CN100457777C

CN100457777C - 基于亮氨酸的基序和梭菌神经毒素

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Publication number: CN100457777C
Application number: CNB018159575A
Authority: CN
Inventors: L·E·斯图尔德; E·费尔南德斯-萨拉斯; T·M·赫林顿; K·R·奥基
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2009-02-04
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: CN1461308A; JP4818565B2; US20050276820A1; US7671177B2; US7691974B2; NZ523662A; ATE380824T1; US8206723B2; US20080177037A1; BR0112715A; US20050260230A1; US20080214781A1; US20080194797A1; ES2296782T3; CA2416988C; US7393925B2; DE60131856D1; US7705124B2; MXPA03000576A; US7534863B2

Abstract

提供包含包括结构修饰的神经毒素的经修饰的神经毒素，其中相对于无所述结构修饰的相同神经毒素而言，所述结构修饰改变所述经修饰的神经毒素的生物持久性例如生物半寿期和/或生物活性。在一个实施方案中，所述经修饰的神经毒素的制备方法包括采用重组技术。在另一个实施方案中，应用所述经修饰的神经毒素治疗病症的方法包括治疗各种障碍、神经肌肉疾病和疼痛。

Description

基于亮氨酸的基序和梭菌神经毒素

交叉引用

本申请是于2000年7月21日申请的申请顺序号09/620,840的部分连续申请。

背景

本发明涉及经修饰的神经毒素、特别是经修饰的梭菌神经毒素及其应用，即用来治疗各种病症包括已经使用天然存在的肉毒杆菌毒素治疗的病症。

已经用肉毒杆菌毒素例如A型肉毒杆菌毒素治疗各种各样的病症，包括疼痛、骨骼肌病症、平滑肌病症和腺病。肉毒杆菌毒素还用于美容目的。

有各种各样的使用肉毒杆菌毒素进行治疗的实例。有关治疗疼痛的实例，参见Aoki等，美国专利6,113,915和Aoki等，美国专利5,721,215。有关治疗神经肌肉疾病的实例，参见美国专利第5,053,005号，所述专利提出用乙酰胆碱释放抑制剂、最好是A型肉毒杆菌毒素治疗青少年脊柱弯曲，即脊柱侧凸。有关用A型肉毒杆菌毒素治疗斜视，参见Elston，J.S.等，British Journal of Ophthalmology，1985，69，718-724和891-896。有关用A型肉毒杆菌毒素治疗睑痉挛，参见Adenis，J.P.等，J.Fr.Ophthalmol.，1990，13(5)，第259-264页。有关治疗痉挛性口下颌张力障碍性斜颈，参见Jankovic等，Neurology，1987，37，616-623。痉挛性发声困难也可用A型肉毒杆菌毒素进行治疗。参见Blitzer等，Ann.Otol.Rhino.Laryngol，1985，94，591-594。舌张力障碍可依照Brin等，Adv.Neurol.(1987)50，599-608用A型肉毒杆菌毒素进行治疗。Cohen等，Neurology(1987)37(增刊1)，123-4公开了用A型肉毒杆菌毒素治疗书写痉挛。

具有改变的生物持久性和/或改变的生物活性的肉毒杆菌毒素将会是有益的。例如，在腱部外科手术后，可以用肉毒杆菌毒素使肌肉固定且防止肢体活动，促进术后恢复。表现出生物持久性持续时间减少的肉毒杆菌毒素(例如A型肉毒杆菌毒素)将会是有益的，以便患者可以在他们从术后恢复的时间内使肌肉再次使用和活动。此外，具有改变的生物活性(例如增强的生物活性)的肉毒杆菌毒素可以具有作为更为有效的毒素的效用(即每单位毒素用量更有效)，以便可以使用较少的毒素。

另外，需要可以表现出生物持久性延长的经修饰的神经毒素(例如经修饰的梭菌毒素)和生物持久性和/或生物活性降低的经修饰的神经毒素(例如经修饰的梭菌毒素)以及制备这类毒素的方法。

定义

在进行描述本发明之前，提供以下定义，所述定义适用于本文。

“重链”是指梭菌神经毒素的重链。它的分子量约为100kDa，在本文中可以将所述重链称为重链或H。

“H_N”是指来源于梭菌神经毒素重链、大约相当于所述重链的氨基末端区段的片段(其分子量约为50kDa)、或对应于所述完整重链中所述片段的部分。认为它包括天然或野生型梭菌神经毒素中参与轻链转运穿过胞内内体膜的部分。

“H_C”是指来源于梭菌神经毒素重链、大约相当于所述重链的羧基末端区段的片段(约50kDa)、或对应于所述完整重链中所述片段的部分。认为它具有免疫原性，并且包括天然或野生型梭菌神经毒素中参与与各种神经元(包括运动神经元)和其它类型的靶细胞高亲和性结合的部分。

“轻链”是指梭菌神经毒素的轻链。它的分子量约为50kDa，所述轻链可以被称为梭菌神经毒素的轻链、L或蛋白水解结构域(氨基酸序列)。当所述轻链存在于靶细胞的胞质中时，认为所述轻链作为胞吐作用的抑制剂包括作为神经递质(即乙酰胆碱)释放的抑制剂是有效的。

“神经毒素”是指能够干扰细胞包括神经元的功能的分子。所述“神经毒素”可以是天然存在的或人造的。所述受干扰的功能可以是胞吐作用。

“经修饰的神经毒素”是指包括结构修饰的神经毒素。换句话说，“经修饰的神经毒素”是已经通过结构修饰而被修饰的神经毒素。相对于所述经修饰的神经毒素从中制备或衍生的神经毒素而言，所述结构修饰改变了所述经修饰的神经毒素的生物持久性例如生物半寿期(即神经毒素作用的持续时间)和/或生物活性。所述经修饰的神经毒素在结构上与天然存在的神经毒素不同。

“突变”是指对天然存在的蛋白质序列或核酸序列的结构修饰。例如，就核酸突变而论，突变可以是DNA序列中一个或多个核苷酸的缺失、添加或取代。就蛋白质序列突变而论，所述突变可以是蛋白质序列中一个或多个氨基酸的缺失、添加或取代。例如，构成蛋白质序列的一个特定氨基酸可以被另一个氨基酸、例如一个选自以下的氨基酸或任何其它天然或非天然存在的氨基酸或经化学修饰的氨基酸取代：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸。蛋白质序列的突变可以是DNA序列突变的结果，当所述DNA序列被转录和所产生的mRNA被翻译时，产生突变的蛋白质序列。对蛋白质序列的突变也可以通过将含有所需突变的肽序列与所需蛋白质序列融合而产生。

“结构修饰”是指使神经毒素在物理学或化学上与无结构修饰的相同神经毒素不同的对神经毒素的任何改变。

“生物持久性”或“持久性”是指因神经毒素或经修饰的神经毒素引起干扰或影响细胞(例如神经元)功能的持续时间，包括抑制细胞例如神经元的胞吐作用(例如胞吐神经递质例如乙酰胆碱)的持续时间。

“生物半寿期”或“半寿期”是指在哺乳动物细胞内、例如哺乳动物神经元内神经毒素或经修饰的神经毒素、最好是所述神经毒素或经修饰的神经毒素的活性部分、例如梭菌毒素的轻链的浓度被降低至原始浓度一半的时间。

“生物活性”或“活性”是指每单位时间抑制细胞的细胞胞吐作用例如抑制神经元的神经递质胞吐量。

“靶细胞”是指对神经毒素或经修饰的神经毒素具有结合亲和性的细胞(包括神经元)。

概述

已经发现了多种经结构修饰的新型神经毒素。本发明经结构修饰的神经毒素可以提供显著益处，例如与未经修饰的神经毒素相比，所述经结构修饰的神经毒素具有增强或降低的生物持久性和/或生物半寿期和/或增强或降低的生物活性。

按照本发明，提供包括神经毒素和结构修饰的经结构修饰的神经毒素。相对于无所述结构修饰的相同神经毒素，所述结构修饰可有效改变所述经结构修饰的神经毒素的生物持久性。另外，所述经结构修饰的神经毒素在结构上与天然存在的神经毒素不同。

本发明也包括含具有结构修饰的神经毒素的经修饰的神经毒素，其中相对于无所述结构修饰的相同神经毒素，所述结构修饰有效改变所述经修饰的神经毒素的生物活性，并且其中所述经修饰的神经毒素在结构上与天然存在的神经毒素不同。该结构修饰有效减少靶细胞的胞吐作用，其减少的胞吐量大于所述靶细胞被无所述结构修饰的相同神经毒素所减少的胞吐量。另一方面，所述结构修饰有效减少靶细胞的胞吐作用，其减少的胞吐量小于所述细胞被元所述结构修饰的相同神经毒素所减少的所述胞吐量。重要的是，所述胞吐作用可以是胞吐神经递质，而所述经修饰的神经毒素可以表现出改变的生物活性，但不表现出改变的生物持久性。所述结构修饰可以包含一种基于亮氨酸的基序。另外，所述经修饰的神经毒素可以表现出改变的生物活性以及改变的生物持久性。本发明也包括下述情况，其中：(a)所述经修饰的神经毒素表现出增强的生物活性以及增加的生物持久性；(b)所述经修饰的神经毒素表现出增强的生物活性以及降低的生物持久性；(c)所述经修饰的神经毒素表现出降低的生物活性以及降低的生物持久性，和；(d)所述经修饰的神经毒素表现出降低的生物活性以及增加的生物持久性。

重要的是，所述经修饰的神经毒素的单位用量(即以摩尔浓度计)可以比天然存在的神经毒素的单位用量更为有效地减少细胞的胞吐作用。换句话说，经修饰的神经毒素例如经修饰的A型肉毒杆菌毒素的单位用量可以以使得与天然存在的神经毒素表现出的抑制神经递质胞吐作用的抑制相比，导致更强地抑制神经递质的胞吐作用(即从所述细胞释放较少的神经递质)的方式，切割其胞内底物(SNAP)。

再者，按照本发明，提供经结构修饰的神经毒素，其中结构修饰可有效增加所述经修饰的神经毒素的生物持久性。所述经结构修饰的神经毒素的增加的生物持久性可能至少部分是由于所述经结构修饰的神经毒素的半寿期和/或生物活性增加所致。

