CN100467594C - 细胞生长表面的制法 - Google Patents

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CN100467594C CNB2006100931206A CN200610093120A CN100467594C CN 100467594 C CN100467594 C CN 100467594C CN B2006100931206 A CNB2006100931206 A CN B2006100931206A CN 200610093120 A CN200610093120 A CN 200610093120A CN 100467594 C CN100467594 C CN 100467594C
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Abstract

本发明提供一种细胞生长表面的制法，包含由藻素酸形成三维多孔隙生长表面，该三维多孔隙生长表面具提高提供细胞增生的表面积、增强细胞贴附能力、被固定度和增殖速度、维持表面结构完整性、激活可程控降解多孔隙生长表面等特性，通过三维多孔隙生长表面，细胞产量随之增加；还提供了多种细胞生长表面的制法，包含用坚硬支撑物保护生长表面完整性、用来增强细胞生长表面效能以及表面改质以提供真核或原核细胞生长的方法，包含利用设多孔隙和三维结构增加生长表面区域、处理生长表面促进细胞贴附、增强细胞增生和扩散、置生长表面于细胞培养组件，该生长表面具有可程控降解和培养结束后释放细胞/组织的特性。

Description

细胞生长表面的制法
技术领域
本发明提供一种生长表面、细胞培养的结构和制造方法，特别是一种可大量收获细胞的生长表面、细胞培养的制造方法。
背景技术
生物科技及基因工程的革命性进步创造了细胞产品的高市场需求，诸如蛋白质药物、细胞激素(cytokines)、干扰素(interferon)、单细胞繁殖抗体(monoclonal antibodies)、荷尔蒙、生长因子、胰岛素(insulin)、病毒性产品、疫苗(vaccines)、核酸(nucleic acids)、酵素(enzymes)以及移植细胞或移植组织等。该产品的市场需求因此带动了对经济、有效的大规模生产方法的需求。
真核细胞(Eukaryotic cells)，例如哺乳动物的细胞，应用在生产高品质的蛋白质产品已经越来越普遍，利用培养哺乳动物细胞来生产疫苗、基因工程蛋白质、药物和其它细胞产品的方法已持续很长一段时间；一般来说，真核细胞分为贴附依赖性细胞(anchorage-dependent)、非贴附依赖性细胞(anchorage-independent)、或两者皆是；然而，真核细胞通常为贴附依赖性细胞，因此需要一生长表面(growth surface)使之固定、增生、以及制造出所需的蛋白质产品；贴附依赖性细胞例如有:纤维组织母细胞(fibroblasts)、上皮细胞(epithelial cells)及内皮细胞(endothelial cells)；真核细胞当中的淋巴细胞(lymphocytes)、某些型变(transformed)细胞和癌细胞为非贴附依赖性细胞，可悬浮生长不需依赖某支撑物；不论真核细胞为贴附依赖性细胞或非贴附依赖性细胞或两者皆是，大部分的真核细胞在培养过程中有下述共同特点，且该特点在设计有效生长表面及培养组件时，扮演着重要的角色。
在所有类型的培养技术当中，包含但不限制于传统的单层(mono-layer)培养或利用载体(carrier)培养或微载体系统，贴附依赖性细胞中用来贴附附的生长表面对细胞活性是重要关键和基础，由于贴附依赖性细胞的增殖(proliferation)只会于贴附在一适当的生长表面之后发生，因此使用一可增强细胞贴附度的表面和培养程序为一相当重要的课题；细胞贴附包含:贴附因子的吸附，比方说蛋白质贴附于一培养表面、透过培养生长表面与细胞接触、细胞贴附于一处理过且适合细胞贴附的表面、细胞的延展及复制增生使其遍及于一生长表面上的各处，直到这些细胞接触到其它的培养(surface-growing)细胞为止(亦即所谓的抑制接触(contact inhibition))。
可实行的贴附依赖性细胞培养，必须包含一个适当的培养生长表面或载体、可提供不同种类细胞循环性培养的培养基的机械结构，以及可供给足够气体以支撑和维持细胞生长的适当环境；培养细胞有多种不同的方法，其中包含于培养的过程当中除了氧气之外，不再补充培养液的批次系统(batchsystem)；以及滋养物和氧气(feed)被监控且于必要时会再补充的馈料批次系统(fed-batch)；以及滋养物和废弃物被监控又不间断地填充新鲜的培养基的灌流系统(perfusion system)。
培养载体有许多已知的不同型样种类，例如:葡萄糖聚体(如:CytodexI、二乙氨基乙基葡聚精(DEAE-dextran)和Cytodex III、猪的覆盖胶原蛋白的葡萄糖聚体(porcinecollagen-coated dextran)；Amersham-Pharmacia，UK)或涂上聚苯乙烯(coated polystyrene-based)为基底的微载体；典型的微载体非常细小且直径大约只有50至250微米，然而，更大或更小尺寸的微载体也曾被使用过(美国专利号5114855，于1992年5月19日颁布)。第二种细胞培养载体的型样包含一由陶瓷、聚氨酯泡棉、或聚乙烯对苯二甲酸酯(polyethylene terephthalate，PET)、或聚乳酸聚甘醇酸(poly-(lactic-co-glycolic)-acid，PLGA)，其为生物所能分解的材质、胶原蛋白、或壳聚糖(chitosan)所组成的多孔隙基质材质；此类产品为以聚乙烯对苯二甲酸酯为基础所衍生出的产品(例如由台湾CESCO Bioengineering，公司所生产的BioNOC II载体，及由美国New Brunswick Scientifics公司生产的FibraCel载体)。
