CN100503639C - 重组肿瘤特异性抗体及其应用 - Google Patents
重组肿瘤特异性抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100503639C CN100503639C CNB02809297XA CN02809297A CN100503639C CN 100503639 C CN100503639 C CN 100503639C CN B02809297X A CNB02809297X A CN B02809297XA CN 02809297 A CN02809297 A CN 02809297A CN 100503639 C CN100503639 C CN 100503639C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- sequence
- epcam
- heavy chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 136
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 132
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 65
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 61
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 47
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 abstract description 4
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 abstract description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 123
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 52
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 21
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 20
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 19
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 18
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 18
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 17
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 16
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 15
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 14
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 11
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 11
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 7
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000008676 import Effects 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 6
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 4
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 4
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 4
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 4
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 4
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 4
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 4
- 102100022949 Immunoglobulin kappa variable 2-29 Human genes 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000018594 Tumour necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 108050007852 Tumour necrosis factor Proteins 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- -1 IL-14 Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000002083 iodinating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102200016293 rs61752141 Human genes 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 1
- 101100191768 Caenorhabditis elegans pbs-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 240000008821 Menyanthes trifoliata Species 0.000 description 1
- 235000011779 Menyanthes trifoliata Nutrition 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- DEFJQIDDEAULHB-UHFFFAOYSA-N N-D-alanyl-D-alanine Natural products CC(N)C(=O)NC(C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102220532739 SPARC-like protein 1_P9A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M iodate Chemical compound [O-]I(=O)=O ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 102200068162 rs121909499 Human genes 0.000 description 1
- 102200057424 rs138789658 Human genes 0.000 description 1
- 102200139516 rs35960830 Human genes 0.000 description 1
- 102220054995 rs373913704 Human genes 0.000 description 1
- 102220041913 rs587780812 Human genes 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 108700008509 tucotuzumab celmoleukin Proteins 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
本发明提供了特异结合人上皮细胞粘附分子的抗体家族。所述抗体包含修饰的可变区，更具体地，修饰的构架区，当施用给人类时所述修饰降低抗体的免疫原性。当所述抗体与合适的部分偶联时，可用于癌症的诊断、预后和治疗。
Description
相关申请
本申请要求在2001年5月3日提交的U.S.S.N.60/288,564的利益和优选权，所述申请的内容在此引用作为参考。
发明领域
本发明广义地说涉及到重组抗体。更具体地，本发明涉及特异结合人上皮细胞粘附分子的重组抗体，并涉及其作为诊断、预后和治疗剂的应用。
发明背景
在过去的几年中，基于抗体的治疗方法的发展已取得显著的进步。例如，研究者不仅已鉴定出多种癌症特异的标记而且还鉴定出与这些标记特异结合的多种抗体。抗体可用于将特定分子，例如毒素或免疫刺激部分，例如细胞因子，递送到表达标记的癌细胞以选择性杀伤癌细胞(参见如，美国专利Nos.5,541,087和5,650,150)。
KS-1/4抗体为指向人上皮细胞粘附分子(EpCAM)的鼠源单克隆抗体。EpCAM在某些上皮细胞的顶端面以非常低的水平表达。例如，EpCAM在肠细胞面向摄入的食物且远离循环的细胞表面进行表达，其在此处将不会接触到免疫系统的多数蛋白质和细胞(Balzar等.[1999]分子医学杂志(J.Mol.Med.)77：699-712)。
但在某些情形下，EpCAM在某些细胞如上皮来源的肿瘤细胞上高度表达。通常，这些肿瘤细胞已经失去极性，这导致EpCAM表达于细胞的整个表面。因此，EpCAM是将基于抗体的免疫刺激部分定向到肿瘤细胞的方便的肿瘤特异性标记(Simon等.[1990]Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78：2755-2759；Perez等.[1989]免疫学杂志(J Immunol.)142：3662-3667)。
但是，抗体可能在宿主哺乳动物中具有相关的免疫原性。这在抗体并非自体来源时更易于发生。因此，基于抗体的治疗的效果由于针对抗体的免疫原性反应而经常受到影响。当抗体全部或部分源自与宿主哺乳动物不同的哺乳动物时，免疫原性反应通常会增加，例如，当抗体源自小鼠而受体为人时。相应地，可能有用的是：将鼠源抗体修饰为更类似于人类抗体的抗体以降低鼠源抗体的免疫原性或使其最小化。
尽管已发展了多种途径，包括例如嵌合抗体、人源化抗体和贴面化(veneering)抗体，但，本领域内仍存在对可结合癌症特异标记且当施用给人类时具有减低免疫原性的抗体的需要。此外，本领域内存在对这样抗体的需要，所述抗体可以将毒素或免疫刺激部分以例如，融合蛋白质或免疫缀合物的形式递送到癌症特异标记处以选择性杀伤肿瘤细胞。
发明概要
本发明部分基于对重组抗体的鉴定，所述抗体特异结合人EpCAM但在人类中其免疫原性低于模板，即鼠抗-EpCAM抗体的免疫原性。具体地，本发明提供了这样的重组KS抗体，在该抗体中定义一个或多个构架区和/或互补决定区的氨基酸序列已经经过了修饰从而降低了其在人类中的免疫原性。
如此处所应用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”应理解为(i)完整抗体(例如，单克隆抗体或多克隆抗体)，(ii)其抗原结合部分，包括，例如，Fab片段、Fab′片段、(Fab′)2片段、Fv片段、单链抗体结合位点、sFv，(iii)双特异性抗体和其抗原结合部分，和(iv)多特异性抗体和其抗原结合部分。
如此处所应用，术语“特异结合”、“特异地结合”和“特异的结合”意指抗体对特定抗原的结合亲合力为至少约106M-1、更优选地至少约107M-1、更优选地至少约108M-1、且最优选地至少约1010M-1。
如此处所应用，术语“互补决定区”和“CDR”应理解为指主要与抗原作用的免疫球蛋白可变区的高变区或环。免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)均含有三个插入在构架区之间的CDR，如在图1中所显示的。例如，对于SEQ ID NO：1中显示的定义KS-1/4抗体的免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列，CDR由Ser24到Leu33(CDR1)、Asp49到Ser55(CDR2)以及His88到Thr96(CDR3)的氨基酸序列定义。对于SEQID NO：2中显示的定义KS-1/4抗体的免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列，CDR由Gly26到Asn35(CDR1)、Trp50到Gly66(CDR2)以及Phe99到Tyr105(CDR3)的氨基酸序列定义。此处描述的其它抗体的相应CDR通过与相应的KS-1/4重链或轻链序列比对后在图1A-1C中显示。
如此处所应用，术语“构架区”和“FR”意在理解为免疫球蛋白可变区中与互补决定区邻近的区域。免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)均含有四个FR，如在图1中所显示的。例如，对于SEQ IDNO：1中显示的定义KS-1/4抗体的免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列，FR由从Gln1到Cys23(FR1)、从Trp34到Phe 48(FR2)、从Gly56到Cys87(FR3)以及从Phe97到Lys106(FR4)的氨基酸序列定义。对于SEQ IDNO：2中显示的定义KS-1/4抗体的免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列，FR由从Gln1到Ser25(FR1)、从Trp36到Gly49(FR2)、从Arg67到Arg98(FR3)以及从Trp106到Ser116(FR4)的氨基酸序列定义。通过与相应KS-1/4重链或轻链序列比对后此处描述的其它抗体的FR在图X和Y中显示。
如此处所应用，术语“KS抗体”意在理解为与由杂交瘤表达的鼠抗体KS-1/4特异结合相同的人EpCAM抗原的抗体，(参见，例如，癌症研究(Cancer Res.)1984，44((2)：681-7)。KS抗体优选地包含(i)限定免疫球蛋白轻链CDR1序列中的至少一部分的SASSSVSY氨基酸序列(SEQ ID NO：1的24-31位氨基酸)，(ii)限定免疫球蛋白轻链CDR2序列中的至少一部分的DTSNLAS氨基酸序列(SEQ ID NO：1的49-55位氨基酸)，(iii)限定免疫球蛋白轻链CDR3序列中的至少一部分的HQRSGYPYT氨基酸序列(SEQID NO：1的88-96位氨基酸)，(iv)限定免疫球蛋白重链CDR1序列中的至少一部分的GYTFTNYGMN氨基酸序列(SEQ ID NO：2的26-35位氨基酸)，(v)限定免疫球蛋白重链CDR2序列中的至少一部分的WINTYTGEPTYAD氨基酸序列(SEQ ID NO：2的50-62位氨基酸)，或(vi)限定免疫球蛋白重链CDR3序列中的至少一部分的SKGDY氨基酸序列(SEQ ID NO：2的101-105位氨基酸)，或前述的任何组合。
一方面，本发明提供了特异结合EpCAM的重组抗体，其中抗体包含的氨基酸序列的一部分限定免疫球蛋白VL结构域的构架区。在一个实施方案中，构架区(FR1)由SEQ ID NO：5中的1-23位氨基酸残基限定，其中Xaa1为Q或E，Xaa3为L或V，Xaa10为I或T，Xaa11为M或L，Xaa13为A或L，Xaa18为K或R，或Xaa21为M或L，条件是Xaa1、Xaa3、Xaa10、Xaa11、Xaa13、Xaa18和Xaa21位的氨基酸残基中的至少一个不与SEQ ID NO：1中相应位置的氨基酸相同。每一位置上氨基酸由标准单字母代码表示。
在另一实施方案中，构架区(FR2)由SEQ ID NO：5的34-48位氨基酸残基限定，其中Xaa41为S或Q，Xaa42为S或A，Xaa45为P或L，或Xaa46为W或L，条件是Xaa41、Xaa42、Xaa45和Xaa46位的氨基酸残基中至少一个不与SEQ ID NO：1中相应位置的氨基酸相同。
在另一实施方案中，构架区(FR3)由SEQ ID NO：5的56-87位氨基酸残基限定，其中Xaa57为F或I，Xaa69为S或D，Xaa71为S或T，Xaa73为I或T，Xaa77为M或L，Xaa79为A或P，Xaa82为A或F，或Xaa84为T或V，条件是Xaa57、Xaa69、Xaa71、Xaa73、Xaa77、Xaa79、Xaa82和Xaa84位的氨基酸残基中至少一个不与SEQ ID NO：1中相应位置的氨基酸相同。
另一方面，本发明提供特异结合EpCAM的重组抗体，其中抗体包含的氨基酸序列的一部分限定免疫球蛋白VL结构域中的构架区。在一个实施方案中，构架区(FR1)由SEQ ID NO：6的1-25位氨基酸残基限定，其中Xaa2为I或V，Xaa9为P或A，Xaa11为L或V，或Xaa17为T或S，条件是Xaa2、Xaa9、Xaa11和Xaa17位的氨基酸残基中至少一个不与在SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸残基相同。
在另一实施方案中，构架区(FR2)由SEQ ID NO：6的36-49位氨基酸残基限定，其中Xaa38为K或R，Xaa40为T或A，或Xaa46为K或E，条件是Xaa38、Xaa40、Xaa46位的氨基酸残基中至少一个不与SEQ IDNO：2中相应位置的氨基酸相同。
在另一实施方案中，构架区(FR3)由SEQ ID NO：6的67-98位氨基酸残基限定，其中Xaa68为F或V，Xaa69为A或T，Xaa70为F或I，Xaa73为E或D，Xaa76为A或T，Xaa80为F或Y，Xaa83为I或L，Xaa84为N或S，Xaa85为N或S，Xaa88为N、A或S，Xaa91为M或T，或Xaa93为T或V，条件是Xaa68、Xaa69、Xaa70、Xaa73、Xaa76、Xaa80、Xaa83、Xaa84、Xaa85、Xaa88、Xaa91和Xaa93位的氨基酸残基中的至少一个不与SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸相同。在另一实施方案中，构架区(FR4)由SEQ ID NO：6的106-116位氨基酸残基限定，其中Xaa108为Q或T。
在另一实施方案中，免疫球蛋白VL结构域包含选自如下的FR1序列：(i)SEQ ID NO：9的1-23位氨基酸残基；及(ii)SEQ ID NO：8的1-23位氨基酸残基。在另一实施方案中，免疫球蛋白VH结构域包含由SEQ ID NO：18的1-25位氨基酸残基限定的FR序列和/或由SEQ ID NO：18的67-98位氨基酸残基限定的FR序列。更优选地，VL结构域包含由SEQ ID NO：9的1-106位氨基酸限定的氨基酸序列和/或VH结构域包含由SEQ IDNO：18的1-116位氨基酸限定的氨基酸序列。
此外，抗体可任选地包括限定至少一部分CDR序列的如下氨基酸序列，该序列包括，例如，(i)SEQ ID NO：1的24-31位氨基酸残基；(ii)SEQID NO：1的49-55位氨基酸残基；和/或(iii)SEQ ID NO：1的88-96位氨基酸残基。类似地，抗体可任选地包括限定至少一部分CDR序列的如下氨基酸序列，该序列包括，例如，(i)SEQ ID NO：2的26-35位氨基酸残基；(ii)SEQ ID NO：2的50-62位氨基酸残基；和/或(iii)SEQ ID NO：2的101-105位氨基酸残基。
在另一实施方案中，抗体包含抗体的抗原靶向部分-细胞因子融合蛋白质。细胞因子优选地为白细胞介素且更优选地为白细胞介素-2。
在另一方面，本发明提供了编码本发明抗体的至少一个部分的表达载体。在一优选实施方案中，表达载体包含在SEQ ID NO：40中列出的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了对患有与EpCAM过表达相关的疾病(例如这样的疾病，在该疾病中相对于未患疾病的组织，EpCAM在患病组织中以较高水平存在)的人类患者进行诊断、预后和/或治疗的方法。此方法包括给需要此该诊断、预后或治疗的个体施用本发明的一种抗体。
抗体任选地包括与其连接的诊断和/或治疗剂。这些药剂可与抗体融合以产生融合蛋白质。备选地，这些药剂可化学偶联到抗体上以产生免疫-缀合物。这些药剂可预期包括，例如，毒素、放射性标记物、细胞因子、显象剂或类似物。在一优选实施方案中，本发明的抗体与细胞因子融合为融合蛋白质。优选的细胞因子优选地包括白细胞介素如白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-18，造血因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和红细胞生成素，肿瘤坏死因子(TNF)如TNFα，淋巴因子如淋巴毒素，代谢过程调节剂如leptin，干扰素如干扰素α、干扰素β及干扰素γ和趋化因子。优选地，抗体-细胞因子融合蛋白质呈现出细胞因子生物活性。
附图描述
图1A、1B和1C显示出轻链和重链变体与KS抗体的共有序列的比对。免疫球蛋白构架区(FR1-FR4)以-指示。免疫球蛋白互补决定区(CDR1-CDR3)用＊指示。各KS抗体轻链V区片段称作“VK”，其中K指出轻链是κ链的事实。各KS抗体重链V区片段称为“VH”。可替换的氨基酸在共有序列中用“X”表示。
发明详述
本发明提供特异结合人上皮细胞粘附分子(EpCAM)的重组抗体。本发明优选的抗体具有导致在人类中免疫原性降低的改变的可变区。
本发明的抗体可变区特别可用于将抗体和抗体融合蛋白质靶向到在人类患者中过表达EpCAM的肿瘤组织处。在优选的实施方案中，本发明的抗体融合到细胞因子上以形成免疫-细胞因子。
本发明的蛋白质序列
本发明公开了抗体可变区或V区序列家族，当进行适当的异源二聚体化时，所述序列可以与又称为KS抗原或KSA的人上皮细胞粘附分子(EpCAM)结合。本发明优选的蛋白质对于治疗如此处描述的人类患者是有用的。相应地，优选的KS抗体变体是经过人源化、去免疫化(deimmunize)或二种方式处理的，以致在施用给人类时其免疫原性降低。根据本发明，鼠KS抗体可进行去免疫化或人源化，例如，通过应用去免疫化方法——该方法通过导入可减弱肽抗原表位与MHC II类分子结合的突变来消除或削弱潜在T细胞抗原表位(参见，例如WO98/52976和WO00/34317)，或通过应用下述方法，即对非人T细胞抗原表位进行突变以使其相应于存在于人类抗体中的人自体抗原表位(参见，例如，美国专利No.5,712,120)。
I.可变轻链
本发明重组抗-EpCAM抗体所具有的免疫球蛋白可变轻链序列具有以下的氨基酸序列：
X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-T-X-L-W-Y-X-
Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-
X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-X-E-I-K
(SEQ ID NO：3).