再者，按照本发明，提供经结构修饰的神经毒素，其中相对于无所述结构修饰的相同神经毒素的生物持久性，所述经结构修饰的神经毒素的生物持久性被降低。这种在生物持久性方面的降低可能至少部分是由于所述经结构修饰的神经毒素的生物半寿期和/或活性减少所致。

再者，按照本发明，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述结构修饰包含多个氨基酸。例如，构成所述结构修饰的氨基酸数目可以是1个或多个氨基酸、1个至约22个氨基酸、2个至约10个氨基酸和约4个至约7个氨基酸。

在一个实施方案中，所述经结构修饰的神经毒素的结构修饰可以包含一个氨基酸。所述氨基酸可以包含一个含多个碳的R基团。例如，所述氨基酸中的碳原子数可以是1个或多个碳、1个至约20个碳、1个至约12个碳、1个至约9个碳、2个至约6个碳和约4个碳。本申请中所用的R基团是指氨基酸侧链。例如，对于丙氨酸R而言基团是CH₃，而例如对于丝氨酸而言R基团是CH₂OH。

在另一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述修饰包含一个氨基酸。所述氨基酸可以包含一个基本为烃基的R基团。

在再一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述结构修饰包含一个氨基酸。所述氨基酸还可以包含一个包括至少一个杂原子的R基团。

再者，按照本发明，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述结构修饰包含例如一个基于亮氨酸的基序、一个基于酪氨酸的基序和/或一个氨基酸衍生物。可以构成经结构修饰的神经毒素的氨基酸衍生物的实例是肉豆蔻酰化氨基酸、N-糖基化氨基酸和磷酸化氨基酸。所述磷酸化氨基酸可以被例如酪蛋白激酶II、蛋白激酶C和酪氨酸激酶磷酸化。

再者，按照本发明，提供可以包括结构修饰的经结构修饰的神经毒素。所述神经毒素可以包含三个氨基酸序列区。第一区可以有效作为细胞结合部分。该结合部分可以是靶细胞例如神经元的结合部分。所述结合部分可以是肉毒杆菌毒素重链的羧基末端。众所周知，肉毒杆菌毒素重链的羧基末端可有效地结合例如存在于某些细胞包括某些神经细胞上的受体。在一个实施方案中，所述羧基末端与存在于神经细胞的突触前膜上的受体结合。第二区可以有效使经结构修饰的神经毒素或经结构修饰的神经毒素的一部分转运穿过内体膜。第三区可有效地抑制靶细胞的胞吐作用。胞吐作用的抑制可以是神经递质释放的抑制，例如抑制从突触前膜释放乙酰胆碱。例如，众所周知，肉毒杆菌毒素轻链有效地抑制例如从各种神经元细胞和非神经元细胞释放乙酰胆碱(以及其它神经递质)。

所述第一区、第二区或第三区中的至少一个可以基本来源于梭菌神经毒素。所述第三区可以包括所述结构修饰。另外，所述经修饰的神经毒素可以在结构上与天然存在的神经毒素不同。另外，相对于无所述结构修饰的相同神经毒素，所述结构修饰可以有效改变所述经修饰的神经毒素的生物持久性。

在一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述神经毒素可以是A、B、C₁、C₂、D、E、F、G血清型肉毒杆菌毒素、破伤风毒素和/或它们的混合物。

在另一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述第三区可以来源于A血清型肉毒杆菌毒素。另外，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述第三区可以不来源于A血清型肉毒杆菌毒素。

在再一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述结构修饰包括一种有效增强所述经结构修饰的神经毒素生物持久性的生物持久性增强组分。所述生物持久性的增强可能至少部分是由于所述经结构修饰的神经毒素的生物半寿期和/或活性增加所致。

再者，按照本发明，提供包含一种生物持久性增强组分的经结构修饰的神经毒素，其中所述生物持久性增强组分可以包含一个基于亮氨酸的基序。所述基于亮氨酸的基序可以包含一连串的7个氨基酸，其中五个一组的氨基酸和二个一组的氨基酸可以构成所述基于亮氨酸的基序。所述五个一组的氨基酸可以限定所述基于亮氨酸的基序的氨基末端。所述二个一组的氨基酸可以限定所述基于亮氨酸的基序的羧基末端。提供经结构修饰的神经毒素，其中所述五个一组的氨基酸可以包含一个或多个酸性氨基酸。例如所述酸性氨基酸可以是谷氨酸或天冬氨酸。所述五个一组的氨基酸可以包含一个含羟基的氨基酸。所述含羟基的氨基酸可以是例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。该含羟基的氨基酸可以被磷酸化。构成所述二个一组氨基酸的至少一个氨基酸可以是亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸或酪氨酸。另外，所述基于亮氨酸的基序中二个一组的氨基酸可以是亮氨酸-亮氨酸、亮氨酸-异亮氨酸、异亮氨酸-亮氨酸或异亮氨酸-异亮氨酸、亮氨酸-甲硫氨酸。所述基于亮氨酸的基序可以是氨基酸序列苯丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸。

在一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述修饰可以是一个基于酪氨酸的基序。所述基于酪氨酸的基序可以包含4个氨基酸。所述基于酪氨酸的基序N-末端的氨基酸可以是一个酪氨酸。所述基于酪氨酸的基序C-末端的氨基酸可以是一个疏水性氨基酸。

再者，按照本发明，所述第三区可以来源于A血清型肉毒杆菌毒素或者来源于其它肉毒杆菌毒素血清型之一。

再者，按照本发明，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述经结构修饰的神经毒素的生物持久性相对于无所述结构修饰的相同神经毒素而言可以被降低。所述降低的生物持久性可能部分是由于所述神经毒素的生物半寿期减少和/或生物活性降低所致。

在一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述结构修饰可以包括一个基于亮氨酸的基序，并且构成所述基于亮氨酸的基序的一个或多个氨基酸发生突变。所述突变可以是所述基于亮氨酸的基序中的一个或多个氨基酸缺失或取代。

在另一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述结构修饰包括一个基于酪氨酸的基序，并且构成所述基于酪氨酸的基序中的一个或多个氨基酸发生突变。例如，所述突变可以是所述基于酪氨酸的基序中的一个或多个氨基酸缺失或取代。

在再一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述结构修饰包含一个氨基酸衍生物，并且所述氨基酸衍生物发生突变或编码所述氨基酸衍生化的核苷酸序列或氨基酸序列发生突变。例如，所述衍生化氨基酸或者负责所述衍生化氨基酸衍生化的核苷酸序列或氨基酸序列发生缺失或取代。所述氨基酸衍生物可以是例如肉豆蔻酰化氨基酸、N-糖基化氨基酸或磷酸化氨基酸。所述磷酸化氨基酸可以通过例如酪蛋白激酶II、蛋白激酶C或酪氨酸激酶来产生。

在本发明的一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述经结构修饰的神经毒素的第一区、第二区和/或第三区可以通过重组DNA方法产生，即重组产生。

在本发明的另一个实施方案中，提供经结构修饰的神经毒素，其中所述神经毒素的第一区、第二区和/或第三区从天然存在的梭菌神经毒素中分离出来。

本发明的另一个实施方案提供一种包含含结构修饰的肉毒杆菌毒素(例如A型肉毒杆菌毒素)的经修饰的神经毒素，所述结构修饰相对于无所述结构修饰的相同神经毒素而言有效改变所述经修饰的神经毒素的生物持久性。所述结构修饰可以包括缺失所述神经毒素轻链的氨基酸416-437(图3)。

在本发明的再一个实施方案中，提供一种含结构修饰的经修饰的神经毒素(例如A型肉毒杆菌毒素)，所述含结构修饰相对于无所述结构修饰的相同神经毒素而言有效改变所述经修饰的神经毒素的生物持久性。所述结构修饰可以包括缺失所述神经毒素轻链的氨基酸1-8(图3)。

再者，按照本发明，提供一种含结构修饰的经修饰的神经毒素，例如A型肉毒杆菌毒素，所述结构修饰相对于无所述结构修饰的相同神经毒素而言有效改变所述经修饰的神经毒素的生物持久性。所述结构修饰可以包括缺失所述神经毒素轻链的氨基酸1-8和氨基酸416-437(图3)。

再者，按照本发明，提供一种含结构修饰的经修饰的肉毒杆菌毒素，例如经修饰的A型肉毒杆菌毒素，所述结构修饰相对于无所述结构修饰的相同神经毒素而言有效改变所述经修饰的神经毒素的生物持久性。所述结构修饰可以包括在所述神经毒素轻链中位置427的亮氨酸被丙氨酸取代以及位置428的亮氨酸被丙氨酸取代(图3)。

另外，本发明范围也包括增强神经毒素的生物持久性和/或增强神经毒素的生物活性的方法。在这些方法中，可以将结构修饰融合或添加到所述神经毒素中，例如，所述结构修饰可以是一种生物持久性增强组分或一种生物活性增强组分。可以融合或添加到所述神经毒素中的结构修饰的实例是一种基于亮氨酸的基序、一种基于酪氨酸的基序和一种氨基酸衍生物。氨基酸衍生物的实例是肉豆蔻酰化氨基酸、N-糖基化氨基酸和磷酸化氨基酸。氨基酸可以被例如蛋白激酶C、酪蛋白激酶II或酪氨酸激酶磷酸化。

另外，按照本发明，提供降低神经毒素的生物持久性和/或降低神经毒素的生物活性的方法。这些方法可以包括一个使所述神经毒素中的氨基酸突变的步骤。例如，可以使所述神经毒素中基于亮氨酸的基序的氨基酸发生突变。另外，例如，可以使所述神经毒素的基于酪氨酸的基序中的一个或多个氨基酸发生突变。另外，例如，可以使负责所述氨基酸衍生化的DNA序列或氨基酸序列的氨基酸衍生物发生突变。所述衍生化氨基酸可以是肉豆蔻酰化氨基酸、N-糖基化氨基酸或磷酸化氨基酸。所述磷酸化氨基酸可以通过例如蛋白激酶C、酪蛋白激酶II和酪氨酸激酶来产生。这些突变可以是例如氨基酸缺失或氨基酸取代。

