CA2585164A1 - Sequences nucleotidiques issues du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications notamment pour l'amplification des genomes de ces retrovirus et pour lediagnostic in vitro des infections dues a ces virus - Google Patents

Sequences nucleotidiques issues du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications notamment pour l'amplification des genomes de ces retrovirus et pour lediagnostic in vitro des infections dues a ces virus Download PDF

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Luc Montagnier
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Abstract

La présente invention concerne des séquences nucléotidiques dérivées des génomes des virus du type HIV-1, ou des génomes des virus du type HIV-2, ou des virus du type SIV, et leurs applications, notamment en tant qu'amorces oligonucléotidiques pour la mise en oeuvre de méthode de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type HIV-1 et/ou HIV-2.

Claims (24)

1. Oligonucléotide caractérisé en ce que sa séquence consiste en :
i) une séquence spécifique du gène gag ou du gène pol, et susceptible d'hybrider à une température de 60°C 1°C avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod ou SIV Mac, ii) une séquence spécifique du gène env, et susceptible d'hybrider à une température de 60°C
1°C avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli, ou iii) une séquence complémentaire d'une séquence telle que définie en i ou ii.
2. Oligonucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique est modifiée par rapport à la séquence du gène gag ou du gène pol des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod ou SIV Mac, et garde les propriétés d'hybridation avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod ou SIV Mac.
3. Oligonucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique est modifiée par rapport à la séquence du gène env des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli, et garde les propriétés d'hybridation avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli.
4. Oligonucléotide qui comprend une conservation d'au moins 5 bases de chaque côté de l'amorce par rapport à la séquence d'une amorce oligonucléotidique telle que décrite à la revendication 1 ou 2, et qui comporte dans sa partie médiane des modifications par rapport à la séquence d'une amorce oligonucléotidique selon la revendication 1 ou 2, et garde les propriétés d'hybridation avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod et SIV Mac.
5. Oligonucléotide qui comprend une conservation d'au moins 5 bases de chaque côté de l'amorce par rapport à la séquence d'une amorce oligonucléotidique telle que décrite à la revendication 3, et qui comporte dans sa partie médiane des modifications par rapport à la séquence d'une amorce oligonucléotidique selon la revendication 3, et garde les propriétés d'hybridation avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli.
6. Oligonucléotide spécifique du gène gag selon la revendication 1 choisi parmi :

- 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' - 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' - 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' - 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' - 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' - 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' - 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' - 5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3' - 5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3' - 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' - 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5' - 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' - 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' - 3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' - 3'-CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5' - 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' - 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' - 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'.
7. Oligonucléotide spécifique du gène pol selon la revendication 1 choisi parmi :

- 5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC
CAA-3' - 5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC
CAA-3' - 5'-TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAGAA-3' - 5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAGAA-3' - 5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACAAAG G-3' - 5'-TGG AAA GGT GAA GGG GCA GT-3' - 5'-TGG AAA GGT GAAGGA GCA GT-3' - 3'-TTG GGC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5' - 3'-TTG GTC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5' - 3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5' - 3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACT GTC CA-5' - 3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5' - 3'-ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5' - 3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5' - 3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'.
8. Oligonucléotide spécifique du gène env selon la revendication 1 choisi parmi :

- 5'-CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT
GCC CC-3' - 5'-AAT GGC AGT CTA GCA GAA GAA
GA-3' - 5'-ATC CTC AGG AGG GGA CCC AGA
AAT T-3' - 5'-GGG TTC TTG GGA GCA GCA GGA
AGC AC-3' - 5'-ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA
AGT AG-3' - 5'-ATG GGT GGC AAA TGG TCAA AAA
GT AG-3' - 5'-TAT TAA CAA GAG ATG GTG G-3' - 5'-TTC ATT CTT TTC TTG CTG G-3' - 3'- GGG GCA CAA TAATGT ATG GGA ATT
GG-5' - 3'-AAT TTC TGG GTC CCC TCC TGA
GGA T-5' - 3'-GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG
AAC CC-5' - 3'-CTA CTT TTT GAC CAC TTG CCA
CCC AT-5' - 3'-TTC ATT CTT TTC TTG CTG G-5'.
9. Couple d'amorces oligonucléotidiques, pour la mise en oeuvre d'une amplification génique du gène gag ou du gène pol de virus de type HIV-1, HIV-2 et SIV, les amorces consistant chacune en :
i) une séquence spécifique du gène gag ou du gène pol, et susceptible d'hybrider à une température de 60°C ~ 1°C avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod et SIV Mac ; ou ii) une séquence complémentaire d'une séquence telle que définie en i).
10.Couple d'amorces selon la revendication 9 caractérisé en ce que la séquence d'au moins une amorce oligonucléotidique est modifiée par rapport à la séquence du gène gag ou du gène pol des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod ou SIV
Mac, et garde les propriétés d'hybridation avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod ou SIV Mac.
11. Couple d'amorces selon la revendication 9, pour la mise en oeuvre d'une amplification génique du gène gag de virus de type HIV-1, HIV-2 ou SIV, les amorces consistant en :

