CN100506846C - 与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的选定抗体和耐久霉素肽以及它们在治疗病毒感染和癌症中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了关于阴离子磷脂和氨基磷脂在肿瘤血管结构和病毒侵入及传播中的作用的惊人发现，以及将这些发现用于治疗癌症和病毒感染的组合物和方法。本发明还公开了可结合并抑制阴离子磷脂和氨基磷脂的有益抗体、免疫缀合物和基于耐久霉素的组合物和联合，可用于安全有效的治疗癌症、病毒感染和相关疾病。

Description

与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的选定抗体和耐久霉素肽以及它们在治疗病毒感染和癌症中的用途
发明背景
本申请要求于2002年7月15日提交的、系列号为60/396263的共同待审美国临时申请的优先权，该文件的公布内容，包括说明书、权利要求、附图和序列在此都特别收编作为参考而并未放弃。
1.发明领域
本发明涉及氨基磷脂和阴离子磷脂生物学、肿瘤血管和病毒感染领域。它提供了惊人的新组合物、方法和组合，可用于肿瘤血管的靶向和癌症治疗、抑制病毒侵入和扩散以及治疗病毒感染。本发明另外还提供了许多结合并抑制氨基磷脂和阴离子磷脂的优选抗体、免疫缀合物和基于耐久霉素的组合物，可用于治疗癌症、病毒感染和有关疾病。
2.相关领域描述
肿瘤细胞对化疗剂的抗性在临床肿瘤学中是一个重要问题。在肿瘤治疗中要解决的另一主要问题是期望“全部细胞杀死”，即，杀死所有能不受控生长并取代通过治疗可去除的任何肿瘤块的所谓“克隆源性”恶性细胞。尽管在此领域内有了一定的进展，但这仍是为何许多普遍形式的人类癌症依然耐受有效的化学治疗干预的两个主要原因。
对于开发接近全部细胞被杀死的疗法这一目的而言，某些类型的肿瘤比其它类型更易受治疗的影响。例如，淋巴瘤等软组织肿瘤和白血病等血液和血液形成器官的肿瘤通常比癌瘤等实体瘤对化学疗法更有反应性。
软组织肿瘤和以血液为基础的肿瘤对化学疗法的易感性的一个原因是淋巴瘤和白血病细胞更易于接受化学疗法干预。简而言之，大部分化疗剂到达实体瘤块的所有细胞比到达软组织肿瘤和以血液为组织的肿瘤的所有细胞要难得多，因此完成全部细胞杀死也要困难得多。增加化疗剂的剂量大部分情况下常常会导致毒副作用，这通常限制了常规抗肿瘤剂的效力。
另一肿瘤治疗方法是使用“免疫毒素”，其中用抗肿瘤细胞抗体将毒素投递至肿瘤细胞。不过，和化学治疗方法一样，免疫毒素疗法在应用于实体瘤时也存在着重要的缺点。例如，抗原阴性或抗原缺乏的细胞能继续存活并再生成肿瘤或导致进一步的转移。实体瘤对基于抗体的疗法有耐受性的另一原因是肿瘤块对于抗体和免疫毒素等大分子剂来说通常是不能通过的。肿瘤内的物理扩散距离和间质压力都造成了对此类型疗法的限制。
改良的治疗方法是靶向于实体瘤的血管结构。靶向于肿瘤血管而非肿瘤细胞本身具有一定的优越之处，即这不太可能导致抗性肿瘤细胞的发生，而且被靶向的细胞容易接近。此外，血管的破坏导致了抗肿瘤效果的扩大，因为许多肿瘤细胞依赖单一血管来提供其氧气和养分。例示性的血管靶向剂(VTAs)如美国专利5855866、5965132、6261535、6051230和6451312中所述，这些文献描述了抗细胞剂和毒素向肿瘤血管结构标记物的靶向投递。
另一有效的血管靶向方案是将凝血因子靶向于肿瘤血管结构或基质中表达或吸附的标记物(Huang等，1997；美国专利申请6093399、6004555、5877289和6036955)。将凝血剂而非毒素投递至肿瘤血管结构具有另外的优越之处，即降低了免疫原性，甚至减少了产生毒副作用的风险。如美国专利5877289中所述，用于所说的肿瘤特异性“凝血配体”中的优选凝固因子是截短形式的人凝血诱导蛋白质，组织因子(TF)，即血液凝结的主要起始因子。
最近，氨基磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)被确定为肿瘤血管结构的特殊标记(Ran等，1998)。这引起了对用于投递抗细胞剂、毒素和凝血因子至肿瘤血管的新型抗PS和抗PE免疫缀合物的开发(美国专利6312694)。此外，还发现未缀合的抗PS和PE抗体无需与治疗剂附着就可发挥抗癌作用，这已知为针对肿瘤血管靶向和治疗的氨基磷脂“裸抗体”方法(美国专利6406693)。
尽管前述免疫缀合物和氨基磷脂血管靶向方法代表了肿瘤治疗中的重大进展，但某些外周肿瘤细胞在这些疗法所造成的普遍肿瘤破坏当中仍能幸存。因此考虑将抗血管发生的方法与美国专利5855866、6093399、6312694和6406693中的VTA、凝血配体和氨基磷脂靶向方法结合使用，前者抑制了从原先存在的血管和/或循环内皮干细胞中发展出新的血管结构。
血管发生不仅在胚胎发生、伤口愈合和月经等生理学过程中起着重要的作用，还涉及肿瘤生长、关节炎、牛皮癣和糖尿病性视网膜病等病理活动(Ferrara，1995)。应用于肿瘤治疗中时，抗血管发生的方法是以抑制开始发生的血管的增殖(通常在实体瘤的外围)为基础的。这些疗法通常用于在较常规的干预治疗(如外科手术或化疗)后降低实体微小转移的风险或抑制实体瘤的进一步生长。
美国专利6342219、6524583、6342221和6416758描述了与血管发生的一种主要刺激物血管内皮生长因子-A(VEGF，以前已知为血管渗透因子VPF)结合的抗体和免疫缀合物。这些抗体具有只抑制VEGF与两个主要VEGF受体中的一个结合的重要优势。通过阻断VEGF与VEGF2而非VEGF1的结合，这些抗体在提高安全性的同时，保持了例如巨噬细胞、破骨细胞和破软骨细胞功能中由VEGFR1所介导的有利功效。
尽管前述方法促进了肿瘤治疗领域的发展，仍然需要开发另外的或可选择的血管靶向疗法。为了扩大治疗选择的数目，需要鉴定肿瘤血管结构的新标记。具有抗癌特性的新的裸抗体的开发会是一个尤其重要的进展，因为它允许相同的靶向部分既作为单一治疗剂也作为血管靶向剂用于投递其它的药物。在同一分子内具有抗血管发生和抗血管，即肿瘤破坏性特征的治疗剂是很有价值的。更重要的进展将是在其它系统中具有抗癌特性和治疗作用的治疗剂的确定。开发既能治疗癌症又能治疗病毒感染(这是此阶段最重要的医学疑症中的两种)的制剂应是一个引人注目的重要突破。
发明简述
本发明通过提供新方法和组合物用于安全有效的肿瘤血管靶向、抗血管发生和破坏肿瘤来致力于解决现有技术中的前述需要及其它需要，所说的方法和组合物对于抑制病毒入侵和扩散以及治疗病毒感染和疾病也出乎意料地非常有效。本发明在某种程度上基于的是关于肿瘤血管结构中阴离子磷脂的表达和作用以及病毒入侵和扩散中氨基磷脂和阴离子磷脂的参与这些惊人发现。本发明另外还提供了结合氨基磷脂和阴离子磷脂的特别有效的抗体和免疫缀合物，以及与磷脂酰乙醇胺结合的以肽为基础的一类新型衍生物。
综述：在第一个全面的实施方案中，本发明根据下述意外的发现，即诸如磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)(以及磷脂酰丝氨酸PS)等的阴离子磷脂是肿瘤血管结构上的易接近且可稳定靶向的标记物，提供了用于肿瘤血管靶向、肿瘤成像和治疗的新方法。此实施方案起因于抗PA、PI、PG和其它阴离子磷脂组分的抗体特异地定位于实体瘤的血管结构的意外发现。
本实施方案的其它方面源自另一意外发现，即，在缺乏与毒素或凝血剂等效应分子缀合的的情况下，抗PA、PI和PG(以及PS)等阴离子磷脂的裸抗体可特异性抑制体内肿瘤血管发生并诱发血管结构的毁坏和肿瘤坏死。本发明因此提供了利用结合阴离子磷脂的单一组分且基于抗体的治疗剂进行血管靶向、抗肿瘤发生和肿瘤治疗的安全有效的方法。
本发明的根本不寻常的特征是，至少在很大程度上，阴离子磷脂向肿瘤血管内皮细胞表面的转位与细胞损伤和细胞凋亡或其它细胞死亡机制无关。因此肿瘤血管结构中阴离子磷脂的表达不是细胞死亡和毁坏的结果或触发物，而是发生于形态完整的血管内皮细胞中。这意味着肿瘤血管结构中阴离子磷脂的表达不是短暂的，而是足够稳定的，从而能为治疗性干预提供靶目标。
由于发现了阴离子磷脂在肿瘤血管结构中被稳定诱导，本发明还提供了利用抗阴离子磷脂抗体的免疫缀合物进行肿瘤血管成像和破坏的一系列新方法和组合物。这些免疫缀合物包含有效连接了毒素和凝血剂等治疗剂且可用于将诊断剂和治疗剂特异投递至肿瘤血管内皮细胞膜表面的抗阴离子磷脂抗体。治疗剂被投递至与肿瘤血管内皮细胞膜密切接触，从而可以快速进入靶细胞或迅速与效应细胞、凝血级联过程中的组分等缔合。
在第二个全面的实施方案中，本发明提供了与氨基磷脂和阴离子磷脂结合的许多优选抗体(以及相关的免疫缀合物和组合物)，所说的抗体具有优于本领域已知的其它抗体的结构和特性。这些所谓的“第二代”或改良的抗体将优选用于本文所述的抗血管发生、抗癌和抗病毒以及其它治疗方法中。
通过提供不具有本领域抗氨基磷脂和阴离子磷脂抗体通常相关联的病理特性的治疗用抗体，本领域所提供的与氨基磷脂和阴离子磷脂结合的新型抗体克服了现有技术中的各种缺点。本发明的开发，在部分程度上，是利用了从本发明发明者对肿瘤血管内皮细胞中磷脂性能的独特观察结果中发展而来的新免疫接种和筛选技术，并且胜过了从疾病相关抗磷脂抗体中产生的抗体。这样的抗体不仅具有独一无二的特性和改良的安全性，还与比较研究中的已有抗体同样有效或更有效。利用所提供抗体的特定分类，本发明这些方面的组合物和方法还延伸到了免疫缀合物和化合物的用途。
在本发明之前，结合氨基磷脂和阴离子磷脂且具有本文所公布的新抗体特性的抗体是未知的。不过，根据本文所公布的发明，目前为本领域提供了产生新的候选抗体的方法以及通过检测这些抗体从候选抗体集合中鉴定更多的有用抗体的技术。因此，根据本发明，可以制备具有优越特性和氨基磷脂和阴离子磷脂结合特征的一系列抗体，它们不会有现有技术中的抗体相关的显著缺点和副作用。因此这样的抗体可用于多种实施方案中，包括抑制血管发生和治疗癌症和病毒感染。
除了本文所提出的新免疫法和筛选技术之外，现在可以利用单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4通过竞争和/或功能检测法鉴定与氨基磷脂和阴离子磷脂结合且具有许多优越特性的抗体。目前，1B12、3B10、9D2和3G4抗体是优选的，因为这些抗体在结合磷脂时不需要血清。更优选单克隆抗体9D2和3G4，目前最优选单克隆抗体3G4(ATCC4545)。为了鉴定与任何前述抗体竞争的另外的抗体，优选3G4，目前优选的检测法是基于ELISA进行的竞争性检测法，其中的许多种方法在此进行了描述，而有关的工作实施例也公布于此。
在第三个全面的实施方案中，本发明提供了与氨基磷脂的一种-磷脂酰乙醇胺(PE)结合的细胞不可渗透且以肽为基础的新型衍生物。这些“结合PE的肽衍生物”至少包含第一PE结合肽，优选耐久霉素，它已被修饰成基本上防止了非特异的毒性，这优选通过修饰PE结合肽(优选耐久霉素)而形成基本上细胞不可渗透或基本上无孔形成的结合PE的构建物来实现。
“基本上细胞不可渗透的”结合PE的构建物或耐久霉素的产生优选通过将结合PE的肽或耐久霉素与至少一种第一细胞不渗透基团结合而完成的。在此描述了许多典型耐久霉素衍生物的合成。“细胞不渗透基团或基团组”可以是小分子、惰性载体或其自身可以是赋予所产生构建物进一步靶向功能的靶向分子，诸如靶向于肿瘤血管结构。因而，结合PE的肽可以是与惰性载体连接的唯一靶向药剂，或者可以是分别将靶向功能赋予构建物的两种药剂之一。此外，结合PE的肽，优选耐久霉素，与效应分子有效的连接，从而使结合PE的肽或耐久霉素提供靶向功能，而所连接的药剂一旦递送至靶细胞则具有充分的治疗功效。优选的例子是与核苷等抗病毒剂连接的结合PE的肽或耐久霉素。
由于正常条件下正常细胞表面基本上不存在PE，所以本发明的基本上细胞不可渗透的结合PE的肽可以发挥选择性结合诸如肿瘤血管内皮细胞、增殖和/或病毒感染细胞等异常细胞或疾病相关细胞表面上的PE的功能。通过与所说的异常靶细胞结合，结合PE的构建物或衍生物抑制或阻断PE在那些细胞中的功能，因此产生全面的治疗效用，如，在肿瘤和/或病毒疾病的治疗中。本文公布了基本上细胞不可渗透的结合PE的肽在抑制病毒入侵和扩散中的成功应用。在将结合PE的肽与诸如西多福韦等抗病毒药剂连接的实施方案中，提供了更有效且更安全的抗病毒疗法。
在第四个全面的实施方案中，本发明进一步提供了抑制病毒复制、感染和扩散的一类重要的新型组合物和方法，可用于治疗病毒感染和疾病。这些方法基于的是如下不寻常的观察结果：结合诸如PS、PE、PI、PA和PG(尤其是PS和PE)等氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体和肽会是安全有效的抗病毒剂。本发明不仅已证实了此观察结果是正确的，还提供了数据显示结合氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体和肽在对抗病毒扩散中出乎意料的有效，意味着这些药剂可广泛的应用于一系列病毒感染及相关疾病的治疗中。
这些发现进一步包括使用新类型的免疫缀合物、组合物、药剂盒和方法，其中抗氨基磷脂或阴离子磷脂(尤其是PS和PE)的抗体与抗病毒药剂有效连接。基本上细胞不可渗透的结合PE的肽衍生物，如耐久霉素肽衍生物，也可与抗病毒剂连接。因而这些药剂中的每一种都提供了独特地靶向于病毒感染细胞的新抗病毒药物。
因此，在异常血管发生、癌症和病毒感染及疾病治疗中有效的新型安全治疗剂的开发是现有技术中的一个突破。
尽管可以有效的单独应用，但本发明的各种方法和组合物还可与其它疗法和药剂结合使用，以提供综合治疗方法和本发明的相关组合物、药物和药剂盒。因此，在第五个全面的实施方案中，正如本文将要更详细描述的，本发明进一步提供了具体的联合组合物、方法和药剂盒，如，用于癌症治疗中，发现它们在一起作用时效果意外的好。
第二代抗体：在本文实施例IV中描述了在产生具有目的特性的抗体中发挥良好功能的某些方法，这些方法包括在所附权利要求中。这些方法可以产生本发明的优势抗体，代表性的有单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2和3G4，尤其是3G4(ATCC 4545)。
本发明因此提供了纯化的抗体及其抗原结合片段和免疫缀合物，它们与至少一种氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)结合，而且与单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，优选与9D2或3G4(ATCC 4545)，最优选与3G4有效竞争结合氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS。
当用于整个申请文件各处时，术语“一个”、“一种”指“至少一种(个)”、“至少第一种(个)”、“一种(个)或多种(个)”或“众多”所提及的组分或步骤，除非在其后特别提出了一个上限。因此，一种(个)“抗体”，用于此处时，指“至少第一种抗体”。正如已知任何单一药剂的量一样，本领域普通技术人员根据本申请的内容将了解各组合的可行限量和参数。
在某些方面，抗体将与单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，优选与9D2或3G4(ATCC 4545)，最优选与3G4有效竞争结合氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS，或者具有单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，优选9D2或3G4，最优选3G4的氨基磷脂或阴离子磷脂结合特征，如表4中所示；且将不具有血清依赖性，即其结合氨基磷脂或阴离子磷脂时不需要血清；并非来自患病者，且不会显著抑制体外凝结反应，引起体内显著的血栓形成或具有狼疮抗凝剂活性。
优选的，与文献中的抗体相比，所说的抗体还将在对照研究中展示结构性质的改良或有利功能特性的范围或程度的增进，诸如对于IgG而言，具有更高的亲合力或显示出与活化内皮细胞的结合增强，增强了对内皮细胞增殖或血管发生的抑制，提高了肿瘤血管定位、抗癌和/或抗病毒作用。
因此本发明的独特方面是以发明者最早的、意外的制备出具有前述、另外公布的和固有的有利特性的抗体为基础的。目前已提供了一组优选抗体和许多特别优选的抗体，本发明进一步包含一类表位特异性确定的抗体，其中所说的抗体或其抗原结合片段与单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，优选与9D2或3G4(ATCC 4545)，最优选与3G4有效竞争抗原的结合，从而它们结合的表位基本上与单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，优选与9D2或3G4，最优选与3G4(ATCC 4545)的结合表位相同。
根据本说明书和方便获得的技术文献、实际知识和起始资料，本申请中要求保护的发明能够得到实施。尽管如此，以本发明申请者Broad ofRegents，The University of Texas System的名义提交了产生3G4单克隆抗体的杂交瘤细胞系样品，在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，美国保存。该样品是由许可证持有者Peregrine制药有限公司的附属机构美国AvidBioservices有限公司，14272Franklin大街，Tustin，CA92780在2002年7月8日开始的一周内提交的，2002年7月10日收到，7月12日证明是存活的，2002年7月30日指定ATCC登记号为PTA4545。
此保藏是根据用于专利程序的国际公认的微生物保藏布达佩斯条约有关条款及其细则(布达佩斯条约)进行的。所说的杂交瘤将根据布达佩斯条约的规定在授予美国专利权后可由ATCC向公众提供。已保存的杂交瘤的可获得性不能解释为可以违反任何政府当局根据其专利法所批准权利实施本发明的许可。
根据所研究的抗体、优选的抗体和本文所公布及本领域已知的技术，现在向本领域普通技术人员提供了一种结合氨基磷脂或阴离子磷脂且具有有利特性的新型抗体。这些抗体“类似”或“基于”单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4。优选的，本发明的抗体是“基于9D2或9D2样的抗体”，更优选的，本发明抗体是“基于3G4或3G4样的抗体”。下文针对3G4抗体所用的表述“某某样”抗体是为了简明表达，但特别收编于此作为参考，可分别应用于1B9、1B12、3B10、2G7、7C5和9D2抗体。
3G4样抗体是所结合表位与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)基本上相同或结合第一氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)上的表位与单克隆抗体3G4(ATCC4545)所结合表位基本相同的抗体或其抗原结合片段。优选的，抗体或其抗原结合片段将结合与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)相同的表位。
术语“结合与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)大约、基本上或本质上相同或同一表位”指抗体与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)“交叉反应”。“交叉反应性抗体”是指这样的抗体，即它们与单克隆抗体3G4(ATCC4545)相比，识别或结合基本上或本质上相同或完全相同的表位、表位位点或共同的氨基磷脂或阴离子磷脂表位或具有对这样的表位的免疫特异性，从而能与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)有效的竞争结合至少一种氨基磷脂或阴离子磷脂、一种以上的氨基磷脂或阴离子磷脂或单克隆抗体3G4(ATCC 4545)所结合的所有氨基磷脂或阴离子磷脂。“3G4交叉反应性抗体”简称为“3G4样抗体”和“基于3G4的抗体”，这些术语在此可互换使用，并适用于组合物、用途和方法中。
由于现在已经提供了具有有利特性的3G4，与单克隆抗体3G4(ATCC4545)相比，结合大约、基本上、本质上或完全相同表位的一种或多种抗体的鉴定是一个直接的技术问题。因为交叉反应性抗体的鉴定是与参照抗体(3G4)相比较确定的，应理解为真实地测定参照抗体(3G4)和待测抗体所结合表位在任何情况下都不是鉴定所结合的表位与单克隆抗体3G4相同或基本上相同的抗体所必需的。不过，本文还是提供了3G4所结合表位的重要信息且可进一步进行表位作图。
交叉反应性抗体的鉴定可以用各种免疫学检测法中的任一种方便的测定，其中可以测定抗体的竞争。所有这些检测法在本领域中都是常规的方法且在此有进一步的详述。美国专利6342219和6342221各自特别收编于此作为参考，其目的是为了对本发明关于如何制备具有下述特点的抗体的教导作一些补充，即，该抗体所结合表位与如3G4等给定抗体相同或基本上或本质上相同，或者与给定抗体有效竞争结合某抗原。
例如，在待检验的试验抗体获自不同来源动物或甚至来源于不同种型的情况下，可以应用一种简单的竞争检测法，其中对照抗体(3G4)和试验抗体被混合在一起(或预吸附)并施用至氨基磷脂或阴离子磷脂抗原组合物上，优选PS。“氨基磷脂或阴离子磷脂抗原组合物”指包含本文所述3G4结合抗原的任何组合物，如表4中所述的那些。因此，基于ELISA和蛋白质印迹的方法适用于这样的简单竞争试验。
在某些实施方案中，在施用于抗原组合物之前，将要或预先混合对照抗体(3G4)和不同量的试验抗体(如，1:10或1:100)一段时间。在另一实施方案中，对照抗体和不同量的试验抗体可以只在暴露于抗原组合物的期间混合。在任何情况下，通过使用物种或同种型的二抗，都将能只探测被结合的对照抗体，它的结合由于存在基本上识别同一表位的试验抗体而减少。
在进行对照抗体和任何试验抗体(无论是何物种或同种型)之间的抗体竞争试验时，可以首先用诸如生物素或酶(或甚至放射性)标记等可检测标记物来标记对照抗体(3G4)，使其随后能够被识别。在这些情况下，应该将被标记的对照抗体与待检测的试验抗体以各种比率(如1:10、1:100或1:1000)预混合或保温，并且(任选在一段适当时间后)随后检测被标记的对照抗体的反应性，将其与保温中不存在潜在竞争性试验抗体情况下的对照值进行比较。
检测法还可以是基于抗体杂交的一系列免疫学检测法中的任一种，对照抗体将通过探测它们的标记物的方式被检测，如，在生物素化抗体的情况下用链霉亲和素，或者就酶标记物而言使用有关的生色底物(如，就过氧化物酶而言使用3，3’5，5’-N四甲联苯胺(TMB)底物)或通过简单地检测放射性标记。正如被结合的标记物的减少所证实的，与对照抗体结合同一表位的抗体将能够有效竞争结合，并因此显著减少了对照抗体的结合。
在不存在完全无关抗体的情况下(已标记)对照抗体的反应性将是对照最高值。通过将被标记(3G4)的抗体与完全同一类型的(3G4)未标记抗体一起保温将获得对照最低值，这种情况下将发生竞争从而减少被标记抗体的结合。在试验组的检测中，试验抗体存在时被标记抗体的反应性的显著降低是识别同一表位的试验抗体(即与被标记(3G4)抗体“交叉反应”的抗体)的指示。
显著的减少是“可重复性的”，即观察到始终如一的结合减少。“显著的减少”就本申请而言被解释为在约1:10和约1:1000之间的任何比率条件下至少约70％、约75％或约80％的可重现性减少(在ELISA中，与一种或多种氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)结合的3G4的减少)。具有更严格交叉封闭活性的抗体在约1:10和约1:1000之间的任何比率条件下将展示至少约82％、约85％、约88％、约90％、约92％或约95％上下的可重现性减少(在ELISA或其它适当的检测中，与一种或多种氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)结合的3G4的减少)。尽管对于进行本发明而言一点也不需要完全或近似完全的交叉封闭性，如在3G4与一种或多种氨基磷脂或阴离子磷脂的结合中展示约97％或96％左右的可重现性减少，但它当然也不排除在本发明之外。
就第二代抗体的总体而言，竞争的测定可以参照至少结合磷脂酰丝氨酸的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酰丝氨酸的结合；参照至少结合磷脂酸的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酸的结合；参照至少结合磷脂酰肌醇的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酰肌醇的结合；参照至少结合磷脂酰甘油的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酰甘油的结合；参照至少结合心磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与心磷脂的结合；以及任选地参照至少结合磷脂酰乙醇胺的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酰乙醇胺的结合。
在某些实施方案中，第二代抗体的测定可以参照可结合至少第一和第二氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争结合此第一和第二氨基磷脂或阴离子磷脂；参照可结合至少第一、第二和第三氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争结合此第一、第二和第三氨基磷脂或阴离子磷脂；参照可结合至少第一、第二、第三和第四氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争结合此第一、第二、第三和第四氨基磷脂或阴离子磷脂；参照可结合至少第一、第二、第三、第四和第五氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争结合此第一、第二、第三、第四和第五氨基磷脂或阴离子磷脂。
在另外的实施方案中，第二代抗体可表征为与至少一种氨基磷脂或阴离子磷脂呈现显著结合、与含胆碱的中性磷脂无可检测到的结合且与本发明的单克隆抗体、优选3G4(ATCC 4545)有效竞争的抗体。
在具体的实施方案中，抗体展示出与阴离子磷脂PS、PA、PI、PG和CL有显著结合；磷脂结合特征为PS＝PA＝PI＝PG>CL>>PE，其中>表示与所说磷脂的结合有至少2倍的差异，而>>则表示与所说磷脂的结合有至少10倍的差异；表现出无可检测到的与磷脂酰胆碱或神经鞘磷脂的结合；且与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)有效竞争结合各阴离子磷脂PS、PA、PI、PG和CL。
优选的，第二代抗体将具有前述特征，并且还展示出与活化、分裂、受伤、凋亡或病毒感染细胞表面存在的至少一种阴离子磷脂的显著结合。更优选的，抗体还显著抑制正在分裂中的内皮细胞的增殖却并未明显改变静止细胞，且更优选地没有显著的狼疮抗凝物活性。
就其功能而言，第二代抗体将优选抑制血管发生，具有抗肿瘤作用和抗病毒作用，优选在体内，且更优选的，在发挥这些作用的同时不会在动物或患者体内引起显著的血栓形成并发症。因此，优选的抗体具有抗血管发生、抗肿瘤血管、抗肿瘤和抗病毒剂的联合特性。
本发明以杂交瘤ATCC 4545产生的单克隆抗体3G4或所说单克隆抗体的抗原结合片段为例进行了说明。产生可与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)结合基本上相同的表位的单克隆抗体的杂交瘤是本发明的另一方面。
除非另外特别提及或从科学术语学的角度更清楚的说明，在以下组合物、免疫缀合物、药物、组合、混合物(cocktail)、药剂盒、第一和第二种医药用途以及按照本发明的所有方法的有关描述中，术语“抗体”和“免疫缀合物”或其抗原结合区在本文中是指一系列抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体以及特异的3G4交叉反应性抗体。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”用于此处时，泛指任何免疫学结合剂，包括多克隆和单克隆抗体。根据重链恒定区的类型，抗体被归为五种主要类型之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中的某些进一步被划分为亚型或同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。相应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是众所周知的。
一般而言，本发明中所使用的是抗体而非抗原结合区时，IgG和/或IgM是优选的，因为它们是生理学条件下最常见的抗体，还因为它们最容易在实验室环境中制备。根据它们恒定结构域的氨基酸序列，将哺乳动物抗体的“轻链”归为两种明显不同的类型之一：kappa(κ)和lambda(λ)。在本发明抗体中基本上没有对使用κ或λ轻链的偏好。
一般情况下优选使用单克隆抗体(MAbs)或其衍生物。MAbs被认识到具有某些优点，如，可再现性和大规模的生产量，这样就使它们适于临床治疗。因此本发明提供了小鼠、人、猴子、大鼠、仓鼠、兔和甚至青蛙或鸡来源的单克隆抗体。小鼠、人来源或人源化的单克隆抗体通常将是优选的。
正如本领域技术人员将理解的，术语“抗体”所涵盖的免疫学结合剂延伸到来自所有物种的所有抗体和其抗原结合片段，包括二聚、三聚和多聚抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；人来源或人源化抗体；重组、基因工程产生和骆驼源化(camelised)抗体及其片段。
术语“抗体”因此被用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，且此术语包括诸如Fab’、Fab、F(ab’)2等抗体片段、单一结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)、线性抗体、二体(diabodies)、骆驼源化抗体等。制备和使用各种基于抗体的构建物和片段的有关技术在本领域中是众所周知的(参阅Kabat等，1991，专门收编于此作为参考)。具体而言，有关二体的描述另外参阅EP 404097和WO 93/11161，分别专门收编于此作为参考；而线性抗体则另外描述于Zapata等人(1995)的文献中，该文献专门收编于此作为参考。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂的抗体，所说抗体含至少第一可变区，该第一可变区包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少具有约75％、更优选至少约80％、更优选至少约85％、更优选至少约90％、最优选至少约95％左右同一性的氨基酸序列区；其中所说的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂的抗体至少基本上保持了本发明抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的生物学特性，如同3G4抗体所示范的一样。
关于本发明这些和其它抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体序列的同一性或同源性在此定义为，在将序列比对并且(在需要时)导入缺口以达到最大序列相同性百分比时，候选序列中与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列、或者与本发明的其它抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体序列相同的氨基酸残基的百分率。保持用于序列比较的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体基本上相同或甚至更有效的生物学特性是尤其重要的。这样的比较是容易进行的，如可利用本文所述的各种检测法中的一种或多种方法进行。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体包含至少第一可变区，该第一可变区包含具有SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4氨基酸序列的氨基酸序列区，例如包含由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核酸序列编码的氨基酸序列的可变区。这些序列是含重链和轻链可变区CDR1-3(互补性决定区)的3G4ScFv的Vh和Vκ序列。
在其它优选的实施方案中，提供了与诸如3G4(ATCC 4545)等最初的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体相比具有增强了的或更优越的特性的第二代抗体。
在某些实施方案中，所应用的抗体将是“人源化的”、部分人源或人来源的抗体。“人源化”抗体通常是来自小鼠或其它非人物种的嵌合单克隆抗体，其中携带人的恒定和/或可变区结构域(“部分人来源的嵌合抗体”)。用于本发明中的各种人源化单克隆抗体将是嵌合抗体，其中小鼠、大鼠或其它非人单克隆抗体的至少第一抗原结合区或互补性决定区(CDR)被有效连接或“移植”到人抗体恒定区或“框架”上。
本文所用的“人源化”单克隆抗体还可以是来自非人物种的单克隆抗体，其中一个或多个选定的氨基酸已被人抗体中更经常观察到的氨基酸所替换。通过使用常规重组技术，尤其是定位诱变，可以方便的完成这一步。
还可制备完全来源于人的抗体，而非“人源化”的抗体，并应用于本发明中。所说的人源抗体可以通过以下方式获自健康的受试者，即，简单地从人受试者中获得混合的外周血淋巴细胞群，其中包括抗原呈递和抗体产生细胞，并通过与免疫学有效量的氨基磷脂或阴离子磷脂样品混合而刺激体外细胞群。该人抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞一旦获得就可用于杂交瘤和/或重组抗体的生产中。
另外用于单克隆抗体生产的技术包括用免疫学有效量的氨基磷脂或阴离子磷脂样品免疫包含人抗体文库的转基因动物，优选转基因小鼠。这还产生了人抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞，以供进一步用于杂交瘤和/或重组抗体的生产中，其优势在于，脾细胞(而非外周血细胞)可方便的获自转基因动物或小鼠。
按照本发明的抗体可以通过选择与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗体而方便的制备得到。适当的制备过程和方法包括：
(a)制备候选的抗体生产细胞；并
(b)从候选的抗体生产细胞中选择与单克隆抗体3G4(ATCC PTA4545)实质性交叉反应或竞争的抗体。
制备适当抗体生产细胞并从中获得抗体的一种方法可以在给定患者体内原位进行。即，简单地向患者提供免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂样品将导致合适的抗体产生。因此，虽然抗体仍然“获自”抗体生产细胞，但它不必从宿主中分离并随后再提供给患者，而能够自发的定位于肿瘤血管结构并发挥其生物学抗肿瘤作用。不过，这样的实施方案并非目前优选的。
还可通过在体外用氨基磷脂或阴离子磷脂刺激外周血淋巴细胞而获得适当的抗体生产细胞，并随后分离和/或纯化抗体。
其它方法包括将包含至少第一免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂组分的免疫组合物施用于动物并从被免疫的动物中选择与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗体。这些方法通常包括：
(a)通过将含免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂的至少一剂、任选一剂以上的组合物施用于动物来免疫动物；并
(b)从被免疫的动物中获取适当的抗体生产细胞，诸如产生与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗体的抗体生产细胞。
本文中，优选的“含免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂的组合物”是含活化内皮细胞的组合物。“活化内皮细胞”优选制备如下：在至少第一条件下放置内皮细胞，或将内皮细胞与至少第一因子接触，该条件/因子可活化内皮细胞以及/或模拟肿瘤环境，持续时间是足以基本上保持细胞活力并有效刺激至少一种阴离子磷脂在内皮细胞表面表达的时间。
有效制备活化内皮细胞的“条件”实例有低氧和/或酸性的环境。有效制备活化内皮细胞的因子的例子有有效浓度的H2O2、凝血酶、炎性细胞因子如IL-1α、IL-1β、干扰素或TNFα，以及总体上模拟肿瘤环境的条件和/或因子的组合。
无论免疫方法的特性或免疫动物的类型是什么，合适的抗体生产细胞可获自免疫动物，并优选进一步进行人工处理。“被免疫的动物”用于此处时，除非另外特别提及，是非人动物。尽管任何抗体生产细胞都可使用，最优选将脾细胞作为抗体生产细胞的来源。抗体生产细胞可用于制备型方法中，其中包括：
(a)将适当的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞与永生化细胞融合以制备产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤；并
(b)从杂交瘤中获取本发明的适当抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体。
“适当”的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞、杂交瘤和抗体是产生抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或以此形式存在的那些细胞或杂交瘤或抗体，优选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗体。
基于杂交瘤的单克隆抗体制备方法由此包括含以下步骤的那些方法：
(a)将含免疫学有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂的至少一剂、任选多剂组合物施用于动物来免疫动物，优选含活化内皮细胞的组合物；
(b)从被免疫动物中制备单克隆抗体生产杂交瘤的集合；
(c)从集合中选择产生本发明的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂单克隆抗体的至少第一杂交瘤，所述抗体任选是与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体；并
(d)培养该至少第一抗体生产杂交瘤，以提供该至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂单克隆抗体；并优选
(e)从人工培养的至少第一杂交瘤中获取所述至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂单克隆抗体。
在鉴定与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体时，选择步骤可以包括：
(a)将氨基磷脂或阴离子磷脂样品，优选PS样品，与有效量的单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)和候选抗体接触；并
(b)测定候选抗体实质性减少3G4抗体与氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)样品结合的能力；其中候选抗体实质性减少3G4抗体与氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)样品结合的能力是与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的指示。
选择步骤可进一步包括：
(a)将第一氨基磷脂或阴离子磷脂样品，优选PS，与有效结合量的单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)接触并测定与氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)结合的3G4的量；
(b)将第二氨基磷脂或阴离子磷脂样品，优选PS，与有效结合量的单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)以及有效竞争量的候选抗体接触，并测定在候选抗体存在的条件下与氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS结合的3G4的量；并