细胞培养载体更可根据其表面的特性予以分类，举例说明，可区分成非多孔隙式或无孔隙式；一般来说，多孔隙载体相对于非多孔隙式的载体而言，具有较多的优点，多孔隙载体不但提供了一较大面积/体积比例，而且也提供了一屏障以保护细胞；因为多孔隙载体的本质，这些载体于生长表面内形成了三维孔穴，因此可使得细胞贴附产生最大化，同时也保护细胞使之远离由于搅拌、充气所造成的剪应力(shearing stress)和在饲育或收获细胞过程时被逐出或被毁坏的风险。
目前多数已知可实行的细胞培养系统是利用多孔隙/非多孔隙式/或无孔隙的微载体，目前的贴附依赖性细胞生产系统利用微载体小珠(beads)当作微载体，此微载体必须与搅拌或具有充气能力的设备结合，然而，微载体系统的常见问题为:支撑细胞培养所需的搅拌的行动会毁坏或甚至摧毁细胞，如此一来，培养系统的效率和细胞产品的产量将会降低。
微载体系统也可制造于一小型球体内，由离子交换胶(ion exchange gel)、葡萄聚糖(dextran)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)或胶原蛋白材质所形成；这些材质是根据本身与细胞之间的适合性、搅拌后的恢复力、以及能维持微载体悬浮于培育培养基间的独特引力所挑选出，微载体通常会保持在培养基内且随着轻柔的搅拌而悬浮于在器皿中，其中搅拌是为了确保所有细胞皆能分配到同量的滋养物和空气。因为微载体的高面积/体积比例以及能够平均分配营养至细胞的特性，所以微载体系统目前被认为是大规模细胞培养中最适宜的系统。
然而，目前的微载体培养系统仍具有许多缺点，这些缺点包含:高成本和由于在培养过程中，细胞暴露在搅拌及充气所造成的高度剪力(shearforces)环境下所致的细胞损耗率高。一般来说，大多数微载体利用多孔隙且非刚性的葡萄聚糖作为一支撑基质，此可压缩的基质是用来减少微载体在剧烈反应而碰撞时该微载体及粘附于微载体的细胞毁坏的可能性(Microcarrier Cell Culture:Principles and Methods，Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden，pages 5-33(1981))。然而，这些多孔隙微载体在培养过程中吸附了培养基中的成长因子，因而造成细胞生长减缓(Butler，M.，“GrowthLimitations in Microcarder Cultures”，Adv.Biochem.Eng./Biotech.4:57-84(1987))。
美国专利号5015576，1991年5月14日颁布，此专利提出制造粒尘(particles)的方法，于一基质材料的水般(亲水)溶剂内，加入一不溶水的固体、液体或形成孔穴的气体，产生一混合物以封住孔穴，接着，利用在一不溶水的散布溶液中散步以形成颗粒，此基质利用冷却、共价交联(covnlent cross-linking)、或聚合作用(polymerization)使之不溶于水。待形成孔穴的混合物被洗掉之后，粒尘便可在胶体过滤(filtration)、疏水性层析法(hydrophobic chromatography)或于亲和性(affinity)层析法过程中，用以作为离子转换器(ion exchanger)，而后随意衍生出粒尘；这些颗粒也可用以当作用来培养贴附依赖性细胞的微载体。
美国专利号5385836，1995年1月31日颁布，此专利有关于一种当细胞培养时或当欲固定动物细胞时供动物细胞粘附的载体；此载体的制造方法是于多孔隙基质(substrate)上涂上一层以包含甲壳素(chitosan)的混合物形式的细胞粘性材质。多孔隙基质为一由充满不织布(non-woven fabric)网状结构物及和搭配一包含丝蛋白(silk fibroin)、动物胶(gelatin)和壳聚糖的粘附树脂所形成的不织布；不织布的外层使不织布与一将丝蛋白和动物胶加入酸性水般的壳聚糖溶剂内的溶剂接触，以形成涂层；接着，风干此具有涂层的不织布，并利用强碱处理使壳聚体不溶于水。
美国专利号5565361，于1996年10月15日颁布，此专利是关于一种用以增强细胞培养和增殖细胞的生物反应器，其包含一壳体、一静态搅拌组件，细胞贴附在该搅拌组件上以及提供培养基以允许贴附的细胞成长和分裂；静态搅拌组件以及生物反应器包含一多孔隙纤维状的薄片材料，如波纹状(corrugated)材料或编织(knitted woven)金属线材料，如不锈钢或钛金属，和一个预先决定尺寸的纤维以提供细胞贴附生长的最大表面积。
美国专利号5739021，于1998年4月14日颁布，是关于一供生物催化剂、一不溶水的无机注入器以及从聚乙烯和聚丙烯挑选出的一聚烯烃类粘附剂使用的一多孔隙载体，此多孔隙载体为打开孔隙并允许细胞穿过其中且于孔隙内生长，密度约1g/cm3。
美国专利号6214618，于2001年4月10日颁布，是关于利用少量苯乙烯共聚物核心(styrene copolymer core)与功能性群组交叉结合于小珠的表面上，以形成微载体小珠的方法，以及利用碱性和酸性溶剂清洗微载体小珠使之适合细胞培养的方法；微载体小珠也可由苯乙烯共聚物核心和已经利用碱性及酸性溶剂清洗过的三甲胺(tri-methylamine)外表所形成，使小珠适合于细胞培养。
尽管有多样化的先前技术提出有关细胞培养的载体，却没有一个载体是适用于可程控降解(programmable degradation)和允许在细胞培养释放细胞的同时，仍可保持高面积/体积比例以及细胞粘附度的特性。
随着生物科技的快速发展，任何细胞培养的技术，不论是真核细胞或真核基因细胞，都日益重要，一般来说，真核细胞成长速度较缓慢也较易因剪应力和污染而受到损伤；多数的真核细胞为粘附性细胞，需要一生长表面供粘附性细胞粘附和生长，为了适应真核细胞的培育，不同的载体和生长表面也被一一发展出来；目前大多可实行的载体为平滑表面的载体，其形成于葡萄聚糖材料、由聚氨酯或聚乙烯对苯二甲酸酯所形成的多孔隙基质和半渗透膜(如:由中空纤维或醋酸纤维所形成的空心纤维)上。然而，透过这些载体所培殖出的细胞获量是令人失望的、容易被污染影响的缺点，尤其是多孔隙架构的载体几乎不可能培养出良好的细胞。因此，粘附性细胞的培育为缓慢、劳力密集和昂贵的工艺，因此，发展一可解决收获细胞的培养载体实为一个迫切课题。