本发明也包括治疗病症的方法。所述方法可以包括将有效剂量的一种经结构修饰的神经毒素给予哺乳动物以治疗病症的步骤。所述经结构修饰的神经毒素可以包括一种结构修饰。所述结构修饰可有效改变所述神经毒素的生物持久性和/或生物活性。这些用于治疗病症的方法可以使用一种不包含基于亮氨酸的基序的神经毒素。另外，这些用于治疗病症的方法可以使用一种包括一种生物持久性增强组分和/或一种生物活性增强组分的神经毒素。所述生物持久性或活性增强组分可以包含例如一种基于酪氨酸的基序、一种基于亮氨酸的基序或一种氨基酸衍生物。所述氨基酸衍生物可以是例如肉豆蔻酰化氨基酸、N-糖基化氨基酸或磷酸化氨基酸。所述磷酸化氨基酸可以通过例如蛋白激酶C、酪蛋白激酶II或酪氨酸激酶来产生。所治疗的病症可以是神经肌肉疾病、自主性障碍或疼痛。神经肌肉疾病的治疗可以包括一个局部给予肌肉或肌肉群有效量的一种经修饰的神经毒素的步骤。一种治疗自主性障碍的方法可以包括一个局部给予一种或多种腺体有效量的一种经修饰的神经毒素的步骤。一种治疗疼痛的方法可以包括一个在疼痛位置给予有效量的一种经修饰的神经毒素的步骤。另外，疼痛的治疗可以包括一个给予脊髓有效量的一种经修饰的神经毒素的步骤。

再者，按照本发明，提供用经修饰的神经毒素治疗包括病症的方法，所述病症包括：痉挛性发声困难、喉张力障碍、口下颌张力障碍、舌张力障碍、颈张力障碍、病灶性手张力障碍、睑痉挛、斜视、一侧面痉挛、眼睑障碍、大脑性麻痹、病灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经原性膀胱、anismus、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难、流泪、多汗(hyperhydrosis)、唾液分泌过多、胃肠分泌过多、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛、眉部皱纹和皮肤皱纹。

附图简述

图1显示荧光倒置显微镜上显现的(神经生长因子)NGF-分化的PC12活细胞内GFP-A型肉毒杆菌毒素轻链的定位。

图2显示荧光倒置显微镜上显现的NGF-分化的PC12活细胞内GFP-截短的A型肉毒杆菌毒素轻链的定位。

图3显示A型肉毒杆菌毒素轻链的氨基酸序列。减去下划线氨基酸的所示氨基酸序列代表A型肉毒杆菌毒素截短的轻链。

图4显示荧光倒置显微镜上显现的NGF-分化的PC12活细胞内在位置427和428具有LL→AA突变的GFP-A型肉毒杆菌毒素轻链的定位。

图5显示星形孢菌素-分化的PC12细胞的水平聚焦切片中显现的荧光标记抗SNAP-25的定位。

图6显示A型肉毒杆菌毒素的X射线晶体结构。

图7显示荧光倒置显微镜上显现的NGF-分化的PC12活细胞内GFP-B型肉毒杆菌神经毒素轻链的定位。

图8显示A型肉毒杆菌毒素HallA轻链和B型肉毒杆菌毒素Danish I轻链的序列比对和共有序列。

图9显示一曲线图，说明本发明人所实施的体外ELISA测定结果，证明在体外切割底物方面截短的LC/A以比未截短LC/A的速率慢或效率低。

图10显示从大肠杆菌(E.coli)表达的供体外分析用的LC/A构建体的比较。

详细的描述

本发明基于这样一个发现：神经毒素的生物持久性和/或生物活性可以通过结构修饰所述神经毒素而改变。换句话说，具有改变的生物持久性和/或生物活性的经修饰的神经毒素可以由含有或包括结构修饰的神经毒素形成。在一个实施方案中，所述结构修饰包括一种生物持久性增强组分与神经毒素一级结构融合，以增强其生物持久性。在一个优选的实施方案中，所述生物持久性增强组分是一种基于亮氨酸的基序。甚至更优选所述经修饰的神经毒素的生物半寿期和/或生物活性可以被增强约100％。一般而言，所述经修饰的神经毒素要比无所述结构修饰的相同神经毒素的生物持久性高约20％-300％。也就是说，例如，包括所述生物持久性增强组分的经修饰的神经毒素能够引起显著抑制神经末梢释放神经递质例如乙酰胆碱，其抑制时间比未经修饰的神经毒素长约20％至约300％。

本发明在其范围内也包括与天然或未经修饰的神经毒素的生物活性相比生物活性改变的经修饰的神经毒素。例如，所述经修饰的神经毒素可以表现出对靶细胞胞吐作用(例如胞吐神经递质)的抑制降低或增强，而在所述经修饰的神经毒素的生物持久性方面有或无任何改变。

在本发明的一个广泛实施方案中，一种基于亮氨酸的基序是一连串的7个氨基酸。所述氨基酸被组构为两组。始于所述基于亮氨酸的基序的氨基末端的前5个氨基酸构成“五个一组的氨基酸”。紧接所述五个一组的氨基酸的2个氨基酸构成“二个一组的氨基酸”。在一个优选的实施方案中，所述二个一组的氨基酸位于所述基于亮氨酸的基序的羧基末端区。在另一个优选的实施方案中，所述五个一组的氨基酸包括至少一个选自谷氨酸和天冬氨酸的酸性氨基酸。

所述二个一组的氨基酸包括至少一个疏水性氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸或酪氨酸。优选所述二个一组的氨基酸是亮氨酸-亮氨酸、亮氨酸-异亮氨酸、异亮氨酸-亮氨酸或异亮氨酸-异亮氨酸、亮氨酸-甲硫氨酸。甚至更优选所述二个一组的氨基酸是亮氨酸-亮氨酸。

在一个实施方案中，所述基于亮氨酸的基序是xDxxxLL(SEQ IDNO：1)，其中x可以是任何氨基酸。在另一个实施方案中，所述基于亮氨酸的基序是xExxxLL(SEQ ID NO：2)，其中E为谷氨酸。在另一个实施方案中，所述二个一组的氨基酸可以包括一个异亮氨酸或一个甲硫氨酸，分别形成xDzxxLI(SEQ ID NO：3)或xDxxxLM(SEQ ID NO：4)。另外，所述天冬氨酸D可以被谷氨酸E取代，形成xExxxLI(SEQID NO：5)、xExxxIL(SEQ ID NO：21)和xExxxLM(SEQ ID NO：6)。在一个优选的实施方案中，所述基于亮氨酸的基序是苯丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸，SEQ ID NO：7。

在另一个实施方案中，所述五个一组的氨基酸可以包括至少一个含羟基的氨基酸例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。优选所述含羟基的氨基酸可以被磷酸化。更优选所述含羟基的氨基酸是可以被磷酸化的丝氨酸，以允许衔接蛋白质结合。

尽管作为实例提供了非修饰氨基酸，但是也考虑修饰氨基酸是在本发明范围内。例如，基于亮氨酸的基序可以包括卤化亮氨酸、最好是氟化亮氨酸。

不同的基于亮氨酸的基序存在于不同的物种中。可以依照本发明使用、来源于不同物种的可能的基于亮氨酸的基序一览表示于表1中。该一览表是非限制性的。

表1

VMAT是囊泡单胺转运蛋白；VACht是囊泡乙酰胆碱转运蛋白；而酿酒酵母Vam3p是小突触泡蛋白的酵母同源物。斜体丝氨酸残基是潜在的磷酸化位点。

所述经修饰的神经毒素可以由任何神经毒素来产生。另外，所述经修饰的神经毒素可以由神经毒素的片段、例如除去轻链和/或重链一部分的肉毒杆菌毒素形成。所用的神经毒素最好是梭菌神经毒素。梭菌神经毒素包含一种具有三个氨基酸序列区的多肽。第一氨基酸序列区可以包括基本完全来源于选自下的述神经毒素的靶细胞(即神经元)结合部分：巴氏梭菌(Clostridium beratti)毒素；丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)毒素；破伤风梭菌(Clostridium tetani)毒素；肉毒梭菌(Clostrdidum botulinum)A、B、C₁、D、E、F和G型毒素。所述第一氨基酸序列区最好来源于毒素重链的羧基末端区H_C。另外，所述第一氨基酸序列区可以包含一个靶向部分，所述靶向部分可以包含可以与靶细胞上的受体例如细胞表面蛋白或其它生物组分结合的分子(例如氨基酸序列)。

所述第二氨基酸序列区可有效地使所述多肽或其部分转运穿过内体膜而进入神经元的胞质中。在一个实施方案中，所述多肽的第二氨基酸序列区包含来源于选自下述的神经毒素的重链氨基末端H_N：巴氏梭菌毒素；丁酸梭菌毒素；破伤风梭菌毒素；肉毒梭菌A、B、C₁、D、E、F和G型毒素。

所述第三氨基酸序列区在被释放到靶细胞(例如神经元)的胞质中时具有治疗活性。在一个实施方案中，所述多肽的第三氨基酸序列区包含来源于选自下述的神经毒素的毒素轻链L：巴氏梭菌毒素；丁酸梭菌毒素；破伤风梭菌毒素；肉毒梭菌A、B、C₁、D、E、F和G型毒素。

所述梭菌神经毒素可以是杂种神经毒素。例如，所述神经毒素的每个氨基酸序列区可以来源于不同的梭菌神经毒素血清型。例如，在一个实施方案中，所述多肽包含：一个来源于破伤风毒素H_C的第一氨基酸序列区、一个来源于B型肉毒杆菌毒素H_N的第二氨基酸序列区和一个来源于E血清型肉毒杆菌毒素轻链的第三氨基酸序列区。所有其它可能的组合都包括在本发明范围内。

或者，所述梭菌神经毒素的所有三个氨基酸序列区可以全都来源于相同物种和相同血清型。如果所述神经毒素的所有三个氨基酸序列区来源于相同物种和血清型的梭菌神经毒素，则所述神经毒素将会以所述物种和血清型命名。例如，神经毒素多肽可以具有来源于E型肉毒杆菌毒素的第一氨基酸序列区、第二氨基酸序列区和第三氨基酸序列区。在这种情况下，所述神经毒素被称为E型肉毒杆菌毒素。

另外，所述三个氨基酸序列区中的每个区可以根据从其来源的天然存在的序列进行修饰。例如，与所述天然存在的序列相比，所述氨基酸序列区可以添加或缺失至少一个或多个氨基酸。

