CN100497639C - 生产腺病毒载体的手段和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在互补细胞系上生产腺病毒载体的方法和手段，其中早期区域4可读框6(E4-orf6)编码核酸存在于腺病毒载体中且其中E4-orf6基因产物与互补细胞提供的E1基因产物的一或多种产物相容，由此所述腺病毒载体可以由互补细胞有效产生。

Description

生产腺病毒载体的手段和方法
发明领域
本发明涉及核酸输送载体及其应用，更特别的，本发明涉及重组腺病毒载体及其应用。
发明背景
迄今为止已经鉴别了51种人腺病毒血清型，基于血细胞凝集性质及序列同源性将它们再分为6个亚群(A、B、C、D、E和F)(Franckiet al.1991)。腺病毒感染周期分为早期和晚期阶段。在早期阶段中，所述病毒未包被而且基因组被转运至核中，之后所述早期基因区(E1、E2、E3和E4)成为转录活性的。所述E1区含有两个转录区：E1A和E1B。E1A编码参与修饰宿主细胞周期及激活其它病毒转录区的蛋白质(参见Russell.2000所述)。E1B区编码两个主要蛋白：E1B-19K和E1B-55K，其防止由于E1A蛋白的活性所诱导的凋亡(Rao et al.1992；Yewand Berk 1992；Shenk 1996)。另外，针对选择性病毒mRNA转运及宿主蛋白表达的抑制，在晚期阶段需要E1B-55K蛋白(Pilder et al.1986)。E2也被分为两个亚结构域：E2A和E2B，其一起编码参与病毒基因组复制的三种蛋白质(一种DNA结合蛋白、一种病毒聚合酶及一种终端前蛋白)(Van der Vliet 1995)。E3对于体外复制是非必需的，但其编码破坏宿主对病毒感染的防御机制的一些蛋白质(Horwitz2001)。E4携带至少6个可读框(orf)，其编码参与病毒mRNA剪接和转运、宿主细胞mRNA转运、病毒及细胞转录及转化相关的一些独特功能的蛋白质(参见Leppard 1997)。形成病毒壳体及包装病毒基因组所需的晚期蛋白均产生自主要晚期转录单位(MLTU)，其在复制开始后变为完全活性的。差别剪接及聚腺苷酸化的复杂过程产生15个以上的mRNA物种，其共有一个三联前导序列。E1B-55K、E4-orf3和E4-orf6蛋白在调节晚期病毒mRNA加工中起关键作用并从核中转运。就此过程而言，E1B-55K与E4-orf6相互作用形成一种功能性复合物，其刺激病毒mRNA转运至细胞质，同时该复合物还参与抑制细胞mRNA从细胞核转运至细胞质(参见Leppard 1997和1998)。
基于亚群C血清型Ad5或Ad2生产E1缺失的载体在E1互补细胞系(complementing cell lines)中实现，所述细胞系如293(Graham etal.1970)、911(Fallaux et al.1996)和PER.C6TM(Fallaux et al.1998；ECACC保藏号96022940)。正如WO 99/55132和WO 01/05945所揭示，载体和细胞系可以是匹配的以避免所述细胞系中的腺病毒序列与载体之间通过同源重组而产生可复制腺病毒。为有效生产衍生自C群的不可复制的腺病毒，优选使用细胞系PER.C6TM。使用这种细胞系可以匹配腺病毒载体，从而可以在没有可复制腺病毒的情况下生产C群腺病毒载体(Fallaux et al.1998；US专利No.6,033,908)。然而C群载体直接在体内应用时不总是理想的载体，因为感染效力受到在大多数人体中存在的高滴度的中和活性及特异性初级靶细胞(例如内皮细胞、平滑肌细胞、滑膜细胞(synoviocytes)、单核细胞及树枝状细胞)上没有足够量的细胞受体(柯萨奇(Coxsackie)-腺病毒受体，CAR)的严重影响。给予较高量的病毒以提高转导可以导致由于受处理的对象的中和滴度变化所致的毒性增加及不可预知的临床后果。这些限制通过使用其它血清型腺病毒可以克服。例如，当亚群B病毒(特别是血清型16)的尾丝的受体结合部分在基于Ad5的载体上表达时，引起人内皮细胞和平滑肌细胞(WO 00/31285)及人滑膜细胞(WO00/52186)的感染显著提高。另—亚群B腺病毒Ad35的尾丝在介导人单核细胞和树枝状细胞的感染中最有效(WO 00/03029)。另外，已经鉴别Ad35是一种病毒，大多数人群对其无中和活性(WO 00/70071)。
通常感觉现有技术领域需要揭示具有更广泛血清型用途的技术。一个特别的问题是缺乏这些其它血清型的合适的包装细胞系。Ad5载体的包装细胞系典型包含衍生自腺病毒血清型5的E1编码的蛋白质。这种‘标准’的包装细胞系例如是293，911和PER.C6TM。在这些标准包装细胞系上生产衍生自其它血清型的载体的尝试如果不是成功就是非常费劲的。偶尔，依赖于所使用的特殊血清型见到一些产品。然而，在Ad5的E1转化及无限增殖化的细胞系上生产的、衍生自除了亚群C之外的腺病毒亚群的重组腺病毒载体的产量很少。在Abrahamsen等(1997)的论文中，在包含衍生自腺病毒血清型5的E4-orf6的293细胞上观测到E1A缺失的腺病毒血清型7载体(亚群B)与没有来自Ad5的E4-orf6序列的293细胞相比改进的噬斑纯化。然而，遇到与载体稳定性相关的一个问题，及在噬斑纯化的原液(stock)中观测到意外的重组。遇到的另一个问题是在生产期间野生型腺病毒污染。另外，就大规模生产腺病毒而言，共转染E4-orf6以获得足够应用的高滴度是无效的。一个生长这种腺病毒的选项是提供具有稳定整合进互补/包装细胞系基因组中的E4-orf6基因的细胞。这种细胞在本领域已经加以描述(例如WO 96/22378所述)。这个系统的一个缺点是必须产生新的稳定细胞系，而且在产生稳定及正确的细胞之前必须进行大量选择循环。这个过程费力又费时。通常地，已经证明在Ad5互补细胞上从除了血清型5(亚群C)之外的血清型如亚群B病毒中产生并增殖腺病毒比较困难。正如WO 00/70071所揭示的，基于亚群B病毒Ad35的重组病毒可以通过共转染含有Ad35早期区域-1序列(Ad35-E1)的表达构建体而产生。另外，仅缺失E1A序列但未缺失E1B序列的基于Ad35的病毒示出在PER.C6细胞上有效复制，提示Ad5的E1A蛋白能互补Ad35-E1A的功能(见国际申请PCT/NL01/00824所述，还未公布)。另外，该实验示出缺乏Ad35-E1B导致在Ad5互补细胞上产量较低。WO 00/70071还揭示了生产E1缺失的非C群腺病毒载体的细胞系，通过进一步修饰能互补腺病毒血清型5的细胞系进行。WO 00/70071进一步提示应建立携带Ad35-E1序列以互补缺乏E1区域的重组腺病毒血清型35载体的新细胞系(也见于国际申请PCT/NL01/00824所述)。
然而，正如以上所揭示的，如果针对特异性需要而应用特异性血清型，则应针对每种特异性血清型建立一种新的细胞系，或者应修饰可互补腺病毒血清型5的可获得细胞系以互补感兴趣的血清型。使用本领域可获得的确立细胞系无疑是有利的，应用本领域已确定的有效方法，将这些细胞系不用修饰地用于生产除了Ad5血清型之外的所有其它血清型。可以推断直至本发明为止，本领域还未获得可以有效生产与亚群C血清型不同的腺病毒血清型的灵活而适当的生产平台(production platform)。
附图简述
图1是质粒pΔMT.Orf6.Hygro(ECACC保藏号P02041226)的示意图。为明显起见，大写字母D代表δ(Δ)。
图2是质粒pAd35.ΔMT.Orf6的示意图。为明显起见，大写字母D代表δ(Δ)。
图3是pUC.35-5E9的示意图。
图4是产生pUC.35-5E4的克隆步骤的示意图。
图5是pBr.Ad35.PRn的示意图。
图6是pBr.Ad35.PR5E4(ECACC保藏号P02041229)的示意图。
图7是pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4的示意图。
图8是pCRscriptAmp.NFI-NcoIR的示意图。
图9是pCRscriptAmp.NcoIF-NR2的示意图。
图10是pCR.NF1-NR2的示意图。