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR1的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：3中的1-23位残基表示，即X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa1位Q或E；Xaa3位L或V；Xaa10位I、T或S；Xaa11位M或L；Xaa12位S或A；Xaa13位A、L或V；Xaa17位E或Q；Xaa18位K或R；Xaa19位V或A；以及Xaa21位M、L或I。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa1位E；Xaa 3位V；Xaa10位T或S；Xaa 11位L；Xaa12位A；Xaa13位L或V；Xaa17位Q；Xaa18位R；Xaa19位A；以及Xaa21位L或I。
在另一实施方案中，本发明的重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链CDR1的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：3中24-33位残基表示，即S-A-S-S-S-V-S-T-X-L。更特别地，本发明的重组抗-EpCAM抗体在此CDR1区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa32位M或I。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此CDR1区具有氨基酸替换，例如，Xaa32位I。
在另一实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR2的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：3中的34-48位残基表示，即W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR2区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa36位Q或L；Xaa41位S或Q；Xaa42位S、A或P；Xaa45位P或L；Xaa46位W或L；以及Xaa48位F或Y。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR2区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa36位L；Xaa41位Q；Xaa42位A或P；Xaa45位L；Xaa46位L；以及Xaa48位Y。
在另一实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR3的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：3中的56-87位残基表示，即
G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa57位F或I；Xaa59位A或S；Xaa69位S、D或T；Xaa71位I或T；Xaa73位I或T；Xaa75位S或N；Xaa77位M或L；Xaa79位A或P；Xaa82位A或F；以及Xaa84位T或V。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸替代：Xaa57位I；Xaa59位S；Xaa69位D或T；Xaa71位T；Xaa73位T；Xaa75位N；Xaa77位L；Xaa79位P；Xaa82位F；以及Xaa84位V。
在另一实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR4的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：3中的97-106位残基表示，即F-G-G-G-T-K-X-E-I-K。更特别地，本发明的重组抗-EpCAM抗体在此FR4区具有至少一个以下的氨基酸，例如，Xaa103位L或V。相应地，本发明的重组抗-EpCAM抗体在此FR4区具有氨基酸替换，例如Xaa103位V。
II.可变重链
本发明重组抗-EpCAM抗体所具有的免疫球蛋白可变重链序列具有以下的氨基酸序列：
Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N-
W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G-W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-
X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-X-S-K-G-D-
Y-W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S(SEQ ID NO：4)
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR1的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：4的1到25位残基表示，即Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa2位I或V；Xaa9位P或A；Xaa11位L或V；Xaa16位E或S；以及Xaa17位T或S。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa2位V；Xaa9位A；Xaa11位V；Xaa16位S；以及Xaa17位S。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR2的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：4的36-49位残基表示，即，W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR2区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa38位K或R；Xaa40位T或A；Xaa43位K或Q；以及Xaa46位K或E。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR2区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa38位R；Xaa40位A；Xaa43位Q；以及Xaa46位E。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链CDR2的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：4的50-66位残基表示，即，W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此CDR2区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa63位D或K；以及Xaa65位K或Q。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此CDR2区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa63位K；以及Xaa65位Q。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR3的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：4中的67-98位残基表示，即
R-X-X-X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R。更特别地，本发明的重组抗-EpCAM抗体在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa68位F或V；Xaa69位A、T或V；Xaa70位F或I；Xaa71位S或T；Xaa72位L或A；Xaa73位E或D；Xaa76位A或T；Xaa79位A或L；Xaa80位F或Y；Xaa83位I或L；Xaa84位N或S；Xaa85位N或S；Xaa88位N、A或S；Xaa91位M或T；以及Xaa93位T或V。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa68位V；Xaa69位T或V；Xaa70位I；Xaa71位T；xaa72位A；xaa73位D；Xaa76位T；Xaa79位L；Xaa80位Y；Xaa83位L；Xaa84位S；Xaa85位S；Xaa88位A或S；Xaa91位T；以及Xaa93位V。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链CDR3的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：4中的99-105位残基表示，即F-X-S-K-G-D-Y。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此CDR3区具有至少一个以下的氨基酸，例如，Xaa100位I或M。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此CDR3区具有氨基酸替换，例如，在Xaa100位M。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR4的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：4中的106-116位残基表示，即，W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR4区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa108位Q或T；以及X111位S或T。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR4区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa108位T；以及X111位T。
III.改进的(Refined)可变轻链
在另一实施方案中，重组抗-EpCAM抗体所具有的免疫球蛋白可变轻链序列具有以下的氨基酸序列：
X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-Y-M-L-W-Y-Q-
Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-
X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-L-E-I-K(SEQ
IDNO：5)
在一优选实施方案中，此重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR1的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：5中的1-23位残基表示，即，X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa1位Q或E；Xaa3位L或V；Xaa10位I或T；Xaa11位M或L；Xaa13位A或L；Xaa18位K或R；以及Xaa21位M或L。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa1位E；Xaa3位V；Xaa10位T；Xaa11位L；Xaa13位L；Xaa18位R；和Xaa21位L。
在另一优选的实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR1的氨基酸序列，且在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa1位Q或E；Xaa11位A或L；Xaa21位M或L。更优选地，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR1的氨基酸序列，且在此FR1区具有至少一个以下的替换：Xaa1位E；Xaa11位L；以及Xaa21位L。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR2的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：5中的34-48位残基表示，即，W-Y-Q-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR2区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa41位S或Q；Xaa42位S或A；Xaa45位P或L；以及Xaa46位W或L。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在FR2区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa41位Q；Xaa42位A；Xaa45位L；以及Xaa46位L。
在另一优选的实施方案中，本发明的重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR2的氨基酸序列，在此FR2区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa42位S或A；Xaa45位P或L；以及Xaa46位W或L。更优选地，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR2的氨基酸序列，在此FR2区具有至少一个以下的替换：Xaa42位A；Xaa45位L；以及Xaa46位L。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR3的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：5的56到87位残基表示，即，
G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa57位F或I；Xaa69位S或D；Xaa71位S或T；Xaa73位I或T；Xaa77位M或L；Xaa79位A或P；Xaa82位A或F；以及Xaa84位T或V。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa57位I；Xaa69位D；Xaa71位T；Xaa73位T；Xaa77位L；Xaa79位P；Xaa82位F；以及Xaa84位V。
在另一优选的实施方案中，本发明的重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR3的氨基酸序列，在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa57位F或I；Xaa69位S或D；Xaa79位A或P；Xaa82位A或F；以及Xaa84位T或V。更优选地，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白轻链FR3的氨基酸序列，在此FR3区具有至少一个以下的替换：Xaa57位I；Xaa69位D；Xaa79位P；Xaa82位F；以及Xaa84位V。
IV.改进的(Refined)可变重链
本发明重组抗-EpCAM抗体所具有的免疫球蛋白可变重链序列具有以下的氨基酸序列：
Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N-
W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G-W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-
X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-I-S-K-G-D-Y-
W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S(SEQ ID NO：6)
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR1的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：6的1-25位残基表示，即，Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa2位I或V；Xaa9位P或A；Xaa11位L或V；以及Xaa17位T或S。相应地，本发明的重组抗-EpCAM抗体在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa2位V；Xaa9位A；Xaa11位V；以及Xaa17位S。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR1的氨基酸序列，在此FR1区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa2位I或V；Xaa9位P或A；以及Xaa11位L或V。相应地，本发明的重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR1的氨基酸序列，在此FR1区具有至少一个以下的替换：Xaa2位V；Xaa9位A；以及Xaa11位V。