可以将一种生物持久性增强组分或一种生物活性增强组分例如一种基于亮氨酸的基序与任一上述神经毒素融合，形成一种具有增强的生物持久性和/或增强的生物活性的经修饰的神经毒素。本发明正文中所用的“融合”包括在神经毒素一级结构中的共价添加或共价插入。例如，可以将一种生物持久性增强组分和/或一种生物活性增强组分添加到在一级结构中不具有一种基于亮氨酸的基序的梭菌神经毒素中。在一个实施方案中，将一种基于亮氨酸的基序与一种杂种神经毒素融合，其中所述第三氨基酸序列来源于A、B、C₁、C₂、D、E、F或G血清型肉毒杆菌毒素。在另一个实施方案中，将所述基于亮氨酸的基序与E型肉毒杆菌毒素融合。

在另一个实施方案中，将一种生物持久性增强组分或一种生物活性增强组分通过改变编码神经毒素的克隆化DNA序列而添加到所述神经毒素中。例如，将编码一种生物持久性增强组分和/或一种生物活性增强组分的DNA序列，添加到编码欲添加所述生物持久性增强组分或生物活性增强组分的神经毒素的克隆化DNA序列中。这一步可以用本领域的分子生物学家熟悉的多种方法来完成。例如，可以用定点诱变或PCR克隆，在所述神经毒素编码DNA序列中产生所需改变。然后，将所述DNA序列重新导入天然宿主菌株中。就肉毒杆菌毒素而论，所述天然宿主菌株是肉毒梭菌(Clostridium botulinum)菌株。该宿主菌株最好缺乏所述天然肉毒杆菌毒素基因。在一个可供选择的方法中，可以将所述经改变的DNA导入异源宿主系统例如大肠杆菌或其它原核生物、酵母、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系中。一旦将所述经改变的DNA导入其宿主中，则含有所述添加的生物持久性增强组分和/或生物活性增强组分的重组毒素可以通过例如标准发酵方法生产。

同样，生物持久性增强组分可以从神经毒素中除去。例如，可以用定点诱变消除生物持久性增强组分，例如一种基于亮氨酸的基序。

可用来完成这些和其它遗传操作的标准分子生物学技术见于Sambrook等(1989)，所述文献通过引用全部结合到本文中。

在一个实施方案中，将所述基于亮氨酸的基序融合或添加到所述神经毒素的第三氨基酸序列区。在一个优选的实施方案中，将所述基于亮氨酸的基序融合或添加到所述第三氨基酸序列区的羧基末端。更优选将所述基于亮氨酸的基序融合或添加到所述神经毒素第三区的羧基末端。甚至更优选将所述基于亮氨酸的基序融合或添加到E型肉毒杆菌毒素第三区的羧基末端。融合或添加所述基于亮氨酸的基序的第三氨基酸序列可以是杂种或嵌合的经修饰的神经毒素中的一种组分。例如，可以将所述基于亮氨酸的基序融合或添加到一种类型的肉毒杆菌毒素(即A型肉毒杆菌毒素)的第三氨基酸序列区(或其部分)，其中所述基于亮氨酸的基序-第三氨基酸序列区本身已经与来源于另一种类型(或多种类型)的肉毒杆菌毒素(例如B型和/或E型肉毒杆菌毒素)的第一和第二氨基酸序列区融合或缀合。

在另一个实施方案中，具有一种预先存在的生物持久性增强组分和/或一种生物活性增强组分(例如一种基于亮氨酸的基序)的神经毒素的结构修饰，包括缺失或取代所述基于亮氨酸的基序的一个或多个氨基酸。另外，经修饰的神经毒素包括产生一种在所述基于亮氨酸的基序中一个或多个氨基酸缺失或被取代的神经毒素的结构修饰。从预先存在的基于亮氨酸的基序中除去或取代一个或多个氨基酸，有效降低经修饰的神经毒素的生物持久性和/或生物活性。例如，A型肉毒杆菌毒素的基于亮氨酸的基序中的一个或多个氨基酸缺失或取代，降低所述经修饰的神经毒素的生物半寿期和/或生物活性。

在一种生物持久性增强组分中所含有的可供用于氨基酸取代的氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸和其它天然存在的氨基酸以及非标准氨基酸。

在本发明中，已经显示所述天然A型肉毒杆菌毒素轻链以特征性模式定位于分化的PC12细胞膜。显示生物持久性增强组分显著地有助于这种定位。

本发明的数据证明，当将A型肉毒杆菌毒素轻链截短时或者当使所述基于亮氨酸的基序发生突变时，所述轻链基本上丧失以其特征性模式定位于所述膜的能力。认为定位于所述细胞膜在决定肉毒杆菌毒素的生物持久性和/或生物活性方面是一个关键因素。这是因为定位于细胞膜可以保护所述定位蛋白免遭细胞间蛋白质降解。

图1和图2显示，从A型肉毒杆菌毒素轻链中缺失所述基于亮氨酸的基序，可以改变所述A型轻链的膜定位。图1显示分化PC12细胞中GFP-轻链A融合蛋白的定位。采用本领域技术人员众所周知的方法，例如，在Galli等(1998)Mol Biol Cell 9：1437-1448中的所述方法(所述文献通过引用全部结合到本文中)；以及例如在Martinez-Arca等(2000)J Cell Biol 149：889-899中的所述方法(所述文献也通过引用全部结合到本文中)，在分化PC12细胞中产生和显现出GFP融合蛋白。GFP-截短的轻链A的定位示于图2中。比较图1和图2，可以观察到所述定位模式由于构成所述基于亮氨酸的基序的N-未端和C-末端的缺失而完全改变了。图3显示A型肉毒杆菌毒素轻链的氨基酸序列。下划线氨基酸序列指出在所述截短突变体中缺失的氨基酸。所述基于亮氨酸的基序以加星号的括号表示。

在本发明中，为了分析所述基于亮氨酸的基序内的特定氨基酸取代的效应，进行了进一步研究。例如，在一项研究中，使所述基于亮氨酸的基序内的两个亮氨酸残基被丙氨酸残基取代。图4显示用编码该2个亮氨酸改变为2个丙氨酸取代的GFP-肉毒杆菌A轻链的DNA转染的分化PC12细胞的荧光图象。正如所观察到的，在A型肉毒杆菌毒素轻链中于位置427和428的亮氨酸被丙氨酸取代，显著改变了所述轻链的定位特征。

在本发明范围内，存在于轻链上的一种基于亮氨酸的基序或任何其它持久性增强组分和/或一种生物活性增强组分也可以用来保护所述重链。无规卷曲带从A型肉毒杆菌毒素转运结构域中延伸，并且环绕所述轻链。可能当所述轻链位于所述细胞膜时，该带使两个亚单位在所述细胞内保持相互接近。天然A型肉毒杆菌毒素的结构示于图6中。

另外，本发明的数据表明，所述基于亮氨酸的基序使A型肉毒杆菌毒素在所述细胞内紧邻SNAP-25底物定位方面可能是重要的。这可能表明，所述基于亮氨酸的基序不仅在决定所述毒素的半寿期方面是重要的，而且在决定所述毒素的活性方面也是重要的。也就是说，当使所述毒素保持在所述细胞内紧邻SNAP-25底物时，所述毒素将会具有更高的活性。图5显示SNAP-25在分化PC12细胞的水平聚焦切片中的定位(得自Marinez-Arca等(2000)J Cell Biol 149：889-899)。当将图1中观察到的A型肉毒杆菌毒素轻链的定位与图5中观察到的SNAP-25的定位进行比较时，可以观察到所述定位模式的相似性。

本发明的数据清楚地表明，截短所述轻链、从而缺失所述基于亮氨酸的基序，或在所述基于亮氨酸的基序内的氨基酸取代，显著改变了神经细胞中A型肉毒杆菌毒素轻链的膜定位。在截短和取代中，一定百分比的经改变的轻链可以以与所述天然A型轻链不同模式定位于细胞膜(参见图1、图2和图4)。该数据支持存在除基于亮氨酸的基序以外的生物持久性增强组分，例如酪氨酸基序和氨基酸衍生物。在经修饰的神经毒素中应用这些其它生物持久性增强组分和/或生物活性增强组分也在本发明范围内。

在经修饰的神经毒素中联合使用不止一种生物持久性增强组分来改变所述经修饰的神经毒素的生物持久性也在本发明的范围内。本发明也包括在经修饰的神经毒素联合应用不止一种生物活性增强或生物活性降低组分，来改变所述经修饰的神经毒素的生物活性。

作为生物持久性和/或生物活性改变组分的基于酪氨酸的基序也在本发明范围内。基于酪氨酸的基序包含序列Y-X-X-Hy，其中Y为酪氨酸，X为任何氨基酸，而Hy为疏水性氨基酸。基于酪氨酸的基序可以以与基于亮氨酸的基序相似的方式起作用。在图3中，存在于所述A型毒素轻链中的某些酪氨酸基序以括号标注。另外，在图3中以加星号的括号表示的所述基于亮氨酸的基序中发现一个基于酪氨酸的基序。

另外，在本发明范围内，还有包含天然存在于A型肉毒杆菌毒素和B型肉毒杆菌毒素两者中的一种或多种生物持久性改变组分和/或生物活性增强组分的经修饰的神经毒素。

图7显示GFP-B型肉毒杆菌神经毒素轻链在分化的PC12活细胞中的定位。所述B型轻链的定位看来是定位于一种胞内细胞器。对于图2中所示的GFP-截短的A型肉毒杆菌毒素，观察到相似的定位模式。认为所述细胞内肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌毒素轻链的定位在决定所述毒素的生物持久性和/或生物活性方面是一个关键因素。因此，这些数据似乎表明，A型肉毒杆菌毒素和B型肉毒杆菌毒素之间存在共同的生物持久性改变组分和/或生物活性改变组分。这些和其它生物持久性改变组分和生物活性改变组分考虑可依照本发明来使用。