(c)通过选择减少与氨基磷脂或阴离子磷脂结合的3G4的量的候选抗体来鉴定与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)结合基本上相同的表位的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体，所说的磷脂优选PS，所说的3G4结合减少量优选至少约80％。
用于本文中时，所有的标准选择均优选在无血清的条件下进行，以避免产生的抗体可能酷似患者的病态抗体的缺点，所说的病态抗体能与结合蛋白质的氨基磷脂或阴离子磷脂结合。
将非人动物用于免疫接种时，从这样的杂交瘤中获取的单克隆抗体常常具有非人类型的组成。正如本领域技术熟练人员已知和本文进一步公布的内容一样，所说的抗体可以任选的进行人源化处理、移植或突变。或者，可以使用含有人抗体基因文库的转基因动物，诸如小鼠等。这些动物的免疫将因此直接导致适当人抗体的产生。
产生适当的抗体生产细胞，最优选杂交瘤后，无论生产人或非人的抗体，都可以克隆编码单克隆抗体的核酸以制备“重组”单克隆抗体。任何重组克隆技术都可利用，包括利用PCRTM起动编码抗体的核酸序列的合成。为此，还有更多的合适单克隆抗体制备方法，包括按如下步骤利用抗体生产细胞的方法：
(a)从适当的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞，优选杂交瘤中获取至少第一适当的编码抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的核酸分子或片段；并
(b)在重组宿主细胞中表达所说的核酸分子或片段，以便获得本发明的重组抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂单克隆抗体。
不过，还有其它的有效重组技术可供利用，它们适于制备重组单克隆抗体的。这些重组技术包括基于噬菌粒文库的单克隆抗体制备方法，含以下步骤：
(a)通过将至少一剂、任选多剂组合物施用于动物来免疫动物，所说的组合物含有免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂，优选含活化内皮细胞的组合物；
(b)制备免疫球蛋白噬菌粒组合文库，该文库表达分离自免疫动物(优选来源于脾)的抗体生产细胞的RNA；
(c)从噬菌粒文库中选择表达至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的至少第一克隆，任选所述抗体可与单克隆抗体3G4(ATCCPTA 4545)实质性交叉反应或竞争；
(d)从至少第一选定克隆中获得编码抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的核酸，并在重组宿主细胞中表达此核酸，以提供至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体；并优选的
(e)获得从由所说的至少第一选定克隆中获得的核酸表达的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体。
此外，在这些基于噬菌粒文库的技术中，可以应用携带人抗体基因文库的转基因动物，从而产生重组的人单克隆抗体。
无论第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体核酸片段的制备方式如何，更多的合适抗体核酸片段都可用标准的分子生物学技术来方便的制备。为了证实任何变体、突变体或第二代抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体核酸片段适用于本发明，将测试核酸片段以证实本发明的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的表达。优选的，还将测试变体、突变体或第二代核酸片段以证实在标准条件下，更优选标准严谨杂交条件下的杂交。例示性的合适杂交条件包括在大约7％十二烷基硫酸钠(SDS)、大约0.5MNaPO4、大约1mM EDTA中50℃左右杂交；然后用大约1％SDS在42℃左右漂洗。
就多种重组单克隆抗体而言，无论是人源的还是非人源的，都是容易制备的，本发明的任何处理方法都可通过向动物提供至少第一核酸片段而实施，所说的核酸片段在患者体内表达生物学有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体。“表达抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂、3G4样或基于3G4的抗体的核酸片段”通常至少以表达构建物的形式出现，且可以以包含于病毒或重组宿主细胞中的表达构建物的形式出现。本发明优选的基因治疗载体通常将是病毒载体，诸如包含于重组逆转录病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、巨细胞病毒(CMV)等病毒中的病毒载体。
细胞不透性耐久霉素衍生物：本发明另外还提供了基本上细胞不透性的磷脂酰乙醇胺(PE)结合肽构建物和衍生物，它包含已被修饰的至少第一PE结合肽从而形成基本上细胞不可渗透的PE结合构建物。
优选的，本发明提供了在药用可接受载体中包含生物学或治疗学有效量的至少第一基本上细胞不可渗透性PE结合构建物的药物组合物，它包含已被修饰的至少第一PE结合肽从而形成基本上细胞不透性PE结合构建物。因此，基本上细胞不透性PE结合构建物是用于制药学、药理学和治疗学，即医学用途中的构建物，优选用于治疗病毒感染。在某些实施方案中，本发明提供了与生物素连接的除肉桂霉素之外的基本上细胞不透性PE结合构建物。
更优选的，本发明的基本上细胞不透性PE结合肽衍生物是基本上细胞不透性耐久霉素肽衍生物和其药物组合物。耐久霉素肽通常通过有效连接至少第一细胞不透性基团而被修饰，从而形成基本上细胞不透性耐久霉素衍生物。细胞不透性基团的有效连接可通过SEQ ID NO：9中的第二位氨基酸赖氨酸残基进行。
细胞不透性基团在生理学pH下可以携带阳性或阴性电荷或者可以是极性的。典型的基团包括硫酸根、磺酸根、磷酸根、羧基、苯酚、季铵离子和胺基团。含有连接了生物素的耐久霉素的药物组合物是本发明的一个具体实施例。
基本上细胞不透性的耐久霉素还可与糖、寡糖或多糖、氨基酸、肽、多肽、蛋白质或多元醇基团有效连接。某些细胞不透性耐久霉素是那些与诸如中性亲和素(neutravidin)、链霉亲和素、白蛋白或惰性免疫球蛋白载体蛋白等惰性载体蛋白有效连接的耐久霉素，其中尤其优选与人IgG(HIgG)连接的耐久霉素。细胞不透性耐久霉素的其它例子包括与靶向剂(优选结合肿瘤细胞、肿瘤血管结构或肿瘤基质或病毒感染细胞的靶向剂)连接的耐久霉素。与肿瘤细胞、肿瘤血管结构或肿瘤基质成分结合的靶向剂的例子参阅美国专利6093399、6004555、5877289和6036955，各自特别收编于此作为参考。
肿瘤治疗：本发明进一步提供了含至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物的组合物，任选该抗体与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位，或者含基本上细胞不透性PE结合肽衍生物、优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物的组合物。这些组合物是优选的药用可接受组合物，包括为诸如静脉内注射等肠胃外投药而配制的组合物，或为了以脂质体或气雾剂形式施用而配制的组合物。
本发明提供了包括3G4交叉反应的、3G4样的或基于3G4的抗体在内的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体和基本上细胞不透性耐久霉素衍生物的许多制备方法和用途。就所有的方法而言，除非特别提及，术语“一个(种)”用于指所述方法中的“至少一个(种)”、“至少第一种(个)”、“一个(种)或多个(种)”或“多个(种)”步骤。这与治疗方法中的施用步骤尤其有关。因此，本发明不仅可以应用不同的剂量，还可以使用不同数目的剂量，如注射或吸入，可多达并包括多种注射或吸入。在施用抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或免疫缀合物或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物之前、之后或期间都可以使用组合疗法。
本发明还提供了具有重要生物学意义的各种有用的体外使用方法和用途。首先提供的是结合氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS或PE的方法和用途，这通常包括将含氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS或PE的组合物接触至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体，或接触基本上细胞不透性耐久霉素衍生物。“接触”是在有效允许结合复合物形成的条件下进行的，并对由此形成的任何复合物进行检测。检测方法和用途可用于生物学样品，如用于诊断细胞凋亡、肿瘤和病毒感染细胞，另外还提供了基于此的诊断药剂盒。
本发明还提供了增殖抑制方法和用途，它们优选使用本发明的抗体、抗原结合片段和免疫缀合物。抑制内皮细胞增殖和/或迁移的方法通常包括在有效抑制内皮细胞增殖和/或迁移的条件下使含内皮细胞群在内的细胞群或组织接触含生物学有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体(任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体)或其抗原结合片段的组合物。
前述方法和用途可在体外和体内进行，在后一种情况下，其中组织或细胞位于动物内，而抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体被施用于动物。在两种情况下，所说的方法和用途都可成为用于抑制血管发生的方法和用途，包括在有效抑制血管发生的条件下使含有潜在生血管性血管的组织或血管群接触含生物学有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段的抗血管发生性组合物，任选所述抗体与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位。
在潜在生血管性血管群离体维持的情况下，本发明在药物开发项目中也具有效用。附带可靠阳性和阴性对照的体外筛选试验可用作药物开发的第一个步骤来抑制或促进血管发生，以及用于阐述有关血管发生过程的更多信息。在潜在生血管性血管群位于动物或患者体内的情况下，抗血管性发生组合物作为一种疗法施用于动物。
针对已经患上或有危险患上特征为不希望有的、不适当的、异常的、过多的和/或病态的血管形成的任何疾病或病症的动物和患者，可提供抗血管发生和抗血管疗法。本领域普通技术人员众所周知，因为异常的血管发生广泛的存在于疾病和病症中，一种给定的抗血管发生疗法一旦显示出在任何可接受模型系统中是有效的，就可用于治疗整个范围内与血管发生相关的疾病和病症。
本发明的方法和用途特别意图用于已经患上或有危险患上以下疾病的动物和患者中：任何形式的血管化肿瘤；黄斑变性，包括与年龄相关的黄斑变性；关节炎，包括类风湿性关节炎；动脉粥样硬化症和动脉粥样斑块；糖尿病性视网膜病和其它的视网膜病；甲状腺增生，包括格雷夫斯氏病；血管瘤；新生血管性青光眼；和牛皮癣。
本发明的方法和用途还意图用于已经患上或有危险患上以下疾病的动物和患者中：动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤和血管再狭窄，包括血管成形术后的再狭窄。这些治疗方法和用途的其它预期目标是已经患上或有危险患上以下疾病的动物和患者：血管纤维瘤、皮炎、子宫内膜异位症、血友病性关节、肥厚性瘢痕、炎性疾病和病症、化脓性肉芽肿、硬皮病、滑膜炎、沙眼和血管粘附。
如同特别收编于此作为参考的美国专利5712291中所述的，前述被治疗疾病类型中的各类都决非对可用本发明治疗的疾病种类的穷举。为了某些特殊的目的将美国专利5712291收编于此作为参考，所说的目的包括：识别可用抗血管形成疗法有效治疗的许多其它疾病；显示一旦确定类型的抑制血管发生的化合物已公布并申请专利，则所有血管形成疾病的治疗都代表了一个统一的概念(在本案例中，是抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体)；以及通过只来自单一模型系统的数据显示可实现所有血管形成性疾病的治疗。
除了血管形成性和血管类疾病的治疗外，本发明重要的统一的方面是用于治疗已经患有或有危险患癌症的动物和患者的组合物和方法。所有的癌症治疗方法和用途包括施加或使用至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体，或者施加或使用基本上细胞不透性的PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性的耐久霉素衍生物。以治疗有效量将所说的构建物施用于患癌症的动物或患者。
本发明的癌症治疗方法，即使是利用抗体的疗法，也不是单纯依赖于发挥抗血管和/或抗血管形成作用的。本发明的癌症治疗方法和用途适于治疗所有形式的癌症，包括已经患有或有危险患血管性实体瘤、转移性肿瘤或来自原发肿瘤的转移性病灶的动物和患者。
未缀合的或“裸露的抗体”及其片段以及该抗体或其抗原结合片段与治疗剂有效连接的免疫缀合物都可用于本发明的抗癌治疗中。因此，除非另外特别提及或以科学术语解释的更清楚，术语“抗体及其片段”用于此处时，是指“未缀合的或裸露的”抗体或片段，它未与另一药剂连接，具体而言是未与治疗或诊断剂连接。这些定义并未排除抗体的修饰，诸如，举例说来，为了提高抗体的生物学半寿期、亲合力、亲和性或其它特性而进行的修饰，或者抗体与其它效应子的组合。
在以免疫缀合物为基础治疗癌症的方法中，所述抗体或其抗原结合片段与一系列生物学、治疗性的和/或所谓的第二抗癌剂(抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体本身，是第一抗血管发生剂)中的任意一种或多种有效连接，后者可以具有直接或间接的抗癌作用。
因此，本发明另外还提供了用于递送选定的治疗剂或诊断剂至肿瘤的方法。这样的实施方案包括向患肿瘤的动物或患者施用至少含第一免疫缀合物的生物学有效量的组合物，在所说的免疫缀合物中诊断剂或治疗剂与抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段有效连接，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体。
因此本发明的组合物以及方法和用途包括含有与至少第一生物学、治疗或诊断剂有效连接的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的组合物，所说抗体任选是与抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体。抗体优选与放射治疗剂、抗血管发生剂、细胞凋亡诱导剂、抗微管蛋白药物、抗细胞的细胞毒性剂或细胞因子(或抗病毒药物，如下所述)连接。
用于连接的某些优选药剂是体内诊断剂，如，使缀合物可作为代用标记用于化学治疗的诊断剂。
优选用于抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的治疗用缀合物中的药剂是补足或增强抗体效力的药剂和/或为特殊肿瘤类型或患者选择的药剂。“补足或增强抗体效力的治疗剂”包括放射治疗剂、血管渗透性增强剂、某些细胞因子、抗血管发生药剂、细胞凋亡诱导剂和抗微管蛋白药物，其中的任意一种或多种治疗剂均可使用。
目前优选的药剂是细胞毒性剂gelonin；细胞因子，诸如TNFα、IL-12和LEC(肝表达的趋化因子)；具有抗血管发生作用的抗癌剂，如表E中所示；诱导细胞凋亡的抗癌剂，如表F中所示；和来自考布他汀家族的抗微管蛋白药物。特别优选的药剂是多西他赛。
本发明的癌症治疗组合物和方法还可与其它疗法和诊断法联合使用。“联合”一词就与治疗剂联合的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂或基于3G4的抗体而言，还包括联合的组合物、药物、混合物、药剂盒、方法，其中的治疗剂是以前体药物的形式出现的。
联合的癌症治疗方法是指这样的方法，即，其中将至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗体，或者基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物，与治疗有效量的至少第二治疗剂或抗癌剂联合施用于患癌症的动物或患者。
本发明进一步提供了组合物、药物组合物、治疗药剂盒和药用混合物，其中，任选地在至少第一组合物或容器中，含生物学有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA4545)基本上结合相同表位的抗体，或其抗原结合片段或免疫缀合物，或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物；和生物学有效量的至少第二生物学药剂、组分或系统，优选至少第二治疗剂或抗癌剂。
“至少第二生物学药剂、组分或系统”经常会是治疗或诊断剂、组分或系统，但也可以不是如此。例如，至少第二生物学药剂、组分或系统可以包含用于修饰抗体的组分和/或用于将其它药剂与抗体连接的组分。某些优选的第二生物学药剂、组分或系统是前体药物或用于制备和使用前体药物的组分，包括用于制备前体药物本身的组分和用于改造本发明的抗体使其在所说的前体药物或ADEPT实施方案中发挥功能的组分。
在待治疗疾病是癌症的情况下，“至少第二治疗或抗癌剂”将包含于治疗药剂盒或混合物中。术语“至少第二抗癌剂”是参考作为第一抗癌剂的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、3G4构建物或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物(优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物)而选择的。本发明的抗体因此可以联合化学治疗剂、放射治疗剂、细胞因子、抗血管发生剂、细胞凋亡诱导剂或抗癌免疫毒素或凝血配体(coaguligands)。“化学治疗剂”还包括基因、载体、反义构建物和核酶。
目前优选的第二抗癌剂是具有抗血管发生作用的抗癌剂，如表E所示；诱导细胞凋亡的抗癌剂，如表F中所示；和来自考布他汀家族的抗微管蛋白药物。特别优选的药剂是多西他赛。
就本发明的组合物、药剂盒和/或药物而言，联合有效量的治疗剂可包含于单一的容器或容器装置中，或包含于不同的容器或容器装置中。混合物通常被混合在一起以便联合使用。常常优选按静脉注射配制的药剂。还可包括成像组分。药剂盒中还可包括使用该至少第一抗体和所包括的一种或多种其它生物学药剂的说明书。
一般而言，该至少第二抗癌剂可与抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物基本上同时施用于动物或患者，例如来自单一药物组合物或来自紧接着一起施用的两种药物组合物。
或者，在施用抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物后顺次的时间点将至少第二抗癌剂施用于动物或患者。“在顺次的时间点”用于此处是指“错开的时间”，这样至少第二抗癌剂在与施用抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物不同的时间施用给动物或患者。两种药剂的给药相隔有效的时间，以便使两种药剂都能发挥它们各自的疗效，即，它们以“生物学有效的时间间隔”进行施用。至少第二抗癌剂可在抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物施用之前或之后间隔生物学有效时间施用于动物或患者。
还可进行肿瘤成像，优选用可检测标记物标记的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体构建物进行。依照本发明的成像可以探测凋亡前和凋亡的细胞，因此它可以在治疗后用作替代标志。或者，因为所形成的图像将预示着待使用治疗剂的结合位点，所以可在治疗前进行成像。因此癌症治疗可通过如下步骤进行：
(a)形成肿瘤图像，即将诊断最少量的至少第一可检测标记的肿瘤结合剂施用于患肿瘤的动物或患者，优选抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体构建物，其中含有与肿瘤结合剂或抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体有效连接的诊断剂，从而形成肿瘤的可检测图像；并
(b)随后对同一动物或患者施用治疗最适量的至少第一裸露的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或3G4抗体或利用了所说抗体的治疗剂-抗体构建物，从而引起抗肿瘤作用。
为此提供了成像和治疗制剂或药物，它们通常包含：
(a)含诊断有效量的可检测标记的肿瘤结合剂的第一药物组合物，优选抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体构建物，组合物中包含与肿瘤结合剂或抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体有效连接的可检测剂；和
(b)含治疗有效量的至少一种裸露抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或3G4抗体或利用所说抗体的治疗剂-抗体构建物的第二药物组合物。
治疗病毒感染：本发明尤其重要和不寻常的进展是用于治疗或预防病毒感染的有关组合物、联合、药剂盒、方法、用途和药物。本发明的抗病毒疗法涉及本发明前述和其它治疗剂中的任一种或多种的施加或使用。
首先，如同上述针对组合物和癌症治疗所述的，本发明的抗病毒组合物和治疗方法涉及至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗体，或者基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物的施加或使用。在基本上细胞不透性PE结合肽衍生物中，优选使用的是基本上细胞不透性耐久霉素衍生物，诸如与生物素连接的耐久霉素或与HIgG连接的耐久霉素。
由于发现了本发明的抗体和肽与病毒感染之间存在着不寻常的关系，本发明进一步提供了一系列新的治疗剂用于治疗病毒感染。具体而言，本发明提供了抗氨基磷脂或阴离子磷脂(尤其是PS和PE)的抗体，它们与至少第一抗病毒剂有效连接。本发明另外还提供了基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选耐久霉素肽衍生物，其与至少第一抗病毒剂有效连接。用于连接本发明抗体和肽的适当抗病毒剂包括表G中所列举的类型。
因此，总而言之，本发明的抗病毒组合物和治疗方法涉及对受病毒感染的动物或患者施用含治疗有效量的至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段或抗病毒免疫缀合物的组合物，所述抗体任选是与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗体，或者是施用含治疗有效量的基本上细胞不透性PE结合肽衍生物(优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物)或其抗病毒免疫缀合物的组合物。
本发明的抗病毒治疗方法适于治疗动物和人、甚至是植物中的所有病毒。本发明的治疗剂可抑制病毒入侵，但优选抑制来自受感染宿主细胞的病毒的复制、流出(egress)和扩散。如表H中所示，本发明适于治疗感染脊椎动物，尤其是人的所有病毒，尤其是在人体内呈致病性的病毒。可用本发明治疗的病毒感染和相关疾病包括表J中所列举的病毒和疾病，举例说来就是治疗CMV、RSV和沙粒病毒感染，以及肝炎、流行性感冒、肺炎、拉沙热和AIDS。
本发明的抗病毒治疗组合物和方法还可与其它疗法和诊断法联合使用。这些“联合的”使用是将独立的抗病毒剂在联合组合物、药物、混合物、药剂盒和治疗方法中联合起来施用。
前述癌症和抗病毒治疗方法和用途常常包括将药用有效量的组合物系统性施用于动物或患者，如通过穿皮肤、肌肉内、静脉内注射等。对于治疗病毒感染，尤其是呼吸性病毒感染而言，优选将组合物递送至肺，这可用气雾剂来达到目的。无论如何，可以使治疗剂定位于肿瘤或病毒感染位置的任何施药途径都将是可接受的。因此，其它适当的递送途径包括口服、直肠投药、鼻饲、局部用药和阴道用药。对于治疗关节炎的用途和方法来说，例如可以采用滑膜内施药，如美国专利5753230中针对其它的免疫学药剂所述的，该文献特别收编于此作为参考。对于与眼睛相关的疾病来说，应考虑眼用制剂和施药方式。
“施用”一词用于此处是指，以有效发挥其治疗作用的一定量和一定的持续时间提供或递送抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选耐久霉素衍生物。在某种程度上，由于它的简单性和可重复性，通常优选蛋白质性治疗剂的被动施药方式。
无论如何，术语“施用”在此处用于指递送治疗剂的任何和所有的方式。“施用”的含义因此包括以有效方式提供产生抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的抗体或耐久霉素衍生物治疗剂的细胞。在这样的实施方案中，可能期望将所说细胞制备或包装于选择性可渗透膜、结构或可移植装置中，通常是可通过移除来终止治疗的装置。从外部施药仍将是一般优选的方式，因为它代表了可以使用药量被严密监测和调控的非侵入型方法。
本发明的治疗方法和用途还延伸到以能有效导致其体内表达的方式提供编码抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4或耐久霉素衍生物治疗剂的核酸。任何基因治疗技术都可应用，诸如裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括患者细胞的离体操作，等等。脂质体和隐蔽的脂质体将优选用于某些实施方案中。
本发明的药物组合物和治疗方法中应用了“治疗有效量的”抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗体，或这些抗体的抗原结合片段或免疫缀合物，或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物。“治疗效果”和由此而来的“治疗有效量”对于癌症治疗和抗病毒治疗来说是用不同的参数检测的。
在癌症治疗中，要求药剂的量在施用于动物或患者后可以有效的特异性杀死至少一部分肿瘤细胞、肿瘤或肿瘤内血管内皮细胞；特异性诱导至少一部分肿瘤细胞、肿瘤或肿瘤内血管内皮细胞中的细胞凋亡；特异性促进至少一部分肿瘤或肿瘤内血管中的凝血；特异性堵塞或破坏肿瘤的至少一部分血液输送管道；特异性诱导至少一部分肿瘤内的坏死；和/或引起肿瘤的衰退或缓解。
在治疗病毒感染和相关疾病中，药剂的量是可以有效抑制病毒感染进行中所需的一种或多种活动，诸如病毒入侵，和优选的，来自受感染宿主细胞的病毒复制、进出和扩散。所说的量还可以以阻碍病毒复制、扩散和进行感染的形式杀死或去除至少一部分受病毒感染的细胞。总而言之，要求药剂的量是在施用于动物或患者时能有效减少、显著减少或消灭病毒感染的量。
术语“优先地”和“特异性地”用于此处时是指抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选耐久霉素衍生物，基本上局限于在发病部位达到抗癌或抗病毒效果，且基本上不会在动物或患者正常健康组织中引起凝血、破坏和/或组织坏死。健康细胞和组织的结构和功能基本上保持不受本发明实施的损害。
附图简述
以下图表组成了本说明书的一部分，用于进一步证明本发明的某些方面。本发明可以参照这些图表中的一个或多个并结合本文所提供的具体实施方案的详述而得到更好的理解。本专利的美国文件包含至少一幅彩图。如果需要并付必需的费用，带彩图的本专利复印件将由专利商标局提供。
图1.抗PS抗体(3SB)对小鼠内人何杰金氏淋巴瘤、3LL小鼠肺癌和B16小鼠黑素瘤中血管内皮细胞的定位。对患肿瘤的SCID小鼠静脉内注射20μg抗PS(3SB)或抗CL(D11)小鼠IgM。1小时后用盐水灌注血液循环系统。1小时后处死小鼠，收获肿瘤和器官并速冻。用山羊抗小鼠IgM-过氧化物酶缀合物检测冰冻切片上的小鼠IgM。在所有肿瘤中抗PS抗体都特异地定位于血管处(箭头所指)。在注射对照样品抗CL IgM的小鼠中未观察到其定位。
图2A和图2B.9D2抗体和膜联蛋白V与吸附于塑料制品上的磷脂的结合。磷脂被吸附于微量滴定板的塑料上。用10％的血清封闭后，在存在10％血清的条件下加入6.66nM-0.005nM浓度范围的9D2抗体(图2A)或膜联蛋白(图2B)。洗涤平板后，分别用山羊抗大鼠IgM-HRP和兔抗膜联蛋白VIgG及随后加入的抗兔HRP检测被结合的9D2抗体和膜联蛋白V。
图3.竞争性磷脂脂质体抑制9D2抗体和膜联蛋白V与经过氧化氢处理过的内皮细胞上的阴离子磷脂的结合。9D2抗体和膜联蛋白V(6.66nM)与含10％血清的各种磷脂脂质体(200μg/ml)DPBS缓冲液预保温。分别用山羊抗大鼠IgM-HRP和兔抗膜联蛋白V IgG及随后加入的抗兔HRP检测被结合的9D2抗体和膜联蛋白V。测定存在或缺乏竞争性脂质体条件下的结合。三份平行试样测定值的标准偏差小于平均值的10％。
图4.生物素化9D2抗体和膜联蛋白V在小鼠中同位MDA-MB-231人乳癌内血管内皮细胞和肿瘤细胞中的定位。对在乳房脂垫处有MDA-MB-231肿瘤的Nu/Nu小鼠静脉内注射50μg生物素化的9D2抗体或100μg生物素化的膜联蛋白V。1小时后，用盐水灌注它们的血液循环系统。切除肿瘤和器官并速冻。用链霉亲和素-HRP缀合物检测冰冻切片上被定位的9D2和膜联蛋白V。将来自用盐水或对照大鼠IgM注射的小鼠的肿瘤切片作为阴性对照。
图5.低氧和炎性细胞因子对PS暴露的联合作用。在含氧量正常的(白色柱)和低氧的(灰色柱)条件下用IL-1α和TNFα处理bEnd.3细胞24小时。在这些条件下细胞单层保持完整并存活。通过检测125I-膜联蛋白V的结合测定PS的外在化。PS的暴露水平表示为在用放线菌素D和TNFα联合处理的细胞中的百分数。
图6A和图6B.抗PS抗体(3SB)在有同基因和异基因肿瘤的动物中的抗肿瘤作用。将1X107个细胞的小鼠结直肠癌Colo26(图6A)或人何杰金氏淋巴瘤L540(图6B)分别皮下注射入BALB/c小鼠(图6A)或雄性CB17SCID小鼠(图6B)的右侧。待肿瘤长至大小约0.6-0.9cm3后，对小鼠(每组4只)腹膜内注射20μg裸露的抗PS抗体(空心正方形)或盐水(空心圆)。每隔48小时重复类似处理3次。每天监测动物的肿瘤大小和体重。当肿瘤长至2cm3时处死小鼠，或者如果肿瘤出现坏死或溃疡的征兆时也可提前处死。对照小鼠IgM给出了与盐水类似的结果。
图7.9D2抗体在携带L540人何杰金氏淋巴瘤的小鼠中的抗肿瘤作用。与对照(空心正方形)相反，对携带肿瘤的小鼠组腹膜内注射100μg9D2抗体(实心圆圈)，每周3次。每周两次用卡钳测量肿瘤大小。以肿瘤体积对肿瘤细胞注射后的天数作图。括弧内的数字表明肿瘤衰退的小鼠数目/每组小鼠的总数目。
图8A、图8B、图8C、图8D、图8E、图8F和图8G.在有同基因和异基因肿瘤的动物中抗PS抗体3G4的抗肿瘤作用。将小鼠MethA肿瘤细胞(图8A)、人MDA-MB-231乳癌细胞(图8B和图8E)、人何杰金氏淋巴瘤L540细胞(图8C和图8D)以及MDA-MB-231癌细胞(图8F和图8G)注射入小鼠。处理前使肿瘤长到所示的大小。人何杰金氏淋巴瘤细胞可被允许长至形成大肿瘤。每组小鼠每周3次腹膜内注射100μg 3G4抗体，与对照相反(3G4在图8A、图8B和图8C中被指出，而在图8D、图8E和图8F中则用空心圆圈表示)。每周监测动物肿瘤尺寸两次。将肿瘤体积对肿瘤接种后的天数(图8A)或对处理天数(图8B和图8C)作图，共20-30天(图8A、图8B和图8C；括弧内的数字表明肿瘤衰退的小鼠数目/每组小鼠的总数目)或60天(图8D、图8E和图8F)。3G4抗体和嵌合的3G4抗体(ch3G4)用于处理MDA-MB-231癌细胞，与对照相反(图8G)。
图9A和图9B.3G4抗体对体外CMA复制的抑制。用3G4处理被CMV感染的HHF-R2细胞(最上方的两个图)。对照孔未经处理(下方的两个图)或用同种型匹配的对照IgG3抗体GV39G处理(中间的两个图)。在不同的时间点观察细胞：第3天(左边的柱)和第9天(右边的柱)。被感染细胞在荧光显微镜下呈现绿色。抗体施用浓度为100μg/ml(图9A)和50μg/ml(图9B)。
图10.体外CMV复制的浓度依赖型抑制。用不同浓度的3G4处理被CMV感染的HHF-R2细胞(上方的组图)。对照孔未经处理(下方的图)或用同种型匹配的对照IgG3抗体GV39G处理(中间的组图)。在第9天观察细胞。被感染细胞在荧光显微镜下呈现绿色。
图11A、图11B和图11C.经抗体处理的细胞中CMV病毒负载量和病毒复制周期晚期复制抑制的定量。以0.01pfu/细胞的低感染复数用CMV感染人成纤维细胞单层，并用指定浓度的3G4抗体、对照抗体GV39G或对照抗秋水仙碱抗体C44(图11A；未处理，未处理对照)处理。以3pfu/细胞的高感染复数用CMV感染人成纤维细胞单层，并用50μg/ml或100μg/ml的3G4抗体或对照抗体GV39G(图11B)处理。以高感染复数用CMV感染人成纤维细胞单层，在感染后的指定时间点加入3G4抗体或对照抗体GV39G(图11C)。在图11A、图11B和图11C各图中，用标准噬斑检测法对细胞内和上清液中的病毒水平进行定量。
图12.3G4、1B9和3SB抗体对RSV体外复制的抑制作用。用3G4、1B9和3SB处理受RSV感染的A-549细胞，以未处理细胞作为对照。用1B9(绿色)和3SB(红色)处理导致病毒复制呈现对数减少(与蓝色的对照相比较)。3G4的更显著的抗病毒效果用粉色显示。
图13A、图13B、图13C、图13D、图13E、图13F、图13G、图13H、图13I、图13J、图13K、图13L、图13M、图13N、图130、图13P、图13Q和图13R。耐久霉素衍生物的结构。描绘了来自实施例XV的实例性耐久霉素衍生物的化学结构。在图13A至图130的各化合物中，已将PE结合肽耐久霉素与细胞不透性基团连接以便防止构建物发挥显著的、非特异的毒性作用。耐久霉素母体环肽的示意性结构如图13P中所示。线性序列用SEQ ID NO：9表示，而序列中被修饰氨基酸的结构如图13Q中所描述的。图13R描绘了示范性的耐久霉素抗病毒构建物，其中的耐久霉素与西多福韦连接。
图14A、图14B、图14C和图14D。耐久霉素衍生物的结合特异性。按实施例XV中所述制备耐久霉素衍生物并按实施例XV中所述用ELISA和竞争性ELISA测定它们的特异性。图14A，耐久霉素衍生物对一组磷脂的磷脂结合概况，显示了对PE的特异性；图14B，血清对PE结合无显著的影响；图14C和图14D，来自竞争性ELISA，证实了耐久霉素衍生物对PE的特异性。
图15。耐久霉素衍生物对CMV体外复制的抑制作用。用耐久霉素衍生物(DLB)4NA和(DIM)nHIgG处理被CMV感染的HHF-R2细胞。对照孔未处理。在不同的时间点观察细胞：第4天(左图)和第6天(右图)。被感染的细胞在荧光显微镜下呈现绿色。(DLB)4NA和(DIM)nHIgG抑制来自逐个感染细胞的病毒扩散。
图16。抗PS抗体对分裂内皮细胞的选择性抑制作用。如实施例XVIII中所述检测抗PS抗体3SB、9D2和3G4在体外对内皮细胞的抑制作用。与对静止(汇合)细胞的作用相反，3SB、9D2和3G4抗体中的每一种都展示了对于分裂中的(亚汇合)内皮细胞的选择性抑制作用。9D2和3G4抗体均具有比3SB更强的抑制作用。
图17A和图17B。在患肿瘤的小鼠中3G4抗体的抗血管发生和血管靶向作用。用100μg/剂的3G4抗体(处理组，右边的组图)或相同剂量的同种型匹配对照抗体(对照组，左边的组图)每周3次处理患MDA-MB-231同位肿瘤的裸鼠。处理结束后，灌注动物并将肿瘤速冻，切片并用小鼠血管结构的泛内皮标记-抗小鼠CD31抗体(大鼠，抗小鼠CD31)染色(图17A)，或者包埋于石蜡中并用H&E染色(图17B)。比较来自对照和被处理动物的肿瘤切片，显示了3G4的施用导致了抗血管发生(图17A)和血管靶向(图17B)效果。
图18A和图18B。3G4抗体互补决定区(CDRs)的DNA和氨基酸序列。展现了重链(图18A；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)和轻链(图18B；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)的DNA和氨基酸序列，且显示了DNA序列中的限制性位点。前导序列与成熟蛋白质区别开来，它的起始在图18A和图18B中分别以第一个箭头指示。给出了移植包含人恒定区的各可变序列的典型方法，其中相应人恒定区序列(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)的第一部分在图18A和图18B中分别用第二个箭头指示。
图19A和图19B。IgG抗PS抗体3G4和IgM抗PS抗体3SB与PS结合的比较。用高达3.375nM的抗体浓度通过ELISA测定IgM抗体3SB(◆)以及两个IgG抗体-3G4(▲)和3B10(■)与PS的结合(图19A)。还分别展示了3SB(◆)、3G4(▲)和3B10(■)抗体在浓度高至0.06nM时与PS的结合(图19B)。
图20。用竞争性磷脂脂质体抑制3G4抗体与固定化PS的结合。将3G4抗体(0.1μg/ml)与从纯磷脂(PS-L、PE-L、PI-L、PC-L、CL-L、PA-L和PG-L)制备而来的各种脂质体或单独的缓冲液(对照)一起预保温30分钟。然后将混合物加入被PS包被的ELISA平板中，漂洗并用二抗和OPD检测被结合的抗体。图中显示了在所列举脂质体存在条件下的结合，并与无任何脂质体存在条件下3G4抗体的结合进行了比较。
图21。嵌合3G4与磷脂的结合。按实施例XIX中所述制备嵌合3G4抗体(ch3G4)。磷脂(PS、PI、PE、PC、SM、CL、PG和PA)吸附于微量滴定板的塑料上。封闭后，以所示浓度添加嵌合3G4抗体。漂洗平板并通过二抗结合和呈色检测被结合的嵌合3G4抗体。
图22。嵌合3G4在体内对肿瘤血管内皮的定位。将生物素化的ch3G4(上方的组图)和对照IgG(下方的组图)施用于患MD-MBA-435s肿瘤的小鼠。肿瘤切片用Cy3缀合的链霉亲和素染色来检测生物素化的抗体(左边的组图)。用MECA 32抗体以及随后加入的FITC标记的抗大鼠IgG二抗染色来检测血管内皮(中间的组图)。将红色和绿色的图形合并(右边的组图)，其中肿瘤血管内皮上结合的生物素化蛋白质呈现黄色。通过叠合图像上的黄色显示了被定位的3G4抗体和血管内皮MECA32标记物的重合染色结果(上方右图)。
图23。3G4增强了PS阳性细胞的巨噬细胞吞噬作用。用绿色荧光染料CFDA标记HL-60肿瘤细胞，并用200μM H2O2诱导PS暴露。收获处理过的细胞并用5μg/ml 3G4或同种型匹配对照抗体(BBG3)调理1小时。然后将靶细胞加入巨噬细胞中，后者是从小鼠骨髓中分离的并在容器内的载玻片上于含5ng/ml GM-CSF的培养基中培养35天。2小时后，固定载玻片并在荧光显微镜下对胞噬作用进行直观计数。结果表示为发生胞噬作用的巨噬细胞的百分数(已吞噬了至少一个肿瘤细胞的巨噬细胞)。
图24A和图24B。多西他赛诱导内皮细胞上PS的暴露。用10nM多西他赛处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人微血管内皮细胞(HMVEC)24小时。收获细胞，用PBS漂洗，并与10μg/ml 3G4一起在冰上放置30分钟。然后将细胞洗两次，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG，并将细胞再在冰上放置30分钟。然后漂洗细胞，并用FACSCalibur血细胞计数器(Becton-Dickinson，San Jose，CA)通过CellQuest搜索软件进行FACS分析。与未处理的细胞相比，处理过的HUVEC(图24A)和HMVEC(图24B)均显示了与3G4结合的显著增加。
图25A、图25B和图25C。用多西他赛诱导肿瘤细胞上PS的暴露。用10nM多西他赛处理小鼠路易斯肺癌(lewis lung carcinoma)3LL、小鼠结肠癌Colo26和人乳癌MDA-MB-435细胞24小时。收获细胞，用PBS漂洗，并与10μg/ml 3G4一起在冰上放置30分钟。然后将细胞洗两次，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG并将细胞再在冰上放置30分钟。然后漂洗细胞，并用FACSCalibur血细胞计数器(Becton-Dickinson，SanJose，CA)通过CellQuest搜索软件进行FACS分析。与未处理的细胞相比，处理过的3LL(图25A)、Colo26(图25B)和MDA-MB-435(图25C)均显示了与3G4结合的显著增加。
