参考图1到5,离心分离器1具有一个圆圈形的转筒2,一个输送管3,和一个收集装置4。输送管3将多相溶液输送给转筒2,以便通过转筒2绕着其中心轴旋转,使多相混合物分离为它的不连续密度相。分离的相在旋转着的转筒2中形成环形柱状物。转筒2的顶部是开放的,之所以是这样的一个形状,是为了允许多相混合物的已经分离的不同密度相之间的分界层被增强。转筒2的形状也允许通过收集装置4的运动去除所有分离的多相混合物。收集装置4包括收集管5,废弃物收集管6,和一个清洗溶液管7。
收集管5与泵相连,该泵在图中没有给出,该泵直接抽吸或者产生降低的压力,以便能将经受进一步处理或分析的分离混合物部分吸引到收集管5中。移动收集装置4,以便收集管8的末端能收集分离混合物部分,同时在转筒2的旋转过程中,使分离混合物的其它部分所遭到的破坏最小化。这可以通过移动收集管8的末端,以便其接近但没有接触到将被收集的部分来实现,正如图3所示。
废弃物收集管6也与泵相连,该泵在图中没有给出,该泵能够直接抽吸或者产生降低的压力,以便能将被抛弃的分离混合物部分吸引到废弃物收集管6中。移动收集装置4,以便废弃物收集管9的末端能收集分离混合物部分,同时在转筒2的旋转过程中,使针对分离混合物的其它部分的破坏最小化。这可以通过移动废弃物收集管的末端,使其接近但不接触到将被收集的部分来实现,正如图2所示。
清洗溶液管7能给转筒2供给清洗溶液,这是为了将另一种多相混合物放入到洁净的转筒中,正如图4所示。清洗溶液能清洗转筒2,以去除任何残余物,并且阻止样品的交叉污染。然后清洗溶液能通过废弃物收集管6从转筒中去除,正如图5所示。
经过输送管3,通过将混合物引入到环形的转筒2中,多相混合物被分离为不连续密度相,使转筒2绕着其中心轴旋转,以便混合物被分离为至少两个不连续密度相,形成环形柱状物,并且通过收集装置4从转筒中去除不连续密度相。收集装置4相对于转筒2是可移动的,这样收集装置4可以位于转筒2中,以便在转筒2正在旋转的时候,顺序地、选择性地并且各别地从转筒2上去除环形柱状物,而基本上不会破坏转筒2中剩余的环形柱状物。
具有最高密度的相形成离转筒2的中心轴最远的外部环形柱状物,而具有最低密度的相形成距离转筒2的中心轴最近的内部环形柱状物。收集装置4能被移动,以便收集装置4序贯地收集所有分离相,首先收集内部柱状物,最后收集外部柱状物。旋转速率在收集过程中可降低到这样的程度,即分离开的不连续密度相将不再重新混合。
用清洗溶液清洁转筒2允许在连续的处理循环中批量处理样品,而没有交叉污染。在优选的构型中,自动化的离心分离器包括一个平面的、圆圈形的转筒;对于该转筒,机动的自动化收集装置,其包括收集管、泵、阀门、清洗管和光学检测设备,提供将多相混合物连续引入到分离环境中,从旋转的离心分离器自动化收集解析开的相部分,以及在离心分离器的连续操作过程中、在混合物之间的转筒清洗。
对于施加在位于收集点处的液体表面上的样品的力,当前的理解为——是作用在旋转液体中的颗粒上的离心力和摩擦力的函数,如下所述:
1.如图6所描绘,考虑位于旋转转筒内的旋转液体柱状物之表面上的一个颗粒,其中61是旋转轴;62是位于旋转的环形液体柱状物表面上的第i个颗粒Pi;63是颗粒Pi在液体柱状物旋转时所经过的路径。设ri是圆盘中心到第i个颗粒的距离,并且设θi是该颗粒运动通过的角度。当该颗粒运动通过角度(角位移)dθ时,该颗粒运动通过的弧长为dsi=ri |dθ|
2.旋转物体的角速度变化的时间速率被称作角加速度α,其中:α=d2θ/dt2=dω/dt。