图8显示分别从A型菌株HallA(SEQ ID NO：19)和B型Danish I(SEQ ID NO：20)中分离的A型轻链和B型轻链之间的序列比对。从A型肉毒杆菌毒素和B型肉毒杆菌毒素的其它菌株分离的轻链或重链也可以用于序列比较。阴影氨基酸代表所述链之间的氨基酸同一性或匹配。图8共有序列中的氨基酸位置10和氨基酸位置425之间的每个阴影氨基酸，单独的或与任何其它一种或多种阴影氨基酸一起，代表本发明范围内的生物持久性改变组分。例如，位置19-22的氨基酸KAFK、位置304-306的LNK、位置228的L以及位置95和96的KL、位置346-351的FDKLYK、位置78-81的YL-T、位置73-75的YYD以及位置78和79的YL以及位置81的T、位置297的F以及位置300的I以及位置95和96的KL，可以是用于本发明范围可供使用内的生物持久性改变组分。另外，电荷、疏水性、亲水性和/或可能与保守序列无关的保守二级结构、三级结构或四级结构的保守区在本发明范围内。

作为生物持久性增强组分和/或生物活性增强组分的氨基酸衍生物也在本发明范围内。用来影响生物持久性和/或生物活性的氨基酸衍生物的实例是磷酸化氨基酸。这些氨基酸包括例如被酪氨酸激酶、蛋白激酶C或酪蛋白激酶II磷酸化的氨基酸。作为生物持久性增强组分和/或生物活性增强组分的本发明范围内的其它氨基酸衍生物是肉豆蔻酰化氨基酸和N-糖基化氨基酸。

在本发明一个广泛的方面，提供一种使用经修饰的神经毒素治疗病症的方法。所述病症可以包括例如骨骼肌病症、平滑肌病症、疼痛和腺病。所述经修饰的神经毒素也可以用于化妆品中，例如用来治疗眉部皱纹。

可以用经修饰的神经毒素治疗的神经肌肉疾病和病症包括例如痉挛性发声困难、喉张力障碍、口下颌张力障碍和舌张力障碍、颈张力障碍、病灶性手张力障碍、睑痉挛、斜视、一侧面痉挛、眼睑障碍、痉挛性斜颈、大脑性麻痹、病灶性痉挛和其它发声障碍、痉挛性结肠炎、神经原性膀胱、anismus、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其它肌肉紧张障碍，并且特征为肌肉群不随意运动的其它障碍也可以用本发明的给药方法进行治疗。可以本发明方法和组合物治疗的病症的其它实例是流泪、多汗、唾液分泌过多和胃肠分泌过多以及其它分泌障碍。另外，本发明可以用来治疗皮肤病症例如减少眉部皱纹、减少皮肤皱纹。本发明也可以用来治疗运动损伤。

Borodic的美国专利第5,053,005号公开了使用A型肉毒杆菌毒素治疗青少年脊柱弯曲即脊柱侧凸的方法。Borodic的公开内容通过引用全部结合到本文中。在一个实施方案中，采用与Borodic公开的方法基本相似的方法，可以将经修饰的神经毒素给予哺乳动物、最好是人类，以治疗脊柱弯曲。在一个优选的实施方案中，给予一种包含与一种基于亮氨酸的基序融合的E型肉毒杆菌毒素的经修饰的神经毒素。甚至更优选将一种包含具有与其轻链的羧基末端融合的一种基于亮氨酸的基序的A-E型肉毒杆菌毒素的经修饰的神经毒素给予所述哺乳动物、最好是人类，以治疗脊柱弯曲。

另外，可以采用通常用A型肉毒杆菌毒素实施的众所周知的技术，给予所述经修饰的神经毒素，以治疗其它神经肌肉疾病。例如，本发明可以用来治疗疼痛，例如头痛、因肌肉痉挛引起的疼痛和各种形式的炎性疼痛。例如，Aoki的美国专利第5,721,215号和Aoki的美国专利第6,113,915号公开了用A型肉毒杆菌毒素治疗疼痛的方法。这两个专利的公开内容通过引用全部结合到本文中。

自主神经系统障碍也可以用经修饰的神经毒素进行治疗。例如，腺体功能不良是一种自主神经系统障碍。腺体功能不良包括出汗过多和唾液分泌过多。呼吸功能不良是自主神经系统障碍的另一实例。呼吸功能不良包括慢性阻塞性肺部疾病和哮喘。Sanders等公开了使用天然存在的肉毒杆菌毒素治疗所述自主神经系统、例如治疗诸如出汗过多、唾液分泌过多、哮喘等的自主神经系统障碍的方法。Sander等的公开内容通过引用全部结合到本文中。在一个实施方案中，为了治疗诸如上述自主神经系统障碍，可以采用与Sanders等的方法基本相似的方法，但使用经修饰的神经毒素。例如，可以将一种经修饰的神经毒素局部应用于哺乳动物鼻腔，其给药量足以使控制所述鼻腔内粘液分泌的自主神经系统的胆碱能神经元变性。

可以用经修饰的神经毒素治疗的疼痛包括因肌肉紧张或痉挛引起的疼痛或者与肌肉痉挛无关的疼痛。例如，Binder在美国专利第5,714,468号中公开了，因血管障碍、肌肉紧张、神经痛和神经病引起的头痛可以用天然存在的肉毒杆菌毒素例如A型肉毒杆菌毒素进行治疗。Binder的公开内容通过引用全部结合到本文中。在一个实施方案中，为了治疗头痛、尤其是因血管障碍、肌肉紧张、神经痛和神经病引起的头痛，可以采用与Binder的方法基本相似的方法，但使用经修饰的神经毒素。因肌肉痉挛引起的疼痛也可通过给予一种经修饰的神经毒素进行治疗。例如，可以在所述疼痛/痉挛部位肌内给予与一种基于亮氨酸的基序融合的、最好是在E型肉毒杆菌毒素轻链的羧基末端融合的E型肉毒杆菌毒素。

此外，可以将一种经修饰的神经毒素给予哺乳动物，以治疗与肌肉障碍例如痉挛无关的疼痛。在一个广泛的实施方案中，用来治疗非痉挛相关疼痛的本发明方法包括中枢给予或外周给予所述经修饰的神经毒素。

例如，Foster等在美国专利第5,989,545号公开了可以中枢(鞘内)给予一种与一个靶向部分缀合的肉毒杆菌毒素以缓解疼痛。Foster等的公开内容通过引用全部结合到本文中。在一个实施方案中，为了治疗疼痛，可以采用与Foster等的方法基本相似的方法，但使用按照本发明的所述经修饰的神经毒素。所治疗的疼痛可以是急性疼痛，或者最好是慢性疼痛。

与肌肉痉挛无关的急性或慢性疼痛也可以通过将所述经修饰的神经毒素局部外周给予所述哺乳动物实际的或感知的疼痛位置来缓解。在一个实施方案中，所述经修饰的神经毒素皮下给予所述疼痛位置或其附近，例如伤口或其附近。在另一个实施方案中，将所述经修饰的神经毒素肌内给予所述哺乳动物的疼痛位置或其附近，例如青肿部位或其附近。在另一个实施方案中，将所述经修饰的神经毒素直接注射到哺乳动物关节中，用以治疗或缓解因关节炎性病症引起的疼痛。另外，频繁地重复注射或输注所述经修饰的神经毒素至外周疼痛位置也在本发明范围内。然而，已知本发明的治疗效应长期持续，所以可以不必频繁注射或输注所述神经毒素。例如，本发明的实施可以通过每次注射为人类提供镇痛效应达2个月或更长时间，例如27个月。

虽然不希望将本发明限于任何操作机制或理论，但认为当局部给予所述经修饰的神经毒素至外周位置时，它通过抑制SNARE依赖性胞吐作用来抑制神经递质例如P物质从外周初级感觉末梢的释放。由于外周初级感觉末梢释放P物质，可能引起或至少放大疼痛传递过程，因此，抑制其在外周初级感觉末梢的释放将减弱来自达到大脑的疼痛信号的传递。

本发明经修饰的神经毒素除了在外周位置有药理作用之外，也可以在直接鞘内给予(如在美国专利5,113,915中所述)时或在外周给予时而在中枢神经系统中有抑制效应，其中推测所述经修饰的神经毒素通过初级感觉传入通过逆向运输发挥作用。该逆向轴突运输假说得到以下公布数据的支持：所述数据表明，当外周注射A型肉毒杆菌毒素时，所述神经毒素可以逆向运输至背角。因此，Weigand等，Nauny-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1976；292，161-165和Habermann，Nauny-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1974；281，47-56的研究表明，肉毒杆菌毒素能够通过逆向运输上行至脊髓区。因此，可以预期，在外周位置(例如肌内)注射在所述基于亮氨酸的基序中一个或多个氨基酸发生突变的经修饰的神经毒素例如A型肉毒杆菌毒素可以从所述外周初级感觉末梢逆向运输至中枢区。

所述经修饰的神经毒素的给药量可以根据待治疗的特定疾病、其严重程度和其它各种患者的变量(包括身高、体重、年龄和对治疗的反应)而在大范围内变动。一般而言，经修饰的神经毒素的给药剂量将随待治疗哺乳动物、最好是人的年龄、出现的病症和体重而变。也会考虑所述经修饰的神经毒素的功效。

假设在人类患者中并且每人平均体重为75kg时，经修饰的神经毒素(对于A型肉毒杆菌毒素)的功效基本上等同于LD₅₀＝2,730U，则所述经修饰的神经毒素(对于A型肉毒杆菌毒素)的致死量约为36U/kg。因此，当给予具有这种LD₅₀的经修饰的神经毒素时，适合于给予人类受治疗者低于36U/kg的所述经修饰的神经毒素。优选给予约0.01U/kg-30U/kg的所述经修饰的神经毒素。更优选给予约1U/kg至约15U/kg的所述经修饰的神经毒素。甚至更优选给予约5U/kg至约10U/kg经修饰的神经毒素。一般而言，所述经修饰的神经毒素作为组合物以基本上等同于约2.5cc/100U的剂量给予。本领域技术人员将会知道或者可以容易地确定，如何调节较高或较低功效的神经毒素的这些剂量。已知B型肉毒杆菌毒素可以以约50倍于A型肉毒杆菌毒素用量水平给予，以达到相似的治疗效应。因此，对于B型肉毒杆菌毒素，上述单位用量可以被放大约50倍。

