CN100347303C

CN100347303C - 具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶

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Publication number: CN100347303C
Application number: CNB008081417A
Authority: CN
Inventors: X·雷
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2020-03-31
Also published as: DE60021715D1; CN1413253A; MXPA01009809A; US6974690B2; US20030072844A1; EP1165806B1; EP1165806A2; US6511699B1; WO2000058481A9; DK1165806T3; DE60021715T2; BR0009516B1; CA2365418C; CA2365418A1; ES2248067T3; ATE301198T1; WO2000058481A2; AU4056700A; BR0009516A; WO2000058481A3

Abstract

本发明提供具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶。本发明提供具有改良的肌醇六磷酸酶活性之磷酸酶的蛋白酶解片段。也提供一种编码具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段的重组基因。本发明也包括一种通过用蛋白酶处理磷酸酶而增加该磷酸酶的肌醇六磷酸酶活性的方法。另外，本发明提供一种具有改良性质的磷酸酶AppA2。

Description

具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶

本申请要求1999年3月1日提交的序号为60/127,032的美国临时专利申请的权益。

发明背景

肌醇六磷酸酶是催化从肌醇六磷酸分步除去无机正磷酸的肌醇六磷酸磷酸水解酶(1)。有两种类型的肌醇六磷酸酶。一类被称为3-肌醇六磷酸酶(EC.3.1.3.8)，该类酶启动在所述肌醇环的位置1和位置3除去磷酸基团。另一类被称为6-肌醇六磷酸酶(EC.3.1.3.26)，该类酶首先在该环的6号位释放出磷酸根。虽然尚未从动物组织中鉴定出肌醇六磷酸酶，但是，植物通常含有6-肌醇六磷酸酶，且各种各样的微生物包括细菌、丝状真菌和酵母产生3-肌醇六磷酸酶(2-9)。因为在由植物而来的食物或饲料中，超过70％的总磷呈单胃动物和人仅利用差的肌醇六磷酸酯的状态；所以在改善这些种类的矿质营养方面，肌醇六磷酸酶具有极大的用途(10-16)。在猪和家禽的食物中补充的微生物肌醇六磷酸酶有效地提高肌醇六磷酸酯之磷的生物利用度，并减少对无机磷补充的需要(11-15)，从而在集约家禽生产区中产生较少的磷污染(8-15)。但是，因为在胃和小肠中，大概由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白酶解而降解相当大量的肌醇六磷酸酶(13)，因而在动物食物中补充比较高水平的肌醇六磷酸酶是必需的(10-16)。同时，还没研究各种各样的肌醇六磷酸酶的蛋白酶解之分布型(profile)。显然，为了改善肌醇六磷酸酶的营养价值，更好地了解肌醇六磷酸酶对胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的敏感性可能是有益的。已在黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的原始宿主中超量表达了黑曲霉肌醇六磷酸酶的基因(phyA)(17)，并且已将重组的肌醇六磷酸酶(r-PhyA，EC.3.1.3.8)作为一种商品化的肌醇六磷酸酶用于动物食物中(13，14)。这种酶是一种大约80kDa的糖蛋白。同样，已表征了大肠杆菌(E.coli)pH 2.5酸性磷酸酶基因(appA)(18，19)。动物实验已证实：在动物食物中释放肌醇六磷酸之磷方面，重组的肌醇六磷酸酶(r-AppA，EC：3.1.3.2)和r-PhyA是一样有效的(14)。

但是，补充有限的市售肌醇六磷酸酶的花费以及该酶活性对饲料制粒之热的不稳定性妨碍该酶在畜牧业方面的实际应用。因此，需要供动物饲料之用的、具有高水平肌醇六磷酸酶活性和高水平稳定性的酶。

发明概述

本发明提供一种具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段。通过用一种蛋白酶处理该磷酸酶，产生一种具有增加的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段。

本发明还提供一种编码具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段的重组基因。所述载体包括一个启动子、一个编码该磷酸酶片段的编码区和一个终止子。

在另一个实施方案中，本发明提供一种通过用一种蛋白酶处理该磷酸酶而增加磷酸酶的肌醇六磷酸酶活性的方法。

本发明也提供一种具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶，该酶具有SEQ.ID No.1中显示的氨基酸序列。

附图简述

图1显示了蛋白酶消化后的肌醇六磷酸酶活性的变化。图1A显示了以不同的胰蛋白酶/蛋白比率(w/w)(r＝0.001、0.005、0.01、以及0.025)保温的r-PhyA和r-AppA之肌醇六磷酸酶活性的变化。符号：r-PhyA(■)和r-AppA(●)。所述结果为来自5个独立实验的平均值±SEM。*表示对未处理的r-PhyA或r-AppA对照的统计学显著性(P＜0.01)。图1B显示了以不同的胃蛋白酶/蛋白比率(w/w)(r＝0.001、0.005和0.01)保温的r-PhyA和r-AppA之肌醇六磷酸酶活性的变化。符号：r-PhyA(□)和r-AppA(○)。所述结果为来自7个独立实验的平均值±SEM。^*表示对未处理的r-PhyA或r-AppA对照的统计学显著性(P＜0.01)。

图2显示：在胰蛋白酶或胃蛋白酶的一段时间的水解过程(0、1、5、30、以及120分钟)后，剩余的r-PhyA和r-AppA的肌醇六磷酸酶活性。符号：胰蛋白酶消化的r-PhyA(■)或r-AppA(●)；胃蛋白酶消化的r-PhyA(□)和r-AppA(○)。所用的胰蛋白酶/肌醇六磷酸酶的比率(w/w)是：r＝0.01(w/w)。所用的胃蛋白酶/肌醇六磷酸酶的比率是：r＝0.005。所述结果为来自6个独立实验的平均值±SEM。^*表示对未处理的r-PhyA或r-AppA对照的统计学显著性(P＜0.01)。

图3显示了用不同量的胰蛋白酶(r＝0.001、0.005、0.01、以及0.025(w/w))的r-AppA(12％、A组)或r-PhyA(20％、B组)的消化产物之SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。用考马斯蓝将蛋白染色。T：胰蛋白酶对照，C：纯化的r-AppA(A组)或r-PhyA(B组)。标准蛋白参照物(M)为一组10kDa的梯(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、以及200kDa)(Gibco)。所述结果为来自4个独立实验的代表。

图4显示了来自用不同量的胃蛋白酶(r＝0.001、0.002、0.005、以及0.01(w/w))的r-AppA(图4A)或r-PhyA(图4B)的消化产物之SDS-聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳的结果。用考马斯蓝将蛋白染色。T：胰蛋白酶对照，C：纯化的r-AppA(图4A)或r-PhyA(图4B)。标准蛋白参照物(M)为一组10kDa的梯(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、以及200kDa)(Gibco)。所述结果为来自6个独立实验的代表。

图5显示了由于r-PhyA和r-AppA与不同浓度的胰蛋白酶(r＝0.001、0.005、0.01、以及0.025，w/w)(图5A)或胃蛋白酶(r＝0.001、0.002、0.005、以及0.01)(图5B)温育而由大豆饼粕中释放出的无机磷(iP)的量。符号：r-AppA(■)，r-PhyA(□)。所述结果为来自3个独立实验的平均值SEM。^*表示对未处理的r-AppA或r-PhyA对照的统计学显著性(P＜0.01)。

图6显示了appA2基因的核苷酸序列以及它的推断的氨基酸序列。用小写字母表示非翻译区。加下划线的序列是用来扩增appA2(Pf1：1-22、以及K2：1468-1490)、appA2(E2：243-22、以及K2：1468-1490)的引物。框注潜在的N-糖基化位点。已将appA2的序列传送到Genebank数据库中，登记号为250016。

图7是细胞外肌醇六磷酸酶活性(□)与酸性磷酸酶活性(○)、以及诱导后在用appA2转化的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的CIPPA2mRNA表达(◆)的时程。将结果以来自三个实验的平均值±SEM表示。

图8显示了诱导后在用appA2转化的巴斯德毕赤酵母中的appA2mRNA表达的RNA印迹分析(图8A)。用[α-³²P]标记的appA2作为探针来实现杂交。每条泳道上加载20μg的总RNA。B组代表在紫外光下由该酵母rRNA显现的相同的RNA加载量。