角dθ是角位移,在时间周期dt内,并且ω是与旋转方向平行的角速度矢量。
3.位于旋转液体表面上的颗粒的线速度与该颗粒的圆形途径相切,该速率具有量级:Vit=dsi/dt。
4.切向速度与旋转体的角速度相关,
因此:Vit=dsi/dt=ridθ/dt=riω。
5.类似地,位于旋转液体柱状物的表面上的颗粒的切向加速度是:αit=dvit/dt=ridω/dt,因此αit=riα。
6.考虑图7所示的位于旋转转筒内的旋转液体柱状物的表面上的一个颗粒,其中71是旋转的环形液体柱状物73的内部表面,第i个颗粒Pi位于其上,72是旋转转筒的(平截的)内壁或内部柱状物73和外部柱状物之间分界层。
类似地,施加在该颗粒上的净切向力是:Fit=miαit=miriα,其中mi是颗粒Pi的质量。
因此,施加在位于液体的旋转柱状物表面上的颗粒上的切向力,与颗粒距离旋转轴的径向距离以及颗粒的切向加速度成比例。
7.在恒定的角速度下,该力是零;然而,当通过静态收集管(相对于液体柱状物的圆周运动而言,是静态的)从液体的旋转着的环形柱状物的表面上收集颗粒时,颗粒要经历一个很快的减速,从而经历一个扭力,该力接近于切向加速度:Fit=miαit=miriα
颗粒的受力可以被分解为两个部分,如图7所示:
Fir=FicosΦ,沿着径向线ri,以及
Fit=FisinΦ,垂直于径向线
8.图8显示了收集导管81的开口,垂直位于内部半径为ri的液体柱状物82的内部表面上,在转筒中旋转。收集管的远端通向(平截的)近中心侧的收集装置83。内部管状收集管81的直径为Sap;在该距离范围内,颗粒Pi被收集。途径距离Sap也与圆弧途径大约接近;通过该圆弧,颗粒Pi在时间dtap内、在旋转角度dθap上被减速。收集管具有外壁84。液体本体85驻留于与转筒86的内壁接近的环形旋转转筒中,或者驻留于内部柱状物85和外部柱状物之间的分界层中,同时收集装置被置于朝向转筒的旋转轴的位置。
因此,对于通过收集装置83所收集的颗粒,保持与旋转液体柱状物85的表面垂直,并且正好在其上面,这显示了转头的旋转方向;当收集颗粒时,颗粒的减速发生在整个收集管81的内部宽度之间。因此,当它通过长度接近dsap的圆弧运动时,施加在这些颗粒上的力与颗粒减速过程中发生的力接近;其中,dsap对着角度dθap,并且其与收集管81的孔径宽度相等。
该力Fiap的大小将受到颗粒运动经过该位移距离所花费时间的影响,因此:
Fiap=mitriαap=mitri(d2θap/dtap 2)
9.典型地,从液体的内部表面收集样品的流速被维持在等于或大于这样的一个流速,即旋转的液体柱状物85之内的相等体积以该流速收集,从而确保当收集臂朝着液体82的内部表面均匀地并且行进式移动时,收集臂的末端不会进入液体的表面、并且维持在液体表面的外面。臂移动的速度和收集泵速度的微处理器控制维持了该平衡。
10.同时,位于液体85的柱状物表面上的每一颗粒也经历了径向加速度,沿着径线指向内部的向心加速度,并且具有这样的量值:
aic=(Vit)2/ri=(riω)2/ri=riω2
因此,被收集过程所扰乱的、位于液体表面上的颗粒持续地经受向心加速度和向心力,试图在液体柱85上重新建立均匀的表面。
11.从表面收集的颗粒必须经受一个超过aic的力,aic=(Vit)2/ri=riω2,通过收集装置、以便借助泵作用从液体表面重新得到颗粒。
12.对于收集管,其保持在小于与旋转液体柱的表面相垂直(对着偏离垂直方向Φ角度)的角度,并且面向旋转方向,这些力将是跨越倾斜的收集孔径Fiap和与径向线垂直的矢量FitsinΦ的一个分量的总和。因此,在这些颗粒的减速过程中发生的力不能超过最大力Fit。该力Fi total的大小也将受到颗粒用于移动该位移距离所花费的时间的影响。