图11示出腺病毒血清型5的E4-orf6的氨基酸序列(SEQ ID NO：21；上方的序列)与通过确定核苷酸顺序获得的克隆进Ad35主链中的腺病毒血清型5的E4-orf6蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：21；中间的序列；NB与上方Ad5的E4-orf6序列相同)及腺病毒血清型35的E4-orf6蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：22；下方的序列)的序列对比，示出编码腺病毒血清型35主链中E4-orf6蛋白的全部片段已经由编码腺病毒血清型5的E4-orf6蛋白的片段置换。
图12示出腺病毒血清型5的E4-orf6/7蛋白的氨基酸序列(SEQID NO：23；上方的序列)与由置换腺病毒血清型35主链中腺病毒血清型35E4-orf6/7片段的相应部分的腺病毒血清型5E4-orf6/7片段部分编码的E4-orf6/7融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：24，中间的序列)及腺病毒血清型35的E4-orf6/7蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：25；下方的序列)的序列对比，示出orf6/7序列是部分嵌合的，大约在第138位的赖氨酸(K)残基融合。为明显起见，符号orf6+7应读作可读框orf6/7，这是除了orf6和orf7之外腺病毒的E4区域内的一个单独的可读框，是本领域技术人员熟知的一个符号。
图13是pBr.Ad35.PR.5Orf6(ECACC保藏号P02041227)的示意图。
图14是pWE.Ad35.pIX-rITR.5Orf6的示意图。
图15是pBr.Ad35.PRnΔE3的示意图。为明显起见，大写字母D代表δ(Δ)。
图16是pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4的示意图。为明显起见，大写字母D代表δ(Δ)。
图17是pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6的示意图。为明显起见，大写字母D代表δ(Δ)。
图18示出在细胞如PER.C6中通过双同源重组(doublehomologous recombination)事件而生产重组腺病毒颗粒的系统。
图19是pWWE.Ad35.pIX-EcoRV的示意图。
发明概述
本发明提供了包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件的重组腺病毒载体，其中所述载体还包含编码E4-orf6蛋白的一个序列，其中所述序列选自如下一组；a)衍生自与所述第一种血清型不同的第二种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；b)衍生自缺失、突变、添加和/或取代一或多个密码子的所述第一种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；及c)包含一个融合体的E4-orf6编码序列，所述融合体是衍生自与所述第一种血清型不同的第二种血清型的E4-orf6编码序列的一部分与衍生自第三种血清型的E4-orf6编码序列的一部分的融合体，其中所述第三种血清型与所述第一种血清型可以相同或不同。
本发明还提供了生产包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件的这种重组腺病毒载体的方法，所述方法包括如下步骤：a)提供携带可表达形式的衍生自第二种血清型腺病毒的E1B-55K编码序列的一种互补细胞，其具有腺病毒的必需元件以可以通过所述互补细胞装配所述重组腺病毒载体，其中所述元件包含与所述第二种血清型不同的第一种血清型腺病毒的至少一些结构元件和非结构元件及编码与所述互补细胞中所述可表达的E1B-55K蛋白相容的功能性E4-orf6蛋白或其功能性部分、衍生物和/或类似物的一个序列；b)在培养基中在可以发生腺病毒生产及装配的条件下培养所述互补细胞；及c)从培养基和/或互补细胞中收获如此产生的重组腺病毒载体，其中所述编码相容的E4-orf6蛋白的序列存在于如此产生的重组腺病毒载体中。
本发明进一步涉及包含本发明腺病毒载体的药物组合物及通过本发明提供的腺病毒载体治疗个体的方法。本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明提供的细胞系及腺病毒载体以实践本发明提供的方法。
详细描述
本发明揭示了解决与Ad5包装/互补细胞中非C群腺病毒载体的互补减少相关的某些难题的方法和手段。尽管在Ad5互补细胞系中存在功能性Ad5E1B-55K表达，但发现当腺病毒主链是源于非C群腺病毒时只产生非常低滴度的腺病毒载体，这个发现意味着E1B-55K与另一种(病毒)蛋白的相互作用中的血清型特异性。本发明揭示了这种血清型依赖性可以通过提供与互补细胞系提供的E1B-55K蛋白相容的E4-orf6蛋白而避免。正如本发明所揭示的，E1B-55K和E4-orf6形成一种复合物，其参与抑制细胞mRNA从核转运至细胞质，同时该复合物还参与刺激病毒mRNA从核转运至细胞质。本发明人已经观测到在包装细胞中病毒载体的正确互补(proper complementation)需要存在相容的E1B-55K和E4-orf6基因产物。如果包装细胞包含编码互补应包装的载体未提供的功能的蛋白质的某些序列，则包装细胞也称为互补细胞。本文所用术语“相容”是指可获得的E1B-55K基因产物之间的复合物与可获得的E4-orf6基因产物能以某种意义形成一种功能性复合物，这种蛋白质复合物支持病毒复制、增殖和/或包装至一定水平，该水平类似于野生型情况或者类似于当重组腺病毒血清型5载体在Ad5互补细胞系如293或PER.C6上生产时发现的情况。如果在病毒形成的生产期间包装细胞包含相容的至少E1B-55K蛋白和E4-orf6蛋白，则包装细胞中的载体复制是有效的。优选地，E1B-55K和E4-orf6序列来自相同腺病毒亚群(如A、B、C、D、E或F)内的腺病毒。更优选地，E1B-55K和E4-orf6序列来自相同的血清型。由于本领域可获得能支持亚群C的腺病毒如血清型5腺病毒生长的确立细胞系，更优选E1B-55K和E4-crf6基因衍生自腺病毒血清型5。本领域技术人员了解相容性可以在互补测试或试验中确定，如在本领域技术人员已知的腺病毒载体生产领域确定。本领域技术人员还已知本发明还可以用于在任何互补细胞系上生产任何腺病毒血清型，只要E1B-55K和E4-orf6蛋白是相容的。
本发明进一步观测到与互补细胞系中E1B匹配的E4-orf6基因产物可以通过腺病毒载体提供，通过用与包装细胞系中存在的E1B基因相容的E4-orf6编码序列置换选择的腺病毒载体中的E4-orf6而进行。令人惊奇地发现这种修饰对载体的稳定性、复制、包装、装配及生产没有严重的影响。
本发明的一个特殊方面是现在能在通常用于生产腺病毒血清型5的细胞系上有效生产与来自亚群C的腺病毒血清型不同的腺病毒血清型或者亚群C的其它血清型，如血清型1、2和6。本发明提供了生产非C群腺病毒的方法，该方法不用必需单独提供与E4-orf6互补的(包装)细胞，因为与互补E1B-55K序列相容的E4-orf6序列掺入在所述腺病毒主链中。
本发明提供了一种包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件的重组腺病毒载体，其中所述载体进一步包含编码功能性E4-orf6蛋白或其功能性部分、衍生物和/或类似物的一个序列，其中所述序列选自如下一组：a)衍生自与第一种血清型不同的第二种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；b)包含一或多个密码子的缺失、突变、添加和/或取代的衍生自所述第一种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；及c)包含一个融合体的E4-orf6编码序列，所述融合体是衍生自与所述第一种血清型不同的第二种血清型的E4-orf6编码序列的一部分及衍生自第三种血清型的E4-orf6编码序列的一部分的融合体，其中所述第三种血清型与所述第一种血清型可以相同或不同。在一个实施方案中，本发明提供了一种重组腺病毒载体，其中所述第一种血清型和所述第二种血清型来自不同的腺病毒亚群。在一个优选的实施方案中，本发明提供了重组腺病毒载体，其中所述第一种血清型来自除了亚群C之外的亚群，且其中所述E4-orf6编码序列衍生自亚群C的腺病毒血清型。更优选的是本发明的重组腺病毒，其中所述第一种血清型来自亚群B，所述第二种血清型来自亚群C。更优选的是所述E4-orf6编码序列衍生自腺病毒血清型5。