图26.用多西他赛诱导人乳癌MDA-MB-231细胞上PS的暴露。用10nM多西他赛处理人乳癌MDA-MB-231细胞24小时。收获细胞，用PBS漂洗并与嵌合3G4(ch3G4)或对照-人IgG一起在冰上放置30分钟。然后漂洗细胞两次，如上所述，加入FITC标记的抗IgG并通过FACS分析细胞。与对照-人IgG相比，ch3G4的结合有显著的增加。
图27.用抗PS抗体处理增加了受mCMV感染的小鼠的成活率。按实施例XXI中所述，用mCMV感染Ba1b/C小鼠并用3G4或ch3G4处理小鼠。感染90天后监测小鼠的成活率。
图28.用耐久霉素-生物素衍生物DLB处理增加了受CMV感染的小鼠的成活率。按实施例XXII中所述，用mCMV感染Ba1b/C小鼠并用DLB处理小鼠。感染90天后监测小鼠的成活率。
图29A和图29B。嵌合3G4与被牛痘病毒感染的细胞的结合。用牛痘病毒感染U937细胞并在感染后的第2天用嵌合3G4抗体(ch3G4)或对照人IgG(HIgG)染色。图29A，未感染的U-937细胞。图29B，被牛痘病毒感染的U937细胞。图29A和图29B中的峰是：左峰(红色)，只加二抗的对照；中间峰(蓝色)，对照HIgG；右峰(绿色)，ch3G4。
图30A、图30B、图30C和图30D。用3G4抗体抑制Pichinde病毒的体外复制。用Pichinde病毒以0.01pfu/个细胞的感染复数感染Vero细胞。用100μg/ml3G4(图30A)或同种型匹配对照抗体GV39G(图30B)处理被感染的细胞。在感染后第2天，用胰蛋白酶收获细胞并使其粘附于载玻片上。用丙酮固定细胞，并用抗PIC兔多克隆血清以及随后加入的山羊抗兔生物素缀合二抗染色。被感染的细胞染色呈红褐色。单独施加二抗的样品未被染色(图30C)。经3G4处理细胞中被感染细胞占对照处理细胞中被感染细胞的百分数也显示于图中(图30D)。
图31。耐久霉素-人IgG(HIgG)缀合物抑制体内MethA肿瘤的生长。按实施例XXV中所述，用耐久霉素-HIgG缀合物(D-SIAB)nHIgG(其中用SIAB接头将耐久霉素与HIgG缀合)或者用对照HIgG处理具有MethA肿瘤细胞的BALB/c小鼠。
图32.耐久霉素缀合物无细胞毒性。用MTT检测法检测天然耐久霉素化合物和生物素化耐久霉素构建物DLB对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性作用。
图33。耐久霉素-抗体缀合物增强了巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用。通过将耐久霉素与一种小鼠IgG2a抗体C44连接产生耐久霉素-C44(DuC44)，构建出耐久霉素抗体缀合物。在DuC44、对照小鼠抗体BBG3和3G4抗体存在的条件下将凋亡的HL-60细胞与小鼠骨髓来源的巨噬细胞一起保温。吞噬作用以摄取呈阳性的吞噬细胞的百分数方式评估。数据是平均值±S.E.。
例证性的实施方案的描述
实体瘤和癌在人类所有癌症中所占比例超过90％。虽然在淋巴瘤和白血病的治疗中已经研究了单克隆抗体和免疫毒素的应用(Vit et ta等，1991)，但是这些药剂在抗癌和其它实体瘤的临床试验中无效的结果令人失望(Abrams和Oldham，1985)。基于抗体的治疗无效的首要原因是大分子不容易转运进入实体瘤。甚至一旦进入了肿瘤块内，由于肿瘤细胞间存在紧密连接、纤维基质、间质压力梯度和结合位点屏障，这些分子也不能均匀分布(Denekamp，1990；Dvorak等人，1991)。
在开发用于治疗实体瘤的新策略的过程中，涉及靶向肿瘤血管结构而非肿瘤细胞的方法具有明显优势。有效破坏或阻断肿瘤血管，则阻止了经过肿瘤的血流并导致雪崩式的肿瘤细胞死亡。抗体-毒素和抗体-凝血剂构建物，例如选择性破坏和/或堵塞肿瘤血管的VTA，早已有效用于特异性靶向并破坏肿瘤血管结构，导致肿瘤坏死(Burrows等人，1992；Burrows和Thorpe，1993；WO 93/17715；WO 96/01653；Huang等，1997；分别收编于此作为参考)。
VTAs在实体瘤的已有血管上发挥其主要的作用，而不同于阻止新血管形成的抗血管发生药剂。VTAs相比于其它癌症治疗剂有许多优越之处。首先，仅仅一条血管为成百上千的肿瘤细胞提供营养并促进代谢废物的去除，只要在某一点被破坏就会阻断上下游的血流。因此VTAs对于已建立的肿瘤尤其有效。其次，无需杀死内皮细胞，尽管这是一个有效的机制。血液凝结的形成或局部引发的变化就足够了。第三，内皮细胞与血流相邻，保证了足够的药物递送。第四，靶目标是不太可能具有造成药物抗性的遗传突变的正常二倍体细胞。第五，生物学活性的代用标记，即血流，是可检测的。
第六，对血管功能的短暂影响可能足以产生显著的抗肿瘤效用。研究表明，在局部缺血2小时内体内99％以上的肿瘤细胞能被杀死。最后，与血管发生抑制剂不一样，VTAs只需间歇施用以便协同加强常规疗法的作用，而无需几个月或几年的长期施用。
在以下专利中有对细胞毒性VTAs的描述：美国专利号5,660,827；5,776,427；5,855,866；5,863,538；5,965,132；6,004,554；6,051,230；6,261,535和6,451,312，分别收编于此作为参考。其中的抗体、生长因子或其它的结合配基用于特异递送凝血剂至肿瘤血管结构，这样的药剂被称为“凝血配体”。凝血配体VTAs参阅以下专利：美国专利号6,093,399；6,004,555；5,877,289和6,036,955，分别收编于此作为参考。
目前优选用于凝血配体的凝血剂是截短的组织因子(tTF)(Huang等人，1997；WO96/01653；美国专利号5,877,289)。TF是血液凝结的主要起始因子(Ruf等，1991；Edgington等，1991)。在损伤位点，血液中的因子VII/VIIa开始接触并结合血管周围组织内细胞上的TF。存在磷脂表面时，TF：VIIa复合物激活因子IX和X。这继而导致凝血酶、纤维蛋白、和最终血块的形成(Ruf和Edgington，1994)。
缺失胞质和跨膜结构域的重组、截短形式的组织因子(tTF)是诱发凝血能力比天然TF低约5个数量级的可溶性蛋白质(Stone等，1995；Huang等，1997)。这是因为TF需要联合磷脂与VIIa形成复合物，从而有效激活IXa或Xa。不过，当tTF通过靶向抗体或药剂的方式递送至肿瘤血管内皮时，它重新接近脂质表面并恢复血栓形成活性(Huang等，1997；美国专利号6,093,399，6,004,555，5,877,289和6,036,955)。由此形成了选择性地在肿瘤血管引起血栓的凝血配体。
截短的TF具有几个优势，使其被推荐用于血管靶向凝血配体中：人tTF易于获取，且人蛋白质对人体只具有可忽略的或微弱的免疫原性；人tTF在包括小鼠在内的实验动物中是完有功能的；且靶向tTF具有高潜能，因为它可引发凝血蛋白质级联反应的激活，产生大大增强了的效应(美国专利号6,093,399，6,004,555，5,877,289和6,036,955)。
已经描述了在肿瘤内皮上可供利用、但在正常内皮上基本上不存在的多种合适的靶分子。例如，可以利用被表达的靶，诸如endoglin、E-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA、TIE、与LAM-1反应的配体、VEGF/VPF受体、FGF受体、αvβ3整联蛋白、pleiotropin、或内皮唾液酸蛋白(美国专利号5,855,866；5,877,289；Burrows等人，1992；Burrows和Thorpe，1993；Huang等人，1997；Liu等，1997；Ohizumi等，1997；分别收编于此作为参考)。
吸附的靶是另一组合适的靶，诸如VEGF、FGF、TGFβ、HGF、PF4、PDGF、TIMP、结合TIE的配体、或肿瘤相关性纤连蛋白异构体(美国专利号5,877,289，5,965,132，6,051,230和6,004,555)。纤连蛋白异构体是可结合受体整联蛋白家族的配体。肿瘤相关性纤连蛋白异构体是肿瘤血管结构和肿瘤基质二者的可靶向成分。单克隆抗体BC-1(Carnemolla等，1989)特异结合肿瘤相关性纤连蛋白异构体。
如美国专利号5,776,427，5,863,538和6,036,955所述，通过天然的肿瘤环境或人为干预后可诱导的其它靶目标也是可靶向的实体。当与正常组织的预先抑制和肿瘤血管诱导结合使用时，也可以采用MHCII类抗原作为靶目标(美国专利号5,776,427，5,863,538，6,004,554和6,036,955)。
目前优选用于临床的一个靶目标是血管内皮粘附分子-1(VCAM-1)(美国专利号5,855,866，5,877,289，6,051,230，6,004,555和6,093,399)。VCAM-1是由炎性细胞因子IL-1α、IL-4(Thornhill等，1990)和TNFα(Munro，1993)诱导的细胞粘附分子，它在体内的作用是向急性发炎部位补充白细胞(Bevilacqua，1993)。
VCAM-1存在于许多人类恶性肿瘤的血管内皮细胞中，包括成神经细胞瘤(Patey等，1996)、肾癌(Droz等，1994)、非小细胞肺癌(Staal-van den Brekel等，1996)、淋巴肉芽肿病(何杰金氏病)(Patey等，1996)和血管肉瘤(Kuzu等，1993)，还存在于良性肿瘤血管内皮细胞上，诸如痣(Patey等，1996)和血管瘤(Kuzu等，1993)。VCAM-1在人体中的组成性表达仅限于甲状腺、胸腺和肾的一些血管(Kuzu等，1993；Bruijn和Dinklo，1993)，而在小鼠内则限于心脏和肺的血管(Fries等，1993)。
本文给出的某些数据甚至进一步补充了美国专利5,855,866，5,877,289，6,051,230，6,004,555和6,093,399中所提供的数据，并证明了抗-VCAM-1·tTF凝血配体的施用选择性地诱导了血栓症和肿瘤梗死。所展示的结果是以带L540人何杰金淋巴瘤的小鼠为材料得到的。当作为异种移植物生长于SCID小鼠中时，就炎性细胞因子的表达以及其血管结构上VCAM-1和其它内皮细胞活化分子的存在而言，该肿瘤显示与人类疾病非常类似(Diehl等，1985)。
利用共价连接的抗-VCAM-1·tTF凝血配体(其中tTF直接与抗-VCAM-1抗体直接连接)，本文显示了凝血配体选择性地定位于肿瘤血管处，诱导那些血管的血栓形成，在携带L540何杰金实体瘤的小鼠中引起了整个肿瘤发生坏死并延缓了肿瘤的生长。肿瘤通常需要直径至少约0.3cm才能对凝血配体产生反应，因为在较小的肿瘤上没有VCAM-1。估计可能是因为在小肿瘤中，肿瘤细胞或浸润肿瘤的宿主细胞分泌的细胞因子水平对于VCAM-1的诱导来说太低了。这与美国专利5,855,866，5,877,289，6,051,230，6,004,555和6,093,399中的研究结果是一致的，其中的发明显示出在较大的实体瘤中最有效。
尽管最初更多的是在肿瘤周边观察到VCAM-1染色，凝血配体明显地结合并堵塞输送血液的血管--因为它能减少所有肿瘤区的血流。此外，有一发明者还考虑到由于最初施加凝血配体所引起的凝血酶的产生有可能导致中枢血管上进一步的VCAM-1诱导作用(Sluiter等，1993)，从而产生扩大的信号并导致对肿瘤内区域的明显破坏。这种类型的凝血配体诱导的其它可靶向标记物的表达以及由此产生的信号放大在美国专利6,036,955中有所描述。
正如本文所显示的，尽管通过施加抗VCAM-1凝血配体观察到其定位于小鼠心脏和肺中表达VCAM-1的血管上，但此构建物并未在这样的非肿瘤部位诱发血栓形成。而且，抗VCAM-1凝血配体对小鼠的毒性并不比具有无关特异性的对照凝血配体更大，再次表明了VCAM-1在心脏和肺血管上的组成性表达不会产生毒性。由于VCAM-1是人类肿瘤血管内皮中天然存在的标记物，此结果对于当前凝血配体疗法的临床进展尤为重要。另一方面，此现象还为发明者提供了独一无二的视野，导致了完全不同的破坏肿瘤血管结构的方法。
A.利用裸露的抗氨基磷脂抗体治疗肿瘤
发明者试图了解抗VCAM-1凝血配体能结合组成性表达于心脏和肺血管上的VCAM-1却不会在那些血管中引起血栓形成这一现象背后的机制。对于此只凭经验观察到的现象有许多科学的可能性解释，通常与肿瘤环境中的前血栓形成特性以及心脏和肺中任何血纤维蛋白溶解诱因相关。
一般而言，在凝血系统(纤维蛋白沉积)和纤溶系统(纤维蛋白被酶降解)之间存在着生物学平衡。不过，在恶性病，尤其是肿瘤中，此平衡被破坏，导致了凝血的异常激活(血凝过快或“前血栓形成状态”)。尽管进行了大量的研究，直到最近才了解了肿瘤环境中前血栓形成状态的明确分子机制。
在详细分析许多可能后，发明者推断抗VCAM-1凝血配体之所以不会在正常组织血管内引起血栓形成是由于这些血管内腔表面缺乏氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸(PS)。因此，为了证实这一理论，不仅需要证明在这些正常血管上无磷脂酰丝氨酸，还需要证实它们存在于肿瘤相关血管的内腔侧面上。
因此，发明者用免疫组织化学染色来确定静脉内注射入患肿瘤小鼠体内的单克隆抗磷脂酰丝氨酸(抗PS)抗体的分布状态。这些研究显示，在心脏和肺中表达VCAM-1的血管缺乏PS，而在肿瘤中表达VCAM-1的血管也表达PS。发明者还发现结合PS的膜联蛋白V在体外和体内均阻断抗VCAM-1·tTF凝血配体的作用，这进一步证实了在凝血配体的作用中需要表面PS的表达。
因此，至少在某种程度上，抗VCAM-1凝血配体在正常心脏和肺血管上无血栓形成作用的原因可以解释为：由于缺乏氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸，意味着正常血管上没有凝血复合物组装所需要的前凝血表面。在缺乏表面PS的情况下，抗VCAM-1·tTF与表达VCAM-1的心脏和肺血管结合，但不会诱发血栓形成。相反，在肿瘤中表达VCAM-1的血管显示出同时表达了表面PS。因此，凝血配体与肿瘤血管结合，并局部激活了凝血因子，从而形成了堵塞的血栓。
除了描述抗VCAM-1凝血配体的肿瘤特异性血栓形成作用外，在肿瘤血管内腔表面上氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸的特异表达还使发明者能够解释早期研究中观察到却不能理解的前血栓形成表型。PS表达在肿瘤血管结构的前血栓形成状态中起了重要的作用。
在他们发现代表性的氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸特异地表达于肿瘤血管内腔表面而不表达于正常血管中后，发明者推断其它的氨基磷脂也具有作为治疗干预靶目标的可能。发明者因此以靶向于氨基磷脂—磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺(PE)为基础开发了肿瘤血管系统靶向和治疗方法。
本发明的发明者研究中尤其令人意外的发现是施用未缀合的抗氨基磷脂抗体对于肿瘤治疗是有效的。由此，通过使用可与氨基磷脂结合的未缀合或“裸露的”抗体，为肿瘤治疗提供了新的重要的途径。这些肿瘤血管结构靶向和治疗方法参阅收编于此作为参考的美国专利6,406,693。尽管在本领域公认的动物模型中的抗肿瘤作用在美国专利6,406,693中得到了证明并在本文中进一步扩展，但是由美国专利6,406,693之前的研究并不能预测到氨基磷脂用作安全有效的肿瘤血管结构可靶向标记物的能力。
一旦氨基磷脂作为肿瘤血管结构特异标记物的发现得到证实，发明者开始开发一系列靶向氨基磷脂的免疫毒素和凝血配体用于肿瘤治疗中。正如美国专利6,406,693中所解释的，这导致了裸露抗氨基磷脂抗体用于肿瘤治疗的意外发现。在有关将毒素或凝血剂递送至肿瘤血管结构时利用氨基磷脂进行靶向的可能性研究中，发明者意外的发现在未附加任何效应子的情况下裸露的抗PS抗体对体内肿瘤血管具有破坏作用。抗氨基磷脂抗体既特异定位于肿瘤血管系统又发挥伴随的破坏作用从而导致肿瘤坏死的能力是根本未曾预料到的。
在其它实施方案中，本发明提供了不寻常且改进了的“第二代”抗PS抗体在肿瘤疗法中作为裸露抗体。本文公布了一组第二代抗PS抗体，其中单克隆抗体9D2和3G4(ATCC 4545)是目前优选的，本文还与此一起公布了产生和选择具有所说优越特性的更多抗体的特殊免疫接种和筛选技术。本文还显示了抗PS抗体对肿瘤血管的损害至少在某种程度上是通过宿主效应物介导的。正如本文所讲述的，由本发明发明者的这些和其它了解可以优化裸露抗体疗法，包括单独使用和与本文所教导的其它抗癌剂结合使用的情况。
B.利用抗阴离子磷脂抗体治疗肿瘤
美国专利6,406,693说明了氨基磷脂—磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺通常与不同细胞中质膜双层的内表面分离(Gaffet等，1995；Julien等，1995)，这种脂质分离产生了不对称的跨双层。尽管膜不对称性的存在已被讨论相当一段时间了，但对其存在的原因和产生及调控的机制仍了解甚少(Williamson和Schlegel，1994)，尤其是在除了血小板之外的细胞中。
发明者在较早的时候证实了PS移位至肿瘤血管内皮细胞表面，并且至少在显著的程度上，这种现象的发生与细胞凋亡或其它细胞死亡机制无关(美国专利号6,406,693)。因此，在肿瘤环境中PS的表面表达不是细胞死亡的结果，也不是由它引起了即时的细胞毁坏。尽管在各种实体瘤中完整血管内皮细胞上始终可以检测到PS的暴露，肿瘤血管内皮却不是真正凋亡的，而是形态学上完好的(尽管不同于正常组织中的情形)，而且是代谢活跃的。这对于基于PS靶向的治疗方法来说是重要的，意味着PS向肿瘤血管内皮细胞外膜的移位对于PS用作成功治疗(利用裸露的抗体或治疗性缀合物)的可靶向实体是足够稳定的。
尽管在美国专利6,406,693(和6,312,694，见下文)中有重要的发现，但基于磷脂的肿瘤血管内皮细胞靶向这一推测只局限于氨基磷脂的靶向，如PS和PE。通过开发对不同磷脂和氨基磷脂具有强特异性的生物学方法，本发明的发明者目前已确定了在肿瘤血管内皮细胞上不可思议地上调了的新的磷脂范围。这些是阴离子磷脂，本文中显示出它们也是肿瘤血管系统的特异且稳定的标记，使利用可与阴离子磷脂结合的裸露抗体和免疫缀合物二者进行治疗干预成为可能。
阴离子磷脂正常条件下在静息哺乳动物细胞表面基本上是不存在的。磷脂酰丝氨酸这种最丰富的质膜阴离子磷脂，正常条件下在大部分细胞类型中被紧密隔离于质膜内表面(Williamson和Schlegel，1994；Zwaal和Schroit，1997)。磷脂酰肌醇(PI)是另一种主要的阴离子磷脂，也主要位于质膜的内表面(Calderon和DeVires，1997)。次要的阴离子磷脂—磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)只在一些细胞类型中检测到，但它们也表现出主要位于质膜的内表面(Hinkovska-Galcheva等，1989)。另一种阴离子磷脂—心磷脂存在于线粒体膜上而非质膜上(Daum，1985)。
中性磷脂也不对称地分布于质膜内。中性磷脂-磷脂酰乙醇胺(PE)主要位于内表面。含胆碱的中性磷脂-磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)主要位于外表面。
PS和PE的不对称性通过ATP-依赖型转运蛋白—氨基磷脂移位酶(Mg2+ATPase)来维持，该酶催化氨基磷脂从质膜外表面向内表面转运(Seigneuret和Devaux，1984)。PS和PE不对称性的丧失或崩溃是由于质膜内这些磷脂向外运动所造成的，或者是由于对移位酶的抑制(Bitbol等，1987；Comfurius等，1990)、PS转运蛋白的激活和/或变频酶(scramb lase)的激活所引起的，变频酶是双向转运所有磷脂的Ca2+依赖型酶(Zhao等，1998)。
在不同的病理和生理状态下都观察到了PS不对称性的丧失，包括细胞损伤、程序性细胞死亡和凋亡(Blankenberg等，1998；Bombeli等，1997)、细胞衰老(Herrmann和Devaux，1990)、血小板的活化(Rote等，1993；Zwaal等，1989)、受伤(Boyle等，1996)和恶性转化(Sugimura等，1994)。PS的暴露还在成肌细胞(Sessions和Horwitz，1981)和营养细胞(Adler等，1995)的胞间融合、细胞迁移(Vogt等，1996)和细胞脱粒(Demo等，1999)中起着一定的作用。内皮细胞对由凝血酶(Qu等，1996)、钙离子载体或佛波酯(Julien等，1997)、高脂血症(Lupu等，1993)和非溶胞浓度的补体蛋白质C5b-9(Christiansen等，1997)所诱导的Ca2+流量增加产生反应而将PS外在化。在无外源激活剂或细胞损伤的情况下在恶性细胞内也观察到自发的PS暴露(Utsugi等，1991)。
膜PS暴露后产生几个主要的后果。有吞噬作用的巨噬细胞识别、附着和消灭PS阳性的衰老和凋亡细胞(McEvoy等，1986；Tait和Smith，1999)。PS还介导T淋巴细胞与凝血酶活化的内皮细胞附着(Qu等，1996)。补体系统被PS激活并促成PS阳性细胞的裂解(Test和Mitsuyoshi，1997)。最后，PS的暴露通过为凝血复合物的装配和活化提供带负电荷的脂类表面而促使前凝血剂移动至内皮上(Williamson和Schlegel，1994；Bombeli等，1997)。长期以来已对肿瘤内皮的前血栓形成特征有所认识(Donati和Falanga，2001)。
尽管科学文献集中于PS上，并且发明者的早期工作局限于诸如PS和PE等氨基磷脂(美国专利号6,406,693和6,312,694)，本发明的发明者猜测在肿瘤血管结构上可能有更宽范围的磷脂变得暴露。由于肿瘤微环境的应激状态增加，发明者推断在肿瘤血管结构中许多阴离子磷脂可能上调，从而为治疗性干预提供了潜在的新机会。
发明者认识到肿瘤内皮的损伤和活化是由以下物质引起的：1)肿瘤来源的细胞因子，诸如白介素-1和肿瘤坏死因子，它们激活内皮并诱导细胞粘附分子的表达(Shaughnessy等，1989；0rr等，2000)；2)由粘附于内皮上的白细胞产生的活性氧类型(ROS)(0rr等，2000)；和3)作为代谢副产物(Shaughnessy等，1989；Soares等，1994)或由于暴露于复氧后的低氧血中(Zulueta等，1995)由肿瘤细胞自身产生的ROS。这些观察结果暗示可能由肿瘤内皮中的这些应激产生Ca2+流量，接着通过变频酶的活化或氨基磷脂移位酶的抑制而引起PS和PE的暴露。
另一方面，发明者进一步推断不只是氨基磷脂PS和PE，阴离子磷脂在肿瘤血管结构中也会上调。为了检测细胞表面阴离子磷脂，发明者创造了新的单克隆抗体9D2，它与阴离子磷脂而非中性磷脂反应。9D2因此与普通的氨基磷脂结合剂区别开来，因为它与阴离子氨基磷脂PS结合，而不与中性氨基磷脂PE结合。9D2抗体还比天然配体膜联蛋白V更特异于阴离子磷脂，其中膜联蛋白V除了与阴离子磷脂结合外还强烈结合PE(Blankenberg等，1998)。
正如本申请所详述的，发明者发现9D2和膜联蛋白V在静脉内注射入带各种类型实体瘤的小鼠中后特异地定位于肿瘤内皮。此发现证实了发明者的假设，即阴离子磷脂通常在肿瘤血管内皮表面变得暴露，且可用作肿瘤治疗(和成像)的靶分子。本发明因此提供了一系列新方法和基于抗体的组合物，可用于靶向阴离子磷脂和治疗肿瘤，在裸露抗体和细胞毒性药物、细胞因子、凝血剂等的投递中均可如此。除了如美国专利6,406,693和6,312,694中所述靶向于PS之外，本发明目前优选的靶向阴离子磷脂是PI(一种主要的阴离子磷脂)、PA和PG，在某些实施方案中还考虑使用靶向CL。
本发明的主要发现之一是阴离子磷脂暴露于肿瘤内皮的表面(实施例VI)。此现象通过两种选择性结合阴离子磷脂的独立药剂得到证明：单克隆抗体9D2，这是发明者为了证明此点而特别开发的，还有膜联蛋白V。9D2抗体和竞争性抗体是本发明更优选的组分。
9D2抗体和膜联蛋白以高亲合力和特异性结合吸附于塑料上、作为脂质体或者体外活化或凋亡内皮细胞膜表面上所展示的阴离子磷脂。9D2与PS、PA和CL强结合，但与PI和PG的结合则弱得多。正如过去所发现的，膜联蛋白V除了结合PS、CL、PA、PI和PG之外，还结合PE(Andree等，1990；Schlaepfer等，1987；Boustead等，1993；Blackwood和Ernst，1990)。9D2抗体对阴离子磷脂的识别在血清存在与否的条件下都是相同的，表明结合不需要血清辅因子。9D2与阴离子磷脂的结合不需要Ca2+离子，而膜联蛋白V的结合则需要Ca2+。
对PS包被平板的交叉封闭研究显示9D2和膜联蛋白V不会相互阻断与PS的结合。这表明所说的两种药剂识别PS分子上的不同表位，或更有可能识别不同包装形式的PS。膜联蛋白V被认为结合平坦的PS表面，而抗PS抗体则被认为结合六角形包装的PS(Rauch和Janoff，1990)。两种形式都可能存在于PS包被的平板上。这些实际的交叉封闭研究(实施例VI)还用于表明，一旦提供一参照抗体(如9D2)，就能方便的鉴定出有效竞争结合阴离子磷脂的抗体，即与参照抗体基本上结合相同表位的抗体。
本申请还显示，9D2抗体和膜联蛋白V特异性定位于肿瘤血管和体内检测的所有肿瘤的坏死区内和周围的肿瘤细胞(实施例VI)。肿瘤中15-40％的血管具有阴离子磷脂阳性内皮。相反，正常组织中没有血管具有可检测到的外在化阴离子磷脂。
9D2对肿瘤血管的染色特异性通过以下几点得到证明：1)用对照大鼠IgM则无肿瘤血管的染色；2)用制备自阴离子磷脂的脂质体可以封闭9D2或膜联蛋白V与经H2O2-处理的体外内皮细胞的结合，而制备自中性磷脂的脂质体则不能；3)用去污剂或有机溶剂从肿瘤部分提取走磷脂就消除了染色；和4)9D2或膜联蛋白都不定位于正常器官的静止内皮上。
肿瘤血管结构中由9D2或膜联蛋白定位的主要阴离子磷脂有可能是PS，因为它是最丰富的阴离子磷脂，并且它在细胞表面的暴露受环境变化或损伤的调控。不过，其它的阴离子磷脂(如PI、PA、PG)也有可能暴露，尽管它们没有这么丰富。
尽管用9D2未检测到，但主要的中性磷脂PE仍有可能与PS一起造成在肿瘤血管上可以观察到的膜联蛋白定位。还已知PE暴露于肿瘤内皮上，且PE在质膜中的位置受到与PS相似的方式调节(美国专利6,406,693)。PE部分地被氨基磷脂移位酶隔离在质膜的内表面，尽管速度较PS慢(Devaux，1992)，而且它还被变频酶转运到外表面(Zhou等，1997)。象PS一样，PE在细胞凋亡和细胞活化期间也会暴露(Emoto等，1997；Umeda和Emoto，1999)。
为了检验肿瘤内皮细胞上阴离子磷脂暴露的机制，进行了一系列的研究，其中用已知存在于肿瘤微环境中的各种因子和条件来处理体外内皮细胞(实施例VII)。低氧血后的复氧、酸性和凝血酶使PS在活内皮细胞上的暴露比所有细胞凋亡情况下观察到的提高了10-22％的水平。炎性细胞因子(TNFα和IL-1)也会微弱但明确的诱发PS暴露。
这些发现与肿瘤中低氧血/复氧结合炎性因子、凝血酶和酸性会诱导阴离子磷脂暴露于血管内皮的可能性是相一致的。尽管对于实施本发明来说并不需要了解确切的机制，但作为代谢的副产物或对低氧血的响应，肿瘤细胞可能产生ROS(Zulueta等，1995)。肿瘤细胞释放的细胞因子可能诱导了内皮上介导活化巨噬细胞、多形核细胞和血小板与肿瘤内皮的粘附的白细胞粘附分子和进一步的ROS分泌。然后ROS可能通过含巯基转运分子的氧化或脂类的过氧化诱导PS移位(Herrmann和Devaux，1990)，这可能是通过引起Ca2+的流入或细胞内贮备Ca2+的释放而实现的(Wang和Joseph，2000)。
PS和其它阴离子磷脂的暴露在某种程度上解释了长久以来认识到的肿瘤内皮的前凝血状态(Donati和Falanga，2001)。阴离子磷脂提供了凝血因子聚集和装配的表面(Bevers等，1985；Dachary-Prigent等，1996)。它还为帮助白细胞浸润入肿瘤的循环巨噬细胞(McEvoy等，1986)、T淋巴细胞(Qu等，1996)和多形核细胞提供了附着位点。
可结合阴离子磷脂的抗体和其它配体因此可被用于肿瘤血管的靶向、成像和/或治疗。由于以下几个原因，阴离子磷脂作为肿瘤靶十分引人注目：它们是丰富的(每个细胞上存在3 x 106个PS分子)；它们位于肿瘤血管的内腔表面，可以直接到达从而便于血液中血管靶向剂的结合；它们存在于各种实体瘤的绝大部分肿瘤内皮细胞上；且它们在正常组织的内皮细胞上基本上没有。
应用血管靶向剂的药物或凝血剂也显示出在携带大实体瘤的小鼠中非常有效，且有时还有疗效(Huang等，1997；Nilsson等，2001；美国专利5,660,827，5,776,427，5,855,866，5,863,538，5,965,132，6,004,554，6,051,230，6,261,535，6,093,399，6,004,555，5,877,289和6,036,955)。本发明因此提供了针对阴离子磷脂的裸露抗体和血管靶向剂用于在人类癌症的诊断和治疗中靶向肿瘤血管结构。
尽管实施本发明不需要对针对阴离子磷脂和氨基磷脂的裸露抗体如何在肿瘤治疗中发挥作用有准确的分子水平的了解，发明者还是考虑了可能造成所观察到的内皮细胞被杀死现象的几种机制。最可能的机制(尤其是对于本文所述的3G4抗体来说)是Fc结构域介导的免疫效应子功能，诸如抗体依赖型细胞毒性(ADCC)、补体依赖型细胞毒性(CDC)和抗体介导的胞噬作用。细胞介导的细胞毒性、补体介导的细胞裂解和/或凋亡、抗体诱导的细胞信号传导和/或对细胞骨架的扰乱也可能涉及在内。
抗阴离子磷脂和氨基磷脂的完整抗体，尤其是3G4，与血管内皮细胞表面的结合意味着抗体的Fc部分突出入血管的内腔。由于抗体Fc片段激活了补体途径，所观察到的细胞破坏可能是补体指导的细胞裂解的结果。因此抗体结合激活了补体依赖型凝血级联反应，引起多组分复合物的装配并最终产生能透过靶细胞的裂解复合物。“补体激活的ADCC”还可在破坏细胞中起作用，其中补体与抗体包被的靶细胞结合，而具有补体受体的细胞，如嗜中性粒细胞，会裂解靶细胞。
当裸露或未缀合抗体，包括其抗原结合片段，与阴离子磷脂和氨基磷脂在肿瘤血管内皮细胞表面结合时，它们将在内腔表面形成一抗体包被层。这可以起到吸引诸如细胞毒性T细胞和/或天然杀伤(NK)细胞等免疫效应细胞的作用，然后免疫效应细胞将在血管内皮细胞上发挥细胞介导的细胞毒性功能。
与阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体结合还可在肿瘤血管内皮细胞中诱导细胞凋亡。尽管尚无已知的有关与PS的抗体结合真正诱导凋亡的报道(而非有关PS是凋亡产生的标记)，发明者仍考虑这可能是所观察到的抗肿瘤效应的另一可能机制。
还可能的是肿瘤血管内皮细胞表面上与阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体结合可能引起细胞内骨架组织的紊乱。由于细胞骨架在膜表面的组织中起着重要的作用，且由于抗体的结合可能扰乱(或进一步扰乱)了膜，抗体与阴离子磷脂和氨基磷脂的结合可能将变化传递至与膜双分子层相互作用的细胞骨架蛋白。已知骨架蛋白的空间结构可控制膜的稳定性和细胞形状，且有可能某些细胞骨架平衡状态的扰乱可能对细胞的完整性具有深远的影响。
本发明作用的另一机制可能是与内皮细胞表面阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体结合可能通过目前未确定的途径起始信号的转导。抗体结合还可能扰乱已知的信号转导，如通过改变膜受体、信号转导蛋白、膜通道等的构象和/或相互作用。有关细胞破坏(凋亡)的信号可以被引发或模拟，并且/或者保护/内环境稳定的信号可能被抑制。
尽管存在科学方面的兴趣，但实施本发明无需确定抗阴离子和氨基磷脂的裸露抗体造成血管破坏的确切性质。既然已显示这些类的抗体的施用有利地在体内产生了抗肿瘤效用，这样的疗法就能应用，而不管造成此现象的分子机制是什么。因此，可结合阴离子磷脂和氨基磷脂的裸露抗体的应用代表了肿瘤治疗中的一个重要进展，在制备和成本上都具有优势。
C.抗阴离子磷脂和氨基磷脂抗体
由于本发明鉴定出了一类新型肿瘤血管系统标记，即阴离子磷脂，因此，可与一种或多种阴离子磷脂结合的裸露的抗体和免疫缀合物(任选的与氨基磷脂联合)目前可以用于肿瘤诊断和治疗中。
C1.多克隆抗体
本领域众所周知用于制备并鉴定抗体的方法(参阅如《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)冷泉港实验室，1988；本文收入作为参考)。为了制备多克隆抗血清，用本文所述含免疫原性阴离子磷脂和/或氨基磷脂(包括用H2O2处理过的细胞和其它药剂)的组合物免疫动物，并由经免疫动物收集抗血清。广泛的动物物种可以用于生产抗血清。用于生产抗血清的动物通常是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、或山羊。因为兔的血量相对较大，所以优选兔用于生产多克隆抗体。
用于生成多克隆抗体的免疫原组合物的量随免疫原的本质以及用于免疫的动物而变化。多种途径可以用于施用本发明免疫原：包括皮下、肌肉内、真皮内、静脉内、腹膜内、和脾内。可以通过在免疫后多个时间点由经免疫动物取血样来监控多克隆抗体的生成。还可以给予第二次加强注射。重复加强和测效价过程，直至达到合适的效价。当获得期望效价水平时，可以给经免疫动物放血，分离并保存血清。动物还可用于产生单克隆抗体。
正如本领域众所周知的，特定组合物的免疫原性可以通过使用称为佐剂的免疫应答非特异性刺激剂而获得增强。例示性佐剂包括完全弗氏佐剂，其包含杀死的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答非特异性刺激剂；不完全弗氏佐剂；和氢氧化铝佐剂。
还可能期望加强宿主的免疫系统，这可以通过将阴离子磷脂和氨基磷脂与载体相联合或偶联来实现。例示性载体是钥孔
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血蓝蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其它清蛋白，诸如卵清蛋白、小鼠血清清蛋白、或兔血清清蛋白，也可以作为载体使用。
正如本领域众所周知的，指定组合物的免疫原性可以变化。然而，产生针对阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体并不特别困难。例如，通过肌肉内注射含磷脂酰丝氨酸的聚丙烯酰胺凝胶和用磷脂酰丝氨酸-细胞色素C囊泡免疫的兔子内可产生高度特异的抗磷脂酰丝氨酸抗体(Maneta-Peyret等，1988；1989；分别收编于此作为参考)。利用丙烯酰胺植入物增加了抗体的产生(Maneta-Peyret等，1988；1989)。以此方式产生的抗磷脂酰丝氨酸抗体能原位检测人血小板上的磷脂酰丝氨酸(Maneta-Peyret等，1988；1989)。Inoue、Rote和Rauch的研究小组还开发了抗PS和抗PE抗体(见下文)。
尽管针对阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体的产生可以通过各种方法完成，本文实施例IV中还是描述了某些优选的方法。
C2.单克隆抗体
现在本领域还众所周知用于产生单克隆抗体(MAb)的各种方法。大多数标准单克隆抗体生成技术通常由符合制备多克隆抗体的路线开始(《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，1988；本文收入作为参考)。通过用免疫原性阴离子磷脂和/或氨基磷脂组合物免疫动物来起始多克隆抗体应答，当获得期望的效价水平时，经免疫动物可以用于生产MAb。优选的，利用本文所述的特殊筛选和选择技术挑选具有所探寻特征的抗体。
通过使用众所周知的技术，诸如美国专利号4,196,265(本文收入作为参考)中例示的技术，可很容易制备MAb。这种技术通常涉及用选定的免疫原组合物免疫合适的动物。以能有效刺激抗体生成细胞的方式施用免疫组合物。优选动物是啮齿类动物，诸如小鼠和大鼠，但是也可以使用兔、绵羊、和蛙的细胞。使用大鼠可能有些好处(Goding，1986，第60-61页；本文收入作为参考)，但是优选小鼠，最优选BALB/c小鼠，因为它是最常规使用的且通常具有较高的稳定融合百分比。
免疫后，选择有潜力生成预期抗体的体细胞，具体而言是B淋巴细胞(B细胞)，用于产生mAb。这些细胞可以由脾、扁桃体、和淋巴结活组织样本或者由外周血样品获得。优选脾细胞和外周血细胞，因为前者是处于成浆细胞分裂阶段的抗体生成细胞的丰富来源，而后者易于获得。通常，需要免疫一组动物，切下具有最高抗体效价的动物脾脏，并用注射器对获得的脾进行匀浆而获得淋巴细胞。来自经免疫小鼠的脾通常包含大约5 x 107-2 x 108个淋巴细胞。
然后将来自经免疫动物、生成抗体的B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，永生化骨髓瘤细胞通常与免疫的动物属于相同物种。适用于杂交瘤生产融合程序的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗体的，具有高融合效率，并具有酶缺陷，使其不能在只支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。
正如本领域技术人员知道的，可以使用大量的骨髓瘤细胞中的任一种(Goding，第65-66页，1986；Campbell，第75-83页，1984；本文收入作为参考)。例如，当经免疫动物是小鼠时，可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7、和S194/5XX0Bul；对于大鼠，可以使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F、4B210、或上文所列的小鼠细胞系；对于人细胞融合，可使用U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、和UC729-6。
用于产生抗体生成脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交细胞的方法通常包括在存在促进细胞膜融合的(化学的或电学的)药剂的条件下将体细胞与骨髓瘤细胞以4:1的比例混和，但是比例可以在约20:1与约1:1之间变化。Kohler和Milstein(1975；1976；本文收入作为参考)已经描述了使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，Gefter等人(1977；本文收入作为参考)已经描述了使用聚乙二醇(PEG)，诸如37％(v/v)PEG的方法。电诱导融合方法的使用也是合适的(Goding，第71-74页，1986；本文收入作为参考)。
融合程序常常以大约1 x 10-6-1 x 10-8的低频率产生能存活的杂交细胞。然而这不是问题所在，因为通过在选择性培养基中进行培养，能够区分能存活的融合杂交细胞与亲本未融合细胞(特别是通常可持续进行无限期分裂的未融合的骨髓瘤细胞)。选择性培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的药剂的培养基。例示性和优选的药剂是氨基蝶呤、氨甲喋呤、和重氮丝氨酸。氨甲喋呤和氨甲喋呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸只阻断嘌呤合成。当使用氨甲喋呤或氨甲喋呤时，要向培养基中添加次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，要向培养基中添加次黄嘌呤。
优选的选择性培养基是HAT。只有能够进行核苷酸补救途径的细胞才能够在HAT培养基中存活。在骨髓瘤细胞中补救途径的关键酶是缺陷的，如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，因此它们不能存活。B细胞能够进行该途径，但是它们在培养中的寿命是有限的，通常在大约2周内死亡。因此，能够在选择性培养基中存活的细胞只有由骨髓瘤与B细胞形成的杂交细胞。
这种培养提供了杂交瘤细胞群，由此可选择特定的杂交瘤。通常在微量滴定板中培养由单克隆稀释的细胞，随后在大约2-3周后对各个克隆的上清液检验期望的反应性，从而选择杂交瘤。测定法应当是灵敏的、简单的、且快速的，诸如放射性免疫测定法、酶免疫测定法、细胞毒性测定法、噬斑测定法、斑点免疫结合测定法、等等。
然后对选择的杂交瘤进行系列稀释，并克隆形成产生抗体的各个细胞系，可以无限繁殖这些克隆来提供mAb。可以以两种基本方式用这些细胞系产生mAb。其一是将杂交瘤样品注射(通常为腹腔内)进入组织相容性动物，这些动物与提供体细胞和骨髓瘤细胞用于最初融合的动物种类相同。经注射动物形成肿瘤，分泌由融合的杂交细胞产生的特定单克隆抗体。然后可以对动物进行穿刺来吸取体液(诸如血清或腹水)，提供高浓度的mAb。另一种方法是在体外培养单个细胞系，此时通常分泌mAb进入培养基，由此可容易的获得高浓度的mAb。
通过每种方法产生的mAb通常将进一步纯化，如使用过滤、离心、和各种层析法，诸如HPLC或亲和层析法，本领域技术人员众所周知所有纯化技术。这些纯化技术都涉及分级分离，以将期望抗体与混和物其它成分分开。特别适用于抗体制备的分析方法包括例如蛋白A-Sepharose和/或蛋白G-Sepharose层析法。