图9显示了在37℃时，用肌醇六磷酸钠作为底物的、纯化的r-appA2(●)、r-appA(▲)和r-phyA(□)之酶促活性的pH依赖性。缓冲液：pH 1.5-4.5，0.2M甘氨酸-HCl；pH 5.5-7.5，0.2M柠檬酸盐；pH 8.5-11，0.2M Tris-HCl。将结果以来自三个实验的平均值SEM表示。

图10显示：在不同温度保温了20分钟后，r-appA2的剩余的酸性磷酸酶活性的非变性凝胶(15％)电泳分析。热处理后，在把样品加载到该凝胶上(200μg蛋白/泳道)之前，将所述样品放在冰上达5分钟。

图11显示了在大豆饼粕中用不同量(100、300、600和900PU)的纯化的r-appA2酶(●)、r-appA酶(▲)和r-phyA酶(□)的肌醇六磷酸之磷的水解。^*表示在r-appA2和其它两种酶之间的显著性差异(P＜0.05)。将结果表示为来自三个实验的平均值±SEM。

发明详述

本发明提供具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶。

本发明的一个实施方案提供一种具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段。用一种蛋白酶处理该磷酸酶，并挑选具有磷酸酶活性的片段。正如在下面进一步详细论述的，与全长的肽相比，这些片段具有改良的肌醇六磷酸酶活性。

在一个优选的实施方案中，所述蛋白酶为胃蛋白酶。

除了通过全长肽的蛋白酶解而产生该活性片段之外，本发明也提供一种重组基因，所述基因具有一个启动子、一段编码按照权利要求1的磷酸酶片段的编码区和一个终止子。可以用该重组基因来直接表达截短的产物。

可以将改良的磷酸酶用于动物饲料，以改善所述动物对磷酸酯的利用性。

除了磷酸酶之外，本发明提供一种通过用一种蛋白酶处理该磷酸酶而增加磷酸酶的肌醇六磷酸酶活性的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供一种具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶，该酶具有显示于图6中的SEQ.ID No.1中所示的氨基酸序列。

最好是，由细胞将所述具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽分泌到生长培养基中。这为较高的表达水平和更容易的产物分离创造条件。使具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽同一种能够引导该蛋白离开该细胞的信号序列偶联。优选的是，由该蛋白切取该信号序列。

在一个优选的实施方案中，将编码一种具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽的异源基因与一种转录增强子元件符合读框地剪接。

一种优选的磷酸酶由大肠杆菌的appA基因编码。最初被定义为大肠杆菌胞质磷酸酐磷酸水解酶(appA)基因的该基因含有1,298个核苷酸(Genebank的登记号为：M58708)。首先发现该基因在大肠杆菌中编码一种最适pH为2.5的酸性磷酸酶蛋白(EcAP)。该酸性磷酸酶是一种分子量为44,644道尔顿的单体。成熟的EcAP含有410个氨基酸(18)。Ostanin等用一种pT7载体在大肠杆菌BL21中超量表达了appA，并使其酸性磷酸酶活性增加了大约400倍(440mU/mg蛋白)(20)。先前不知道该appA基因的产物具有肌醇六磷酸酶的活性。

可以在任何原核表达系统或真核表达系统中表达所述的磷酸酶。可以利用各种各样的宿主-载体系统来表达编码所述蛋白的序列。优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或一种寡核苷酸。首要的是，所述载体系统必须与所用的宿主细胞是相容的。宿主-载体系统包括但不限于下面那些系统：用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌，诸如包含酵母载体的酵母之类的微生物，用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等等)感染的哺乳动物细胞系统，用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，以及由细菌感染的植物。这些载体的表达元件在其强度和特异性方面不同。根据所利用的宿主-载体系统，可以用许多合适的转录元件和翻译元件中任何一种。

用于表达磷酸酶的优选宿主包括真菌细胞，包括酵母菌种或丝状真菌菌种的真菌细胞，且可依据本发明将所述真菌细胞用作宿主细胞。优选的酵母宿主细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的不同菌株。也可使用如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的其它酵母。在一个优选的实施方案中，用来超量表达该蛋白的酵母菌株是酿酒酵母。丝状真菌宿主细胞包括曲霉属和链孢霉属(Neurospora)。

在本发明另一个实施方案中，所述酵母菌株是一种甲基营养酵母菌株。甲基营养酵母是能够利用甲醇作为碳源来产生维持细胞功能所必需的能源且包含一种用于表达醇氧化酶的基因的那些酵母属。典型的甲基营养酵母包括毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母菌属(Torulopsis)、假丝酵母属(Candida)和Karwinskia的成员。这些酵母属能用甲醇作为唯一的碳源。在一个优选的实施方案中，该甲基营养酵母菌株为巴斯德毕赤酵母。

本发明的一个优选实施方案是具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽，其中在57-65℃的温度范围内具有最适活性。一种更优选的具体实施方案是具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽，其中其最适活性的温度范围是从58-62℃。

而另一种优选的具体实施方案是具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽，其中在80℃加热蛋白达15分钟后该蛋白至少保留其活性的40％。更优选的具有肌醇六磷酸酶活性的、其中在60℃加热蛋白达15分钟后该蛋白至少保留其活性的60％的蛋白或多肽。

用几种方法可获得纯化的蛋白。最好是用常规技术以纯化的形式(优选至少约80％纯度、更优选90％纯度)产生出本发明的蛋白或多肽。通常，将本发明的蛋白或多肽分泌到重组宿主细胞的生长培养基中。用另一种方法，产生本发明的蛋白或多肽，但不将其分泌到生长培养基中。在这样的实例中，为了分离该蛋白，则增殖包含一种重组质粒的宿主细胞；通过超声处理、热处理、或化学处理，裂解宿主细胞；以及将匀浆离心以除去细胞碎片。然后，使该上清液经受顺序的硫酸铵沉淀。在一根适当大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中使包含本发明多肽或蛋白的级分经受凝胶过滤，从而分离该蛋白。必要时，可以用HPLC进一步纯化该蛋白级分。

本发明也提供一种含有异源基因的酵母菌株，该异源基因编码具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽。应该把该异源基因功能性地连接到一个能够在酵母中表达肌醇六磷酸酶的启动子上，且后接一个转录终止子。

而本发明的另一方面是用于在宿主中表达肌醇六磷酸酶的载体。该载体携带一种编码具有肌醇六磷酸酶活性之蛋白或多肽的磷酸酶基因。

对于克隆到酵母中，可以将该基因克隆到自主复制或整合到酵母基因组中的任一载体上。例如YEp质粒的自主复制型质粒的拷贝数可以是高的，但其有丝分裂的稳定性可能不够(48)。它们可含有负责自主复制的2μ质粒序列和个负责在大肠杆菌中复制的大肠杆菌序列。该载体最好包含一种用于酵母转化子选择的遗传标记和一种在大肠杆菌中用于选择的抗性基因。包含ARS序列和CEN序列的附加型载体以每个细胞单个拷贝的形式而存在，且它们比所述YEp载体更稳定。当以一个或多个拷贝的形式将一种DNA片段整合到酵母基因组中时，使用整合型载体。在这种情况下，该重组DNA是稳定的，且不需要选择(49-51)。某些载体具有复制起点，该复制起点在选定的宿主细胞中起作用。合适的复制起点包括2μ、ARS1和25μM。所述载体具有用于插入融合基因和启动子序列的限制性内切酶位点和选择标记。可以通过去掉或添加限制性位点、或者除去其它不想要的核苷酸，来修饰该载体。

可以将该肌醇六磷酸酶基因置于任何启动子的控制之下(52)。人们可选择一种组成型酵母启动子或调节型酵母启动子。用于酵母载体的合适启动子序列尤其还包括：金属硫蛋白的启动子、3-磷酸甘油酸激酶的启动子(53)或其它糖酵解酶的启动子(54)，所述其它糖酵解酶例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。在Hitzeman的EP A-73,657中进一步描述了供酵母表达之用的其它合适载体和启动子，该文献通过引用结合到本文中。另一个可供选择的启动子是葡萄糖阻抑型ADH2启动子(56，57)，所述文献通过引用结合到本文中。