13.与径向线垂直的力矢量Fit sinΦ之一部分也将驱动收集的液体到收集导管中;对于收集导管,其保持在小于与旋转液体柱的表面垂直的角度,并且面向旋转方向。
在一个实施方案中,多个成分之间的确定可以通过鉴定存在于从转筒而来的分离混合物的流中分界层来实现。传感设备,如测量光密度或光散射的设备,可以放置在收集溶液的途径中,用于检测相溶液的不同组分。从该传感所得到的数据激活受控的适当处理器,以确定柱状物是否应该被收集,用于进一步处理或弃为废弃物。传感器可定位在收集管入口或者收集装置的废弃物收集管入口的相对侧。可以替代性地,传感器可以是固定的,并且通过扫描数据分析、确定用于收集和分离的适当流体组分。
在可替换的实施方案中,在转筒中鉴定分离密度介质,这样每种介质被鉴定出距离旋转轴有特定的距离。然后,收集装置能将收集管或者废弃物收集管移动到与内部柱状物最接近。然后从内部柱到外部柱顺序收集随后的部分,其中每种离散密度介质指向废弃物或一个收集容器,例如试管。然后,收集容器中的分离混合物可以被进一步分析,例如在显微镜或其它设备下。
仍然在另一个实施方案中,流动离心也作为混合器发挥作用;转筒可以被修改,以便在转筒的底部具有小的混合器/搅拌器叶片,从而在水相的离心分离之前,为引入的多相混合物的混合提供完整的低速交替旋转。例如,在离心分离器的自动化的、连续的操作中,含有被破坏以便从细胞中释放细胞核的植物材料的缓冲溶液和缓冲液,相缓冲液,或其它适当溶液或添加剂,可以被加入到转筒中,相缓冲液和其它成分通过混合叶片或搅拌器以低速的叶轮作用被轻轻地混合在一起。在所施加的离心场的影响下,转筒模式中的旋转速率的增加导致溶液和材料沿着转筒壁移动,直到溶液集聚在转筒的径向末端。
在混合叶片的一个可选方案中,收集装置移动到混合物主体中,以便为加入到转筒中的溶液提供紊流混合作用。例如,在离心分离器的自动化的、连续操作中,含有植物材料的缓冲溶液和缓冲液,相缓冲液,或其它适当的溶液或添加剂,可以被加入到转筒中;相缓冲液和其它成分通过收集装置插入到混合物中所产生的紊流作用被轻轻地混合在一起。收集臂的撤出和离心模式中旋转速率的增加引起溶液和材料形成由分离的不连续密度相组成的环形柱。
在本发明的一个应用中,组织样品,例如植物组织,在离心分离器中进行分离之前,通常将经受碾磨,以便释放细胞核。碾磨将在一个单独的机器中进行,或者该单独机器作为与离心分离器组合的自动化组织碾磨装置的一部分。优选地,在低剪切条件下磨碎组织,以维持DNA的完整性。离心可以提供从含有细胞材料匀浆的离散样品中更快速地分离细胞核。上述方法可以以连续处理循环、在批量处理离散组织样品中发挥作用。
使用离心分离器的实施方案以及离心分离方法的实施方案,现在将仅仅通过实施例的方式进行实施例描述。
实施例1
含有三个相的混合物,其中要求这些相中的一个相与其它两个相分离,以便它可以被进一步处理和分析。含有三个相的混合物被引入到离心分离器的转筒中。转筒高速旋转,将三个相分离为环形柱状物,在转筒的外侧具有最高密度相,并且具有最低密度的相形成了内部柱。将要经受进一步处理的相位于其它两个相之间。
由于最内部的相将被废弃,同时转筒仍然在旋转,所以收集装置将废弃物收集管的末端移向最内部柱状物的内部边缘,而不会扰乱其它柱状物。当与废弃物收集管相连的泵通过导管吸引内部柱状物的流体时,收集装置向外移动,以便整个内部柱状物可以被收集。