本领域技术人员已经意识到人体内有针对不同的血清型的不同水平的中和抗体循环。已经发现某些腺病毒血清型遇到了高滴度的这种中和抗体，并且不同人群中的许多个体携带抗这种血清型的中和抗体。还已经发现某些血清型仅在少量样品中被中和(WO 00/70071)。很明显，来自亚群B的某些血清型仅在一小组样品中被中和。因此，在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了重组腺病毒载体，其中所述第一种血清型选自腺病毒血清型11、14、26、21、34、35和50组成的组中。高度优选的是重组腺病毒载体，其中所述第一种血清型是血清型11或35，同时这些血清型仅在非常小百分比的所测试的样品中遇到中和抗体。
本发明的载体可以用于不同的方案中，如基因治疗、功能性基因组学、肿瘤免疫接种和/或抗病毒免疫接种。为此，腺病毒载体必须作为基因输送载体，其中非天然基因掺入到腺病毒基因组中。随后腺病毒颗粒可以被特异导向感兴趣的靶细胞，腺病毒通过壳体—受体结合或其它方式与该特异靶细胞结合并输送转基因。腺病毒的定向可以以许多不同方式进行。腺病毒载体定向领域的技术人员可以认识到可以应用的将腺病毒载体输送到感兴趣细胞的所有不同可能性。这些可能性包括但不限于壳体改变(尾丝、六邻体和/或五邻体修饰如缺失、不同血清型尾丝之间的交换、以及肽和/或其它结合部分的添加)，其中产生识别存在于感兴趣细胞上的受体的嵌合尾丝，或者其中利用五邻体碱基结合。其它可能性是将定向部分与衣壳蛋白(capsid protein)连接，其中例如将结合肽、已知的强结合蛋白或抗体或其部分与衣壳蛋白连接以实现特异性定向。所有这些载体均可以用本发明提供的方法和手段产生。因此，本发明还公开了本发明的重组腺病毒载体，其进一步包含编码一种非腺病毒蛋白、多肽或肽的序列。这种序列可以存在于腺病毒主链内的不同位置，但是优选地存在于E1区，E1区在本发明的重组腺病毒载体中缺失。E1区通过存在于互补细胞中的(互补)元件被互补。启动子、转基因和其它调节序列的方向可以朝向左反向末端重复，也可以朝向右反向末端重复。
本发明还可用于生产基于腺病毒和/或其它病毒如腺伴随病毒(AAV)的病毒载体，其中所述组合例如Ad-AAV嵌合病毒可以被整合进宿主细胞基因组。本领域技术人员已知产生整合腺病毒的若干方法。通常，本发明还可以用于生产可以(特异地或非特异地)整合的腺病毒。
如上所述，一些非腺病毒转基因可以被克隆进本发明的重组腺病毒载体。这些转基因不仅包括调节性核酸序列如增强子、启动子(例如非腺病毒强启动子如巨细胞病毒启动子、SV40启动子和RSV启动子)和聚腺苷酸化信号，也包括用于治疗目的的异源基因。因此，在本发明的一个方面中，提供了本发明的重组腺病毒载体，其中所述非腺病毒蛋白、多肽或肽选自如下一组：诱导细胞死亡的多肽、病原生物体的抗原决定簇、肿瘤特异性抗原、病毒蛋白、激素和细胞因子。病原生物体的例子包括但不限于细菌、病毒和真菌。非腺病毒因子、蛋白质、多肽和肽的非限制性例子为转录因子、胞内信号蛋白、磷酸酶、激酶、凋亡抑制因子、受体拮抗剂、膜结合受体的可溶形式、RNA抑制剂、反义RNA、诱饵(decoy)因子、核酶，更具体地为胸苷激酶、促红细胞生成素、新红细胞生成刺激蛋白(NESP)、IL3、ceNOS、γ-干扰素和gp100。非腺病毒病毒蛋白可以通过本发明提供的方法和手段被克隆进重组腺病毒载体中用于免疫接种目的。这种病毒蛋白包括但不限于用于HIV疫苗的gag，pol，env，nef等，用于人乳头瘤病毒疫苗的E6和E7蛋白，用于疟疾疫苗的来自疟原虫(Plasmodium protozoa)环子孢子蛋白，用于轮状病毒疫苗的轮状病毒成分，用于埃博拉病毒(ebola)疫苗的埃博拉病毒蛋白，用于呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗的来自RSV的F和G基因产物，用于流感疫苗的HA和NA等。
本发明的重组腺病毒包含结构元件和非结构元件。结构元件的例子为编码衣壳蛋白如尾丝、六邻体和五邻体蛋白的基因，以及这些基因产物本身。非结构元件的例子为在感染细胞时表达的并且当感染循环进行时被下调的早期基因。非结构元件的其它例子为编码在复制期间有活性的蛋白质的基因如pol和pTP。应理解的是重组腺病毒载体可以包含衍生自不同血清型的结构元件和非结构元件。这种载体的例子例如为携带嵌合尾丝的腺病毒颗粒(参见申请人的专利申请WO00/03029)。分子生物学技术使得可以构建核酸序列的无限组合。分子生物学领域技术人员理解可以用不同的分子学技术如聚合酶链反应(PCR)以及直接亚克隆来组合不同序列。本发明所用的许多序列以及本领域已知已知的序列和嵌合构建体衍生自不同的腺病毒血清型。本文所用术语“衍生”因此是指可以通过从得自野生型病毒的野生型序列中直接克隆而获得的这种序列组合，它们例如也可以通过使用不同DNA片段作为模板而经PCR获得。这还意味着这些序列可以呈野生型形式以及呈改变的形式。实现相同结果的另一个选择是通过组合合成的DNA。应理解的是“衍生”并非绝对意味着野生型DNA的直接克隆。本领域技术人员也能理解分子生物学中获得某一核酸的突变形式的各种可能性。这些突变可以赋予不同的功能性，但是它们也可以是沉默的，从而某些突变不改变该特定DNA及其编码的蛋白质的功能性。因此，术语“其功能性部分、衍生物和/或类似物”应被理解为它们相关的核酸的等价物。本领域技术人员能理解某些缺失、交换、(点)突变、添加等仍可能导致产生与原始核酸具有相似功能的核酸。因此，应理解的是这种不显著改变蛋白质如E4-orf6和E1B-55K基因产物的功能性的改变属于本发明范围。
核酸中的一些改变如一或多个密码子的缺失、突变、添加和/或取代也可能显著改变所编码基因产物的结构和/或功能性。本发明因此也涉及这样的E4-orf6编码序列，它们衍生自与携带例如结构元件和非结构元件基因的主链相同的腺病毒血清型，但是其中E4-orf6编码序列已经被突变，从而其变得与产生腺病毒载体的互补细胞中存在的E1蛋白(如E1B-55K基因产物)相容。密码子也可以被完全改变以改变编码的氨基酸，当然也可以部分突变以改变所编码的氨基酸。核酸的缺失可能导致丢失一或多个所编码的氨基酸，当然也可导致移码。本发明还涉及存在于包含衍生自不同血清型的不同部分的腺病毒核酸中的E4-orf6序列，其中赋予蛋白质相容性功能的结构域可以来自一个血清型，而E4-orf6序列的其余部分或其一部分衍生自另一种无关或相关血清型(例如来自相同亚群、来自不同亚群或者来自不同物种或者这些的组合)。因此，本发明范围也包括应用相容的E4-orf6融合蛋白。这种融合蛋白可以是几种核酸的产物。
本领域技术人员能理解除了所有人类腺病毒之外还鉴别了许多非人类腺病毒。显然，也可以使用非人类腺病毒实现本发明所公开的相同结果。本领域技术人员清楚E1B-55K与E4-orf6之间的相容性不限于人类腺病毒，来自特异于不同物种的腺病毒的元件也可以是相容的。因此，本发明的另一方面中，非人类腺病毒可以在本领域可获得的已知包装细胞系上以高滴度产生，只要E1B-55K和E4-orf基因产物相容即可。可以用本发明方法和手段生产的非人类腺病毒的非限制性例子为狗、牛、羊、青蛙、猪、马、猴和禽类腺病毒。因此本文所用血清型不仅限于物种限制的血清型。例如如果猴腺病毒E4-orf6基因产物与包装细胞提供的E1B-55K相容，则这—组合属于本发明范围。另外，当使用不同血清型之间的融合体，或者使用与包装细胞的E1B基因相容的衍生自例如人和禽腺病毒的E4-orf6序列之间的融合体时，则该特定的组合也属于本发明范围内。
本发明提供了生产包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件的重组腺病毒载体的方法，所述方法包括如下步骤：a)将腺病毒的必需元件提供给携带可表达形式的衍生自第二种血清型腺病毒的E1B-55K编码序列或其功能性部分、衍生物和/或类似物的互补细胞，以使得所述互补细胞组装所述重组腺病毒载体，其中所述元件包含至少一些来自与所述第二种血清型不同的所述第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件，以及一种编码与所述互补细胞中所述可表达的E1B-55K蛋白相容的功能性E4-orf6蛋白或其功能性部分、衍生物和/或类似物的序列；b)在允许产生和组装所述腺病毒载体的条件下在培养基中培养所述互补细胞；和e)从培养基和/或互补细胞中收获如此产生的重组腺病毒载体，其中编码相容的E4-orf6蛋白的序列存在于如此产生的重组腺病毒载体中。