D.抗阴离子磷脂和氨基磷脂的第二代抗体
本发明提供了结合氨基磷脂和阴离子磷脂的“第二代”抗体，所说的抗体具有改良的特性且/或不具有现有技术中抗体相关的缺点。本文描述了这样一组抗体，其中单克隆抗体9D2和3G4是目前优选的，尤其优选3G4(ATCC 4545)抗体。本发明还提供了特殊的免疫和筛选技术，它可以产生具有优越特性和/或较少缺点的“类似”或“竞争性”抗体。
D1.抗体特性
本发明的第二代抗体结合氨基磷脂和阴离子磷脂，且不具有通常与抗这些磷脂的抗体相关的致病特性。这就在某种程度上使得发明者可能开发新的免疫和筛选技术。
抗磷脂综合症(APS)与所谓“抗心磷脂”抗体和“狼疮抗凝血抗体”的自身抗体相关。这些综合症与倾向静脉和动脉血栓栓塞、血小板减少症和许多神经系统综合症相关。在这些患者中的抗磷脂抗体因此是“致病抗体”。
尽管多年来被描述成“抗磷脂抗体”和“抗PS抗体”，但这些致病抗体实际上识别结合心磷脂、PS或二者的蛋白质辅因子，而非磷脂本身(Galli等，1990；1993；McNeil等，1990；Rote，1996)。抗心磷脂抗体识别β2-糖蛋白I上的特殊区域(第281位残基和第288位残基之间)，而狼疮抗凝血抗体识别凝血酶原。类似的，疾病状态下存在的抗PE抗体结合PE与蛋白质的组合，所述蛋白质诸如低分子量和高分子量激肽原(HK)、激肽释放酶原和因子XI联合结合PE(Sugi和McIntyre，1995；1996a；1996b)。基于此类型的蛋白质识别，患者中的抗磷脂抗体顶替了磷脂的蛋白质辅因子，从而产生了疾病的症状。
基于其并非与蛋白质辅因子联合的氨基磷脂和阴离子磷脂，而是“真正的”抗磷脂抗体这一点，特别选择出了本发明的抗体。这样，本发明的抗体不结合或置换磷脂的蛋白质辅因子，因此可以安全施用。事实上，用高剂量的本发明抗体长时期处理的小鼠未显示出凝血能力的改变，而当注射抗心磷脂或狼疮抗凝血抗体时，小鼠会有APS的反应。
无论基本机制为何，人群中存在的抗磷脂抗体都与自身免疫疾病相关，如，系统性红斑狼疮(Branch等，1987；Staub等，1989；Drouvalakis和Buchanan，1998；Smirnov等，1995；Rauch等，1986；Rauch和Janoff，1990)和复发性流产(Rote等，1995；Rote等，1996；Vogt等，1996；1997；Katsuragawa等，1997)。当本发明的抗体施用于小鼠或猴子时，不会产生这样的症状。
此外，被诸如9D2和3G4(ATCC 4545)等本发明抗体识别的表位与膜联蛋白V识别的不一样。本文显示，所说的药剂不会相互交叉阻断各自与磷脂的结合。3G4和9D2抗体所识别的表位可能是六角形包装形式的PS，这是具有免疫原性的形式。膜联蛋白除了结合六角形形式的PS外，还可能结合平坦的PS。六角形的PS集中于与细胞活化相关的质膜突出中和凋亡细胞上的“泡”中。因此，诸如9D2和3G4(ATCC 4545)抗体等的本发明抗体的有限分布进一步造成了无可检测到的细胞毒性和无抗体凝血效果。
为了产生具有优越特性且/或减少或基本上无副作用的抗氨基磷脂和阴离子磷脂抗体，本发明提供了优选的免疫接种和筛选方法。其它的免疫技术和抗体在文献中已有报道(Umeda等，1989；Igarashi等，1991；Rote等，1993)，包括那些具有针对所涉及脂肪酸的报道特异性的文献(Levy等，1990；Qamar等，1990)。另一方面，本发明的免疫技术、特别是对无血清依赖性的抗体的选择也提供了特别的有利之处。
Umeda等(1989)报道了识别磷脂酰丝氨酸的立体特异表位的单克隆抗体的产生。不过，Umeda的方法具有用沙门氏菌包裹的氨基磷脂样品直接将磷脂酰丝氨酸免疫小鼠脾脏的缺点(Umeda等，1989)。Umeda等(1989)所报道的许多抗体还展示了抗凝血活性，这是一个缺点，而本发明抗体并不如此。3G4抗体的结合模式与Umeda等(1989)的PSC8抗体不同。
本发明的抗体还具有识别所有或大部分阴离子磷脂的优势，它能提供更多的结合靶目标。因此，本发明的第二代抗体可以定义为，如本文表4中所述，与9D2或3G4(ATCC4545)抗体具有基本上相同或完全相同的磷脂特异性且不依赖于血清的抗体。
Igarashi等(1991)也报道了抗PS抗体的诱导，但再次使用了脾内免疫接种，并且当再次静脉注射抗原时只观察到了微弱的效价增加。大部分来自Igarashi等(1991)的MAbs与DNA交叉反应，且许多展示了狼疮抗凝血活性，这些缺点均不存在于本发明发明者开发的抗体中。本发明优选的3G4抗体的结合模式也不同于Igarashi等(1991)表1中的那些抗体。
其它研究者已报道了与一种以上阴离子磷脂交叉反应的小鼠单克隆抗体的狼疮抗凝血活性(Alving等，1987；Rauch&Janoff，1990)，而本发明的发明者则未经历任何困难就可得到无狼疮抗凝血活性的抗体。这代表了本发明的方法、抗体和竞争性抗体的独特优势。
除了避免使用来自患者的抗体之外，如Rauch等(1986)、Hasegawa等(1994)、Ravirajan等(1995)和Menon等(1997)中所述的抗体，本申请还通过与本领域中的已有抗体(如Rote等(1993)所述的3SB抗体)的并列比较证明了本发明提供抗体的优越特性。尽管3SB抗体具有适用于本文所公布的各种方法的特性，本发明发明者开发的抗体在比较研究中仍然胜过3SB抗体，例如，如本文所示，与3SB抗体相比，3G4抗体的抗病毒作用增强(实施例XIII)。
本发明的抗体还以其亲和力为特征。在本发明之前，本领域中的抗体具有相对弱的亲和力(按其报道的)。在某些实施方案中，本发明的第二代抗体因此被定义为，如表3中所述，对PS的亲和力至少与9D2或3G4(ATCC 4545)抗体对PS的亲和力(具体而言，如本文所述在ELISA中检测到的亲和力)相同且不依赖于血清的抗体。
更优选的，本发明的第二代抗体被定义为，如表3中所述，对PS的亲和力至少与9D2或3G4(ATCC 4545)抗体对PS的亲和力相同且如本文表4中所述与9D2或3G4(ATCC 4545)抗体具有基本上相同或相同的磷脂特异性且不依赖于血清的抗体。最优选的，第二代抗体是如表3中所述对PS的亲和力至少与3G4(ATCC 4545)抗体对PS的亲和力相同且如本文表4中所述与3G4(ATCC 4545)抗体具有相同的磷脂特异性且不依赖于血清的抗体。
D2.CDR技术
抗体由可变区和恒定区组成。如本文所用，涉及抗体的术语“可变的”指抗体序列中广泛不同并用于每一种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的可变结构域某些部分。然而，可变性并不是均匀分布在整个抗体可变结构域上，而是集中在轻链和重链可变结构域中都有的称为“高变区”的三个区段中(除了下文所讨论的骆驼源化抗体之外)。
可变结构域中更高度保守的部分称为框架区(framework region，FR)。天然轻链和重链的可变结构域各包含4个FR(分别为FR1、FR2、FR3、和FR4)，主要采用β-折叠片构象，由3个高变区相连，它们形成环，连接(在某些情况中是构成)β-折叠片结构部分。
每条链中的高变区由FR紧密维持在一起，并与其它链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(Kabat等人，1991；本文特别收入作为参考)。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但是展示多种效应物功能，诸如抗体参与依赖抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域第24-34位(L1)、第50-56位(L2)、和第89-97位(L3)残基，重链可变结构域第31-35位(H1)、第50-56位(H2)、和第95-102位(H3)残基；Kabat等人，1991，本文收入作为参考)和/或来自“高变环”的残基(即轻链可变结构域第26-32位(L1)、第50-52位(L2)、和第91-96位(L3)残基和重链可变结构域第26-32位(H1)、第53-55位(H2)、和第96-101位(H3)残基)。“框架”或“FR”残基是除了本文定义的高变区残基以外的可变结构域残基。
本文提供了3G4抗体(ATCC 4545)的Vh和Vκ链的DNA和推导的氨基酸序列，分别见SEQ ID NO：1、2、3和4。这些序列包含抗体重链和轻链可变区的CDR1-3。借助本文提供的序列和其它信息以及现有技术知识，目前能够产生一系列3G4样和改进的抗体和抗原结合区，并因此包含在本发明内。
在某些实施方案中，本发明提供了由保藏号为ATCC 4545的杂交瘤所产生的抗体的至少一个CDR。在另一实施方案中，本发明提供了CDR、抗体或其抗原结合区，它结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS，而且它包括由保藏号为ATCC 4545的杂交瘤所产生的抗体的至少一个CDR。
本发明的其它方面涉及具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4氨基酸序列的至少一种CDR，或其变体或诱变形式。本发明的其它方面涉及CDR、抗体或其抗原结合区，它结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS，且包含具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4氨基酸序列的至少一种CDR，或其变体或诱变形式，其中所说的变体或诱变形式保持了与该氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)的结合。
在一个具体实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合区，其中3G4抗体(ATCC 4545)框架区已从小鼠IgG改变成人IgG，诸如人IgG1，或其它IgG亚类，从而降低在人体内的免疫原性。在其它实施方案中，在3G4抗体(ATCC 4545)序列中检测T细胞表位的存在，正如本领域中已知的。然后可改变相应序列以去除T细胞表位，即使抗体“脱免疫”。
3G4抗体的Vh和Vκ链的DNA和氨基酸序列(SEQ ID NO：1、2、3和4)的可用性意味着现在能够用CDR技术制备一系列抗体。具体而言，对在CDR中进行随机突变，并筛选产物，以鉴定出具有较高亲合力和/或更高特异性的抗体。这样的诱变和选择是抗体领域内常规实施的。由于本文所公布的优越的筛选技术，这种方法尤其适用于本发明。
这些技术可用于产生相对于其来源亲本抗体诸如9D2或3G4(ATCC4545)来说生物学特性有所改良的抗体变体。这些变体或第二代化合物通常是在亲本抗体中包含一处或多处高变区残基取代的取代变体。用于产生这些取代变体的便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟法。
在使用噬菌体展示的亲和力成熟法中，对几个高变区位点(如6-7个位点)进行突变，从而在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。由此产生的抗体变体以单价方式，作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合体形式展示在丝状噬菌体颗粒上。然后，如本文公开的，对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定显著有助于抗原结合的高变区残基。
CDR改组和植入技术也可用于本发明的抗体，优选9D2和3G4(ATCC4545)抗体。CDR改组是将CDR序列插入一特殊的框架区(Jirholt等，1998，特别收编于此作为参考)。CDR植入技术允许CDR序列随机组合入单一的主体框架中(Soderlind等，1999，2000，分别收编于此作为参考)。利用这样的技术，可将例如3G4(ATCC 4545)抗体的CDR序列诱变而产生众多的不同序列，它们被掺入骨架序列中，并对所产生的抗体变体筛选期望特征，如较高亲和力。
根据本文所公布的内容，抗体、优选9D2和3G4(ATCC 4545)抗体的抗原结合片段还可以被最小化，从而提高稳定性。这可以基于免疫球蛋白VH和VH-样结构域通过制备单一结构域结合蛋白质来完成(Nuttall等，2000，特别收编于此作为参考)。
或者/另外，可以描绘并分析抗原-抗体复合物的晶体结构，从而鉴定抗体与靶氨基磷脂或阴离子磷脂(如PS)之间的接触点。这些接触残基和邻近残基是替代的候选者。一旦产生了这些变体，如本文所述，对变体理进行筛选，选择出在一种或多种相关测定法中显示出相似但是不同或甚至更好的特性的抗体用于进一步的开发。
D3.骆驼源化抗体(camelized antibodies)
本发明另外的实施例是“骆驼源化”抗体。来自camels和llamas(Camelidae，camelids)的抗体包括一种独特类型的抗体，它没有轻链，因此只由重链组成。这些抗体已被称为“骆驼源化抗体”。这样的抗体的抗原结合位点是单一的结构域，被称作VHH(VHH)。
本文提供了3G4(ATCC 4545)抗体Vh和Vκ链的DNA和氨基酸序列(SEQ ID NO：1、2、3和4)，这样可制备骆驼源化形式的3G4抗体。可以进行突变和结构修改，以将VH-VL对中的VH改造成保留足够可变性的单一结构域VHH(Muyldermans等，2001，特别收编于此作为参考)。这样的VHH构建体是具有强抗原结合能力的小而强且有效的识别单元(Riechmann和Muyldermans，1999)，它具有可与常规VH-VL对不易接近的新表位相互作用的更多优势。因此，camelised抗体虽然类似于Fv片段，但具有更多的优势。
美国专利5,800,988、美国专利6,005,079、PCT申请WO 94/04678、PCT申请WO 94/25591、Riechmann&Muyldermans(1999)和Muyldermans等(2001)都分别收编于此作为参考，以便进一步描述和进行骆驼源化抗体的生产。因此，3G4抗体的CDR可以移植到Camelidae抗体重链免疫球蛋白的可变结构域框架上。
D4.CDR序列
因此，本发明的更多方面涉及编码抗体重链和轻链CDR区的分离DNA片段和重组载体，诸如9D2和3G4抗体，优选3G4(ATCC 4545)的重链和轻链，还涉及通过DNA技术的应用产生和利用表达这些CDR区的重组宿主细胞和噬菌体。
本发明由此提供了含编码保藏号为ATCC 4545的杂交瘤所产生的抗体的至少一种CDR的核酸序列的分离多核苷酸。本发明另外提供了分离的多核苷酸，它包含编码结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)、并包含保藏号ATCC 4545的杂交瘤所产生的抗体的至少的一种CDR的CDR、抗体或其抗原结合区的核苷酸序列。
本发明的其它方面涉及包含编码具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的至少一种CDR的核苷酸序列或其变体或诱变形式的分离多核苷酸。本发明的其它方面涉及包含编码CDR、抗体或其抗原结合区(它可结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS，且包含具有SEQID NO：2或SEQ ID NO：4氨基酸序列的至少一种CDR)的核苷酸序列或其变体或诱变形式的分离多核苷酸，其中所说的变体或诱变形式保持了与所述氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)的结合。
在本发明的其它方面，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3所示核苷酸序列或其变体或诱变形式。具体而言，所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其变体或诱变形式，该核苷酸序列编码可结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)的CDR、抗体或其抗原结合区，其中任何的所说变体或诱变形式保持了与氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)的结合。
本发明由此涉及可由任何哺乳动物(优选人或鼠)分离的不含总基因组DNA、并能够表达抗阴离子磷脂或抗氨基磷脂抗体重链和轻链(诸如9D2和3G4，优选SG4(ATCC4545))的CDR区的多核苷酸和DNA片段。如本文所用，术语“多核苷酸区段”和“DNA区段”指已分离的不含特定物种总基因组DNA的多核苷酸和DNA分子。术语“多核苷酸区段”和“DNA区段”包括DNA片段和这些片段的小片段，还有重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等等。
相似的，包含编码抗阴离子磷脂或抗氨基磷脂抗体(诸如9D2和3G4，优选3G4)重链和轻链的纯化CDR区的编码片段或分离基因部分的DNA片段，指包含这些编码序列(而且在某些方面包含调控序列)、与其它天然存在的基因或蛋白质编码序列基本上分离开的DNA片段。在这方面，术语“基因”简便的用于指功能性蛋白质、多肽、或肽编码单元。本领域技术人员可以理解，这种功能性术语包括表达或可能适合于表达合适的抗原结合蛋白质、多肽、或肽的天然抗体编码序列和更小的基因工程化片段。
“与其它编码序列基本上分离开”指感兴趣的编码片段或分离基因部分构成DNA片段编码区的重要部分，而且该DNA片段不含天然编码DNA的大部分，诸如大染色体片段或其它功能基因或cDNA编码区。当然，这指最初分离的DNA片段，不排除后来人工添加的基因或编码区。
在特定实施方案中，本发明涉及分离的编码片段或分离的基因部分，和掺入了编码抗阴离子抗体或抗氨基磷脂抗体重链和轻链(诸如9D2和3G4，优选3G4的重链和轻链)CDR区的DNA序列的重组载体，所述CDR区包含具有与氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4有至少大约75％；更优选至少大约80％；更优选至少大约85％；更优选至少大约90％、91％、92％、93％、94％；最优选至少大约95％、96％、97％、98％或99％左右氨基酸序列同一性的氨基酸序列区的至少第一序列区；其中所述CDR区至少基本上维持氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的CDR区的生物学特性。
如本文公开的，序列中可以包含某些生物学上功能等同的氨基酸或“保守性替代”。其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其特意经基因工程改造以改进CDR或含CDR的抗体的特性，本领域普通技术人员是知道的，本文将进一步描述。
也可以理解，氨基酸和核酸序列可以包含额外残基，诸如额外的N或C端氨基酸或者5’或3’序列而仍然属于本发明的序列，条件是序列符合上文提出的标准，优选在涉及蛋白质表达时包括生物学蛋白质活性的维持或改进。末端序列的添加包括位于编码区5’或3’部分侧翼的各种非编码序列以及控制区。
因此，本发明的核酸片段可以与其它DNA序列联合，诸如启动子、多聚腺苷酸化信号、额外的限制酶切位点、多克隆位点、其它编码片段、等等，使得它们的整体长度可能显著变化。因此预计可以采用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选受到意欲采用的重组DNA方案中制备和使用便利性的限制。
因此，重组载体形成本发明的另外方面。特别有用的载体预计包括将DNA片段编码部分置于启动子控制之下的载体。通常，将采用重组或异源启动子，即在天然环境中与编码序列通常不相连的启动子，当然并不仅限于此。这些启动子可以包括细菌、病毒、真核、和哺乳动物启动子，只要启动子有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞类型、生物体、或甚至动物中的表达即可。
用于蛋白质表达的启动子和细胞类型组合的使用对于分子生物学领域技术人员而言是知道的。采用的启动子可以是组成性的或可诱导的，而且可以在指导导入的DNA片段高水平表达的适当条件下使用，这在诸如大量生产重组蛋白质或肽中是有益的。
本发明核酸序列的表达可以方便的通过本领域普通技术人员知道的、本文进一步描述的任何一种或多种标准技术来实现。例如，关于融合蛋白质重组表达的后续描述同样可以应用于在核酸水平上不与另一种编码序列可操作相连的抗体和抗体片段。
E.更多的抗体制备技术
E1.来自噬菌粒文库的抗体
重组技术现在能够由编码一系列抗体的重组基因制备具有期望特异性的抗体(VanDijk等人，1989；本文收入作为参考)。某些重组技术涉及对使用由经免疫动物的脾分离的RNA而制备的组合免疫球蛋白噬菌体表达文库进行免疫学筛选来分离抗体基因(Morrison等人，1986；Winter和Milstein，1991；Barbas等，1992；本文收入作为参考)。
对于这些方法，使用由经免疫动物的脾分离的RNA来制备组合型免疫球蛋白噬菌粒文库，并通过使用表达抗原的细胞和对照细胞进行淘选来选择表达适当抗体的噬菌粒。这种方法相对于传统杂交瘤技术的优势是可以在一轮中产生并筛选多达大约104倍的抗体，而且通过H链与L链的组合产生了新的特异性，进一步增加了产生适当抗体的可能性。
用于在细菌中产生多样性抗体分子大型文库的一种方法是利用细菌噬菌体λ作为载体(Huse等人，1989；本文收入作为参考)。使用λ载体的抗体生成涉及将重链和轻链DNA序列群克隆到分开的起始载体中。随后随机组合载体形成单一载体，来指导重链和轻链共表达形成抗体片段。由用选定抗原免疫的动物的脾细胞(或其杂交瘤)分离mRNA并进行扩增，优选通过PCRTM或相关扩增技术，获得重链和轻链DNA序列。重链和轻链序列通常使用引物进行扩增，所述引物将限制性位点引入扩增DNA片段末端，有助于将重链和轻链片段克隆到起始载体中。
用于产生并筛选全部或部分合成的抗体结合位点或互补位的大型文库的另一种方法利用了由丝状噬菌体(诸如M13、f1、或fd)衍生的展示载体。这些称为“噬菌粒”的丝状噬菌体展示载体可产生具有不同的和新的免疫特异性的单克隆抗体大型文库。这种技术使用丝状噬菌体外壳蛋白膜锚定结构域作为在丝状噬菌体复制装配阶段过程中联系基因产物与基因的方法，而且已经用于由组合型文库克隆并表达抗体(Kang等人，1991；Barbas等人，1991；本文收入作为参考)。
美国专利号5,658,727描述了这种用于丝状噬菌体展示的常用技术，本文收入作为参考。在最常用的方面，这种方法为使用单一载体系统由抗体基因库同时克隆并筛选预先选定的配体结合特异性提供了一种系统。对文库的分离成员筛选预先选定的配体结合能力能够将表达的抗体分子的结合能力与用于由文库分离成员编码基因的便利方法联系起来。
通过将融合多肽靶向进入细菌细胞周质以便装配功能性抗体与噬菌体装配过程中将融合多肽靶向至丝状噬菌体颗粒外壳上以便方便的筛选感兴趣文库成员进行组合，可以实现表达与筛选的联系。通过融合多肽中存在的分泌信号结构域来提供周质靶向。通过融合多肽中丝状噬菌体外壳蛋白膜锚定结构域(即cpIII或cpVIII衍生的膜锚定结构域)的存在来提供噬菌体颗粒靶向。
可以通过重链和轻链基因的改组，通过改变克隆的文库重链基因的一个或多个互补决定区、或通过易错聚合酶链式反应将随机突变导入文库，来增加基于丝状噬菌体的组合型抗体文库的多样性。美国专利号5,580,717、5,427,908、5,403,484、和5,223,409描述了用于筛选噬菌粒文库的其它方法，本文收入作为参考。
已经开发了用于筛选大型组合型抗体文库的另一种方法，其中利用了多样化重链和轻链序列群在丝状噬菌体(诸如M13、f1、或fd)表面的表达(美国专利号5,698,426，本文收入作为参考)。通过聚合酶链式反应(PCRTM)合成了两套多样性重链(Hc)和轻链(Lc)序列群。将这些序列群克隆到分开的含表达必需元件的基于M13的载体中。重链载体包含基因VIII(gVIII)外壳蛋白序列，使得重链序列的翻译产生gVIII-Hc融合蛋白质。随机组合两套载体群，使得只有包含Hc和Lc序列的载体部分连接成单个环状载体。
组合型载体指导Hc与Lc序列二者的共表达，用于两种多肽的装配和M13表面表达(美国专利号5,698,426，本文收入作为参考)。组合步骤将两套多样性序列群的不同Hc和Lc编码序列随机带入单个载体。来自每个独立载体的载体序列对于产生存活噬菌体是必需的。另外，既然两种起始载体中只有一种包含假的gVIII序列，那么在噬菌体表面不能够实现功能性抗体片段作为Lc相关性gVIII-Fc融合蛋白质的共表达，除非载体序列连接成单个载体。
在琥珀抑制子菌株中进行抗体文库的表面表达。Hc序列与gVIII序列之间的琥珀终止密码子在无抑制子菌株中拆开了两种成分。分离由无抑制子菌株产生的噬菌体并感染抑制子菌株，将在表达过程中将Hc序列与gVIII序列联系起来。感染后培养抑制子菌株能够在M13表面以gVIII融合蛋白质(gVIII-Fab融合蛋白质)形式共表达文库内所有抗体种类。或者，可以由无抑制子菌株分离DNA，然后导入抑制子菌株来实现相同效果。
通过标准亲和分离程序对表面表达文库筛选可结合预先选定的分子的特异性Fab片段。这些方法包括例如淘选(Parmley和Smith，1988；本文收入作为参考)、亲和层析法、和固相印迹程序。优选淘选，因为可以在小体积中容易的、快速的筛选高效价噬菌体。而且，该程序可以选择群体中用其它方法检测不到的较少Fab片段种类，并扩增成基本上均一的群体。可以在扩增噬菌体群后对编码多肽的核酸进行测序来鉴定选定的Fab片段。
美国专利号5,667,988和5,759,817描述了用于产生多样性抗体文库并筛选期望结合特异性的另一种方法，本文收入作为参考。该方法涉及使用简并寡核苷酸和引物延伸反应将简并性引入免疫球蛋白可变重链和轻链可变结构域CDR区，并将诱变的多肽展示在噬菌颗粒表面，由此以噬菌粒文库的形式制备杂二聚体免疫球蛋白分子文库。此后，对展示蛋白筛选结合预先选定的抗原的能力。
用于产生杂二聚体免疫球蛋白分子的方法通常涉及(1)将感兴趣的重链或轻链V区编码基因导入噬菌粒展示载体；(2)通过使用包含抗体V区基因CDR同源区且包含产生随机化编码序列的简并区的寡核苷酸进行引物延伸，将随机化结合位点导入噬菌粒展示蛋白载体，形成展示载体的大型群体，其中的每一个都能够表达在噬菌粒表面展示蛋白上展示的不同的假定结合位点；(3)在丝状噬菌体颗粒表面表达展示蛋白和结合位点；并(4)使用亲和技术来分离(筛选)表面表达的噬菌体颗粒，诸如针对预先选定的抗原进行噬菌体颗粒淘选，由此分离所含展示蛋白包含可结合预先选定的抗原的结合位点的一种或多种噬菌粒。
美国专利号5,702,892描述了用于产生多样性抗体文库并筛选期望结合特异性的这种方法的另一种形式，本文收入作为参考。在这种方法中只采用重链序列，对重链序列中编码CDRI或CDRIII高变区的所有核苷酸位置进行随机化，并独立于任何生物学过程而产生CDR遗传变异性。
在这种方法中，对两个文库进行改造，即对重链基因结构框架内的寡核苷酸基序进行遗传改组。通过CDRI或CDRIII的随机突变，重建重链基因高变区，产生高度多样化序列集合。由突变基因序列集合编码的重链蛋白有可能具有免疫球蛋白的所有结合特征，同时只需要两条免疫球蛋白链之一即可。
具体而言，在不存在免疫球蛋白轻链蛋白的情况中实践这种方法。将展示经修饰的重链蛋白的噬菌体文库与已固定化的配体一起温育，来选择编码可特异性结合固定化配体的重组蛋白质的克隆。然后将结合的噬菌体与固定化配体解离，通过在细菌宿主细胞中的生长进行扩增。扩增表达不同重组蛋白质的各个病毒斑，然后可以对各个克隆测定结合活性。
E2.来自人淋巴细胞的抗体
抗磷脂抗体存在于人种群中。不过，这些抗体通常与疾病相关，本发明中应优选避免使用它们。另一方面，来自健康受试者的人淋巴细胞可适于作为起始材料用于产生本发明中所用的抗体。
体外免疫或抗原刺激也可以用于产生本发明的人抗体。这些技术可以用于刺激来自正常、健康个体的外周血淋巴细胞，其中仅仅需要用阴离子磷脂和氨基磷脂对抗体生成细胞进行体外刺激。
这种“体外免疫”涉及通常在淋巴细胞混和群(混和淋巴细胞培养物，MLC)内进行的未免疫B淋巴细胞的抗原特异性激活。体外免疫还可以由B细胞生长和分化因子及淋巴因子获得支持。由这些方法产生的抗体常常是IgM抗体(Borrebaeck等人，1986；本文收入作为参考)。
美国专利号5,681,729描述了能够获得主要产生IgG或IgA抗体的人淋巴细胞的另一种方法，本文收入作为参考。一般地，这种方法涉及将人淋巴细胞移植到免疫缺陷型动物中，使得人淋巴细胞“参与”该动物体；用期望抗原免疫动物，生成可产生对抗原具有特异性的抗体的人淋巴细胞；并由动物回收产生该抗体的人淋巴细胞。由此产生的人淋巴细胞可以用于产生单克隆抗体：即使产生抗体的人淋巴细胞永生化，克隆获得的永生化、人起源、产生抗体的淋巴细胞，并由克隆的永生化人起源淋巴细胞回收对期望抗原具有特异性的单克隆抗体。
在这种技术中可采用的免疫缺陷型动物是那些在移植了人淋巴细胞后不展示排异的动物。这些动物可以通过物理的、化学的、或生物学的处理而人工制备。可以采用任何免疫缺陷型动物。人淋巴细胞可以由人外周血、脾、淋巴结、扁桃体等等获得。
动物中移植的人淋巴细胞的“参与”可以通过仅仅对动物施用人淋巴细胞来实现。施用途径不限于且可以是例如皮下、静脉内、或腹膜内。人淋巴细胞的剂量不受限制，通常可以是每只动物106-108个淋巴细胞。然后用期望的抗原免疫免疫缺陷型动物。
免疫后，通过任何传统方法由血液、脾、淋巴结、或其它淋巴组织回收人淋巴细胞。例如，单核细胞可以通过Ficoll-Hypaque(比重：1.077)离心法进行分离，并通过塑料盘吸附法除去单核细胞。来自免疫缺陷型动物的污染细胞可以通过使用对该动物细胞具有特异性的抗血清而除去。可以通过例如用该免疫缺陷型动物的脾细胞免疫另一种不同动物并由该不同的经免疫动物回收血清来获得抗血清。可以在任何阶段进行抗血清处理。也可以通过采用在细胞表面表达作为标记物的人免疫球蛋白的免疫学方法来回收人淋巴细胞。
通过这些方法，可以获得主要产生对一种或多种选定阴离子磷脂和氨基磷脂具有特异性的IgG和IgA抗体的人淋巴细胞。然后通过永生化、选择、细胞培养、和抗体生成，由人淋巴细胞获得单克隆抗体。
E3.含人抗体文库的转基因小鼠
重组技术现在可用于制备抗体。除了上文公开的组合型免疫球蛋白噬菌体表达文库，另一种分子克隆方法是由含人抗体文库的转基因小鼠制备抗体。美国专利号5,545,807描述了这些技术，本文收入作为参考。
在最常用的方面，这些方法涉及产生在其种系中插入了遗传物质的转基因动物，所述遗传物质编码至少部分的人起源免疫球蛋白，或者可以重排而编码免疫球蛋白集合。可以由人来源产生所述插入的遗传物质，或者可以人工合成。遗传物质可以编码至少部分的已知免疫球蛋白，或者可以经修饰而编码至少部分的经改变免疫球蛋白。
插入的遗传物质在转基因动物中表达，导致生成至少部分由插入的人免疫球蛋白遗传物质衍生的免疫球蛋白。发现遗传物质在转基因动物中发生重排，使得可以产生部分由插入的遗传物质衍生的免疫球蛋白集合，甚至有时插入的遗传物质以错误位置或错误几何学掺入种系也如此。
可以以DNA的形式将插入的遗传物质克隆到原核载体中，诸如质粒和/或粘粒。使用酵母人工染色体载体(Burke等人，1987；本文收入作为参考)，或者通过导入染色体片段(Richer和Lo，1989；本文收入作为参考)，可以插入较大的DNA片段。可以以传统方式将插入的遗传物质导入宿主，例如通过注射或其它程序引入受精卵或胚胎干细胞。
在优选方面，可利用最初不携带编码免疫球蛋白恒定区的遗传物质的宿主动物，使得产生的转基因动物在产生免疫球蛋白时将只使用所插入的人遗传物质。这可以通过使用天然存在的缺乏相关遗传物质的突变宿主，或者通过人为制备突变体(如在细胞系中产生最终除去了相关遗传物质的宿主)来实现。
当宿主动物携带编码免疫球蛋白恒定区的遗传物质时，转基因动物将携带天然存在的遗传物质和所插入的遗传物质，并将产生由天然存在的遗传物质、插入的遗传物质、和这两种遗传物质的混和物衍生的免疫球蛋白。在这种情况中，可以通过筛选由转基因动物衍生的杂交瘤来获得期望的免疫球蛋白，如利用抗体基因表达的等位基因排斥或差异染色体丢失现象。
一旦制备了合适的转基因动物，即可简单地用期望免疫原免疫动物。根据插入物质的性质，动物可能产生嵌合免疫球蛋白，如混和小鼠/人起源的免疫球蛋白，其中外源遗传物质只编码免疫球蛋白一部分；或者，动物可能产生完全外来的免疫球蛋白，如完全人起源的免疫球蛋白，其中外源遗传物质编码整个免疫球蛋白。
可以由免疫后的转基因动物产生多克隆抗血清。可以由动物获得免疫球蛋白生成细胞来产生感兴趣的免疫球蛋白。优选由转基因动物产生单克隆抗体，如融合来自该动物的脾细胞与骨髓瘤细胞，并筛选产生的杂交瘤以选择产生期望抗体的杂交瘤。本文描述了用于这些过程的适用技术。
在另一种方法中，可以以这样一种方式将遗传物质掺入动物，使得在体液(诸如血清或动物的外部分泌物，诸如乳汁、初乳、或唾液)中产生期望抗体。例如，在体外将编码至少部分的人免疫球蛋白的遗传物质插入编码乳蛋白的哺乳动物基因，然后通过如注射将该基因导入哺乳动物受精卵，由此卵可能发育成产生乳汁的成年雌性哺乳动物，乳汁中包含至少部分由插入的人免疫球蛋白遗传物质衍生的免疫球蛋白。然后可以由乳汁收获期望抗体。本领域技术人员知道用于进行这些过程的适用技术。
通常采用上述转基因动物来产生单一同种型的人抗体，更具体的说是B细胞成熟必需的同种型，诸如IgM，可能还有IgD。用于产生人抗体的另一种优选方法是使用美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、和5,770,429(本文收入作为参考)中描述的技术，其中转基因动物据描述能够由B细胞发育需要的同种型转变成其它同种型。
在B淋巴细胞的发育过程中，细胞最初产生IgM，其结合特异性由有效重排的VH和VL区决定。随后，每个B细胞及其后代合成具有相同L和H链V区的抗体，但是它们可能转变H链的同种型。μ或δ恒定区的使用很大程度上是通过改变剪接决定的，使得IgM和IgD在单个细胞中共表达。其它重链同种型(γ、α、和ε)只在基因重排事件删除了Cμ和Cδ外显子后天然表达。这一基因重排过程，称为同种型转变，通常通过位于紧邻每个重链基因(除了δ)上游的所谓转变片段之间的重组而发生。各个转变片段的长度为2-10kb，主要由短重复序列组成。
由于这些原因，优选转基因在用来进行同种型转变的每个转变区上游大约1-2kb内掺入转录调控序列。这些转录调控序列优选包括启动子和增强子元件，更优选包括与转变区天然相连(即存在于种系结构中)的5’侧翼(即上游)区。虽然来自一个转变区的5’侧翼区可以可操作连接用于转基因构建的不同转变区，但是在一些实施方案中，优选转基因构建物中掺入的每个转变区具有在天然种系结构中紧接着上游的5’侧翼区。涉及免疫球蛋白转变区序列的序列信息是知道的(Mills等人，1990；Sideras等人，1989；本文收入作为参考)。
在美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、和5,770,429描述的方法中，转基因动物所含的人免疫球蛋白转基因在B细胞发育的整个途径中正确发挥功能，导致同种型转变。因此，在这种方法中，构建这些转基因来产生同种型转变和下列一项或多项：(1)高水平和细胞类型特异性表达，(2)功能性基因重排，(3)等位基因排斥的应答和激活，(4)足够大的初级库的表达，(5)信号转导，(6)体细胞超突变，和(7)免疫应答过程中转基因抗体基因座的显性化。
对转基因功能的重要要求是产生的初级抗体库的多样性足以触发针对广泛抗原的再次免疫应答。重排的重链基因包含信号肽外显子、可变区外显子、和一列串联的多结构域恒定区(其中的每一个都由几个外显子编码)。每个恒定区基因编码不同种类免疫球蛋白的恒定部分。在B细胞发育过程中，删除了V区近端恒定区，导致重链新类型的表达。对于每类重链，RNA剪接的不同模式产生跨膜的和分泌的免疫球蛋白二者。
人重链基因座包含大约200个V基因片段，跨越2Mb；大约30个D基因片段，跨越大约40kb；6个J片段，群集于大约3kb内；和9个恒定区基因片段，跨越大约300kb。整个基因座在14号染色体长臂远端部分跨越大约2.5Mb。包含所有6种已知VH家族成员，D和J基因片段，以及μ、δ、γ3、γ1、和α1恒定区的重链转基因片段是知道的(Berman等人，1988；本文收入作为参考)。相似地构建了包含来自人轻链基因座的所有必需基因片段和调控序列的基因组片段。
成功重排的免疫球蛋白重链和轻链转基因的表达常常通过在转基因非人动物中抑制内源免疫球蛋白基因的重排而具有显性效果。然而，在某些实施方案中，期望达到内源Ig基因座的完全灭活，使得不能通过例如转基因与内源Ig序列之间的转变而形成包含人可变区和非人(如鼠)恒定区的杂合免疫球蛋白链。使用胚胎干细胞技术和同源重组，可以容易的消除内源免疫球蛋白库。例外，可以使用多种技术(诸如反义技术)来实现内源Ig基因的抑制。
在本发明的其它方面，可能期望产生反式转变的(trans-switched)免疫球蛋白。包含这些嵌合的反式转变免疫球蛋白的抗体可用于期望具有非人(如鼠)恒定区的多种应用中，如用于在宿主中保留效应物功能。鼠恒定区的存在相对于人恒定区能够提供优势，例如提供鼠效应物功能(如ADCC、鼠补体固定)，从而能够在小鼠疾病模型中检验这种嵌合抗体。在动物检验后，可以通过如由来源(杂交瘤克隆)进行PCR扩增或cDNA克隆来分离人可变区编码序列，并剪接成编码期望的人恒定区的序列，编码更适合于人治疗性用途的人序列抗体。
E4.人源化抗体(humanized antibody)
人抗体用于人的治疗通常具有至少3个潜在优势。第一，因为效应物部分是人的，所以它与人免疫系统其它部分的相互作用可能更好，如通过依赖补体的细胞毒性(CDC)或依赖抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)更有效的破坏靶细胞。第二，人免疫系统不会将抗体识别成外来物质。第三，人体循环中的半衰期将与天然产生的人抗体相似，使得所需剂量较小，给药频率较低。
本文提供了用于制备人抗体的多种方法。除了人抗体，“人源化”抗体也具有许多优势。“人源化”抗体通常是来自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或其它物种并包含人恒定区和/或可变区结构域或特定变化的嵌合或突变单克隆抗体。本领域技术人员众所周知用于产生所谓的“人源化”抗VEGF抗体的技术。
人源化抗体也享有上述优势。第一，效应物部分仍是人的。第二，人免疫系统不会将框架或恒定区识别成外来的，因此针对这种注射抗体的抗体应答应当比针对完全外来的小鼠抗体的低。第三，与注射的小鼠抗体相反，注射的人源化抗体的半衰期与天然产生的人抗体大概更相似，也使得所需剂量较小且频率较低。
已经描述了用于产生人源化抗体的大量方法。可以利用通过二硫键结合在一起的抗体结构域的受控重排，形成新的人造蛋白质分子或“嵌合”抗体(Konieczny等人，1981；本文收入作为参考)。重组DNA技术也可以用于构建编码小鼠抗体轻链和重链可变结构域与人抗体轻链和重链恒定结构域的DNA序列之间的融合基因(Morrison等人，1984；本文收入作为参考)。
可以通过分子方法将编码鼠单克隆抗体抗原结合部分或互补决定区(CDR)的DNA序列移植到编码人抗体重链和轻链框架的DNA序列中(Jones等，1986；Riechmann等人，1988；各自引入本文作为参考)。表达的重组产物称为“重塑(reshaped)”或人源化抗体，其包含人抗体轻链和重链的框架和鼠单克隆抗体的抗原识别部分CDR。
美国专利号5,639,641描述了用于产生人源化抗体的另一种方法，本文收入作为参考。这种方法经重新铺面(resurfacing)提供了因可变区展现人表面而具有改进的治疗功效的人源化啮齿类抗体。在这种方法中：(1)产生抗体重链和轻链可变区群的位置比对，给出一组重链和轻链可变区框架表面暴露位置，其中所有可变区的比对位置至少大约98％是相同的；(2)对啮齿类抗体(或其片段)确定一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基；(3)鉴定与该组啮齿类表面暴露氨基酸残基最近似相同的一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基；(4)用步骤(3)中鉴定的重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基组替代步骤(2)中确定的重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基组，不作改变的是距啮齿类抗体互补决定区的任何残基的任何原子5???以内的那些氨基酸残基；和(5)产生具有结合特异性的人源化啮齿类抗体。
美国专利号5,693,762、5,693,761、5,585,089、和5,530,101描述了用于产生人源化抗体的类似方法，本文收入作为参考。这些方法涉及产生具有来自供者免疫球蛋白的一个或多个互补决定区(CDR)和可能的额外氨基酸以及来自人受者免疫球蛋白的框架区的人源化免疫球蛋白。每一条人源化免疫球蛋白链除了CDR之外，通常还包含来自能够与该CDR相互作用而发挥结合亲和力的供者免疫球蛋白框架的氨基酸，诸如与免疫球蛋白供者内CDR紧邻或者据分子模拟预测相距大约
Figure C03816751D0082135831QIETU