人们可以选择一种组成型酵母启动子或调节型酵母启动子。例如磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的其它编码糖酵解酶的基因、以及α-因子基因的强启动子，都是组成型的。当使用一种组成型启动子时，在细胞生长期间则合成该产物。用乙醇和葡萄糖调节ADH2启动子，用半乳糖和葡萄糖调节GAL-1-10和GAL7启动子，用磷酸盐调节PHO5启动子，以及用铜调节金属硫蛋白启动子。用温度调节热激启动子，HSP150启动子属于所述的热激启动子。也可以用杂合启动子。当连续表达所需产物对宿主细胞有害时，使用一种调节型的启动子。可以用一种强的原核启动子例如T7启动子来代替酵母启动子，但在这种情况下，则必须用一种编码相应的聚合酶的基因来转化该酵母菌株。至于转录终止，使用HSP150终止子或任何其它有功能的终止子。这里，把启动子和终止子称为控制元件。本发明不限于任何特定的载体、启动子或终止子。

所述载体也可以携带一种选择性标记。选择性标记通常是抗生素抗性基因或能够互补具有充分表征的代谢缺陷的酵母菌株的基因，例如色氨酸缺陷突变型或组氨酸缺陷突变型。优选的选择性标记包括URA3、LEU2、HIS3、TRP1、HIS4、ARG4或抗生素抗性基因。

所述载体也可以有能够在细菌细胞中复制的复制起点。在细菌菌株中操作载体更有效。优选的细菌复制起点为ColE1、Ori或oriT。

可以使用或来自酵母或来自肌醇六磷酸酶基因或其它来源的一种前导序列，来帮助所表达的肌醇六磷酸酶分泌到培养基中去。本发明不限于任何特定类型的前导序列或信号肽。

合适的前导序列包括酵母α-因子的前导序列，可以用该α-因子的前导序列来引导所述肌醇六磷酸酶的分泌。通常将该α-因子前导序列插入到启动子序列和结构基因序列之间(58；美国专利号4,546,082；以及欧洲公布的专利申请号324,274；所述文献通过引用结合到本文中)。另一种合适的前导序列是作为165个氨基酸的前原(prepro)形式合成的酿酒酵母的MFα1(α-因子)，所述前原形式包括19个氨基酸的信号肽或前肽(prepeptide)、后接64个氨基酸的“前导肽”或原肽(propeptide)，且包含三个N-连接的糖基化位点、后接(LysArg(Asp/Glu，Ala)2-3α-因子)4(58)。已广泛地用前原MFα1(preproMF α1)的信号肽-前导肽部分来达到酿酒酵母中异源蛋白的合成与分泌。从第4,546,082号美国专利、第116,201号欧洲专利申请、第123,294号欧洲专利申请、第123,544号欧洲专利申请、第163,529号欧洲专利申请、第123,289号欧洲专利申请以及第3614/83号DK专利申请了解与酵母同源的信号肽/前导肽的应用，通过引用将上述专利和专利申请结合到本文中。在第123,289号欧洲专利申请中，描述了利用酿酒酵母α-因子前体，而WO 84/01153指出了酿酒酵母转化酶信号肽的利用，且德国专利申请DK 3614/83指出了为了分泌外源蛋白而利用酿酒酵母的PH05信号肽；上述三个文献通过引用结合到本文中。

在酵母中表达的异源蛋白的分泌过程方面，也可以利用来自酿酒酵母(MFα1或MFα2)的α-因子信号肽-前导肽(第4,546,082号美国专利、第16,201号欧洲专利申请、第123,294号欧洲专利申请、第123,544号欧洲专利申请和第163,529号欧洲专利申请，所述文献通过引用结合到本文中)。通过在所需蛋白之基因的5’末端融合编码酿酒酵母MFα1之信号序列/前导序列的DNA序列，证明了所需蛋白的分泌与加工。在公布的WO89/02463号和WO 90/10075号PCT申请中，描述了运用了鼠唾液淀粉酶信号肽(或其突变体)来达到在酵母中表达的异源蛋白的分泌，通过引用将WO 89/02463号和WO 90/10075号PCT申请结合到本文中。

第5,726,038号美国专利描述了酵母天冬氨酸蛋白酶3的信号肽的应用，该信号肽的运用能够提供改善的、在酵母中表达之蛋白的分泌。对于本领域技术熟练人员，适宜于促进重组多肽从酵母中分泌的其它前导序列是已知的。可以在靠近前导序列3’端处修饰前导序列，以使该前导序列包含一个或更多个限制性位点。这将便于该前导序列与结构基因的融合。

对于本领域技术熟练人员，酵母转化的方案是已知的。在Hinnen等的文章(59)中描述了一个这样的方案。所述Hinnen等的方案在一种选择性培养基中选择Trp转化子，其中，该选择性培养基包括0.67％的酵母氮碱、0.5％的水解酪蛋白氨基酸、2％的葡萄糖、10μg/ml的腺嘌呤以及20μg/ml的尿嘧啶。

在稳定表达的载体上、在人工染色体上、或通过整合到酵母宿主细胞的染色体上，可以保持所述的基因。通过把所述肌醇六磷酸酶基因克隆到将重组到酵母染色体上的载体中，可以完成进入到染色体中的整合。适宜的载体可包括与酵母染色体中的核苷酸序列同源的核苷酸序列。用另一种方法，可以使该肌醇六磷酸酶基因位于能够转移该基因到染色体中的重组位点之间，所述重组位点例如转座因子。

本发明也提供一种生产肌醇六磷酸酶的方法；即通过提供一种分离的磷酸酶基因，该磷酸酶基因编码一种具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽，并在宿主细胞中表达该基因。该磷酸酶最好是一种微生物的磷酸酶。在一个更优选的实施方案中，所述微生物的磷酸酶是一种大肠杆菌磷酸酶。同样优选的是微生物的磷酸酶AppA和AppA 2。

也提供一种将肌醇六磷酸转变成肌醇和无机磷的方法。用本领域众所周知的技术，由一种生物分离出一种appA基因。然后，在宿主细胞中由该基因表达一种具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽。使所产生的蛋白或多肽与肌醇六磷酸混合或接触。这种技术对于处理食物或动物饲料中的肌醇六磷酸是特别有用的。

从大肠杆菌中分离出优选的appA基因。

虽然在酵母系统中产生的所述肌醇六磷酸酶与当前商品化的肌醇六磷酸酶一样有效地从玉米和大豆里释放出肌醇六磷酸酯之磷，但所述肌醇六磷酸酶好象是更耐热的。可以用这种酵母中的肌醇六磷酸酶超量表达系统来提供供食品和饲料工业之用的耐热的肌醇六磷酸酶。

实施例

实施例1用于实施例2-6的材料与方法

r-AppA的表达从用表达载体pAPPA1(20)转化的大肠杆菌BL21菌株中获得appA基因(Genebank的登记号为M58708)。按照制造商的说明书(Perkin Elmer)，通过PCR，扩增包含appA编码区的1.35kb的DNA片段。引物衍生自该核苷酸序列(18)的5’和3’区域，且所述引物包括：E2[正向的：242-252]：5’GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA3’(SEQ.ID.NO.2)；以及K2[反向的：1468-1490]：5’GGGGTACCTTACAAACTGCACG3’(SEQ.ID.NO.3)。这两种引物由康乃尔大学寡核苷酸合成实验室(the Cornell University OligonucleotideSynthesis Facility)(Ithaca，NY))合成。从1％的琼脂糖凝胶中切下扩增的产物，并用GENECLEAN II试剂盒(Bio101)将其洗脱。首先把纯化的该片段克隆到pGEM T-easy载体(Promega)中，然后在EcoRI位点，将该片段插入到酵母表达载体pPIcZαA(Invitrogen)中。将大肠杆菌菌株TOP10F’(Invitrogen)用作原始宿主来扩增这两种构成物。按照制造商的说明书(Invitrogen)，通过电穿孔，将包含appA的pPIcZαA载体转化到巴斯德毕赤酵母菌株X33中。将转化了的细胞铺平板到YPD-Zeocin琼脂培养基中；且在具有甘油的基本培养基(BMGY)中将阳性菌落培养24小时。当所述酵母细胞密度达到2.5×10⁸个细胞/ml(OD₆₀₀＝5)时，将细胞离心；并用0.5％的甲醇培养基(BMMY)悬浮所述的细胞，以诱导appA基因的表达。诱导后，从所述转化了的X33细胞中提取酵母基因组的总DNA；且将其用作模板，使用上文描述的同样的引物，通过PCR，来核实所述appA基因的存在。在康乃尔大学DNA服务实验室(the Cornell University DNAServices-Facility)中，运用以Dye Deoxy终止物的Taq循环自动化测序(Applied Biosystems，Forster City，CA)，来测定所扩增的DNA片段的序列。

r-PhyA和r-AppA的纯化从BASF(Mt Olive，NJ)获得r-PhyA。开始时，既将r-PhyA酶、又将r-AppA酶悬浮于pH 7的50mM Tris-HCl中，且添加硫酸铵至25％饱和度。在离心(25,000g，20分钟)该混合物后，保留上清液，并添加硫酸铵至75％饱和度。然后，离心(25,000g，20分钟)该混合物，并将沉淀悬浮到10ml pH 7的25mM Tris-HCl中。使该悬浮液对同一缓冲液透析过夜，并将其加到一根用pH 7的25mM Tris-HCl平衡的DEAE-琼脂糖柱(Sigma)上。在用200ml(n-LL)pH 7的25mM Tris-HCl洗涤该柱后，用pH 7的0.2M NaCl、25mM Tris-HCl来稀释蛋白。分析所收集的所有级分的肌醇六磷酸酶活性及蛋白浓度(21)。在4℃下进行全部的纯化过程，且在分析之前，将所述级分贮藏在-20℃。