在本发明的一个方面中，提供了一种本发明的方法，其中所述E4-orf6编码序列选自如下一组中：i)衍生自所述第二种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；ii)衍生自与所述第一种和第二种血清型不同的第三种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；iii)来自包含一或多个密码子缺失、突变、添加和/或取代的所述第一种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；以及iv)包含一种融合体的E4-orf6编码序列，所述融合体为衍生自第三种血清型的E4-orf6编码序列的一部分与衍生自所述第二种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列的一部分的融合体，其中所述第三种血清型可以与所述第一种血清型相同或不同。在一个优选的实施方案中，所述第一种和所述第二种血清型来自不同的亚群。在一个更优选的实施方案中，所述第二种血清型是亚群C的腺病毒血清型。在一个还更优选的实施方案中，所述第二种血清型是腺病毒血清型5。在本发明的一个其它特定方面，所述第一种血清型是亚群B的腺病毒血清型。优选地，所述第一种血清型选自腺病毒血清型11、14、16、21、34、35和50组成的组中。
本领域已知几种包装细胞可用于互补重组腺病毒载体以及生产、组装和包装腺病毒颗粒。这种细胞系的非限制性例子为HEK-293，911和PER.C6TM细胞。优选地使用已经被证明能输送高滴度腺病毒原液的细胞系。这类细胞系稳定地表达E1蛋白，因此本发明的一个优选方面是使用细胞系和方法，其中所述E1B-55K编码序列被整合进所述互补细胞的基因组中。更优选的是衍生自原代二倍体人细胞或其祖细胞的互补细胞。更优选地，所述互补细胞衍生自原代人成视网膜细胞、原代人胚肾细胞、原代人神经元细胞或原代人羊膜细胞(primaryhuman amniocyte)。高度优选的是在本发明方法中使用一种互补细胞，其中所述互补细胞是PER C6细胞或其衍生物。本领域熟知当使用与PER.C6细胞提供的核酸没有重叠的腺病毒DNA时，PER.C6细胞不会产生可复制的腺病毒。本领域使用的许多腺病毒载体缺少E1区，因此在本发明的一个方面，所述互补细胞包含整合进其基因组中的编码至少一种腺病毒E1A蛋白的核酸。优选地，所述编码至少一种腺病毒E1A蛋白的核酸衍生自非亚群B的一种亚群的腺病毒血清型。更优选地，所述编码至少一种腺病毒E1A蛋白的核酸衍生自亚群C的腺病毒血清型。高度优选的是这样的实施方案，其中所述编码至少一种腺病毒E1A蛋白的核酸衍生自腺病毒血清型5。在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述E4-crf6编码序列和所述E1B-55K编码序列衍生自不同的腺病毒血清型，并且其中所述不同的腺病毒血清型是相同腺病毒亚群的成员。优选地，所述E4-orf6编码序列和所述E1B-55K编码序列衍生自不同的腺病毒血清型，并且其中所述不同的腺病毒血清型是腺病毒亚群C的成员。更优选地，所述E4-orf6编码序列和所述E1B-55K编码序列衍生自相同腺病毒血清型。在高度优选的方法中，所述E4-orf6编码序列和所述E1B-55K编码序列衍生自腺病毒血清型5。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的或可通过本发明的方法获得的重组腺病毒载体。药物组合物还包含制药领域技术人员通常采用的可接受的药物载体。另外，本发明涉及治疗人体的方法，包括给予人体本发明的重组腺病毒载体或者本发明的药物组合物。本发明还涉及这样的方法，其中腺病毒载体可以用合适的互补/包装细胞和感兴趣的腺病毒载体产生。为了获得有效生产方法，有利的是采用具有合适腺病毒载体的正确细胞。因此，本发明还提供了一种试剂盒(kit of parts)，其包括：a)一种用于产生包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件的重组腺病毒载体的互补细胞，所述细胞携带可表达形式的衍生自第二种血清型腺病毒的E1B-55K编码序列或其功能性部分、衍生物和/或类似物；和b)在一个或多个可复制核酸载体上的所有腺病毒必需元件，从而使得所述互补细胞组装所述重组腺病毒载体，其中所述元件包含来自与所述第二种血清型不同的所述第一种血清型腺病毒的至少一些结构元件和非结构元件，以及一种编码与所述互补细胞中的所述可表达E1B-55K蛋白相容的功能性E4-orf6蛋白、或其功能性部分、衍生物和/或类似物的序列。优选地，使用这样一种试剂盒，其中所述E4-orf6编码序列选自如下一组：a)衍生自所述第二种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；b)衍生自与所述第一种和第二种血清型不同的第三种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；c)衍生自包含一或多个密码子的缺失、突变、添加和/或取代的所述第一种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列；和d)包含一种融合体的E4-orf6编码序列，所述融合体为衍生自第三种血清型的E4-orf6编码序列的一部分与衍生自所述第二种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列的一部分的融合体，其中所述第三种血清型可以与所述第一种血清型相同或不同。
本发明特别可以用于几乎全部衍生自除了腺病毒5之外的一种血清型的E1缺失的嵌合腺病毒的复制。这类载体仅需要被提供一种编码腺病毒5的E4orf6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸即可。一旦被提供了这种核酸，所述载体可以有效地在正常腺病毒5E1互补包装细胞系中复制。这些载体的稳定性被改善，并且载体可以互补E1A和E1B中的同时缺失。通过向这类载体提供编码腺病毒E4orf6的核酸，当在293或911细胞上生长时，可以实现有效的噬斑纯化以及优良的产量，同时避免了额外的野生型污染问题。当然，在PER.C6中，也可以以其它方式防止野生型腺病毒污染。
本发明重组载体的另一个优点是无需产生特殊的细胞系，来自一种核酸的腺病毒E4-orf6整合进基因组中。尽管存在这类细胞系，但是它们不易保持。这至少部分由于随着越来越多的外源基因插入细胞系基因组中，很难保持所有外源序列(或其表达)的稳定性。在本发明中，发现使用本发明的重组腺病毒载体至少可以克服一些与基于非腺病毒血清型5的载体的低产量相关的问题，以及与来自亚群B如腺病毒血清型7、11和35的腺病毒血清型载体在腺病毒血清型5包装细胞系上的稳定性相关的问题。
实施例
实施例1.在Ad5互补细胞系上产生表达Ad5 E4-Orf6的E1缺失的Ad35病毒
WO00/70071已经详细描述了腺病毒血清型35基因组的测序以及一种基于质粒的载体系统的构建和基于Ad35的重组病毒的产生。