以内的一个或多个氨基酸。重链和轻链都可以通过使用美国专利号5,693,762、5,693,761、5,585,089、和5,530,101(本文收入作为参考)描述的多种位置标准中的任一项、任意组合、或所有标准来进行设计。当组合形成完整抗体时，人源化免疫球蛋白在人中基本上没有免疫原性，并基本上保留与免疫球蛋白供者相同的针对原始抗原的亲和力。
美国专利号5,565,332和5,733,743描述了用于产生人源化抗体的另一种方法，本文收入作为参考。这种方法将人源化抗体的概念与也在本文详细描述的噬菌粒文库结合起来。一般地说，这种方法利用来自针对感兴趣抗原的抗体或抗体群的抗原结合位点的序列。由此，对于单一的啮齿类抗体，可以将包含抗体中部分抗原结合位点的序列与能够在组合时产生完整抗原结合位点的人抗体序列多样性文库联合起来。
由这一方法产生的抗原结合位点与由CDR移植产生的不同，其中只有原始啮齿类抗体的部分序列有可能以相似方式接触抗原。选择的人序列有可能在序列和与抗原的接触方面与最初的结合位点不同。然而，由部分原始序列与抗原的结合和抗原及其抗原结合位点的形状造成的约束，有可能驱动人序列与抗原的相同区域或表位的新接触。这一过程因此称为“表位盖印选择”(epitope imprinted selection，EIS)。
由动物抗体开始，一种方法可以选择出对部分人源抗体。这些抗体可能与人抗体在序列方面足够相似，可直接或在改变少数关键残基后用于治疗。可以通过各个残基的定点诱变或通过整个环的CDR移植来取代那些与人序列残基不同的残基，从而将选定抗体的啮齿类成分与人序列残基之间的序列差异降至最低。然而，也可以产生完全为人序列的抗体。EIS由此提供了用于产生可相应地与动物或部分人源抗体结合相同表位的部分人源或完全人源抗体的方法。在EIS中，可以将抗体片段库展示在丝状噬菌体表面，并通过噬菌体与抗原的结合来选择具有抗原结合活性的片段的编码基因。
美国专利号5,750,078、5,502,167、5,705,154、5,770,403、5,698,417、5,693,493、5,558,864、4,935,496、和4,816,567描述了在本发明中试图用于使抗体人源化的其它方法，本文收入作为参考。
E5.经PCRTM的诱变
定点诱变是一种有用的技术，可通过其DNA的特异性诱变而用于制备各种抗体。通过将一个或多个核苷酸序列变化导入DNA，本技术还能够容易的用于制备并检验体现了一个或多个上述考虑的序列变体。
虽然有许多方法适用于诱变，但是目前通常优选使用聚合酶链反应(PCRTM)。此技术提供了快速、有效的将期望突变导入给定DNA序列中的方法。下文具体描述了如何使用PCRTM将点突变导入序列中，这可以用于改变由给定序列编码的氨基酸。此方法经改动也适于将限制性酶切位点导入DNA分子。
在此方法中，可将合成的寡核苷酸设计成能在扩增片段的一端掺入点突变。PCRTM之后，通过用Klenow片段处理使扩增片段成为平端，然后连接平端化片段并亚克隆至载体中以便于序列分析。
为了制备期望诱变的模板DNA，可使用待突变区侧翼的限制性位点将DNA亚克隆至高拷贝数的载体，如pUC19中。然后使用质粒微量制备法制备模板DNA。使用自动合成仪合成适当的寡核苷酸引物，该引物基于亲本序列，但含有期望的点突变，其5’端侧翼是限制性酶位点。通常要求引物与模板DNA有大约15个碱基是同源的。可通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化引物，但用于PCRTM中时，并不绝对需要这么做。然后，应使寡核苷酸的5’末端磷酸化。
应使用含有期望点突变的寡核苷酸引物，通过PCRTM扩增模板DNA。扩增缓冲液中的MgCl2浓度通常为大约15mM。通常应如下进行大约20-25轮PCRTM循环：95℃变性35秒；50℃杂交2分钟；72℃延伸2分钟。PCRTM通常包括于72℃最后一次延伸循环约10分钟。在最后的延伸步骤之后，应在反应混合物中加入约5个单位的Klenow片段，于约30℃再保温15分钟。需要有Klenow片段的外切核酸酶活性，以使末端成为平端并适于平端克隆。
通常通过非变性的琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳分析得到的反应混合物，以证实扩增已产生预定的产物。可通过除去大多数矿物油，用氯仿抽提以除去残留的油，用经缓冲的酚抽提，然后用100％乙醇沉淀浓缩来处理反应混合物。接着，用能够切割寡核苷酸侧翼序列的限制性酶消化大约一半的扩增片段。在低融点琼脂糖凝胶上纯化经消化的片段。
为了亚克隆片段和检查点突变，可通过平端连接将两种扩增片段亚克隆至经适当消化的载体中。然后用于转化大肠杆菌，随后使用微量制备法从中制备质粒DNA。通过DNA测序分析质粒DNA中的扩增部分以确认产生了正确的点突变。这一点至关重要，因为TaqDNA聚合酶会将额外的突变导入DNA片段。
使用依次PCRTM步骤也可实现点突变的导入。在此程序中，使包含突变的两种片段互相退火，并通过相互引发的合成而延伸。然后通过第二个PCRTM步骤扩增此片段，从而避免了上述方案中需要的平端连接。在此方法中，如上所述进行模板DNA的制备、寡核苷酸引物的产生、和第一次PCRTM扩增。然而，在此方法中，选定的寡核苷酸与模板DNA应有大约15-大约20个碱基的一段序列是同源的，它们互相之间还必须重叠大约10个碱基或更多。
在第二次PCRTM扩增中，可使用各个扩增片段和各个侧翼序列引物，并使用上述条件进行大约20-25轮PCRTM循环。可使用上述步骤再次亚克隆片段并检查点突变是否正确。
在使用上述任一方法时，通常优选通过扩增尽可能小的片段来导入突变。当然，也应仔细考虑如寡核苷酸的解链温度这样的参数，该参数通常受寡核苷酸的GC含量和长度的影响。本领域技术人员众所周知这些方法的实施及其优化(必要时)，多种出版物进一步描述了有关内容，如《分子生物学现行方案》(Current Protocol in Molecular Biology)(1995，本文收入作为参考)。
当进行定点诱变时，可以采用表A作为参考。
表A
E6.抗体片段和衍生物
不管针对阴离子或氨基磷脂的原始抗体的来源是什么，完整的抗体、抗体多聚体、或抗体的多种功能性抗原结合区之任一种都可用于本发明。例示性功能区包括抗体的scFv、Fv、Fab’、Fab、F(ab’)2片段。本领域技术人员众所周知用于制备这些构建物的技术，本文进一步例示。
抗体构建物的选择可能受到多种因素的影响。例如，肾内完整抗体的积极再吸附能够延长半衰期，这是免疫球蛋白Fc片段的特性。由此预计基于IgG的抗体展示的血液清除率比其Fab’对应物低。然而，基于Fab’的组合物通常展示更好的组织渗透能力。
可以由完整免疫球蛋白经非特异性硫醇蛋白酶—木瓜蛋白酶进行蛋白水解获得抗体片段。木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab片段”，每个片段含有一个抗原结合位点；和一个残余的“Fc片段”。
首先必需用半胱氨酸、2-巯基乙醇、或二硫苏糖醇还原活性位点中的巯基而激活木瓜蛋白酶。应当用EDTA(2mM)的螯合作用除去酶原液中的重金属，以确保最大酶活性。通常以1:100的重量比混和酶和底物。温育后，可以通过碘乙酰胺对巯基的不可逆烷化或仅通过透析来终止反应。应当通过SDS-PAGE来监控消化是否完全，并通过蛋白A-Sepharose或离子交换层析来分离各种片段。
用于由兔和人来源的IgG制备F(ab’)2片段的常用程序包括用胃蛋白酶进行有限的蛋白水解。反应条件是，100倍(w/w)抗体过量，在pH4.5的醋酸盐缓冲液中，37℃，这说明抗体是在重链间二硫键的C端被切割。小鼠IgG的消化速率随亚类而变化，要想以高产率得到活性F(ab’)2片段，同时又不存在一些未消化的或完全降解的IgG可能是比较困难的。具体而言，IgG2b易被完全降解。其它亚类要求不同的温育条件以产生最佳结果，这些本领域都是知道的。
胃蛋白酶对完整抗体的处理产生具有两个抗原结合位点、仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。用胃蛋白酶消化大鼠IgG要求的条件包括在0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)中透析，然后与1％(w/w)胃蛋白酶温育4小时；如果首先在0.1M甲酸盐缓冲液(pH2.8)中于4℃透析16小时，然后换成醋酸盐缓冲液，则可以改进IgG1和IgG2a的消化。将IgG2b在含葡萄球菌V8蛋白酶(3％w/w)的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.8)中于37℃温育4小时，将给出更一致的结果。
Fab片段也包含轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同在于在重链CH1结构域的羧基末端多几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)2抗体片段最初以成对的Fab’片段产生，相互之间有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
“Fv”片段是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区包含一个重链可变区与一个轻链可变区紧密共价相连的二聚体。正是在这个构象中，每个可变结构域的3个高变区相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合位点。总而言之，6个高变区赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单一可变结构域(或只包含3个具有抗原特异性的高变区的半个Fv)也能够识别并结合抗原，只是亲和力比完整结合位点低。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段(也称作“单链”)包含抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于一条多肽链中。通常，Fv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原的所需结构。
为了进一步补充关于抗体的功能性抗原结合区(包括scFv、Fv、Fab’、Fab、和F(ab’)2片段)的制备及使用的教导，本文特别收入下列专利作为参考：美国专利5,855,866；5,877,289；5,965,132；6,093,399，6,261,535和6,004,555。为了进一步描述并教导抗体可变区、高变区、和互补决定区(CDR)的制备，本文还收入WO 98/45331作为参考。此外，本发明范围内scFv构建体的成功产生详述于实施例XIV。
“二体(diabody)”是包含两个抗原结合位点的小抗体片段，各片段包含在同一多肽链(VH-VL)中相连的重链可变结构域(VH)与轻链可变结构域(VL)。通过在同一条链上两个结构域之间使用短得不能配对的接头，可迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。EP 404,097和WO 93/11161(本文特别收入作为参考)描述了二体。如Zapata等人(1995，本文收入作为参考)所述，抑或双特异性抑或单一特异性的“线性抗体”，包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，形成一对抗原结合区。
在使用伴随组织渗透优势的抗体Fab’或抗原结合片段时，可以通过修饰片段而衍生得到额外优势，即延长半衰期。可以采用多种技术，诸如对抗体分子自身的操作或修饰，以及与惰性载体的缀合。对于仅仅为了延长半衰期而非为了靶向投递药剂而进行的缀合，应当小心选择Fab’和其它片段以渗透组织。尽管如此，本发明涵盖了与非蛋白质聚合物的缀合，诸如PEG等等。
因此，除缀合以外的其它修饰是基于修饰抗体片段的结构从而使其更稳定和/或降低体内代谢速率。用于这些修饰的一种机制是使用D-氨基酸来取代L-氨基酸。本领域普通技术人员将理解，导入这些修饰后需要对产生的分子进行严格的检验以确保它仍然保留了期望的生物学特性。其它稳定修饰包括在N末端或C末端之一或二者添加通常用于延长生物学分子半衰期的稳定化部分。作为范例，可以通过酰化或胺化来修饰末端。
用于本发明的适度缀合型修饰包括在抗体片段中掺入挽救型(salvage)受体结合表位。用于实现该目的的技术包括抗体片段适当区域的突变或将表位作为肽标签附着于抗体片段。为了进一步例示这些技术，本文特别收入WO 96/32478作为参考。挽救型受体结合表位通常是由Fc结构域的一个或两个环转移至抗体片段上类似位置的3个或更多氨基酸的区域。为了用于本发明，本文收入WO 98/45331的挽救型受体结合表位作为参考。
F.与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的免疫缀合物
本发明发明者早期开发了结合氨基磷脂的一系列免疫缀合物用于靶向肿瘤血管系统(美国专利6,312,694，特别收编于此作为参考)。这些药剂利用诸如膜联蛋白和激肽原等结合氨基磷脂的蛋白质和针对诸如PS和PE等的氨基磷脂的抗体来投递附着的治疗剂至肿瘤和肿瘤内血管结构。本发明现在提供了选定的具有改良特性的抗PS抗体，诸如3G4(ATCC 4545)和9D2，这些抗体和竞争性抗体目前能用作免疫缀合物的抗体部分。
除了利用结合氨基磷脂的血管靶向剂外(美国专利6,312,694)本发明中关于阴离子磷脂以及氨基磷脂是肿瘤血管结构中稳定且可靶向的实体这一发现使一系列新的肿瘤血管靶向剂的利用成为可能。在较早期针对氨基磷脂的工作中并未提及的新化合物利用针对阴离子磷脂的抗体投递毒素、细胞因子、凝血剂和其它治疗剂至肿瘤和肿瘤内血管结构中上调的阴离子磷处。正如上文有关裸露抗体的详述，本发明这些方面的开发需要产生对不同磷脂、阴离子磷脂和氨基磷脂具有强特异性的生物学制剂，尤其是抗体。
因为本发明显示的，诸如PS、PE、PI、PA和PG等阴离子和氨基磷脂，最优选PS和PE，是用于抗病毒治疗的安全有效的靶目标，现在可有利地将能结合这些组分(尤其是PS和PE)的抗体和肽与一系列已知的抗病毒剂相连接。这些抗病毒缀合物包括基于肽和基于抗体二者的缀合物，后者可被称为抗病毒免疫缀合物或“免疫杀病毒剂”。
在本发明的这些方面中，任何抗阴离子磷脂抗体都可用于制备免疫缀合物、免疫毒素或凝血配体，优选抗体，诸如第二代抗体，尤其是9D2样和3G4样抗体，它们具有优越的阴离子磷脂结合模式。用于所说免疫缀合物中的药剂优选包括抗细胞药剂或细胞毒性剂、凝血剂(凝血因子)、细胞因子、放射治疗剂、抗血管发生剂、诱导凋亡的药剂、抗微管蛋白药物和抗病毒剂(和PE结合肽，诸如耐久霉素衍生物，正如本文所详述的)。在抗病毒免疫缀合物中，无需使用本文所述的第二代抗体，尽管这些抗体当然是可以应用的。因此任何针对氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体都可以连接抗病毒剂从而形成本发明的抗病毒免疫缀合物或免疫杀病毒剂。
F1.抗细胞剂和细胞毒性剂
在某些应用中，治疗剂是细胞毒性剂或药理活性剂，尤其是能杀死细胞(特别是肿瘤内皮细胞或肿瘤细胞)或者抑制其生长或分裂的细胞毒性剂、细胞抑制剂、或者抗细胞剂。通常，本发明的这些方面考虑使用能缀合抗阴离子磷脂抗体(优选基于9D2的抗体或基于3G4的抗体)并以活性形式递送至靶内皮的任何药理活性剂。
抗细胞药剂的范例包括化疗剂，以及细胞毒素。可以使用的化疗剂包括：激素，诸如类固醇；抗代谢物，诸如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、或氨基喋呤；蒽环霉素；丝裂霉素C；长春花生物碱；地美可辛(demecolcine)；依托泊苷(etoposide)；普卡霉素；抗肿瘤烷化药剂，诸如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。其它实施方案可以包括诸如细胞因子等药剂。基本上可以使用任何抗细胞药剂，条件是它能够以某种方式成功的缀合或连接抗体从而能够在靶向的细胞(如内皮细胞)位点处向血液成分进行靶向、内在化、释放、和/或呈递。
可能会有这样的情况，比如靶抗原没有通过与有毒化合物的有效去毒一致的途径发生内在化，需要靶向化疗剂，诸如抗肿瘤药物、细胞因子、抗代谢物、烷化剂、激素、等等。目前多种化疗剂和其它药理活性剂已经成功的缀合于抗体，并显示药学功能，包括多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素、氨甲喋呤、长春花碱、新制癌菌素(neocarzinostatin)、大分子霉素、三乙烯亚胺苯醌、和α-鹅膏蕈碱。
在其它情况中，可以通过使用DNA合成抑制剂来消除来自基于细胞毒素疗法的任何潜在副作用，诸如道诺霉素、多柔比星(doxorubicin)、阿霉素等等。因此这些药剂是用于本发明某些方面的抗细胞药剂的优选范例。至于抑制细胞的药剂，这些化合物通常扰乱靶细胞的正常细胞周期，优选使得细胞退出细胞周期。
已知多种细胞毒性剂可以缀合于抗阴离子磷脂抗体(优选基于9D2的抗体或基于3G4的抗体)。范例包括大量有用的植物、真菌、或细菌衍生毒素，例如包括各种A链毒素，特别是蓖麻毒蛋白A链；核糖体灭活蛋白，诸如皂草素或gelonin；α-帚曲菌素；曲霉素；局限曲霉菌素；核糖核酸酶，诸如胎盘核糖核酸酶；白喉毒素；和假单胞菌外毒素等等。
在毒素中，优选使用gelonin和蓖麻毒蛋白A链。利用gelonin作为可与标记结合的免疫缀合物的效应物或毒素部分在美国专利6,051,230(特别收编于此作为参考)以及美国专利6,451,312(它特别涉及与作为靶向剂的VEGF连接的gelonin)中有描述，其中所述标记是血管化肿瘤的肿瘤内血管中表达的，或易于接近而结合它，吸附或定位在其上。
对于篦麻毒素A链来说，更优选的毒素部分常常是经处理而修饰或除去碳水化合物残基的蓖麻毒蛋白A链，即所谓的“脱糖基A链”(dgA)。脱糖基蓖麻毒蛋白A链是优选的，因为它极有效力、半衰期较长，而且进行临床等级和规模的制造在经济上是可行的。
从制药学的立场出发，可能希望采用尽可能小的分子而又提供适当的生物学应答。由此可能希望采用提供适当的抗细胞应答的较小A链肽。为了这个目标，已经发现蓖麻毒蛋白A链可以通过Nagarase(Sigama)除去30个N末端氨基酸而“截短”，但仍保留适当的毒素活性。建议需要时可以将这种截短的A链用于本发明的缀合物中。
或者，可发现对毒素A链部分应用重组DNA技术可以提供本发明的额外好处。实现了有生物学活性的蓖麻毒蛋白A链的克隆和表达后，现在有可能鉴定并制备仍展示适当毒素活性的更小的肽或变体肽。此外，蓖麻毒蛋白A链已被克隆的事实使得能够应用定点诱变，由此容易的制备并筛选A链衍生肽，获得可用于本发明的其它有用部分。
F2.细胞因子
细胞因子和趋化因子是可与本发明抗体连接的药剂的实例。可以使用一系列的细胞因子，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-13、TGF-β、M-CSF、G-CSF、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、IFN-α、INF-β。更优选的细胞因子包括IL-1α、IL-1β、IL一2、IL-6、IL-10、GM-CSF、IFNγ、单核细胞化学吸引蛋白-1(MCP-1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)和C-反应蛋白(CRP)等等。尤其优选的例子是TNFα、TNFα诱导物和IL-12。
TNFα增加了血管的通透性。此药剂预计可用于附着本发明的抗体，尤其是在所产生的免疫缀合物用于治疗癌症的组合疗法中时。抗体将投递附着的TNFα至肿瘤环境中，且在肿瘤中引起的血管通透性的增强将促进第二种抗癌剂渗透入肿瘤中，因此扩大了全面的抗肿瘤效果。尤其考虑将scFv构建体用于所说的实施方案中。这在一定程度上是因为TNFα是作为三聚体发挥功能，而scFv构建体能够方便的三聚体化。
例如，IL-12可与抗体连接并用于重新指导宿主防御系统，从而攻击肿瘤血管。在使用IL-12时，scFv形式的抗原结合区可能是优选的。趋化因子LEC(肝脏表达的趋化因子，也称为NCC-4、HCC-4或LMC)是另一种优选的组分(Giovarelli等，2000)。LEC对于树突细胞、单核细胞、T细胞、NK细胞和嗜中性粒细胞是趋化性的，因此能增强宿主介导的抗肿瘤反应。
F3.凝血因子
抗阴离子磷脂抗体或基于本发明优选的9D2和3G4(ATCC 4545)抗体的第二代抗体可与能直接或间接刺激凝血的组分联接形成凝血配体。为了进一步描述凝血剂与抗体的操作性联接形成凝血配体，将美国专利6,093,399，6,004,555，5,877,289和6,036,955特别收编于此作为参考。
本发明的抗体可以直接连接凝血剂或凝血因子，或者可以连接可结合而后释放凝血剂或凝血因子的第二种结合区。如本文所用，术语“凝血剂”和“凝血因子”都用于指在适当条件下，优选当到达特定体内环境(诸如肿瘤血管结构)时，能够直接或间接刺激凝血的成分。
优选的凝血因子是组织因子组合物，诸如截短的TF(tTF)、二聚体、多聚体、和突变TF分子。“截短的TF”(tTF)指通过除去足够多的实现膜结合特性改变的氨基酸序列从而变成膜结合缺陷型的TF构建物。本文中的“足量”指最初足以使TF分子进入膜或介导TF蛋白质的功能性膜结合的跨膜氨基酸序列的量。通过除去“足够量的跨膜序列”产生了截短的组织因子蛋白质或多肽，其结合磷脂膜的能力是缺陷的，使得该蛋白质是不显著结合磷脂膜的基本上可溶的蛋白质。因此，截短的TF在标准TF测定法中基本上不能够将因子VII转变成因子VIIa，但是仍然保留所谓的催化活性，包括在存在因子VIIa时激活因子X。
美国专利5,504,067、6,156,321、6,132,729和6,132,730(本文特别收入作为参考)进一步描述了这些截短的组织因子蛋白质。优选用于本发明这些方面的组织因子通常不含该蛋白质的跨膜和胞质区(第220-263位氨基酸)。但是，也不需要将截短的TF分子局限于长度恰好是219个氨基酸的分子。
二聚体的组织因子组合物也是有用的。可以以二聚体的形式制备任何截短的、突变的、或其它组织因子构建物以用于本发明。本领域普通技术人员可以理解，通过分子生物学和重组表达的标准技术，在同一读码框中制备两个编码区并由表达载体进行表达，可以制备这些TF二聚体。同样，可以将各种化学缀合技术用于制备TF二聚体。可以在缀合前对各TF单体进行衍生化。本领域技术人员清楚的知道所有这些技术。
如果需要，可以经生物学可释放键连接组织因子二聚体或多聚体，诸如可选择性切割的接头或氨基酸序列。例如，可使用包含酶切割位点的肽接头，所述酶优先定位于肿瘤环境或在肿瘤环境内有活性。这些肽接头的例示性形式是供尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金属蛋白酶(诸如胶原酶、明胶酶、或溶基质素)切割的肽接头。
在某些实施方案中，组织因子二聚体还可以包含受阻的疏水性膜插入部分，以便日后促进组织因子与磷脂酶的功能性联合，但是这只发生于某些特定条件下。正如关于截短的组织因子的内容中所述，疏水性膜联合序列通常是由于其疏水本质可驱动与磷脂环境的联合的氨基酸段。同样，脂肪酸可以用于提供潜在的膜插入部分。
这些膜插入序列可以位于TF分子的N末端或C末端，或者通常附着于该分子的任何其它位点，只要它们的附着不阻碍TF构建物的功能特性即可。受阻插入部分的意图是在TF构建物定位于肿瘤环境前保持无功能，并使得疏水性附着物能够接近并进一步促进与膜的物理学联合。此外，预计生物学可释放键和可选择性切割序列在这方面特别有用，其中所述键或序列只在定位于肿瘤环境内并暴露于特定酶或其它生物活性分子时才受到切割或修饰。
在其它实施方案中，tTF构建物可以是多聚体。在此内容中，“多聚体构建物”包含3个或更多组织因子构建物。“多聚体TF构建物”指包含第一TF分子或衍生物可操作附着至少第二和第三TF分子或衍生物的构建物。多聚体可以包含大约3个-大约20个TF分子。多聚体中的各TF单元也可以通过可选择性切割的肽接头或其它生物学可释放键相连。此外，正如上文就TF二聚体所述，可以使用重组操作和表达或使用标准合成化学来生成构建物。
可用于本发明的其它TF构建物是激活因子VII的能力缺陷的突变体。本文通常将这些“因子VII激活突变体”定义为可结合功能性因子VII/VIIa，通过蛋白水解激活因子X，但是基本上不能通过蛋白水解激活因子VII的TF突变体。因此，这些构建物是缺乏因子VII激活活性的TF突变体。
这些因子VII激活突变体促进肿瘤特异性凝血的能力基于的是它们对肿瘤血管结构的特异性投递和血浆中低水平存在的因子VIIa。在施用了这些因子VII激活突变体缀合物后，突变体将定位于血管化肿瘤的血管结构内。在定位前，由于TF突变体不能将因子VII转变成因子VIIa，因此它通常不能够在任何其它身体部位启动凝血。但是，在定位于肿瘤区并积累后，突变体将遭遇来自血浆的足够因子VIIa，从而起始外在凝血途径，导致肿瘤特异性血栓症。也可以对患者施用外源因子VIIa。
可以制备多种组织因子VII激活突变体中的一种或多种，并用于本发明。现在有了关于TF上因子VII/VIIa识别位点的充足科技知识。由此可以理解，因子VII活化区通常位于TF分子的大约第157位-大约第167位氨基酸之间。但是，预计该区域外的残基也可能与因子VII激活活性有关，由此可考虑在TF序列大约第106位-大约第209位氨基酸之间的任何一个或多个残基处导入突变(WO 94/07515；WO 94/28017；本文收入作为参考)。
如美国专利6,093,399，6,004,555，5,877,289和6,036,955中所述的，多种其它凝血因子可以用于本发明，例示性药剂见下文。凝血酶、因子V/Va及其衍生物、因子VIII/VIIIa及其衍生物、因子IX/IXa及其衍生物、因子X/Xa及其衍生物、因子XI/XIa及其衍生物、因子XII/XIIa及其衍生物、因子XIII/XIIIa及其衍生物、因子X激活剂、和因子V激活剂可用于本发明。
Russell蝰蛇毒因子X激活剂预计可用于本发明。已生成了对Russell蝰蛇毒液中存在的因子X激活剂具有特异性的单克隆抗体，并可作为双特异性结合配体的一部分用于特异性投递药剂。
血栓烷A是由内过氧化物通过血小板微粒体中的环加氧酶和血栓烷合成酶的依次反应形成的。血栓烷A2是由血小板产生的，而且由于其能够引起血小板聚集，它还是有效的血管收缩剂。血栓烷A2及其活性类似物预计可用于本发明。
血栓烷合酶和合成激活血小板的前列腺素的其它酶也可在本文中作为“凝血剂”使用。针对血栓烷合酶的单克隆抗体和血栓烷合酶的免疫亲和纯化是已知的，人血栓烷合酶的cDNA也是已知的。
α2-抗纤溶酶或α2-纤溶酶抑制剂是人血浆中天然存在的蛋白酶抑制剂，能够有效抑制由纤溶酶原激活剂诱导的纤维蛋白凝块的裂解。α2-抗纤溶酶是特别有效的抑制剂，预计可用于本发明。
由于可以获得α2-抗纤溶酶的cDNA序列，因此优选重组表达和/或融合蛋白质。还可以获得针对α2-抗纤溶酶的单克隆抗体，可用于本发明的双特异性结合配体实施方案。这些抗体可用于将外源α2-抗纤溶酶投递至靶位点或储存内源α2-抗纤溶酶，并使其集中在靶区内。
F4.抗微管蛋白药物
一系列药物可经干扰微管蛋白活性来展现其效果。由于微管蛋白的功能是有丝分裂和细胞生存所必需的，所以某些“抗微管蛋白药物”是强有力的化疗剂。目前了解得更清楚也更优选用于本发明的抗微管蛋白药物包括秋水仙碱；紫杉烷类，诸如紫杉醇；长春花生物碱，诸如长春花碱、长春花新碱、和长春碱酰胺；和考布他汀。其它合适的抗微管蛋白药物是细胞松弛素(包括B、J、E)、多拉司他汀、auristatin PE、紫杉醇、ustiloxin D、根胆酸(rhizoxin)、1069C85、秋水仙胺、阿苯达唑(albendazole)、阿扎毒素、和诺考达唑(nocodazole)。
如美国专利5,892,069、5,504,074、和5,661,143(本文特别收入作为参考)中所述，考布他汀是通常抑制细胞有丝分裂的雌二醇衍生物。可用于本发明的例示性考布他汀包括基于考布他汀A、B、和/或D的那些和美国专利5,892,069、5,504,074、和5,661,143中所述的那些。考布他汀A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-1、B-2、B-3、和B-4是上述类型的范例。
美国专利5,569,786和5,409,953(本文收入作为参考)描述了考布他汀A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、B-3、和B-4的分离、结构表征、和合成，以及使用这些考布他汀来治疗肿瘤生长的制剂和方法。这些考布他汀中的一种或多种都可用于本发明。
如美国专利5,892,069、5,504,074、5,661,143、和4,996,237(本文特别收入作为参考)中所述，考布他汀A-4也可用于本文。美国专利5,561,122(本文收入作为参考)进一步描述了合适的考布他汀A-4前药，预计可与本发明联合使用。
美国专利4,940,726(本文特别收入作为参考)特别描述了命名为考布他汀D-1和考布他汀D-2的大环内酯，可与本发明的组合物和方法联合使用。美国专利5,430,062(本文特别收入作为参考)涉及具有抗癌活性、可与本发明联合使用的芪衍生物和考布他汀类似物。
F5.抗血管发生药剂
抗血管发生药剂可用于附着于本发明的抗体和肽。许多抗癌剂作用机制的一部分是具有抗血管发生效用。针对联合疗法所述的任何一种或多种这样的药剂，包括表E中的药剂，都还可以按本文所述与本发明的抗体缀合。已发现、设计或选择了某些其它药剂，它们的主要作用机制是具有抗血管发生效用。所说药剂的实例描述如下，其中的任一种都还可以用于制备免疫缀合物或分别用于本发明的联合疗法中。
现在已知大量的酪氨酸激酶抑制剂可用于治疗在多种疾病状态中出现的血管发生，包括例如美国专利5,639,757(本文特别收入作为参考)描述的4-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，它也可以与本发明联合使用。能够调节经VEGFR2受体的酪氨酸激酶信号转导的有机分子的其它范例是美国专利5,792,771的喹唑啉化合物和组合物，这项专利在此特别收入，以便描述可以与本发明联合用于治疗血管发生性疾病的其它组合。
其它化学类化合物也已经显示可抑制血管发生，而且可用于与本发明的联合。例如，联合疗法中可以采用类固醇，诸如美国专利5,972,922(本文特别收入作为参考)中描述的抑血管的4，9(11)-类固醇和C21-氧合类固醇。美国专利5,712,291和5,593,990(本文特别收入作为参考)描述了沙利度胺(thalidomide)及相关化合物、前体、类似物、代谢物和水解产物，它们也可以与本发明联合用于抑制血管发生。美国专利5,712,291和5,593,990中的化合物可以口服施用。表B列出了可用于联合疗法的其它例示性抗血管发生药剂，其中列出的每一种药剂都只是例示而绝非限制。
表B.血管发生的抑制剂和负调控剂
 
物质 参考文献
血管生长抑素 0’Reilly等人，1994
抑内皮素 0’Reilly等人，1997
16kDa催乳素片段 Ferrara等人，1991；Clapp等人，1993；D’Angelo等人，1995；Lee等人，1998
层粘连蛋白肽 Kleinman等人，1993；Yamamura等人，1993；Iwamoto等人，1996；Tryggvason，1993
纤连蛋白肽 Grant等人，1998；Sheu等人，1997
组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP1、2、3、4) Sang，1998
纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1、2) Soff等人，1995
肿瘤坏死因子α(高剂量，体外) Frater-Schroder等人，1987
TGF-β1 RayChadhury和D’Amore，1991；Tada等人，1994
干扰素(IFN-α、β、γ) Moore等人，1998；Lingen等人，1998
ELR-CXC趋化因子：IL-12；SDF-1；MIG；血小板因子4(PF-4)；IP-10 Moore等人，1998；Hiscox和Jiang，1997；Coughlin等人，1998；Tanaka等人，1997
血小板反应蛋白(TSP) Good等人，1990；Frazier，1991；Bornstein，1992；Tolsma等人，1993；Sheibani和Frazier，1995；Volpert等人，1998
SPARC Hasselaar和Sage，1992；Lane等人，1992；Jendraschak和Sage，1996
2-甲氧基雌二醇 Fotsis等人，1994
增殖蛋白相关蛋白质 Jackson等人，1994
苏拉明 Gaglliardi等人，1992；Takano等人，1994；Waltenberger等人，1996；Gagliardi等人，1998；Manetti等人，1998
沙利度胺 D’Amato等人，1994；Kenyon等人，1997；Wells，1998
可的松 Thorpe等人，1993；Folkman等人，1983；Sakamoto等人，1986
利诺胺 Vukanovic等人，1993；Ziche等人，1998；Nagler等人，1998
烟曲霉素(AGM-1470；TNP-470) Sipos等人，1994；Yoshida等人，1998)
他莫西芬 Gagliardi和Collins，1993；Lindner和Borden，1997；Haran等人，1994
韩国槲寄生提取物(Viscum albumcoloratum) Yoon等人，1995
视黄醇(醛、酸)类 Oikawa等人，1989；Lingen等人，1996；Majewski等人，1996
CM101 Hellerqvist等人，1993；Quinn等人，1995；Wamil等人，1997；DeVore等人，1997
地塞米松 Hori等人，1996；Wolff等人，1997
白血病抑制因子(LIF) Pepper等人，1995
某些优选用于抑制血管发生的成分是血管生长抑素、抑内皮素、抑血管素(vasculostatin)、制霉菌素(canstatin)、和maspin。美国专利5,776,704、5,639,725、和5,733,876(本文收入作为参考)描述了被称为“血管生长抑素”的蛋白质。血管生长抑素是分子量在大约38kDa-大约45kDa之间(通过还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定)的蛋白质，大致包含纤溶酶原分子的第1-4个Kringle区。血管生长抑素的氨基酸序列通常与完整鼠纤溶酶原分子自第98位氨基酸开始的片段基本上相似。
血管生长抑素的氨基酸序列在物种间略有变化。例如，在人的血管生长抑素中，氨基酸序列与上述鼠纤溶酶原片段的序列基本上相似，但是有活性的人血管生长抑素序列可以自完整人纤溶酶原氨基酸序列的第97位或第99位氨基酸开始。而且，人纤溶酶原在小鼠肿瘤模型中具有相似的抗血管发生活性，因而可以使用。
某些抗血管发生治疗剂已显示出造成肿瘤的衰退，而血管生长抑素就是这样的一种药剂。抑内皮素、胶原蛋白XVIII的20kDaCOOH-末端片段、细菌多糖CM101和抗体LM609也具有抑制血管生长的活性。另一方面，根据它们的其它特性，它们被称为抗血管治疗剂或肿瘤血管毒素，因为它们不仅抑制血管发生，还通过几乎尚未明确的机制起始对肿瘤血管的破坏。
由于血管生长抑素和抑内皮素是最早在小鼠中证明不仅能够抑制肿瘤生长而且能够引起肿瘤退化的血管发生抑制剂，因此它们已经成为深入研究的焦点。已经显示多种蛋白酶可由纤溶酶原产生血管生长抑素，包括弹性蛋白酶、巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MME)、基质溶素(MMP-7)、和92kDa的明胶酶B/IV类胶原酶(MMP-9)。
MME能够在肿瘤中由纤溶酶原产生血管生长抑素，而粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)通过上调巨噬细胞的MME表达而诱导血管生长抑素生成。MME在血管生长抑素生成中的作用得到MME确实在来自患者的肝细胞癌临床样品中表达这一发现的支持。认为能够产生血管生长抑素的另一种蛋白酶是溶基质素-1(MMP-3)。MMP-3显示在体外可由纤溶酶原产生血管生长抑素样片段。血管生长抑素的作用机制目前还不清楚，猜测它结合内皮细胞上尚未鉴定的细胞表面受体，诱导内皮细胞经历程序化细胞死亡或有丝分裂阻滞。
抑内皮素似乎是甚至更强有力的抗血管发生和抗肿瘤药剂，尽管它的生物学特性尚不是很清楚。抑内皮素在大量的小鼠肿瘤模型中能够有效引起退化。肿瘤没有形成针对抑内皮素的抗性，而且肿瘤在多个治疗周期后进入体积不再增加的休眠阶段。在此休眠阶段，经历凋亡的肿瘤细胞百分比上升，产生基本上保持相同大小的群体。抑内皮素被认为与介导其作用的尚未鉴定的内皮细胞表面受体结合。
授予Folkman和0’Reilly的美国专利5,854,205(本文特别收入作为参考)涉及抑内皮素及其作为内皮细胞增殖和血管发生抑制剂的应用。抑内皮素蛋白质对应于XVIII型胶原的C末端片段，而且可以由多种来源分离该白质。美国专利5,854,205还教导抑内皮素具有XVIII型胶原、XV型胶原、或BOVMPE 1 pregastric酯酶片段的氨基酸序列。美国专利5,854,205还描述了抑内皮素与其它抗血管发生蛋白质(特别是血管生长抑素)的联合，这些联合的组合物能够有效的使依赖血管发生的肿瘤块消退。
CM101是已经详细鉴定为能够在肿瘤中诱导新血管炎症的细菌多糖。CM101结合并交联去分化内皮上表达的受体，刺激补体系统的激活。它还启动由细胞因子驱动的、选择性靶向肿瘤的炎症应答。它是下调VEGF及其受体的表达的唯一抗病理性血管发生药剂。CM101目前作为抗癌剂正在进行临床试验，而且可用于与本文的联合。
血小板反应蛋白(TSP-1)和血小板因子4(PF4)也可用于与本发明中。它们都是与肝素有关的血管发生抑制剂，是在血小板α颗粒中发现的。TSP-1是细胞外基质成分，一种450kDa的大型多结构域糖蛋白。TSP-1结合在细胞外基质中发现的许多蛋白聚糖分子，包括HSPG、纤连蛋白、层粘连蛋白、和不同类型的胶原。TSP-1抑制体外内皮细胞迁移和增殖以及体内血管发生。TSP-1还抑制经转化的内皮细胞的恶性表型和肿瘤发生。肿瘤抑制基因p53显示直接调控TSP-1的表达，p53活性的丧失将引起TSP-1生成显著降低，伴随着由肿瘤起始的血管发生增加。
PF4是含70个氨基酸的蛋白质，它是CXC ELR趋化因子家族的成员，能够在体外有效抑制内皮细胞增殖，在体内有效抑制血管发生。肿瘤内施用或通过腺病毒载体投递的PF4能够引起对肿瘤生长的抑制。
干扰素和金属蛋白酶抑制剂是能够按照本发明被递送的另外两类天然存在的血管发生抑制剂。20世纪80年代早期就已经知道干扰素的抗内皮活性，但是抑制机制仍然不清楚。已知它们能够抑制内皮细胞迁移，而且它们在体内确实具有一些抗血管发生活性，这可能是由抑制肿瘤细胞产生血管发生促进剂的能力介导的。特别是血管肿瘤对干扰素较敏感，例如用IFNα可以成功的治疗增殖的血管瘤。
金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)是天然存在的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂家族，它们也能够抑制血管发生，可用于本发明的治疗方案中。MMP在血管发生过程中具有重要作用，因为它们降解内皮细胞和成纤维细胞在延伸或改造血管网络时迁移经过的基质。事实上，MMP的一个成员MMP-2显示与推测为此目的经整联蛋白αvβ3激活的内皮有关。若这种相互作用被MMP-2片段破坏，则血管发生下调，肿瘤生长受抑制。
存在大量抑制血管发生的药理学活性剂，其中任何一种或多种都可用作本发明的一部分。这包括AGM-1470/TNP-470、沙利度胺、和羧基酰胺三唑(CAI)。1990年发现烟曲霉素是血管发生的有效抑制剂，从此开发了烟曲霉素的合成类似物AGM-1470和TNP-470。这两种药物可抑制体外内皮细胞增殖和体内血管发生。在人临床试验中对TNP-470进行了广泛研究，结果表明进行长期给药是最佳的。
沙利度胺最初作为镇静剂使用，但是发现是很强的致畸剂，因而停用。1994年发现沙利度胺是血管发生抑制剂。沙利度胺目前作为抗癌剂和血管性眼疾病的治疗正在进行临床试验。
CAI是小分子量的血管发生合成抑制剂，作为钙通道阻断剂防止肌动蛋白再组织、内皮细胞迁移、和在胶原IV上的展开而起作用。CAI在生理学可达到浓度抑制新血管形成，而且癌症患者口服后耐受较好。CAI的临床试验在49％的治疗前患有进行性疾病的癌症患者中稳定了疾病。
在存在肝素或肝素片段时，可的松在小鼠中显示通过阻断内皮细胞增殖来抑制肿瘤生长。类固醇和肝素的加成性抑制效果所涉及的机制尚不清楚，但是认为肝素可能增加内皮细胞对类固醇的摄取。该混和物显示可增加新形成的毛细血管下基底膜的解体，这也是加成性血管抑制性效果的一种可能解释。肝素-可的松缀合物在体内还具有有效的血管抑制性和抗肿瘤效果活性。