当检测到整个内部柱柱状物已经被收集,并且送出去丢弃时,收集装置移动,以便收集管能移动中间的柱状物,该中间柱状物现在是剩余的两个柱状物中的最内部柱状物。该柱状物的收集类似于第一个柱状物的收集,尤其是不干扰最外部的柱状物,除了收集的相被导向用于进一步处理的容器或分析机器而外。
一旦该整个柱状物被收集,就移动收集装置,以便废弃物收集管能收集外部柱状物,并且弃掉该柱状物。
然后,直接对由不同部分或相组成的另一份样品重复该过程,或者在清洗转筒之后重复该过程。
实施例2
本发明的实施方案尤其适合于从植物和其它属和种的组织中分离和分开细胞核。例如动物(哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物、鱼、昆虫类)和真菌。
尤其是,在其中混合植物组织匀浆的两相缓冲溶液中,含有聚合物葡聚糖和聚乙二醇(PEG)作为不混溶相形成试剂,所带有的缓冲物是磷酸钾,在pH 7.0-8.0的范围内,其被引入到离心分离器的转筒中。
然后使转筒旋转,以便混合物分离为两个不连续相,其形成内部环形柱和外部柱。植物组织的微粒物质在两个柱的分界层上形成一个环形柱。含水的两相系统促进了微粒材料中的自由植物细胞核在界面区域中的分配。扫描分离的混合物,以鉴定含有自由植物细胞核的部分。随后,在转筒旋转的同时,用移动的收集装置从转筒中收集分离的混合物。含有自由细胞核的柱被导向收集容器,以便可以进行进一步的分析,以确定植物样品的DNA,同时处置掉剩余的相。
然后清洗转筒,以便可以对不同的各种数量和组成的其它样品重复该过程。
上面描述的两相缓冲液溶液含有试剂,以保护植物细胞核的完整性,以便通过抑制核酸酶的活性来保护DNA完整性,并且抑制促进活性酚类化合物的聚合作用的氧化过程。两相缓冲液也可以包括添加剂,如可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP),EDTA(乙二胺四乙酸)和二硫苏糖醇或β-巯基乙醇和非离子型去污剂如Triton或者Tween,以促进植物细胞膜的分散,并且提高蛋白质、多糖和酚类化合物的溶解。
然而,应该理解到,形成前述相的聚合物化合物不是排他的,其它的或替代性的化合物可以被包括在内,或者取代前述化合物,包括这样的替代性的水相形成系统,如Ficol:葡聚糖,Uncon:葡聚糖,羟基丙基淀粉:聚(乙二醇)(PEG),阿拉伯半乳聚糖:PEG,PVP/PEG:葡聚糖,PVP:PEG或盐:PEG,或一种聚合物与取代葡聚糖的一些其它组合,或者一种取代的聚(乙二醇)聚合物与葡聚糖。
实施例3
本发明的实施方案尤其适合于:从植物和其它属和种类的组织中,从细胞核中,分离和分开核酸,如基因组DNA和RNA。例如动物(哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖类、鱼类、昆虫类)、真菌和细菌。
多相混合物也可以利用核酸聚合物的选择性分配而成为特定的相层,以便部分地从其它细胞颗粒材料和可溶性聚合物中分离聚合物,所述细胞颗粒材料和可溶性聚合物选择性地分配进另一个相中。然后,含有核酸聚合物的相可以被收集,并且与新鲜的多相组分重新混合,以便进一步去除残余组分,这些残余组分将分配进一个与其中分配有核酸的相而不同的相中。
该技术包括将样品与多相混合物以及能释放核酸聚合物的离液序列高的离子混合,从而溶解核酸,使其不含有其它污染物聚合物,如蛋白质和多糖,通过相分配去除污染物,收集富含核酸的相层。该技术是有利的,这在于它对于DNA的提取和对于不太稳定的RNA的提取都是合适的,并且能给出高度富含核酸。分离核酸和其它聚合物的步骤涉及诸如离心、使用过滤器的过滤等等程序;因此当与此处描述的仪器一起使用时,是相容性的。