蛋白酶解和蛋白电泳按照制造商的说明书(Sigma)，将纯化的r-AppA和r-PhyA(2mg/ml)与不同量的胃蛋白酶和胰蛋白酶保温。分别地，将胃蛋白酶(800单位/mg蛋白)溶解到pH 2的10mM HCl(0.1mg/ml)中，且将胰蛋白酶(1,500BAEE单位/mg蛋白)溶解到pH 7.5的80mM碳酸氢铵(0.1mg/ml)中。一个BAEE单位被定义为：用BAEE作为底物，在pH7.6和25℃时，每分钟在253nm的0.001的吸光度变化。按100μl的终体积，在37℃将10μg纯化的r-PhyA(0.1PU)或r-AppA(0.08PU)与胰蛋白酶或胃蛋白酶以范围为0.001-0.01的蛋白酶/肌醇六磷酸酶(w/w)的比率保温1小时至120分钟。在冰上停止该反应，且为了蛋白电泳和肌醇六磷酸酶活性分析而将该混合物的pH调节到8。用先前描述的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳或尿素-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析消化的蛋白混合物(22，23)。

肌醇六磷酸酶活性以及来自大豆饼粕的肌醇六磷酸之磷的水解如同先前描述的(24)，在蛋白酶解之前或在蛋白酶解的不同时间点，既测定r-PhyA的肌醇六磷酸酶活性，又测定r-AppA的肌醇六磷酸酶活性。用Chen等的方法(25)来分析所释放的无机磷(iP)。一个肌醇六磷酸酶单位(PU)被定义为：在37℃时，每分钟从肌醇六磷酸钠释放出1μmol无机磷的酶活性。为了证实胰蛋白酶与胃蛋白酶对r-PhyA和r-AppA剩余活性的蛋白酶解效应，监测了用与不同量之胰蛋白酶或胃蛋白酶保温的这两种酶从大豆饼粕中的肌醇六磷酸酯之磷的水解。在一个5ml的总反应中，在37℃时(at 3VC)，将0.5mg纯化的r-PhyA(5PU)或r-AppA(4PU)与1克大豆饼粕和在pH 2.5的10mM HCl中的胃蛋白酶或在pH 6.8的0.2M柠檬酸盐中的胰蛋白酶保温2小时。如同上面描述地测定所释放的无机磷(iP)。

实施例2 r-AppA和r-PhyA的制备

在用所述appA基因转化的X33中，超过30个的菌落表达水解肌醇六磷酸钠的胞外肌醇六磷酸酶活性。菌落26具有最高的该酶活性(88U/ml)，且选择其用于进一步的研究。在从所述的DEAE-琼脂糖柱上洗脱出r-PhyA和r-AppA样品后，收集了每份4ml的45份级分以分析肌醇六磷酸酶活性。用于蛋白酶解的级分的r-PhyA和r-AppA的肌醇六磷酸酶比活分别为9.6U/mg蛋白和8.1U/mg蛋白。

实施例3胰蛋白酶消化对两种酶的肌醇六磷酸酶活性的影响

在胰蛋白酶消化2小时之后，r-PhyA和r-AppA之间的剩余肌醇六磷酸酶活性有显著性差异(图1A)。虽然在胰蛋白酶/肌醇六磷酸酶的比率为0.001及0.005时，两种酶保留了其最初活性的85％以上；但在所述比率为0.01和0.025时，r-AppA相应地分别失去其最初活性的64％和74％。同时，r-PhyA仅相应地分别失去了其最初活性的14％和23％。因为这两种酶对胰蛋白酶消化的敏感性在所述比率为0.01时有明显差异，而以这种比率进行时程研究。胰蛋白酶消化一直到2小时，r-PhyA仍保留着其最初活性的90％(图2)。比较起来，在消化1分钟、5分钟、30分钟和120分钟后，r-AppA相应地分别失去了其最初活性的64％、77％、87％和95％。

实施例4胃蛋白酶消化对两种酶的肌醇六磷酸酶活性的影响

在胃蛋白酶消化2小时之后，剩余的r-AppA的肌醇六磷酸酶活性是完全意想不到的。在所述比率为0.001和0.002时，该肌醇六磷酸酶活性或者保持不变，或者微微增加。在所述比率为0.005及0.01时，与最初的活性值相比，则使该肌醇六磷酸酶活性增加了30％。然而，在这两种高比率时，r-PhyA失去了其最初活性的58％及77％(图1B)。因为在所述比率为0.005时r-PhyA和r-AppA之间在反应方面有显著性差异，而将这种比率用于一种跟踪时程研究。当将所述r-AppA与胃蛋白酶保温0分钟至30分钟时，肌醇六磷酸酶活性随着时间而逐步增加。此后，没观察到进一步的增加(图2)。但是，在保温1分钟、5分钟、30分钟和120分钟后，r-PhyA相应地分别失去了其最初活性的42％、73％、82％和92％。

实施例5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

当将r-AppA与胰蛋白酶保温时，在所述比率高于0.01时，则该酶蛋白被降解；而在所述比率为0.025时，则看不见该酶蛋白。有一条大约28kDa的主带，在所述三种低比率的胰蛋白酶中在这条带和完整蛋白之间，有几条其它的带。然而，在所述胰蛋白酶的比率为最高时，则那条主带明显减弱，且其它带消失(图3A)。如果将所述r-AppA与不同量的胰蛋白酶保温，则有许多的中间带；且在所述胰蛋白酶比率为最高时，至少有三条看得见的带(图3B)。如果以高于0.002的所述比率将r-AppA与胃蛋白酶保温，则显示出一条大约8.4kDa的独特带(图4A)。另一方面，用不同量之胃蛋白酶的r-PhyA的蛋白酶解，除了产生一种大约14kDa的主要片段外，还产生许多扩散的且轮廓不清的带(图4B)。

实施例6蛋白酶解对用r-PhyA和r-AppA水解出肌醇六磷酸酯之磷的影响

当在37℃将r-AppA与大豆饼粕和不同量的胰蛋白酶保温2小时时，则在所述比率为0.001、0.005、0.01和0.025时，从大豆饼粕中释放出的无机磷的减少相应地分别为3％、13％、34％和52％(图5A)。同时，在同样的条件下，对于r-PhyA，则所述的减少分别为3％、6％、13％和28％。与对照相比，添加胃蛋白酶到r-AppA(比率为0.005)和大豆饼粕的混合物中，导致从大豆饼粕中释放出的无机磷增加大约30％(图5B)。比较起来，在由r-PhyA释放无机磷方面，同样的处理产生大于50％的减少。

迄今为止，关于微生物的肌醇六磷酸酶对胰蛋白酶和胃蛋白酶的敏感性，还没有具体的数据。在这个研究中，把两种部分纯化的重组肌醇六磷酸酶暴露于单一的蛋白酶消化，且测定了蛋白酶解对其剩余活性的影响以及对其从大豆饼粕中释放出肌醇六磷酸酯之磷的能力的影响。这些结果已表明：r-PhyA比r-AppA更抗胰蛋白酶而对胃蛋白酶的抗性较弱。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，这两种肌醇六磷酸酶的蛋白酶解方式也是显然不同的。推测起来，r-PhyA和r-AppA之间对蛋白酶的不同敏感性，可能与其一级氨基酸序列特征以及肽折叠的特性有关；因为两种酶之间的氨基酸序列同源性(～15％)联系着这(17，18)。然而，在考虑肌醇六磷酸酶之蛋白酶解的分子机制时，则应该给予注意；这超出了本研究原先的范围。近来在phyA肌醇六磷酸酶(26)和一种大肠杆菌肌醇六磷酸酶(27)的结晶和(或)初步的X-射线分析方面的进展能够帮助我们了解其蛋白酶解反应的结构基础。