贴附依赖性细胞的载体有两种主要的形态，分别为微粒状(particulate)的平滑表面载体(非多孔隙式或无孔隙)和多孔隙载体；平滑表面无法适用于大生长表面区域，因此细胞粘附和生长的数目也会被限制；另外一方面，多孔隙载体提供至少三维的孔穴以供细胞安居，这些载体的多孔隙性也创造了额外的表面区域供载体粘附，因此可保护细胞远离直接与由充气、搅拌及培育所产生的剪应力接触的风险。
应用藻素酸(alginic acid或称褐藻胶alginate)所形成的载体来包埋固定细胞的方法已经实行很长一段时间，然而，在无菌条件下进行细胞包埋是一种非常冗长、容易造成污染且通常只局限于非贴附依赖性细胞的技术。褐藻胶载体容易利用添加螯合剂(chelating agent)(例如:二乙胺四乙酸，Ethylene-diamine-tetraacetic acid(EDTA)或柠檬酸钠，sodiumcitrate)予以分解。待载体分解完毕后细胞则非常容易地被释放，因此褐藻胶为大量培养细胞或组织的有潜力的材料。
但是，利用褐藻胶当作培养细胞/组织的载体有三大主要问题:1.为了包埋细胞，常见的褐藻胶微珠内的养分交换和质传遭受严重限制，因此，于培养过程中会局限细胞的密度及其生存能力；2.褐藻胶通常被视为是细胞粘附抗体(cell adhesion resistant，CAR)材料，因此，大部分的粘附性细胞无法于褐藻胶的表面粘附和生长，进而限制了褐藻胶的应用；3.多孔隙式褐藻胶载体的机械强度很低，在激烈的培养环境中对降解非常敏感，尤其是包含钠和钾离子的培养基。因此，褐藻胶的应用只局限在静态的培养环境，且无法应用于大规模的生产。根据上述褐藻胶的限制，藻素酸甚少被用来当作大量生产粘附性细胞时培养的材料。
发明内容
为解决上述微载体培养系统的缺点，即，在培养过程中经搅拌和充气使微载体培养系统暴露在高程度的剪力中所造成的高成本和高损耗率，本发明提供一种利用坚硬、多孔隙固体层保护细胞生长表面完整性的方法。
为了解决上述多孔隙微载体为了固定导致成长因子吸附作用的细胞产品和培养基内的其它组件，本发明在培养媒介中添加额外的钙离子围绕在褐藻水胶表面使得粘附性细胞以一可比较的成长速度和密度粘附延展和增生。
为了解决上述藻素酸(或褐藻胶)所形成的载体的缺点，包括:细胞密度和可用性被培养过程中被限制、大部分的粘附性细胞无法于褐藻胶表面上粘附或成长以及多孔隙褐藻胶载体的机构强度过低；本发明在培养基中添加额外的钙离子围绕在褐藻水胶表面使得粘附性细胞以可比较的成长速度及密度粘附延展和成长，保护多孔隙褐藻胶基质于一网内，多孔隙培育基质的完整性于细胞培养过程中可维持很长的周期。
为了解决上述细胞培养的载体的缺点，包括:平滑表面的载体(非多孔隙式或无孔隙的载体)无法适合于大的生长表面区域，因此，粘附或生长的细胞数目被限制、欲利用多孔隙载体培养並收
Figure C200610093120D0011173446QIETU
大量细胞通常非常困难，以及没有任何一个载体适合使用可程控降解和适合于细胞培养中，在保持高面积/体积比例及细胞粘附特性下仍能容易地释放细胞等；本发明提供一种制造方法，该方法为提供多孔隙、能够被完全降解、以及在培养过程结束时能释放所有的细胞、因此很容易达成高细胞密度的培养以及高良率的细胞收获量目的的简化工艺。
本发明披露了一供培养细胞使用的新颖可降解的生长表面和结构，该生长表面可使细胞粘附度达到最大值，促进细胞生长，增加机械强度，可利用几何操作有效地增加表面区域以增加细胞密度。因此，本发明可应用于大规模细胞培养中，以供细胞/组织大量生产。
本发明目的还在于提供在可程控降解之前仍可保持多孔隙载体机械强度的培育载体系统，此培育载体系统可向上堆叠在其它培育载体系统上而彼此不重叠，于培养器皿或生物反应器中提供至少一三维的空间使简化培养载体的流程不受拘束且单一化；另外，当细胞培育完成后，载体系统的单一降解特性可简化细胞或组织的产量。
本发明的目的还在于提供一可支撑细胞粘附力和生长的细胞培养生长表面、提供一在搅拌培养环境中可承担机械压力且可维持载体完整性的结构，以及提供一可程控降解且可于培养完成后简化组织或细胞产量的细胞培养生长表面。
为了达到上述的目的，本发明提供了一种细胞生长表面的制法，其为一种用以促进细胞粘附、分布和生长并通过可程控降解作用(programmabledegradation)释放细胞或组织的细胞生长表面的制造方法，该方法包含:提供三维藻素酸亲水凝胶以作为该细胞生长表面；补充钙离子于含浸该藻素酸凝胶的溶液，以使含浸该藻素酸凝胶的溶液的钙离子浓度超过2.3mM。
上述细胞生长表面的制造方法，其中提供该三维藻素酸亲水凝胶的步骤还可包含交联一藻素酸聚合物以形成该三维藻素酸亲水凝胶；或者优选还包含于该三维藻素酸亲水凝胶内形成多数个孔隙(pores)的步骤。
上述制造方法中形成所述孔隙的步骤还可包含冷冻和冻干(lyophilzing)该三维藻素酸亲水凝胶。
本发明提供一种由藻素酸所形成的三维多孔隙生长表面，三维多孔隙生长表面可改善粘附性细胞的培养效果，增强细胞生长表面，提升细胞固定性和繁殖性，维持表面结构的完整性，激活可程控降解，以及增加细胞生产量。
本发明还提出一利用坚硬和多孔隙固体层保护生长表面以增强生长表面完整性的方法，其为一种用以促进细胞粘附、分布与生长并通过可程控降解作用(programmable degradation)释放细胞或组织的细胞生长表面的制造方法，该方法包含:提供一坚硬支撑物(rigid support)；于坚硬支撑物上凝固(solidifying)一藻素酸聚合物以形成一三维藻素酸亲水凝胶；补充钙离子于含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液，以使含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度超过2.3mM。