如下所述将Ad5-E4-orf6编码序列克隆进pAdApt35IP1(ECACC保藏号P02041228，这一质粒的克隆细节参见WO00/70071)。所述质粒用NheI和AvrII消化，用牛小肠磷酸酶(New England Biolabs)去磷酸化。用GeneClean试剂盒从凝胶中分离消化的DNA。质粒pΔMT.Orf6.Hygro(图1，ECACC保藏号P02041226)用NheI消化，随后用Xbal部分消化。在凝胶上分离所得条带后，从凝胶中纯化相应于与E4-orf6序列连接的ΔMT启动子的1350bp片段。接下来，将两个分离的片段连接并转化进电感受态DH10B细胞(Invitrogen/LifeTechnologies)中，之后选择具有相对于SV40 poly(A)信号为正确方向的插入体的菌落，以进行大规模DNA制备。这导致产生构建体pAd35.ΔMT.Orf6(图2)，其含有与一种突变的金属硫蛋白启动子(ΔMT)功能性连接的Ad5 E4-orf6编码序列。ΔMT启动子由Hagmeyer et al.(1996)描述。所述Ad5 E4-orf6序列相应于Ad5序列(Genbank accession number M73260)的第33193位核苷酸至第34077位核苷酸。为测试Ad5 E4-orf6蛋白的表达是否使得能在Ad5互补细胞上生产完全缺失E1的Ad35载体，将pAd35.ΔMT.Orf6与Ad35主链构建体pWE.Ad35.pIX-rITR共转染进PER.C6细胞。为此，pAd35.ΔMT.Orf6用PI-Psp-1消化，pWE.Ad35.pIX-rITR用NotI消化，以从主链中释放腺病毒插入序列。用LipofectAmine转染2μg消化的pAd35.ΔMT.Orf6和6μg消化的pWE.Ad35.pIX-rITR。将转染混合物加入到前一天以3.5 x 106个细胞/T25培养瓶的密度接种的PER.C6细胞中。第二天，将培养基更换为PER.C6培养基(含10％FBS和10mM MgCl2的DMEM)，细胞继续在37℃/10％CO2下培养。对照转染用pAdApt35.Luc与pWE.Ad35.pIX-rITR共转染，以及用pWE.Ad35.pIX-rITR单独转染。转染后2天，将细胞从T25转移到T80培养瓶，并如上所述温育。再3天后，用pAd35.ΔMT.Orf6与Ad35主链共转染的培养物显示出细胞致病变作用(cytopathogenic effect)(CPE)，表示有病毒复制，再温育2天后收获培养物。将细胞悬液进行2轮冻/融循环，将所得材料(粗裂解物)在—20℃保存直至进一步使用。其它培养瓶未显示出CPE，在转移进T80培养瓶6天后将其以1：3转移进T80培养瓶中。再5天后，pAdApt35.Luc+pWE.Ad35.pIX-rITR转染的培养瓶显示少量类似CPE的事件，但是其不再发展。用得自pAd35.ΔMT.Orf6转染的0.2和0.5ml粗裂解物再感染T80培养瓶中的大约85％铺满的PER.C6细胞，在温育1天后产生完全CPE，表明在粗裂解物中存在感染性病毒。这些培养物也经过两次冻/融循环而收获。用构建体pAd35.ΔMT.Orf6单独在PER.C6上进行额外的对照转染，以证实orf6表达本身不产生细胞毒性和CPE样细胞死亡。结论是，仅仅是pAd35.ΔMT.Orf6与pWE.Ad35.pIX-rITR一起的转染产生CPE和病毒复制。
进行PCR分析以证实存在基于Ad35的病毒基因组中，其中该病毒基因组中Ad5-E4-orf6置换了先前的E1区。为此，如下所述从粗裂解物中分离病毒DNA：将275μl粗裂解物与10μl DNaseI(10mg/ml)在37℃温育30分钟。随后，加入6.0μl0.5M EDTA(pH8.0)，7.5μl20％SDS和1.5μl20mg/ml蛋白酶K并涡旋混合。随后将混合物在50℃温育1小时。最后用GeneClean Spin试剂盒(Bio101，Inc.)分离病毒DNA。随后将2μl分离的DNA用引物35psi-For和35R4(表1)进行PCR扩增。扩增程序为94℃2分钟，随后30个循环的94℃30秒、58℃30秒和72℃5分钟，最后在72℃温育10分钟。所述引物特异于Ad35序列并产生一2.9kb片段，其从包装序列直至nt4669(如wtAd35序列编号)，因此包括Ad5orf6转基因盒。所得PCR片段的电泳显示这些片段具有与在衔接(adapter)质粒pAd35.ΔMT.Orf6上产生的对照PCR片段相匹配的预期长度。因此，如果病毒也表达Ad5-E4orf6，则可以在Ad5互补细胞上制备完全E1缺失的基于Ad35的载体。
实施例2.pWE.Ad35.pIX-rITR5E4的构建
用引物DF35-1和35FR(表1)扩增第一个PCR片段。用pWE.Ad35.pIX-rITR(见WO00/70071)作为模板DNA，使用Pwo DNA聚合酶(Roche)以及额外的DMSO(Sigma，终浓度3％)进行扩增，扩增程序如下：94℃2分钟随后30个循环(94℃30秒，52℃30秒，72℃3分钟)，最终步骤为72℃8分钟以保证获得完整片段。扩增产生一1.6kb片段，相应于Ad35序列的nt30224—31805。在3’末端引入一BamHI位点。用GeneClean试剂盒从凝胶中纯化扩增的DNA，并连接进pCRScript/Amp克隆载体试剂盒(Stratagene)。转化进电感受态DH10B细胞后，选择白色菌落进行进一步分析。这导致产生构建体pCR-fiber35。由于是平端克隆，因此PCR片段可以以两个方向插入。选择在5′末端的pCRScript/Amp多接头中具有BamHI位点的插入体的克隆。因此用BamHI消化产生一个1.6kb片段。测序证实该PCR片段的正确扩增。第二个PCR片段用引物5E4F和5E4R(表1)扩增。用pWE.Ad5.AflII-rITRsp进行扩增，其是一种在pWE.Ad5.AflII-rITR(ECACC保藏号P97082116，在本申请人的国际申请PCT/NL01/00824中所述)中含有—额外PacI位点的粘粒载体。如上所述使用pWE.Ad5.AflII-rITRsp作为模板，使用Pwo DNA聚合酶，当然pWE.Ad5.AflII-rITR也可用于这一目的。从凝胶中纯化后，将DNA用SstI和BamHI(在PCR过程中引入了这两个位点)消化，用GeneClean试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化3kb片段。被扩增的Ad5E4区相应于Ad5序列的32794碱基对至35828碱基对。用引物355ITR和353ITR(表1)在pWE.Ad35.pIX-rITR上产生第三个PCR片段。如上所述进行PCR扩增。所得160bp片段两侧为SstI位点(5′末端)和EcoRI位点(3′末端)。如上所述从凝胶中纯化后，将该DNA用SstI和EcoRI消化。随后在低熔点琼脂糖凝胶上从消化混合物(digested ends)中分离相应于Ad35的右侧ITR(right ITR)的160bp片段，并收集在凝胶中。接下来，用BamHI和EcoRI消化pUC119，用GeneClean试剂盒从凝胶中纯化3.1kb片段。随后上述处理的第二个和第三个PCR片段与BamHI/EcoRI消化的pUC119连接，产生pUC.Ad5E4-35ITR。对克隆的FCR衍生插入体进行测序以证实正确的扩增。接着，用BamHI切割pCR-fiber35中的1.6kb插入序列，如上所述从凝胶中纯化所述片段。pUC.Ad5E4-35ITR也用BamHI消化，并从凝胶中纯化线性片段。两个片段进行连接，选择互相具有正确方向的克隆，产生pUC.35-5E4(图3)。图4示意性绘出了构建pUC.35-5E4的步骤。将pUC.35-5E4中的腺病毒插入序列亚克隆进具有Ad353′序列的构建体pBr.Ad35.PRn(图5；参见WO 00/70071)中。为此，将构建体pUC.35-5E4用MluI和NotI消化，并用GeneClean试剂盒从凝胶中纯化4.7kb片段。这一片段随后与MluI和NotI消化构建体pBr.Ad35.PRn产生的载体片段连接。用琼脂糖酶(Roche)从凝胶中纯化这一16.3kb片段。然后将连接物转化进感受态DH10B细胞中。所得构建体命名为pBr.Ad35.PR5E4(图6，ECACC保藏号P02041229)。最后一步是将Ad35序列的修饰的3′末端克隆进病毒粘粒克隆pWE.Ad35.pIX-rITR中。为此，根据厂商指导将两个片段组合进λ噬菌体包装反应(Stratagene)中。第一个片段是通过用PacI和SwaI消化从pBr.Ad35.PR5E4获得的16.8kb的修饰的Ad35插入序列，第二个片段是通过用PacI和SwaI消化pWE.Ad35.pIX-rITR获得的22.8kb的片段。两个片段的正确组合产生pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4(图7)。因此，在此构建体中，Ad35主链中的E4区被衍生自Ad5的相应区域替换。
实施例3：pWE.Ad35.pIX-rITR5Orf6的构建