意想不到的是，在胃蛋白酶消化后，r-AppA显示出剩余的肌醇六磷酸酶活性增长30％。同样，在存在胃蛋白酶的情况下，这种酶也从大豆饼粕中释放出30％额外的无机磷。根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，r-AppA显然依照着不同的保温期而被胃蛋白酶降解成小肽。可能的是，可能有潜在的抗胃蛋白酶的、与完整r-AppA蛋白相比具有较高的肌醇六磷酸酶活性的多肽。虽然SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析没有为我们提供任何有关这样的肽的具体信息，但是，已表明了胃蛋白酶将天然蛋白或合成蛋白转变成活性多肽，例如将猪的内皮缩血管肽转变成有活性的21个残基的内皮缩血管肽(28)。胃蛋白酶也可以调节某些蛋白的结构与功能(29，30)。正如上面所提到的，关于phyA(26)和大肠杆菌肌醇六磷酸酶(27)的近来的结晶数据的可用性，能促进所述appA基因的定向定点诱变或缺失。因此，有可能揭示出与胃蛋白酶水解有关的r-AppA的肌醇六磷酸酶活性增加的分子机制。尽管抗胃蛋白酶的r-AppA肽的生化不确定性，这个发现仍有重大的营养意义。因为胃蛋白酶是胃中的主要蛋白酶，且是一种充分描述的天冬氨酸蛋白酶(31)，因此，一种抗胃蛋白酶的肌醇六磷酸酶多肽让我们能够以足够的酶活性而补充少量的酶到所述的食物中；因而将减少家畜生产中应用食物肌醇六磷酸酶的花费。

将用于本研究的蛋白酶活性水平与生理条件下的蛋白酶活性水平进行比较是困难的，因为体内的胃蛋白酶和胰蛋白酶的浓度还没被很好地描述过。已报道了猪肠中的平均胰蛋白酶活性为20-25U/毫克蛋白(32)，这比在本文中使用的剂量高得多。无论如何，使用多种水平的胰蛋白酶和胃蛋白酶，在最低水平和最高水平之间有10至25倍范围的差异。另外，在存在胃蛋白酶或胰蛋白酶的情况下，即在一种模拟的体内消化条件下，测定了由r-AppA或r-PhyA从大豆饼粕中释放出的无机磷。虽然r-AppA和r-PhyA都是部分纯化的，但所有的数据都一致地表明这两种重组酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的截然不同的反应方式。因此，这种体外的观察可能是与生理状态有关的。

实施例7用于实施例8-12的材料与方法

产生肌醇六磷酸酶的细菌菌落的分离与鉴定由在康乃尔大学养猪场(Cornell University Swine Farm)中圈饲的杂种Hampshire-Yorkshire-Duroc猪(13周龄)获得结肠内含物。用实用的玉米-大豆饼粕食物来喂养这些猪。在杀死所述猪后，立即通过无菌步骤取出结肠的内含物，并将其保存在无氧、无菌塑料袋中。在一个带橡皮塞的250ml锥形烧瓶中，用190ml的厌氧瘤胃液葡萄糖培养基稀释10克样品。在CO₂环境中将该混合物剧烈地摇动3分钟。相应地进行一系列的连续稀释。

在一种改进的、含有不溶解性肌醇六磷酸钙的瘤胃液-葡萄糖-纤维二糖-琼脂培养基(43，44)中，将稀释的样品于37℃培养3天。将伴随着亮区的菌落作为细胞内和细胞外肌醇六磷酸酶活性的潜在生产者来研究。用肌醇六磷酸钠作为底物来测定肌醇六磷酸酶的活性(24)。一个肌醇六磷酸酶单位(PU)被定义为：在37℃时，每分钟从肌醇六磷酸钠中释放出1μmol无机磷的酶活性。用磷酸对硝基苯酯(P-NPP)作为底物，按照制造商的说明书(Sigma，St.Louis，MO)来测定酸性磷酸酶的活性。在康乃尔兽医学院诊断实验室(the Diagnostic Laboratory of Cornell Veterinary College)(Ithaca，NY)中进行了选定菌落的鉴定。通过标准步骤确定了所分离菌落的形态学特征和生理学特征。

DNA扩增和测序因为产生最高的酸性磷酸酶活性和肌醇六磷酸酶活性的菌落被鉴定为一株大肠杆菌菌株，所以用起源于大肠杆菌pH 2.5酸性磷酸酶基因(appA，Genebank的登记号为145283)(18)之DNA序列的引物来分离所述的基因。在康乃尔大学寡核苷酸合成实验室合成下述的引物，即引物Pf1[正向的：1-22]：5’-TAAGGAGCAGAAACAATGTGGT-3’(SEQ.ID.NO.4)、E2[正向的：254-264]：5’-GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA-3’(SEQ.ID.NO.5)和K2[反向的：1468-1491]：5’-GGGGTACCTTACAAACTGCACG-3’(SEQ.ID.NO.6)。分别地，用[Pf1-K2]引物扩增全序列，用[E2-K2]引物来扩增该编码区。所述PCR反应混合物(100μl)包含：作为模板的500ng基因组DNA、各种引物各100pmol、5U的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT)、pH 8.3的10mM Tris-HCl、50mM KCl、12.5mM MgCl2和各种dNTP(Promega，Madison，WI)各200μM。用GeneAmp PCR系统2400(PerkinElmer)来完成该反应。所述热程序包括：94℃(3分钟)的一个循环、[94℃(0.8分钟)、54℃(1分钟)以及72℃(2分钟)]的30个循环、以及在72℃(10分钟)的一个循环。通过1％的低熔点琼脂糖(Gibco BRL，Grand Island，NY)凝胶电泳，来分离所扩增的PCR产物。切割下包含预期大小之带的凝胶薄片，并用GENECLEAN II试剂盒(Bio101，Vista，CA)洗脱DNA。在康乃尔大学DNA服务实验室，使用用Dye Deoxy终止物的Taq循环自动化测序(Applied Biosystems，Forster City，CA)，来测定所述PCR产物的序列。进行5次测序实验，并用多重序列对比程序CLUSTAL BLAST(45)，把推断出的氨基酸序列与其它酸性磷酸酶和肌醇六磷酸酶进行序列对比。在下文中，把鉴定出的两种PCR片段[Pf1-K2]和[E2-K2]分别描述为appA2和appA2。为了比较的目的，用引物[E2-K2]来从大肠杆菌BL21(DE3)扩增appA基因。如同上面描述的，实施所述聚合酶链反应并处理所产生的片段。

亚克隆和表达载体的构建按照制造商的说明书，将PCR产物[E2-K2]和[Pf1-K2]克隆到pGEMT-easy载体(Promega)中；然后将其转化到TOP10F中以筛选阳性菌落。如由制造商的说明书所描述的，在EcoRI位点和KpnI位点，将分离的appA2片段和appA片段插入到pPICZαA(Invitrogen，San Diego，CA)中。将这些构成物转化到TOP10F细胞中去，并在含有25μg zeocin/ml的LB培养基上，将所述的TOP 10F细胞铺平板。然后，培养阳性菌落，以制备用于转化的DNA。

酵母的转化和表达按照制造商的说明书，用YPD培养基培养巴斯德毕赤酵母菌株X33(Invitrogen)，并制备用于转化的所述菌株X33。运用BglII，使2μg质粒DNA线性化；然后，通过电穿孔将其转化到毕赤酵母中。在30℃于1M山梨糖醇中不摇动地温育3小时后，在YPD-zeocin琼脂培养基中将这些细胞铺平板，以筛选转化的基因进入到宿主染色体DNA的5’AOX1区域中的整合。2天后，用具有甘油的基本培养基(GMGY培养基)培育转化子达24小时。在所述培养物达到约2.5×10⁸个细胞/ml(OD₆₀₀＝5)的密度后，将细胞离心下来(3500g，5分钟)；然后，用0.5％的甲醇培养基(GMMY)悬浮所述的细胞，以诱导该肌醇六磷酸酶基因的表达。