上述制造方法中采用的坚硬支撑物为多孔隙或非多孔隙，优选多孔隙并具有一网(netting)结构或一筛网(mesh)结构，该网结构与该筛网结构的材质为聚合物，优选为聚丙烯(polypropylene)或尼龙(nylon)。该坚硬支撑物为[形、U形、V形、W形、椭圆形、O形、碗形(或称锥台形)或铲状物形以限制于该坚硬支撑物内的该细胞生长表面。该坚硬支撑物优选为多孔隙且具有至少两侧，该两侧用以遮盖该细胞生长表面，并加以保护，避免其于细胞培养过程中产生分解作用(decomposition)，并提供产生足以互相堆叠的机械强度；该坚硬支撑物优选还可为多孔隙且具有环绕部(circling-portion)，该环绕部用以环绕该细胞生长表面加以保护，避免其于细胞培养过程中产生分解作用(decomposition)，并提供产生足以互相堆叠的机械强度；该坚硬支撑物还可为非孔隙状且由坚硬生物可适应的材质所制成，优选为非孔隙状且具有一平板或片状的形状。
本发明细胞生长表面的制造方法，其中所述的多糖聚合物为藻素酸(alginic acid)或其衍生物；所述的凝固步骤还包含冷冻及以钙离子交联该藻素酸聚合物。
本发明还提供一种表面修饰的方法，其利用在细胞生长表面的周围或在培养载体内部或在适当环境内加入钙(calcium)离子，该钙离子的浓度约为2.3mM至300mM，优选为3mM至60mM，更优选为3mM至10mM。另外其修正步骤还包含利用设计的多孔隙和三维结构增加表面区域，利用在生长表面的周围或培养载体内部或生长表面内部增加钙离子浓度的步骤处理生长表面。该生长表面能够使用可程控降解及当培养完成后可轻易释放细胞/组织的质量。
本发明还包含一通过涂布多价阳离子修饰该细胞生长表面的步骤，其中该多价阳离子选自聚-L-离氨酸(poly-L-lysine)、聚-D-离氨酸(poly-D-lysine)、蛋白氨酸(polyarginine)、聚乙亚胺(polyethyleneimine)、聚-D-鸟胺酸(poly-D-ornithine)和聚-L-鸟氨酸(ploy-L-ornithine)中至少一种。
上述制造方法，其中还包含冷冻和冻干(lyophilzing)该三维藻素酸亲水凝胶以于该三维藻素酸亲水凝胶内形成多数个孔隙；或者，还包含使用盐析(salt leaching)以于该三维藻素酸亲水凝胶内形成多数个孔隙；或者，还包含冷冻与干燥该三维藻素酸亲水凝胶以于该三维藻素酸亲水凝胶内形成多数个孔隙。
其中所述的坚硬支撑物优选具有至少一褶层(fold)或至少一变形(deformation)以产生至少一三维孔穴(three-dimensional cavity)；所述的细胞生长面为用以生长真核细胞(eukaryotic cell)，优选为用以生长依赖固着生长的细胞(anchorage-dependent cell)。
附图说明
图1:根据本发明一实施例的载体结构示意图，其中多孔隙载体防护物的外表层为三维的V形结构，多孔隙褐藻胶为隔绝设置于V形支撑层的内部以及在表面上结网；
图2:根据本发明另一实施例的载体结构示意图，其中多孔隙载体防护物的外表层为三维U形结构，多孔隙褐藻胶隔绝设置于U形支撑层的内部；
图3:根据本发明另一实施例的载体结构示意图，其中多孔隙载体防护物的外表层为三维W形结构，多孔隙褐藻胶隔绝设置于W形支撑层的内部；
图4:根据本发明的另一实施例的载体结构示意图，其中多孔隙载体防护物的外表层为三维的O形结构，或一圆柱状结构，多孔隙褐藻胶隔绝设置于O形支撑层的内部；
图5:根据本发明的另一实施例的载体结构示意图，其中多孔隙载体防护物的外表层为三维的椭圆形结构，或一圆柱状结构，多孔隙褐藻胶隔绝设置于椭圆形支撑层的内部；
图6:根据本发明的一实施例的碗状的生长表面示意图；
图7:细胞培养前的多孔隙生长表面结构图；
图8:细胞于生长表面中的细胞生长形态；
图9:细胞于2％的褐藻胶生长表面的培育图，其中褐藻胶生长表面并无经过任何表面处理及钙离子强化动作；
图10:生长表面降解之后细胞/组织释放图；
图11:根据本发明的一实施例的制造细胞生长表面方法流程图。
附图标号:
10——提供三维藻素酸亲水凝胶
20——于三维藻素酸亲水凝胶的溶液补充钙离子
具体实施方式
以下结合附图详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。
于本实验室中，令人惊讶的是发现通过在环绕于褐藻酸盐亲水凝胶表面之培养媒介中添加额外的钙离子，许多原先通常无法附着、伸展与成长于褐藻酸盐表面的贴附依赖性的细胞(anchorage-dependent cell)，于本发明中都可伸展与生长于表面上且具有和现有组织培养皿可比较的生长速率与密度，且无需进一步涂布任何额外细胞基质(extra-cellular matrix)成分，如胶原或纤维粘连蛋白(fibronectin)于褐藻酸盐表面以改善细胞附着、伸展与成长过程。在该设计理念中，通过供应离子螯合剂，如二乙胺四乙酸EDTA或柠檬酸钠(sodium citrate)可程控地降解褐藻酸盐生长面。另一发现是将褐藻酸盐亲水凝胶制作成三维生长基质时，在一搅动的培养环境中很容易受到破坏，为了解决该问题，申请人发现通过在一网中保护多孔隙褐藻酸盐基质，此多孔隙生长基质可于细胞培养期间长时间保持其完整性。两个重要发现使申请人可构建一生长基质并允许应用于动态培养环境中，且能够在无须酵素性的处理(enzymatic treatment)下收获细胞/组织。并且，此添加额外钙离子的发现同样可以应用于无孔隙或多孔隙褐藻酸盐亲水凝胶基质且无网状物保护时的状态。这表示此发现可应用于以任何方式保护或配置的褐藻酸盐亲水凝胶基质于贴附依赖性细胞的培养应用。