i. au moins un mélange choisi dans le groupe des mélanges de séquences sens suivant MMy1: Mélange constitué des séquences 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' MMy2 : Mélange constitué des séquences 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' MMy4Bbis: Mélange constitué des séquences 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' MMy28 : Mélange constitué des séquences 5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3' 5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3', et ii. au moins un mélange choisi dans le groupe des mélanges de séquences antisens suivant :
MMy3 : Mélange constitué des séquences 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5"
3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5' MMy4 : Mélange constitué des séquences 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' MMy4B : Mélange constitué des séquences 3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5' MMy28bis : Mélange constitué des séquences 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'.
12.Couple d'amorces selon la revendication 9, pour la mise en uvre d'une amplification génique du gène pol de virus de type HIV-1, HIV-2 ou SIV, les amorces consistant en :
i. au moins un mélange choisi dans le groupe des mélanges de séquences sens suivant :

Mmy29: Mélange constitué des séquences 5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3' 5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC CAA-3' Mmy30: Mélange constitué des séquences 5'-TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAGAA-3' 5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAGAA-3' Mmy3l: Mélange constitué de la séquence 5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACAAAG G-3' Mmy32: Mélange constitué des séquences 5'-TGG AAA GGT GAA GGG GCA GT-3' 5'-TGG AAA GGT GAAGGA GCA GT-3', et ii. au moins un mélange choisi dans le groupe des mélanges de séquences antisens suivant :
Mmy29bis: Mélange constitué des séquences 3'-TTG GGC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5' 3'-TTG GTC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5' Mmy30bis: Mélange constitué des séquences 3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5' 3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACT GTC CA-5' Mmy3lbis: Mélange constitué de la séquence 3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5' Mmy32bis: Mélange constitué des séquences 3'-ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5' 3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5' 3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'
13.Couple d'amorces oligonucléotidiques, pour la mise en oeuvre d'une amplification génique du gène env de virus de type HIV-1, les amorces consistant chacune en :
i) une séquence spécifique du gène env, et susceptible d'hybrider à une température de 60°C ~ 1°C avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli ; ou ii) une séquence complémentaire d'une séquence telle que définie en i).
14.Couple d'amorces selon la revendication 13 caractérisé en ce que la séquence d'au moins une amorce oligonucléotidique est modifiée par rapport à la séquence du gène env des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal ou HIV-1 Eli, et garde les propriétés d'hybridation avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal ou HIV-1 Eli.
15.Couple d'amorces selon la revendication 13, pour la mise en oeuvre d'une amplification génique du gène env de virus de type HIV-1, consistant en i. MMy5-MMy8 - 5'-CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT
GCC CC-3' - 3'-GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG
AAC CC-5' ii. MMy6-MMy8 - 5'-AAT GGC AGT CTA GCA GAA GAA
GA-3' - 3'-GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG
AAC CC-5' iii. MMy7-MMy8 - 5'-ATC CTC AOG AGG GGA CCC AGAAAT
T-3' - 3'-GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG
AAC CC-5' iv. MMy5-MMy7bis - 5'-CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT
GCC CC-3' - 3'-AAT TTC TGG GTC CCC TCC TGA
GGA T-5' v. MMy6-MMy7bis - 5'-AAT GGC AGT CTA GCA GAA GAA
GA-3' - 3'-AAT TTC TGG GTC CCC TCC TGA
GGA T-5' vi. MMy8bis-MMy9bis - 5'-GGG TTC TTG GGA GCA GCA GGA
AGC AC-3' - 3'-CTA CTT TTT GAC CAC TTG CCA
CCC AT-5' vii. MMy8bis-MMy89 - 5'-GGG TTC TTG GGA GCA GCA GGA
AGC AC-3' - 5'-CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT
GCC CC-3' viii. MMy89bis-MMy9bis - 3'-TTC ATT CTT TTC TTG CTG G-5' - 3'-CTA CTT TTT GAC CAC TTG CCA
CCC AT-5' ix. MMy26-MMy5bis - 5' - AGC AGA AGA CAG TGG CCA TGA
GAG-3' - 3'- GGG GCA CAA TAATGT ATG GGA
ATT GG-5'
16.Oligonucléotide ou couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 susceptible d'hybrider avec les génomes des virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod ou SIV Mac ou HIV-1 Bru, HIV-1 Mal et HIV-1 Eli dans un tampon de composition Tris-HC1, pH 8,9 : 50 mM ;(NH4)2 SO4 :
15 mM ; MgCl2 : 5mM ; .beta.-mercapto-éthanol : 10 mM ;
gélatine : 0,25 mg/ml.
17.Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic d'une infection par un virus HIV par amplification génique comprenant :

