CA2558357A1 - Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques - Google Patents

Abstract

47 ABREGE DESCRIPTIF <= Réactifs de marquage, procédés de synthèse de tels réactifs et procédés de détection de molécules biologiques >= - BIOMERIEUX
S.A. 5 La présente invention concerne un réactif de marquage stable à la température de formule (0) : dans laquelle : 10 R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, 15 R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n- Y- X- , OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3- (O - CH2-CH2)3- CH2- NH- R2, - CO- NH- (CH2)3- (O - CH2- CH2)4- CH2- NH- R2 avec R =
alkyle ou aryle, A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris entre 20 0 et 2, préférentiellement de 0 ou 1, -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O- , -CH2S-, -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3. 25 48 La présente invention décrit aussi un procédé de synthèse desdits marqueurs ainsi que des applications pour le marquage de molécules biologiques, en particulier des acides nucléiques, avec un réactif de marquage portant la fonction diazométhyle. L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic. 5

Description

Réactiîs de maraua~e, procédés de synthèse de tels réactifs etproçédé de détection de molécules biolo~iaues La présente invention concerne de nouveaux réactifs de marquage de molécules biologiques, un procédë de synthèse desdits marqueurs ainsi que des applications pour le marquage de molécules biologiques en particulier dans le domaine du diagnostic utilisant l'analyse des acides nucléiques..
L'état de 1a technique montre que de nombreuses méthodes existent pour marquer des nucléotides, des oligonucléotides ou des acides nucléiques.
Une première méthode consiste à fixer le marqueur sur la base, que celle-ei soit naturelle ou modifxêe. Une deuxième méthode pxopose de fixer Ie marqueur sur le sucre, 1â
encore qu'il soit naturel ou modifié. Une troisième méthode a pour objet la fixation du marqueur sur le phosphate.
Le marquage sur la base a été notamment utilisé dans l' approche de marquage des acides nucléiques par incorporation de nuclëotides directement marqués.
Le marquage sur le sucre est souvent utilisé dans le cas des sondes nucléiques préparées par synthèse chimique.
Le marquage sur le phosphate a été aussi utilisé pour introduire des bxas fonctionnalisés et des marqueurs lors de la synthèse chimique des oligonuciéotides.
En fait (homme du métier, qui doit effectuer un marquage d'un nucléot'tde, ou d'un analogue de nucléotide ou d'un acide nucléique, est enclin à effectuer cette fixation sur la base ou sur le sucre qui lui oîfxent plus de commodité et d'alternatives. C'est d'ailleurs ce qui aessort de l'étude de nombmux documents, tels que EP-A-0.329.198, EP-A-0.302.175, EP-A 0.097.373, EP-A
0.063.879, US-A 5,449,767, US-A 5,328,824, W(?-A 93/I6094, DE-A 3.910.151, EP-A

2 0.567.841 pour la base ou EP-A-0.286.$98 pour le sucre.
La fixation du marqueur sur le phosphate est une technique plus complexe que la. technique consistant à fonctionnaliser la base ou le sucre et a été bien moins utilisée notamment à cause de la faible réactivité du phosphate (voir par exemple Jencks W.P, et al J. Amer.
Chem Soc., 82, 1778-1785, 1960). De même dans la revue de O'Donnel et Mc Laughlin (e< Reporter gxoups for the analysis of nucleic acid structura », p 216-243, dans « Bioorganic Chemistry :
Nucleic Acids », Ed Hecht S.M., Oxford University Press, 1996) portant sur les méthodes d'introduction de sondes dans les fragments d'oligonucléotides, l'alkylation efficace du phosphodiester internucléotidique est considérée comme étant impossible.
La demande de brevet WO-A-99165926 décrit un procédé de marquage d'un acide ribonucléique (ARN) de synthèse ou naturel qui consiste à fragmenter l'ARN et à marquer au niveau du phosphate terminal. Ce document décrit un certain nombre de fonctions pouvant être utilisées pour le marquage en liaison avec la fragmentation comme les fonctions hydroxyle, amine, hydrazine, alcoxyamine, halogénure d' allcyle, halogénure d' alkyle de type benzylique et en particulier le dérivé ~ ' r 5-(bromométhyl)fluorescéine. Ces fonctions permettent de marquer les acides nucléiques, mais il faut associer une étape de fragmentation pour avoir un marquage efficace car ce marquage se produit sur le phosphate libéré lors de la fragmentation. De plus, il faut ajouter un excès important de réactif de marquage par rapport à TARN pour obtenix un marquage efficace ce qui induit des problèmes de bruit de fond générés par le marqueur en excès. Enfin, cette méthode ne fonctionne pas efficacement sur de l'ADN double brin.
Il existe donc un besoin pour de nouveaux réactifs qui soient efficaces du point de vue du 2o rendement de marquage, qui soient spécifiques au niveau de la position de marquage et en particulier qui n'affectent pas les propriétés d'hybridation des bases impliquées dans la formation de Ia double hélice, par l'intermédiaire des liaisons hydrogènes, qui soient utilisables à
la fois pour l'ADN et l'ARN, et enfin qui permettent de marquer indifféremment des nucléotides, des oligonucléotides, des acides nucléiques naturels ou préparés par amplification enzymatique.
La Demanderesse a déjà proposê de tels nouveaux marqueurs qui répondent aux conditions précitées et qui utilisent la fonction diazométhyle comme fonction réactive pour le marquage. C'est par exemple le cas dans les demandes de brevet WO-A-02/090319 et WO-A-02/090584 ou dans l'ai.-ticle de Laayoun et al. paru. dans Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1298-1306 et intitulé : «

3 Aryldiazomethanes for Universal Labelling of Nucleic Acids and Analysis on DNA
Chips a>, auxquels le lecteur peut se référer afin de. mieux comprendre les modes de synthèse et d'utilisation de tels GoZlstitLlantS.
Ainsi la fonction diazométhyle (de formule -C(N2)-) a déjà été utilisêe pour fallcylation des groupements phosphates, mais un certain nombre de problèmes se posent. D'une part, les réactifs incorporant au moins une fonction diazo en général sont instables par eux-mêmes, ce qui pose des problèmes pour (utilisation de ces réactifs dans un kit de marquage, ce qui est rédhibitoire si le produit marqué a pour fonction de mettre en évidence la présence d'une molécule cible biologique dans un échantillon quelconque.
1o Enfin les réactifs portant la fonction diazométhylé et associés à certains marqueurs, tels que la biotine, sont peu solubles dans Peau, ce qui conduit à utjlliser des solvants organiques qui sont missibles à Peau pour le couplage avec des molécules biologiques, qui ne sont solubles que dans l'eau ou des tampons aqueux, mars ces solvants, présents en concentration importante dans la rêaction de marquage, ralentissent la vitesse de réaction et donc nuisent à
l'efficacité du couplage.
L,es réactifs de marquage préconisés par les documents WO-A-02/090319 et WO-A-02109054 ci-dessus mentionnês résolvent aussi ces problèmes techniques. Le contenu de ces demandes est incorporé ici pour référence.
Toutefois même si ces molécules et procédés de marquage sont particulièrement efficaces, la Demanderesse a réussi à trouver de nouvelles molécules et de nouveaux procédés qui améliorent encore (efficacité du marquage. L'invention consiste en f utilisation de bras polyaminés qui, à l'instar des bras éthylèneglycols, permettent f éloignement de la biotine par rapport au centre réactif (fonction diazo). Ainsi on obtient une meilleure solubilité en milieu aqueux, grâce à (introduction du bras hydrophile, avec la possibilité de protonation des amines en milieu aqueux à pH neutre, ce qui produit une attraction ente les acides nuclêiques, chargés négativement et le marqueur avec deux conséquences principales

4 ~ marquage plus rapide, ce qui peut être particulièrement intéressant pour les échantillons à
faible concenhation, et ~ stabilisation de la double hélice par neutralisation des charges négatives des phosphates.
De plus ces nouvelles molécules permettent la mise en oeuvre de procédés pouvant fonctionner en milieu acide, ce qui est particulièrement intéressant pour des molécules incorporant des fonctions diazo. Ainsi la sélectivité des reactifs portant une fonction diazo est donc plus importante en milieu acide. La solubilité apportée aux chaînes polyamides facilite donc le lavage tout en diminuant le bruit de fond lors de la détection ultérieure, voire même l'élimination pure et simple de l'étape de purification l0 Selon un premier mode de réalisation de l'inventions celle-ci propose un réactiî de marquage stable à la température de formule (0) dans laquelle ~ Rl représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, ~ RZ représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multirnérique, ~ L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, ~ R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NOZ, Cl, Br, F, I, R2 -(L)ri Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CHZ)s-(O-CHZ-CHa)3-CHa-NH-RZ, -CO-NH-(CHZ)s-(O-CH2-CHZ)4-CHZ-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, ~ A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalence permettant Ia conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris entre 0 et 2, préférentiellement de 0 ou 1, ~ -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CHzO-, -CH2S-, ~ -~ reprêsente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, ~ m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et ~ p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3.