RNA的定量在诱导后，于不同的时间从所述appA2转化子中提取总RNA。在1％的甲醛-琼脂糖凝胶中分离所述RNA，并通过毛细作用的印迹法，将其转移到Hybond N+膜(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上，且用UV将其交联2分钟。然后，在42℃将该膜预杂交4小时。探针为appA2[E2-K2]PCR片段，且使用Ready-to-go TM DNA标记珠(Ready-To-Go TM DNA Labeling Beads)(Amersham PharmaciaBiotech)，用[α-³²P]-dCTP(DuPont，Boston，MA)将其标记。在42℃将该膜与所述探针杂交过夜，并用2X SSC(0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)、1％的十二烷基硫酸钠(SDS)于25℃洗涤该膜3次达20分钟以及在50℃洗涤该膜2次，且最后用0.2X SSC、0.1％的SDS于50℃洗涤该膜2次。通过将该膜对一个附有BAS-III FUJI成像底片(Fuji，Japan)的增感屏曝光达10小时，来产生放射自显影图；用一台生物图象分析仪(Bio-ImagingAnalyzer)(Kohshin Graphic Systems，Fuji，Japan)将该放射自显影图定量。根据18S rRNA的相对水平来使结果标准化。

所表达酶的纯化在4℃下进行所有的操作。用pH 7的、具有25％硫酸铵饱和度的50mM Tris-HCl悬浮所表达的r-appA酶和r-appA2酶、以及在黑曲霉中表达的r-phyA肌醇六磷酸酶(由BASF友好地提供，Mt.Olive，NJ)。然后，以25,000g离心该悬浮液20分钟。在12小时的搅动期间，按照75％的硫酸铵饱和度，来调制所述上清液；并以25,000g离心该混合物20分钟。然后，将沉淀悬浮到10ml pH 7的25mM Tris-HCl中；并使该悬浮液对同一缓冲液透析过夜。将透析过的样品加到一根用pH 7的25mM Tris-HCl平衡的DEAE-琼脂糖柱(Sigma)上。在用200ml同样的缓冲液洗涤该柱后，用pH 7的、溶于25mM Tris-HCl中的1M NaCl来洗脱结合的肌醇六磷酸酶。把显示出最高肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性的三个级分汇集起来，并将其对pH 7.5的25mM Tris-HCl透析过夜，以用于下面的研究。

电泳分析用Lowry的方法(21)测定蛋白浓度。按照Laemmli所描述的方法(22)，进行非变性凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％)。用考马斯亮蓝R-250将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的蛋白染色。如先前所描述的(17)，检测非变性凝胶带中的酸性磷酸酶活性或肌醇六磷酸酶活性。电泳后，在0.2％α-19磷酸萘酯(naphtylphosphate)(或肌醇六磷酸钠)、0.1％Fast Garnet GBC盐、1mM CaCl₂和pH 7.0的0.5M Tris-HCl缓冲液中，把该凝胶在25℃保温达20分钟。

所述酶的去糖基化按照制造商的说明书(New England Biolabs，Beverly，MA)，在7℃用0.3IU的内切糖苷酶Hf(Endo Hf)进行r-appA2的去糖基化达4小时。如上面描述的，用15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析去糖基化的蛋白。

酶的性质及大豆饼粕中肌醇六磷酸酯之磷的水解在33℃，用三种不同的缓冲液于不同的pH测定了肌醇六磷酸酶的活性。在各种酶的最适pH下测定其最适温度。在37℃和各种酶的最适pH下，测定r-appA2和r-appA的K_m值和V_mas值。将r-appA2的肌醇六磷酸酯之磷的水解与r-appA及r-phyA的肌醇六磷酸酯之磷的水解相比较。在所述酶各自最适的pH(对r-appA为2.5、对r-appA2为3.5和对r-phyA为5.5)下，在5ml缓冲液(10mM HCl或0.2M的柠檬酸盐)中将不同量的纯化的酶与1克大豆饼粕于37℃保温2小时。如先前所描述的(25)，测定所释放的无机磷。比较这三种酶的热稳定性。用pH 5.5的0.2M柠檬酸钠以1∶200稀释所述酶中的每一种(2mg/ml)，且将其在25℃、37℃、55℃、65℃、80℃和100℃保温20分钟。把所述样品放置在冰上达30分钟，并在37℃测定剩余的肌醇六磷酸酶的活性。

所用的统计学检验将Mann-Withney U-检验用于所有的统计学评价(46)。

实施例8细菌菌落的筛选和鉴定

总共分离了93个菌落。超过70个的菌落具有低于500U/克蛋白的胞内肌醇六磷酸酶活性；而6个菌落具有高于1,000U/克蛋白的活性。菌落88显示了最高的肌醇六磷酸酶活性(2,927U/克蛋白)，且具有酸性磷酸酶活性(1,391U/克蛋白)。因此，挑选菌落88用于进一步的实验。用该菌落在Sweet E中产生的肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性比在LB肉汤中产生的这两种酶的活性相应地大，且在无氧条件下产生的这两种酶的活性比在有氧条件下产生的这两种酶的活性相应地大。随后，将该菌落鉴定为一种革兰氏阴性的大肠杆菌。尤其是，根据底物发酵分布型(profile)，进一步证实了这点。

实施例9猪大肠杆菌appA2基因的克隆和测序

由菌落88的基因组DNA扩增了一种1482bp(完整序列)的片段和一种1241bp(编码区)的片段(图6)。除了大肠杆菌appA2基因和芽孢芽孢杆菌属(Bacillus)肌醇六磷酸酶基因外，用BLAST程序在GenPro数据库(版本61)、GeneBank或EMBL数据库中没发现显著的序列同源性。所述的完整核苷酸序列与种名未定的芽孢杆菌DS11的肌醇六磷酸酶基因(GeneBank的登记号为3150039)有着47％的同源性，且与大肠杆菌的appA有着95％的同源性。尽管有这样高的核苷酸序列同源性，但在appA和appA2之间以及在其编码的多肽之间，仍有着明显差异。首先，在所推断的肽序列中，七个氨基酸是不同的：一个在信号肽中，即L4F；六个在编码区中，即S102P、P195S、S197L、K202N、K298M和T299A。其次，位于该前导序列和编码区之间的73bp的非翻译区比appA的非翻译区短6bp。然而，三个推定的N-糖基化位点仍定位于该编码区的同样的位置。将该DNA片段序列分析了5次，以证实这些差异。与phyA比较，appA2仅有19％的氨基酸序列同源性。已将该序列传送到GeneBank数据库，其登记号为250016。

实施例10 appA2在巴斯德毕赤酵母中的表达

以不同的时间间隔分析了总共42个转化子的肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性。在甲醇诱导三天后，13个转化子产生的肌醇六磷酸酶活性为18-114U/毫升培养基；且产生7-42U/ml的酸性磷酸酶活性。同时，22个appA转化子表达了25-130U/ml的肌醇六磷酸酶活性和59-85U/ml的酸性磷酸酶活性。将显示出最高活性的appA2转化子用于表达时程研究(图7)及其它研究。该appA2 mRNA水平在4小时时达到最高点(图7和图8)，且保持高水平到12小时为止，此后显著下降。在对照细胞中没有检测到appA2 mRNA信号。在0至24小时之间，由所述转化子产生的胞外肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性都明显地增加。此后，所述酸性磷酸酶活性几乎保持不变；而与较早阶段时的肌醇六磷酸酶活性的增加相比，肌醇六磷酸酶活性随着时间延长而增加得少得多。

实施例11所纯化酶的特性

所纯化的r-appA2酶、r-appA酶和r-phyA酶的肌醇六磷酸酶比活相应各为28.9U/毫克蛋白、30.7U/毫克蛋白和19.8U/毫克蛋白。K_m值和V_max值(表1)表明，纯化的r-appA2对肌醇六磷酸钠显示出的亲合性高于对pNNP的亲和性。当将肌醇六磷酸钠用作底物时，pH曲线在所述的三种酶之间有显著性差异。

表1

在巴斯德毕赤酵母中表达的、纯化的r-appA和r-appA2的动力学参数

	r-appA	r-appA2
	r-appA	r-appA2	K_m，mM肌醇六磷酸钠p-NNPV_max，μmol分钟^-1mg^-1肌醇六磷酸钠p-NNP	1.032.2689310	0.661.43117340