褐藻酸盐，为藻素酸(alginic acid)，其为含beta(1-4)-linked D-mannuronicacid(M)与alpha-(1-4)-linked L-guluronic acid(G)的线形非支链高分子(linearunbranched polymers)。褐藻酸盐可以被冷固化(cold setting)存在于钙离子或其它多价金属离子中，如二价镁(Mg++)、二价锶(Sr++)与二价钡(Ba++)。通过添加螯合剂，如柠檬酸钠或乙二胺四乙酸(EDTA)也可轻易地降解褐藻酸盐亲水凝胶。因此，此材质是用来控制释放的理想材质，如药物释放控制。通过一般冷冻/冻干程序，褐藻酸盐亲水凝胶可被制作成多孔隙结构。如此多的优点来自于藻素酸材料，故此材料多被应用于食品、医药或其它产业上。然而，由于其为细胞贴附抵抗(cell adhesion resistant，CAR)的特性，故贴附依赖性的细胞(anchorage-dependent cell)难以附着(anchor)和生长在褐藻酸盐表面。因此，即使褐藻酸盐应用于细胞培养领域已数十年之久，但仅限定于极少数种类细胞，且大部分为非依赖固着生长的细胞，如融合瘤细胞(hybridoma)。然而，如果褐藻酸盐生长表面更进一步被处理成一多孔隙结构，其于含钠或钾离子溶液中会变成非常脆弱且于搅拌培养环境中被破坏。如表
Figure C200610093120D0016173600QIETU
所示，当放置多孔隙褐藻酸盐结构于一搅拌培养表面时，仅有本发明具有三维折叠网(3-D folded netting)保护的褐藻酸盐可维持其完整性至少10天，无保护或仅一侧保护的褐藻酸盐在24小时内结构被破坏怠尽。因此，于一动态培养环境下无任何额外保护下使用多孔隙褐藻酸盐生长表面作为载体用来大量培养是非常困难的。
表1:多孔隙褐藻酸盐结构放置于搅动培养表面
(agitating culture surface)的完整性维持时间
 
生长表面 分裂前搅动(Agitation)的时数
本发明 10天后仍无裂解(disruption)
仅一侧保护 24小时内裂解
无保护 2小时内裂解
本发明提供了由藻素酸制成的一三维多孔隙生长表面，可改进细胞生长表面，促进细胞固化(cell immobilization)，维持表面结构完整性(surfacestructure integrity)，可程控降解作用(programmable degradation)以及增加细胞产量。本发明提供的方法通过在坚硬多孔固态层内保护生长表面可改善生长表面的完整性。本发明还提供修饰真核细胞(eukaryotic)或原核生物(prokaryotic)的生长表面的方法，包括通过产生多孔与三维结构增加表面积，对表面进行处理以增进细胞附着，促进细胞的生长与增生(proliferation)并处理在传统细胞培养装置内的生长表面。该生长表面在细胞培养完成后通过添加螯合剂(chelating agent)，如柠檬酸钠(sodium citrate)或二乙胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，可以程控降解予释放细胞/组织团块(cell/tissue mass)。此细胞/组织团块通过添加胰蛋白酶(trypsin)、蛋白酵素(protease)与脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNAse)中至少一种后，也可被进一步分解以获得独立细胞。
以下通过具体实施例配合附图详加说明，可更容易了解本发明的目的、技术内容、特点及所达成的功效，并据以实施，但不能以此限定本发明的保护范围。依据本发明所揭示的实施例可应用于真核细胞与原核生物的至少一种的细胞培养，特别是动物与哺乳类动物的任意一种。本发明尤其提供适用于培养任何细胞的新型的生长表面和结构，可承受机械强度，控制降解并于生长表面降解后容易收获细胞/组织团块。
根据本发明提供的具有新颖性的生长表面由一坚硬支撑物加上一生物可分解(biodegradable)的、有弹性(flexible)、坚固(sturdy)且能维持所给予结构的材质的组合所制成。
该具有新颖性的生长表面由下列步骤制成:首先，构建一固体支撑物以形成一三维形状；然后，将固体支撑物浸入褐藻酸盐溶液并将相当数量褐藻酸盐溶液限制于固体支撑物内；之后，通过冷冻固化褐藻酸盐溶液或于钙离子溶液内进行交联以形成一凝胶；接着继续，于胶化程序之前或之后利用已知冷冻/冻干程序可于褐藻酸盐凝胶内形成孔洞；然后，于此多孔藻酸盐凝胶内或环绕于生长表面提供过量钙离子并使生长表面干燥或是供应钙离子，并使培养过程中钙离子于培养基质内浓度超过2.3mM。
该坚硬支撑物可为由聚丙烯或尼龙制成的网状或筛状物。该坚硬支撑物可被弯曲或回火以形成I形、[形、U形、V形、W形、()形(椭圆形)、O形、碗形(锥台形)或铲状物形状以于该坚硬支撑物内限制该细胞生长表面并保护多孔生长表面。请参阅图1至6，为根据本发明不同载体结构示意图，其中多孔隙载体防护物的外表层为三维的V形、U形、W形、O形(或柱状)、椭圆形与碗形结构，多孔隙褐藻胶隔绝设置于支撑层的内部。在附图中，102表示网状物，而100则表示多孔隙生长表面。该坚硬支撑物具有至少两侧用以遮盖细胞生长表面，或是具有环绕部(circling-portion)以环绕细胞生长表面加以保护避免其于细胞培养过程中产生分解作用(decomposition)，并产生足以提供互相堆叠的机械强度。
此坚硬支撑物为多孔隙，如此细胞/组织于接种(inoculation)时能够穿透进入生长表面，于生长表面降解后穿出生长表面，并能够帮助养分与氧气传送进入生长表面。此坚硬支撑物可为非多孔隙，如此可适用于相对静态培养环境。坚硬支撑物的孔洞直径约为500μm至2mm。
褐澡酸盐溶液的浓度范围约为1％至5％。此多孔隙结构的褐藻酸盐亲水凝胶可通过其它普通颗粒来提供形成多空隙结构，如盐析(salt leaching)、相分离(phase separation)或发泡冷冻干燥(aphron freeze-and-dry)。优选为冷冻冻干与aphron冷冻干燥。于多孔隙结构内孔洞尺寸约为10μm至500μm，优选约为50μm至500μm。根据本发明所述的孔隙可提供一最大表面区域供细胞附着、贴固与增生(proliferation)，故可提供最大细胞密度和最大细胞产量。