在另一实施方案中，本发明的重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR2的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：6的36-49位残基表示，即W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR2区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa38位K或R；Xaa40位T或A；以及Xaa46位K或E。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR2区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa38位R；Xaa40位A；以及Xaa46位E。
在另一优选的实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR2的氨基酸序列，在此FR2区具有以下的氨基酸，例如，Xaa46位K或E。更优选地，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR2的氨基酸序列，在此FR2区具有氨基酸替换，例如，Xaa46位E。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链CDR2的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：6的50-66位残基表示，即W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此CDR2区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa63位D或K；以及Xaa65位K或Q。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此CDR2区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa63位K；以及Xaa65位Q。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR3的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：6的67-98位残基表示，即R-X-X-X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R。更特别地，本发明的重组抗-EpCAM抗体在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa68位F或V；Xaa69位A或T；Xaa70位F或I；Xaa73位E或D；Xaa76位A或T；Xaa80位F或Y；Xaa83位I或L；Xaa84位N或S；Xaa85位N或S；Xaa88位N、A或S；Xaa91位M或T；以及Xaa93位T或V。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸替换：Xaa68位V；Xaa69位T；Xaa70位I；Xaa73位D；Xaa76位T；Xaa80位Y；Xaa83位L；Xaa84位S；Xaa85位S；Xaa88位A或S；Xaa91位T；以及Xaa93位V。
在另一优选的实施方案中，本发明的重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR3的氨基酸序列，在此FR3区具有至少一个以下的氨基酸：Xaa68位F或V；Xaa73位E或D；Xaa84位N或S；Xaa85位N或S；Xaa88位N或A；以及Xaa93位T或V。更优选地，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR3的氨基酸序列，在此FR3区具有至少一个以下的替换：Xaa68位V；Xaa73位D；Xaa84位S；Xaa85位S；Xaa88位A；以及Xaa93位V。
在一优选实施方案中，重组抗-EpCAM抗体具有限定免疫球蛋白重链FR4的氨基酸序列，所述序列可由SEQ ID NO：6的106-116位残基表示，即W-G-X-G-T-S-V-T-V-S-S。更特别地，重组抗-EpCAM抗体在此FR4区具有至少一个以下的氨基酸，例如Xaa108位Q或T。更优选地，重组抗-EpCAM抗体在此FR4区具有氨基酸替换，例如，Xaa108位T。
因此，相应于鼠KS-1/4可变区，优选的V区在VH和/或VK区的FR结构域中包含替换。此外，本发明优选的V区相对于鼠KS-1/4可变区不包括氨基酸插入或缺失。
优选的变体包括所具有的可变区与鼠KS-1/4的同一性/同源性高于80％的蛋白质。鼠KS可变区或其部分的氨基酸序列可用作参考序列，以确定候选序列是否具有足够的氨基酸相似性以致在本发明的方法中具有合理预期的成功。优选地，变体序列与鼠KS可变重链或轻链FR或CDR至少有70％类似或60％相同，更优选地至少75％类似或65％相同，且最优选地80％类似或70％相同。
为测定候选肽序列与鼠KS序列是否具有所需的相似性或同一性百分比，候选氨基酸序列和鼠KS序列首先应用动态程序运算法则(Smith和Waterman(1981)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)147：195-197)并联合在Henikoff和Henikoff(1992)PNAS 89：10915-10919的图2中描述的BLOSUM62替换矩阵进行比对(align)。对于本发明，空位(gap)插入罚分的合适数值为-12，且空位延伸罚分的合适数值为-4。应用Smith-Waterman运算法则和BLOSUM62矩阵进行比对的计算机程序，如GCG程序包(oxford Molecular Group，oxford，英国)可从厂商获得并且是本领域内的技术人员广泛应用的。一旦完成候选和参考序列间的比对，即可计算出相似性百分比得分。根据其彼此的相似性，每一序列的各氨基酸进行顺序比较。如果BLOSUM62矩阵中对应于两个比对的氨基酸的数值为零或负数，则成对相似性得分为零；否则成对相似性得分为1.0。粗相似性得分为比对氨基酸的成对相似性得分的总和。然后将粗得分除以较小的候选或参考序列中的氨基酸数目进行标准化。标准化的粗得分为相似性百分比。备选地，为计算百分比同一性，每一序列的比对氨基酸再次顺序比较。如果氨基酸不相同，则成对同一性得分为零；否则成对同一性得分为1.0。粗同一性得分为相同比对氨基酸的总和。然后将粗得分除以较小的候选或参考序列中的氨基酸数目进行标准化。标准化的粗得分为同一性百分比。用于计算相似性和同一性百分数时，忽略插入和缺失。相应地，空位罚分不用于此计算，尽管其用于初始的比对中。
本发明也公开了用于测试KS抗体在细胞中的表达的方法，所述细胞如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞、其它真核或原核细胞(参见实施例1)。在一优选的方法中，KS抗体V区作为完整的人抗体的组分进行表达，且真核细胞系的抗体表达通过检测人Fc区的ELISA进行分析。为精确定量KS抗体与EpCAM的结合，可应用Biacore试验。
用KS抗体融合蛋白质治疗人类疾病
本发明也公开了可用于治疗人类疾病的KS抗体-IL2融合蛋白质的序列，所述疾病如癌症。某些KS抗体-IL2融合蛋白质，例如KS-1/4-IL2(参见如，实施例X中的构建体3)，可用于治疗人类癌症患者，且针对抗体的免疫反应小得令人惊异。
已发现，在应用KS-1/4(VH2/VK1)-IL2治疗人类癌症的过程中观察到的免疫原性甚至小于KS-1/4(构建物3)-IL2使用时的免疫原性。特别是，在临床试验过程中，观察到具有抗独特型抗体和抗抗体-IL2连接处或抗IL-2部分的抗体的患者的频率甚至低于使用KS-1/4(构建物3)-IL2时的频率。本发明的抗体可变区也可与其它细胞因子融合，例如白细胞介素1、2、6、10或12；α和β干扰素；TNF，和γINF。可通过参考以下非限定的实施例更为充分地理解本发明。
实施例
实施例1.用于表达KS抗体和分析其抗原结合活性的方法和试剂
1A.细胞培养和转染
以下的普通技术用于随后的实施例中。对于瞬时转染，通过质粒DNA与磷酸钙共沉淀将质粒DNA导入到人肾293细胞中[Sambrook等.(1989)分子克隆：实验室指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor，NY]。
为获得稳定转染的克隆，质粒DNA通过电穿孔导入小鼠骨髓瘤NS/0细胞。NS/0细胞培养在补充有10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)中。约5 x 106个细胞用PBS洗一次并重悬在0.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中。10μg的线性化质粒DNA与细胞在Gene脉冲杯(Gene PulserCuvette，0.4cm电极间距，BioRad)中冰上孵育10分钟。应用Gene脉冲仪(Gene Pulser，BioRad)进行电穿孔，操作设置为0.25V和500μF。细胞在冰上复苏1omin，之后重悬在生长培养基中并置于两个96孔板上。通过在100nM氨甲蝶呤(MTX)存在条件下生长筛选稳定转染的克隆，所述氨甲蝶呤在转染后两天引入。每3天饲喂细胞2-3次以上，抗MTX的克隆在2-3周内出现。通过抗-人Fc的ELISA测试克隆上清以鉴定出高产的克隆[Gillies等(1989)免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)125：191]。分离高产克隆并在含100nM MTX的生长培养基中增殖。
1B.ELISA
应用三种不同的ELISA来测定MTX抗性克隆的上清中及其它测试样本中蛋白质产物的浓度。应用抗-huFc的ELISA测定含人Fc的蛋白质，例如嵌合抗体的数量。应用抗-huκ ELISA测量κ轻链(嵌合或人免疫球蛋白的)的数量。应用抗-muFc ELISA测量测试样本中含muFc的蛋白质的数量(参见以下的实施例1C)。
抗-huFc ELISA在以下详细描述。
A.包被平板
用AffiniPure山羊抗-人IgG(H+L)(Jackson Immune Research)包被ELISA平板，所述抗体为5μg/ml溶于PBS中，且以100μl/孔置入96孔板(Nunc-Immuno plate Maxisorp)。给包被的平板盖上盖子并在4℃过夜孵育。然后用溶于PBS的0.05％ Tween(Tween20)洗涤4次，并用200μl/孔的含1％ BSA/1％山羊血清的PBS封闭。用封闭缓冲液37℃孵育2小时后，平板用溶于PBS的0.05％ Tween洗涤4次并在纸巾上拍干。
B.测试样本与二抗的孵育
将测试样本在样本缓冲液中稀释成适当的浓度，所述样本缓冲液为含1％ BSA/1％山羊血清/0.05％ Tween的PBS。用浓度已知的嵌合抗体(具有人Fc)制备标准曲线。为制备标准曲线，在样本缓冲液中进行系列稀释以得出范围从125ng/ml到3.9ng/ml的标准曲线。稀释的样本和标准品以100μl/孔加到平板中，且平板在37℃孵育2小时。
孵育过后，平板用含0.05％ Tween的PBS洗涤8次。然后每孔加入100μl的二抗，所述抗体为辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗人IgG(JacksonImmuno Research)，在样本缓冲液中约1:120,000稀释。对于每一批HRP-缀合的抗-人IgG，必须确定二抗的精确稀释。37℃孵育2小时后，平板用含0.05％ Tween的PBS洗涤8次。
C.显色
底物溶液以100μl/孔加入平板。将30mg的邻苯二胺二盐酸盐(OPD)(1片)溶解到15ml的0.025M柠檬酸/0.05M Na2HPO4缓冲液(pH5)中，所述缓冲液含0.03％新鲜加入的H2O2，以制备底物溶液。室温置黑暗中30min以允许产生颜色。显色时间根据包被的平板、二抗等的批次差异而改变。观察标准曲线中的颜色生成以确定终止反应的时间。通过加入100μl/孔的4N H2SO4终止反应。通过平板读取器读取平板，所述读取器在490nm和650nm处均进行设定，并通过程序化从490nm的OD值中减去650nm的背景OD。
抗-人κ ELISA根据如以上描述的程序进行，不同之处为二抗是辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-人κ(Southern Biotechnology Assoc.Inc.，Birmingham，AL)，应用时1:4000稀释。
抗-muFc ELISA的程序也是类似的，不同之处在于ELISA平板用5μg/ml的AffiniPure山羊抗-鼠IgG(H+L)(Jackson Immune Research)的PBS溶液以100μl/孔进行包被；且二抗为辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-muIgG，Fcγ(Jackson ImmunoResearch)，应用时1：5000稀释。
1 C.克隆KS抗原(KSA，EpCAM)并以人EpCAM-鼠Fc的可溶性形式进行表达
应用Dynabeads mRNA Direct试剂盒(Dynal，Inc.，Lake Success，NY)根据生产商的指南从LnCAP细胞制备信使RNA(MRNA)。用寡聚(dT)和逆转录酶合成第一链cDNA后，通过聚合酶链反应(PCR)克隆编码上皮细胞粘附分子(也称为KS抗原或KSA)的全长cDNA。PCR引物的序列基于在Perez和Walker(1989)免疫学杂志(J.Immunol.)142：3662-3667中描述的发表序列。有义引物的序列为
TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGCA(SEQ ID NO：27)，且反义引物的序列为CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT(SEQ ID NO：28)，其中黑体处表示翻译起始密码子和翻译终止密码子的反密码子，且划线处为XbaI(TCTAGA)和XhoI(CTCGAG)限制性位点。克隆PCR产物并测定几个独立克隆的序列以确认正确的KSA序列。来自LnCAP的KSA的cDNA序列与来自UCLA-P3细胞的KSA的发表序列(Perez和Walker，1989)基本相同。但是，在115位氨基酸残基处，来自LnCAP的核苷酸序列为ATG而不是ACG(Met代替Thr)，以及在277位氨基酸残基处，来自LnCAP的核苷酸序列为ATA而不是ATG(Ile代替Met)。
KS-1/4抗体与重组KSA的结合通过免疫染色进行证明。KSA的表面表达通过用在适宜的哺乳动物表达载体(pdC，如在美国专利号5,541,087中所描述的)中的全长KSA转染细胞(例如，CT26、B16等)而获得，随后用KS-1/4抗体进行免疫染色。KSA作为可溶性抗原表达时，将编码KSA的跨膜结构域的cDNA部分缺失。为促进表达、缺失和纯化，可溶性KSA表达为KSA-muFc，其构建在以下描述。编码可溶性KSA的780bp的XbaI-EcoRI限制性片段与编码muFc(美国专利号5,726,044)的AflII-XhoI片段连接，所述连接通过如下接头-衔接子进行：
5′AA TTC TCA ATG CAG GGC3′(SEQ ID NO：29)
3′G AGT TAC GTC CCG AAT T5′(SEQ ID NO：30)
编码可溶性KSA-muFc的XbaI-XhoI片段与pdC载体连接。导致产生的pdCs-KSA-muFc表达载体用于转染细胞，并通过抗-muFc的ELISA鉴定表达KSA-muFc的稳定克隆。
1D.抗原结合的测定
首先根据供应商的操作指南(Repligen，Cambridge，MA)通过蛋白质A层析来纯化条件培养基中的KSA-muFc。纯化的KSA-muFc用于包被96孔板(Nunc-Immuno plate，Maxisorp)，所述KSA-muFc为5μg/ml的PBS溶液，且以100μl/孔进行包被。试验与在实施例1B中描述的ELISA方法类似。简言之，包被的平板加盖在4℃过夜孵育。然后洗涤并封闭平板。测试样本在样本缓冲液中稀释至适当的浓度，以100μl/孔加到平板中，且平板在37℃孵育1小时。孵育过后，平板用含0.05％ Tween的PBS洗涤8次。然后每孔加入100μl的二抗，所述二抗为辣根过氧化物酶缀合的抗-人IgG(Jackson Immune Research)，在样本缓冲液中约1:120,000稀释。然后如在实施例1B中描述的平板显色并进行读数。
IE.应用Biacore试验测定KS-1/4抗体与EpCAM的结合速率(on-rate)和解离速率(off-rate)。