5 Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, celle-ci concerne un réactif de marquage, selon la revendication l, de formule (1) dans laquelle Rl représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, ~ RZ représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multirnérique, ~ L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalences et n un nombre entier égal à 0 ou 1, ~ R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NOZ, Cl, Br, F, I, RZ -(L)n Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CHz)s-CH2-NH-RZ, -CO-NH-(CHZ)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-RZ avec R ~ allcyle ou aryle, et ~ -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH20-, -CH2S-, ~ m est un nombre entier compris entre I et I0, préférentiellement entre 1 et 3, et ~ p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3.
Avantageusement, selon une variante des deux premiers modes de rêalisation, la valeur p est inférieure ou égale à la valeur m dans la formule (0) ou (I) du réactif.
Selon un troisième mode de réalisation, la présente invention propose un réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de foixnule (2)

6 dans laquelle ~ Rl représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, ~ Rz représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, ~ L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier êgal à 0 ou 1, ~ R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NOz, Cl, Br, F, I, Rz -(L)n Y-X-, OR, SR, NRz, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CHz)s-(O-CHz-CHz)s-CHz-NH-Rz, -CO-NH-(CHz)s-(O-CHz-CHz)4-CHz-NH-R2 avec R = allyle ou aryle, et ~ q est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et Selon un quatrième mode de réalisation, la présente invention décrit un réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de formule (3) âans laquelle Rl représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, ~ Rz représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multiméiique, ~ L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalences et n un nombre entier égal à 0 ou 1, et R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, N02, Cl, Br, F, I, Rz -(L)ri Y-X-, OR, SR, NRz, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH (CHz)3-(O-CHz-CHz)s-CHz-NH-Rz, -CO-NH-(CHz)3-(O-CHz-CHz)4-CHz-NH-Rz avec R ~ alkyle ou aryle.

7 Selon une variante associée au quatrième mode de réalisation de l'invention, R2 est consituté par un assidu D-Biotine de formule (4):
Avantageusement et quel que soit le mode de réalisation précédemment évoqué du réactif, Rl est consituté de : CH3, et R3 et R4 représentent chacun : H
Avantageusement et quel que soit le mode de réalisation ou variante précédemment ëvoqué(e) du réactif, la structure -(L)n est constituée par ~ la spermine ou N,N'-Bis(3-aminopropyl)-1,4.-diaminobutane : NH~-(CHZ)3-NH
(CHZ)4-NH
(CH2)3-NH~,, ou ~ la spemiidine ou N-(3-aminopropyl)-1,4.-butandiamine : H2N-(CHZ)4-NH-(CHZ)3-NHZ, ou ~ un dérivé contenant un motif alanine : NH~-CHZ-CHI-COOH.
Selon un cinquième mode de réalisaüon de l'invention, celle-ci a trait également un réactif dans laquelle ~ Rl représente H ou un groupe alkyle, aryle ou acyle substitué, ~ RZ représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multirnérique, ~ L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, de marquage stable à la température de formule (6)

8 ~ R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NOZ, Cl, Br, F, I, RZ -(L)n Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CHZ-CH2)3-CH2-NH-RZ, -CO-NH-(CH2)3-(O-CHa-CH2)4-CHZ-NH-RZ avec R = alkyle ou aryle, ~ A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris entre 0 et 2, préférentiellement de 0 ou 2, ~ -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CHZO-, -CHZS-, ~ -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, ~ m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et ~ p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3.
Selon un sixième mode de réalisation, l'invention propose un re'actif de marquage stable à
la température de formule (7) dans laquelle ~5 ~ R~ représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, ~ R2 représente un marqueur dêtectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, ~ L est un bras de liaison comportant un enchainement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombm entier égal à 0 ou 1, ~ R~ et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, N02, Cl, Bx, F, I, R2 -(L)n Y-X-, OR, SR, NRZ, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CHZ)3-(O-CH2-CHa)s-CHa-NH-R2, -CO-NH-(CHa)s-(O-CHz-CHZ)a-CHZ-NH-R2 avec R= alkyle ou aryle, ~ -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CHZO-, -CH2S-, ~ -Z- reprêsente -NII , -NHCO-, -CONH ou -O-, ~ m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et ~ p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3.

9 Avantageusement et quel que soit le mode de réalisation ou variante pncédemment évoquée) du réactif, L comprend un motif -(O-CHZ-CHZ)-, répété de 1 à 20 fois, préférentiellement de 1 à 10 fois, et encore plus préférentiellement de 2 à ~
fois, -Z- étant alors représenté par -NH-, -NHCO- ou -CONH-.
L'invenüon concerne également un procédé de synthèse d'un réactif de marquage, selon les modes de réalisation précédents, comprenant les étapes suivantes a) on dispose d'un marqueur ou d'un prêcurseur de marqueur possédant me fonction réactive R6, t0 b) on dispose d'un bras de liaison de formule (8) '~ ~ (H~)~~, T
dans laquelle ~ -~ représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, ~ m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, ~ p est un nombre entier eompris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, ~ R' et R8 représentent deux fonctions réactives identiques ou différentes, c) on fait réagir ensemble la fonction réactive R6 dudit marqueur ou précurseur de marqueur avec la fonction R7 du bras de liaison de formule (8) en présence d' au moins un agent de couplage pour former une liaison covalente, R6 et R' étant complémentaires, 2o d) on dispose d'un dérivé de formule (9) dans laquelle ~ Rl représente H ou un groupe alkyle ou acyle ou acyle substitué,

10 PCT/FR2005/050192 ~ L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou I, ~ R3 et R4 représentent indépendamment f un de f autre : H, NOa, Cl, Br, F, I, RZ - (L)ri Y-X-, OR, SR, NRZ, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CHz)a-(O-CH2-CH2)3-CHZ-NH-R2, s CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, ~ -Y-X- représente -CONH , -NHCO-, -CH20-, -CHZS-, ~ A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazométhyle avec le cycle aromatique et u est un nombre entier égal à
0 ou 1, et 10 ~ R9 représente une fonction réactive complémentaire de R8, e) on fait réagir ensemble la fonction réactive R9 du dérivé de formule (9) avec la fonction R$ du bras de liaison de formule (8) en présence d' au moins un agent de couplage pour former une liaison covalente, f) on fait réagir I'hydrazine ou un de ses dérivés sur la fonction cétone ou aldéhyde pour former une hydrazone, et g) on transforme fhydrazone en fonction diazométhyle à (aide d'un traitement approprié.
Avantageusement, le procédé de synthèse peut également comprendre ~ une étape supplémentaire de protection de Ia fonction cétone ou aldéhyde du composé (9), et ~ une étape supplémentaire ultérieure de déprotection de ladite fonction cétone ou aldéhyde.
2o L'invention concerne aussi un procédé pour le marquage d'une molêcule biologique, en particulier un acide nucléique, comprenant la mise en contact en solution hornogéne, dans un tampon sensiblement aqueux, d'une molécule biologique et d'un réactif, selon les modes de réalisation précédemment évoqués.
L'invention concerne encore une molécule biologique marquée susceptible d'être obtenue par le procédé, selon la revendication de marquage ci-dessus.
L'invention concerne également un procédé de marquage et de fragmentation d'un acide nucléique simple ou double brin comprenant les étapes suivantes ~ fragmenter l' acide nucléique,

11 ~ attacher un marqueur sur au moins un des fiagments par (intermédiaire d'un réactif de marquage choisi parmi les rêactifs, selon les modes de réalisation précédemment évoqués, ledit réactif se couplant de manière covalente et majoritaire sur au moins un phosphate dudit fiagment Avantageusement le procêdé de marquage et de fi-agmentation s'effectue à
l'aide d'un réactif de marquage qui est choisi parnli les composés de formule (3) dans laquelle : .
~ Rl représente H ou un groupe allcyle, aryle ou aryle substitué, ~ RZ représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multirnérique, ~ L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaü~ d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, et ~ R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, RZ -(L)n Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CHZ-CHZ)3-CH2-NH-RZ, -CO-NH-(CHa)s-(O-CHa-CH2)4-CHa-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle.
Selon wie première variante de réalisation du procédé de marquage et de fiagmentation, la fragmentation et le marquage sont effectués en deux étapes.
Selon une seconde variante de réalisation du procêdé de marquage et de fragmentation, la 2o fragmentation et le marquage sont effectués en une étape.
Quel que soit le procédé de marquage et de fragmentation, le marquage s'effectue en solution homogène sensiblement aqueuse.
Quel que soit le procédé de marquage et de fragmentation, la fragmentation s'effectue par voie enzymatique, physique ou chimique.

12 La présente invention concerne aussi tout acide nucléique marqué susceptible d'être obtenu par le procêdé de marquage et de fragmentation précédent.
La présente invention concerne encore un kit de détection d'un acide nucléique cible comprenant un acide nucléique marqué, tel que défini ci dessus.
La présente invention concerne toujours un support solide sur lequel est fixé
au moins un réactif, tel que défini ci dessus.
l0 La présente invention concerne enfin un procédé de capture d'acides nucléiques comprenant les étapes suivantes ~ on dispose d'un support solide sur lequel est fixé directement ou indirectement au moins une molécule biologique, définie précêdemment, ou un acide nucléique, défini également précédemment, la molécule biologique ou l'acide nucléique compxenant une fonction diazornéthyle, ~ on met en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des acides nucléiques libres, et ~ on lave le support solide où 1a (ou les) molécules) sont fixées) de manière covalente au moins à
un acide nucléique.
Par « structzue rnultirnérique », on entend un polymère formé d'unités répétées de synthons chimiques ou biologiques. Un exemple est cité dans f exemple 34.2 de la description de la demande de brevet VVO-A-02/090319. L'homme du métier est invité à se référer à ce document si celui-ci trouvait les informations ci-après développées insu~santes pour sa compléte compréhension sur ce sujet De nombreuses variantes de telles structures utilisables dans la présente invention sont connues, comme par exemple ~ les polymères linéaires (EP-A 0.561.722, EP-A-0.669.991), ~ les polymères ramifiés (WO-A-01/92361), ~ les particules (EP-A 0 827 552),