预计其它特异性血管发生抑制剂也可利用本发明的肿瘤靶向方法递送至肿瘤。这些包括(但不限于)抗侵入因子、视黄酸和紫杉醇(美国专利5,716,981，本文收入作为参考)、AGM-1470(Ingber等人，1990；本文收入作为参考)、鲨鱼软骨提取物(美国专利5,618,925，本文收入作为参考)、阴离子聚酰胺或聚脲寡聚物(美国专利5,593,664，本文收入作为参考)、羟吲哚衍生物(美国专利5,576,330，本文收入作为参考)、雌二醇衍生物(美国专利5,504,074，本文收入作为参考)、和噻唑并嘧啶衍生物(美国专利5,599,813，本文收入作为参考)。
包含αvβ3整联蛋白拮抗剂的组合物也可以与本发明联合用于抑制血管发生。正如美国专利5,766,591(本文收入作为参考)所公开的，含RGD的多肽及其盐，包括环状多肽，是αvβ3整联蛋白拮抗剂的合适范例。
因为血管生成素是Tie2的配体，所以基于改变通过Tie2受体的信号传导的其它治疗性干预方法也可在本文中联合使用。例如，可以应用能阻断Tie2受体活化的可溶性Tie2受体(Lin等，1998a)。用重组腺病毒基因疗法投递这样的构建体已显示对于治疗癌症和减少转移是有效的(Lin等，1998a)。
血管生成素，与VEGF家族成员一样，是血管内皮的特异性生长因子(Davis和Yancopoulos，1999；Holash等，1999；本文收入作为参考)。首先被描述的血管生成素是天然存在的受体激活剂或激动剂--血管生成素-1(Ang-1)，和天然存在的受体拮抗剂--血管生成素-2(Ang-2)，二者都是通过内皮细胞酪氨酸激酶受体Tie2来发挥作用的。
两种新的血管生成素--血管生成素-3(小鼠)和血管生成素-4(人)也已经得到鉴定(Valenzuela等人，1999)。血管生成素-3似乎作为拮抗剂(像Ang-2)发挥作用，而血管生成素-4似乎作为激动剂(像Ang-1)发挥作用(Valenzuela等人，1999)。还由人的心脏克隆了称为血管生成素-3的蛋白质，而且据报导对内皮细胞没有促有丝分裂的效果(Kim等人，1999)。
VEGF是血管发育早期所必需的，而血管生成素-1是血管化晚期通常需要的。由此，VEGF促进内皮细胞分化、增殖、和原始血管形成。血管生成素-1经Tie2受体促进成熟血管的维持和稳定。因此，血管生成素-1是成熟或稳定因子，认为它通过促进内皮细胞与周围支持细胞之间的相互作用而将未成熟血管转变成未成熟血管(Holash等人，1999)。
F6.诱导凋亡的药剂
本发明还可用于投递在肿瘤内任何细胞(包括肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞)中诱导凋亡的药剂。许多抗癌药剂可能具有诱导凋亡的效果，这是其作用机制的一部分。按本文所述，针对联合疗法所述的任何一种或多种这样的药剂，包括表F中的那些药剂，也可与本发明的抗体缀合。已发现、设计或选择出了具有诱导凋亡的作用作为主要机制的某些其它药剂。这些药剂的例子描述如下，其中任何一种都可以用于制备免疫缀合物或分别用于与本发明联合的治疗方法中。
据报导，许多形式的癌症在肿瘤抑制基因中包含突变，诸如p53。p53的灭活导致不能促进凋亡。由于这一失败，癌细胞进行肿瘤发生，而非注定的细胞死亡。本发明因此还涵盖通过投递肿瘤抑制基因来刺激细胞死亡。例示性的肿瘤抑制基因包括(但不限于)p53、成视网膜细胞瘤基因(Rb)、Wilm氏肿瘤(WT1)、baxα、白介素-1β-转换酶及其家族、MEN-1基因、1型神经纤维瘤(NF1)、cdk抑制剂p16、结肠直肠癌基因(DCC)、家族性多发性腺癌基因(FAP)、多瘤抑制基因(MTS-1)、BRCA1、和BRCA2。
优选使用的是p53(美国专利5,747,469、5,677,178、和5,756,455，本文收入作为参考)、成视网膜细胞瘤、BRCA1(美国专利5,750,400、5,654,155、5,710,001、5,756,294、5,709,999、5,693,473、5,753,441、5,622,829、和5,747,282，本文收入作为参考)、MEN-1(GenBank编号U93236)、和腺病毒E1A(美国专利5,776,743，本文收入作为参考)基因。
抑制凋亡或程序性细胞死亡的其它癌基因包括，但不局限于，bcr-abl、bcl-2(不同于bcl-1，细胞周期蛋白D1；GenBank登记号M14745、X06487；美国专利号5,650,491；和5,539,094；分别收编于此作为参考)和包括Bc1-x1、Mc1-1、Bak、A1、A20在内的家族成员。bc1-2的过表达首先在T细胞淋巴瘤中发现。bc1-2通过与凋亡途径中的一种蛋白质Bax结合并使其失活而发挥癌基因的功能。bc1-2功能的抑制防止了Bax的失活，并使得凋亡途径能继续进行。因此，对此类癌基因的抑制，如利用反义核苷酸序列进行抑制，预计可用于本发明期望增强凋亡的有关方面(美国专利5,650,491；5,539,094；和5,583,034；分别收编于此作为参考)。
可以由本发明抗体投递的其它组合物包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(称为TRAIL)的编码基因及TRAIL多肽(美国专利5,763,223，本文收入作为参考)；24kD凋亡相关蛋白酶(美国专利5,605,826，本文收入作为参考)；Fas相关因子1(FAF1)(美国专利5,750,653，本文收入作为参考)。本发明的这些方面还包括提供白介素-1β-转换酶及其家族成员，据报导，它们也刺激凋亡。
还可以使用诸如2-羟基喹啉衍生物(美国专利5,672,603和5,464,833，本文收入作为参考)、branched apogenic peptide(美国专利5,591,717，本文收入作为参考)、磷酸酪氨酸抑制剂及不可水解的磷酸酪氨酸类似物(美国专利5,565,491和5,693,627，本文收入作为参考)、RXR类视色素受体激动剂(美国专利5,399,586，本文收入作为参考)、和甚至抗氧化剂(美国专利5,571,523，本文收入作为参考)等化合物。还可以将酪氨酸激酶抑制剂(诸如金雀异黄素)连接至本发明的抗体(正如美国专利5,587,459所支持的，本文收入作为参考)。
F7.抗病毒剂
因为阴离子磷脂和氨基磷脂，尤其是PS和PE，在病毒感染的细胞上变得暴露，诸如9D2和3G4(ATCC 4545)抗体等的本发明抗体也可连接任何一种或多种抗病毒剂。本发明的这些方面的其它根本原因及其优势在下文中针对PE结合肽、抗病毒缀合物有更详细的描述。
用于连接抗体或肽的实例性抗病毒剂也连同本发明的PE结合肽、抗病毒缀合物有更详细的描述。按本文所述，任何一种或多种抗病毒剂，包括表G中的那些药剂，都可与本发明的抗体缀合。这样的抗病毒剂还可单独用于本发明的联合抗病毒疗法中。
G.生物学功能等同物
现在可以生成抗体和效应子的等同物或甚至改良物，通常是使用上文提供的材料作为起点。可以对这种抗体的结构进行修饰和改变，但是仍然能够获得具有类似或所需特征的分子。例如，可以用某些氨基酸替代蛋白质结构中的其它氨基酸，而在相互作用性结合能力方面没有明显损失。这些考虑也可应用于毒素、抗血管发生剂、凋亡诱导剂、凝血剂、等等。
由于蛋白质相互作用能力和本质确定了该蛋白质的生物学功能活性，因此可以在蛋白质序列(当然也可以是相应的DNA序列)中进行某些氨基酸序列替代，从而得到具有类似(激动剂)特性的蛋白质。因此，预计可在以抗体或治疗剂的序列(或相应的DNA序列)中进行多种改变，而不会使其生物学效用或活性明显损失。可以根据本文表A提供的密码子信息和关于定点诱变的支持性技术细节，通过突变相应的DNA序列而产生生物学功能等同物。
本领域技术人员也深入领会到，“生物学功能等同的”蛋白质或肽这一定义的内在含义是，在分子的确定部分内可以进行的、仍然导致分子具有可接受水平的等同生物活性的改变数目存在限制。因此，本文将生物学功能等同的蛋白质和肽定义为某些而非大多数或所有氨基酸可被替代的蛋白质和肽。当然，根据本发明可以容易的制备和使用具有不同替代的多种不同的蛋白质/肽。
氨基酸替代通常基于的是氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等等。对氨基酸侧链取代基大小、形状、和类型的分析揭示了精氨酸、赖氨酸、和组氨酸都是带正电的残基；丙氨酸、甘氨酸、和丝氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸都具有基本上相似的形状。因此，根据这些考虑，本文将精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸、和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸确定为生物学功能等同物。
在进行更多的量变时，可以考虑氨基酸的水性指数(hydropathicindex)。根据其疏水性和带电特性确定了各种氨基酸的水性指数，即：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域技术人员通常都理解氨基酸水性指数在赋予蛋白质相互作用性生物学功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982，本文收入作为参考)。已知某些氨基酸可以被具有相似水性指数或评分的其它氨基酸替代，而仍保留相似的生物学活性。在根据水性指数进行改变时，优选水性指数为±2之间的氨基酸替代，特别优选水性指数为±1之间的氨基酸替代，甚至更特别优选水性指数为±0.5之间的氨基酸替代。
因此，可以理解，氨基酸可以用具有相似亲水性值的另一种氨基酸取代，而仍得到生物学等同的蛋白质。如美国专利4,554,101(本文收入作为参考)中所述，已经为氨基酸残基指定了下列亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。
在根据亲水性值进行改变时，优选亲水性值为±2之间的氨基酸替代，特别优选亲水性值为±1之间的氨基酸替代，甚至更特别优选亲水性值为±0.5之间的氨基酸替代。
H.缀合作用
抗氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体，包括选定的具有改良特性的抗PS抗体，诸如9D2和3G4(ATCC 4545)，可以缀合或附着或可操作性的连接抗细胞剂或细胞毒性剂，由此制备“免疫毒素”；或者直接或间接缀合或附着或可操作连接能够凝血剂，由此形成“凝血配体”；或者缀合或连接诸如核苷等抗病毒剂，由此制备抗病毒免疫缀合物或“免疫杀病毒剂”。诸如耐久霉素等PE结合肽还可与惰性载体、靶向剂或抗病毒剂缀合或附着或可操作性的连接，由此制备一系列PE结合肽衍生物和抗病毒肽缀合物。
尽管优选共价连接，其它的可操作附着方式也可以使用。例如，可以用亲和素：生物素桥产生联接的构建体。为了更进一步的描述并使亲和素：生物素能用于抗体和靶向和靶向剂与生物学活性剂和治疗剂的可操作性连接中，除了本领域普通技术人员已知的知识外，还将共同拥有的美国专利6,093,399特别收编于此作为参考。
两种药剂可用第二种结合区，优选其抗体或抗原结合区连接。这可以通过凝血配体作为实例说明，其中的靶向剂与凝血剂通过第二种结合区连接(美国专利6,093,399；6,004,555，5,877,289，和6,036,955，分别收编于此作为参考)，它已制备并成功用于癌症治疗中。在第一种靶向剂是抗体或抗原结合区时，使用也是抗体或抗原结合区的第二种结合区产生了双特异性抗体构建体。本领域通常众所周知双特异性抗体的制备和应用，本文进一步公开。
本领域普遍知晓免疫缀合物技术。但是，通过在其制备和纯化以供随后临床施用的过程中使用某些优选的技术可获得某些好处。例如，尽管基于IgG的构建物与其Fab’对应物相比通常展示更好的结合能力和更慢的血液清除速率，但是基于Fab’片段的构建体通常将展示更好的组织穿透能力。
另外，尽管已知多种类型的含二硫键的接头可以成功用于抗体和肽的缀合，但是基于不同的药理学特征和能力，某些接头通常优于其它接头。例如，优选含有空间上“受阻”的二硫键的接头，因为这种接头在体内更加稳定，可防止毒素部分在结合至作用位点之前就被释放下来。
交联剂的类型，以及如何进行交联将会改变所得缀合物的药效学。可能会希望获得这样的缀合物，它在除了预定作用位点以外的所有其它身体部位中的条件下都能够保持完整，而在所述预定作用位点处具有良好的“释放”特性。因此，具体交联方案，特别包括所用的具体交联剂和被交联的结构，具有一定的意义。
取决于所缀合的具体药剂，可能会需要或希望提供抗体或PE结合肽和第二药剂或治疗剂可操纵附着的肽间隔区。某些肽间隔区能折叠成以二硫键键合的环结构。然后，环内的蛋白水解切割会产生异二聚体多肽，其中抗体和治疗剂仅通过单个二硫键连接。这种毒素的范例是蓖麻毒蛋白A链毒素。
当利用其它一些毒素化合物时，可以提供不能被切割的肽间隔区，以可操作附着融合蛋白质中的抗体与毒素化合物。可以与不能被切割的肽间隔区结合使用的毒素是自身可通过蛋白水解切割而转变成毒害细胞的二硫键键合形式的毒素。这种毒素化合物的范例是假单胞菌外毒素化合物。
目前多种化疗剂和其它药理活性剂已经成功的缀合于抗体，并显示药学功能。已经研究过的例示性抗肿瘤药剂包括多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素、氨甲喋呤、长春碱、和其它多种药剂。此外，已经描述了诸如新制癌菌素、大分子霉素、三乙烯亚胺苯醌、和α-鹅膏蕈碱等其它药剂的附着。可对这些附着方法作些改动以用于本发明中。
与抗体或PE结合肽的任何共价连接都应当理想地在不同于功能性位点的位点处进行。组合物由此以任何可操作方式“连接”，使得每个部分都能够发挥预定功能而无显著削弱，具体而言，就是使产生的构建体仍然结合预定抗原或PE，并使附着的药剂在从构建体中释放时基本上保持生物学活性并/或恢复生物学活性。
H1.生化交联剂
除了本文提供的一般信息，可以使用某些优选的生化交联剂使抗体或PE结合肽与治疗剂或其它药剂缀合。交联剂用于形成将两种不同分子的官能团维系在一起的分子桥接。为了以分步方式连接两种不同的蛋白质，可以使用杂双功能交联剂来消除不需要的均多聚体形成。例示性的杂双功能交联剂可以参考表C。
表C.杂双功能交联剂
Figure C03816751D01081
杂双功能交联剂包含两个反应基团：一个通常与伯胺基团发生反应(如N-羟基琥珀酰亚胺)，而另一个通常与硫醇基发生反应(如吡啶二硫化物(pyridyldisulfide)、马来酰亚胺、卤素、等等)。交联剂通过伯胺反应基团与一种蛋白质(如选定的抗体、片段或PE结合肽)的赖氨酸残基发生反应，而通过硫醇反应基团，已经与第一种蛋白质连接的交联剂与另一种蛋白质的半胱氨酸残基(游离的巯基)发生反应。
由此，组合物通常具有或经衍生具有可用于交联目的的官能基。这一要求不应视作限制性的，因为多种基团可用于这种方式。例如，伯胺或仲胺基、酰肼或肼、羧基醇、磷酸酯(phosphate)、氨基甲酸酯或烷化基团可用于结合或交联。
交联剂的两种反应基团之间的间隔臂可以具有不同的长度和化学组成。较长的间隔臂能够使缀合物成分获得较好的柔性，而桥接中的有些特定成分(如苯基)可以给反应基团带来额外的稳定性或使化学连接对各方面作用的抗性增加(如二硫键对还原剂的抗性)。还包括使用诸如L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala等肽间隔物。
优选采用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知大量类型的含二硫键接头能够成功的用于缀合中。可以证明含空间受阻的二硫键的接头能够带来较好的体内稳定性，防止药剂在结合作用位点前释放。这些接头因而成为一组优选的连接剂。
最优选的交联剂之一是SMPT，这是一种含二硫键的双功能交联剂，二硫键因邻近的苯环和甲基而“空间受阻”。认为该二硫键的空间位阻有助于保护该键免受硫醇阴离子(诸如组织和血液中可能存在的谷胱甘肽)的攻击，由此有助于防止在缀合物将附着的药剂投递至肿瘤位点前发生脱偶联。预计SMPT剂也可用于本发明的缀合物方面。
与许多其它已知的交联剂一样，SMPT交联剂提供了交联官能基(诸如半胱氨酸的SH或伯胺如赖氨酸的ε-氨基)的能力。另一种可能类型的交联剂包括含可切割二硫键的杂双功能光反应性叠氮基苯，诸如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨基酰氨)-1，3’-二硫代丙酸乙酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基团与伯胺基团发生反应，而叠氮基苯(在光分解作用后)无选择性的与任何氨基酸残基发生反应。
除了受阻的交联剂，本文还可以采用不受阻的接头。认为不含或不产生受保护二硫键的其它有用交联剂包括SATA、SPDP、和2-亚氨基硫杂戊环(2-iminothiolane)。本领域完全理解这些交联剂的应用。
一旦完成缀合，将缀合物与未缀合的抗体或肽和其它试剂与其它污染物分开。有大量的纯化技术可用于提供足够纯的缀合物，从而能够用于临床。使用最多的通常是基于大小分离的纯化方法，诸如凝胶过滤、凝胶渗透、或高效液相层析。也可以使用其它层析技术，诸如Blue-Sepharose分离。
H2.生物学可释放接头
虽然任何连接部分优选具有合理的血液稳定性以防止在靶向到疾病(如肿瘤位点)前显著释放附着的治疗剂，但是在某些方面，也可以使用生物学可释放键和/或可选择性切割间隔物或接头。“生物学可释放键”和“可选择性切割的间隔物或接头”仍然具有合理的循环稳定性。
本发明的抗体或PE结合肽由此可以经生物学可释放键连接一种或多种治疗剂或另一种药剂。可以采用任何形式的靶向剂或抗体，包括完整抗体。在某些实施方案中，优选scFv片段。
“生物学可释放键”或“可选择性水解键”包括只有或优先在某些条件下可释放的、可切割的、或可水解的所有连键。这包括二硫键和三硫键和酸不稳定键，正如美国专利5,474,765和5,762,918(本文收入作为参考)所述。
特别涵盖使用对酸敏感的间隔物将治疗剂附着于本发明的抗体或PE结合肽上。在这些实施方案中，治疗剂在细胞的酸性区室内释放。预计使酸敏感性释放发生于细胞外，但是是在特异性靶向(优选)肿瘤位点或病毒感染性细胞之后。目前优选的某些范例包括经酸敏感间隔物连接了秋水仙碱或多柔比星(doxorubicin)的抗体。还涵盖经抗体的碳水化合物部分进行附着。在这些实施方案中，治疗剂在细胞的酸性区室内释放。
抗体或PE结合肽还可以经衍生而导入能够经生物学可释放键附着治疗剂的官能基。抗体或PE结合肽由此可以经衍生而导入以酰肼、肼、伯胺、或仲胺基终止的侧链。治疗剂可以经Schiff碱连接、腙或酰腙键、或酰肼接头而进行缀合(美国专利5,474,765和5,762,918，本文特别收入作为参考)。
同样如美国专利5,474,765和5,762,918(本文特别收入作为参考)所述，抗体或PE结合肽可以经一种或多种对酶敏感的生物学可释放键可操作附着治疗剂，包括肽键、酯键、酰胺键、磷酸二酯键、和糖苷键。
本发明的某些优选方面涉及包含肽酶和/或蛋白酶的至少第一种切割位点的肽接头的使用，而所述肽酶和/或蛋白酶优先定位于疾病位点，特别是肿瘤环境内。由抗体或肽介导的附着治疗剂的投递导致疾病位点或肿瘤环境内的特异性切割，继而导致活性治疗剂的特异性释放。某些肽接头包含由改造中涉及的一种或多种酶可识别的切割位点。
特别优选包含尿激酶、尿激酶原、纤溶酶、纤溶酶原、TGFβ、链激酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金属蛋白酶(诸如间质胶原酶、明胶酶、或溶基质素)的切割位点的肽接头。本文特别引入美国专利6,004,555、美国专利5,877,289、和美国专利6,093,399作为参考，以进一步描述和教导如何产生并使用包含生物学可释放键和可选择性切割接头和肽的免疫缀合物。本文特别收入美国专利5,877,289作为参考，以进一步描述和教导如何产生并使用包含可在肿瘤环境内尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金属蛋白酶(诸如间质胶原酶、明胶酶、或溶基质素)切割的可选择性切割肽接头的免疫缀合物。
目前优选的可选择性切割肽接头是包含纤溶酶或金属蛋白酶(也称为“基质金属蛋白酶”或“MMP”)(诸如间质胶原酶、明胶酶、或溶基质素)的切割位点的肽接头。可有利地用于本发明的其它肽接头包括，例如，纤溶酶可切割序列，诸如用尿激酶原、TGFβ、纤溶酶原和链激酶可切割的序列；因子Xa可切割序列；MMP可切割序列，诸如明胶酶A可切割序列；胶原酶可切割序列，诸如小牛皮肤胶原(α1(I)链)、小牛皮肤胶原(α2(I)链)、牛软骨胶原(α1(II)链)、人肝胶原(α1(III)链)、人α2M、人PZP、大鼠α1M、大鼠α2M、大鼠α1I3(2J)、大鼠α1I3(27J)、人成纤维细胞胶原酶自溶切割位点。为了更进一步进行描述并教导这些可切割序列的使用，除了本领域普通技术人员已知的知识外，还将共同拥有的美国专利6,342,219、6,524,583、6,342,221和6,416,758的内容和其中的表2所列序列特别收编于此作为参考。
H3.双特异性抗体
双特异性抗体通常可以应用，只要一条臂与氨基磷脂或阴离子磷脂结合，且双特异性抗体在与抗原结合位点不同的位点附着治疗剂即可。
一般而言，本领域众所周知双特异性抗体的制备。一种方法涉及分开制备对氨基磷脂或阴离子磷脂具有特异性的抗体，以及对治疗剂有特异性的抗体。由两种选定抗体制备F(ab’γ)2肽片段，随后还原它们以提供分开的Fab’γSH片段。然后用交联剂(诸如邻-亚苯基二马来酰亚胺)对待偶联的两种配偶体之一的SH基团烷化，从而在一种配偶体上提供游离的马来酰亚胺基团。然后通过硫醚键使这种配偶体缀合另一种配偶体，从而产生所需F(ab’γ)2杂缀合物。还知道使用SPDP或蛋白A进行交联的其它方法，或者制备三特异性构建物。
产生双特异性抗体的另一种方法是通过融合两种杂交瘤以形成四倍体瘤。如本文所用，术语“四倍体瘤”用于描述两种B细胞杂交瘤的生产性融合体。使用目前的标准技术，将两种产生抗体的杂交瘤融合在一起，得到子代细胞，然后选择出维持表达两套克隆型免疫球蛋白基因的那些细胞。
产生四倍体瘤的优选方法包括选择出至少一种亲代杂交瘤的酶缺陷突变体。然后，将第一种突变型杂交瘤细胞系与经致死暴露于如碘乙酰胺以防其持续存活的第二种杂交瘤的细胞融合。经过细胞融合，通过从经致死性处理的杂交瘤处获得补偿酶缺陷的基因，挽救了第一种杂交瘤，而通过与第一种杂交瘤的融合也挽救了第二种杂交瘤。优选相同同种型、不同亚类的免疫球蛋白融合，但并非必需。如果用其它测定法分离优选的四倍体瘤，则可使用混合亚类的抗体。
更详细的说，培育和筛选四倍体瘤的一种方法包括获得分泌第一种选定mAb的杂交瘤细胞系，并使其缺陷必需的代谢酶，如次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。为了获得该杂交瘤的缺陷突变体，在浓度渐增的8-氮杂鸟嘌呤(1×10-7M至1×10-5M)的存在下培养细胞。通过有限稀释亚克隆突变体，并测试其对次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)的敏感性。培养基可由例如添加了10％ FCS/2mM L-谷氨酰胺/1mM青霉素-链霉素的DMEM组成。
通过标准的细胞融合技术，使用产生第二种所需mAb的互补杂交瘤细胞系来产生四倍体瘤。简单的说，将4.5×107个HAT敏感型的第一种细胞与2.8×107个HAT抗性的第二种细胞混合，所述第二种细胞已于融合前，在冰上用致死剂量的不可逆生化抑制剂碘乙酰胺(5mM于磷酸盐缓冲盐水中)预处理30分钟。使用聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合，将细胞平铺在96孔微量培养板上。使用含有HAT的培养基选择四倍体瘤。使用例如固相同种型特异性ELISA和同种型特异性免疫荧光染色鉴定含有双特异性抗体的培养物。
在一个鉴定双特异性抗体的鉴定实施方案中，用一种试剂包被微量培养板(Falcon，Becton Dickinson Labware)的孔，所述药剂可与亲代杂交瘤抗体之一特异性相互作用，但缺乏与两种抗体的交叉反应性。清洗培养板，封闭，并向每个孔中加入待测上清液(SN)。将培养板于室温温育2小时，弃去上清液，清洗板，加入经稀释的碱性磷酸酶-抗抗体缀合物并于室温温育2小时。清洗板，向每个孔中加入磷酸酶底物，如对硝基苯基磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate)(Sigma，St.Louis)。将培养板温育，向每个孔中加入3N NaOH以终止反应，并使用ELISA读数器测定OD410的值。
在另一个鉴定实施方案中，使用经聚-L-赖氨酸预处理的微量滴定板将靶细胞之一结合至每个孔中，然后使用例如1％的戊二醛固定细胞，检测双特异性抗体结合完整细胞的能力。另外，本发明中也可结合使用FACS、免疫荧光染色、独特型特异性抗体、抗原结合竞争测定法、和抗体鉴定领域知道的其它方法来鉴定优选的四倍体瘤。
分离四倍体瘤之后，从其它细胞产物中纯化出双特异性抗体。通过免疫球蛋白纯化领域技术人员知道的多种蛋白质分离方法可实现纯化目的。本领域众所周知制备和鉴定抗体的方法(参阅如《抗体：实验室手册》，1988)。
例如，可以将来自选定四倍体瘤的上清液流经蛋白质A或蛋白质GSepharose柱以结合IgG(取决于其同种型)。然后用例如pH5.0的柠檬酸盐缓冲液洗脱结合的抗体。将含BsAb的洗脱级分在等渗的缓冲液中进行透析。或者，也可将洗脱液流经抗免疫球蛋白-Sepharose柱。然后用3.5M氯化镁洗脱BsAb。然后如上所述，通过例如同种型特异性ELISA和靶细胞的免疫荧光染色测定法来检测以此方式纯化的BsAb的结合活性。
也可以通过SDS-PAGE电泳，随后用银或考马斯蓝染色，从而鉴定和分离经纯化的BsAb和亲代抗体。当亲代抗体之一的分子量比另一种更高时即有可能如此，其中BsAb带迁移至两种亲代抗体的中间。样品的还原证实了其中存在具有两种不同表观分子量的重链。
H4.融合蛋白质和重组表达
包括9D2和3G4(ATCC 4545)抗体和其它具有改良特性的竞争性抗体在内的抗氨基磷脂和阴离子磷脂抗体以及PE结合肽还可用来通过使用分子生物学技术制备融合蛋白。使用本文公开的和本领域技术人员知道的任何抗体、PE结合肽和第二种活性剂或治疗剂，可以设计并产生任何融合蛋白质。融合蛋白质技术可以容易的应用于制备具有其它修饰的融合蛋白质，诸如CDR序列最优化，通过可选择性切割的肽序列连接两个部分，等等。
使用重组DNA技术来实现这些目标现在对于本领域技术人员而言已是标准实践。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、和体内重组/遗传重组。还可以使用自动合成仪来进行DNA和RNA合成(参阅例如Sambrook等人描述的技术，1989，本文收入作为参考)。
这种融合蛋白质的制备通常必需制备第一个和第二个DNA编码区，并在同一读码框中功能性连接这些区从而产生编码所需融合蛋白质的单个编码区。在本文中，抗体序列将在同一读码框中连接编码治疗剂的DNA序列。通常不认为免疫缀合物的哪个部分作为N末端区或C末端区特别有关系。
一旦产生了所需编码区，就可产生表达载体。表达载体在插入的DNA区上游包含一种或多种启动子，该启动子启动DNA的转录并由此启动所编码的重组蛋白质的表达。这就是“重组表达”。
为了获得所谓的免疫缀合物的“重组”形式，将载体在重组细胞中进行表达。可以通过重组表达领域技术人员通常知道的技术对用于在原核或真核系统中表达的DNA片段进行改造。我们认为事实上可以采用任何表达系统来表达。
本发明的免疫缀合物可以在真核表达系统中成功的表达，如CHO细胞，但是预计细菌表达系统(诸如大肠杆菌pQE-60)对于构建体的大量制备及随后纯化将是特别有用的。cDNA也可以在细菌系统中进行表达，所编码的蛋白质表达为与β-半乳糖苷酶、泛素、日本裂体吸虫(Schistosoma japonicum)谷胱甘肽S转移酶等等的融合形式。我们认为细菌表达系统相对于真核表达系统在使用简便性和由此获得的物质的量方面具有优势。
关于微生物表达，美国专利5,583,013、5,221,619、4,785,420、4,704,362、和4,366,246(本文收入作为参考)进一步补充了本公开书关于重组宿主细胞中基因表达的内容。
可以纯化重组产生的免疫缀合物，并加以配制以施用于人。或者，可以经基因疗法投递编码免疫缀合物的核酸。虽然可以采用裸露的重组DNA或质粒，但是优选使用脂质体或载体。某些病毒经受体介导的内吞作用进入细胞的能力，和整合到宿主细胞基因组并稳定的、有效的表达病毒基因的能力，使得它们成为将外来基因转移至哺乳动物细胞内的引人注目的候选者。优选用于本发明的基因治疗载体通常是病毒载体。
逆转录病毒有希望作为基因投递载体，因为它们能够将它们的基因整合宿主基因组中，从而转移大量的外来遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型，且在特定细胞系中包装。其它病毒，诸如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、和腺伴随病毒(AAV)，诸如美国专利5,139,941(本文收入作为参考)中描述的病毒，也可加以改造而作为基因转移的载体。
虽然有些能够接受外来遗传物质的病毒所能够容纳的核苷酸的量受到限制，且它们感染的细胞范围也受到限制，但是这些病毒已经证明能够成功的实现基因表达。然而，腺病毒不将其遗传物质整合到宿主基因组中，因而基因表达不需要宿主复制，这使得它们特别适用于快速、有效的异源基因表达。本领域众所周知用于制备复制缺陷的感染性病毒的技术。
在其它实施方案中，基因治疗载体是HSV。使HSV成为引人注目的载体的一个因素是基因组的大小和组织。因为HSV比较大，所以与其它较小的病毒系统相比，掺入多个基因或表达盒不太会成问题。另外，与其它系统相比，具有不同性能(如时间、强度)的不同病毒控制序列的可用性使得它有可能更大程度的控制表达。病毒具有相对较少的剪接信息，进一步简化基因操作，这也是优点。HSV还相对易于操作，而且可以生长至高滴度。
当然，在使用病毒投递系统时，可能期望充分纯化病毒粒子，使它基本上不含不需要的污染物，诸如缺陷型感染性病毒颗粒或热原，由此不会在接受载体构建物的细胞、动物、或个体中引起任何不恰当的反应。纯化载体的优选方法包括使用浮力密度梯度，诸如氯化铯梯度离心。
I.结合和功能检测法
本发明不但在动物和人的治疗方案中具有显著效用，而且它还具有许多其它特殊和可靠的用途，包括在许多体外方案中的实际应用。某些应用涉及抗体、肽和免疫缀合物的特异性结合特性。由于本发明的所有构建物都包含至少一种可结合氨基磷脂和/或阴离子磷脂的抗体或肽成分，因此事实上它们可用于多种结合方案中，包括有用的结合测定法。
尽管相关时存在的附着剂提供了有益特性，但是不否定第一种抗体或肽区域在任何结合测定法中的效用。因此，适用的结合测定法包括常常被本领域所采用的方法，诸如免疫印渍、Western印渍、点印渍、RIA、ELISA、免疫组织化学、荧光激活细胞分拣术(FACS)、免疫沉淀、亲和层析、等等，本文对此有进一步描述。
某些标准结合测定法将抗原固定在固体支持物基质，如硝酸纤维素、尼龙或其组合上，诸如免疫印渍、Western印渍、ELISA和相关测定法。其它的重要检测法是那些利用细胞的检测法，其中本发明的组分可用于检测在细胞表面具有具有氨基磷脂和/或阴离子磷脂的细胞。这些测定法可用于临床前检测，如，关于药物的设计、检测作用机制和/或选择联合使用的治疗剂。
其它的体外检测法可用于诊断与异常细胞活化和/或凋亡相关的疾病，其中检测氨基磷脂和/或阴离子磷脂在细胞表面的存在尤其有用。本发明的构建体还可在免疫组织化学中与新鲜冷冻的和福尔马林固定、石蜡包埋的组织块相结合使用；用于荧光激活的细胞分拣术、流式细胞计、或流式显微荧光测定法中。
本发明的构建体还可进一步用于免疫沉淀；用于抗原纯化实施方案，诸如亲和层析，甚至在双特异性抗体的情况中包括一步同时快速纯化一种或多种抗原；和用于本领域技术人员根据本文提供的信息将了解的其它结合测定法。
本发明的其它实际用途是在功能测定法中作为对照，包括许多体外和离体(exvivo)测定法和系统。按本文所公布的，由于本发明抗体、肽和缀合物的结合和功能特性特别有特异性，因此这种“对照”用途事实上极有价值。受益于本发明的这种实际用途的测定法包括例如关注氨基磷脂和/或阴离子磷脂在细胞表面检测的测定法。这些测定系统还可以发展成体外或离体药物筛选测定法，其中本发明提供的具有详细描述特性的生物学物质特别重要。例如，在药物筛选和开发中，利用本发明的构建体作为阳性对照选择具有类似、同等或改良结合特性的小分子。
J.药物组合物
本发明的治疗剂将通常被制备成药物组合物。药物组合物将包含生物学或治疗有效量的至少第一种本发明的治疗剂，它们溶解或分散于制药学可接受的载体或水性介质中。还包括联合治疗剂，而相同类型的相应药物组合物可用于单一和联合药物。
术语“制药学或药理学可接受的”指当适当施用于动物或人后不会产生不利的、过敏的、或其它不良反应的分子实体和组合物。本发明同样包括兽医应用，且“制药学可接受的”制剂包括可用于临床和/或兽医应用的制剂。
如本文所用，“制药学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、等等。本领域众所周知这些介质和试剂对制药学活性物质的应用。在此范围内，除了活性成分与任何常规介质或试剂不相容，否则，预计它们能用于治疗组合物中。为了施用于人，制剂应当达到FDA局生物药剂标准要求的无菌、热原性、全面安全性、和纯度标准。组合物中还可以掺入补充的活性成分。
“单位剂量”制剂是包含所施用成分适用于特定定时投递的一份剂量或亚剂量的类型。例如，例示性的“单位剂量”制剂包含每日剂量或单位或每日亚剂量、每周剂量或单位或每周亚剂量、等等。
J1.可注射制剂
本发明的治疗剂常常被配制成供非肠道施用，尤其是对于肿瘤治疗来说，例如经配制供静脉内、肌肉内、皮下、穿真皮、或其它这种途径的注射，包括蠕动施用和直接滴注至肿瘤或疾病位点(腔内施用)。本领域技术人员参照本公开书将知道含有抗体或免疫缀合物或肽缀合物作为活性成分的水性组合物的制备。这些组合物通常被制备成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备成适用于在注射前通过加入液体而制成溶液或悬浮液的固体形式；而且制品也可进行乳化。
适于注射使用的制药学形式包括无菌水溶液或分散液；包括麻油、花生油、或水性丙二醇的制剂；和用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在所有情况下都必须是无菌形式，并且流动程度必须易于注射。制剂在制备和储存条件下必须很稳定，而且必须能够防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。
治疗剂可配制成中性或盐形式的无菌水性组合物。可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备游离碱或制药学可接受盐形式的治疗剂的溶液。制药学可接受的盐包括酸加成的盐(与蛋白质的游离氨基形成)，以及与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、三氯乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。与游离羧基基团形成的盐也可衍生自无机碱(诸如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁)和有机碱(诸如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸，普鲁卡因、等等)。
合适的载体包括含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇、等等)、其适当混和物、和植物油的溶剂和分散介质。在许多情况中，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用包衣，诸如卵磷脂，在分散剂的情况中通过维持所需颗粒大小，和/或通过使用表面活性剂，可以维持适当流动性。
在普通的储存和使用条件下，所有这些制剂应当包含防腐剂以防止微生物的生长。通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等，可以防止微生物的作用。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。
在配制之前或之后，治疗剂应当彻底透析以除去不需要的小分子量分子，和/或适当时冻干，从而更易于配制到所需载体中。通过将所需量的溶于适当溶剂的活性剂与各种上述其它成分混和，随后过滤除菌，由此制备无菌的可注射溶液。通常，通过将各种无菌的活性成分掺入含基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌载体来制备分散剂。
在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
本发明的合适药物组合物通常包含与可接受的制药学稀释剂或赋形剂(诸如无菌水溶液)混合以达到所需终浓度范围(取决于预定用途)的一定量的治疗剂。本领域通常众所周知制备技术，例如可参阅《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Mack出版公司，1980(本文收入作为参考)。为了施用于人，制剂应当符合FDA局生物制剂标准要求的无菌、致热性、全面安全性、和纯度标准。配制后，以与剂型相容的方式，以治疗有效量施用治疗剂。
J2.缓释制剂
可以多种剂型容易地施用制剂，诸如上述可注射溶液的形式，但还包括其它制药学可接受形式，如片剂、丸剂、胶囊或用于口服的其它固体、栓剂、阴道栓剂、滴鼻液或喷雾剂、气雾剂、吸入剂、局部制剂、脂质体形式、等等。施用形式的类型应与治疗的疾病或紊乱匹配。
可以使用制药学“慢释”胶囊或“缓释”组合物或制剂。慢释制剂通常被设计成在较长的一段时间内维持恒定的药物水平，并可用于投递本发明的治疗剂。通常将慢释制剂植入疾病位点(例如肿瘤位点或病毒感染位点)附近。
缓释制剂的合适范例包括含治疗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质为有形物品的形式，如薄膜或微囊。缓释基质的范例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(如美国专利3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(诸如Lupron DepotTM，由乳酸-乙醇酸共聚物与乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够在长达100天的时间里释放分子时，而某些水凝胶释放蛋白质的时间要短一些。当包囊的抗体在体内维持了较长时间后，它们可能因暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性降低和/或免疫原性改变。根据涉及的机制，可采用合理的策略来进行稳定。例如，若聚集机制涉及经硫-二硫键交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制水气含量、使用适当添加剂、开发特异性聚合物基质组合物等等来实现稳定。
J3.脂质体和纳米颗粒(nanoparticle)
在某些实施方案中，可以将脂质体和/或纳米颗粒用于治疗剂。本领域技术人员通常知道脂质体的制备和使用，见下文概述。本发明提供了抗体、脂质体和化疗剂的特别组合，见下文所述。此外，脂质体制剂还可用作本发明全部治疗剂中任一种的常规组分。
由分散于水性介质并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡，MLV)的磷脂可形成脂质体。MLV的直径通常为25nm-4μm。对MLV的超声波处理导致形成小型单层囊泡(SUV)，直径为
Figure C03816751D0121161441QIETU
，其核心含有水性溶液。
当分散于水中时，根据脂质与水的摩尔比，磷脂还能够形成除脂质体以外的多种结构。在低比率，脂质体是优选结构。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度、和二价阳离子的存在。脂质体能够对离子性和极性物质显示低通透性，但是当温度升高时发生相变，显著改变其通透性。相变涉及由紧密的有序结构(称为凝胶态)向松散的无序结构(称为流体态)的改变。这发生于特征性相变温度，并导致对离子、糖、和药物的通透性增加。
脂质体经四种不同的机制与细胞发生相互作用：网状内皮系统吞噬细胞的内吞作用，诸如巨噬细胞和嗜中性细胞；细胞表面的吸附，这通过非特异性弱疏水作用或静电作用来实现，或者通过与细胞表面成分的特异性相互作用；脂质体的脂双层通过嵌入原生质膜而与细胞膜的融合，同时将脂质体内容物释放进入细胞质；和脂质体脂质转移至细胞或亚细胞膜，或反向转移，无脂质体内容物的任何结合。改变脂质体制剂能够改变起作用机制，但是可能同时有超过一种机制起作用。
纳米颗粒通常能够以稳定且可重现的方式俘获化合物。为了避免因细胞内聚合物过多引起的副作用，应当使用体内可降解的聚合物来设计这些超微颗粒(大小为大约0.1μm)。预计符合这些要求的生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒可用于本发明，而且这些颗粒易于制备。
J4.眼科制剂