KS-1/4和KS-IL2分子对抗原EpCAM的亲合力通过抗体-抗原交互作用的表面等离子体共振分析(surface plasmon resonance analysis)进行测定，所述测定应用Biacore仪器(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)。应用生产商提供的胺偶联方案将EpCAM-鼠Fc偶联到CM5传感器芯片上。然后使浓度在25nM和200nM之间变化的KS-1/4和KS-IL2通过芯片，由此观察与芯片的结合。应用Biacore软件的内置曲线拟合程序，计算出结合速率、解离速率、结合及解离常数。
IF.应用表达EpCAM的细胞系测定KS-1/4抗体的结合亲合力
应用标准技术以125I碘化纯化的KS-1/4抗体，然后将浓度不断提高的标记蛋白质与EpCAM阳性细胞系PC-3一起孵育。产生饱和结合曲线并通过Scatchard分析确定解离常数。
实施例2.编码小鼠KS-1/4的VH和VK的cDNA的克隆以及用于表达KS-1/4杂交瘤来源的抗体的载体的构建
从表达小鼠KS-1/4的杂交瘤细胞(从R.Reisfeld，Scripps ResearchInstitute获得)制备的信使RNA以寡聚(dT)进行反转录并随后用作PCR模板以扩增编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VK)的序列。根据已发表序列(Beavers等，同上引文)设计PCR引物。用于VH的PCR引物具有以下的序列：
VH正向引物(5′)GACTCGAGCCCAAGTCTTAGACATC(3′)(SEQID NO：31)
VH反向引物(5′)CAAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGACGTTC(3′)，(SEQ NID NO：32)，
其中CTCGAG和AAGCTT序列分别为XhoI和HindIII限制性位点，用于将VH与表达载体连接(参见以下)；且反向引物中的TAC将在PCR产物的有义链中引入剪接供体共有序列GTA。
用于VK的PCR引物具有以下的序列：
VK正向引物(5′)GATCTAGACAAGATGGATTTTCAAGTG(3′)(SEQ ID NO：33)
VK反向引物(5′)GAAGATCTTACGTTTTATTTCCAGCTTGG(3′)(SEQ ID NO：34)
其中TCTAGA和AGATCT序列分别为XbaI和BglII限制性位点，用于将VK与表达载体连接(参见以下)；ATG为轻链的翻译起始密码子；且反向引物中的TAC将在PCR产物的有义链中引入剪接供体共有序列GTA。
将编码小鼠KS-1/4抗体的VH和VK的PCR产物克隆入pCRII载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。测定几个VH和VK克隆的序列且确定各共有序列。将VH和VK序列逐步插入表达载体pdHL7。VH的连接利用唯一的XhoI和HindIII位点，且VK的连接利用唯一的XbaI和BglII/BamHI位点(VK插入片段中的唯一BglII和载体中的唯一BamHI具有相容的突出端)。导致产生的构建体称作pdHL7杂交瘤chKS-1/4，其已经包含用于表达嵌合抗体的转录调控元件和人Ig恒定区序列(Gillies等.(1989)免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)125：191)。
表达载体pdHL7来自pdHL2[Gillies等.(1991)杂交瘤(Hybridoma)10：347-356]，具有以下的修饰：在表达载体pdHL2中，用于轻链和重链-细胞因子的转录单元由重链免疫球蛋白基因的增强子和金属硫蛋白启动子组成。在pdHL7中，这两个转录单元由CMV增强子-启动子[Boshart等.(1985)细胞(Cell)41：521-530]组成。编码CMV增强子-启动子的DNA源自可商业获得的pcDNAI(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)的AflIII-HindIII片段。
实施例3.鼠KS-1/4抗体的表达研究
该实施例讨论了应用编码V区序列的抗体表达质粒进行的表达研究，其中所述V区序列在美国专利No.4,975,369中公开。
3A.质粒构建
为直接比较由杂交瘤KS-1/4序列和美国专利No.4,975,369中公开的序列所编码的嵌合抗体，合成了编码美国专利No.4,975,369中描述的VH序列的cDNA。然后该cDNA与已含有KS-1/4的VK的pdHL7表达载体连接。
为构建在美国专利No.4,975,369中描述的VH序列，通过全化学合成获得编码部分VH序列的NdeI-HindIII片段。化学合成重叠寡核苷酸并进行连接。然后将连接的双链体亚克隆到XbaI-HindIII pBluescript载体(Stratagene，LaJolla，CA)中。
该DNA编码美国专利No.4,975,369的蛋白质序列IQQPQNMRTM。编码序列紧3′端的是以gta起始的剪接供体位点。上链5′末端的ctag为用于XbaI克隆位点的突出端。产生的XbaI位点仅用于克隆到pBluescript载体的多聚接头中。紧随该位点之后为NdeI限制性位点(CATATG)。下链5′末端的agct为HindIII克隆位点的突出端。该HindIII粘端随后与Cγl基因[Gillies等.(1991)杂交瘤(Hybridoma)10：347-356]前的内含子中的HindIII位点连接。
进行序列确认后，分离NdeI-HindIII限制性片段。然后将该片段以及编码VH的N端半分子的XhoI-NdeI片段与XhoI-HindIII消化的pdHL7表达载体连接，其中所述表达载体包含KS-1/4的VK。导致产生的构建体pdHL7-′369chKS-1/4包含所述VK及在美国专利No.4,975,369中描述的VH(称为US4,975,369chKS-1/4)。
3B.杂交瘤chKS-1/4和US4,975,369chKS-1/4抗体的比较
通过以上提及的磷酸钙共沉淀方法将质粒DNA pdHL7-杂交瘤chKS-1/4和pdHL7-′369chKS-1/4平行导入人肾293细胞。转染后5天，用抗-huFc ELISA和κ ELISA(参见实施例1的ELISA方法)测试条件培养基且结果总结在表1中
表1.
| 抗体 | huFc ELISA | κELISA |
| 杂交瘤chKS-1/4 | 254ng/mL | 200ng/mL |
| US4,975,369chKS-1/4 | 14ng/mL | 0ng/mL |
结果表明杂交瘤chKS-1/4正常表达和分泌，且在两种不同ELISA的精确度范围内，分泌的抗体由基本等克分子数的重链和轻链组成。另一方面，对于US4,975,369chKS-1/4抗体在条件培养基中仅检测到低水平的重链，且无κ轻链与之结合。
对这两种瞬时转染的细胞系的全细胞裂解物以及条件培养基进行Western印迹分析。用于Western印迹分析的方法在Sambrook等.(1989)，前述引文中描述。为分析全细胞裂解物，将转染细胞裂解，离心以移除碎屑，且每一泳道应用相当于5 x 105个细胞的裂解物。为分析条件培养基，来自300μL条件培养基的蛋白质产物在还原条件下进行SDS-PAGE前，首先通过蛋白质A琼脂糖凝胶层析进行纯化。Western印迹转移之后，印迹与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-人IgG，Fcγ(JacksonImmunoResearch)杂交，所述抗体应用时1:2000稀释。
Western印迹转移显示，在应用的条件下，当使用pdHL7-杂交瘤chKS-1/4进行转染时于条件培养基和裂解细胞二者中均检测出重链。该结果表明chKS-1/4抗体的重链在细胞中产生并有效地分泌(与轻链一起)。另一方面，用pdHL7-′369chKS-1/4转染时仅在细胞裂解物中检测出重链，而条件培养基中则不能检测到。该结果表明尽管相当水平的重链在细胞内产生，但重链并不能分泌。该发现与ELISA的数据一致，表明在US4,975,369 chKS-1/4抗体中少量分泌的重链没有κ轻链与之相连。应当理解，典型地免疫球蛋白重链在缺乏免疫球蛋白轻链时一般不进行分泌[Hendershot等.(1987)今日免疫学(Immunology Today)8:111]。
除前述之外，NS/0细胞用质粒pdHL7-杂交瘤chKS-1/4和pdHL7-US4,975,369 chKS-1/4通过电穿孔进行平行转染。在100nM MTX存在条件下筛选稳定的克隆，如在实施例1中描述的，且通过抗-huFcELISA测试96孔板中MTX抗性克隆的条件培养基，如在实施例1中所描述。结果在表2中总结。
表2
| 抗体 | 筛选的克隆总数 | 模式<sup>＊</sup> | 最高表达水平<sup>＊</sup> |
| 杂交瘤chKS-1/4 | 80 | 0.1-0.5μg/mL(41) | 10-50μg/mL(4) |
| US4,975,369chKS-1/4 | 47 | 0-10ng/mL(36) | 0.1-0.4g/mL(4) |
(＊括号内的数表示通过抗-Fc ELISA所测定的在此模式中的克隆数或表达最高水平产物的克隆数。)
在96孔板筛选阶段，用pdHL7-杂交瘤chKS-1/4构建体获得的大多数克隆产生约100ng/mL到500ng/mL的抗体，最佳克隆的产量约为10-50μg/mL。另一方面，用pdHL7-′369 chKS-1/4构建体获得的大多数克隆产生约0ng/mL到10ng/mL的抗体，最佳克隆的产量约为300-400ng/mL。为检测US4,975,369 chKS-1/4抗体的组成和结合特性，必须培养生长300-400ng/mL抗体的克隆。挑选这些克隆中的两个用于扩大培养。但是，发现这些克隆的表达水平非常不稳定。培养物生长到200mL时，通过抗-FcELISA测试，两克隆的表达水平均降到约20ng/mL。当用抗-κ ELISA测试相同的条件培养基时，没有检测出κ轻链，这与在293细胞中的瞬时表达相同。
以下的实验表明不存在可检测水平的与US4,975,369 chKS-1/4重链连接的κ轻链。简言之，来自每一克隆的各50mL条件培养基用蛋白质A层析浓缩。通过抗-Fc ELISA和抗-κELISA测试洗脱物。作为对照，来自产生杂交瘤chKS-1/4的克隆的条件培养基用同样方法处理并在相同的时间测试。ELISA结果在表3中总结。
表3
| 抗体 | huFc ELISA | κELISA |
| 杂交瘤chKS-1/4 | 42μg/mL | 44μg/mL |
| US4,975,369 chKS-1/4-克隆1 | 253ng/mL | 0ng/mL |
| US4,975,369 chKS-1/4-克隆2 | 313ng/mL | 0ng/mL |
结果表明的确不存在可检测水平的与US4,975,369 chKS-1/4重链连接的κ轻链。此外，杂交瘤chKS-1/4抗体在10-20ng/mL之间显示可结合KS抗原，而来自两克隆的US4,975,369抗体一直浓缩到253和313ng/mL仍不结合KS抗原(参见用于测定与KS抗原的结合的实施例9)。
实施例4.KS抗体变体的表达和表征
显著降低抗体的表达或抗体对靶分子的亲合力的突变预期将降低其用于人类治疗目的的功效。一些降低免疫原性的方法，例如＂贴面化(veneering)＂、＂人源化＂和＂去免疫化(deimmunization)＂涉及导入多个氨基酸替换，并可能破坏抗体与抗原的结合(参见如，美国专利Nos.5,639,641；5,585,089；和PCT公开号WO 98/52976；WO 00/34317)。本领域内存在对如下类型的抗体序列的需要，所述序列可与上皮细胞粘附分子结合，但其不同于识别该抗原的起始鼠单克隆抗体。
测试了KS-1/4重链和轻链可变(＂V＂)区的多种组合的表达能力以及它们与EpCAM结合的能力。
这些结果总结在表4-6中并在以下进行描述。
表4.KS-1/4抗体重链和轻链V区的序列。
轻链：
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
VK0 QILLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR
VK1 QIVLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYILWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPSR
VK6 KIVLTQSPATLSLSPGERVTLTCSASSSVSYMLWYQQKPGQAPKLLIFDTSNLASGIPAR
VK7 QILLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR
VK8 KIVLTQSPATLSLSPGERVTLTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR
70 80 90 100
| | | |
VK0 FSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：1)
VK1 FSGSGSGTSYTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：11)
VK6 FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：7)
VK7 FSGSGSGTSYSLIISSMEPEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK_(SEQ ID NO：8)
VK8 FSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：9)
重链：
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
VH0 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH1 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH2 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH2.5 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH6 QVQLVQSGAEVKKPGESVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLBWMGWTNTYTGEPTY
VH7 QIQLVQSGAEVKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
VH369 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY
70 80 90 100 110
| | | | |
VHO ADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNE.DMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：2)
VH1 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE.DTATYFCVRFMSKGDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：21)
VH2 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE.DTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：22)
VH2.5 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE.DTATYFCVRFISKGDYWGTGTTVTVSS(SEQ ID NO：19)
VH6 AQKFQGRVTISLDTSTSTAYLQLSSLRAE.DTAVYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：17)
VH7 ADDFKGRFAFSLETSTSTAFLQINNLRSE.DTATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：18)
VH369 ADDFKGRFAFSLETSASTAFLQIqqpqnmrtMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：35)
表5.具有单氨基酸插入的KS-1/4抗体变体和CDR3重链变体的序列。
VH2部分序列： ...ATYFCVRF I S K GDYWGQG...(SEQ ID NO：22第92-109位
氨基酸残基)
VH2.1： ...ATYFCVRF IIS K GDYWGQG...(SEQ ID NO：36)
VH2.2：. ...ATYFCVRF IVS K GDYWGQG...(SEQ ID NO：37)
VH2.3： ...ATYFCVRF I SAK GDYWGQG...(SEQ ID NO：38)
VH2.4： ...ATYFCVRF I S KTGDYWGQG...(SEQ ID NO：39)
表6.KS-1/4抗体变体的表达水平和结合活性。
(＊)常规可达到的水平
(＊＊)＂相对结合＂表示为达到等同结合水平所需的蛋白质浓度的增加倍数.因此，较大的数字反映出对EpCAM的较小亲合力。
(＊＊＊)κ轻链不能被ELISA检测到(与背景等同)；因此，未表达功能性抗体。
(＊＊＊＊)n.d.＝检测不出.