i) au moins une amorce ou un couple d'amorces oligonucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, ii) des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'opérations d'amplification, notamment de l'ADN polymérase, quatre nucléotides triphosphate différents, et le tampon 10 x tel que décrit dans la revendication 16, iii) une (ou plusieurs) sonde(s), pouvant être marquée(s), capable(s) de s'hybrider avec la (ou les) séquence(s) d'acide nucléique amplifiée(s) à détecter.
18. Utilisation d'au moins une amorce ou d'un couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour l'amplification génique de séquences nucléiques du gène gag ou du gène pol de virus du type HIV-1 et/ou HIV-2, et/ou SIV.
19. Procédé d'amplification génique de séquences nucléiques du gène env de virus du type HIV-1, réalisé à partir d'un échantillon biologique, ce procédé comprenant principalement les étapes suivantes:
a) une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter appartenant au génome du virus du type HIV-1 éventuellement présent dans l'échantillon biologique sus-mentionné, et, le cas échéant, une étape de traitement à l'aide d'une transcriptase inverse dudit acide nucléique si ce dernier est sous forme d'ARN, b) un cycle comprenant les étapes suivantes :
.cndot.dénaturation de l'acide nucléique double brin à détecter, ce qui conduit à la formation d'un acide nucléique simple brin, .cndot. hybridation de chacun des brins d'acide nucléique, obtenus lors de l'étape de dénaturation précédente, avec au moins une amorce ou un couple d'amorces selon l'une des revendications 3, 5, 8 ou 13 à 15, par mise en contact des brins susmentionnés avec au moins un couple d'amorces susmentionnées, .cndot. formation à partir des amorces des ADN
complémentaires aux brins sur lesquels elles sont hybridées en présence d'une ADN
polymérase et de quatre nucléosides triphosphate (dNTP) différents, ce qui conduit à la formation d'un plus grand nombre d'acides nucléiques double brin à
détecter qu'à l'étape de dénaturation précédente, ce cycle étant répété un nombre de fois déterminé pour obtenir ladite séquence nucléique à détecter éventuellement présente dans l'échantillon biologique dans une proportion suffisante pour permettre sa détection, c) une étape de détection de la présence éventuelle de l'acide nucléique appartenant au génome du virus du type HIV-1 dans l'échantillon biologique.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'étape de dénaturation est réalisée en présence du (ou des) couple(s) d'amorces selon l'une des revendications 13 à 15.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est réalisé dans les conditions suivantes :
a) hybridation : les amorces (1 µl d'une solution à 40 µmolaire de chaque amorce) sont mis en présence de l'ADN-matrice (100 à 300 ng) pour la première étape de dénaturation-réassociation ; on chauffe, durant 10 minutes à
100 °C puis on plonge les tubes contenant ce mélange d'ADN-matrice et d'amorces dans de l'eau contenant de la glace. Les amorces doivent être utilisés à une concentration finale dans l'étape d'amplification qui suit de 0,8 µM chaque, b) amplification : on ajoute au milieu précédent les 4 dNTP chacun étant utilisé à 0,5 µmolaire en solution finale (50 µl), et une unité de Taq-polymérase pour un milieu réactionnel de 50 µl ;
22. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 21 au diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus du type HIV-1.
23. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 21 à la synthèse d'une protéine ou d'un polypeptide codé(é) par un polynucléotide obtenu par ladite amplification génique.
24. Méthode de synthèse d'une protéine ou d'un polypeptide codé(e) par un polynucléotide obtenu par l'amplification génique du génome de HIV-1 comprenant :

- une étape d'amplification du génome de HIV-1, à
l'aide d'au moins deux amorces oligonucléotidiques telles que définies selon l'une quelconque des revendications 3, 5, 8 ou 13 à 15, - l'introduction du polynucléotide ainsi obtenu dans un vecteur approprié, - la transformation de cellules hôtes à l'aide du vecteur susmentionné, et - la mise en culture des cellules hôtes transformées par ledit vecteur et la récupération de la protéine ou du polypeptide produit par ces dernières.
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