对于r-appA2，最适pH在2.5和3.5之间；对于r-appA，最适pH为2.5；而对于r-phyA肌醇六磷酸酶，最适的pH为2.5和5.5(图9)。然而，对于底物pNNP，两种大肠杆菌酶显示了同样的最适pH(2.5)。另外，r-appA和r-appA2都有同样的最适温度(55℃)，该温度比r-phyA的最适温度微微地低些。这两种酶也有非常类似的肌醇六磷酸酶的热稳定性；这种热稳定性在37℃至60℃之间则略高于r-phyA的肌醇六磷酸酶的热稳定性，而在65℃至100℃之间则低于r-phyA的肌醇六磷酸酶的热稳定性。在不同温度处理后而保留的r-appA2的酸性磷酸酶活性在非变性凝胶中显示为一条71kDa唯一条带(图10)。在65℃或80℃时，则该活性大大地损失或完全丧失；但在100℃时，由于某种原因该活性得到部分恢复。当把这三种纯化的重组酶与大豆饼粕保温时，r-appA2蛋白与所述的其它两种酶相比，该r-appA2蛋白从肌醇六磷酸中释放出明显更多的磷(图11)。

实施例12去糖基化对酶性质的影响

用β-巯基乙醇和Endo Hf处理所述的纯化的三种酶后，使大于90％的这些酶对肌醇六磷酸钠和pNNP的活性都丧失了。但是，单独的Endo Hf对这些酶的催化活性没有显著影响。r-appA2的去糖基化产生一条具有46.3kDa的表观Mr的单一带；该单一带不同于三条已分辨的、糖基化形式的带，所述糖基化形式的三条带具有50.5kDa、53kDa以及56kDa的表观Mr。这表示出了r-appA2的糖基化范围在8.3％至17.3％之间。

在上述的实施例中，从所述猪结肠内含物中分离出一株产生肌醇六磷酸酶的大肠杆菌菌株。运用基于Dassa等描述的大肠杆菌pH 2.5酸性磷酸酶基因(appA)(18)的引物，从该菌株的基因组DNA中扩增了一种1489bp的DNA片段。这种被命名为appA2(SEQ ID No.9)的片段编码一种具有三个推定的N-糖基化位点的433个氨基酸的蛋白(SEQ ID No.1)。这种推断的肽既包含N-末端基序(RHGXRXP，位置：38-44)(SEQ.ID No.7)，又包含C-末端基序(HD，位置：325-326)；所述基序为组氨酸酸性磷酸酶的特征(8)。另外，有一个30个氨基酸的前导序列(SEQ ID No.8)和一个73bp的非翻译区。在可用的序列数据库之中，只有大肠杆菌appA pH 2.5酸性磷酸酶基因和种名未定的芽孢杆菌DS11肌醇六磷酸酶基因与appA2享有某些同源性(在核苷酸序列方面相应地分别为95％和47％的同源性)。尽管appA和appA2之间有高度同源性，但在这两种基因之间、以及在其各自的蛋白之间，仍有着明显的差异。首先，在所述两种推断的多肽序列之间，有七个氨基酸不同：一个在信号肽内，且六个在编码区中。其次，在该前导序列和编码区之间的73bp的非翻译区比appA的非翻译区短6bp。通过5次重复的核苷酸序列分析，证实了所有的那些差异。

更为重要的是，当将这两种基因转化到同一宿主巴斯德毕赤酵母中时，所表达的蛋白r-appA和r-appA2表现出不同的生化特性。虽然两种蛋白对pNNP显示出同样的、pH为2.5的最适pH，但对于肌醇六磷酸钠，r-appA2有宽广的2.5-3.5的最适pH，而r-appA的最适pH在2.5。与r-appA相比，r-appA2对两种底物都有较高的亲合性，正如由较低的K_m值和较高的V_max值所表明的；而且在体外，该r-appA2从大豆饼粕里的肌醇六磷酸中释放出更多的磷。因此，对于从肌醇六磷酸或磷酸中水解磷，r-appA2的催化功能似乎是比r-appA的催化功能更好的。显而易见，所述多肽中的六个氨基酸的调换也许不仅仅是所述酶的多态性，而是造成所观察到的动力学差异的原因。因此，确定appA2是一种不同于appA的基因似乎是合情合理的；尽管需要更确定的结构分析来阐明特定的氨基酸调换与这两种酶的功能改变之间的关系。为了将来的结构研究，有必要首先制备两种酶的晶体(27)。

先前，已经报道了几种水解pNNP或肌醇六磷酸钠的大肠杆菌酶(18、19、39-41)。Greiner等(39)描述了两种大肠杆菌肌醇六磷酸酶(P1和P2)的特征。他们发现：纯化的大肠杆菌肌醇六磷酸酶P2在N-末端序列、化学性质和动力学方面与大肠杆菌pH 2.5酸性磷酸酶享有着很大的一致性。因此，他们提出这两种酶可能是同一种蛋白，且大肠杆菌pH 2.5酸性磷酸酶更应该被认为是一种肌醇六磷酸酶。实际上，r-appA酸性磷酸酶和r-appA2两者不仅都能水解纯的化学形式的肌醇六磷酸或天然食物中的肌醇六磷酸，而且都对肌醇六磷酸钠比对pNNP具有更高的亲合性。因此，可将这两种酶分类为肌醇六磷酸酶类。

和纯化的肌醇六磷酸酶P2(39)相比，r-appA2具有同样的最适温度(55℃)和去糖基化后的相同分子量(46.3kDa)。根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和非变性凝胶电泳分析，该蛋白也是单体的。然而，r-appA2具有更酸的最适pH(pH 2.5-3.5对P2的pH 4.5)，且因为在毕赤酵母属中的N-糖基化而含有8％至14％的糖部分。用Endo Hf将r-appA2去糖基化，减小所述分子的大小，但对r-appA2的活性影响极微。比较起来，如果把该酶蛋白与β-巯基乙醇和Endo H_f一起保温，则大大地降低r-appA2的肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性。这表明：正如先前关于无花果曲霉(A.ficuum)的肌醇六磷酸酶而指出的(47)，二硫键是r-appA2的肌醇六磷酸酶活性所需的。

虽然在本文中已详细地描绘和描述了优选的实施方案，但对于有关技术领域的技术人员而言，显而易见的是：可以在不离开本发明精神的情况下进行各种各样的修饰、添加、取代等等，因此认为这些修饰、添加、取代等等在以下所附的权利要求书中限定的本发明的范围内。

参考文献

通过引用，特此将本文里引用的下列参考文献结合到本申请中：

1.Pallauf，J.等， Arch Tierernahr，50，301-319(1997)。

2.Greiner，R.等， Arch.Biochem.Biophys.，303，107-113(1993)。

3.Kim，Y.等， Enz.Microbiol.Technol.，22，2-7(1998)。

4.Shieh，T.R.等， Appl.Microbiol.，16，1348-1351(1968)。

5.Mitchell，D.B.等， Microbiol.，143，245-252(1997)。

6.Pasamontes，L.等， Appl.Environ.Microbiol.，63，1696-1700(1997)。

7.Barberic，S.等， J Biol.Chem.，259，878-883(1984)。

8.Wodzinski，R.J.等， Adv.Appl.Microbiol.，42，263-302(1996)。

9.Liu，B.L.等， Enz.Microbiol.Technol.，22，415-424(1998)。

10.Harper A.F.等， J.Anim.Sci.，75，3174-86(1997)。

11.Lei，X.G.等， J.Anim.Sci.，71，3359-3367(1993a)。

12.Lei，X.G.等， J.Anim.Sci.，71，3368-3375(1993b)。

13.Jongloed，A.W.等， J.Anim.Sci.，70，1159-1168(1992)。

14.Stahl，C.H.等， J.Anim.Sci.，77，(在印刷中)(1999)。

15.Jongbloed，A.W.等， Vet.Q.，19，130-134(1997)。

16.Skoglund，E.等， Can.J.Anim.Sci.，78，175-180(1998)。

17.Van Hartingsveldt，W.等， Gene，127，87-94(1993)。

18.Dassa，J.等， J.Bacteriol.，172，5497-5500(1990)。

19.Pradel，E.等， J.Bacteriol.，170，4916-4923(1988)。

20.Ostanin，K.等， J.Biol.Chem.，267，22830-22836(1992)。

21.Lowry，O.H.等， J.Biol.Chem.，193，265-275(1951)。

22.Laemmli，U.K.， Nature，227，680-685(1970)。

23.Sherton，C.C.等， J.Biol.Chem.，249，2258-2262(1974)。

24.Piddington，C.S.等， Gene，133，55-62(1993)。

25.Chen，P.S.等， Anal.Chem.，28，1756-1758(1956)。

26.Kostrewa，D.等， Nature Stru.Biol.，4，185-189(1997)。

27.Jia，Z.等， Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.，54，647-649(1998)。