13 ~ les dendrimères (US-A-4,507,466 ; US-A-4,568,737 ; US-A-6,083,708), ~ les polynucléoiides, et ~ les polypeptides.
Si cela s'avérait nécessaire, l'homme du métier peut également se rêférer à
ces documents pour une pai~aüe compréhension sur ce sujet.
Par e< marqueur détectable », on entend au moins un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs suit ~ les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la (3-galaetosidase, la glucose=6-phosphate déshydrogénase, ~ les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, ~ les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par Ieur propriété électrique comme Ia conductivitë, I'ampérométrie, la voltamétrie, l'impédance, I5 ~ les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques etlou chimiques, cette détection peut être réalisêe par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d' angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, ~ les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le l'AI.
De préférence, le marqueur n'est pas un marqueur radioactif pour éviter les problèmes de sécurité
liés à ces marqueurs.
Dans un mode de réalisation particulier de Ia présente invention le marqueur est détectable ëlectrochimiquement, et en particulier le marqueur est un dérivé d'un complexe de fer, comme un ferrocène.
Des systèmes indirects peuvent être aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti ligand. Les couples ligandlanti ligand sont bien connus de f homme du métier, ce qui est Ie cas par exemple des couples suivants : biotine/st<eptavidine, haptène/anticoips, antigène/anticozps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/
complémentaire du

14 polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte la fonction réactive diazomêthyle. L'ami ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un autre couple ligand/anti ligand. Ce système d'empilement est illustré dans les exemples.
Un autre exemple de systèmes indirects utilise une liaison covalente spécifique entre le ligand et l'anti ligand par exemple méthylcétone et alcoxyamine. Des exemples de ce système sont décrits dans les demandes de brevet WO-A-00/40590 et WO-A-98/05766. Ces systèmes de détection indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures WO-A-00/07982, WO-A-01/92361 et WO-A-95/08000 pour des exemples d' amplification âlimique en utilisant des polymères ou à la demande WO~=A-01/44.506 pour les systèmes d'amplification chimique par empilement.
Dans un mode particulier de l'amplification de signal, au moins deux marqueurs sont présents sur le réactif de marquage.
Dans un mode préféré de l'invention, le traceur est un composé fluorescent de faible encombrement stérique comme la fluorescéine, l' hexachlorofluorescein (I~XX), le dansyl (edans), la rhodamine, la tetramethylrhodamine (5 ou 6-TAMRA), la carboxy-X-rhodamine (ROB, les chromophores du type NIR (LI-COR Inc, Lincoln NE, USA), des dérivés cyanines comme le Cy5 et le Cy3 (Randolph J.B, and al, Nucleic Acids Res., 25(14), p2923-2929, 1997) et en particulier les dérivés du Cy5 ou bien Ie traceur est un haptène de faible encombrement stérique comme la biotine, le dinitrohenyle, ou un dérivé de I'abiêtane (voir Ia demande WO-A-00/0'7982).
Par faible encombrement stérique, on entend un poids moléculaire inférieur à 1000 g/mole.
Dans le cas d'un fluorophore, il est préférable de travailler avec des fluorophores dont la 2 longueur d'onde d'excitation est supérieure à 450 nm, de préférence supérieure à 600 nm.
Dans le ca.s où le traceur est un haptène qui ne produit pas de signal par lui-même comme par exemple la biotine, la détection est réalisé par la reconnaissance d'un anti ligand marqué comme décrit plus haut. Dans le cas de la biotine, on utilise de préférence de la sireptavidine ou un anticorps anti-biotine couplé à un composé fluorescent comme la fluox~scêine, Cy5 ou la phycoéiythrine. Dans Ie cas de fabiétane, on utilise un anticorps monoclonal comme décrit dans la demande de brevet WO-A 00/07982.
En particulier les tractifs de marquage de l'invention sont solubles dans des solvants polaires 5 comme le DMF, le DMSO, CH3CN, THF, DMA (diméthylacétanaide), NMP (N-méthylpyrrolidone), DME (dimêihoxyéthane).
De préférence les réactifs de marquage sont solubles dans le DM~O ou l'eau.
Par solvant miscible à l'eau, on entend un solvant qui est miscible dans une proportion d'au moins 5% en volume avec de l'eau ou un tampon aqueux contenant des sels.
~o Avantageusement dans les formules prêcédentes, le bras L comprend un motif éthylène glycol ou polyéthylène glycol pour augmenter la solubilité du réactif dans l'eau.
A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison de type éthylénique permettant la conjugaison de la fonction diazométhyle avec le cycle aromatique. Le bras de liaison A
a pour fonction d'éloigner la fonction diazométhyle du cyle pour diminuer l'encombrement stêrique

15 tout en conservant la stabilité de la fonction diazoméihyle. Par «
conjugaison », on entend la délocalisation électronique du cycle aromatique le long de la chaire carbonée du bras de liaison A. A
titre d'exemple, le bras A peut avoir la structure suivante Rio Rio I I
CH=CH ou C=CH ou -C=CH-~CH=CH~--v-1 v v dans laquelle ~ v est un nombre entier compi~s entre 1 et 10, de préférence v est 1 ou 2, et ~ Rl° est H ou un groupement alkyle, de préfêrence Rl° est H, méthyle ou éthyle.
a Ces réactifs peuvent ainsi se fixer en phase homogène sur les molécules biologiques, la phase homogène étant constituée d'une solution sensiblement aqueuse c'est à dire contenant au moins 50%
d'eau.
Par « molëcule biologique », on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre

16 d'exemple on peut citer comme molécules biologiques les acides nucléiques, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes.
Le terme e< acide nucléique » signifie un enchainement d'au moins deux désoxyribonuclêotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au rnoin.s un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, Ia méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant (hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de 1a liaison internucléoüdique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonuclêoti.des ( FR 2 607 507) ou Ies PNA (M. Eghohn et al., T. Am. Chem.
Soc., 114, 1895 1897, 1992 ou les 2' O-alkyl ribose. L'acide nucléique peut être naturel ou synthétique, un oligonucléotide, un polynucléotide, un fragment d'acide nuclëique, un ARN
ribosomique, un ARN
messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique telle que ~ PCR (Polymerase Chaire Reaction), décrite dans les brevets US-A 4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A 4,800,159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse Transcription PCR), notamment dans un format en une étape, tel que décrit dans le brevet EP-B-0.569.272, ~ LCR (Ligase Chaire Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0.201.184, ~ RCR (Repair Chair Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069, ~ 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A
90/06995, ~ NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818, et ~ TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491.
~ RCA (Rolling Circle Amplification (US-6,576,448).
On parle alors d' amplicons pour désigner les acides nucléiques générés par une technique d'amplification enzymatique.

17 Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison pour peu qu' au moins un phosphate soit présent dans l'acide nucléique.
Par e< polypeptide », on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés.
Par « acides aminés », on entend ~ les acides aminés pnnaires qui codent pour les protêines, ~ les acides aminés dérivés après action enzymatique, comme la trans-4-hydroxyproline, ~ les acides aminés naturels, mais non présents dans les protéines conune la norvaline, la N méthyl L leucine, la staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemishy of the amino acids, Barett 1o G.C., ed., Chapman and Hall, London, 1985), et ~ les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels.
Le terme «haptène » désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux-mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjuguê haptène-protéine. Ces composés ont génêralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à
2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des 2o prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et nucléoiides.
Le terme « anticorps » inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des fragments d'anticorps tels que des fragments Fab ou F(ab' )2.
Le terme « antigène » désigne un composé susceptible de générer des anticorps.
Le terme e< protëine » inclut les holoprotéines et les hétéroprotêines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métallopxotéines et les glycoprotéines, aussi bien fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnelle caractéristique.
Avantageusement la molécule biologique possède un groupe phosphate, c'est-à-dire ayant au moins un motif

18 O_ O_ -O-- P--O-- ou -O- P-O_ qui est soit présent naturellement dans la molécule biologique, soït peut être introduit par exemple par modification chimique ou enzymatique. Des exemples de modification chimique pour les protéines sont données dans «Chemisby of proiein conjugafion and cTOSS 1in_tring », S.S.
Wong, CRC Press, 1991.
De préférence, la, molécule biologique est un acide nucléique.
Certains réactifs avantageux de l'invention sons a) de formule (10) O
R2-(L)n-C- NH

R~
b) de formule (11) O
I I
R2-(L)n--C-NH
R1 1\
Nz c) de formule (12,) :
O Ri R2 ~-)n C-NH
I$ N2 dans lesquelles ~ Rl représente H ou un groupe allcyle ou acyle ou aryle substitué, ~ R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimêixque,

19 ~ L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes, et ~ n un nombre entier égal à 0 ou 1.
De préférence, le réactif de marquage a la a) formule (13) b) formule ( 14) 1o c) formule (15) Quels que soient la variante et le mode de réalisation du réacüf, L peut comprendre un motif -(NH-CHI-CH2)-, répété de 1 à 20 fois, préférentiellement de 1 à 10 fois, et encore plus préférentiellement de 2 à 5 fois.
dans lesquelles Rl représente un groupe méthyle ou phênyle.