尽管提供了给药途径和剂量的实例，但一般对于某个病例，由主治医师根据病例来确定合适的给药途径和剂量。这类决定对于本领域技术人员而言是常规技术(参见例如，Harrison′s Principles of InternalMedicine(1998)，Anthony Fauci等编著，第14版，McGraw Hill出版)。例如，依照公开的本发明经修饰的神经毒素的给药途径和剂量可以根据例如所选经修饰的神经毒素的溶解特性以及所治疗疾病类型的标准来选择。

采用本领域众所周知的常规化学方法，通过将所述基于亮氨酸的基序与一种神经毒素化学连接，可以生产所述经修饰的神经毒素。例如，E型肉毒杆菌毒素可以通过下述方法获得：依照已知方法建立肉毒梭菌培养物，让其在发酵罐中生长，然后收获并纯化所述发酵混合物。

也可以用重组技术生产所述经修饰的神经毒素。重组技术最好用于生产具有来源于不同梭菌种的氨基酸序列区或具有经修饰的氨基酸序列区的神经毒素。另外，所述重组技术在生产具有通过缺失修饰的所述基于亮氨酸的基序的A型肉毒杆菌毒素时是优选的。所述技术包括下述步骤：从天然来源或合成来源获得遗传物质，所述遗传物质编码一个细胞结合部分、一个有效转运所述神经毒素或其部分的氨基酸序列和一个被释放到靶细胞(最好是神经元)的胞质中时具有治疗活性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案，所述遗传物质编码所述生物持久性增强组分、最好是所述基于亮氨酸的基序、梭菌神经毒素的H_C、H_N和轻链及其片段。通过首先将所述遗传构建体与一种克隆载体(例如噬菌体或质粒)融合，将所述遗传构建体掺入宿主细胞中以进行扩增。然后将所述克隆载体插入到宿主例如梭菌、大肠杆菌或其它原核生物、酵母、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系中。在所述重组基因在宿主细胞中表达后，可以采用常规技术分离所产生的蛋白质。

重组生产这些经修饰的神经毒素有许多好处。例如，为了制备经修饰的神经毒素，必须将一个修饰性片段或组分连接或插入到神经毒素中。用厌氧梭菌培养物生产神经毒素是一种烦琐且费时的方法，包括涉及几个蛋白沉淀步骤和或者延长且重复结晶所述毒素或者几个柱层析阶段的多步骤纯化方法。重要的是，产物的高毒性要求所述方法必须在严格防范下进行(BL-3)。在发酵过程中，内源梭菌蛋白酶通过所谓产生缺口的过程产生双链，活化经折叠的单链神经毒素。同时，产生缺口的过程涉及从单链中除去大约10个氨基酸残基，产生其中两条链仍通过链内二硫键共价连接的双链形式。

有缺口的神经毒素比无缺口形式的活性高得多。缺口的量和精确位置随生产所述毒素的细菌的血清型而变。单链神经毒素活化的差异以及因此有缺口毒素的产量的差异是由于特定菌株所产生的蛋白水解酶活性的血清型和量的变异引起的。例如，99％以上的A血清型肉毒梭菌单链神经毒素被Hall A肉毒梭菌菌株活化，而B血清型和E血清型菌株产生活化量较低(根据发酵时间为0-75％)的毒素。因此，成熟神经毒素的高毒性在作为治疗药的神经毒素的商业生产中起重要作用。

因此，工程梭菌毒素的活化度是生产这些物质的一个重要考虑因素。如果神经毒素(例如肉毒杆菌毒素和破伤风毒素)能够在快速生长的细菌(例如异源大肠杆菌细胞)中作为相对无毒性单链(或毒性降低的单链)高产量地重组表达，然后将其安全、容易地分离并且简单地转化为全活性形式，则将会有很大的优势。

由于安全性是首要关注的因素，因此先前的研究集中于在大肠杆菌中表达并且纯化破伤风毒素和肉毒杆菌毒素的各个H链和轻链；这些分离的链本身是元毒的；参见Li等，Biochemistry 33：7014-7020(1994)；Zhou等，Biochemistry 34：15175-15181(1995)，所述文献通过引用结合到本文中。在分别生产这些肽链后，可以在严格控制的条件下通过氧化二硫键，使所述H链和轻链结合，形成神经麻痹性双链。

实施例

以下非限制性实施例为本领域技术人员提供了本发明范围内的治疗非痉挛相关疼痛的具体优选方法，但这些实施例不是限制本发明范围。

实施例1

治疗与肌肉障碍相关的疼痛

一位不幸的36岁妇女患有的颞下颌关节病和沿咬肌和颞肌的慢性疼痛有15年病史。在评价之前15年，她注意到与疼痛相关的颌骨和张-合用的颌骨的不动性增加并且沿她的每侧面部触痛。左侧最初被认为比右侧情况更糟。她被诊断为患有下颌关节(TMJ)机能障碍伴有所述关节的不全脱位，已用外科矫形(orthoplasty)半月板切下术和髁切除术进行治疗。

手术后，她一直难以张-合她的颌骨，为此，几年后，在其双侧上进行一次置换假关节的手术。手术后，跟着发生进行性痉挛和颌骨偏斜。第一次手术后进行再一次手术矫正，以矫正假关节松动。在这些手术后，她的颌骨一直表现为相当痛和不活动性。TMJ仍然触痛以及肌肉本身触痛。在颞下颌关节上有多个触痛点以及整块肌肉紧张增加。她被诊断为患有术后肌筋膜疼痛综合征，在她的咬肌和颞肌中注射所述经修饰的神经毒素；所述经修饰的神经毒素是包含一种基于亮氨酸的基序的E型肉毒杆菌毒素。具体的给药剂量以及频率取决于有经验的主治医师技术范围内的各种各样的因素。

注射后几天，她注意到在其疼痛方面有显著改善，并且报告她的颌骨感觉比以前松。这在2-3周内逐渐改善，在此期间，她注意到张开颌骨的能力增加并且疼痛减轻。该患者陈述，疼痛比近4年来任何时间都好转。在初次注射所述经修饰的神经毒素后，病症改善的持续时间长达27个月。

实施例2

治疗脊髓损伤后的疼痛

一位正经历脊髓损伤后疼痛的39岁患者例如通过腰椎穿刺或通过导管插入术(用于输注)鞘内给予所述经修饰的神经毒素至脊髓进行治疗；所述经修饰的神经毒素是包含一种基于亮氨酸的基序的E型肉毒杆菌毒素。如前所述，具体的毒素剂量和注射部位以及毒素给药频率取决于有经验的主治医师技术范围内的各种各样的因素。在给予所述经修饰的神经毒素后约1天至约7天内，患者的疼痛得到显著缓解。疼痛缓解的持续时间长达27个月。

实施例3

外周给予经修饰的神经毒素以治疗“肩-手综合征”

肩、臂和手部位的疼痛可以因肌营养不良、骨质疏松和关节固定而发生。尽管在冠状动脉闭锁不全后最常见，但是该综合征可以因颈骨关节炎或局部性肩部疾病或在要求患者较长时间卧床休息的任何疾病后而发生。

一位46岁的妇女患有肩-手综合征类型的疼痛。该疼痛具体位于三角肌区。该患者通过在肩部大剂量皮下注射一种经修饰的神经毒素进行治疗；所述经修饰的神经毒素最好是包含一种基于亮氨酸的基序的E型肉毒杆菌毒素。所述经修饰的神经毒素也可以是例如包含一种基于亮氨酸的基序、经修饰的A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素。如前所述，具体的给药剂量以及频率取决于有经验的主治医师技术范围内的各种各样的因素。在给予经修饰的神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。疼痛缓解的持续时间约为7-27个月。

实施例4

外周给予经修饰的神经毒素以治疗治疗后神经痛

治疗后神经痛是最为难治的慢性疼痛问题之一。经历这种折磨人的痛苦过程的患者常常是老年人，患有致虚弱性疾病，并且不适于主要的干涉操作。根据疤疹愈合病灶的外观以及患者的病史，可容易地进行诊断。所述疼痛是强烈的，并且在情感上是痛苦的。治疗后神经痛可以在任何部位发生，但最常发生于胸部。

一位76岁男性患有治疗后类型的疼痛。这种疼痛局限于腹部。该患者通过在腹部大剂量皮内注射一种经修饰的神经毒素进行治疗；所述经修饰的神经毒素是例如A、B、C1、C2、D、E、F和/或G型肉毒杆菌毒素。所述经修饰的神经毒素包含一种基于亮氨酸的基序和/或额外的基于酪氨酸的基序。如前所述，具体的给药剂量以及频率取决于有经验的主治医师技术范围内的各种各样的因素。在给予经修饰的神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。疼痛缓解的持续时间约为7-27个月。

实施例5

外周给予经修饰的神经毒素以治疗鼻咽肿瘤疼痛

这些肿瘤最通常是鳞状细胞癌，通常位于咽隐窝中，并且可以侵袭颅底。面部的疼痛是常见的。其性质上是时常的钝痛。

一位35岁男性患有鼻咽肿瘤类型的疼痛。发现在左颊下部疼痛。该患者通过在所述颊部大剂量肌内注射一种经修饰的神经毒素进行治疗，所述经修饰的神经毒素最好是包含额外的生物持久性增强氨基酸衍生物例如磷酸化酪氨酸的A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素。具体的给药剂量以及频率取决于有经验的主治医师技术范围内的各种各样的因素。在给予经修饰的神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。疼痛缓解的持续时间约为7-27个月。

实施例6

外周给予经修饰的神经毒素以治疗炎性疼痛

一位45岁患者在胸部有炎性疼痛。该患者通过在所述胸部大剂量肌内注射一种经修饰的神经毒素进行治疗，所述经修饰的神经毒素最好是包含额外的基于酪氨酸的基序的A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素。如前所述，具体的给药剂量以及频率取决于有经验的主治医师技术范围内的各种各样的因素。在给予经修饰的神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。疼痛缓解的持续时间约为7-27个月。

实施例7

治疗出汗过多

一位65岁一侧出汗过多的男性患者通过给予一种经修饰的神经毒素进行治疗。给药剂量和频率取决于所需效应的程度。所述经修饰的神经毒素最好是A、B、C1、C2、D、E、F和/或G型肉毒杆菌毒素。所述经修饰的神经毒素包含一种基于亮氨酸的基序。所述给药是给予腺体神经丛、神经节、脊髓或中枢神经系统。具体的给药部位根据主治医师对靶腺体和分泌细胞解剖学和生理学的了解来决定。另外，在合适的脊髓水平或脑区注射所述毒素。在所述经修饰的神经毒素治疗后，出汗过多停止长达27个月。