为了获得含有从pIX基因(Ad35序列的第3401位核苷酸)至右侧ITR的末端的Ad35序列但是E4-orf6和E4-orf6/7序列替换为Ad5的相应序列的腺病毒主链构建体，如下所述将Ad5和Ad35序列进行PCR扩增并组合。用Pwo DNA聚合酶并添加直至3％的DMSO产生PCR片段。第一个PCR用pBr.Ad35.PRn(图5；见WO00/70071)作为摸板和引物E4-F1和E4-R2(表1)进行。扩增程序如下：94℃ 2分钟，5个循环的(94℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟)，随后30个循环的(94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟)，最后步骤为68℃ 8分钟。用GeneClean试剂盒纯化所得1.8kb片段。第二个PCR用pWE.Ad5.AflII-rITRsp作为模板和引物E4-F3和E4-R4(表1)进行，pWE.Ad5.AflII-rITRsp是在pWE.Ad5.AflII-rITR(ECACC保藏号P97082116，见本申请人的国际专利申请PCT/NL01/00824)中含有一个PacI位点的一种粘粒载体。扩增程序如下：94℃ 2分钟，随后30个循环的(94℃ 30秒、62℃ 30秒和72℃ 1分钟)，最后步骤为68℃ 8分钟。如上所述纯化1.1kb片段。第三个PCR用pBr.Ad35.PRn作为模板和引物E4-F5和E4-R6(表1)进行。扩增程序如下：94℃ 2分钟，5个循环的(94℃ 30秒、48℃ 30秒和72℃ 45秒)，随后30个循环的(94℃ 30秒、56℃ 30秒和72℃ 45秒)，最后步骤为68℃ 8分钟。如上所述纯化366bp片段。将纯化片段的样品上样至凝胶上估计浓度，然后混合这些片段以在30微升总体积中含有700ngPCR-1、650ng PCR-2和430ng PCR-3。向此混合物中加入3微升EcoPol缓冲液(New England Biolabs)，3微升2mM dNTP溶液和3微升milliQ水。在94℃温育所得混合物3分钟，然后在一PCR仪中以0.5℃/秒速率冷却至65℃。在65℃温育10分钟后，以0.05℃/秒的速率将混合物进一步冷却至20℃，并在20℃温育10分钟。随后加入1微升(5单位)Klenow酶(New England Biolabs)，随后于37℃温育60分钟。将5微升这一Klenow混合物用作模板以如下分别扩增两个片段。引物组1：NF-1和NcoI-R(表1)用于一反应中，使用Pwo DNA聚合酶(Roche)，添加DMSO至终浓度为3％，PCR仪如下设定：94℃ 2分钟，随后30个循环的(94℃ 30秒、66℃ 30秒和72℃ 3分钟)，最后步骤为68℃ 8分钟。引物组2：NcoI-F和NR-2(表1)用于一反应中，使用Pwo DNA聚合酶(Roche)，添加DMSO至终浓度为3％，PCR仪如下设定：94℃ 2分钟，随后30个循环的(94℃ 30秒、62℃ 30秒和72℃ 90秒)，最后步骤为68℃ 8分钟。所得2.7kb(引物组1)和1.1kb(引物组2)片段用GeneClean试剂盒从凝胶中纯化，并分别与pCRscriptAmp载体(Stratagene)连接并转化进DH10B电感受态细胞。这产生了构建体pCRscriptAmp.NFI-NcoIR(图8)和构建体pCRscriptAmp.NcoIF-NR2(图9)。由于插入序列含有平端，因此每一克隆获得两种方向。用KpnI消化，选择具有进一步克隆所需方向的构建体(见图8和图9)。然后测序插入序列以证实正确扩增。接下来，来自pCRscriptAmp-NcoIF-NR2的部分插入序列用BamHI和NcoI酶切，并如上所述从凝胶中纯化。pCRscriptAmp-NFI-NcoIR用相同酶消化，从凝胶中纯化含载体的片段。这些片段的连接产生pCR.NF1-NR2(图10)。pCR.NF1-NR2含有Ad35序列的nt30162—33234之间的Ad35序列，其中nt31879—32974之间的E4-orf6和E4-orf6/7序列用位于来自Genbank中公布的Ad5序列(登录号M73260)的32968—34077之间的Ad5衍生序列替换。因此，如图11和12中所示的氨基酸对比可见，克隆的E4-orf6蛋白的氨基酸序列与Ad5中发现的E4-orf6序列相同，E4-orf6/7氨基酸序列大部分与Ad5中存在的E4-orf6/7序列相同。很明显，在不偏离本发明的情况下可以用上述通用方法设计不同的杂合Ad35-Ad5E4构建体。然后来自pCR.NF1-NR2的这一嵌合插入序列被克隆进pWE.Ad35.pIX-rITR中，pCR.NF1-NR-2用MluI和NdeI消化，用GeneClean试剂盒从凝胶中纯化所得2.8kb片段。构建体pBr.Ad35.PRn也用MluI和NdeI消化，用琼脂糖酶(Roche)从凝胶中分离18kb载体片段。两个片段的连接产生构建体pBr.Ad35.PR.5Orf6(图13，ECACC保藏号P02041227)。在这一构建体中的位于PacI和SwaI之间的含有嵌合E4区域的Ad35序列随后用如上所述的λ噬菌体包装克隆进构建体pWE.Ad35.pIX-tITR中。所得pWE.Ad35pIX-rITR.5Orf6(图14)随后通过与Ad35衔接质粒在PER.C6包装细胞上共转染而用于产生重组的基于Ad35的病毒。
实施例4.pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3、pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3.5E4和pWE.Ad35.pIX-rITRΔE35Orf6的构建
Ad35主链通过缺失E3序列而进一步修饰。已知E3蛋白调节宿主对腺病毒感染的免疫应答，因此对于重组病毒的体外增殖不是必需的。另外，E3序列的缺失使得在载体中可以插入更大的异源序列而不影响包装效率。另外，对于腺病毒载体作为免疫接种载体的应用，表达由E3区编码的免疫调节基因也是不优选的。下面描述缺失质粒pBr.Ad35.PRn(图5)中的E3序列的方法。
首先，用pBr.Ad35.PRn作为模板DNA，用引物35E3for和35E3rev(表1)利用Pwo DNA聚合酶(Roche)根据厂商指导产生一PCR产物。程序设定如下：94℃ 2分钟和30个循环的94℃ 30秒、58℃30秒和72℃ 1分钟，随后68℃ 8分钟。扩增片段含有从nt 26814至27647的Ad35序列(见WO00/70071)，其3’末端为MluI位点。所得833bp片段用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化并用MluI和StuI消化。消化的PCR片段随后用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从LMP琼脂糖凝胶中纯化。构建体pBr.Ad35.PRn也用MluI和StuI消化，用本领域技术人员已知的方法用琼脂糖酶(Roche)从琼脂糖凝胶中分离17.3kb的含有载体的片段。连接两个分离的DNA并转化进Max—efficiency DH5α感受态细菌(Invitrogen/LTI)中以制备pBr.Ad35.PRnΔE3(图15)。缺失的序列包含Ad35序列的nt27648-30320，即产生2673bp的缺失。然后使用λ噬菌体包装提取物(Stratagene)将该E3缺失导入构建体pWE.Ad35.pIX-rITR中。为此，将pWE.Ad35.pIX-rITR和pBr.Ad35.PRnΔE3用PacI和SwaI消化，用琼脂糖酶(Roche)从低熔点琼脂糖凝胶中分别分离22.8kb和14kb的片段。连接并用STBL-2细胞(Invitrogen/LTI)包装后，获得构建体pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3。