28.Takaoka，M.等， Biochem.Biophys.Res.Commun.，166，436-442(1990)。

29.Fruton，J.S.， Adv.Exp.Med.Biol.，95，131-140(1977)。

30.Savoie，L.等， Plant Foods Hum.Nutr.，40，233-242(1990)。

31.Wiesemuller，W.等， Arch.Tierenahr，40，689-693(1990)。

32.Tivey，D.R.等， Digestive physiology in pigs，第140-143页，EAAPNo.88。

33.Han，Y.M.等， J.Anim.Sci.，76，2649-2656(1998)。

34.Lolas，M.等， J.Food Sci.，42，1094-1097(1977)。

35.Reddy，N.L.等， Adv.Food Res.，28，1-92(1982)。

36.Pasamontes，L.等， Biochim.Biophvs.Acta.，1353，217-223(1997)。

37.Dvorak，H.F.等， Biochemistry，6，1743-1751(1967)。

38.Dassa，E.等， J.Biol.Chem.，257，6669-6676(1982)。

39.Greiner，R.等， Arch.Biochem.Biophys.，303，107-113(1993)。

40.Greaves，M.P.等， Biochem.Biophys.Acta.，132，412-418(1967)。

41.Kerovuo，J.等， Appl.Environ.Microbiol.，64，2079-85(1998)。

42.Kim，Y.O.等， FEMS Microbiol.Lett.，162，185-191(1998)。

43.Butine，T.J.等， Appl.Environ.Microbiol.，55，1112-1116(1989)。

44.Robinson，L.M.等， Appl.Environ.Microbiol.，48，964-969(1984)。

45.Altschul，S.F.等， J.Mol.Biol.，215，403-410(1990)。

46.Zan，G.H.， Biostatistical.Analysis，第109-114页，Prentice-Hall，Englewood Cliffs，NJ(1974)。

47.Ullah，A.H.J.等， Biochem.Biophys.Res.Commun.，227，311-317(1996)。

48.Bitter等， Meth.Enzymol.，153，516-44(1987)。

49.Struhl等， Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 76，1035-39(1979)。

50.Powels等， Cloning Vectors，I-IV，et seq.Elsevier，(1985)。

51.Sakai等， Biotechnolgy9，1382-85(1991)。

52.Stetler等， Biotechnology 7，55-60(1989)。

53.Hitzeman等， J.Biol.Chem.255，2073(1980)。

54.Hess等， J.Ady.Enzyme Reg.7，149(1968)。

55.Holland等， Biochem.17，4900，(1978)。

56.Russell等， J.Biol.Chem.258，2674(1982)。

57.Beier等， Nature 300，724(1982)。

58.Kurjan等， Cell 30，933-43(1982)。

59.Hinnen等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75，1929(1978)。

序列表

<110>Cornell Research Foundation，Inc.

<120>具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶

<130>19603/2793

<140>

<141>

<150>60/127,032

<151>1999-03-31

<160>9

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>433

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>未确定

<222>(433)

<223>该序列中位置433的Xaa是未知的

<400>1

Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr

1 5 10 15

Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser

20 25 30

Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr

35 40 45

Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val

50 55 60

Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys

85 90 95

Lys Gly Cys Pro Gln Pro Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp

100 105 110

Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro

115 120 125

Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp

130 135 140

Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala

145 150 155 160

Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp

165 170 175

Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu

180 185 190

Asn Phe Ser Gln Leu Asn Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu

195 200 205

Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala

210 215 220

Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr

225 230 235 240

Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp

245 250 255

Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His

260 265 270

Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser

275 280 285

Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His

290 295 300

Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu

305 310 315 320

Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu

325 330 335

Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly

340 345 350

Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln

355 360 365

Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp

370 375 380

Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr

385 390 395 400

Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala

405 410 415

Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

420 425 430

Xaa

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>2

ggaattccag agtgagccgg a 21

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>3

ggggtacctt acaaactgca cg 22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>4

taaggagcag aaacaatgtg gt 22

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>5

ggaattccag agtgagccgg a 21

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>6

ggggtacctt acaaactgca cg 22

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：N-末端基序

<400>7

Arg His Gly Xaa Arg Xaa Pro

1 5

<210>8

<211>30

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>8

Met Trp Tyr Phe Leu Trp Phe Val Gly Ile Leu Leu Met Cys Ser Leu

1 5 10 15

Ser Thr Leu Val Leu Val Trp Leu Asp Pro Arg Leu Lys Ser

20 25 30

<210>9

<211>1489

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>9

taaggagcag aaacaatgtg gtatttcctt tggttcgtcg gcattttgtt gatgtgttcg 60

ctctccaccc ttgtgttggt atggctggac ccgcgattga aaagttaacg aacgtaagcc 120

tgatccggcg cattagcgtc gatcaggcaa taatatcgga tatcaaagcg gaaacatatc 180

gatgaaagcg atcttaatcc catttttatc tcttttgatt ccgttaaccc cgcaatctgc 240

attcgctcag agtgagccgg agctgaagct ggaaagtgtg gtgattgtca gccgtcatgg 300

tgtgcgtgcc ccaaccaagg ccacgcaact gatgcaggat gtcaccccag acgcatggcc 360

aacctggccg gtaaaactgg gttggctgac accacgcggt ggtgagctaa tcgcctatct 420

cggacattac caacgccagc gtctggtggc cgacggattg ctggcgaaaa agggctgccc 480

gcagcctggt caggtcgcga ttattgctga tgtcgacgag cgtacccgta aaacaggcga 540

agccttcgcc gccgggctgg cacctgactg tgcaataacc gtacataccc aggcagatac 600

gtccagtccc gatccgttat ttaatcctct aaaaactggc gtttgccaac tggataacgc 660

gaacgtgact gacgcgatcc tcagcagggc aggagggtca attgctgact ttaccgggca 720

tcggcaaacg gcgtttcgcg aactggaacg ggtgcttaat ttttcccaat taaacttgtg 780

ccttaaccgt gagaaacagg acgaaagctg ttcattaacg caggcattac catcggaact 840

caaggtgagc gccgacaatg tttcattaac cggtgcggta agcctcgcat caatgctgac 900

ggaaatattt ctcctgcaac aagcacaggg aatgccggag ccggggtggg gaaggatcac 960

tgattcacac cagtggaaca ccttgctaag tttgcataac gcgcaatttt atttactaca 1020

acgcacgcca gaggttgccc gcagtcgcgc caccccgtta ttggatttga tcatggcagc 1080

gttgacgccc catccaccgc aaaaacaggc gtatggtgtg acattaccca cttcagtgct 1140

gtttattgcc ggacacgata ctaatctggc aaatctcggc ggcgcactgg agctcaactg 1200

gacgcttcca ggtcagccgg ataacacgcc gccaggtggt gaactggtgt ttgaacgctg 1260

gcgtcggcta agcgataaca gccagtggat tcaggtttcg ctggtcttcc agactttaca 1320

gcagatgcgt gataaaacgc cgctatcatt aaatacgccg cccggagagg tgaaactgac 1380

cctggcagga tgtgaagagc gaaatgcgca gggcatgtgt tcgttggccg gttttacgca 1440

aatcgtgaat gaagcgcgca taccggcgtg cagtttgtaa tggtacccc 1489

Claims

1.一种具有改良的肌醇六酶活性的磷酸酶，该磷酸酶包括：具有SEQ.ID No.1中所示氨基酸序列的一种多肽。

2.权利要求1的磷酸酶，其中所述的磷酸酶在酵母中表达。

3.权利要求2的磷酸酶，其中所述酵母为巴斯德毕赤酵母。

4.权利要求2的磷酸酶，其中所述酵母为酿酒酵母。

5.权利要求1的磷酸酶，其中所述的磷酸酶由一种重组基因编码，该重组基因包括：

一个启动子；

一个编码权利要求1的磷酸酶的编码区；以及

一个终止子。

6.一种改良的动物饲料，所述动物饲料包含权利要求1的磷酸酶。

7.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1的磷酸酶。

8.一种载体，所述载体携带权利要求7的核酸分子。

9.一种宿主细胞，所述宿主细胞是用权利要求8之载体转化的宿主细胞。

10.权利要求9的宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母。

11.权利要求10的宿主细胞，其中所述酵母为巴斯德毕赤酵母。

12.权利要求11的宿主细胞，其中所述酵母为酿酒酵母。