实施例8

手术后治疗

一位22岁妇女患者撕裂肩腱并且经过修复肩腱的矫形手术。手术后，该患者在肩部肌内给予一种经修饰的神经毒素。所述经修饰的神经毒素可以是A、B、C、D、E、F和/或G型肉毒杆菌毒素，其中一种生物持久性增强组分的一个或多个氨基酸从所述毒素中缺失。例如，可以使一个或多个亮氨酸残基从A血清型肉毒杆菌毒素中的基于亮氨酸的基序中缺失和/或突变。或者，所述基于亮氨酸的基序中的一个或多个氨基酸可以被其它氨基酸取代。例如，所述基于亮氨酸的基序中的两个亮氨酸可以被丙氨酸取代。具体的给药剂量以及频率取决于有经验的主治医师技术范围内的各种各样的因素。具体的给药部位根据主治医师对于肌肉解剖学和生理学的了解来决定。所给予的经修饰的神经毒素减少臂部运动，有利于术后恢复。所述经修饰的神经毒素的效应持续约5周或更短时间。

实施例9

肉毒杆菌神经毒素轻链基因的克隆、表达和纯化

该实施例描述了克隆和表达编码肉毒杆菌毒素轻链的DNA核苷酸序列以及纯化所产生的蛋白质产物的方法。编码肉毒杆菌毒素轻链的DNA序列可以通过PCR方法进行扩增，所述PCR方法采用具有对应于所述轻链基因5′和3′末端区的序列的合成寡核苷酸。引物的设计可供用于在所述肉毒杆菌毒素轻链基因PCR产物的5′和3′端引入多个限制位点，例如Stu I和EcoR I限制位点。这些限制位点可以随后用来促进所述扩增产物的单向亚克隆。另外，这些引物可以在所述轻链编码序列C末端引入一个终止密码子。来源于肉毒梭菌(C.botulinum)例如菌株HallA的染色体DNA在所述扩增反应中可以作为模板使用。

所述PCR扩增可以在含有以下组分的0.1mL体积中进行：10mMTris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、各0.2mM的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、各50pmol的引物、200ng基因组DNA和2.5单位的Tag DNA聚合酶。所述反应混合物可以经过变性(94℃1分钟)、退火(55℃2分钟)和聚合(72℃2分钟)的35个循环。最后，所述反应可以于72℃再延伸5分钟。

所述PCR扩增产物可以用例如Stu I和EcoR I消化，释放编码轻链的克隆化PCR DNA片段。然后，该片段可以通过例如琼脂糖凝胶电泳纯化，将其连接到例如Sma I和EcoR I消化的pBluescript II SK噬菌粒中。带有该重组噬菌粒的细菌转化体例如大肠杆菌可以通过标准方法例如蓝色/白色筛选来鉴定。包含所述轻链编码DNA的克隆可以通过用标准方法进行的DNA序列分析来鉴定。所述克隆化序列可以通过将所述克隆化序列与肉毒杆菌轻链的公布序列进行比较来加以证实，所述公布序列例如Binz等(J.Biol.Chem.265，9153(1990))、Thomson等(Eur.J.Biochem.189，73(1990))和Minton(ClostridialNeurotoxins，The Molecular Pathogenesis of Tetanus and Botulism，第161-191页，C.Motecucco编著(1995))的公布序列。

可以将所述轻链亚克隆至一种表达载体例如pMal-P2中。pMal-P2带有由强诱导型启动子P_tac控制的、编码MBP(麦芽糖结合蛋白)的malE基因。

为了证实所述肉毒杆菌毒素轻链的表达，可以用带有含轻链基因的pMal-P2的充分分离的细菌菌落，接种含有0.1mg/ml氨苄青霉素和2％(w/v)葡萄糖的L-肉汤，让其于30℃震荡生长过夜。过夜培养物在含有0.1mg/ml氨苄青霉素的新鲜L-肉汤中以1∶10稀释，然后保温2小时。可以通过加入IPTG至终浓度0.1mM，诱导融合蛋白表述。于30℃再保温4小时后，可以通过以6,000xg离心10分钟收集细菌。

小规模SDS-PAGE分析可以证实来源于IPTG诱导的细菌样品中的90kDa蛋白条带的存在。该分子量与具有MBP(～40kDa)和肉毒杆菌毒素轻链(～50kDa)组分的融合蛋白的预测大小一致。

可以采用Cenci di Bello等，Eur.J.Biochem.219，161(1993)中所述的多克隆抗L链探针，通过蛋白质印迹法证实在IPTG诱导的细菌提取物中存在所需融合蛋白。PVDF膜(Pharmacia；Milton Keynes，UK)上的反应性条带可以采用与辣根过氧化物酶缀合的抗兔免疫球蛋白(BioRad；Hemel Hempstead，UK)和ECL检测系统(Amersham，UK)来显现。蛋白质印迹法的结果通常证实主要融合蛋白条带以及对应于分子量比全长融合蛋白低的数种模糊蛋白条带的存在。这一观测结果表明，在所述细菌中或在所述分离过程中发生所述融合蛋白的有限降解。

为了产生亚克隆化轻链，可以将得自1升表达所述野生型肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白的细菌培养物的沉淀重悬于含有1mM苯甲磺酰氯(PMSF)和10mM苯甲脒的柱缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，200mM NaCl，1mM EGTA和1mM DTT]中，通过超声处理裂解。可以通过以15,000x g于4℃离心15分钟，使裂解液变得澄清。将上清液上样到直链淀粉亲和柱[2x10cm，30ml树脂](New England BioLabs；Hitchin，UK)。未结合的蛋白可以用柱缓冲液从所述树脂洗出，直到通过于280nm的稳定吸光度读数判断洗出物不含蛋白质为止。结合的MBP-L链融合蛋白可以随后用含有10mM麦芽糖的柱缓冲液洗脱。可以将含有所述融合蛋白的流分合并，对补充150mM NaCl、2mM CaCl2和1mM DTT的20mM Tris-HCl(pH 8.0)于4℃透析72小时。

MBP-L链融合蛋白可以在从所述宿主细菌释放后纯化。从所述细菌释放可以通过酶促降解或机械破碎所述细菌细胞膜来完成。可以用直链淀粉亲和层析进行纯化。重组野生型或突变型轻链可以通过用因子Xa进行定点切割，从所述融合蛋白的糖结合结构域中分离出来。该切割操作通常产生游离MBP、游离轻链和少量未切割的融合蛋白。尽管所产生的存在于这类混合物中的轻链可以显示具有所需活性，但是可使用一个额外的纯化步骤。例如，所述切割产物的混合物可以上样到结合MBP和未切割的融合蛋白两者的第二直链淀粉亲和柱。游离轻链可以在流通流分中分离出来。

实施例10

天然轻链、重组野生型轻链与纯化重链的重建

可以将天然重链和轻链用2M尿素与BoNT解离，用100mM DTT还原，然后依照已建立的层析方法进行纯化。例如Kozaki等(1981，Japan J.Med.Sci.Biol.34，61)和Maisey等(1988，Eur.J.Biochem.177，683)。可以将纯化重链与等摩尔量的或者天然轻链或者重组轻链混合。重建可以通过将所述样品对由25mM Tris(pH 8.0)、50μM乙酸锌和150mM NaCl组成的缓冲液于4℃透析4天来进行。透析后，重组轻链和天然重链的缔合形成二硫键连接的150kDa双链通过SDS-PAGE监测和/或通过光密度扫描定量。

实施例11

生物持久性增强的经修饰的神经毒素的生产

经修饰的神经毒素可以通过采用重组技术结合常规化学技术一起来生产。

将与一种生物持久性增强组分融合以形成经修饰的神经毒素的神经毒素链例如肉毒杆菌毒素轻链，可以如实施例9所述方法通过重组方法生产和纯化。

得自所述重组技术的重组神经毒素链可以与一种生物持久性增强组分例如一种基于亮氨酸的基序、一种基于酪氨酸的基序和/或一种氨基酸衍生物共价融合(或偶联)。正如本领域技术人员知道的，包含生物持久性增强组分的肽序列可以通过标准t-Boc/Fmoc技术在溶液或固相中合成。类似的合成技术也包括在本发明范围内，例如Milton等(1992，Biochemistry 31，8799-8809)和Swain等(1993，Peptide Research 6，147-154)中所用的方法。可以将一种或多种合成生物持久性增强组分与A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素轻链在例如所述毒素的羧基末端融合。所述生物持久性增强组分的融合采用本领域技术人员已知的试剂和技术例如PDPH/EDAC和Traut的试剂化学通过偶联来完成。

或者，可以无需将所述生物持久性增强组分与重组肉毒杆菌毒素链融合的步骤，而通过重组方法生产经修饰的神经毒素。例如，可以生产具有一种生物持久性增强组分例如一种基于亮氨酸的基序、一种基于酪氨酸的基序和/或一种氨基酸衍生物的重组神经毒素链，例如得自实施例9重组技术的肉毒杆菌毒素轻链。例如，可以在编码A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素轻链的DNA序列中加入编码生物持久性增强组分的一种或多种DNA序列。这种添加可以通过本领域技未人员熟悉的用于定点诱变的任何方法来进行。

含有所述融合或添加的生物持久性增强组分的重组修饰的轻链可以通过实施例10中的所述方法与神经毒素重链一起重建，从而生产完整的经修饰的神经毒素。

依照该实施例生产的经修饰的神经毒素具有增强的生物持久性。相对于无所述额外的生物持久性增强组分的相同神经毒素而言，所述生物持久性最好增强约20％至约300％。

实施例12

生物持久性降低的经修饰的神经毒素的生产

生物持久性降低的经修饰的神经毒素可以通过采用重组技术来生产。例如，可以生产得自实施例9重组技术的肉毒杆菌毒素轻链，但无生物持久性增强组分。例如，可以使一种或多种基于亮氨酸的基序、基于酪氨酸的基序和/或氨基酸衍生物发生突变。例如，可以从编码A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素轻链的DNA序列中除去编码生物持久性增强组分的一种或多种DNA序列。例如，可以从编码A型肉毒杆菌毒素轻链的DNA序列中除去编码所述基于亮氨酸的基序的DNA序列。所述DNA序列的除去可以通过本领域技术人员熟悉的任何方法来进行。