在第2和第3组中，每一种蛋白质的相对结合活性用该组第一行显示的对照进行标准化.ELISA试验主要反映出解离速率(off-rates)，以几轮洗涤后结合的蛋白质的量为基础。该试验用作排除弱结合者的快速筛选，但并非是对亲合力的精确测定。在第3组中，将VH2变体VH2.1-VH2.4与VH1进行比较以确定氨基酸的插入是否导致相对结合的提高。
序列的关系在以下叙述。如在实施例中所描述，VH0和VK0序列通过PCR扩增来自表达起始的鼠源KS-1/4的杂交瘤细胞系(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。VH‘369为在美国专利No.4,975,369中公开的VH序列。序列VH1、VH2、VH2.1-2.4 VK1和VK2或通过应用去免疫化(deimmunization)技术(所述技术中通过引入可降低肽表位与II类MHC分子结合的突变来去除或减弱潜在的T细胞表位)或通过改变非人T细胞表位以使其相应于存在于人类抗体中的人自体表位(self-epitopes)而获得。这些构建体的设计在以下进一步描述和分析。表6中构建体的产生通过将表达相应重链和轻链V区的核酸组合用于转染哺乳动物细胞而实现。序列VH6、VH7、VK6、VK7和VK8通过将杂交瘤KS-1/4的表面残基改变为以下描述的人类对应残基而产生，所述改变的目的在于移除潜在的人B细胞表位。构建体1到3的产生通过将表达重链和轻链V区VH6、VH7、VK6、VK7和VK8(见表4和以下描述)的核酸组合用于转染哺乳动物细胞而实现。
4A.具有较少人T细胞抗原表位的KS抗体的表征
制备序列VH2.1-VH2.5用于测试是否能够容忍在KS-1/4重链CDR3区中某些氨基酸的插入和替换。构建出用于轻链和重链组合VK0/VH1、VK1/VH7、VK1/VH1、VK1/VH2、VK1/VH1-IL2、VK1/VH2-IL2和VK1/VH2.5-IL2的表达载体，且根据在前述实施例中描述的方法表达和测试相应抗体和抗体-IL2融合蛋白质。
具体地，序列VH1、VH2、VK1和VK2通过全化学合成获得。对于这些序列中的每一段序列，化学合成覆盖这些区的整个编码和互补链的一系列重叠寡核苷酸，对其磷酸化并进行连接。然后用针对片段末端的适宜引物PCR扩增连接的双链体分子，导入pCRII载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)并进行序列验证。然后将这些DNA片段导入表达载体pdHL7的合适位点以分别产生完整的重(＂H＂)链和轻(＂L＂)链。
应用标准分子生物学技术，通过单密码子修饰以在108位获得Thr而不是Gln(表4)，由此从VH2产生序列VH2.5。
通过ELISA(表6)并应用表面等离子体激光共振(Biacore仪器和软件)检测这些抗体以比较它们与EpCAM结合的能力。ELISA实验的结果被认为主要反映了解离速率而非结合速率，且通常精确性较低，因此一般利用不佳的ELISA结果将某些构建体排除在进一步的实验考虑之外。但是，ELISA实验显示有良好结合的抗体仍需要进行进一步的表征。
表面等离子体激光共振分析的结果如下：
| 融合蛋白质 | k<sub>on</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) | k<sub>off</sub>(s<sup>-1</sup>) | K<sub>D</sub>(M) |
| VK8/VH7-IL2 | 3.1 x 10<sup>5</sup> | 3.2 x 10<sup>-4</sup> | 1.0 x 10<sup>-9</sup> |
| VK1/VH2-IL2 | 1.7 x 10<sup>5</sup> | 5.3 x 10<sup>-4</sup> | 3.1 x 10<sup>-9</sup> |
| VK1/VH1-IL2 | 2.8 x 10<sup>5</sup> | 2.2 x 10<sup>-3</sup> | 7.9 x 10<sup>-9</sup> |
由于VK1/VH1-IL2的解离速率远远快于VK1/V2-IL2或VK8/VH7-IL2的解离速率，因此认为VK1/VH1-IL2是一种有用性较低的融合蛋白质。
鉴于VK1/VH1-IL2和VK1/VH1-IL2仅在CDR3中VH的第100位存在蛋氨酸/异亮氨酸的差异，因此VK1/VH1-IL2的解离速率高于VK1/VH2-IL2提示此差异位置造成了与EpCAM的疏水性接触，且提示略长的蛋氨酸侧链导致接触效率降低。在蛋白质-蛋白质交互作用领域，一般认为疏水交互作用在决定解离速率中起到主要作用，而在决定结合速率中起到的作用要低得多。
4B.具有单核苷酸插入的KS-1/4变体的表征
重链V区的CDR3序列对于KS抗体与EpCAM的亲合力的重要性通过含有位于该区的氨基酸插入或替换的一系列变体进行确定。应用标准DNA重组技术，通过操作编码VH2和VK1的表达载体产生序列VH2.1、VH2.2、VH2.3和VH2.4。用产生的表达载体转染NS/0细胞且纯化分泌的抗体蛋白质，方法如在前述实施例中所描述的。
发现与VH2变体相比VH1变体未达到最佳，这表明CDR3中的异亮氨酸不能用蛋氨酸替换。下一目标是测试CDR3中氨基酸的插入是否可产生结合特性优于VH1的KS-1/4重链V区。表6的数据将VKI/VH2.1、VK1/VH2.2、VK1/VH2.3和VK1/VH2.4的结合与VK1/VH1的结合进行了比较。发现在KS-1/4VH的CDR3中带有氨基酸插入的构建体与VH1相比无一显示出抗原结合的提高，相反，插入突变体的抗原结合活性或是略微降低或是显著降低。
这些结果表明CDR3中氨基酸的插入对于KS-1/4重链V区的抗原结合活性是不利的。当分析该数据时，可获得一些一般性结论。具体地，KS-1/4VH中84到108位氨基酸的片段对于KS-1/4的抗原结合是重要的，所述片段由以下氨基酸组成：
Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg-Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln。该片段包括一段构架片段，Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg，该片段一般可容忍单个和多个氨基酸替换，但不能容忍氨基酸插入，所述氨基酸插入可能对表达和组装具有有害的效应。此外，数据提示，对于86、91、93、94和95位的氨基酸，就进行有效表达并能与EpCAM进行结合的抗体而言，优选抗体具有疏水性氨基酸。
尽管可忍受仅导致部分活性丧失的一些插入，但VH CDR3片段(由Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr组成)中氨基酸的插入一般对KS-1/4抗体的EpCAM抗原结合功能是不利的。类似地，尽管可忍受一些仅导致部分活性丧失的插入，但这些位置的替换一般对EpCAM抗原的结合也是不利的。
4C.构建其中的鼠表面残基转换为其人类对应残基的KS-1/4抗体的活性衍生物
用通常存在于人类抗体中的氨基酸替换KS-1/4抗体内的氨基酸来制备抗体，以最小化鼠源V区的免疫原性。优选的KS衍生物也保留对人类EpCAM的特异性结合亲合力。
构建体1.已发现KS-1/4轻链与人类的共有III亚群最为类似，且重链与I亚群最为类似。基于这些相似性，产生了由人类共有亚群氨基酸和KS-1/4来源的CDR以及非共有氨基酸组成的概念性序列。对于此构建体以及以下的构建体，应用硅图形工作站(Silicon Graphics Workstation)和BioSym分子建模软件(BioSym molecular modeling software)构建出三维模型。
对三维模型的观察显示，某些人源的氨基酸与CDR接近且可能影响其构象。基于此分析，在轻链中将人Ser22、Arg44和Phe66分别更改回原来的Thr、Lys和Tyr。在重链中，这些更改被认为是非必须的。在最终的用于构建体1的设计中，轻链具有18个不存在于鼠轻链中的人氨基酸，且重链具有22个不存在于鼠重链中的人氨基酸。
应用合成的寡核苷酸产生用于表达构建体1的DNA。构建体1蛋白质得以有效表达，但发现其在EpCAM结合试验中的活性低了10倍以上。
构建体2.然后采用较为保守的方法，其中仅导入以下的变化：
轻链：K18R、A79P
重链：P9A、L11V、A76T、N88S、M91T
应用合成寡核苷酸和标准重组DNA技术生成用于表达构建体2的DNA。构建体2蛋白质未能有效表达。进一步发现构建体2轻链和鼠KS-1/4重链的组合也不能有效表达，而构建体2重链和鼠KS-1/4轻链的组合得以有效表达。因此，似乎表达缺陷存在于构建体2轻链中。
构建体3.基于构建体2轻链中明显的表达缺陷，通过将构建体1轻链的N端部分与鼠轻链的C端部分融合以构建出新的轻链。应用编码35位和36位氨基酸的KpnI位点。当此轻链与构建体2重链组合时，观察到有效表达且结合并未显著丧失。
由于构建体3导致产生的抗体与构建体1或2相比在蛋白质表达和抗原亲合力方面具有更佳的特性，因此将构建体3的DNA序列插入到pdHL7s-IL2中，产生在SEQ ID NO：40中公开的pdHL7s-VK8/VH7-IL2。用于表达目的时，用电穿孔将该质粒DNA导入小鼠骨髓瘤细胞NS/0中以产生如在实施例1A中描述的稳定转染的细胞系。然后在包被有人Fc的ELISA中测试取自稳定克隆的培养基的抗体表达，见实施例1B中的描述。用于该抗体融合蛋白质的重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42中显示。
此外，应用在实施例1F中描述的方法，将碘化的VK8/VH7和VK8/VH7-IL2和表达于PC-3肿瘤细胞表面的EpCAM的结合与碘化的VK0/VH0-IL2的结合进行比较。在实验误差的范围内，发现对于VK8/VH7和VK0/VH0以及对于VK8/VH7-IL2和VK0/VH0-IL2有基本相同的结合亲合力。
4D.用于构建活性KS-1/4抗体的结构-功能关系
总之，具有公开的V区序列的KS-1/4抗体以及融合蛋白质的抗原结合活性为设计针对EpCAM的KS-1/4抗体序列以及为KS-1/4抗体的正确表达和分泌提供了指导。具体地，如果氨基酸替换位于CDR之外，则KS-1/4重链和轻链V区可容忍多个氨基酸替换并保留活性。KS-1/4重链和轻链V区一般似乎不能容忍氨基酸插入，特别是当插入位于CDR内或位于CDR间的构架区内时。
例如，当杂交瘤KS-1/4序列用作起始的、＂野生型＂序列时，数据表明重链V区可在9、11、16、17、38、40、69、70、71、72、76、79、80、83、88、91和111位容忍氨基酸替换而不丧失或几乎不丧失活性。类似地，轻链可在1、3、10、11、12、13、17、18、19、21、41、42、59、71、73、75、77和103位容忍氨基酸替换而不丧失或几乎不丧失活性。这些改变位于KS-1/4重链和轻链V区的CDR之外。这17个明显可接受的重链氨基酸替换占据了CDR之外的约21％的氨基酸位置，且占CDR之外尝试过替换的氨基酸位置的约68％。类似地，这18个明显可接受的轻链氨基酸替换占据了CDR之外的约23％的氨基酸位置，且占CDR之外尝试过替换的氨基酸位置的约72％。仅在两个例子中CDR之外的氨基酸替换导致了蛋白质的有用性显著降低：轻链中的Ala79Pro替换呈现出对表达有负面影响；以及重链中的Q108T替换对抗原结合具有负面影响。因此，可将氨基酸替换导入到CDR之外的KS-1/4抗体重链或轻链序列中，且所述替换有很大的可能性将导致产生活性蛋白质。
涉及到CDR内的氨基酸替换的突变对抗原结合常常具有负面影响。例如，在重链中的I100M替换将结合减小了约8倍。涉及到氨基酸插入的突变通常对KS-1/4序列的效用具有负面影响。例如，VH-′369重链V区不能与轻链组装成正确抗体，如在此所描述的。VH2.1到2.4突变具有在重链V区CDR3中的氨基酸插入，且这些突变中的每一个均对抗原结合具有负面影响。
实施例5.KS抗体(构建体3)-IL2融合蛋白质在人类中的免疫原性
在人类临床试验中，22位患者接受了一个或多个疗程，每一疗程包括连续3天的每天4小时静脉输注KS抗体(构建体3)-IL2。疗程之间间隔一个月(Weber等.(2001).Proc.Am.Soc.Clin.肿瘤学(Oncology)20：259a.)。在每一疗程之前和之后收集每位患者的血清样本并测试其对完整KS抗体(构建体3)-IL2分子或Fc-IL2成分(不含Fv区)的抗体反应性。在免疫前的血清中均未观察到任何反应性。结果表明仅4位患者产生了对单独Fv区或对Fv区和Fc-IL2成分两者的显著免疫反应。此外，在随后接触huKS-IL2后这些反应并未表现出被加强。
抗体-IL2融合蛋白质的用途被认为在于对V区免疫原性进行特别严格的测试，因为白细胞介素2部分具有佐剂效应。因此，这些结果表明可以将KS抗体(构建体3)施用给人类且仅有少数的受者会明显产生对KS抗体(构建体3)-IL2融合蛋白质的抗体反应。考虑到KS抗体(构建体3)含有几乎完全鼠源的可变区(其中仅少数的氨基酸残基被替换为相应的人氨基酸残基)，前述的这些结果尤为令人鼓舞。
等同方案
本发明可以以其它的特定形式体现而不偏离其精神和本质特征。因此前述的实施方案应在各方面视作举例说明性的而非限定此处描述的本发明。本发明的范围因此由所附权利要求而不是由前述的描述来指示，且落于权利要求的等同意义和范围之内的所有变化均意在包括于其中。
参考引入
此处公开的每一专利文件和科学出版物的内容，全部作为参考加入到该申请中。
序列表
<110>默克专利有限公司
<120>重组肿瘤特异性抗体及其应用
<130>LEX-019PC
<150>US60/288，564
<151>2001-05-03
<160>42
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS VK小鼠
<400>1
<210>2
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS VH小鼠
<400>2
<210>3
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>EpCAM抗体中可变轻链序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中在1位的Xaa是谷氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中在3位的Xaa是缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中在10位的Xaa是苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>其中在11位的Xaa是亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>其中在12位的Xaa是丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>其中在13位的Xaa是亮氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>其中在17位的Xaa是谷氨酰胺
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>其中在18位的Xaa是精氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>其中在19位的Xaa是丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>其中在21位的Xaa是亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>其中在32位的Xaa是异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(36)..(36)
<223>其中在36位的Xaa是亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(41)..(41)
<223>其中在41位的Xaa是谷氨酰胺
<220>
<221>misc_feature
<222>(42)..(42)
<223>其中在42位的Xaa是丙氨酸或脯氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(45)
<223>其中在45位的Xaa是亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(46)
<223>其中在46位的Xaa是亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(48)..(48)
<223>其中在48位的Xaa是酪氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>其中在57位的Xaa是异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(59)..(59)
<223>其中在59位的Xaa是丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>其中在69位的Xaa是天冬氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(71)..(71)
<223>其中在71位的Xaa是苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(73)..(73)
<223>其中在73位的Xaa是苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(75)..(75)
<223>其中在75位的Xaa是天冬酰胺
<220>
<221>misc_feature
<222>(77)..(77)
<223>其中在77位的Xaa是亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(79)..(79)
<223>其中在79位的Xaa是脯氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(82)..(82)
<223>其中在82位的Xaa是苯丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(84)..(84)
<223>其中在84位的Xaa是缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(103)..(103)
<223>其中在103位的Xaa是缬氨酸
<400>3
<210>4
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>EpCAM抗体中可变重链序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中在2位的Xaa是异亮氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>其中在9位的Xaa是脯氨酸或丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>其中在11位的Xaa是亮氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>其中在16位的Xaa是谷氨酸或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>其中在17位的Xaa是苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(38)
<223>其中在38位的Xaa是赖氨酸或精氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>其中在40位的Xaa是苏氨酸或丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(43)
<223>其中在43位的Xaa是赖氨酸或谷氨酰胺
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(46)
<223>其中在46位的Xaa是赖氨酸或谷氨酸
<220>
<221>msic_feature
<222>(63)..(63)
<223>其中在63位的Xaa是天冬氨酸或赖氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(65)..(65)
<223>其中在65位的Xaa是赖氨酸或谷氨酰胺
<220>
<221>misc_feature
<222>(68)..(68)
<223>其中在68位的Xaa是苯丙氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>其中在69位的Xaa是丙氨酸、苏氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(70)..(70)
<223>其中在70位的Xaa是苯丙氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(71)..(71)
<223>其中在71位的Xaa是丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(72)..(72)
<223>其中在72位的Xaa是亮氨酸或丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(73)..(73)
<223>其中在73位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(76)..(76)
<223>其中在76位的Xaa是丙氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(79)..(79)
<223>其中在79位的Xaa是丙氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(80)..(80)
<223>其中在80位的Xaa是苯丙氨酸或酪氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(83)..(83)
<223>其中在83位的Xaa是异亮氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(84)..(84)
<223>其中在84位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(85)..(85)
<223>其中在85位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(88)..(88)
<223>其中在88位的Xaa是天冬酰胺、丙氨酸或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(91)..(91)
<223>其中在91位的Xaa是甲硫氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(93)..(93)
<223>其中在93位的Xaa是苏氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(100)..(100)
<223>其中在100位的Xaa是异亮氨酸或甲硫氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(108)..(108)
<223>其中在108位的Xaa是谷氨酰胺或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(111)..(111)
<223>其中在111位的Xaa是丝氨酸或苏氨酸
<400>4
<210>5
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链共有序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中在1位的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中在3位的Xaa是亮氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中在10位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>其中在11位的Xaa是甲硫氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>其中在13位的Xaa是丙氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>其中在18位的Xaa是赖氨酸或精氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>其中在21位的Xaa是甲硫氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(41)..(41)
<223>其中在41位的Xaa是丝氨酸或谷氨酰胺
<220>
<221>misc_feature
<222>(42)..(42)
<223>其中在42位的Xaa是丝氨酸或丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(45)
<223>其中在45位的Xaa是脯氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(46)
<223>其中在46位的Xaa是色氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>其中在57位的Xaa是苯丙氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>其中在69位的Xaa是丝氨酸或天冬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(71)..(71)
<223>其中在71位的Xaa是丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(73)..(73)
<223>其中在73位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(77)..(77)
<223>其中在77位的Xaa是甲硫氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(79)..(79)
<223>其中在79位的Xaa是丙氨酸或脯氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(82)..(82)
<223>其中在82位的Xaa是丙氨酸或苯丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(84)..(84)
<223>其中在84位的Xaa是苏氨酸或缬氨酸