为构建上述E4修饰的主链构建体的E3缺失版本，如下所述将E4修饰导入pBr.Ad35.PRnΔE3构建体。用MluI和NotI消化构建体pUC.35-5E4(图3)，用GeneClean II试剂盒从凝胶中分离4.7kb片段。构建体pBr.Ad35.PRnΔE3也用MluI和NotI消化，用GeneClean spin试剂盒从凝胶中分离13.6kb的载体片段。这些片段的连接产生构建体pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4(图16)。构建体pCR.NF1-NR2(图10)用MluI、NdeI和BglI消化(后一种酶用于将载体片段消化成较小的片段)，用GeneClean spin试剂盒从凝胶中分离2.8kb片段。构建体pBr.Ad35.PRnΔE3用MluI和NdeI消化，用CIP酶(New EnglandBiolabs)去磷酸化，所得15.2kb载体片段也用GeneClean spin试剂盒分离。这些片段的连接产生构建体pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6(图17)。然后如本文所述使用pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4和pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6将pWE.Ad35.pIX-rITR中的3’PacI-SwaI片段交换为来自pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4和pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6中的相应区域。这导致产生构建体pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3.5E4和pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3.5Orf6。产生这些大粘粒的另一种方法是在用于包装的连接反应中使用3个片段：l4.7kb的来自pWE.Ad35.pIX-rITR的NotI-PacI片段、来自pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4或pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6的PacI-NotI插入序列以及NotI消化的pWE15粘粒载体片段(Stratagene)。后一片段也可以从pWE.Ad35.pIX-rITR的NotI/PacI消化产物中分离。
实施例5  在PER.C6细胞上产生E1和E1/E3缺失的基于Ad35的载体
为了使得能用基于pBR.Ad35.PRn的构建体在互补细胞系PER.C6上产生重组Ad35病毒，我们首先制备了一种新构建体，其含有来自Ad35序列(WO00/70071)的bp3401—bp24650的Ad35序列，并因此与衔接质粒和基于pBr.Ad35.PRn的构建体是重叠的。将这三个质粒转染进PER.C6细胞中，一个双同源重组事件导致图18所示的完整病毒基因组和重组病毒的复制。所需质粒通过缺失pWE.Ad35.pIX-rITR中的大部分Ad35序列而制备。为此，pWE.Ad35.pIX-rITR用EcoRV消化，用GeneClean spin试剂盒从低熔点凝胶中纯化29kb含载体片段。将纯化的DNA进行自连，并用于转化DH10B电感受态细菌(Invitrogen/LTI)，产生pWE.Ad35.pIX-EcoRV(图19)。
用于转染的所有DNA如表2所示进行消化，在65℃热灭活15分钟，转染中不进一步处理。在转染前一天将PER.C6细胞以3×106个细胞/培养瓶的密度接种于T25培养瓶中，并如表2所示根据厂商指导用Lipofectamine(Invitrogen/LTI)转染，除了在无血清DMEM培养基(Gibco/BRL)中的转染混合物5小时后用PER.C6培养基(DMEM，10％FBS和10mM MgCl2)更换。1天后，通过荧光显微术估计转染效率为50％。2天后，将细胞用胰蛋白酶处理，再接种于T80培养瓶中进一步在37℃/10％CO2下温育。转染后6天，除了用Ad35.AdApt.eGFP+pWE.Ad35.pIX-rITR转染的PER.C6培养物之外的所有培养物均显示充分的细胞致病变作用(CPE，病毒增殖的指示)。1天后，收获培养瓶中具有CPE的细胞和培养基并进行两次冻/融循环，离心(1500rpm下10分钟)清除细胞碎片，将100微升这一粗裂解物用于再感染在T80培养瓶中的85％铺满的新鲜的PER.C6细胞。经胰蛋白酶处理收获不显示CPE迹象的Ad35.AdApt.eGFP+pWE.Ad35.pIX-rTR转染物并如上所述处理。感染新鲜PER.C6细胞2天后，除了在初次收获时不显示CPE迹象的培养瓶之外，所有的培养瓶均显示充分的CPE。这清楚表明当从Ad35主链表达Ad5 E4-orf6基因产物时，可以在PER.C6细胞上制备完全E1缺失的基于Ad35的病毒。
表1引物序列
35FR      5’-CGGGATCCACTTTATTTTAGTTGTCGTCTTC-3’(SEQ ID NO：1)
35R4      5’-CGGAATTCTTAATTAAGGGAAATGCAAATCTGTGAGG-3’(SEQ ID NO：2)
35psi-For 5’-GTGGTATTTATGGCAGGGTG-3’(SEQ ID NO：3)
DF35-1    5’-CACTCACCACCTCCAATTCC-3’(SEQ ID NO：4)
5E4F      5’-CGGGATCCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTG-3’(SEQ ID NO：5)
5E4R      5’-GCTGGCGAGCTCGGCGGAGTAACTTGTATGTG-3’(SEQ ID NO：6)
355ITR    5’-GATCCGGAGCTCACAACGTCATTTTCCCACG-3’(SEQ ID NO：7)
353ITR    5’-AGGAATTCGCGGCCGCATTTAAATC-3’(SEQ ID NO：8)
E4-F1     5’-AGAGGAACACATTCCCCC-3’(SEQ ID NO：9)
E4-R2     5’-GGGGAGAAAGGACTGTGTATTCTGTCAAATGG-3’(SEQ ID NO：10)
E4-F3     5’-TTTGACAGAATACACAGTCCTTTCTCCCCGGCTGG-3’(SEQ ID NO：11)
E4-R4     5’-ACAAAATACGAGAATGACTACGTCCGGCGTTCC-3’(SEQ ID NO：12)
E4-F5     5’-GGACGTAGTCATTCTCGTATTTTGTATAGC-3’(SEQ ID NO：13)
E4-R6     5’-TCACCAACACAGTGGGGG-3’(SEQ ID NO：14)
NF-1      5’-CCACAACCCCCACTACTCCC-3’(SEQ ID NO：15)
NR-2      5’-CGTCTCTTCCCTCTCCTCTCC-3’(SEQ ID NO：16)
NcoI-R    5’-AGGATCATCCGCTGCTGCCC-3’(SEQ ID NO：17)
NcoI-F    5’-CATCAGGATAGGGCGGTGG-3’(SEQ ID NO：18)
35E3for   5’-AATGACTAATGCAGGTGCGC-3’(SEQ ID NO：19)
35E3rev   5’-CGACGCGTTGTAGTCGTTGAGCTTCTAG-3’(SEQ ID NO：20)
表2如实施例所述用于在PER.C6细胞上产生E1缺失的基于Ad35的病毒构建体的列表。衔接质粒用PacI消化，pWE.Ad35.pIX-EcoRV用NotI和EcoRV消化，E4修饰的基于pBr的构建体用PacI和NotI消化。
Figure C03809352D00301
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<400>9
Figure C03809352D00345
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer E4-R2
<400>10
Figure C03809352D00351
<210>11
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer E4-F3
<400>11
Figure C03809352D00352
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer E4-R4
<400>12
Figure C03809352D00353
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer E4-F5