Par ee dérivé de fhydrazine », on entend une molécule possédant la fonction NH~-NH-. L,e tosylhydrazine est un exemple d'un tel dérivé.
La transformation de fhydrazone en diazométhyle est réalisée par les méthodes usuelles, en 5 particulier l' oxydation par Mn02.
D'autres mêthodes sont utilisables comme décrites dans X. Creary, Organic Syntheses, Wiley : New York, Coll. Vol. VII, p438-443,1990; H. Zollinger, Diazo Chemistry II, VCH, Weinheim, p34-47, 1995; T. L. Holton and H. Shechter, J. Org. Chem., 60, 4725-4729, 1995.
Dans le cas de l'utilisation d'un dérivé tosylhydrazine, la méthode est décrite dans X.
z0 Creary, Organic Syntheses ; Wiley : New York, Coll. Vol. VII, p438-443, 1990.
Dans un mode particulier de l'un quelconque des procédés de synthèse, ledit procédé
comprend 15 ~ une étape supplémentaire de protection de la fonction cétone ou aldéhyde (dans le cas où Rl est H) du composé (9), et ~ une étape supplêmentaire ultérieure de déprotection de ladite fonction cétone ou aldéhyde:
Cette protection est réalisée par un groupement acétal par exemple. La déprotection est effectuée par un moyen approprié comme en milieu acide pour le groupement acétal.
L'homme du métier 2o détermine en fonction des composés à quelle étape de synthèse ces deux étapes de protection et de déprotection interviennent.
Dans le cas de l'amplification de signal, le procédé de synthèse est similaire à ceux évoqués précédemment Le précurseur du ma~zlueur peut avoir la foxmule (17) ci-dessous.
GP1- NH- (CH2)p >--COOH

dans laquelle GPl et GP2 representent deux groupements protecteurs de fonction amine identiques ou différents et p est un nombre entier compris entre 1 et 10, avantageusement 2 et 6 de préférence 4. Avantageusement, GPr et GPZ sont différents pour pouvoir additionner plusieurs motifs comme cela est expliqué ci dessous.
Des exemples de groupement protecteurs GPl ou GP2 utilisables dans la présente invention sont données dans T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2eme édition, John Wiley and Sons, New York, 1991, préférentiellement ceux couramment utilisés en synthèse peptidique comme Boc (tertiobutyloxycarbonyle), Fmoc (9-fluorénylznéthylèneoxycarbonyle), Cbz (carboxybenzyle) ou Alloc (allyloxycarbonyle).
En particulier GP1 et GP2 sont respectivement les groupements protecteurs Boc et Fmoc.
La. réaction entre ce précurseur qui possède une fonction carboxylique et le dérivê de formule (18), ci-après a lieu en présence d'un agent de couplage pour former la liaison amide.
>:G :..
:-.
,ë~-:,~
Après déprotection dans des conditions usuelles d'un des deux groupements protecteurs, par exemple Fmoc avec une base telle que la pipéridine, la fonction amine libérée ~t utilisée pour coupler une autre molécule de formule (27). Ce processus est répêïé autant de fois que nécessaire pour obtenir une multitude de fonctions 1VH2 protégé par un groupement protecteur par exemple une fonction Boc. Le motif est additionné entre une (1) et cent (100) fois, de préférence entre une (1) et vingt (20) fois.
On fait réagir de l'hydrazine sur la fonction cétone provenant du dérivé
phénylcétone pour former une hyârazone puis on oxyde en présence de MnO2 pote former un résidu diazométhyle. Puis après déprotection de la fonction amine pontant le groupement Boc, un traceur, par exemple une biotine activée par un groupement N hydroxysuccinimide, est couplé sur les fonctions amines pour conduire à un réactif dont 1e motif RZ-{L)n- est celui de la formule (5).
C'est un auüe objet de la présente invention que de décrh~ un procédé, ainsi que les produits obtenus par ce procédé, pour le marquage d'une molécule biologique, en particulier un acide nucléique, comprenant la mise en contact en solution, dans une solution homogène sensiblement aqueuse, d'une molécule biologique et d'un réactif de marquage selon l'invention.
Par « solution sensiblement aqueuse », on entend une solution contenant au moins 54%
d'eau. Cette solution contient de préférence des sels comme une solution tampon.
Par « solution homogène », on entend une solution monophasique telle qu'une solution eau/DMSO par opposition à une solution biphasique telle qu'une solution eau/chloroforme. Les conditions paxticulières poux les réactions de marquage varient en fonction des molêcules biologiques et du marqueur. En ce qui concerne les acides nucléiques, un pH compris entre 5 et 8 permet un marquage efficace. En pariàculier, un pH compris entre 5,S et 7,0 est préféré
pour l'ensemble des rêactifs de l'invention. Avec le réactif de formule (11), la gamme de pH est plus large pour le marquage. ITne bonne efficacité de marquage est obtenue pour un pH compris entre 3'et 8 pour ce réactif.
Ce procédé de marquage et de fragmentation est particulièrement utile dans le cas où l'acide nucléique marqué doit s'hybrider avec une multitude d'acides nucléiques, noiaxnment oligonucléotides, fixés sur Ie suppoxt solide à une position prédétem~inée pour former une puce à
ADN. Par "puce à ADN",. on entend un support solide de dimension réduite où
sont fixês une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminëes. En effet, la densité des acides nucléiques fixés sur le support solide impose des contraintes stériques importantes lors de l'hybridation et la fragmentation pemnet d'améliorer cette étape d'hybridation. Des exemples de ces puces à ADN sont donnês par exemple dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, p1-10, 1997 ; J. Cheng et al, Molecular diagnoses, 1(3), p183-200, 1996 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 22(15), p2915-2921, 1994 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology,16, p541-546, 1998.
La fragmentation et le marquage s'effectuent en une étape ou en deux étapes et le marquage peut s'effectuer indifféremment avant, après ou simultanément avec Ia fragmentation.
De préfêrence, le marquage et la fragmentation s'effectuent simultanément c'est-à-dire que les réactifs nécessaires à ces deux étapes sont nus ensemble en solution homogène sensiblement aqueuse avec l'acide nucléique par exemple. C'est notamment le cas pour la fragmentation chimique ou enzymatique. Dans le cas de la fiagmentation mécanique par un moyen physique, «marquage et fragmentation s'effectuant simultanément » signifie que le moyen physique est appliqué à une solution homogène sensiblement aqueuse contenant au moins les acides nucléiques et le réactif de marquage.
La fragmentation de l'acide nucléique s'effectue par voie enzymatique, chimique ou physique.
La fragmentation par voie enzymatique de l'acide nucléique est réalisée par exemple par des nucléases.
La fragmentation par voie physique de l'acide nucléique est réalisée par exemple par sonication ou par radiation.
La fragmentation par voie chimique, si l'acide nucléique est un ARN, est réalisée par les méthodes usuelles (voir par exemple Chem. Rev, 98, 961-990, 1998 de Oivanen M.
et ad.).
Les complexes de métaux, tels que décrits dans la revue de G. Pratviel et al, Adv. Org.
Chem., 45, p251-312, 1998 ou la revue G. Pratviel et al., Angew. Chem. Int.
Ed. EngL, 34, p746-769, 1995, sont utilisables pour la fragmentation de l'ADN ou l'ARN.
Dans un premier mode de réalisation, la fragmentation chimique d'ARN est réalisée par des cations métalliques associés ou non à un catalyseur chimique. Dans ce cas, les cations métalliques sont des ions Mgz'+, Sr2'+, Ba2+, Pba+, Zn2+, Cd2+, Mn2+, Fez+, Coi+, Ni2+, Ru3+, Ce3+, Eu3+, Tb3+, Tm3+~ ~3+ ou Lu3+, le catalyseur chimique est constitué par de l'imidazole, un analogue substitué, 2o par exemple 1e I~méthyl-imidazole, ou toute molécule chimique ayant une affinité pour TARN et portant un noyau imidazole ou un analogue substitué. Les conditions de fragmentation à l'aide de métaux sont bien décrites dans la demande de brevet V6D-A-99/65926.
Avantageusement, les métaux sont Mg2+, Mn2+, Znz+~ ~s+ ou Ce3+, de préférence Mg Z+, Mn2+, Zn2+
Des conditions efficaces de fragmentation sont obtenues avec une concentration en cation métallique comme Mn++ entre 2 et 100 rnM, une concentration en imidazole entre 2 et 100mM.
Des conditions spécialement efficaces sont obtenues avec une concentration en cation comme Mn++ comprise entre 3 et 15 mM, et une concentration en imidazole comprise entre 20 et 50 rnM, en particulier 30 rnM.

Le pH de la réaction doit être légèrement basique. Avantageusement, le pH est compris entre 8,5 et 9, ce qui reprêsente un compromis très intéressant pour réaliser la combinaison marquage et fragmentation avec de l'ARN.
Dans un deuxième mode de réalisation, la fragmentation chimique de l'ARN est réalisée par action d'une polyamine, comme la sperniine, la putrescéine ou la. cadavérine.
Des concentrations de 5 à 100 mM permettent la fragmentation. Celle-ci est totale à partir de 10 mM
de polyamine.
Dans un troisième mode de rêalisation, la fragmentation chimique de l'ARN est réalisée par action d'une nucléase artificielle (voir G. Pratviel et al., Adv. Inorg.
Chem.,45, p251-312; 1998; D.
S. Sigman et al. Chern. Rev., 93, p2295-2316, 1993), comme la 1,10-phénanthroline associée à un cation métallique comme le fer, le cuivre ou le zinc. Ces cations proviennent respectivement de FeSO~ ou CuCb ou ZnC)~, en solution. Des concentrations entre 2 et 50 mM de 1;10-phénanthroline sont utilisées pour la fiagmentation d'ARN en particulier entre 4 et 10 mM.
La fragmentation par voie chimique de l'ADN est réalisée en mettant en présence l'acide nucléique avec un moyen chimique de création de site abasique. La formation d'un site abasique rësulte de la coupure de la liaison N-glycosidique qui lie le sucre 2-désoxyribose à la base nucléique.
Il s'agit d'un dépurination par la perte d'une purine (guanine, adénine), chargée négativement, ou d'une dépyrimidination dans le cas de la perte d'une pyrimidine (cytosine, thymine), chargée positivement.
2o Cette dépurination est spontanée dans des conditions physiologiques (pH 7,4 à 37°C) mais la vitesse de la réaction est très faible de l'ordre de 3.10-11 dépurination par seconde, c'est-à-dire inutilisable pour une fragmentation efficace. Pour augmenter la vitesse de xéaction, on utilise des agents alkylants qui fragilisent la liaison N-glycosidique ou des uracile-ADN
glycosiïases sur des ADN incorporant des uracyles.
Le site abasique obtenu par dépurination ou dépyrimidation est très instable.
La fragmentation au niveau de ce site est obtenue à température ambiante en milieu basique. En milieu acide, la température élevée accélère ëgalement cette fragmentation.
L'utilisation de molécules capables d'initier le phénomène de ~3-élinvnation accélère aussi la fi~gmentation.