许多眼科疾病，尤其是具有血管发生成分眼科疾病都可以用本发明治疗。例如，如下所述，眼新血管疾病、与年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、新血管性青光眼、晶体后纤维增生症和其它与角膜新血管生成或视网膜/脉络膜新血管生成相关的疾病。
本发明的治疗剂由此可以有利的用于制备适合作为眼科用液使用的药物组合物，包括玻璃体内和/或眼房内(intracameral)施用的眼科用液。为了治疗任何上述或其它疾病，以按照传统制药学实践(参阅例如《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，第1488-1501页(Mack出版公司，Easton，PA))制成的眼科制剂形式将治疗剂施用于需要治疗的个体的眼部。
眼科制剂在制药学可接受的溶液、悬浮液或油膏中含有治疗剂，其浓度为大约0.01-大约1％(重量百分比)，优选大约0.05-大约0.5％。根据采用的具体化合物、待治疗个体的状况诸如此类，可能需要改变浓度。负责治疗的人员将为该个体确定最适浓度。眼科制剂通常优选无菌水性溶液的形式，如果需要，还可以包含额外成分，例如防腐剂、缓冲液、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型湿润剂或澄清剂、增稠剂、等等。
适用于这种溶液的防腐剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵、三氯叔丁醇、硫柳汞等等。合适的缓冲液包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、醋酸钠、磷酸氢钠、等等，其量足以将pH维持在大约pH6-pH8，优选大约pH7-pH7.5。合适的张力剂是dextran40、dextran70、右旋糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠、等等，使得眼科用液的氯化钠当量为0.9±0.2％。
合适的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等等。合适的湿润剂和澄清剂包括polysorbate80、polysorbate 20、poloxamer282、和泰洛沙泊(tyloxapol)。合适的增稠剂包括dextran40、dextran70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、凡士林、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等等。眼科制剂将通过传统方法局部施用于需要治疗的个体的眼部，例如以滴液的形式或以眼科用液洗眼。
J5.局部制剂
在最广的意义上，局部施用制剂包括用于经口(口腔)和经皮肤投递的制剂。“局部投递系统”还包括含待施用成分的穿真皮贴剂。如果需要，还可以通过离子电渗或电转移来实现经皮肤的投递。
适用于口局部施用的制剂包括在调味基质(通常是蔗糖与阿拉伯胶或黄芪胶)中包含活性成分的锭剂、在惰性基质(诸如明胶与甘油或蔗糖与阿拉伯胶)中包含活性成分的软锭剂、和在合适液态载体中包含待施用成分的漱口剂。
适用于皮肤局部施用的皮肤包括在制药学可接受载体中包含待施用成分的油膏、乳膏、凝胶、和糊剂。正如本领域众所周知的，用于局部施用的治疗剂的制剂，诸如乳膏、油膏、和凝胶，包括油质或水溶性油膏基底的制剂。例如，这些组合物可以包含植物油、动物脂肪、和更优选的得自石油的半固体碳氢化合物。所用具体成分可以包括白色油膏、黄色油膏、十六烷基酯蜡、油酸、橄榄油、石蜡、凡士林、白色凡士林、鲸蜡、甘油淀粉、白蜡、黄蜡、羊毛脂、无水羊毛脂、和甘油单硬脂酸酯。还可以使用各种水溶性油膏基底，包括乙二醇醚及其衍生物、聚乙二醇、硬脂酸40聚烃氧基酯、和polysorbate。
用于直肠施用的制剂可以是在合适基底中包含例如可可脂或水杨酸酯的栓剂。适用于阴道施用的制剂可以是除了活性成分之外还包含本领域已知的适当载体的阴道栓剂、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂制剂。
J6.鼻科制剂
经鼻和呼吸路径的局部投递可用于治疗各种状况，尤其是用于本发明的抗病毒治疗法中。这些投递路径还适用于将药剂投递到系统循环中。本发明因此包括在适用于鼻施用的载体中包含活性成分的制剂，例如鼻科用液、喷雾剂、气雾剂、和吸入剂。当载体是固体时，制剂包括具有20-500微米颗粒大小的粗粉，当施用时，将装有粉末的容器置于鼻下由鼻孔快速吸入。
载体是液体的合适制剂可用于鼻施用。鼻科用液常常是设计并制备成滴液或喷雾剂、经鼻孔施用的水性溶液，它们在许多方面与鼻分泌物相似，使得能够维持正常的纤毛作用。由此，水性鼻科用液通常是等渗并略有缓冲的，维持于pH5.5-6.5。另外，如果需要，制剂中可以包含与用于眼科制剂相似的抗微生物防腐剂和合适的药物稳定剂。已知多种商品化的鼻科制剂，包括例如抗生素和抗组胺剂，并用于预防哮喘。
吸入剂是设计用于将药物或化合物投递至患者呼吸树的药物制剂。施用水汽或水雾并使之到达受疾病侵袭区域。此路径还可用于将药剂投递至系统循环中。可以通过鼻或口呼吸路径施用吸入剂。只有当小液滴足够细小且大小均一从而水雾能够到达细支气管时，吸入液的施用才会有效。
同样称为吸入剂、有时称为吹入剂的另一组产品包含精细粉状或液体药物，它由特殊投递系统(诸如在液化气体推进剂中包含药物溶液或悬浮液的药物气雾剂)携带进入呼吸通路。当经合适阀门和口接管释放时，将计量剂量的吸入剂推进到患者呼吸道中。颗粒大小在这种类型制剂的施用中特别重要。据报导，渗透进入肺腔的最佳颗粒大小范围为0.5-7μm。通过对气雾剂增压而产生精细水雾，由此使其应用具有上述优点。
K.诊断和治疗药剂盒
本发明还提供了包含至少本发明的第一治疗剂(即可与氨基磷脂或阴离子磷脂结合的抗体、免疫缀合物或肽缀合物)的诊断和治疗药剂盒，可用于治疗方法、组合的治疗方法和/或用于成像和治疗实施方案中。这些药剂盒通常在第一种合适的容器(或容器装置)中包含至少一种可与氨基磷脂或阴离子磷脂结合的治疗剂、抗体、免疫缀合物或肽缀合物的制药学可接受制剂。药剂盒还包含书面或电子版的说明书，用于如临床前、临床和/或畜兽医实施方案中。
药剂盒还可以包含用于联合疗法和/或诊断/成像的其它组合物、制药学可接受制剂和第二生物学和治疗剂。例如，这些药剂盒可以包含任何一种或多种化疗或放疗药物、抗血管发生剂、抗肿瘤细胞抗体、抗肿瘤血管结构或抗肿瘤基质的抗体、免疫毒素或凝血配体、抗病毒剂和/或诊断性组分或药剂。还可包括用于组合疗法和/或诊断和成像的书面或电子版说明书。
药剂盒中可以只有单一容器(容器装置)，其中装有可与氨基磷脂或阴离子磷脂结合的第一种抗体、免疫缀合物或肽缀合物，含或不含其它成分；或者，药剂盒中可以有不同容器，其中各装有所需药剂。当提供联合治疗剂时，可以以等摩尔或一种成分过量的联合方式预先混和单一溶液；或者，可以在施用于患者前，在不同容器中分开保存药剂盒中本发明的主要治疗剂和第二种生物活性剂或治疗剂，诸如第二抗癌剂或抗病毒剂。
诊断组分最通常保存于至少第二种容器中，其区别于含所述一种或多种治疗剂的其它容器或第一种容器。诊断药剂盒可以包含与作为主要治疗剂的相同氨基磷脂或阴离子磷脂可结合的标记抗体或肽，或适于诊断待治疗疾病的任何其它试剂。药剂盒中可包括体内、或体外使用的诊断剂，或者二者兼之。药剂盒可包括书面或电子版的说明书，用于如临床前、临床和/或兽医诊断实施方案中。
尽管优选重配的抗体溶液或粉剂，为了进行体外免疫检测，抗体也可以与例如微量滴定板的孔等固体支持物结合。免疫检测药剂盒优选包含至少第一种免疫检测剂。药剂盒的免疫检测剂可以采取多种形式中的任一种，包括那些与给定抗体相关或连接的可检测标记，诸如体内使用的标记。还包括与第二种结合配体联接或附着的可检测标记。典型的第二种配体是那些与第一种抗体具有结合亲和力的二抗。
另外适当的用于本发明药剂盒的免疫检测剂包括含有与第一种抗体具有结合亲和力的二抗以及与第二种抗体具有结合亲和力的第三种抗体的双组分试剂，第三种抗体与可检测标记联接。许多典型的标记是本领域已知的且可与本发明联合应用。这些药剂盒可以包含完全缀合形式、中间态形式或作为分离部分由药剂盒使用者缀合的抗体-标记缀合物。成像药剂盒优选包含已与体内可检测标记附着的靶向剂或抗体。不过，标记和附着方式可以分开应用。
任一种形式的诊断药剂盒都可进一步包含对照药剂，诸如适当分装的生物学组合物，无论是标记的还是未标记的，如在制作检测试验的标准曲线即会用到。药剂盒的组分可以以水溶液或冻干形式包装。
当以一种或多种液态溶液提供药剂盒成分时，液态溶液优选水性溶液，特别优选无菌水性溶液。但是，也可以以干粉形式提供药剂盒成分。当以干粉形式提供药剂或成分时，可以通过向干粉中加入合适溶剂来进行重建。还可以在药剂盒内的其它容器中提供溶剂。
诊断和治疗药剂盒的容器通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、玻璃瓶、注射器、或其它容器或容器装置，其中装有治疗剂和任何其它所需试剂，且优选适当分装。当优选至少两种分离的组分时，药剂盒将优选包括至少两个这样的容器。药剂盒还可以包含第三种/第四种容器装置，用来包装制药学可接受的无菌缓冲液或其它稀释剂。
药剂盒还可以包含对动物或患者施用治疗剂的装置，如一套或多套针头或注射器、眼滴瓶、取液器、或其它这类装置，由此将制剂注射到动物体内或应用于体内患病区域。本发明的药剂盒通常还包含装这些小瓶等和其它成分以供出售的密封装置，诸如注射或吹制成型的塑料容器，其中装有所需小瓶和其它装置。
L.免疫检测和成像
本发明还提供了供体外和体内使用的诊断和成像方法。这些方法可用于获得诊断、预后和/或成像信息，例如与血管发生疾病和病毒感染相关的信息，优选与肿瘤治疗和成像方法相关的信息。本发明的方法包括体外诊断试验，如在可以非侵入方式获得样品并优选在高通量测定法中进行检验时，和/或临床诊断不明且需要确认时即如此。在体内诊断和成像领域内，本发明的抗体和肽与一种或多种可检测药剂联接并用于形成血管发生位点或肿瘤的图像，任选这作为治疗前的第一步进行。
L1.免疫检测方法和药剂盒
本发明因此涉及用于结合、纯化、量化、或一般性检测氨基磷脂和阴离子磷脂的免疫检测方法，如用于诊断活化的和凋亡的细胞以及相关疾病。本发明的抗体(诸如9D2和3G4(ATCC 4545))可用于在体内对分离的组织样品、活组织样品或swab和/或匀浆组织样品检测氨基磷脂和阴离子磷脂(见下文)。这些免疫检测方法具有明显的诊断效用，而且还可用于非临床样品，诸如抗原样品的滴定等。
诸如Nakamura等人(1987，本文特别收入作为参考)等科学文献已经描述了各种有用的免疫检测方法的步骤。免疫结合方法通常包括：获得怀疑含有氨基磷脂和/或阴离子磷脂的样品，优选怀疑在细胞表面有氨基磷脂和/或阴离子磷脂的细胞，并在能够有效形成免疫复合物的条件下使样品接触本发明的抗体(诸如9D2和3G4(ATCC 4545))。然后检测在结合作用期间形成的任何免疫复合物并优选进行定量。
被分析的样品可以是细胞样品，诸如在实验室中暴露于一定检测条件下的细胞。样品还可以是来自动物或患者，如怀疑患有与一种或多种细胞类型的活化或凋亡相关的疾病的动物或患者的生物学样品。这些样品可以是组织切片或标本、活检组织样品、待测样品式子或涂片、匀浆组织提取物、或者其分离的或纯化的形式。
在能够形成免疫复合物(初级免疫复合物)的有效条件和足够时间下使选定的生物学样品接触抗体，通常也就是简单的向样品中加入抗体，并且将混合物温育足够长的时间以使抗体能够形成免疫复合物(即结合存在的任何氨基磷脂和/或阴离子磷脂)。而此后，通常清洗样品-抗体组合物，诸如组织切片或ELISA板，从而除去任何非特异性结合的抗体，使得只能检测到初级免疫复合物中特异性结合的抗体。
本领域众所周知免疫复合物形成的检测，而且可以通过多种方法来实现。这些方法通常基于标志或标记物的检测，诸如本领域已知的放射性、荧光、生物学、或酶学标签或标记。涉及这些标记物应用的美国专利包括3,817,837、3，850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149、和4,366,241(本文收入作为参考)。通常优选使用在接触显色底物后产生有色产物的酶。正如本领域知道的，也可以使用第二种结合配体，诸如二抗或生物素/抗生物素蛋白配体结合组。
在检测中采用的本发明抗体(诸如9D2和3G4(ATCC 4545))自身可以连接可检测标记物，然后可以通过简单的检测这种标记物来测定组合物中初级免疫复合物的量。
优选通过使用对本发明抗体具有结合亲和力的第二种结合配体的方法来检测初级免疫复合物。在这些情况中，第二种结合配体可以连接可检测标记物。第二种结合配体自身常常是抗体，因此可以称为“二抗”。在能够形成次级免疫复合物的有效条件和足够时间下，使初级免疫复合物接触经标记的第二种结合配体或抗体。然后通常清洗次级免疫复合物以除去任何非特异性结合的经标记第二种配体或抗体，并检测次级免疫复合物中的剩余标记物。
其它方法包括通过两步法来检测初级免疫复合物。如上所述，使用对一抗具有结合亲和力的第二种结合配体(诸如抗体)来形成次级免疫复合物。清洗后，再次在能够形成免疫复合物(三级免疫复合物)的有效条件和足够时间下，使次级免疫复合物接触对二抗具有结合亲和力的第三种结合配体或抗体。第三种配体或抗体连接了可检测标记物，能够检测由此形成的三级免疫复合物。如果需要，该系统可以提供信号放大。
临床诊断或监测可用于患各种疾病的患者，尤其是与细胞表面了氨基磷脂和/或阴离子磷脂暴露增加相关的疾病。氨基磷脂和/或阴离子磷脂的检测，或与来自正常受试者的相应生物学样品中的水平相比较而言的氨基磷脂和/或阴离子磷脂水平的增加，是患所说疾病的患者的指标。
但是，正如本领域技术人员所知道的，不能孤立的根据这种方法来进行临床诊断。本领域技术人员非常熟悉任何区分代表阳性鉴定的生物标记的显著表达与生物标记的低水平或背景表达。事实上，常常将背景表达水平作为“临界点”(cut-off)，比它更多的染色将评为显著或阳性。
L2.体内成像
本发明提供了各种体内诊断和成像的实施方案。本发明的某些方面涉及用于体内诊断和成像的新的和出乎意料地有效的组合物。例如，任何一组或多组本发明的新型抗PS抗体，优选9D2或3G4(ATCC 4545)抗体或具有类似特性的竞争性抗体，都可以与体内可检测药剂联接而形成本发明的免疫诊断缀合物。尽管抗体代表了本领域中的重要进展，所产生的免疫诊断剂现在可用于前述的与氨基磷脂和/或阴离子磷脂检测相关的诊断或成像实施方案中。
在这点上，含本发明抗体(包括9D2或3G4(ATCC 4545)抗体或具有类似特性的竞争性抗体)的免疫诊断剂可用于血管血栓形成的成像，尤其是在心脏内或心脏附近，诸如深静脉血栓症、肺栓塞、心肌梗死、心房颤动、与修复性心血管材料有关的问题、中风，等等。本发明的这些组合物还可用于活化血小板的成像，如在诸如脓肿、再狭窄、关节发炎和止血失调，诸如动脉、冠脉、静脉和脑血栓症等等。本发明的免疫诊断组合物，优选含9D2或3G4(ATCC 4545)抗体或具有类似特性的竞争性抗体的那些组合物，还可用于检测凋亡细胞中，正如可用于其中增加了凋亡或发生了不适当凋亡的各种疾病的诊断和成像中一样。
本发明进一步提供了一系列用于体内诊断和成像的新方法，它们不局限于使用本文提供的抗体组。例如，根据诸如PI、PA和PG等阴离子磷脂是肿瘤血管结构的易接近和稳定的可靶向标记这一意外发现，本发明提供了用于肿瘤诊断和成像的方法，包括施用可结合PI、PA或PG的免疫诊断剂，它们将特别地定位于实体瘤的血管结构。此外，现在可以用可结合诸如PS、PE、PI、PA和PG等氨基磷脂和/或阴离子磷脂(优选PS和PE)的免疫诊断缀合物检测病毒性感染细胞和诊断病毒感染。
本发明的体内成像组合物和方法可用于成像本身，或在体内对位点预成像以便在治疗前形成可靠的图像。优选成像是肿瘤成像。这些组合物和方法还可应用于与氨基磷脂和阴离子磷脂相关的其它疾病或病症的成像和诊断，这样的病症涉及细胞活化和/或凋亡，包括血管发生疾病、动脉硬化症、病毒感染和为诊断或预后目的或者为了设计治疗而期望获得内部影像的其它这样的状况。
在这些实施方案中，抗体和肽，优选本发明的抗体，诸如9D2、3G4(ATCC 4545)和类似抗体，可操作性的附着、联接或缀合可检测标记。“可检测标记物”指能够根据其特定功能特性或化学特征而进行检测的化合物或元素，利用它能够检测出所附着的成分，如果需要，还可以进一步量化。在用于体内诊断方案或“成像方法”的抗体和肽缀合物中，可以使用非侵入式方法来检测标记物。
本领域知道许多适当的成像剂，以及将它们附着于抗体和结合配体的方法(参阅如美国专利5,021,236和4,472,509，本文收入作为参考)。某些附着方法涉及使用金属螯合复合物，其中将例如有机螯合剂(诸如DTPA)附着于抗体上(美国专利4,472,509)。在存在偶联剂(诸如戊二醛或高碘酸盐)时，也可以使单克隆抗体与酶发生反应。在存在这些偶联剂时，或者通过与异硫氰酸酯的反应，可以制备包含荧光素标记物的缀合物。
可检测标记物的范例是顺磁离子。在这种情况中，合适的离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、和铒(III)，特别优选的是钆。
可用于其它内容(诸如X射线成像)的离子包括(但不限于)镧(III)、金(III)、铅(II)，特别是铋(III)。荧光标记物包括若丹明、荧光素和renographin。常常经异硫氰酸酯中间介质来连接若丹明和荧光素。
在用于诊断性应用的放射性同位素的情况中，合适的范例包括14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152铕、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m、和钇90。125I常常优选用于某些实施方案，而锝99m和铟111因它们的低能量和适于长期检测也常常是优选的。
可以参照本领域众所周知的方法产生用于本发明的放射性标记的抗体和肽。例如，常用于使放射性同位素金属离子结合在抗体上的中介官能基是二乙撑三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
也可以通过接触碘化钠或碘化钾与化学氧化剂(诸如次氯酸钠)或酶氧化剂(诸如乳过氧化物酶)使单克隆抗体碘化。可以通过配体交换方法用锝99标记本发明的抗肿瘤抗体，例如，通过用亚锡溶液还原过锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体应用于该柱直接标记技术也是合适的，如将过锝酸盐、还原剂(诸如SNCl2)、缓冲液(诸如邻苯二甲酸钠钾溶液)与抗体一起温育。
任何前述类型的可检测可标记的抗体和结合配体都可用于本发明的成像方面，其或者仅仅用于成像或者用于在治疗前形成疾病位点或肿瘤的图像。无论走任一途径，所说的方法通常包括对动物或患者施用与以非侵入方法可检测的标记相缀合的治疗有效量的抗体或结合配体。抗体-或结合配体-标记缀合物可以有足够时间定位并结合于发病部位(诸如肿瘤或肿瘤血管)中表达氨基磷脂和/或阴离子磷脂的细胞。然后将患者暴露于检测装置中以鉴别可检测标记，由此形成发病部位或肿瘤的图像。
用核磁成像装置检测诸如钆等核磁共振同位素；用γ闪烁相机或检测仪检测诸如锝99m或铟111等放射性物质。为了提供更多的有关可检测标记构建物安全有效进入受试者血液的指导以及用例如γ闪烁相机或磁共振检测法体外测定可检测标记的药剂分布的方法，我们将美国专利5,627,036也特别收编于此作为参考。
用于成像实施方案的剂量通常小于治疗的剂量，但也取决于患者的年龄和体重。每个患者一次剂量为约0.1mg、0.5mg或约1mg到约9mg或10mg，更优选在约1mg到约5-10mg之间的抗体或结合配体缀合物被认为是有用的。
L3.用于癌症治疗的替代标记
关于体内诊断和成像，本发明进一步提供了用作癌症治疗替代标记的组合物和使用方法。这样的实施方案涉及使用与体内可检测药剂联接的、可结合氨基磷脂和/或阴离子磷脂(优选PS)的抗体，更优选使用9D2或3G4(ATCC 4545)抗体或竞争性抗体。
目前使用的许多抗癌疗法诱发了凋亡和坏死。氨基磷脂和阴离子磷脂，尤其是PS，是凋亡前和凋亡细胞的标志物。因此，利用合适的抗体，优选9D2、3G4(ATCC 4545)或竞争性抗体进行成像可以用来鉴定凋亡前和凋亡细胞并由此提供有关治疗进展的信息。用于本文时，这是“癌症治疗的替代标记物”的含义。
利用本发明的抗体，优选9D2或3G4(ATCC 4545)抗体或具类似特征的竞争性抗体作为替代标记物对于癌症治疗尤其有利。例如，鉴定凋亡前细胞的能力尤其有好处。抗体的特异性还将为内科医师提供更有意义的图像数据。此外，这些抗体的安全特性是令人印象深刻的且优越于膜联蛋白，例如，膜联蛋白具有与凝血有关的缺点。
因此，上述任何体内诊断和成像方法都可能适于作为替代标记物用于癌症治疗的预后中，仅仅施用于接受癌症治疗的患者中即可。
M.肿瘤治疗
本发明的重要方面涉及恶性肿瘤、肿瘤和血管化肿瘤的治疗。这包括血管发生有或多或少重要性的肿瘤和具有前血栓性血管的肿瘤。良性肿瘤的治疗也包括于本发明中，诸如听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼、化脓性肉芽肿和BPH。血液肿瘤的治疗也涵盖在内，诸如白血病和各种急性或慢性骨髓瘤疾病。
本发明可广泛的用于治疗任何恶性肿瘤，无论该肿瘤是否具有血管组分。可治疗的肿瘤包括实体瘤，尤其是癌，它需要血管成分来提供氧气和营养。典型的可用本发明治疗的实体瘤包括，但不局限于，肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状上皮细胞癌、腺癌、小细胞癌、恶性黑素瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤等等。
本发明被包括用于治疗任何患实体瘤的患者。一般而言，本发明可用于治疗所有尺寸的肿瘤，包括约0.3-0.5cm和更大的肿瘤以及大于0.5cm的肿瘤，所患肿瘤在约1.0和约2.0cm大小之间的患者，也可以治疗人体中已发现的最大的肿瘤。
尽管本发明通常并不意图用作防护性的或预防性的疗法，但本发明的使用当然不局限于治疗患中等大小或大肿瘤的患者。造成本发明的这些方面是有许多原因的。例如，呈现中等大小或更大原发肿瘤的患者还可能具有被认为小尺寸或甚至在转移性肿瘤萌芽早期的各种转移性肿瘤。既然本发明的抗氨基磷脂或阴离子磷脂抗体或PE结合肽衍生物或组合通常施用入患者的全身循环中，它们将自然对次级的、较小的和转移性肿瘤具有效用，尽管这可能不是治疗的最初目的。此外，即使在肿瘤块整体是一单一的小肿瘤的情况下，使用本发明的疗法也将产生某些有利的抗肿瘤效果。
本文提供的关于使用本发明治疗更合适的患者的指导意欲指出，某些患者特征可能有助于选择可用本发明治疗的患者。预先选择某些患者，或将患者分类，并不否定本发明可用于治疗患癌症的所有患者。进一步考虑的事实是本发明抗体疗法对肿瘤的攻击可能使肿瘤易于接受进一步的治疗，从而使随后的治疗导致全面协同效果或甚至导致完全消除或治愈。
不认为任何特定类型的肿瘤应当排除在本发明治疗以外。但是，肿瘤细胞的类型可能与本发明与其它治疗剂、特别是化疗剂和抗肿瘤细胞免疫毒素的联合使用有关。由于本发明在其作用模式内包括肿瘤血管结构的靶向和破坏，并且所有实体瘤中的血管结构基本上或完全相同，所以可以理解，本发明方法学广泛或完全适用于治疗所有实体瘤，无论肿瘤细胞自身是哪种特定的表型或基因型。本文所呈现的结果是引人注目的，由于它在多种不同肿瘤模型中都显示了不寻常的结果。
使用来自动物模型的资料，如本文详细显示的研究，以及一系列治疗剂的临床使用资料，可以容易的确定治疗有效剂量。在转换成临床环境之前，常常用携有实体瘤的实验动物来优化合适的治疗剂量。已知这些模型能够很可靠的预测有效的抗癌策略。例如，携有实体瘤的小鼠(诸如实施例中使用的)被广泛用于临床前检验。发明人已经使用了这样的本领域认可的小鼠模型来确定治疗剂给出有益抗肿瘤效果而毒性最低的工作范围。
就肿瘤疗法而言，在考虑到与本发明整体有关的使用安全优势之时，也可以参考关于成功使用其它抗血管疗法的科学和专利文献。作为例示，美国专利5,855,866、5,877,289、5,965,132、6,051,230、6,004,555、5,776,427、6,004,554、6,036,955和6,093,399在此收入作为参考，以便进一步描述所说治疗剂也可如同本发明中的其它药剂一样应用。美国专利6,312,694和6,406,693也特别收编于此作为参考，以指导用未缀合的抗PS和PE抗体及相关免疫缀合物进行治疗的方法和剂量。
正如本领域知道的，有一些现时目标可以作为进行临床治疗前的临床前检验中的指导方针。然而，由于在已认可模型中已证明的安全性，本发明的临床前试验将更倾向于最优化，而不仅仅是证实效力。因此，临床前检验可用于选择最有利的抗体、剂量、或联合。
导致任何一致性可检测抗肿瘤效果，包括可检测的肿瘤血管退化、肿瘤血栓症和/或破坏和肿瘤坏死的任何抗体制剂、组合方法或药物都将成为有用的发明。退化、血栓、破坏和坏死效果优选应在约10％到约40-50％之间的肿瘤血管和肿瘤组织中观察到，甚至在多达约50％-约99％的肿瘤血管和肿瘤组织中可观察到所说的效果。本发明还对肿瘤下游的脉管有效，即靶向至少一类引流脉管，特别是当由肿瘤释放的细胞因子作用于这些脉管，改变它们的抗原特性时。
还可以理解的是，甚至在治疗的抗肿瘤效果为预定治疗范围低端值的情况下，与特定肿瘤靶有关的其它已知疗法相比，这种疗法仍然可能同样甚至更加有效。不幸的是，临床医生知道某些肿瘤不能在中期或长期中获得有效治疗，但是这并不否定本发明疗法的有效性，当它与通常建议的其它策略至少大致一样有效时尤其如此。
在为治疗血管化肿瘤设计抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、PE结合肽衍生物或组合治疗剂的适当剂量时，可以容易的由本文所述动物研究进行外推，从而获得临床施用的适当剂量。为了实现这一转变，需要考虑对单位质量的实验动物所施用的药剂量，优选考虑实验动物与人患者之间的体表面积差异。所有这些计算对于本领域普通技术人员而言是众所周知的，而且是常规的。
例如，采用小鼠研究中治疗剂的成功剂量，并通过应用基于质量和表面积的标准计算，将得出活性剂用于人患者的有效剂量是每个患者大约1mg-大约500mg抗体，优选大约10mg-大约100mg抗体。
由此，根据这一信息，发明人预计施用于人的有用低剂量将是大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、或30mg/个患者；施用于人的有用高剂量将是每个患者大约250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或约500mg左右。施用于人的有用中间剂量被认为是每个患者大约35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或大约225mg左右。一般而言，优选剂量范围是每个患者约5-100mg、约10-80mg、约20-70mg、约25-60mg或约30-50mg。不过，也可以考虑使用任何前述示范性剂量的任何特殊剂量范围或在特别提及的范围间的任何有效中间剂量。
无所谓提及的范围，应当理解，根据给定的参数和本文所提出的详细指导，活性或最佳范围内进一步的变化都将涵盖于本发明内。因此，可以理解，较低剂量更适于与其它药剂联合，高剂量仍然可以耐受，由于本发明构建物的安全性获得增强，因此更是如此。人或人源化抗体以及人效应物的应用使得本发明在临床应用中甚至更安全，可进一步降低在健康组织中产生显著毒性或副作用的机会。
本发明治疗方案的目的通常是产生显著的抗肿瘤效果，同时将剂量维持在与不可接受的毒性相关的水平以下。除了改变剂量本身以外，还可以改变施用方案以优化治疗策略。目前优选的治疗策略是施用约1-500mg，优选约10-100mg的抗体或含有它们的治疗剂混合物，在约7天期间施用约3次。例如，可以在约第1天、第3或4天和第6或7天给药。
在施用特定剂量本身时，优选给患者全身性提供制药学可接受的组合物(符合FDA关于无菌、致热性、纯度、和全面安全性的标准)。通常优选静脉内注射，最优选在大约1或2小时左右的时间内进行连续灌注。尽管在使用本发明进行治疗前不需要测定所说的参数，应当提及本文所详述的这些研究在注射约12-24小时内在实体瘤血管内特异观察到了至少一些血栓形成，且肿瘤细胞本身在约24-72小时内开始死亡。在紧接着的约48-96小时内通常观察到普遍的肿瘤坏死，观察到多达60％、甚至多于60％的肿瘤坏死。
自然，在广泛应用前需要进行临床试验。本领域技术人员参照本公开书将知道进行临床试验的多种要素。提供下列资料作为建立这些试验的一般性指导。
选择用于第一种治疗研究的患者应是对至少一个疗程的常规疗法没有应答，而且通过体格检查、实验室技术、和/或放射显影方法测定出该患者患有客观的可测量疾病。在开始研究前2周应当停止任何化疗。当使用鼠单克隆抗体或抗体部分时，患者应当对小鼠免疫球蛋白没有变态反应史。
发现使用具有三联腔门的内置式中枢静脉导管具有某些优点。应当使用例如0.22μm的滤器过滤治疗剂，并用诸如生理盐水适当稀释至终体积100ml。使用前，也应当以相似方式过滤待测样品，过滤之前和之后通过测定A280评估其浓度。预计回收率应当在87％-99％范围内，然后可以根据蛋白质的损失进行调整。
构建物可以在大约4-24小时的时间内施用，每个患者以2-7天的间隔接受2-4次输注。也可以在7天的时间内以稳定的输液速率施用。输液的剂量水平应当取决于是否观察到任何毒性。因此，如果任何单次输液后或稳定速率输液的特定时间点达到II级毒性，那么应当停止进一步的给药或停止稳定速率输液，直至毒性改善为止。应当将增加的剂量施用于患者组直至任一组中大约60％的患者显示不可接受的III级或IV级毒性。将该值2/3的剂量确定为安全剂量。
当然，治疗之前和治疗后每隔不超过1个月应当进行体格检查、肿瘤测量、和实验室检验。实验室检验应当包括全血计数、血清肌酸酐、肌酸激酶、电解质、脲、氮、SGOT、胆红素、白蛋白、和总血清蛋白。应当通过放射免疫测定法评价治疗后长达60天取的血清样品中所施用的构建体和针对其任何部分的抗体的存在情况。使用任何标准测定法(诸如ELISA或RIA)对血清进行的免疫学分析，能够评价治疗剂的药代动力学和清除情况。
为了评价抗肿瘤应答，应当在最后一次输注后48小时-1周内和第30天检查患者。当存在可触知的疾病时，应当在治疗过程中的每一天、治疗完成后的1周内、和第30天测定所有肿瘤块的两个正交直径。为了测量不可触知的疾病，应当在48小时-1周内和第30天，遍及胸、腹、和骨盆以1cm为间隔进行系列CT扫描。还应当使用疾病位点活组织切片或适当时使用血液或流体样品，在组织学上和/或通过流式细胞术评价组织样品。
可以通过可接受的测量来确定临床应答。例如，治疗后1个月所有可测量肿瘤消失可以确定为完全应答。而治疗后1个月所有可评估的肿瘤结的正交直径乘积的总和降低50％或更多，并且无肿瘤位点显示增大，可以确定为部分应答。相似的，治疗后1个月所有可测量病变的正交直径乘积减少50％或更多，并且一个或多个位点发生恶化，可以确定为混合应答。
根据来自临床试验的结果(诸如上文所述)，可以设计甚至更精确的治疗方案。虽然如此，根据治疗个体的状况，后来可能必须对剂量做一些改变。负责施用的医师参照本公开书将能够为各个受试者确定适当剂量。这些优化和调整在本领域是常规的，绝非反映需要过多实验。
N.组合肿瘤疗法
本发明的治疗方法可以与常用于治疗患者展示的特定肿瘤、疾病或紊乱的任何其它方法结合使用。只要知道特定的治疗方法自身对患者状况无害，且不显著抵消本发明的基于抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂的疗法，那么就可以与本发明联合使用。
也考虑组合疗法用于非恶性疾病的治疗。具体的例子是良性前列腺肥大(BPH)，它可以用本领域目前实施的其它疗法联合治疗。例如，将免疫毒素靶向于BPH内定位的标记物，诸如PSA。
对于实体瘤的治疗，本发明可以联合经典方法，诸如手术、放疗、化疗、细胞因子疗法、抗血管形成等等。本发明由此提供了联合疗法，即在手术或放疗之前、之时、或之后使用抗体、免疫缀合物或肽缀合物；或者，在传统的化疗、放疗剂、细胞因子、抗血管发生药剂、凋亡诱导剂、靶向性免疫毒素或凝血配体等之前、之时、或之后对患者进行施用。上文针对本发明免疫缀合物方面描述了适当治疗剂的许多实例。在本发明的组合疗法中，开始被描述用作治疗缀合物一部分的任何药剂也可以分开使用。
至于手术，任何手术干预都可以与本发明联合实施。至于放疗，包括用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，诸如γ照射、X射线、UV照射、微波、和甚至电子发射等。也包括将放射性同位素靶向投递至肿瘤细胞，这可以与靶向抗体或其它靶向方法联合使用。
众所周知物质联合在癌症治疗中的一般性应用。例如，美国专利5,710,134(本文收入作为参考)公开了与无毒物质或“药物前体”联合时在肿瘤中诱导坏死的成分。由坏死过程释放的酶切割无毒的“药物前体”变成有毒的“药物”，从而导致肿瘤细胞死亡。同样，美国专利5,747,469(本文收入作为参考)公开了编码p53的病毒载体与DNA破坏剂的联合应用。任何这些相似方法都可用于本发明。
当一种或多种药剂与本发明的抗体、免疫缀合物和基于肽的治疗剂联合使用时，不要求联合结果是分开进行每种治疗时观察到的效果的加和。虽然通常希望获得至少加和的效果，但是抗肿瘤效果相对于一种单一疗法有任何增长也是有益的。同样，没有特别要求联合治疗展示协同效果，尽管这当然是可能的且有益的。
N1.第二抗癌剂的选择
本发明的“主要治疗剂”在用于本文中时，是抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、免疫缀合物或PE-结合肽衍生物和缀合物。“第二治疗剂”在用于本文时，是另一种不同的治疗剂或抗癌剂，即，“除了”主要治疗剂之外的治疗剂或抗癌剂。任何第二治疗剂都可与本发明的治疗剂联合使用。此外，按照下述说明，可以从达到加和、大于加和和潜在的协同效果的出发点选择第二治疗剂或“第二抗癌剂”。
为了实施组合的抗肿瘤治疗，可以只是简单的将本发明的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、免疫缀合物或基于PE结合肽的治疗剂与其它，即另一种不同的抗癌剂以在动物或患者内有效产生其联合抗肿瘤作用的方式联合施用于动物或患者。因此，可以有效地导致其联合存在于肿瘤或肿瘤血管结构中以及它们在肿瘤环境中的联合作用的量和时间提供所说的药剂。为了达到此目的，可以基本上同时施用本发明的主要治疗剂和不同的第二抗癌剂，它们或者在单一的组合物中，或者作为两种不同的组合物通过不同的途径施用。
或者，可在该不同的第二抗癌剂之前或之后施用本发明的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、免疫缀合物或基于PE结合肽的治疗剂，如间隔数分钟到数周。在本发明的主要治疗剂和该不同的第二抗癌剂分别施用于动物的某些实施方案中，应保证在各递送的时间之间不花费太多时间，从而使各药剂仍然能够发挥其在肿瘤上的优越组合效果。在这些情况下，预计可以相互间间隔约5分钟到约1周内用两种药剂接触肿瘤，更优选，相互间间隔约12-72小时内，最优选的延迟时间是只有约12-48小时。
可基于一定的标准，包括那些下述的标准，选择用于分别定时的组合疗法的第二治疗剂。不过，优选一种或多种不同的第二抗癌剂用于在先或后续给药并不排除在需要时将它们基本上在同一时间施用。
选择在本发明主要治疗剂施用“之前”施加且设计成达到增大和潜在协同效应的不同的第二抗癌剂包括在肿瘤血管结构中诱导氨基磷脂或阴离子磷脂表达的活性剂。例如，刺激定位钙产生、激活转移PS和其它磷脂至质膜外表面的膜转运蛋白、损伤肿瘤内皮、在肿瘤内皮中引起凋亡前变化和/或诱导凋亡的药剂通常将导致氨基磷脂和阴离子磷脂表达增加。这些药剂的例子是多西他赛和紫杉醇。然后可用本发明的抗体靶向氨基磷脂和阴离子磷脂，由此扩大了整体治疗效果，还通过宿主效应器(补体、ADCC、抗体介导的胞噬作用、CDC)提高了攻击性。
对血管发生、重新塑造或活化的内皮细胞具有选择性的药物，诸如存在于肿瘤血管中，但不存在于正常静息血管中的药物，也可用于选择性的引起PS和其它磷脂暴露于肿瘤内皮细胞的表面。这些药剂的例子是combretastains和多西他赛。这将再次导致增加抗体的结合并增强宿主效应器机制的启动。
选择在本发明主要治疗剂施用“之后”给药且设计成达到增大和潜在地协同的效应的不同的第二抗癌剂包括在主要治疗剂效果中受益的药剂。本发明的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、免疫缀合物或基于肽的治疗剂将引起肿瘤破坏。因此，随后施用的有效第二独特抗癌剂包括抗血管发生剂，它抑制转移；靶向于坏死肿瘤细胞的药剂，例如特异于体内恶性细胞上变得易接近的细胞内抗原的抗体(美国专利5,019,368、4,861,581和5,882,626，分别收编于此作为参考)；化疗剂和抗肿瘤细胞免疫缀合物，它们攻击可存活于外围的任何肿瘤细胞。
在有些情况中，当相应施用之间间隔几天(2、3、4、5、6、或7)、几周(1、2、3、4、5、6、7、或8)、或甚至几月(1、2、3、4、5、6、7、或8)时，可能需要显著延长治疗时间。这对于其中一种治疗(诸如施用本发明的主要治疗剂)意欲充分破坏肿瘤而另一种治疗(诸如施用抗血管发生剂)意欲防止微转移或肿瘤再生长的情况也是有益的。应当注意在手术后一段安全时间施用抗血管发生剂以确保有效的创伤愈合。然后可以在患者的一生中施用抗血管发生剂。
也可以预计可不止一次的施用主要治疗剂或该第二独特抗癌剂。主要治疗剂或第二独特抗癌剂可以在不同的日子或星期交替施用；或者先进行一系列的某种药剂的治疗，随后再进行一系列的另一种治疗。在任一种情况下，为了实现肿瘤退化而使用联合疗法的任何情况中，只需要以有效展现抗肿瘤效果的联合量投递两种药剂，而不用管施用的次数。
无论是基本上同时施用还是顺序施用，本发明的抗氨基磷脂和抗阴离子磷脂抗体及治疗剂都可与一种或多种化疗剂或药物联合施用。化疗剂可以杀死增殖的肿瘤细胞，增加全面治疗所产生的坏死区。药物由此增强了本发明主要治疗剂的血栓形成作用。
大部分癌症化疗剂对于分裂的氧化细胞有选择性。这些药物在组合疗法中是有优势的，因为化疗药物作用于与本发明主要治疗剂不同的靶目标上，产生更全面的抗血管或抗肿瘤效果。例如，化疗剂选择性的对肿瘤外围快速分裂的氧化肿瘤细胞具有活性，而本发明的药剂主要作用于“受压”肿瘤核心中的血管或肿瘤细胞，其中富含活化的反应性氧形式。对肿瘤外围的充分氧化的新生血管具有选择性的抗血管发生药物也可被有效的联合使用，因为本发明的药剂作用于肿瘤核心中相对含氧量低的静息血管。
通过诱导肿瘤血管中血栓的形成，本发明的主要治疗剂还可通过在肿瘤内保持或截留药物而增强化疗药物的作用。化疗剂由此被保持在肿瘤内，而药物的其它部分则从肿瘤中清除掉。肿瘤细胞因此在更高浓度的药物中暴露了更长的时间。药物在肿瘤内的这种截留使得有可能减少药物的剂量，使治疗更安全有效。
在本发明中可组合使用的其它药物是作用于因主要治疗剂而对所说药物“致敏”的细胞上的药物，从而减少了达到其抗肿瘤效果所需的第二药物的剂量。例如，这可以在这样的情况下发生，即，第二药物的主要组分作用于肿瘤血管中，且本发明的抗体或药剂使细胞对该药物敏感。在本发明的主要治疗剂直接地或者通过刺激细胞因子的释放而使肿瘤细胞对第二药物敏感的情况下也是如此。
用于组合疗法的其它适当的第二抗癌剂是增强宿主效应细胞活性的药剂，如通过选择性的抑制免疫系统中免疫抑制组分的活性而起作用的那些。所说的药剂使本发明的主要治疗剂更具有攻击性，作为其治疗机制的一部分它刺激了效应细胞的进攻。这样的药剂的例子是多西他赛。
尽管进行本发明不需要了解主要治疗剂的确切作用机制，有关这些机制的资料和合理推论可用于选择联合用于本发明的具体第二抗癌剂。所选组合疗法的效力继而支持了原始资料和推测的作用机制，还确定了进行组合疗法的第二抗癌剂的优选范围。
诱导凋亡的药物优选用于组合疗法中。例如，多西他赛通过与微管结合并破坏细胞的有丝分裂而诱发了凋亡以及因此而造成的PS暴露(Hotchkiss等，2002)。正如体外3G4抗体的强结合所证实的，用亚临床浓度的多西他赛处理内皮细胞(排列于肿瘤血管内)和肿瘤细胞在此显示出诱导了PS在细胞表面的表达。
正如增加的抗体介导胞噬作用所显示的，本发明的发明者还确定了本发明抗体的抗肿瘤作用包括Fc结构域介导的免疫效应物功能的增大。因此，抗体还应发挥其它的Fc结构域介导的功能，诸如ADCC、CDC、刺激细胞因子的产生以及这样的机制组合。这还涉及多西他赛，因为其它的研究已显示出用多西他赛治疗乳癌患者导致血清中IFN-γ、IL-2、IL-6和GM-CSF细胞因子水平的增高，通过提高天然杀手细胞(NK)和淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)细胞的活性增强了这些患者中的抗肿瘤免疫反应(Tsavaris等，2002)。
因此，本发明的发明者推断多西他赛诱导了PS表达和所施用抗体的结合，还增强了免疫效应物的活性，后者介导了抗肿瘤作用。基于前述考虑，本发明的发明者还证实了在带同位MDA-MB-435人乳癌异种移植物的小鼠中将本发明抗体(如3G4抗体)与多西他赛结合使用明显优越于单独使用多西他赛或3G4(实施例XX)。
因此，多西他赛和诱导凋亡的其它化疗剂是优选用于本发明联合疗法中的药剂。将抗氨基磷脂和/或阴离子磷脂的抗体与诸如多西他赛等诱导凋亡的化疗药物组合将协同攻击肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞组分，不仅产生了显著增强的治疗效果还降低了毒性。这些组合预计可用于乳癌治疗中，尤其是将利用多西他赛的有规律化学疗法与本发明抗体的组合。