<400>13
Figure C03809352D00354
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer E4-R6
<400>14
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer NF-1
<400>15
Figure C03809352D00356
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer NR-2
<400>16
Figure C03809352D00361
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer NcoI-R
<400>17
Figure C03809352D00362
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer NcoI-F
<400>18
Figure C03809352D00363
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer 35E3for
<400>19
Figure C03809352D00364
<210>20
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer 35E3rev
<400>20
Figure C03809352D00365
<210>21
<211>294
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Amino acid sequence of the E4-orf6 protein of Adenovirus type 5
<400>21
Figure C03809352D00381
<210>22
<211>299
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Amino acid sequence of the E4-orf6 protein of Adenovirus type 35
<400>22
Figure C03809352D00382
Figure C03809352D00391
<210>23
<211>150
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Amino acid sequence of the E4-orf6+7 protein of Adenovirus type 5
<400>23
Figure C03809352D00392
<210>24
<211>150
<212>pRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Amino acid sequence of the E4-orf6÷7 fusion prctein frcmAdenovirus type 5 and Adenovirus type 35
<400>24
Figure C03809352D00401
<210>25
<211>141
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Amino acid sequence of the E4-orf6+7 protein of Adenovirus type 35
<400>25
Figure C03809352D00402
Figure C03809352D00411

Claims (24)

1.一种重组腺病毒载体，其包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件，其中所述载体还包含编码功能性E4-orf6蛋白的一个序列，其中所述序列是来自与所述第一种血清型不同的第二种血清型腺病毒的E4-orf6编码序列。
2.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述第一种血清型和所述第二种血清型来自不同的腺病毒亚群。
3.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述第一种血清型来自除亚群C之外的一个亚群，且其中所述E4-orf6编码序列来自亚群C的腺病毒血清型。
4.权利要求1的重组腺病毒，其中所述第一种血清型来自亚群B，且所述第二种血清型来自亚群C。
5.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述E4-orf6编码序列来自腺病毒血清型5。
6.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述第一种血清型选自由腺病毒血清型11、14、16、21、34、35和50组成的一组。
7.权利要求1的重组腺病毒载体，其进一步包含编码非腺病毒蛋白、多肽或肽的一个序列。
8.权利要求7的重组腺病毒载体，其中所述非腺病毒蛋白、多肽或肽选自由细胞死亡诱导多肽、病原生物体的抗原决定簇、肿瘤特异性抗原、病毒蛋白、激素及细胞因子组成的一组中。
9.生产包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件的重组腺病毒载体的方法，所述方法包括如下步骤：
a).提供腺病毒的必需元件给互补细胞，所述细胞携带可表达形式的来自第二种血清型腺病毒的E1B-55K编码序列，使得可以通过所述互补细胞装配所述重组腺病毒载体，其中所述元件包含来自与所述第二种血清型不同的所述第一种血清型腺病毒的至少一些结构元件和非结构元件及编码来自所述第二种血清型腺病毒的功能性E4-orf6蛋白的序列；
b).在允许腺病毒载体生产和装配的条件下在培养基中培养所述互补细胞；并
c).收获从培养基和/或互补细胞中如此产生的重组腺病毒载体，其中编码E4-orf6蛋白的序列存在于如此产生的重组腺病毒载体中。
10.权利要求9的方法，其中所述第一种和所述第二种血清型来自不同亚群。
11.权利要求9的方法，其中所述第二种血清型是亚群C的腺病毒血清型。
12.权利要求11的方法，其中所述第二种血清型是腺病毒血清型5。
13.权利要求9的方法，其中所述第一种血清型是亚群B的腺病毒血清型。
14.权利要求9的方法，其中所述第一种血清型选自由腺病毒血清型11、14、16、21、34、35和50组成的组中。
15.权利要求9的方法，其中所述E1B-55K编码序列整合进所述互补细胞的基因组中。
16.权利要求9的方法，其中所述互补细胞衍生自原代二倍体人细胞或者其祖细胞。
17.权利要求9的方法，其中所述互补细胞衍生自原代人成视网膜细胞、原代人胚肾细胞、原代人神经元细胞或者原代人羊膜细胞。
18.权利要求9的方法，其中所述互补细胞包含整合进其基因组的编码至少一种腺病毒E1A蛋白的一种核酸。
19.权利要求18的方法，其中所述编码至少一种腺病毒E1A蛋白的核酸来自不同于亚群B的一个亚群的腺病毒血清型。
20.权利要求18的方法，其中所述编码至少一种腺病毒E1A蛋白的核酸来自亚群C的腺病毒血清型。
21.权利要求19的方法，其中所述编码至少一种腺病毒E1A蛋白的核酸来自腺病毒血清型5。
22.权利要求9的方法，其中所述互补细胞是PER.C6细胞。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1—8中任一项的重组腺病毒载体或者可通过权利要求9—22中任一项的方法获得的重组腺病毒载体。
24.试剂盒，其包含：
a)一种生产包含第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件的重组腺病毒载体的互补细胞，所述细胞携带可表达形式的来自第二种血清型腺病毒的E1B-55K编码序列；和
b)包含所有必需的腺病毒元件的一或多个可复制的核酸载体，以便允许通过所述互补细胞装配所述重组腺病毒载体，其中所述元件包含至少一些来自与所述第二种血清型不同的所述第一种血清型腺病毒的结构元件和非结构元件及编码来自所述第二血清型腺病毒的功能性E4-orf6蛋白的序列。
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