Un mode préféré de réalisation de la fragmentation est obtenu par l'utilisation d'un pH acide c'est-à-dire un pH inférieur à 5. Avantageusement le pH est de 3.
Un tampon formiate de sodium à pH 3 permet de fragmenter de manière efficace selon (invention. Ce tampon est compatible avec les conditions de marquage en une étape comme cela 5 sera démontré dans les exemples. Encore plus avantageusement, un milieu acide (HCI, carbonate, HZS 04) est utilisé.
Dans un mode particulier de la prêsente invention et dans le but d'augmenter encore la fragmentation, l'acide désoxyribonucléique contient au moins une base modifiée susceptible de l0 générer un site abasique plus facilement Diverses bases modifiées sont utilisables comme les N7-all~yl purines, les N3-allcyl purines, les 06-all~yl purines, les 8-brornopurines, les 8-thiopurines, les 8-alkylthiopurines, les 8 azidopurines ou les 8-alkylsulfonylpurines.
Dans le cas où l' acide nucléique à marquer serait généré par une technique d' amplification enzymatique comme la. PCR, l'utilisation d'une 8-bromopurine permet d'avoir une incorporation efficace pendant l'amplif~.cation, ce qui facilite d'autant le procédé de fragmentation et de marquage selon l'invention, tout en conservant une sensibilité excellente pour l'étape d'amplification enzymatique.
La présente invention décrit une molêcule biologique marquée et en particulier un acide nuclëique marqué, susceptible d'êhe obtenue) par (un quelconque des procédés selon l'invention.
La présente invention concerne aussi un kit de détection d'une molécule biologique, en particulier un acide nucléique cible comprenant un xéactif de marquage selon l'invention. En fonction des applications du kit, d' autres éléments comme par exemple, des moyens de lyse (micro-organismes edou cellules) edou des moyens de concentt~ation (comme de la silice ou des particules magnétiques) etlou des moyens d'amplification enzymatique sont incorporés dans le kit.

L'invention concerne l'utilisation d'une molécule biologique m_arquêe, en particulier un acide nuclêique marqué tel que défini ci dessus, comme sonde de détection d'une molécule biologique cible, et en particulier d'un acide nucléique cible.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, comme cible marquée pouvant se fixer sur une sonde de capture.
Pour permettre 1a détection et/ou la quantification etlou la purification de la molécule 1o biologique Bible, la molécule biologique marquée est capable de former un complexe avec la molécule biologique cible. A titre d'exemple, pour la mise en évidence d'une molécule cible de type acide nucléique, l'acide nucléique marqué est suffisamment complémentaire de la cible pour s'hybrider spécifiquement en fonction des conditions de réaction, et notamment de la température ou de la salinité du milieu réactionnel.
Le procédé de détection est applicable pour le séquençage, le profil d'expression des ARN
messagers ou le criblage de mutations à des fins de recherche ainsi que le criblage de drogues dans l'industrie pharmaceutique, le diagnostic de maladies infectieuses ou génétiques, le contrôle alimentaire ou industriel.
La tendance en matière de diagnostic et notamment pour les maladies infectieuses (S>DA ou Tuberculose par exemple) est de baisser le niveau de sensibilité, jusqu'à la détection d'une molécule unique dans un échantillon qui peut représenter plusieurs millilitres dans le cas d'un prêlèvement liquide type sang ou urine ou liquide céphalo-rachidien. Ce niveau de sensibilité ne peut être obtenu que si toutes les étapes depuis le prélèvement de l'échantillon jusqu'au rendu de résultat sont optimisées. Les différents moyens de (invention permettent cette optimisation sans difficulté car les réactifs, méthodes et procédés de l'invention sont applicables de manière très large à différentes molécules biologiques. En particulier dans le cas où une étape d'amplification enzymatique est nécessaire pour obtenir la sensibilité nécessaire (infection virale ou bactérienne comme VIEi, VHC
ou Tuberculose), un procédé de marquage et/ou de fragmentation, comme décrit dans la présente invention, permet de ne pas affecter la sensibilité de la technique d'amplifiication, soit parce qu'il n'est pas nécessaire de remplacer les désoxyribonucléotides ou les ribonucléotides utilisés dans la technique d'amplification enzymatique, soit parce ce que les ribonuclêotides ou désoxyribonueléotides incorporés n'altèrent pas la sensibilité.
La chimie de greffage décrite dans la présente invention possède des caractêristiques telles, du point de vue réactivité et spécificité, que d'autres applicaïions sont décrites ci après ~ Dans un premier mode de réalisation, cette chimie de greffage est appliquée à la fixation covalence d'acides nucléiques sur un support solide.
~ Dans une première variante du procédé, un précurseur de la fonction diazométhyle, tel une cétone ou hydrazine comme décrit précédemment, est introduit pendant la synthèse chimique et Ia fonction diazomêthyle est introduite sùr les acides nucléiques dans une deuxième étape.
~ Dans une deuxième variante préférée du procédé, les fonctions diazornéthyles sont introduites sur le support solide et les acides nucléiques sont fixés sur Ie support solide par l'intermédiaire des phosphates des acides nucléiques et en particulier des phosphates terminaux (5' ou 3').
L'introduction de phosphate à l'extrémité 3' ou 5' des acides nucléiques est bien connue (voir e< Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties » édité par S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).
Dans un mode de réalisation particulier d'un tel support solide, un rêactif de marquage portant un ligand, en particulier un haptène comme la biotzne ou fabiétane, est fixé sur le support solzde sur lequel est îixé de manière covalente ou par adsorption un anti ligand, comme la streptavidine ou un anticorps par exemple. Ces supports solides sont bien connus dans l'état de la technique et sont même commercialement disponibles (plaque de microtitration-streptavidine ou latex sireptavidine par exemple). La fonction du marqueur n'est plus dans ce cas de permettre la détection mais de permettre Ia fixation du réactif de marquage sur le support solide. La fonction diazométhyle est alors disponible pour réagir sur des acides nucléiques. Les dérivés de formule (13), (14), (15) ou le dérivé PDAM sont des exemples de réactifs utilisables pour la fabrication d'un tel support solide. La technique des anticorps monoclonaux permet de préparer des aniicoips coniae un grand nombre de marqueur comme la fluorescéine ou un dérivé du CyS. L'homme du métier peut mettre en ceuvre un support solide avec les réactifs de marquage de la présente invention sans difficulté excessive par ce mode de préparation indirect du support solide dans lequel une réaction ligandlanti-ligand est utilisée pour fixer la fonction diazornéthyle sur le support solide.
Un deuxième mode de rêalisation du support solide concerne les supports particulaires comme les latex. Différents modes de polymérisation peuvent être utilisés pour préparer les particules portant une fonction diazométhyle à partir d'un monomère fonctionnel polymérisable portant soit une fonction diazométhyle soit préférentiellement une fonction précurseur de la fonction diazométhyle comme un alde-hyde ou une cétone et notamment l0 ~ Polymérisation à rêacteur fermé appelée e< batch » : les monomères sont introduits dans le réacteur avant le début de réaction avec les autres ingrêdients et sans ajout ultérieur. En raison de la diffêrence de réactivité des monomères, ce procédê conduit souvent à
l'apparition d'une dérive de composition. Celle-ci se manifeste par l'obtention de macromolécules ayant des compositions qui varient considérablement en fonction de la conversion. Cette méthode est peu efficace pour l'incorporation en surface car une partie importante du monomère fonctionnel risque d'être perdue soit à l'intérieur des particules, soit sous forme de polymère hydrosoluble. Lorsque la copolymérisation est effectuée en <ebatch » avec des monomères de nature polaire, on obtient des particules plus petites, en gr and nombre, mais avec une conversion limitée. Ce comportement est lié à l'importante solubilité dans l'eau de ces monomères, et il est attribué à la prépondérance 2o du mécanisme de nucléation homogène.
~ Polymérisation en serai-continu : une partie au moins des monomères est introduite dans le réacteur sur une période comprise entre le début de la réaction et la fin de celle-ci. Ce rajout peut être effectué à une viïesse fixe ou bien suivant un profil donné. Le but est de contrôler (addition du mélange de monon~res de façon à obtenir un copolymère de composition contrôlée (contrôle de la composition de (interface); c'est ainsi qu'on se place souvent dans des conditions d'addition telles que la vitesse de polymérisation soit plus grande que celle d'addition.
~ Polymérisation par addition différée appelée e< shot » : une fois que la réaction de polymérisation est en cours, le monomère fonctionnel seul, ou en pnsence du monomère de base, est introduit dans le système d'une façon contrôlée. Le succès de l'opération dépend donc du degré de connaissance préalable de la cinétique de copolymérisation. C'est une méthode efficace pour favoriser l'incorporation supeWcielle. La sélection des conditions expérimentales (degré de conversion au moment de l'addition, composition et concentration du mêlange des monomères) permet d' optimiser les rendements de surface.
~ Polymérisation sur semence : elle consiste à introduire le monomère fonctionnel dans le système contenant un latex déjà constitué et parfaitement caractérisé. Le monomère fonctionnel peut être additionné seul ou en mélange avec le monomère de base de la semence, en une étape ou en serai-continu.
1o Les techniques de polymérisation sur semence, polymérisation par addition différée, polymérisation en serai-continu sont préféréës car elles conduisent à un maxim__um d'incorporation du dérivé portant le précurseur de la fonction diazométhyle en surface. Des exemples de particules portant des fonctions aldéhydes sont donnés par exemple dans B. Charleux et al, Die Ma.~-omolecular Chem, 193, p 187 et p. 205, 1992 ou dans le bxevet EP-B-0.350.407.
Un troisième mode de réalisation du support solide consiste à disposer d'un support solide comprenant une première fonction réactive nucléophile ou électrophile, comme par exemple NH~, SH, OH, O-NH2, allcylcétone, aldéhyde, isocyanate, isothiocyanate, rnaléimide, halogénure d'alkyle, ester de N hydroxysuccinimide, tosylate, puis à faire réagir un intermédiaire de fixation, comportant 2o une fonction réactive complémentaire de la première fonction réactive du support solide. Cette réaction entre le support solide et fintermédiaiare de fixation s'effectue en présence, éventuellement, d'un agent de couplage pour former une liaison covalente.
Un tel support solide comprenant au moins une fonction diazométhyle, selon les différents modes de réalisation décrits ci dessus, en particulier un. support solide sur lequel est fixé
indirectement un réactif de marquage de (invention, est aussi un objet de la présente invention ainsi que le support solide comprenant des acides nucléiques f xés sur le suppou solide par l'intermédiaire des fonctions diazométhyles.