通过实施例10中的所述方法，可以将缺失了所述生物持久性增强组分的重组修饰的轻链与神经毒素重链一起重建，从而生产完整的经修饰的神经毒素。

依照该实施例生产的经修饰的神经毒素的生物持久性降低。相对于具有所述基于亮氨酸的基序的相同神经毒素例如A型肉毒杆菌毒素而言，所述生物持久性最好降低约20％至约300％。

尽管已经在某些优选方法方面详细描述了本发明，但在本发明范围内的其它实施方案、形式和修改都是可行的。例如，各种各样的经修饰的神经毒素可以有效地用于本发明方法，来取代梭菌神经毒素。另外，对应于所述经修饰的神经毒素的遗传密码即DNA序列也认为是本发明的一部分。另外，本发明包括外周给药法，其中两种或更多种经修饰的神经毒素(例如具有融合的基于亮氨酸的基序的E型肉毒杆菌毒素和包含基于亮氨酸的基序的B型肉毒杆菌毒素)可以同时或连续给予。尽管在各种具体的实施例和实施方案方面详细描述了本发明，但不用说本发明不限于所述实施例和实施方案，在以下权利要求书的范围内，可以用不同的方式来实施本发明。

实施例13

生物持久性降低的经修饰的神经毒素的生产

定位于所述细胞膜在决定肉毒杆菌毒素的生物持久性方面可能是一个关键因素。这是因为定位于细胞膜可以保护已定位的蛋白免受胞间蛋白降解复合体的作用。

众所周知并且一般认为，B型肉毒杆菌神经毒素的生物持久性比A型肉毒杆菌神经毒素的生物持久性短。在该项研究中，证明当A型肉毒杆菌毒素轻链被截短，包括除去所述基于亮氨酸的基序时，所述轻链基本上丧失了以其特征性模式定位于细胞膜的能力。事实上，截短的A型轻链以与B型肉毒杆菌毒素轻链模式相似的模式定位于所述细胞膜。

因此，可以假设，截短的A型肉毒杆菌毒素的生物持久性降低和/或生物活性降低，而与B型肉毒杆菌毒素的生物持久性和/或生物活性相似。

实施例14

具有改变的生物持久性的经修饰的神经毒素的生产

在该项研究中，证明当A型肉毒杆菌毒素轻链发生突变、位置427和428的两个亮氨酸被改变为丙氨酸(图3)时，所述轻链基本上丧失了以其特征性模式定位于细胞膜的能力。

根据该数据，可以得出的结论是，所述突变的A型肉毒杆菌毒具有改变的生物持久性。

实施例15

截短的LC/A对SNAP 25的体外切割

如图9所示，本发明人进行体外ELISA测定，证明截短的LC/A体外切割SNAP-25底物的效率低于未截短的LC/A。所示数据不是抑制胞吐作用的测量结果，而是体外形成SNAP-25切割的测量结果。所述分析如下进行：

材料：

BirA-SNAP25_128-206-这是一种LC/A的重组底物，由与SNAP25残基128-206的N末端融合的BirA信号序列组成。该融合构建体在大肠杆菌中产生，并且BirA信号序列被大肠杆菌生物素化。用链霉抗生物素蛋白包被微量滴定板。所用的毒素是BoNT/A复合体或LC/A构建体。第一抗体是抗SNAP25₁₉₇抗体。该抗体识别被A型毒素切割后的SNAP25(BirA-SNAP25_128-197)的C末端。第二抗体是与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG。免疫纯的TMB底物得自Pierce，是一种辣根过氧化物酶的显色底物。识别切割产物SNAP25₁₉₇的抗体对该切割产物有特异性，而不识别未经切割的全长底物SNAP25₂₀₆。

方法：

BirA-SNAP25_128-206与微量滴定板上的链霉抗生物素蛋白结合。向所述板中加入连续稀释的BoNT/A 900kDa复合体、His6-S-天然LC/A或His6-S-截短的LC/A-His6。所有毒素样品预先与DTT一起温育(这一步骤不是LC/A构建体所需的，但它们与BoNT/A复合体一样进行处理)。所述毒素样品与所述底物一起于37℃温育90分钟。除去所述毒素，将结合的底物与抗SNAP25₁₉₇抗体一起温育。洗去未结合的抗体，然后将所述板与第二抗体(与辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG)一起温育。再次洗去未结合的抗体，进行辣根过氧化物酶的比色测定。所述测定通过于450nm读出吸光度进行定量。

在本文公开的、本发明人的其它研究中，在PC-12细胞中表达的轻链构建体直接在PC-12细胞中表达并且不含任何标志。用于这些体外测定、已从大肠杆菌表达的轻链构建体含有供纯化目的用的亲和标志(这些标志在PC-12细胞中表达的蛋白上不存在，如本文公开内容所述)。在PC12中表达的LC/A是融合蛋白GFP-LC/A。在GFP和LC/A之间有一组Gly，以分隔这两种蛋白质。

各种构建体的解释如下：

复合体(图中红色部分)-这是一种从肉毒梭菌中分离的BoNT/A900kDa复合体。

截短的LC/A-在N末端缺少8个氨基酸并且在C末端缺少22个氨基酸的构建体。然而，该构建体在N末端含有一个六组氨酸和S-标志以及在C末端含有六组氨酸标志。

经透析的截短LC/A-与截短的LC/A一样，但从纯化步骤中产生的咪唑已被除去。

全长LC/A(图中深绿色部分)-天然LC/A构建体(全长)，但含有N末端六组氨酸和S-标志。不具有C末端六组氨酸。

经透析的全长LC/A(图中浅绿色部分)-与全长LC/A一样，但从纯化步骤中产生的咪唑已被除去。

为了用图示法描绘这些差异，图10显示这些构建体的N末端和C末端(未显示LC/A蛋白的中间部分)。被称为野生型的，相当于本发明人在PC-12细胞中直接表达的天然LC/A(这是本发明人通过蛋白质印迹分析所述SNAP25切割产物证明活性的构建体)。截短的LC/A是含有所述His和S-标志的截短的轻链。在图9中，N-His-LC/A被称为全长LC/A。

序列表

<110>STEWARD，LANCE E

FERNANDEZ-SALAS，ESTER

HERRINGTON，TODD M

AOKI，KEI R

<120>基于亮氨酸的基序和梭菌神经毒素

<130>D-2885CIP

<150>US 09/620,840

<151>2000-07-21

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(5)

<223>Description of Artificial Sequence；fragment having prope

rties su

bstantially similar to that of leucine based sequence

x may be any amino acid or derivatives thereof

<400>1

Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Leu

1 5

<210>2

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Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Leu Leu

1 5

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1 5

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<213>Unknown

<220>

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<400>7

Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu

1 5

<210>8

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<213>rat

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1 5

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<213>mouse

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1 5

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<211>7

<212>PRT

<213>frog

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1 5

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<211>7

<212>PRT

<213>chicken

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1 5

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<211>7

<212>PRT

<213>sheep

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1 5

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<211>7

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5

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<211>7

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>7

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu

1 5

<210>19

<211>437

<212>PRT

<213>Clostridium botulinum

<400>19

Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly Val

1 5 10 15

Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro Val

20 25 30

Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg Asp

35 40 45

Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu Ala

50 55 60

Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu Arg

85 90 95

Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val Arg

100 105 110

Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys Val

115 120 125

Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr Arg

130 135 140

Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile Ile

145 150 155 160

Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr Arg

165 170 175

Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr

180 185 190

Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu Gly

195 200 205

Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu Leu

210 215 220

Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn Arg

225 230 235 240

Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu

245 250 255

Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe

260 265 270

Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys

275 280 285

Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val Gly

290 295 300

Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys Tyr

305 310 315 320

Leu Leu Ser Glu Asn Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu Lys

325 330 335

Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp Asn

340 345 350

Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe

355 360 365

Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr Thr

370 375 380

Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe

385 390 395 400

Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys

405 410 415

Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg Gly

420 425 430

Ile Ile Thr Ser Lys

435

<210>20

<211>441

<212>PRT

<213>Clostridium botulinum

<400>20

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145 150 155 160

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

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405 410 415

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<210>21

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Description of Artificial Sequence：fragment having

properties substantially similar to leucine based motif

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(5)

<223>Description of Artificial Sequence：fragment having

properties substantially similar to leucine based motif

<400>21

xExxxIL

<210>22

<211>7

<212>PRT

<213>S.cerevisiae Vam3p

<400>22

NEQSPLL

Claims

1.一种经修饰的肉毒杆菌神经毒素，所述神经毒素除了天然存在的基于亮氨酸的基序SEQ ID NO：7外包含一种或几种附加的基于亮氨酸的基序，其中所述附加的基于亮氨酸的基序包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：21，并且所述附加的基于亮氨酸的基序提高经修饰的肉毒杆菌神经毒素的半寿期。

2.权利要求1的经修饰的肉毒杆菌神经毒素，其中所述神经毒素是经修饰的A、B、C₁、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素或它们的杂种。

3.权利要求1的经修饰的肉毒杆菌神经毒素，其中所述神经毒素是经修饰的A型肉毒杆菌毒素。

4.权利要求1、2或3的经修饰的肉毒杆菌神经毒素，其中附加的基于亮氨酸的基序是SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22。

5.权利要求4的经修饰的肉毒杆菌神经毒素，其中附加的基于亮氨酸的基序是SEQ ID NO：7。

6.一种经修饰的A型肉毒杆菌神经毒素，其中所述修饰是基于亮氨酸的基序SEQ ID NO：7从天然存在的包含SEQ ID NO：7的A型肉毒杆菌神经毒素的氨基酸序列中缺失。

7.权利要求1-6中任一项的经修饰的肉毒杆菌神经毒素在制备用于治疗神经肌肉疾病、自主性障碍或疼痛的药物中的用途。

8.权利要求7的用途，其中所述病症选自痉挛性发声困难、喉张力障碍、口下颌张力障碍、舌张力障碍、颈张力障碍、病灶性手张力障碍、睑痉挛、斜视、一侧面痉挛、眼睑障碍、大脑性麻痹、病灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经原性膀胱、anismus、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难、流泪、多汗、唾液分泌过多、胃肠分泌过多、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛、眉部皱纹和皮肤皱纹。