由于褐藻酸盐表面对于细胞附着和生长的惰性，故称为细胞贴附抵抗(cell adhesion resistant，CAR)材质，可通过添加过量钙离子增强此生长表面于培养前或培养进行时，并可选择性地涂布多价阳离子高分子，如聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)、聚-D-赖氨酸(poly-D-lysine)、聚精氨酸(蛋白氨酸polyarginine)、聚乙亚胺(polyethyleneimine)、聚-D-鸟氨酸(poly-D-omithine)或是聚-L-鸟氨酸(ploy-L-ornithine)。更特别的是，钙离子被选用是因其经济性与生物兼容可行性。褐藻酸盐生长表面更可选择性的涂布胞外基质(extra-cellular matrix)或粘着因子(attachment factors)，如。胶原(collagen)、纤维粘连蛋白(fibronectin)、附着性分子(laminins)、(trhombospondin1)、玻连蛋白(vitronectin)、弹性蛋白(elastin)、肌糖蛋白(tenascin)或其它细胞粘着分子。然而，涂布胞外基质(extra-cellular matrix)或粘着因子在本发明中并非必要的。
只要依据本发明精神，本发明的新颖的生长表面可以是任何尺寸、形状、外形、结构或几何型态。此生长表面可以是任何适当外形，例如颗粒状物(pellet)、条状物(strip)或任何三维结构。于一实施例中，生长表面的外形为条状物。该生长表面也可为颗粒状物，如尺寸多样且直径范围约为1mm至250mm，然而直径尺寸仍需取决于个别需要。优选的，该生长表面为一颗粒状物的外形，其于培养槽内或培养烧瓶或生物反应瓶内为零散堆积的基质。该多孔隙载体或生长表面或颗粒状物可以形成一零散堆积床，于接种时允许细胞简单有效率的分布，并获得最大量细胞附着于多孔颗粒状物或多孔生长表面或多孔隙载体上。
本领域技术人员应可了解一生长表面的某些特性从其效能上可得到的效果。载体或是表面特性，如表面性质、载体密度、尺寸、毒性(toxicity)与坚硬度(rigidity)，可影响生长表面效能和细胞培养效能，特别是有关于细胞密度和细胞产物的整体产量。特别地，生长表面孔隙尺寸会影响细胞效能。虽然本领域技术人员可理解已知任何生长表面孔洞尺寸都为恰当，此孔洞尺寸优选的范围约为50μm至500μm。
然而，此表面应用方法在增进整体效能方面也相当重要且关键，特别是，通过在表面存放的环境中保持过量钙离子浓度，其可能的原因之一是培养基质中钾与钠离子容易将钙离子置换造成此褐藻酸盐凝胶被分解，因而阻碍了(impede)细胞伸展与增生。即使大部分细胞培养基已含有约1.8mM(200mg/L)氯化钙浓度，然而，并不带来促进细胞附着与伸展于褐藻酸盐生长表面上的效益。只有增加培养媒介内钙离子浓度至约2.3mM，细胞才会有出现显著附着与伸展于褐藻酸盐生长表面的效果，当钙离子浓度增加时细胞附着与伸展于褐藻酸盐生长表面的效果亦同时增加。于培养媒介中钙(calcium)离子整体浓度范围约为2.3mM至300mM，优选范围约为3mM至60mM，更优选范围约为3mM至10mM。本发明添加过量钙离子于褐藻酸盐生长表面上或其内显著增加依赖固着生长的细胞可应用于生物降解材料。此实验数据明确支持通过使用该新颖性生长表面与本发明所提供的实测状况所产生的惊人成果。
实施例1:制备多孔隙生长表面
本实施例描述本发明多孔隙结构的制法，改多孔隙结构如同支架用以物理性地支撑活细胞的生长。材料与方法分别为:一般店家购买1m/m×1m/m网目尺寸的聚丙烯网(PolyPropylene Netting)。自FMC BioPloymer(Philadelphia，PA 19103，USA)购买的藻素酸(alginic acid，or alginate)。氯化钙则自Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com)购买。聚丙烯网切割成10cm长与3cm宽，折叠并融接加热以形成具有1cm宽度和3mm高度的3维()形(椭圆)状圆柱。藻素酸(alginic acid)粉末溶解于去离子水中以形成重量/体积为2％的藻素酸溶液。将()形状圆柱聚丙烯网放置于一槽，注入藻素酸溶液于放置()形状圆柱聚丙烯网的槽内并让藻素酸溶液填满网状支撑物内部，让在网状支撑物内的具有2％的藻素酸溶液的网状支撑物浸入浓度为300mM的氯化钙溶液中，并使其进行胶化30分钟。之后将此网状/胶状物放置于摄氏负80度的冰箱内2小时并于真空脱水冷冻干燥(dehydrated)。此时于胶体内会形成一内部连接的多孔状结构，此孔洞尺寸约为30～200μm。将网状/多孔胶状物切割成1cm长的颗粒状物(pellet)。此多孔隙结构于光学显微镜下的观察如图7所示。
实验2:表面修饰
接着将改网状/多孔胶状的颗粒状物以含有过量100mM CaCl2的去离子水冲洗并使这些颗粒状物干燥。此控制组(对照组)的制备并无添加过量氯化钙，而是仅通过去离子水冲刷清洗确保无多余的钙离子残存于褐藻酸盐表面并使其干燥。然后将此生长结构置于UV灯下超过一夜以消毒杀菌。
实验3:细胞培养
于M199/5％FBS培养基中培养Vero种细胞。将每一上述多孔褐藻胶载体颗粒放置于12孔盘中并于每一颗粒添加2ml培养基以及播种1×105个细胞。此时，含有过量氯化钙的上述载体颗粒内的钙离子被培养基所稀释，培养基溶液内的钙离子浓度大致是稀释至l0mM左右。之后，于培养第五天，通过95％乙醇连续干燥固定其中一个载体颗粒的细胞并以考马斯亮蓝G(Coomassie brilliant blue G.)染色观察。细胞形态(Cell morphology)如图8所示，显示Vero细胞可于本发明生长表面增生且完全占据生长表面空间。相反的，如图9所示的控制组并无过量钙离子于褐藻酸盐载体颗粒上或于培养媒介内，细胞无法附着于生长表面且形成团块聚集并增生失败。
实验4:细胞/组织释放
