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / cm2.
16. Procédé de culture de cellules souches kératinocytaires selon la revendication 15, dans lequel l'étape de décollement a lieu dans des conditions permettant d'une part le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 % et d'autre part le détachement de cellules les plus difficiles à
détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA 0,02 %.
détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,25 % + EDTA 0,02 %.
17. Procédé de culture de cellules souches kératinocytaires comprenant la mise en culture de la fraction EGF-R faible obtenue selon la revendication 11, avec une densité
d'ensemencement d'environ 2500 à environ 7000 cellules/cm2 pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi du décollement dans des conditions permettant le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 et le détachement des cellules les plus difficiles à détacher à l'aide de trypsine 0,25 % +
EDTA 0,02 %, et suivi du repiquage des cellules souches obtenues.
d'ensemencement d'environ 2500 à environ 7000 cellules/cm2 pour obtenir au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi du décollement dans des conditions permettant le détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 et le détachement des cellules les plus difficiles à détacher à l'aide de trypsine 0,25 % +
EDTA 0,02 %, et suivi du repiquage des cellules souches obtenues.
18. Composition de cellules souches telles qu'obtenues par mise en oeuvre du procédé
selon l'une des revendications 1 à 6 ou par mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 7 à 17.
selon l'une des revendications 1 à 6 ou par mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 7 à 17.
19. Composition de cellules kératinocytaires souches comprenant des cellules souches kératinocytaires, (CSK), possédant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à 10 10.
20. Composition de CSK selon l'une des revendications 18 ou 19, dans laquelle les CSK sont viables.
21. Composition de cellules souches selon l'une des revendications 18 à 20, contenant des CSK à la surface desquelles le niveau d'expression d'un récepteur mitogénique est faible.
22. Composition de cellules souches selon la revendication 21, dans laquelle le niveau d'expression du récepteur de l'EGF(EGF-R) est faible.
23. Utilisation d'une composition de cellules kératinocytaires souches selon l'une des revendications 18 à 22, pour la reconstruction de peau.
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