Une première application d'un tel support solide est la fabrication de puces à
ADN. Des méthodes existent pour répartir des acides nucléiques sur le support solide en des positions discrètes et prédéternzinées.
5 Le brevet US-A-6,110,426 propose une méthode pour réaliser ces puces à ADN à
l'aide d'un capillaire que f on met en contact sur une surface solide pour délivrer un volume contrôlé de liquide. Un contact effectif a lieu entre l'extrémité du capillaire et le support solide pour que la goutte se dépose par capillarité. De même, le brevet US-A-6,083,763 décrit un ensemble de capillaires coulissant dans un dispositif de façon à compenser les différences de hauteur de chacun d'eux. lls 10 sont amenés au contact d'une surface plane pour le dépôt par capillarité
d'oligonucléotides spêcifiques.
Le brevet US-A-6,083,762 propose une système de répartition de gouttes comprenant un microdispenseur couplé à un transducteur piézo-électrique pour éjecter des volumes de goutte infêneurs au nanolitre sur une surface solide. Un résultat semblable est obtenu en appliquant une 15 source chaude sur Ia paroi d'un capillaire pour former une bulle qui êjecte un volume défini de solution (voir T. Okamoto et al., Nature Biotechnology, l8, p438-441, 2000).
La fonction diazométhyle permet ainsi de greffer de manière covalente les acides nucléiques sur le support. Le greffage est simple, la liaison est stable, par rapport à
l'adsorption notamment, et la sélectivité de la réaction par rapport au phosphate terminal permet de réaliser un couplage orienté
2o de l'acide nucléique sur le support solide, ce qui facilite d'autant les étapes d'hybridation ultérieures en diminuant l'encombrement stérique.
Une deuxième application d'un support solide selon l'invention est la purification des acides nucléiques.
25 Dans le cas de Ia purification, cette purification est soit directe (le support solide porteur de fonctions diazométhyle réagit avec les acides nuclêiques à purifier) soit indirecte (des acides nucléiques de capture sont fixês sur le support solide). Ces acides nucléiques de capture sont suffisamment complémentaires de la cible à capturer pour s'hybrider avec le degré de spécificité

souhaité et c'est le complexe e< acides nucléiques de capture/support solide »
qui permet la purification des acides nucléiques cibles.
Le support solide est de préférence sous forme dispersée pour l'utilisation en purification comme des particules de latex, par exemple des particules magnétiques.
Par e< étape de purification », on entend notamment la séparation entre les acides nucléiques des micro-organismes et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse qui prêcéde la purification des acides nucléiques. Ces étapes de lyse sont bien connues à
titre d'exemple indicatif, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet - WO-A-00/60049 sur la lyse par sonication, - WO-A-00105338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, - WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et - WO-A-99/15621 sur la lyse mécanique.
L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les traitements par des agents chaotropiques, tels que les sels de guanidium(brevetUS-A-5,234,809).
Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques, qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement 2o intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO-A-97/45202 et WO-A 99/35500.
Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matëz~aux sur lesquels peut être fixé
un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides, tels que les matéi~aux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, ou le dextran ; des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ;
des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels, etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane, d'une particule ou d'une plaque sensiblement plane de verre ou silicium ou dêrivês.
L'invention concerne enfin un procédé de capture d'acides nuclêiques comprenant les étapes suivantes ~ on dispose d'un support solide sur lequel est fixé directement ou indirectement au moins une molêcule comprenant une fonction diazométhyle, l0 ~ on met en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des acides nucléiques libres, et ~ on lave le support solide où la (ou les) molécules) sont fixées) de manière covalence au moins à
un acide nucléique.
Des informations complémentaires peuvent être trouvées dans une autre demande de brevet de la Demanderesse, W0021090584, déposée sous priorité du 4 mai 2001.
Les exemples et figures ci-joints représentent des modes particuliers de réalisation et ne peuvent pas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
La figure 1 représente les foi~nules développées de différents réactifs utilisés dans la présente invention ainsi que (abréviation les désignant (o- signifie ortho, m- méta et p- paya).
La figure 2 représente la valeur moyenne du signal et le pourcentage de similarité de la m-bio-'TÉTA PMDAM en fonction de sa concentration pour rpoB.
Exemple 1 ~ Synthèse du réactif de référence : rnéta-BioPMDA,M:
~ Composé biotine méta-acétophénone la On solubilise la D-biotine (1,0 gramme (g), 4,1 miLmoles (rnmol)) dans 45 millilitres (mL) de DMF
anhydre à chaud. On refioidit à 0°C sous argon, puis on ajoute successivement la N-méthylmorpholine (590 microlitres ~ (~tL), 5,33 mmol) et Ie chloroformiate d'isobutyle (840 (.tL, 6,60 mmol). On laisse sous agitation pendant 30 minutes (min), puis on ajoute la 3-aminoacétophénone (824 mg, 6,10 mmol) et la N méthylmorpholine (480 ~,I,, 4,35 mmol) dans 10 mL
de DMF. La solution est maintenue sous agitation à 0°C pendant 2 heures (h), puis on évapore à sec. On reprend le résidu dans 3 mL de MeOH, puis on ajoute 50 rnL d'eau. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l'eau, du CHZCIz et de l'éther pour donner 1,2 g (80 %) de produit la brut.
Une recristallisation dans le couple MeOH H20 donne la (1,01 g, 70 %) sous forme d'une poudre blanche.
1o -i F 145°C. - IR (KBr~)': 3280, 2931, 2857, 1691, 1590,1540, 1487, 1434, 1298, 1266 cm .
RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) ~ = 1,3-1,7 (m, 6 H) ; 2,33 (t, J= 8 Hz, 2 H) ; 2,55 (s, 3 H) ;
2,58 ; (d, J = 12 Hz, 1 H) ; 2,83 (dd, J =12 et 5 Hz, 1 H) ; 3,13 (m, 1 H) ;
4,15 (m, 1 H) ; 4,31 (ni, 1 H) ; 6,34 (s, 1 H) ; 6,41 (s, 1 H) ; 7,44 (t, J= 8 Hz, 1 H) ; 7,64 (d, J= 8 Hz,1 H) ; 7,85 (d, J= 8 Hz, 1 H) ; 8,17 (s,1 H) ; 10,05 (s,1 H). - MS (FAB/glycérol), rrrlz: 362 [M+H]+.
~ Composê rnéta-hydrazone 2a Une solution de la (500 mg, 1,38 mmol) et d'hydrazine monohydrate (200 ~.L, 4,15 mmol) dans de l'éthanol absolu (8 mL) est chauffée à reflux pendant 2 h. Après refroidissement à température ambiante, le précipité blanc est filtrê, lavé avec de l'eau, puis avec de (éther et séché. On obtient ainsi 385 mg (74 %) de produit 2a sous forme d'une poudre blanche.
F 185°C. - IR (KBr) : 3298, 2931, 2857, 1698, 1665, 1626, 1541, 1494, 1470, 1446, 1330, 1265 cm 1. - RMN 1H (300 MHz, DMSO-ds) 8 = 1,3-1,7 (m, 6 H) ; 1,98 (s, 3 H) ;
2,26 (t, J = 8 Hz, 2 H) ; 2,56 ; (d, J = 12 Hz, 1 H) ; 2,81 (dd, J=12 et 5 Hz,1 H) ; 3,11 (m, 1 H) ; 4,13 (m, 1 H) ; 4,29 (m, 1 H) ; 6,39 (s, 3 H) ; 6,42 (s, 1 H) ; 7,22 (m, 2 H) ; 7,50 (d, J = 8 Hz, 1 H) ; 7,84 (s, 1 H) ; 9,82 (s, 1 H). - MS (FAB/glycérol), ryzlz: 376 [M+H]+.