<400>5
<210>6
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链共有序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中在2位的Xaa是异亮氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>其中在9位的Xaa是脯氨酸或丙氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>其中在11位的Xaa是亮氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>其中在17位的Xaa是苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(38)
<223>其中在38位的Xaa是赖氨酸或精氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>其中在40位的Xaa是苏氨酸或丙氨酸
<220>
<221>misc_featrue
<222>(46)..(46)
<223>其中在46位的Xaa是赖氨酸或谷氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(63)
<223>其中在63位的Xaa是天冬氨酸或赖氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(65)..(65)
<223>其中在65位的Xaa是赖氨酸或谷氨酰胺
<220>
<221>misc_feature
<222>(68)..(68)
<223>其中在68位的Xaa是苯丙氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)
<223>其中在69位的Xaa是丙氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(70)..(70)
<223>其中在70位的Xaa是苯丙氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(73)..(73)
<223>其中在73位的Xaa是谷氨酸或天冬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(76)..(76)
<223>其中在76位的Xaa是丙氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(80)..(80)
<223>其中在80位的Xaa是苯丙氨酸或酪氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(83)..(83)
<223>其中在83位的Xaa是异亮氨酸或亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(84)..(84)
<223>其中在84位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(85)..(85)
<223>其中在85位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(88)..(88)
<223>其中在88位的Xaa是天冬酰胺、丙氨酸或丝氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(91)..(91)
<223>其中在91位的Xaa是甲硫氨酸或苏氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(93)..(93)
<223>其中在93位的Xaa是苏氨酸或缬氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(108)..(108)
<223>其中在108位的Xaa是谷氨酰胺或苏氨酸
<400>6
<210>7
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Vk6轻链
<400>7
<210>8
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VK7轻链
<400>8
<210>9
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VK8轻链
<400>9
<210>10
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS VK贴面化的
<400>10
<210>11
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS去免疫的VK1
<400>11
<210>12
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS去免疫的VK2
<400>12
<210>13
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS-去免疫的VK3
<400>13
<210>14
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS去免疫的VK4
<400>14
<210>15
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS去免疫的VK5
<400>15
<210>16
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KSVK小鼠
<400>16
<210>17
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH6重链
<400>17
<210>18
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH7重链
<400>18
<210>19
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH2.5重链
<400>19
<210>20
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KSVH贴面化的
<400>20
<210>21
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS去免疫的VH1
<400>21
<210>22
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS去免疫的VH2
<400>22
<210>23
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS去免疫的VH3
<400>23
<210>24
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS-去免疫的VH4
<400>24
<210>25
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS去免疫的VH5
<400>25
<210>26
<211>116
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KS VH小鼠
<400>26
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KSA有义引物
<400>27
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KSA反义引物
<400>28
<210>29
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头-衔接子
<400>29
<210>30
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头-衔接子
<400>30
<210>31
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH正向引物
<400>31
<210>32
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH反向引物
<400>32
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VK正向引物
<400>33
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VK反向引物
<400>34
<210>35
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH369重链
<400>35
<210>36
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH2.1部分序列
<400>36
<210>37
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH2.2部分序列
<400>37
<210>38
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH2.3部分序列
<400>38
<210>39
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH2.4部分序列
<400>39
<210>40
<211>10494
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pdHL7s-VK8/VH7-IL2序列
<400>40
<210>41
<211>579
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链-IL2
<400>41
<210>42
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链
<400>42
Claims (8)
1.重组抗-EpCAM抗体，所述抗体包含：
(i)定义部分轻链CDR1的SEQ ID NO：1的第24-31位氨基酸残基；
(ii)定义轻链CDR2的SEQ ID NO：1的第49-55位氨基酸残基；
(iii)定义轻链CDR3的SEQ ID NO：1的第88-96位氨基酸残基；
(iv)定义重链CDR1的SEQ ID NO：2的第26-35位氨基酸残基；
(v)定义部分重链CDR2的SEQ ID NO：2的第50-62位氨基酸残基；
(vi)定义重链CDR3的SEQ ID NO：2的第101-105位氨基酸残基；
(vii)定义修饰的轻链FR1的SEQ ID NO：9的第1-23位氨基酸残基；
(viii)定义修饰的重链FR1的SEQ ID NO：18的第1-25位氨基酸残基；
和
(ix)定义重链FR3的SEQ ID NO：18的第67-98位氨基酸残基。
2.权利要求1的重组抗-EpCAM抗体，其中所述抗体包含完整的抗体轻链和完整的抗体重链，由此轻链如SEQ ID NO：9的第1-106位残基定义的氨基酸序列基所示，而重链如SEQ ID NO：18的第1-116位残基定义的氨基酸序列所示。
3.权利要求1或2的重组抗-EpCAM抗体，其中抗体对EpCAM的KD结合亲合力为至少10-8M。
4.融合蛋白，其包含权利要求1或2的重组抗-EpCAM抗体和细胞因子。
5.权利要求4的融合蛋白，其中细胞因子为IL-2。
6.编码权利要求1-3中任一项的重组抗-EpCAM抗体或权利要求4-5中任一项的融合蛋白的核酸。
7.包含权利要求6的核酸的表达细胞。
8.权利要求1-3中任一项的重组抗-EpCAM抗体或权利要求4-5中任一项的融合蛋白在制备治疗与EpCAM过表达有关的疾病的药物中的用途。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28856401P | 2001-05-03 | 2001-05-03 | |
| US06/288,564 | 2001-05-03 | ||
| US60/288,564 | 2001-05-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1520421A CN1520421A (zh) | 2004-08-11 |
| CN100503639C true CN100503639C (zh) | 2009-06-24 |
Family
ID=23107653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB02809297XA Expired - Fee Related CN100503639C (zh) | 2001-05-03 | 2002-05-03 | 重组肿瘤特异性抗体及其应用 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6969517B2 (zh) |
| EP (1) | EP1383785B1 (zh) |
| JP (2) | JP4309662B2 (zh) |
| KR (1) | KR100900166B1 (zh) |
| CN (1) | CN100503639C (zh) |
| AT (1) | ATE502053T1 (zh) |
| AU (1) | AU2002308562B2 (zh) |
| BR (1) | BR0209177A (zh) |
| CA (1) | CA2446087C (zh) |
| DE (1) | DE60239454D1 (zh) |
| DK (1) | DK1383785T3 (zh) |
| ES (1) | ES2361664T3 (zh) |
| HU (1) | HUP0400284A3 (zh) |
| MX (1) | MXPA03009924A (zh) |
| PL (1) | PL205352B1 (zh) |
| PT (1) | PT1383785E (zh) |
| RU (1) | RU2306320C9 (zh) |
| WO (1) | WO2002090566A2 (zh) |
| ZA (1) | ZA200309380B (zh) |
Families Citing this family (79)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE267215T1 (de) | 1997-12-08 | 2004-06-15 | Lexigen Pharm Corp | Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung |
| US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
| PL343462A1 (en) * | 1998-04-15 | 2001-08-13 | Lexigen Pharm Corp | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor |
| EP1187852B1 (en) * | 1999-05-19 | 2007-08-08 | EMD Lexigen Research Center Corp. | EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| WO2001010912A1 (en) * | 1999-08-09 | 2001-02-15 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Multiple cytokine-antibody complexes |
| US20050202538A1 (en) * | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
| CA2399832C (en) | 2000-02-11 | 2011-09-20 | Stephen D. Gillies | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| ES2288967T3 (es) * | 2000-06-29 | 2008-02-01 | Merck Patent Gmbh | Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado por agentes que mejoran la incorporacion de inmunocitoquina. |
| CA2440221C (en) | 2001-03-07 | 2013-02-05 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
| WO2002079415A2 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| BR0209177A (pt) * | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
| AU2004236174B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| US8980568B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample |
| US8986944B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-24 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples |
| ES2381025T3 (es) | 2001-12-04 | 2012-05-22 | Merck Patent Gmbh | Inmunocitocinas con selectividad modulada |
| US20100311954A1 (en) * | 2002-03-01 | 2010-12-09 | Xencor, Inc. | Optimized Proteins that Target Ep-CAM |
| AT502293B1 (de) * | 2002-05-15 | 2008-03-15 | Igeneon Krebs Immuntherapie | Immunogener, monoklonaler antikörper |
| ES2346205T3 (es) * | 2002-12-17 | 2010-10-13 | Merck Patent Gmbh | Anticuerpo humanizado (h14.18) del anticurpo 14.18 de raton que se enlaza con gd2 y su fusion con la il-2. |
| EP2829283B1 (en) | 2003-04-30 | 2017-06-07 | Universität Zürich | Methods for treating cancer using an immunotoxin |
| AT500651B9 (de) * | 2003-05-27 | 2010-04-15 | Altropus Gmbh | Aktiv immunisierender antikörper |
| WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
| US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
| US7297336B2 (en) * | 2003-09-12 | 2007-11-20 | Baxter International Inc. | Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| WO2005063820A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Merck Patent Gmbh | Il-7 fusion proteins |
| KR20060124656A (ko) * | 2003-12-31 | 2006-12-05 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질 |
| WO2005066348A2 (en) | 2004-01-05 | 2005-07-21 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin |
| CA2553883C (en) | 2004-01-22 | 2013-04-02 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation |
| US20050180979A1 (en) * | 2004-02-13 | 2005-08-18 | Micromet Ag | Anti-EpCAM immunoglobulins |
| US7670595B2 (en) * | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
| WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
| EP1814573B1 (en) | 2004-10-29 | 2016-03-09 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
| DE602005020837D1 (de) * | 2004-12-09 | 2010-06-02 | Merck Patent Gmbh | Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität |
| NZ556436A (en) | 2005-01-10 | 2010-11-26 | Biogenerix Ag | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| US9187546B2 (en) | 2005-04-08 | 2015-11-17 | Novo Nordisk A/S | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| CA2652434A1 (en) | 2005-07-08 | 2007-01-18 | Xencor, Inc. | Optimized proteins that target ep-cam |
| US20070105755A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| US20070104689A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
| US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
| JP5612247B2 (ja) | 2005-11-29 | 2014-10-22 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Ｃｄ１６６に対するモノクローナル抗体およびその産生方法 |
| EP1960435A1 (en) * | 2005-12-15 | 2008-08-27 | Micromet AG | Domain-grafted antibodies |
| KR20080090484A (ko) * | 2005-12-30 | 2008-10-08 | 메르크 파텐트 게엠베하 | ＧＰ130 에 대한, ＩＬ-6Ｒα 와 복합체를 형성한 ＩＬ-6의 결합을 방해하는 항-ＩＬ-6 항체 |
| PT2270050E (pt) | 2005-12-30 | 2013-09-12 | Merck Patent Gmbh | Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida |
| CA2635618C (en) * | 2005-12-30 | 2015-10-06 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraekter Haftung | Interleukin-12p40 variants with improved stability |
| AU2007229698B9 (en) | 2006-03-24 | 2012-11-08 | Merck Patent Gmbh | Engineered heterodimeric protein domains |
| EP2038417A2 (en) * | 2006-07-06 | 2009-03-25 | Merck Patent GmbH | Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses |
| CA2657621A1 (en) | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting rare cells from a biological sample |
| JP2009544327A (ja) | 2006-07-21 | 2009-12-17 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化 |
| JP2010505874A (ja) | 2006-10-03 | 2010-02-25 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | ポリペプチドコンジュゲートの精製方法 |
| KR20150064246A (ko) | 2007-04-03 | 2015-06-10 | 바이오제너릭스 게엠베하 | 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법 |
| JP5876649B2 (ja) | 2007-06-12 | 2016-03-02 | ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ | ヌクレオチド糖の改良製造法 |
| CN103497246B (zh) | 2008-02-27 | 2016-08-10 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 缀合的因子viii分子 |
| MX2010011453A (es) * | 2008-04-25 | 2010-11-09 | Merck Patent Gmbh | Armazones proteinicos artificiales. |