取一颗粒状物浸入浓度为1.6％的柠檬酸钠(sodium citrate)溶液内，振动数分钟直到凝胶溶解，仅有细胞组织留下。如图10所示，由于此生长表面为三维多孔隙结构，细胞生长在孔隙内部形成了片状或三维组织结构。之后，将此细胞组织离心且再悬浮此细胞组织于酵素溶液中以分离组织形成单一独立的细胞颗粒。于本实施例中，可自一多孔隙褐藻酸盐载体上收集到8.0×105个细胞，表示于细胞5天的培养过程中约有8倍的细胞增生。此吻合在Vero细胞增生速度(propagation)的合理范围内。相反的，如图9所示的控制组并无过量钙离子于褐藻酸盐载体颗上或于培养媒介内，细胞无法附着于生长表面且形成聚集团块，增生速率低且于相同培养期间内仅有1.7倍的增加。此显示本发明所提供的生长表面与结构可提供细胞附着、细胞增生且于此生物可降解多孔隙结构内大量回收细胞。
实验5:测试其它贴附依赖性生长的细胞株
本发明于细胞生长表面的培养效能更进一步地由不同的贴附依赖固着生长的细胞株(anchorage-dependent cell line)来加以评量，包括Vero、MDCK、MDBK、BHK-21、CHO-k1、HEK-293、RK-13与3T3。经过五天的培养，实验结果如下表2所示:
表2:不同生长依赖固着生长细胞株的培养效能的实验结果
 
细胞株 接种细胞量(细胞数/基质)      自本发明的生长表面收获细胞量   细胞增加倍数 自仅有褐藻胶的基质收获细胞量(控制组)            细胞增加倍数
V6ro 1×10<sup>5</sup> 8.0×10<sup>5</sup> 8.0 1.7×10<sup>5</sup> 1.7
MDCK 1×10<sup>5</sup> 9.6×10<sup>5</sup> 9.6 1.5×10<sup>5</sup> 1.5
MDBK 1×10<sup>5</sup> 10.4×10<sup>5</sup> 10.4 0.92×10<sup>5</sup> 0.92
CHO-k1 1×10<sup>5</sup> 20.4×10<sup>5</sup> 20.4 13.9×10<sup>5</sup> 13.9
BHK-21 1×10<sup>5</sup> 18.0×10<sup>5</sup> 18.0 2.8×10<sup>5</sup> 2.8
RK-13 1×10<sup>5</sup> 7.6×10<sup>5</sup> 7.6 1.5×10<sup>5</sup> 1.5
HEK293 1×10<sup>5</sup> 4.4×10<sup>5</sup> 4.4 1.8×10<sup>5</sup> 1.8
 
3T3 1×10<sup>5</sup> 1.28×10<sup>6</sup> 12.8 0.85×10<sup>5</sup> 0.85
除了CHO不是绝对的贴附依赖性生长细胞株外，其它细胞株在两种不同基质中的生长皆显示出显著的不同。
上述实验结果显示出本发明的确证实了现有常识将褐藻酸当作细胞附着抵抗物质(Cell Adhesive Resistant，CAR)是不适当的。此外，对褐藻酸盐生长表面以过量钙离子适当处理后，几乎可进行各式各样的生长依赖固着生长细胞林的培养。
图11为根据本发明的一实施例的制造细胞生长表面方法流程图。首先，提供一三维藻素酸亲水凝胶(步骤10)。于一实施例中，此三维藻素酸亲水凝胶的制备时通过交联一多糖高分子于一坚硬支撑物上。可选择性地，通过折叠一固体支撑物以形成一三维结构，之后将此固体支撑物浸入褐藻酸盐溶液或含有褐藻酸盐的混合物(alginate)使其可很容易被限制在该固体支撑物内。接着，此褐藻酸盐溶液于钙离子溶液中被固化(solidified)以形成一亲水凝胶。可选择性地，通过冷冻并冻干(lyophilization)该亲水凝胶以于其内部形成多数个孔洞。另外，亦可通过涂布非共价的阳离子聚合物(non-covalentpolycation)以修饰亲水凝胶的细胞表面。于另一实施例中，可通过冷冻与干燥(dry)来形成孔洞。
于另一实施例中，利用水分散性(water-dispersible)及水溶性(water-soluble)的褐藻胶(褐藻酸钠sodium alginate(水溶性)和褐藻酸钙calcium alginate(水分散性))来制备三维藻素酸亲水凝胶，冷冻干燥此液态褐藻胶悬浮液以形成一褐藻海绵(resulting algin sponge)。于又一实施例中，通过在褐藻酸盐溶液(alginate solution)内发泡来制备三维藻素酸亲水凝胶，冷冻干燥此发泡的液态褐藻溶液或悬浮液以形成一似泡沫状(foam-like)结构的三维藻素酸亲水凝胶泡棉。于另外实施例中，此三维藻素酸亲水凝胶可通过混合水溶性褐藻酸盐液态溶液和水溶性螯合剂剂(water solublesequestering agent)的组成，于混合液中添加塑化剂(plasticizer)和表面活性剂，添加多价金属离子(multi-valent metal ion)以形成不可水溶的褐藻酸盐水胶(water-insoluble alginate hydrogels)，冷冻此褐藻酸盐水胶与冻干此冷冻褐藻酸盐水胶。可选择性地，此三维亲水凝胶的制备可通过提供可溶于水的多糖溶液，冷冻此溶液以形成冷冻固体，以含有钙离子溶液交联该冷冻固体且通过溶剂干燥该已经交联的多糖材料。可选择地，该三维藻素酸亲水凝胶的制备可通过多糖溶液，将多糖溶液胶化，冷冻该凝胶并干燥该冷冻凝胶以获得多糖海绵状物。于另一实施例中，此三维藻素酸亲水凝胶的制备可通过以气体乳化的水溶性褐藻酸盐溶液(gas emulsion)，冷冻并冻干该乳化褐藻酸盐溶液，以含钙离子溶液交联该乳化褐藻酸盐物质，并再次冻干该物质。因此，三维亲水多孔凝胶的制备有多种方法，本发明三维藻素酸亲水凝胶的制备并不仅限于上述制法。
其次，在培养过程中供应浓度超过2.3mM的过量钙离子(步骤20)。在一实施例中，在三维藻素酸亲水凝胶或培养基中补充钙离子。可选择地，在三维藻素酸亲水凝胶与培养基中补充钙离子(di-cation)。
以上所述的实施例仅为说明本发明的技术思想和特点，其目的在于使本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，但不能以此限定本发明的专利保护范围，大凡依本发明所提供的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (28)