~ Composé ntéta-cliazométhane 3a On solubilise 2a (180 mg, 0,48 rnmol) dans 2 mL de DMF. On ajoute alors MnOz (340 mg, 3,9 mmol). Après 30 minutes d'agitation à température ordinaire, le mélange est filtrë à travers un entonnoir firitté contenant de la vélite (épaisseur : 0,5 cm) et des tamis moléculaires en poudre 3 A
(0,5cm). Le mélange réactionnel est concentré jusqu'à un volume d'environ 0,5 mL, puis 5 mL
d'éther sont ajoutés. Le précipité résultant est filtré, lavé à l'éther puis séché. Le composé 3a (170 mg, 95 %) est obtenu sous forme d'une poudre rose.
F 160°C. - IR (KBr) : 3278, 2935, 2859, 2038, 1704, 1666, 1605, 1577, 1536, 1458, 1430, 1263 cm 1. - RMN 1H (300 MHz) 8 =~ 1,3-1,7 (m, 6 H) ; 2,11 (s, 3 H); 2,28 (t, J = 8 Hz, 2 H);
2,57; (d,J=l2Hz,lH);2,81(dd,J=I2et5Hz,lH);3,1I(m,lH);4,13(m,lH);4,29 (m,1 H) ; 6,33 (s,1 H) ; 6,41 (s, l H) ; 6,60 (m, l H) ; 7,25 (m, 3 H) ; 9,84 (s, l H)).
1s Exemt~le 2 ~ Synthèse du réactif N-(3,6,9-triaminenonanyl)-biotinamide Bio-TETA) (r) La D-biotine (2,80 g, 11,40 mmol) est dissoute dans 30 mL de DMF anhydre.
L'ajout du carbonyldiimidazole (1,5 éq. ; 2,78 g) provoque après quelques minutes la formation d'un précipité.
Après 30 min d'activation, la suspension qui résulte est ajoutée doucement sur la triéthylènetétramine (2 éq. ; 5,00 g) en suspension dans 20 mL de DMF. La réaction est laissée 2h sur bain d'huile â
60°C.
Le produit est purifié par chromatographie flash sur gel de silice avec comme éluant CH2Ch/MeOH/N~140H 20 : 80 : 3. Aprés évaporation des fractions concernêes, on obtient 1,94 g de produit en foi~ne d'une poudre blanche (46 %).
RMN-1H (200 MHz, DMSO- d6) 8 = 7,75 (s, 1H, -NH-CO-) ; 6,40 (d, 2H, -NH- biot) ; 4,30 (t, 1H, -CH- biot) ; 4,15 (d, 1H, -CH- biot) ; 3,30 (m, 12H, -CHZ-NH-) ; 3,11 (m, 1H, -CH-S-) ;
2,8 (dd, 2H, -CHZ-S-) ; 2,55 (m, 5H, -NH-CHZ- & -NHz) ; 2,04 (t, 2H, -CHZ-CO-) ; 1,52 (m, 6H, -CHz-).

Acide N f3'-acétophényl)-succinarnique fACBA) (2) La 3-aminoacétophénone (5,0 g ; 37 mmol) est dissoute dans 50 mL
d'acétonitrile anhydre sous argon. On ajoute l'anhydride succinique (1,3 éq. ; 4,62 g) et on laisse réagir une heure sous argon.
Le produit 2 apparaît en forme de précipitê. Après filtration et lavage à
l'éther du précipité, on 5 obtient 7,29 g de poudre blanche (84 %).
RMN-~H (200 MHz, DMSO-d6) S =12,10 (s, 1H, -OH) ; 10,17 (s, 1H, -NH-) ; 8,19 (s, 1H) ;
7,82 (d, 1H) ; 7,66 (d,1H) ; 7,50 (t, 1H) ; 2,56 (m, 7H, -(CH2)a- et-CH3).
N f3' ac~tot~hényl)-N'-f3 6-diamine-9-bioti~coylamirzononanyl)-succinamide fBio-fTETA) AP) L'ACBA (2) (1,03 g; 4,39 mmol) est dissoute dans 20 mL de DMF anhydre sous argon. Le milieu est refroidi dans la glace, et on ajoute successivement N méthylmorpholine (1,25 êq. ; 725 ~L) et chloroformiate d'isobutyle (1 éq. ; 690 ~L) : le milieu devient trouble après 30 min. En parallèle, la Bio-TETA (1) (0,8 éq. ; 1,94 g) est solubilisée à chaud dans 50 mL de DMF et de triéthylamine (0,8 éq. ; 750 ~L). Elle est ajoutée à l'ACBA activée à 0°C, pendant 30 min. On Iaisse ensuite à
température ambiante sur la nuit. La purification se fait par chromatographie flash sur gel de silice avec comme éluant CHZCb_/MeOH/NHaOH 85 : 30 : 3. Les fiactions contenant le produit 3 sont réunies et le solvant évaporé. On obtient 1,01 g de solide blanc en forme de paillettes (33%).
RMN-1H (200 MHz, DMSO- d6) 8 = 10,16 (s, 1H, Ph NH-CO-) ; 8,18 (s, 1H) ; 7,97 (s, 1H, -2o CO-NH-CH2-) ; 7,80 (d, 1H) ; 7,85 (s, 1H, -CH2-NH-CO-) ; 7,60 (d, 1H) ;
7,43 (t, 1H) ; 6,38 (d; 2H, -NH- biot) ; 4,3 (t,1H, -CH- biot) ; 4,10 (d, 1H, -CH- biot) ; 3,35 (m,12H, -CHZ-NH-) ;
3,10 (m, 1H, -CH-S-) ; 2,80 (dd, 2H, -CHZ-S-) ; 2,60 (s, 4H, -CHZ-CO-) ; 2,55 (s, 3H, -CO-CH3) ; 2,50 (m, 2H, -CHZ-CHI-CO-) ; 2,15 (m, 2H, -NH-) ; 1,40 (m, 6H, -CHZ-).
N ~3' f1 hydraTOno-éthyl)-phényl7-N'-f3 6-diarnine-9-biotinoylamir2ononanyl)-succina»ride ~Bio-fTETA)-Hy) (4) La Bio-('TÉTA)-AP (3) (1,0 g; 1,71 mmol) est mise en suspension dans 25 mL
d'éthanol à chaud (60°C). A reflux, on ajoute I'hydrazine monohychate (9 éq. ; 750 ~L).
La réaction est laissée à reflux pendant 2h, puis refroidie sur glace. Un précipité se forme après quelques moments. Les deux phases sont séparées et le prêcipité est mis sous vide. On obtient 690 mg d' un solide floconneux (68 %).
RMN-~H (200 MHz, DMSO- d6) 8 = 9,95 (s, 1H, Ph-NH CO-) ; 8,0 (s, 1H, -CO-NH
CH2-) ;
7,90 (s, 1H) ; 7,80 (s, 1H, - CHz-NH-CO-) ; 7,5 (d, 1H) ; 7,28 (m, 2H) ; 6,41 (s,1H, -NH- biot) s ; 6,36 (d,.3H, -NH- biot & -NHZ) ; 4,64 (t, 1H, -CH- biot) ; 4,30 (d, 1H, -CH- biot) ; 3,43 (m, 12H, -CH2-NH-) ; 3,12 (m, 1H, -CH-S-) ; 2,80 (dd, 2H, -CH2-S-) ; 2,60 (s, 4H, -CHZ-CO-) ;
2,50 (s, 3H, -CO-CH3) ; 2,10 (m, 2H, -CHa-NH-CHZ-) ;1,50 (m, 6H, -CHZ-).
N ~3'-(1-diazo-éthyl)-phényll-N'-f3 6-diamine-9-biotinoylaminononanyl)-succinamide rrn-Bio-Zo (TÉTA)-PMI~AM) (5) La Bio-(TÉTA)-Hy (4) (150 mg ; 250,4 .mol) est solubilisée dans 1 mL de DMSO
anhydre sous argon. On laisse réagir 30 minutes avec Mn02 (s) (15 éq. ; 330 mg) puis on filtre sur fritté n°4 avec de la célite (0,5 cm d'épaisseur) et du tamis moléculaire 3 1~ (0,5 cm d'épaisseur). 100 ~L sont utilisés pour la RMN avec ajout de 380 ~L de DMSO-d~ et 20 ~L de methanol-d4.
On ajuste le 15 volume final à 4,5 mL avec DMSO anhydre et 4% de méthanol. On aliquote dans une boite à gants sous Argon par 250 pL. Le composê est rose fuchsia. Le degré de pureté
(contenu en diazométhyle) est contrôlé par RMN 1H et spectrophotométrie UV-vis (pic d'absorbance du diazométhyle à 516 nm).
RMN-~H (200 MHz, DMSO- d6) 8 = 9,93 (s, 1H, Ph NH-CO-) ; 7,3 (s, 3H, H~.o~,a,;9ues) ; 6,6 (s,

20 1H, Harou,atique) ; 6,4 (s, 1H, -NH- biot) ; 6,3 (s, 1H, -NH- biot) ; 4,3 (t, 1H, -CH- biot) ; 3,3 (m, 12H, -CHZ-NH-) ; 3,3 (m, 1H, -CH-S-) ; 2,9 (dd, 2H, -CH2-S-) ; 2,5 (4H, -CHZ-CO-) ; 2,1 (s, 3H, -CH3) ; 2,0 (m, 2H, -CH2-NH-CHZ-) ; 1,50 (m, 6H, -CH2-).
25 Exemple 3 ~ Préuaration des acides nucléiaues ADN et ARN
Exemple 3.1 : Préparation des amplicons ADN