| AU2010238858A1 (en) * | 2009-04-22 | 2011-12-08 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites |
| GB0909904D0 (en) * | 2009-06-09 | 2009-07-22 | Affitech As | Product |
| CA2773907A1 (en) | 2009-09-21 | 2011-03-24 | Mount Sinai Hospital | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of thyroid cancer |
| WO2011137513A1 (en) | 2010-05-04 | 2011-11-10 | Paul Walfish | Method for the diagnosis of epithelial cancers by the detection of epicd polypeptide |
| CN102174465A (zh) * | 2011-01-12 | 2011-09-07 | 武汉格蓝丽富科技有限公司 | 一种从组织中分离富集靶细胞的方法 |
| AU2012228100B2 (en) | 2011-03-17 | 2016-09-08 | The University Of Birmingham | Re-directed immunotherapy |
| US9541480B2 (en) * | 2011-06-29 | 2017-01-10 | Academia Sinica | Capture, purification, and release of biological substances using a surface coating |
| CN103857700A (zh) | 2011-08-26 | 2014-06-11 | 梅里麦克制药股份有限公司 | 串联fc双特异性抗体 |
| JP6163502B2 (ja) * | 2012-03-02 | 2017-07-12 | アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ | 抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗体及びその使用方法 |
| US9494500B2 (en) | 2012-10-29 | 2016-11-15 | Academia Sinica | Collection and concentration system for biologic substance of interest and use thereof |
| EP2964676A1 (en) | 2013-03-06 | 2016-01-13 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Anti-c-met tandem fc bispecific antibodies |
| KR20160058954A (ko) * | 2013-10-02 | 2016-05-25 | 비벤티아 바이오 인코포레이티드 | 항-epcam 항체 및 사용 방법 |
| GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
| WO2015153816A2 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Academia Sinica | Methods and systems for cancer diagnosis and prognosis |
| US10112198B2 (en) | 2014-08-26 | 2018-10-30 | Academia Sinica | Collector architecture layout design |
| JP6824183B2 (ja) | 2015-03-12 | 2021-02-03 | セセン バイオ，インコーポレイテッド | Ｅｐｃａｍ陽性膀胱癌の処置方法 |
| CN107580501A (zh) | 2015-03-12 | 2018-01-12 | 维文蒂亚生物公司 | 用于靶向epcam阳性膀胱癌的给药策略 |
| US10107726B2 (en) | 2016-03-16 | 2018-10-23 | Cellmax, Ltd. | Collection of suspended cells using a transferable membrane |
| US9567399B1 (en) | 2016-06-20 | 2017-02-14 | Kymab Limited | Antibodies and immunocytokines |
| US11779604B2 (en) | 2016-11-03 | 2023-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| AU2018273914A1 (en) * | 2017-05-24 | 2019-11-14 | Pandion Operations, Inc. | Targeted immunotolerance |
| CN108503714A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-09-07 | 浙江科途医学科技有限公司 | 一种人白介素2和抗人上皮细胞黏附分子单链抗体融合蛋白及其应用 |
| KR20210105890A (ko) | 2018-12-17 | 2021-08-27 | 레비토프 리미티드 | 트윈 면역 세포 인게이저 |
Family Cites Families (172)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US73627A (en) * | 1868-01-21 | Improved paint-compound | ||
| US348237A (en) * | 1886-08-31 | richards | ||
| US4196265A (en) * | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
| US4522811A (en) * | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
| US4469797A (en) * | 1982-09-23 | 1984-09-04 | Miles Laboratories, Inc. | Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
| US4737462A (en) * | 1982-10-19 | 1988-04-12 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β |
| US4966843A (en) * | 1982-11-01 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| KR850004274A (ko) | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
| US4703008A (en) | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| NZ210501A (en) | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| US5082658A (en) * | 1984-01-16 | 1992-01-21 | Genentech, Inc. | Gamma interferon-interleukin-2 synergism |
| EP0158198A1 (en) | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| US5807715A (en) * | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
| US4667016A (en) * | 1985-06-20 | 1987-05-19 | Kirin-Amgen, Inc. | Erythropoietin purification |
| US4690915A (en) | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| US5679543A (en) * | 1985-08-29 | 1997-10-21 | Genencor International, Inc. | DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi |
| US5643565A (en) * | 1985-09-20 | 1997-07-01 | Chiron Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
| US4676980A (en) * | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
| US4935233A (en) * | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
| US5359035A (en) * | 1985-12-21 | 1994-10-25 | Hoechst Aktiengesellschaft | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) |
| DE3712985A1 (de) | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
| EP0237019A3 (en) | 1986-03-14 | 1988-03-09 | Toray Industries, Inc. | Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene |
| US5225539A (en) * | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| DK173067B1 (da) | 1986-06-27 | 1999-12-13 | Univ Washington | Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa |
| US4894227A (en) | 1986-08-01 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Composition of immunotoxins with interleukin-2 |
| US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| US5508031A (en) * | 1986-11-21 | 1996-04-16 | Cetus Oncology Corporation | Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2 |
| US4732683A (en) * | 1986-12-02 | 1988-03-22 | Biospectrum, Inc. | Purification method for alpha interferon |
| US5019368A (en) * | 1989-02-23 | 1991-05-28 | Cancer Biologics, Inc. | Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy |
| EP0307434B2 (en) * | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
| US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
| DE3856559T2 (de) | 1987-05-21 | 2004-04-29 | Micromet Ag | Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung |
| US5091513A (en) * | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
| ATE122238T1 (de) | 1987-06-10 | 1995-05-15 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Bifunktionelle antikörperkonstruktionen und verfahren zur selektiven tötung von zellbeständen. |
| US5064646A (en) | 1988-08-02 | 1991-11-12 | The University Of Maryland | Novel infectious bursal disease virus |
| ES2054753T3 (es) | 1987-09-02 | 1994-08-16 | Ciba Geigy Ag | Conjugados de citoquinas con inmunoglobulinas. |
| EP0308936B1 (en) | 1987-09-23 | 1994-07-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells |
| NZ226414A (en) | 1987-10-02 | 1992-07-28 | Genentech Inc | Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use |
| AU2635088A (en) | 1987-12-04 | 1989-06-08 | Du Pont Merck Pharmaceutical Company, The | Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxyl-terminal extension |
| WO1989006692A1 (en) * | 1988-01-12 | 1989-07-27 | Genentech, Inc. | Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function |
| CA1341588C (en) | 1988-01-26 | 2009-01-06 | Michel Revel | Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use |
| US5120525A (en) * | 1988-03-29 | 1992-06-09 | Immunomedics, Inc. | Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer |
| US4975369A (en) * | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
| IT1217724B (it) | 1988-05-26 | 1990-03-30 | Ist Naz Ric Sul Cancro | Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori |
| IE62463B1 (en) | 1988-07-07 | 1995-02-08 | Res Dev Foundation | Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy |
| US5601819A (en) * | 1988-08-11 | 1997-02-11 | The General Hospital Corporation | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding |
| US5457038A (en) | 1988-11-10 | 1995-10-10 | Genetics Institute, Inc. | Natural killer stimulatory factor |
| US5242824A (en) | 1988-12-22 | 1993-09-07 | Oncogen | Monoclonal antibody to human carcinomas |
| US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US5166322A (en) | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
| ZA902949B (en) | 1989-05-05 | 1992-02-26 | Res Dev Foundation | A novel antibody delivery system for biological response modifiers |
| US6291158B1 (en) * | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for tapping the immunological repertoire |
| US5399346A (en) * | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
| ATE123065T1 (de) * | 1989-07-07 | 1995-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Proteine und deren herstellung. |
| US5073627A (en) | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| WO1991005867A1 (en) | 1989-10-13 | 1991-05-02 | Amgen Inc. | Erythropoietin isoforms |
| US5856298A (en) | 1989-10-13 | 1999-01-05 | Amgen Inc. | Erythropoietin isoforms |
| ATE163675T1 (de) | 1989-12-22 | 1998-03-15 | Hoffmann La Roche | Zytotoxischer lymphozyten-reifefaktor |
| US5314995A (en) * | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
| US5349053A (en) * | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
| US7253264B1 (en) | 1990-06-28 | 2007-08-07 | Sanofi-Arentideutschland GmbH | Immunoglobulin fusion proteins, their production and use |
| US5650150A (en) * | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
| US5709859A (en) * | 1991-01-24 | 1998-01-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Mixed specificity fusion proteins |
| US6072039A (en) | 1991-04-19 | 2000-06-06 | Rohm And Haas Company | Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest |
| DE69233482T2 (de) | 1991-05-17 | 2006-01-12 | Merck & Co., Inc. | Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen |
| US5199942A (en) * | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
| ATE173763T1 (de) | 1991-08-30 | 1998-12-15 | Hutchinson Fred Cancer Res | Hybride cytokine |
| US20020037558A1 (en) * | 1991-10-23 | 2002-03-28 | Kin-Ming Lo | E.coli produced immunoglobulin constructs |
| US6627615B1 (en) * | 1991-12-17 | 2003-09-30 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for in vivo gene therapy |
| ATE260971T1 (de) * | 1992-04-01 | 2004-03-15 | Univ Rockefeller | Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung |
| DK0615451T3 (da) * | 1992-05-26 | 2006-04-24 | Immunex Corp | Hidtil ukendt cytokin der binder til CD30 |
| CA2134773A1 (en) * | 1992-06-04 | 1993-12-09 | Robert J. Debs | Methods and compositions for in vivo gene therapy |
| US5614184A (en) * | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| CA2142007C (en) * | 1992-08-11 | 2007-10-30 | Robert Glen Urban | Immunomodulatory peptides |
| DE4228839A1 (de) | 1992-08-29 | 1994-03-03 | Behringwerke Ag | Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren |
| US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
| DE69232604T2 (de) * | 1992-11-04 | 2002-11-07 | City Of Hope Duarte | Antikörperkonstrukte |
| EP1757694A3 (en) * | 1992-11-05 | 2008-02-27 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Prostate-specific membrane antigen |
| US5738849A (en) * | 1992-11-24 | 1998-04-14 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them |
| US5543297A (en) * | 1992-12-22 | 1996-08-06 | Merck Frosst Canada, Inc. | Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity |
| US6096331A (en) * | 1993-02-22 | 2000-08-01 | Vivorx Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents |
| CA2161095A1 (en) * | 1993-04-20 | 1994-10-27 | Solis Therapeutics, Inc. | Methods and materials for treatment of individuals infected with intracellular infectious agents |
| US5759551A (en) * | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| JPH08509614A (ja) * | 1993-04-29 | 1996-10-15 | アボツト・ラボラトリーズ | エリスロポエチン類似体組成物および方法 |
| US5554512A (en) * | 1993-05-24 | 1996-09-10 | Immunex Corporation | Ligands for flt3 receptors |
| CA2125763C (en) * | 1993-07-02 | 2007-08-28 | Maurice Kent Gately | P40 homodimer of interleukin-12 |
| CN1057534C (zh) | 1993-08-17 | 2000-10-18 | 柯瑞英-艾格公司 | 促红细胞生成素类似物 |
| AU692865B2 (en) * | 1994-04-26 | 1998-06-18 | Children's Medical Center Corporation | Angiostatin and method of use for inhibition of angiogenesis |
| US5837682A (en) * | 1996-03-08 | 1998-11-17 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
| US5639725A (en) * | 1994-04-26 | 1997-06-17 | Children's Hospital Medical Center Corp. | Angiostatin protein |
| CU22615A1 (es) | 1994-06-30 | 2000-02-10 | Centro Inmunologia Molecular | Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos |
| US6429199B1 (en) * | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
| US5888773A (en) * | 1994-08-17 | 1999-03-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing single-chain Fv molecules |
| US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US5541087A (en) * | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
| PT706799E (pt) | 1994-09-16 | 2002-05-31 | Merck Patent Gmbh | Imunoconjugados ii |
| US6086875A (en) * | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
| US6485726B1 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
| US5691309A (en) * | 1995-01-31 | 1997-11-25 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5552524A (en) * | 1995-01-31 | 1996-09-03 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5891680A (en) * | 1995-02-08 | 1999-04-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12 |
| ES2225874T3 (es) * | 1995-03-10 | 2005-03-16 | Genentech, Inc. | Activacion de receptor mediante gas. |
| US5719266A (en) * | 1995-03-17 | 1998-02-17 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US6281010B1 (en) * | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
| WO1997002004A2 (en) * | 1995-06-30 | 1997-01-23 | Eli Lilly And Company | Methods for treating diabetes |
| US6406689B1 (en) * | 1995-10-03 | 2002-06-18 | Frank W. Falkenberg | Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases |
| US5854205A (en) * | 1995-10-23 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic compositions and methods |
| US6080409A (en) * | 1995-12-28 | 2000-06-27 | Dendreon Corporation | Immunostimulatory method |
| US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| US6750334B1 (en) * | 1996-02-02 | 2004-06-15 | Repligen Corporation | CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor |
| CN1136197C (zh) * | 1996-05-30 | 2004-01-28 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 新的哒嗪酮衍生物 |
| US5922685A (en) * | 1996-06-05 | 1999-07-13 | Powderject Vaccines, Inc. | IL-12 gene therapy of tumors |
| ATE218143T1 (de) * | 1996-09-03 | 2002-06-15 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verwendung bi-und trispezifischer antikörper zur induktion einer tumorimmunität |
| US5994104A (en) * | 1996-11-08 | 1999-11-30 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Interleukin-12 fusion protein |
| US6100387A (en) * | 1997-02-28 | 2000-08-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric polypeptides containing chemokine domains |
| US6277375B1 (en) * | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
| EP0973550B1 (en) * | 1997-04-11 | 2002-10-09 | G.D. SEARLE & CO. | Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies |
| TR199902553T2 (xx) * | 1997-04-14 | 2000-03-21 | Micromet Gesellschaft F�R Biomedizinische Forschung Mbh | �nsan v�cuduna kar�� antijen resept�rlerinin �retimi i�in yeni metod ve kullan�mlar�. |
| US5873423A (en) * | 1997-07-31 | 1999-02-23 | Briese Industrial Technologies, Inc. | Frustum cutting bit arrangement |
| ATE267215T1 (de) * | 1997-12-08 | 2004-06-15 | Lexigen Pharm Corp | Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung |
| US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
| PL343462A1 (en) * | 1998-04-15 | 2001-08-13 | Lexigen Pharm Corp | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor |
| EP1071469A2 (en) * | 1998-04-17 | 2001-01-31 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor |
| WO1999054484A1 (en) | 1998-04-20 | 1999-10-28 | The Regents Of The University Of California | Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof |
| WO1999058662A1 (fr) | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Merck Patent Gmbh | Proteine fusionnee |
| US6620382B1 (en) | 1998-05-22 | 2003-09-16 | Biopheresis Technologies, Llc. | Method and compositions for treatment of cancers |
| US20020142374A1 (en) | 1998-08-17 | 2002-10-03 | Michael Gallo | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
| CA2339331C (en) * | 1998-08-25 | 2011-03-01 | Lexigen Pharmaceuticals Corporation | Expression and export of angiogenesis inhibitors as immunofusins |
| US6646113B1 (en) * | 1998-09-17 | 2003-11-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants |
| US6335176B1 (en) | 1998-10-16 | 2002-01-01 | Pharmacopeia, Inc. | Incorporation of phosphorylation sites |
| KR20020007287A (ko) * | 1999-01-07 | 2002-01-26 | 추후보정 | Ｆｃ 융합 단백질로서 항-비만 단백질의 발현 및 이출 |
| KR100922809B1 (ko) | 1999-05-06 | 2009-10-21 | 웨이크 포리스트 유니버시티 | 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법 |
| US6348192B1 (en) * | 1999-05-11 | 2002-02-19 | Bayer Corporation | Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells |
| EP1187852B1 (en) * | 1999-05-19 | 2007-08-08 | EMD Lexigen Research Center Corp. | EXPRESSION AND EXPORT OF INTERFERON-ALPHA PROTEINS AS Fc FUSION PROTEINS |
| CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
| JO2291B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
| US7067110B1 (en) * | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| WO2001010912A1 (en) | 1999-08-09 | 2001-02-15 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Multiple cytokine-antibody complexes |
| WO2001036489A2 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Merck Patent Gmbh | Erythropoietin forms with improved properties |
| US20050202538A1 (en) | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
| CA2399832C (en) | 2000-02-11 | 2011-09-20 | Stephen D. Gillies | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| PT1257297E (pt) * | 2000-02-24 | 2006-12-29 | Philogen Spa | Composições e método para tratamento da angiogénese em lesões patológicas |
| US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| MXPA02011016A (es) * | 2000-05-12 | 2004-03-16 | Neose Technologies Inc | Glicopeptidos recombinantes de glucolisacion in vitro. |
| ES2288967T3 (es) * | 2000-06-29 | 2008-02-01 | Merck Patent Gmbh | Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado por agentes que mejoran la incorporacion de inmunocitoquina. |
| JP2004525621A (ja) * | 2001-01-18 | 2004-08-26 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | グルコセレブロシダーゼ活性を有する二機能性融合タンパク質 |
| WO2002069232A2 (en) * | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
| JP2004532620A (ja) * | 2001-02-19 | 2004-10-28 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 免疫原性の低減された人工タンパク質 |
| CA2440221C (en) | 2001-03-07 | 2013-02-05 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
| WO2002079415A2 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| BR0209177A (pt) | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
| TW544602B (en) * | 2001-08-08 | 2003-08-01 | Hon Hai Prec Ind Co Ltd | Delivery notification system |
| ES2381025T3 (es) * | 2001-12-04 | 2012-05-22 | Merck Patent Gmbh | Inmunocitocinas con selectividad modulada |
| ES2346205T3 (es) * | 2002-12-17 | 2010-10-13 | Merck Patent Gmbh | Anticuerpo humanizado (h14.18) del anticurpo 14.18 de raton que se enlaza con gd2 y su fusion con la il-2. |
| US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
| WO2005063820A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Merck Patent Gmbh | Il-7 fusion proteins |
| KR20060124656A (ko) | 2003-12-31 | 2006-12-05 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질 |
| CA2553883C (en) | 2004-01-22 | 2013-04-02 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation |
| US7670595B2 (en) | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
| DE602005020837D1 (de) * | 2004-12-09 | 2010-06-02 | Merck Patent Gmbh | Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität |
| US20070104689A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
| PT2270050E (pt) | 2005-12-30 | 2013-09-12 | Merck Patent Gmbh | Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida |
| KR20080090484A (ko) | 2005-12-30 | 2008-10-08 | 메르크 파텐트 게엠베하 | ＧＰ130 에 대한, ＩＬ-6Ｒα 와 복합체를 형성한 ＩＬ-6의 결합을 방해하는 항-ＩＬ-6 항체 |
| CA2635618C (en) | 2005-12-30 | 2015-10-06 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraekter Haftung | Interleukin-12p40 variants with improved stability |
| AU2007229698B9 (en) | 2006-03-24 | 2012-11-08 | Merck Patent Gmbh | Engineered heterodimeric protein domains |
| EP2038417A2 (en) * | 2006-07-06 | 2009-03-25 | Merck Patent GmbH | Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses |
-
2002
- 2002-05-03 BR BR0209177-1A patent/BR0209177A/pt active Search and Examination
- 2002-05-03 ES ES02769304T patent/ES2361664T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 EP EP02769304A patent/EP1383785B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 AT AT02769304T patent/ATE502053T1/de active
- 2002-05-03 HU HU0400284A patent/HUP0400284A3/hu unknown
- 2002-05-03 JP JP2002587625A patent/JP4309662B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 PT PT02769304T patent/PT1383785E/pt unknown
- 2002-05-03 DK DK02769304.3T patent/DK1383785T3/da active
- 2002-05-03 KR KR1020037014151A patent/KR100900166B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-05-03 CA CA2446087A patent/CA2446087C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 RU RU2003132705/13A patent/RU2306320C9/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-05-03 PL PL367831A patent/PL205352B1/pl unknown
- 2002-05-03 AU AU2002308562A patent/AU2002308562B2/en not_active Ceased
- 2002-05-03 DE DE60239454T patent/DE60239454D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-03 CN CNB02809297XA patent/CN100503639C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-03 WO PCT/US2002/013844 patent/WO2002090566A2/en active Application Filing
- 2002-05-03 MX MXPA03009924A patent/MXPA03009924A/es active IP Right Grant
- 2002-05-03 US US10/138,727 patent/US6969517B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-12-02 ZA ZA2003/09380A patent/ZA200309380B/en unknown
-
2005
- 2005-07-01 US US11/174,186 patent/US7459538B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-08-29 US US12/201,935 patent/US7803618B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-17 JP JP2009064775A patent/JP4546571B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Chimeric L6 antitumor antibody. FELL ET AL.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.267 No.22. 1992 |
| Chimeric L6 antitumor antibody. FELL ET AL.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.267 No.22. 1992 * |
| Structural and functional implications of a restrictedantibodyresponse to a defined antigenic region on theinfluenza virusemagglutinin. CATON ET AL.THE EMBO JOURNAL,Vol.5 No.7. 1996 |
| Structural and functional implications of a restrictedantibodyresponse to a defined antigenic region on theinfluenza virusemagglutinin. CATON ET AL.THE EMBO JOURNAL,Vol.5 No.7. 1996 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100503639C (zh) | 重组肿瘤特异性抗体及其应用 | |
| JP7317272B2 (ja) | Ｔｉｇｉｔ抗体、その抗原結合断片及びその医療用途 本願は、２０１９年９月２９日に出願された出願番号ｃｎ２０１７１０９０８５６５．３に基づいたものであり、その優先権を主張する。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 | |
| RU2499001C2 (ru) | Антитела к nkg2a и их применения | |
| AU2002308562A1 (en) | Recombinant tumor specific antibody and use thereof | |
| JP2022106751A (ja) | ＧＵＣＹ２ｃに特異的な抗体及びその使用 | |
| EP3712170A1 (en) | Cd96 antibody, antigen-binding fragment and pharmaceutical use thereof | |
| CN111278861A (zh) | Pd-l1抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| WO2021098822A1 (zh) | 一种双特异性抗体 | |
| WO2020139171A1 (ru) | Моноклональные антитела, специфически связывающиеся с trbv-9 человека | |
| CN112513088A (zh) | 抗ox40抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| CN107840885B (zh) | Gm-csf抗体及其用途 | |
| EP4324848A1 (en) | Human antibody targeting covid-19 virus | |
| US11299545B2 (en) | Anti-HLA-C antibodies and uses thereof | |
| EP4201961A1 (en) | Antibody specifically bound to glycosylated ceacam5 | |
| TWI804099B (zh) | 特異性結合糖基化ｃｅａｃａｍ５的抗體及其製備方法 | |
| WO2024077777A1 (zh) | 多功能重组抗体及其制备方法和应用 | |
| WO2024008110A1 (zh) | 抗ccr8抗体及其应用 | |
| CN116574189A (zh) | 针对人il-36r和/或人il-1r3的多种抗体及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090624 Termination date: 20170503 |