实施例4
本发明的实施方案尤其适合于从由植物和其它属和种类的组织中而来的细胞核中分离和分开核酸,如基因组DNA和RNA。例如动物(哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物、鱼、昆虫类)、真菌和细菌。
多相混合物也可以利用核酸聚合物选择性分配为特定的相层,以便部分地从其它细胞颗粒材料和可溶性聚合物中分离这些聚合物,所述细胞颗粒材料和可溶性聚合物选择性地分配进另一个相中。含有核酸聚合物的相然后可以被收集,并且与新鲜的多相组分重新混合,以便进一步去除残余组分,这些残余组分将分配进一个与其中分配了核酸的相不同的相中。
多相混合物也可以使用顺磁性微球体,以便应用质量作用亲和性,从包括选定相层的相对纯的含水溶液中可逆地捕获核酸聚合物。优选地,核酸聚合物可以通过质量作用与具有负电荷表面的磁性颗粒可逆地结合;该表面电荷有助于在去除污染可溶物后释放结合的DNA。
微球体的表面可以被功能化,加入到表面上的活性选择性配体在特定生物分子和颗粒包括核酸的捕获中提供特异性。平面芳族化合物如孔雀绿、苯基中性红、苯基phenazinium染料、多胺、溴乙非啶、SYBR Green、Pico Green、Hoechst 42942或Hoechst 33258的附着是已知的,所述这些芳族化合物显示出对特定DNA序列或DNA中特定碱基对区域的优先结合。这样的亲和染料可以被附着到多种固体基质上,所述固体基质发挥作用以保留并且使核酸与固体表面结合。
多相混合物也可以使用多种微粒支持物,而不是微球体,包括用受控多孔玻璃(CPG)制成的微粒,丙烯酸共聚物、PEG颗粒、纤维素、尼龙、葡聚糖、高度交联的聚苯乙烯、polyacrolein及其类似物。
替代性地,可以使用非特异性核酸结合技术,该技术包括使用去污剂,以及通过使用离液剂(chaotropes);可以使用核酸结合固相如硅石颗粒,而不是结合剂、微球体或微粒支持物。
该技术包括将样品与能释放核酸的核酸结合硅石颗粒和离液序列高的离子混合,从而使核酸与硅石颗粒结合,从而通过洗涤去除污染物,并且收集与硅石颗粒结合的核酸。该技术是有利的,这在于它对于DNA的提取和对于不太稳定的RNA的提取都是适合的,并且能给出高纯度核酸。洗涤带有结合的核酸的颗粒的步骤涉及诸如离心、使用过滤器的过滤等等的方法,因此当使用时,与此处描述的仪器是相容的。然而,应该理解到,前述以丙烯酰胺为基础的亲和颗粒和DNA结合硅石基质颗粒和磁性颗粒不是排他的,也可以包括其它的或可替代的化合物,或者代替前述化合物。
实施例5
核酸分子的选择性纯化也可以通过使用前面描述的仪器和方法来实现。选择性要素可以是任何合适的介质,该介质可以通过任何合适的方式选择感兴趣的分子。例如,选择可以基于对感兴趣分子的吸引和选择性结合,如在亲和基质中。
选择性要素也可以包括应用颗粒床或亲和基质树脂,其中亲和染料可以指导结合。例如,可以使用溴乙菲啶、Hoechst42942或SYBR绿,通过伯胺或叔胺官能团,其分别对聚丙烯酰胺颗粒或琼脂糖颗粒或磺酰氯树脂、表面活化尼龙或精细的二氧化硅颗粒的表面上的羟基发挥作用;或者在顺磁性颗粒上处理具有硅石的表面涂层,聚丙烯酰胺,或者使用醛连接物部分。然而,应该理解到,前述基于丙烯酰胺的亲和树脂和DNA结合硅基质石不是排他的,可以包括额外的或可选择的化合物,或者可以代替前述化合物。