Les amplicons ADN sont générés par PCR à partir de cibles d'ADN génomique Mycobacteriuna tuberculosis 16S (10+4 copies comme cibles de départ) en utilisant le kit Fast Start de Roche, 0,2 mM de chaque désoxyribonucléotide (d-ATP, d CTP, d GTP, d TTP), 0,3 ~M
d'amorces et 0,4 ~L, d'enzyme.
Les paramètres de la PCR sont les suivants - 95°C : 4 mn puis 35 cycles (95°C : 30 sec ; 55°C : 30 sec ; 72°C : 30 sec) puis 4°C.
Les amplicons sont analysés qualitativement par électrophorèse sur gel d'agarose (1,5%, TBE
0,5X). Le volume déposé est de 5 ~L et la migration s'effectue durant 20 mn à
100 Volts (V). La visualisation des produits PCR est réalisée sous lampe ITV après coloration au bromure d'éthidiuni Les conditions pour Ia culture, l'extraction des Mycobactéries ainsi que les amorces d'amplification sont données dans la demande de brevet WO-A-99/65926.
Exemple 3.2 : Préparation des ARN transcrits Les transcriptions sont réalisées à partir de cible PCR (fragment de TARN 16S
de Mycobacterium tuberculosis) en utilisant le kit MEGAscript d'Ambion : 7,5 mM de chaque nucléotide (ATP, CTP, GTP et UTP) et 2 ~L d'enzyme (ARN polymérase). Le temps d'incubation est de 3 heures (h) à 37 °C. Les amorces d' amplification de la PCR portent un promoteur de polymêrase T3 ou T7, comme décrit dans la demande WO-A-99/65926 ou dans l'article J. Clin Microbiol.
37(1), p 49-55, 1999, ce qui permet de réaliser la transcription.
Les transcrits sont analysés par élecürophorèse sur gel d'agarose (1,5% ; TBE
0,5X). Le volume déposé est de 5 ~L et la migration s'effectue durant 20 mn à 100V. La visualisation des transcrits est réalisêe sous lampe UV après coloration au bromure d'éthidium.
Des résultats identiques du point de me de l'invention peuvent être obtenus en utilisant d'autres techniques d'amplification comme la NASBA ou TMA, qui génèrent directement des amplicons ARN.

Claims (25)

1. Réactif de marquage stable à la température de formule (0) :
dans laquelle :
.cndot. R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, .cndot. R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, .cndot. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, .cndot. R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2,-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, .cndot. A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris entre 0 et 2, préférentiellement de 0 ou 1, .cndot. -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-, .cndot. -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, .cndot. m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et .cndot. p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3.

2. Réactif de marquage, selon la revendication 1, de formule (1) :

dans laquelle :
.cndot. R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, .cndot. R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, .cndot. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, .cndot. R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, -CO-NH-(CH2)s-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R= alkyle ou aryle, et .cndot. -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-, .cndot. m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et .cndot. p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3.

3. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que p est inférieur ou égal à m.

4. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de formule (2) dans laquelle :
.cndot. R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, .cndot. R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structura multimérique, .cndot. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, .cndot. R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)m Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R= alkyle ou aryle, et .cndot. q est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3

5. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de formule (3) :
dans laquelle :
.cndot. R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, .cndot. R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, .cndot. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, et .cndot. R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 - (L)n Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle.

6. Réactif, selon la revendication 5, caractérisé par le fait que R2 est consituté par un résidu D-Biotine de formule (4):

7. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que R1 est consituté de : CH3, et R3 et R4 représentent chacun : H

8. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la structure -(L)n-est constituée par :
.cndot. la spermine ou N,N'-Bis(3-aminopropyl)-1,4-diaminobutane : NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2, ou .cndot. la spermine ou N-(3-aminopropyl)-1,4-butandiamine : H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2, ou .cndot. un dérivé contenant un motif alanine : NH2-CH2-CH2-COOH.

9. Réactif de marquage stable à la température de formule (6) :
dans laquelle :
.cndot. R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, .cndot. R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, .cndot. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, .cndot. R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R= alkyle ou aryle, .cndot. A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazo avec le cycle aromatique et u est un nombre entier compris entre 0 et 2, préférentiellement de 0 ou 1, .cndot. -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-, .cndot. -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, .cndot. m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et .cndot. p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3.

10. Réactif de marquage, selon la revendication 9, de formule (7) :
dans laquelle :
.cndot. R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, .cndot. R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, .cndot. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, .cndot. R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, .cndot. -Y X représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-, .cndot.-Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, .cndot. m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, et .cndot. p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3.

11. Réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que L
comprend un motif -(O-CH2-CH2)-, répété de 1 à 20 fois, préférentiellement de 1 à 10 fois, et encore plus préférentiellement de 2 à 5 fois, -Z- étant alors représenté par -NH-, -NHCO- ou -CONH-.

12. Procédé de synthèse d'un réactif de marquage, selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant les étapes suivantes :

a) on dispose d'un marqueur ou d'un précurseur de marqueur possédant une fonction réactive R6, b) on dispose d'un bras de liaison de formule (8) :
dans laquelle :
.cndot. -Z- représente -NH-, -NHCO-, -CONH- ou -O-, .cndot. m est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, .cndot. p est un nombre entier compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 1 et 3, .cndot. R7 et R8 représentent deux fonctions réactives identiques ou différentes, c) on fait réagir ensemble la fonction réactive R6 dudit marqueur ou précurseur de marqueur avec la fonction R7 du bras de liaison de formule (8) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une liaison covalente, R6 et R7 étant complémentaires, d) on dispose d'un dérivé de formule (9) :
dans laquelle .cndot. R1 représente H ou un groupe alkyle ou aryle ou aryle substitué, .cndot. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, .cndot. R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l' autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle, .cndot. -Y-X- représente -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, -CH2S-, .cndot. A est un bras de liaison comportant au moins une double liaison covalente permettant la conjugaison de la fonction diazométhyle avec le cycle aromatique et u est un nombre entier égal à

0 ou 1, et .cndot. R9 représente une fonction réactive complémentaire de R8, e) on fait réagir ensemble la fonction réactive R9 du dérivé de formule (9) avec la fonction R8 du bras de liaison de formule (8) en présence d'au moins un agent de couplage pour former une liaison covalente, f) on fait réagir l'hydrazine ou un de ses dérivés sur la fonction cétone ou aldéhyde pour former une hydrazone, et g) on transforme l'hydrazone en fonction diazométhyle à l'aide d'un traitement approprié.

13. Procédé de synthèse, selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'il comprend .cndot. une étape supplémentaire de protection de la fonction cétone ou aldéhyde du composé (9), et .cndot. une étape supplémentaire ultérieure de déprotection de ladite fonction cétone ou aldéhyde.

14. Procédé pour le marquage d'une molécule biologique, en particulier un acide nucléique, comprenant la mise en contact en solution homogène, dans un tampon sensiblement aqueux, d'une molécule biologique et d'un réactif, obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.

15. Molécule biologique marquée susceptible d'être obtenue par le procédé, selon la revendication 14.

16. Procédé de marquage et de fragmentation d'un acide nucléique simple ou double brin comprenant les étapes suivantes .cndot. fragmenter l'acide nucléique, .cndot. attacher un marqueur sur au moins un des fragments par l'intermédiaire d'un réactif de marquage choisi parmi les réactifs, obtenus selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, ledit réactif se couplant de manière covalente et majoritaine sur au moins un phosphate dudit fragment.

17. Procédé, selon la revendication 16, caractérisé par le fait que le réactif de marquage est choisi parmi les composés de formule (3):
dans laquelle:
.cndot. R1 représente H ou un groupe alkyle, aryle ou aryle substitué, .cndot. R2 représente un marqueur détectable ou au moins deux marqueurs détectables reliés entre eux par au moins une structure multimérique, .cndot. L est un bras de liaison comportant un enchaînement linéaire d'au moins deux liaisons covalentes et n un nombre entier égal à 0 ou 1, et .cndot. R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre : H, NO2, Cl, Br, F, I, R2 -(L)n-Y-X-, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2, -CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2 avec R = alkyle ou aryle.

18. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17, caractérisé
par le fait que la fragmentation et le marquage sont effectués en deux étapes.

19. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 16 à 17, caractérisé
par le fait que la fragmentation et le marquage sont effectués en une étape.

20. Procédé, selon l'un quelconque des revendications 18 à 17, caractérisé par le fait que le marquage s'effectue en solution homogène sensiblement aqueuse.

21. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisé
par le fait que la fragmentation s'effectue par voie enzymatique, physique ou chimique.

22. Acide nucléique marqué susceptible d'être obtenu par le procédé, selon l'une quelconque des revendications 16 à 21.

23. Kit de détection d'un acide nucléique cible comprenant un acide nucléique marqué, selon la revendication 22.

24. Support solide sur lequel est fixé un réactif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.

25. Procédé de capture d'acides nucléiques comprenant les étapes suivantes:
.cndot. on dispose d'un support solide sur lequel est fixé directement ou indirectement au moins carie molécule biologique, selon la revendication 15, ou un acide nucléique, selon la revendication 22, la molécule biologique ou l'acide nucléique comprenant une fonction diazométhyle, .cndot. on met en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des acides nucléiques libres, et .cndot. on lave le support solide où la (ou les) molécule(s) sont fixée(s) de manière covalente au moins à
un acide nucléique.