1.一种用以促进细胞粘附、分布和生长并通过可程控降解作用释放细胞或组织的细胞生长表面的制造方法，该方法包含:
提供三维藻素酸亲水凝胶以作为该细胞生长表面；以及
补充钙离子于含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液，以使含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度超过2.3mM。
2.如权利要求1所述的细胞生长表面的制造方法，其中提供该藻素酸亲水凝胶的步骤还包含交联一藻素酸聚合物以形成该三维藻素酸亲水凝胶。
3.如权利要求1所述的细胞生长表面的制造方法，其中提供该三维藻素酸亲水凝胶的步骤还包含于该三维藻素酸亲水凝胶内形成多数个孔隙。
4.如权利要求3所述的细胞生长表面的制造方法，其中形成所述孔隙的步骤还包含冷冻和冻干该三维藻素酸亲水凝胶。
5.如权利要求1所述的细胞生长表面的制造方法，其中含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度为2.3mM至300mM。
6.如权利要求1所述的细胞生长表面的制造方法，其中含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度为3mM至60mM。
7.如权利要求1所述的细胞生长表面的制造方法，其中含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度为3mM至10mM。
8.一种用以促进细胞粘附、分布与生长并通过可程控降解作用释放细胞或组织的细胞生长表面的制造方法，该方法包含:
提供一坚硬支撑物；
于坚硬支撑物上凝固藻素酸聚合物以形成三维藻素酸亲水凝胶；
补充钙离子于含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液，以使含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度超过2.3mM。
9.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该钙离子补充是来自含浸该三维藻素酸亲水凝胶的培养基。
10.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该坚硬支撑物为多孔隙或非多孔隙。
11.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该坚硬支撑物为多孔隙并具有一网结构或一筛网结构。
12.如权利要求11所述的细胞生长表面的制造方法，其中该网结构与该筛网结构的材质为高分子聚合物。
13.如权利要求11所述的细胞生长表面的制造方法，其中该聚合物为聚丙烯或尼龙。
14.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该坚硬支撑物系为[形、U形、V形、W形、()形、O形、碗形或铲状物形以限制在该坚硬支撑物内的细胞生长表面。
15.如权利要求14所述的细胞生长表面的制造方法，其中该坚硬支撑物为多孔隙且具有至少两侧，该两侧用以遮盖该细胞生长表面，并加以保护，避免其于细胞培养过程中产生分解作用，并提供产生足以互相堆叠的机械强度。
16.如权利要求14所述的细胞生长表面的制造方法，其中该坚硬支撑物为多孔隙且具有环绕部，该环绕部用以环绕该细胞生长表面加以保护，避免其于细胞培养过程中产生分解作用，并提供产生足以互相堆叠的机械强度。
17.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该坚硬支撑物为非孔隙状且由坚硬生物可适应的材质所制成。
18.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该坚硬支撑物为非孔隙状且具有平板或片状的形状。
19.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度为2.3mM至300mM。
20.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度为3mM至60mM。
21.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中含浸该三维藻素酸亲水凝胶的溶液中该钙离子的浓度为3mM至10mM。
22.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中还包含冷冻和冻干该三维藻素酸亲水凝胶以于该三维藻素酸亲水凝胶内形成多数个孔隙。
23.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，还包含使用盐析以于该三维藻素酸亲水凝胶内形成多数个孔隙。
24.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，还包含冷冻与干燥该三维藻素酸亲水凝胶以于该三维藻素酸亲水凝胶内形成多数个孔隙。
25.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该坚硬支撑物具有至少一褶层或至少一变形以产生至少一三维孔穴。
26.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该细胞生长面为用以生长真核细胞。
27.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该细胞生长面为用以生长依赖固着生长的细胞。
28.如权利要求8所述的细胞生长表面的制造方法，其中该凝固步骤还包含冷冻及以钙离子交联该藻素酸聚合物。
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