N2.内毒素
内毒素和已解毒的内毒素衍生物可用于组合治疗中，优选低剂量(PCT公开号WO 03/028840，特别收编于此作为参考)。有各种已解毒的内毒素可供利用，它们优选用于动物尤其是人中。已解毒并精制的内毒素及其组合参阅美国专利4,866,034、4,435,386、4,505,899、4,436,727、4,436,728、4,505,900，各特别收编于此作为参考。
非毒性衍生物单磷酰脂质A(monophosphory1 lipid A，MPL)是可用于本发明的解毒内毒素的一个例子。已知MPL对人是安全的，使用MPL作为佐剂的临床试验显示100μg/m2对于人体应用是安全的，对于门诊患者也是如此。
N3.细胞因子
已经证明细胞因子疗法是联合治疗方案的有效配对方法。多种细胞因子可用于这些联合疗法。细胞因子的范例包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNFα、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。根据与诸如患者状况和细胞因子相对毒性等临床指征一致的标准方案施用细胞因子。子宫珠蛋白也可用于防止或抑制转移(美国专利5,696,092，本文收入作为参考)。
N4.TNFα和TNFα的诱导物
TNFα和TNFα的诱导物还可与本发明组合使用。TNFα增加了血管的通透性，并因此可用于促进抗癌剂渗透入肿瘤。正如本发明中所述，尽管当靶向于氨基磷脂和阴离子磷脂时，抗体的定位决非问题，但TNFα的联合使用促进了其它化疗剂和免疫缀合物到达肿瘤，并甚至增加了本发明抗体与远距离肿瘤细胞的结合。
还可使用低水平的内毒素、Rac1拮抗物，诸如减毒的或基因工程化的腺病毒、DMXAA(和FAA)、CM101和沙利度胺。Rac1拮抗物还可用于本发明的组合疗法中，因为每个细胞中约5000个DNA颗粒引起不依赖于CD14的TNF上调(Sanlioglu等，2001)。CM101、沙利度胺和DMXAA还可以标准和减少的剂量用于此处的联合疗法中。
N5.化疗
无论机制为何，多种化疗剂可用于本文公开的联合治疗方法中。预计可组合应用的化疗剂包括如他莫西芬(tamoxifen)、泰素、长春碱、依托泊苷(VP-16)、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、考布他汀，尤其是泰素(泰索帝)、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、多柔比星、氨甲蝶呤、紫杉醇和长春新碱，以及它们的衍生物和药物前体。
本领域普通技术人员可以理解，化疗剂的适当剂量包括化疗剂单独施用或与其它化疗剂联合施用的临床疗法中已采用的剂量。不过，由于本发明提供的优越之处，现在有可能使用较低的剂量。例如，可以使用诸如顺铂等药剂和其它DNA烷基化剂。顺铂被广泛用于治疗癌症，其临床应用的有效剂量为每3周5天给药20mg/m2，共3个疗程。顺铂不能口服吸收，因此必须经静脉内、皮下、肿瘤内、或腹膜内注射。
其它有用的药剂包括干扰DNA复制、有丝分裂、染色体分离和/或微管蛋白活性的化合物。这些化疗化合物包括阿霉素(也称为多柔比星)、依托泊苷、维拉帕米(verapamil)、鬼臼毒素、考布他汀等。在广泛用于治疗肿瘤的临床环境中，对于阿霉素而言，以25-75mg/m2的剂量范围，每隔21天通过大剂量静脉内注射给药；对于依托泊苷而言，以35-50mg/m2的剂量静脉内给药或以双倍于静脉内剂量的剂量口服。
也可以使用破坏多核苷酸前体的合成和精确性的药剂。特别有用的是已经过深入检验并容易获得的药剂。例如，致瘤性组织优先使用诸如5-氟尿嘧啶(5FU)等药剂，使得此药剂对靶向致瘤性细胞特别有用。尽管5-FU毒性很大，但它可用于宽范围的载体，包括局部使用，然而，常用剂量范围是3-15mg/kg/天的静脉内施用。
表D列出了在联合疗法中可应用的例示性化疗剂，其中所列的各种药剂仅作为例示而非限制。熟练技术人员可参照《雷明顿制药科学》，第15版，第33章，特别是第624-652页。根据治疗对象的病情必需对剂量作一些改变。负责治疗的医师能够为各个受试者确定适当剂量。
表D.用于致瘤性疾病的化疗剂
Figure C03816751D01451
表C-续
Figure C03816751D01461
表C-续
Figure C03816751D01471
N6.抗血管发生
术语“血管发生”指新血管的产生，通常是进入组织或器官中。在正常生理学条件下，人或动物只在非常特殊的有限情况中才经历血管发生。例如，通常在创伤愈合、胎儿和胚胎发育、卵巢黄体、子宫内膜、和胎盘形成中观察到血管发生。不过，新的证据显示血管发生在某些正常状况下是重要的，诸如肾上腺组织、前列腺和卵巢中。本发明的治疗剂，其中抗血管发生不是唯一的作用模式，因此具有比著名的抗血管发生治疗剂(诸如抗体A4.6.1)(Berm，1998；Baca等，1997；Presta等，1997)更优越之处在于使用本发明时其中的合乎需要的或“生理学”的血管发生将不会被抑制。
不受控制的(持续的和/或不受调控的)血管发生与多种疾病状态有关，并在肿瘤发展和转移过程中发生。受到控制和不受控制的血管发生被认为是以相似方式进行的。由基底膜包围的内皮细胞和外膜细胞形成毛细血管。血管发生从由内皮细胞和白细胞释放的酶对基底膜的侵蚀开始。然后沿血管腔排列的内皮细胞凸出基底膜。血管发生刺激物诱导内皮细胞迁移出受侵蚀的基底膜。迁移细胞在亲本血管外形成“萌芽”，内皮细胞在此经历有丝分裂和增殖。内皮萌芽彼此汇合形成毛细血管环，从而形成新的血管。
尽管有新的证据显示在某些正常组织中需要有血管生成，抗血管发生疗法在肿瘤和其它疾病的治疗中仍然是重要的。抗血管发生疗法因此意图用于本发明的组合疗法中。尤其考虑将相对频繁的低剂量本发明治疗剂与抑制血管发生的药剂组合。可用于组合疗法中的示例性抗血管发生剂如上文所列举的(针对免疫缀合物)。任何一种或多种这样的药剂，包括表B中的药剂，可与本发明联合使用。血管生长抑素、抑内皮素、抑血管素、制霉菌素、和maspin是目前优选的。
许多已知的抗癌剂也具有抗血管发生效果作为其作用机制的一部分。这些药剂，如表E中所列举的，特别考虑用于本发明的组合疗法方面(如上所述，它们也可以与本发明的抗体缀合)。
表E
具有抗血管发生活性的抗癌剂
 
药剂种类或类型 例子
烷化剂 环磷酰胺、依地福新、雌莫司汀、美法仑
抗代谢物 氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、巯基嘌呤、UFT、替加氟、尿嘧啶、阿糖胞苷
抗肿瘤抗生素 博来霉素、道诺霉素、阿霉素、表柔比星、丝裂霉素、米托蒽醌
拓扑异构酶抑制剂 喜树碱、伊立替康、依托泊苷、托泊替康
紫杉烷类 多西他赛、紫杉醇
长春花生物碱 长春碱、长春新碱
混杂物 顺铂、奥曲肽
此外，针对αvβ3整联蛋白的抗体LM609也诱导肿瘤退化并可用组合疗法中。整联蛋白αvβ3的拮抗剂，诸如LM609，诱导血管发生性内皮细胞的凋亡，而对静止血管没有影响。LM609或其它αvβ3拮抗剂还可以通过抑制αvβ3与MMP-2的相互作用来发挥作用(MMP-2被认为是在内皮细胞和成纤维细胞迁移中具有重要作用的蛋白水解酶)。
LM609引起的血管发生性内皮的凋亡可能对剩余血管网络具有级联效果。抑制肿瘤血管网络对肿瘤扩张信号产生完全应答，事实上可能启动了网络的部分或全部崩溃，导致肿瘤细胞死亡和肿瘤体积损失。可能抑内皮素和血管生长抑素以相似方式发挥功能。LM609不影响静止血管但能够引起肿瘤退化的事实强烈说明在治疗中不需要靶向肿瘤中的所有血管来获得抗肿瘤效果。
如美国专利5,520,914(本文特别收入作为参考)所述，可以采用针对血管生成素的抗体。由于FGF与血管发生有关，因此也可以使用FGF抑制剂。范例是序列中以交替的N-乙酰葡糖胺与2-0-硫酸化糖醛酸作为主要重复单元的化合物，包括葡糖胺基聚糖，诸如archaran sulfate。美国专利6,028,061(本文特别收入作为参考)描述了这些化合物，它们可用于与本文的联合。
N7.VEGF抑制剂
VEGF是低氧和致癌突变诱导的多功能性细胞因子。VEGF是胚胎发生中血管网络产生和保持的主要刺激物。它起着强通透性诱导剂、内皮细胞趋化剂、内皮存活因子和内皮细胞增殖因子的功能。它的活性是正常胚胎发育所需要的，因为一个或两个VEGF等位基因的靶向破坏会导致胚胎致死。
利用一种或多种VEGF抑制方法是本发明组合疗法的优选方面。由有关VEGGF是病理状况下血管发生的主要刺激物的认识产生了阻断VEGF活性的各种方法。所开发的任何VEGF抑制剂现在可有利的应用于此。因此，设计成干扰VEGF信号传导的任何一种或多种以下的中和性抗VEGF抗体、可溶性受体构建物、反义策略、RNA aptamers和酪氨酸激酶抑制剂都可应用。
合适的药剂包括中和性抗体(Kim等人，1992；Presta等人，1997；Sioussat等人，1993；Kondo等人，1993；Asano等人，1995)、可溶性受体构建物(Kendall和Thomas，1993；Aiello等人，1995；Lin等人，1998；Millauer等人，1996)、酪氨酸激酶抑制剂(Siemeister等人，1998)、反义策略、RNAaptamer、和针对VEGF或VEGF受体的核酶(Saleh等人，1996；Cheng等人，1996；Ke等人，1998；Parry等人，1999；本文收入作为参考)。正如WO 98/16551(本文特别收入作为参考)所述，还可以采用具有拮抗剂特性的VEGF变体。上述各文献均特别收入作为参考。
某些实施方案中将优选阻断抗VEGF抗体，尤其是为了简单起见。抗VEGF的单克隆抗体已显示出抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长和腹水形成(Kim等，1993；Mesiano等，1998；Luo等，1998a；1998b；Borgstrom等，1996；1998；分别收编于此作为参考)。抗体A4.6.1是高亲和力的抗VEGF抗体，能够阻断VEGF与VEGFR1和VEGFR2二者的结合(Kim等人，1992；Wiesmann等人，1997；Muller等人，1998；Key等，1996，分别收编于此作为参考)。A4.6.1最近已通过单价噬菌体展示技术进行了人源化，目前作为抗癌剂正在进行I期临床试验(Brem，1998；Baca等人，1997；Presta等人，1997；本文收入作为参考)。
对A4.6.1Fab片段结合的VEGF的丙氨酸扫描诱变和X射线结晶学显示，A4.6.1结合的VEGF表位集中于第89-94位氨基酸周围。这一结构性结果证明A4.6.1竞争性抑制VEGF结合VEGFR2，但是最有可能通过位阻现象抑制VEGF结合VEGFR1(Muller等人，1998；Keyt等人，1996；本文收入作为参考)。
A4.6.1可与本发明联合使用。不过，目前优选被命名为2C3(4545)的新抗体，它选择性的阻断VEGF与两个VEGF受体中只一个的相互作用。2C3抑制VEGF介导的内皮细胞生长，它具有强的抗肿瘤活性并选择性的阻断VEGF与VEGFR2(KDR/F1k-1)的相互作用，而不阻断VEGF与VEGFR1(FLT-1)的相互作用。与A4.6.1相反，2C3可以特异抑制VEGFR2诱导的血管发生，但不伴随着对巨噬细胞趋化性的抑制(由VEGFR1介导)，因此预计可以作为更安全的治疗剂。为了更进一步描述2C3抗体和其在抗血管发生疗法和VEGF抑制中的用途，将美国专利6,342,219，6,342,221，6,416,758，6,416,758特别收编于此作为参考。
N8.凋亡诱导剂
本发明的治疗剂还优选与可诱导肿瘤中任何细胞内诱导(包括肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞)的凋亡的治疗方法相组合。诱导凋亡的典型药剂列举如上(针对免疫缀合物)。任何一种或多种这样的凋亡诱导剂都可以用于本发明的联合疗法中，无需与本发明抗体联接。
许多已知的抗癌剂作为其作用机制的一部分还具有诱导凋亡的作用。这些药剂，如表F中列举的，尤其被考虑用于本发明的组合疗法方面(如上所述，它们还可与本发明的抗体缀合)。
表F
诱导凋亡的抗癌剂
 
药剂种类或类型 实施例
抗代谢物 阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟-29-脱氧尿苷、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤
DNA交联剂 苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、氮芥
插入剂 多柔比星(阿霉素)、米托蒽酯
拓扑异构酶II毒物 依托泊苷、替尼泊苷
微管靶向剂 秋水仙胺、秋水仙碱、多西他赛、长春花新碱
激酶抑制剂 flavopiridol、星孢素、STI571(CPG57148B)、UCN-01(7-羟基星孢素)
法呢基转移酶抑制剂 L-739749、L-744832
激素 糖皮质类固醇、芬维A胺
DNA断裂剂 博来霉素
激素拮抗剂 它莫西芬、非那雄胺、LHRH拮抗剂
生物制品 TNF-α、TRAIL、抗CD20
蛋白质合成抑制剂 L-天冬酰胺酶、环己酰亚胺、嘌呤霉素、白喉毒素
拓扑异构酶II毒物 喜树碱、托泊替康
N9.免疫毒素和凝血配体
本发明还可与其它的免疫毒素或凝血配体联合使用，其中靶向部分靶向于肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤基质的标志物。本文所述用于将PE结合肽靶向于肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤基质的任何靶向剂都可用于这些实施方案中。在这些免疫毒素中，所附着的药剂包括抗细胞或细胞毒性剂、细胞因子、放疗剂、抗血管发生剂、凋亡诱导剂和抗微管蛋白药物。在凝血配体中，所附着的药剂是凝血剂。美国专利5,855,866、5,965,132、6,261,535、6,051,230、6,451,312(免疫毒素)、6,093,399、6,004,555、5,877,289、和6,036,955(凝血配体)特别收编于此作为参考来说明这些构建体。
N10.ADEPT和药物前体疗法
本发明的抗体，包括9D2、3G4(ATCC 4545)和类似抗体，还可以与药物前体联合应用，其中所述抗体可操作连接激活药物前体的成分，诸如激活药物前体的酶，它只有在接触抗体时才将药物前体转变成更有活性的形式。这项技术通常称为“ADEPT”，并描述于如WO 95/13095、WO 97/26918、WO 97/24143、美国专利4,975,278和5,658,568(本文特别收入作为参考)。
如本文所用，术语“药物前体”指生物学或制药学活性物质的前体或衍生物形式，与作为基础的亲本药物相比，它对靶细胞(包括肿瘤血管内皮细胞)的细胞毒性或抗细胞的效果下降。优选的是，药物前体或前体形式与“天然”或亲本形式相比细胞毒性或抗细胞的效果显著降低，或者更优选可以忽略。“药物前体”能够被激活或转变成更有活性的药物亲本形式。
用于制备并使用药物前体的技术属于普通技术人员的技术范围之内。Willman等人(1986)和Stella等人(1985)在本文特别收入作为参考，以补充关于如何制备并使用各种药物前体的描述和教导。可用于本发明的药物前体构建物的范例包括(但不限于)含磷酸的药物前体(美国专利4,975,278)、含硫代磷酸的药物前体、含硫酸的药物前体、基于肽的药物前体(美国专利5,660,829、5,587,161、5,405,990、WO97/07118)、D-氨基酸修饰的药物前体、糖基化的药物前体(美国专利5,561,119、5,646,298、4,904,768、5,041,424)、含β-内酰胺的药物前体、任选含取代的苯氧基乙酰胺的药物前体(美国专利4,975,278)、任选含取代的苯乙酰胺的药物前体、甚至5-氟胞嘧啶(美国专利4,975,278)和5-氟尿嘧啶药物前体等等(本文特别收入每一项专利作为参考)。
可以以药物前体形式使用的治疗剂或细胞毒性药物的类型事实上是不计其数的。优选以这种形式投递的细胞毒性剂比例如凝血剂多，凝血剂较不优选以药物前体的形式使用。在制备药物前体中需要的只是对构建物进行设计，使得药物前体基本上无活性，而“释放的”或激活的药物具有显著活性或者至少足以达到预定目的的活性。
正如WO95/03830、EP751,144(蒽环霉素)、WO97/07097(环丙基吲哚(cyclopropylindole))、和WO 96/20169中公开的，还知道对原始药物前体的多种改进，本文也涵盖其使用。例如，美国专利5,621,002(本文特别收入作为参考)中描述了Km降低的药物前体，可用于本发明中。正如WO 96/03151(本文特别收入作为参考)所例示的，还知道在细胞内进行的药物前体疗法，本文可以进行实践。
为了用于ADEPT，将激活或转变药物前体形成更有活性药物的药剂可操作附着于本发明的抗体上。所说的抗体由此将药物前体转变能力定位于血管发生性或肿瘤位点，从而只在这些区域产生有活性的药物，而在循环或健康组织中却不会。
可附着于本发明的抗体从而发挥激活药物前体功能的酶包括(但不限于)与含磷酸的药物前体联合使用的碱性磷酸酶(美国专利4,975,278)；与含硫酸的药物前体联合使用的芳基硫酸酶(美国专利5,270,196)；与基于肽的药物前体联合使用的肽酶和蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶(美国专利5,660,829、5,587,161、5,405,990)和组织蛋白酶(包括组织蛋白酶B和L)、与D-氨基酸修饰的药物前体联合使用的D-丙氨酰羧肽酶；与糖基化的药物前体联合使用的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶(美国专利5,561,119和5,646,298)；与含β-内酰胺的药物前体联合使用的β-内酰胺酶；与在氨基氮处用苯氧基乙酰胺或苯基乙酰胺基团衍生的药物联合使用的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶(美国专利4,975,278)或青霉素G酰胺酶；和与基于5-氟胞嘧啶的药物前体(美国专利4,975,278)联合使用的胞嘧啶脱氨酶(美国专利5,338,678和5,545,548)(本文特别收入每一项专利作为参考)。
具有酶活性的抗体(称为催化性抗体或“抗体酶(abzyme)”)也可用于将药物前体转变成有活性的药物。基于本发明抗体(优选9D2和3G4以及类似抗体)的抗体酶由此构成本发明的另一方面。用于制备抗体酶的技术属于本领域普通技术人员的技术范围之内，例如Massey等人(1987)，本文特别收入该文作为参考，以补充关于抗体酶的教导。正如EP 745,673(本文特别收入作为参考)所述，本发明还进一步涵盖能够催化药物前体在氨基甲酸酯处断裂的催化性抗体。
0.抗体包被的脂质体和治疗剂
脂质体制品经常用于治疗剂和药物中。不过，有关脂质体分布的最初研究表明这样的制剂并非可广泛用于人体的。因此开发了“隐藏的或被隐藏的”脂质体和制剂技术，它可以使脂质体循环较长的时间。优选用于隐藏脂质体的药剂是聚乙二醇(PEG)，而产生的脂质体也被称为PEG化脂质体。
隐藏的脂质体已被推荐用于投递细胞毒性剂至癌症患者的肿瘤中。一系列的药物已被掺入到隐藏的脂质体中，包括顺铂(Rosenthal等，2002)、TNFα(Kim等，2002)、柔红霉素(Symon等，1999)和阿霉素(Singh等，1999)，分别收编于此作为参考。不过，最近的报道已显示出隐藏的脂质体柔红霉素和vinorelbine在转移性乳癌治疗中意外的低效(Rimassa等，2003)。
本发明提供了改良的被隐藏脂质体制剂，克服了现有技术中的各种缺点，其中用可结合氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS或PE)的抗体功能性地结合或“包被”隐藏的脂质体。尽管可结合氨基磷脂或阴离子磷脂的任何抗体或其抗原结合区都可利用，但本发明的9D2、3G4(ATCC 4545)以及类似的竞争性抗体优选用于此法中。在本发明的这些方面中无需二价抗体或抗体片段。
任何已隐藏的脂质体都可构成新脂质体制剂的主要成分，优选应用PEG化的脂质体。已隐藏的脂质体是被“包被”的，即可操作性的或功能性的联接了可与氨基磷脂或阴离子磷脂结合的抗体。该可操作性的或功能性的联接形式能使抗体保持特异性结合靶氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS或PE)的能力，从而将已隐藏的脂质体和其中的任何组分投递或靶向于PS-和/或PE-阳性细胞，诸如肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞。
本发明的抗体包被的隐藏脂质体可以单独使用。不过，优选的，这样的脂质体还将包括一种或多种第二治疗剂，诸如抗癌剂或化疗剂(第一治疗剂是抗体本身)。第二治疗剂通常被认为在脂质体的“核心”内。本领域已知和/或本文针对缀合抗体或组合疗法所述的任意一种或多种第二抗癌剂或化疗剂都可针对用于本发明的抗体包被的隐藏脂质体中。例如，任何化疗剂或放疗剂、细胞因子、抗血管发生剂或凋亡诱导剂。目前优选的化疗剂是抗微管蛋白药物、多西他赛和紫杉醇。
此外，本发明的抗体包被隐藏脂质体还可装载一种或多种抗病毒药物以用于治疗病毒感染和疾病。正如抗癌剂一样，本领域和/或本文针对缀合抗体或组合疗法所述的任一种或多种第二抗病毒药物都可用于本发明的抗体包被隐藏脂质体中。西多福韦和AZT是目前优选的例子。
P.抗血管、抗血管发生和其它疗法
本发明可用于治疗涉及异常血管发生的其它疾病，包括具有前血栓形成性血管的疾病和紊乱。尽管并非唯一的治疗方法，但本发明的抗体、免疫缀合物和基于肽的疗法也可用于治疗患异常血管发生、诸如促成多种疾病和紊乱的异常血管发生的动物和患者。
无论是基于抗血管发生、前血栓形成性血管结构还是其它的抗血管机制，本发明都可用于治疗除了癌症之外的最普遍和/或在临床上重要的疾病，包括关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病变、与年龄有关的黄斑变性、格雷夫氏病、血管再狭窄(包括血管成形术后再狭窄)、动静脉畸形(AVM)、脑(脊)膜瘤、血管瘤、和新血管性青光眼。其它的干预靶包括血管纤维瘤、动脉粥样硬化病斑、角膜移植物新血管形成、血友病性关节、肥大性瘢痕、Osler-Weber综合症、脓性肉芽肿、晶状体后纤维增生症、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、各种其它炎症性疾病和紊乱、和甚至是子宫内膜异位症。下文列出了本发明可以治疗的其它疾病和紊乱，以及这些血管发生性疾病的统一基础。
涉及异常血管和血管发生的一种重要疾病是类风湿性关节炎，其中关节滑膜内层的血管经历血管发生。除了形成新血管网络，内皮细胞还释放导致血管翳生长和软骨破坏的因子和活性氧类。血管发生中涉及的因子可以积极促成并维持类风湿性关节炎的慢性发炎状态。与血管发生有关的因子在骨关节炎中也有作用，促成关节的破坏。包括VEGF在内的各种因子已显示出参与类风湿性关节炎和骨关节炎的发病机理。
涉及异常血管结构和血管发生的另一重要疾病范例是眼部新血管性疾病。该疾病的特征为新血管侵入眼结构，诸如视网膜或角膜。这是失明的最常见原因，并涉及大约20种眼科疾病。在与年龄有关的黄斑变性中，相关视觉问题是由脉络膜毛细血管经Bruch氏膜(玻璃膜)的缺陷向内生长，同时视网膜色素上皮下的纤维血管组织增殖引起的。血管发生性损伤还涉及糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、新血管性青光眼、和晶状体后纤维组织形成。
可按本发明进行治疗的与角膜新血管形成有关的其它疾病包括(但不限于)流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏、隐形眼镜过度佩戴、特应性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、Sjogren症(干燥症)、玫瑰痤疮(酒糟鼻)、phylectenulosis、梅毒、分支杆菌感染、脂肪变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、Kaposi氏肉瘤、Mooren溃疡、Terrien氏边缘变性、边缘角质层分离、类风湿性关节炎、系统狼疮、多动脉炎、外伤、Wegeners类肉瘤、巩膜炎、Steven’s Johnson病、角膜放射状切开术、和角膜移植排斥。
可按本发明进行治疗的与视网膜/脉络膜新血管形成有关的疾病包括(但不限于)糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰刀形红细胞贫血病、结节病、梅毒、弹性假黄色瘤、Pagets病、静脉堵塞、动脉堵塞、颈动脉梗阻性疾病、慢性色素层炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、Lyme氏病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、Eales病、Bechets病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、推测的眼组织胞浆菌病、Bests病、近视、视窝、Stargarts病、平坦部炎、慢性视网膜脱落、高粘滞性综合症、弓形体病、外伤、和激光后并发症。
可按本发明进行治疗的其它疾病包括(但不限于)与发红有关的疾病(虹膜角的新血管形成)和由纤维血管或纤维组织异常增殖引起的疾病，包括所有形式的增殖性玻璃体视网膜病变，无论其是否与糖尿病相关。
慢性炎症也涉及异常血管结构和病理性血管发生。这些疾病状态(如溃疡性结肠炎和Crohn氏病)显示组织学变化，其中有新血管进入发炎组织的向内生长。巴尔通体病(在南美洲发现的细菌性感染)能够导致特征为血管内皮细胞增殖的慢性阶段。
在动脉粥样硬化中发现了与异常血管结构和血管发生有关的另一种病理学作用。在血管内腔内形成的病斑显示具有血管发生刺激活性。有具体证据证明了诸如VEGF等血管发生标志在人冠状动脉粥样硬化发展中，以及在冠脉梗阻性疾病的血管再成形过程中有病理生理学重要性。本发明为这些状况提供了有效治疗。
血管瘤是儿童时期最频繁的血管发生性疾病之一。在大多数情况中，肿瘤是良性的，并在没有干预的条件下就退化。在更严重的情况中，肿瘤发展成大型海绵状和渗透性形式并产生临床并发症。血管瘤的系统形式，血管瘤病，具有较高的死亡率。存在耐受治疗的血管瘤，不能用目前使用的治疗剂进行治疗，本发明则特别针对解决该问题。
血管发生还与在遗传性疾病(诸如Osler-Weber-Rendu病或遗传性出血性毛细管扩张症)中发现的损伤有关。遗传性出血性毛细管扩张是特征为多处小型血管瘤、血管或淋巴管肿瘤的遗传病。血管瘤存在于皮肤和粘膜中，常常伴随鼻出血或胃肠出血，有时伴随肺或肝动静脉瘘管。
血管发生还与正常的生理学过程有关，诸如再生和创伤愈合。血管发生是排卵还有受精后囊胚着床中的重要步骤。根据本发明预防血管发生可用于诱导闭经，阻断排卵或防止囊胚着床。在创伤愈合中，过度修复或纤维增生成为手术治疗的有害副作用，而且可能由血管发生引起并恶化。粘附是手术后频繁的并发症，并导致诸如小型肠梗阻等问题。这也可以用本发明进行治疗。
所有前述疾病和紊乱，以及所有类型的肿瘤，都被考虑按照本发明进行治疗。美国专利5,712,291特别收编于此作为参考，以便进一步证明本领域内的认识，即，一旦使用某一具体药剂已显示出对血管发生的抑制作用，那么用它或类似药剂治疗与异常血管发生相关的广泛类型疾病就应该能进行。美国专利6,524,583也特别收编于此作为参考以达到相似的目的，并特别证明此原理适用于利用基于抗体的疗法抑制血管发生和治疗血管发生性疾病。3G4抗体(ATCC 4545)在患肿瘤小鼠中的抗血管发生效果(图17A)因此是证明3G4和类似抗体适于治疗多种类型的血管发生型疾病的重要证据。
本发明进一步提供了用于治疗氨基磷脂和/或阴离子磷脂(优选PS和PE)在其中起作用的其它疾病。例如，因为细胞粘附、炎性反应和脓毒性休克中涉及PS，所以针对PS的抗体可用于治疗发炎和脓毒性休克。3G4(ATCC 4545)或类似抗体的应用对这样的实施方案是优选的，尤其是所说抗体的Fab二聚体。耐久霉素Fab二聚体还特别被考虑用于治疗脓毒性休克。
氨基磷脂和/或阴离子磷脂，尤其是PS，还与镰状细胞贫血有关，具体而言，是作为清除过程的一部分。因此抗PS抗体可用于治疗或改善镰状细胞贫血。优选使用3G4(ATCC 4545)或其类似抗体，尤其是其Fab二聚体。
大部分细菌表达阴离子磷脂PA。因此结合PA、并任选地结合其它阴离子磷脂的抗体可用作抗菌剂。尽管本发明的抗体能在大肠杆菌中制备，并因此不是在所有情形下都是杀菌的，但体内的抗菌作用被认为是因其固定补体的能力导致的。因此应使用完整的抗体而非抗体片段作为抗菌剂。尽管可以应用固定补体并结合PA的任何抗体，诸如表4的其它PA结合抗体，但优选在这样的实施方案中使用3G4(ATCC 4545)和类似抗体。
抗磷脂综合症和狼疮(其中所产生抗体抗自身磷脂的自体免疫紊乱)与凝血紊乱相关，包括流产和血小板减少症(低血小板计数)。因此，在这些患者中的抗磷脂抗体是致病抗体，它会造成血栓形成。不过，本发明的抗体可与氨基磷脂和阴离子磷脂结合，但并不引起所说的副作用。因此，本发明的抗体被考虑用于治疗抗磷脂综合症及其相关疾病和并发症。
在患抗磷脂综合症的患者体内循环的致病性抗磷脂抗体被认为与诸如β2-糖蛋白I、凝血酶原、激肽原、前激肽释放酶和因子XI等蛋白质协同结合PS、PE和其它磷脂(Rote，1996；Sugi和McIntyre，1995；1996a；1996b)。据报道，与PS结合的β2-糖蛋白I和凝血酶原分别是抗心磷脂抗体和狼疮抗体的初级抗原。本发明的抗体基于其只在血清蛋白存在的情形下才不结合氨基磷脂和阴离子磷脂的特性而被特别选择出来。因此，通过结合磷脂组分，本发明的抗体预期可用于拮抗或竞争所说患者体内的致病抗体，从而将致病抗体从体内它们的磷脂-蛋白质靶目标上置换下来。
Q.PE结合肽衍生物和缀合物
除了抗体和免疫缀合物之外，本发明还提供了PE结合肽衍生物和各种用途，尤其是在肿瘤和病毒疾病的治疗中。目前优选的PE结合肽构建体和衍生物是以被称为耐久霉素的肽为基础的。本发明提供了三种普遍类型的PE结合肽和耐久霉素衍生物，其中的两种利用PE结合肽或耐久霉素作为构建物的靶向部分，而另一种主要利用耐久霉素或类似药剂作为构建物的效应子部分。
利用PE结合肽(优选耐久霉素)作为靶向剂是基于它们将选择性结合的性能赋予所产生构建物的能力。因此，含PE结合肽(优选耐久霉素)的构建物或缀合物将特异结合表达PE的细胞，诸如肿瘤血管内皮细胞、恶性肿瘤细胞、增殖细胞和/或病毒感染细胞。
因为诸如耐久霉素等PE结合肽除了具有PE靶向功能外还具有生物学活性，所以不再需要将诸如耐久霉素之类的PE结合肽与治疗剂缀合来得到治疗性缀合物。不过，由于诸如耐久霉素等PE结合肽在其天然状态下具有相关的毒性，所以应将所说的肽进行修饰以降低其毒性。毒性与所说的肽在细胞膜内形成簇、形成孔的能力以及通常渗透或插入细胞的能力有关。因此，这些功能应被削弱，从而显著的或充分的阻止PE结合肽形成簇、渗透入细胞以及具有非特异毒性。优选的，在充分保持与PE结合的能力的同时，实质性抑制PE结合肽形成簇和渗入细胞的能力，从而显著降低或消除细胞毒性。
本发明提供的第一类毒性降低的PE结合肽衍生物是使其中的PE结合肽(优选耐久霉素)相对或基本上细胞不通透的类型。优选通过附着于细胞不通透性基团来达到此目的，所说的基团可以是带正电荷或负电荷的小基团或极性基团，或可以是惰性载体形式。术语“细胞不渗透基团”和“细胞不透性PE结合肽”用于此处时，是相对的而非绝对的，指已修饰的PE结合肽，优选耐久霉素，其中形成簇和渗入细胞的能力已显著并优选充分地降低。产生的细胞不透性PE结合肽可以通过截留PE和相关的膜分子作用于细胞外部以及/或通过使宿主的防御系统针对肽包被的细胞来发挥功能。
在此类型的PE结合肽衍生物中，某些构建体将着重于宿主防御系统的恢复，由此增强它们的治疗活性。例如，在PE结合肽(优选耐久霉素)附着于免疫球蛋白上的情况下，所说的免疫球蛋白能发挥既作为惰性载体又作为免疫效应器的功能。这适用于所谓“无关特异性”的免疫球蛋白和无抗原结合能力的免疫球蛋白衍生物，诸如Fc区。依靠所附着的免疫球蛋白或免疫球蛋白衍生物，这样的构建体将能使宿主防御系统改向于针对表达PE的细胞，如通过吸引和/或激活免疫效应细胞而实现。
在本发明的第二种普通类型的PE结合肽衍生物中，肽仍然被修饰以降低其细胞通透性和产生的毒性，但并非利用小的细胞不透性基团或惰性载体，而是利用可改变所产生的构建物的血液和组织分布的药剂。优选的实例是其中PE结合肽(优选耐久霉素)附着至可与肿瘤细胞、肿瘤或肿瘤内血管结构或肿瘤基质组分结合的靶向剂上。尽管PE结合肽自身仍然具有靶向特性，但在本发明的这些方面，靶向剂主要指导构建体至靶组织，诸如至肿瘤部位，而所附着的PE结合肽(诸如耐久霉素)在投递后发挥治疗效用。
第三种普通类型的PE结合肽衍生物又恢复到利用PE结合肽(优选耐久霉素)作为靶向剂将衍生物定位于PE表达细胞。与正常的未感染细胞相反，由于病毒感染细胞在细胞表面表达PE，所以将诸如耐久霉素等PE结合肽与抗病毒剂联接将产生有效的靶向抗病毒剂。尽管PE结合肽部分(优选耐久霉素)可能具有额外的治疗效用，但所附着的抗病毒剂仍被设计成所说构建物内的主要治疗剂。
上述任何缀合技术都可用于制备本发明的耐久霉素衍生物，包括交联剂、肽间隔物、生物素：亲和素构建物和重组表达。耐久霉素分子内的有利附着位点是，例如耐久霉素序列(SEQ ID NO：9；图13P；Hayashi等，1990)中第2位氨基酸处的赖氨酸残基。不过，在此位点的键合不是本发明所必需的。
因此，PE结合肽，优选耐久霉素，可衍生成具有可供交联目的而使用的官能团。多种类型的基团可以此方式被利用，例如，但胺或仲胺基团、酰肼或肼基团、羧基醇、磷酸根、氨基甲酸根和烷基。用于附着的药剂，包括抗病毒剂，由此可通过Schiff’s碱键—腙或酰基腙键或酰肼接头缀合(美国专利5,474,765和5,762,918，分别收编于此作为参考)。
Q1.PE结合肽和抗微生物肽
任何PE结合肽都可用于本发明的这些方面。例如，已知低和高分子量的激肽原可结合PE。针对各种这样的结合蛋白质(包括人蛋白质在内)的蛋白质和DNA序列是本领域已知的，这方便了PE结合肽的利用。例如，人的高分子量和低分子量激肽原基因和蛋白质参阅Kitamura等(1985)和Kellemann等(1986)所述文献，它们分别特别收编于此作为参考。
美国专利6,312,694描述了某些利用PE结合蛋白质(诸如激肽酶)及其PE结合片段的PE结合缀合物。在美国专利6,312,694中，PE结合蛋白质或其PE结合片段被可操作性的附着于抗细胞剂、毒素和凝血因子上。在本案中，PE结合肽被附着于惰性载体、肿瘤靶向剂或抗病毒剂上。尽管目前用于附着的药剂和它们的使用方法体现了惊人的进展，为了进一步描述和实施PE结合肽，诸如激肽酶的PE结合肽片段，现将美国专利6,312,694特别收编于此作为参考。
目前优选用于本发明的PE结合肽是基于PE结合分子—耐久霉素的那些肽。耐久霉素(2622U90，Moli1901)是来自羊毛硫抗生素家族的抗微生物肽(美国专利4,452,782；Shotwell等，1958；Nakamura和Racker，1984)，而羊毛硫抗生素家族的其它成员也可用于本发明中。在PE结合肽被用作构建体靶向剂的情况下，例如，当与惰性载体或抗病毒剂联接时，羊毛硫抗生素PE结合肽应基本上保持PE结合活性。当在构建物中被用作治疗剂时，尤其是附着于肿瘤靶向剂时，对于PE结合活性的一些丧失具有更多的耐受性。
检测候选肽以证实或鉴定充分结合PE的那些肽是从本发明公开内容出发的直接了当的方式，并可以利用如本文所述的任何一种或多种ELISAs来完成。在此用作PE结合肽的羊毛硫抗生素将优选展示基本上与耐久霉素相同的PE结合活性，甚至更优选的，还将展示基本上与耐久霉素相同的对PE的特异性超过其它磷脂的性质。这些特性还可以根据本发明的公开内容，尤其是工作实施例进行方便的测定。
基于上述标准，以下羊毛硫抗生素(lantibiotics)可用作本发明构建物和缀合物的一部分：耐久霉素、肉桂霉素(cinnamycin)、法令霉素、血管紧张肽转化酶抑制肽、表皮素、gallidermin、羊毛硫肽(lanthiopeptin)、mersacidin、乳酸菌肽、Pep5和枯草菌素。耐久霉素是用于本发明所有方面的最优选PE结合肽。耐久霉素是一种抗微生物剂，它已被推荐用于治疗哮喘、慢性支气管炎和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染(美国专利5,849,706；5,716,931；5,683,675；5,651,957；和5,512,269；分别收编于此作为参考)和囊性纤维化(McNulty等，2003)。不过，以前尚未有关于将耐久霉素与细胞不透性基团缀合的有关描述或建议，尤其是用于治疗病毒感染的有关描述或提议。
肉桂霉素(Ro09-0198)是可与PE结合的相关分子(Wakamatsu等，1986；Choung等，1988a；1988b)。标记后的肉桂霉素已被用作探针来研究PE的跨双分子层运动(Aoki等，1994；Emoto等，1996)和在体外T细胞凋亡期间PE的暴露(Emoto等，1997；Umeda和Emoto，1999)。不过，按照本发明的肉桂霉素衍生物的治疗用途过去从未被描述或提出过。因此，含有基于肉桂霉素的本发明PE结合肽衍生物的药物组合物及其各种医疗用途体现了本领域的一个进展，尤其是在意图将所说的组合物用于治疗病毒感染的情况下。
以下抗微生物的肽还可用于本发明的缀合物中，尤其是作为治疗剂附着于肿瘤靶向剂：cystibiotics，诸如片球菌素AcH/PA1、leucocinA/Ual 187、肠膜菌素Y105、sakacin A、sakacin P、莴苣苦素F、蜡样菌素7/8；和carnobacteriocin，诸如carnobacteriocin A、BM1和B2；和硫醇生物素，尤其是乳球菌素，诸如乳球菌素B、A、Ma、Na、Ga和G。
Q2.细胞不透性基团
PE结合肽(优选耐久霉素)与细胞不渗透基团的附着将降低该肽成簇的能力，实质性地防止PE结合肽渗透入正常细胞中并因此减少其毒性。不过，PE结合特性则仍然保持，从而使肽能定位于表面有暴露PE的异常或被感染细胞。
典型的细胞不透性基团包括在生理学pH下带阳性或阴性电荷的基团，诸如硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐、羧基、酚基、季铵离子和胺基。另外的例子是极性基团，诸如单糖和多糖、氨基酸和多元醇。具体而言，可以将耐久霉素与生物素联接形成生物素化PE结合肽，它能分散于药物组合物或药剂中，尤其是用于治疗病毒感染的药剂中。细胞不透性基团还可以是多肽、蛋白质或免疫球蛋白，它们都可用作惰性载体或靶向剂。
Q3.惰性载体
PE结合肽(优选耐久霉素)可以通过附着于惰性的细胞不透性载体使其成为细胞不透性的。有多种惰性、细胞不透性载体可与PE结合肽(优选耐久霉素)缀合来制备细胞不透性PE结合肽，只要PE结合活性基本上不被破坏即可。惰性载体应优选是生物学相容性的，从而使它们在施用于动物或患者时不会导致任何显著的不利后果。
可以使用载体蛋白质，代表性的蛋白质是白蛋白和球蛋白。neutravidin和链霉亲和素常常是优选的。还可使用非蛋白质载体，诸如天然或合成的多聚物，包括多糖和PEG。
在某些实施方案中，载体将是免疫球蛋白或其部分。对于人类给药将优选人免疫球蛋白(HIgG)。如下所述，免疫球蛋白还可以具有靶向功能。作为惰性载体，免疫球蛋白是具有“无关特异性”的一种分子，因为它不会将靶向功能赋予缀合物。不过，通过选择免疫球蛋白的特殊类型还是可以有一些优势的。例如，免疫球蛋白的Fc部分可用于补充宿主的免疫细胞并因此进一步刺激宿主的防御系统。
Q4.靶向剂
除了附着于惰性载体外，PE结合肽(优选耐久霉素)还可通过附着于靶向剂，尤其是结合肿瘤细胞、肿瘤或肿瘤内血管结构或肿瘤基质的组分)而成为细胞不透性的。靶向剂指导构建物至靶组织，优选肿瘤部位，所附着的PE结合肽(优选耐久霉素)通过投递发挥治疗效用。
合适的靶向剂是可结合肿瘤细胞的成分，诸如抗体和其它药剂。正如本文所进一步描述的，“可结合肿瘤细胞的”药剂在此定义为可与肿瘤细胞易于接近的任一组分或多种组分结合的靶向剂，或与本身和肿瘤细胞相结合或与肿瘤细胞相关联的组分相结合的靶向剂。
大多数这样的肿瘤细胞靶向剂和结合配体预计可以作为结合细胞表面肿瘤抗原或标志物的药剂，尤其是抗体。许多这样的抗原是已知的，同样已知有可用于抗原结合和肿瘤靶向的各种抗体。本发明由此包括了可结合已鉴定的肿瘤细胞表面抗原和/或结合完整肿瘤细胞的靶向剂。为了举例说明合适的肿瘤细胞表面抗原，将美国专利5,877,289、6,004,555、6,036,955、6,093,399中表I和表II所列的已鉴定肿瘤细胞表面抗原和完整肿瘤细胞特别收编于此作为参考。
肿瘤细胞结合区的例子是包含抗体的抗原结合区的区域，所说的抗体可结合细胞表面肿瘤抗原p185HER2、乳粘核心蛋白、TAG-72、Lewis a或癌胚抗原(CEA)。肿瘤细胞结合区的另一类型是包含与肿瘤相关抗原可结合的抗体的抗原结合区的区域，所说的肿瘤相关抗原可结合抗体9.2.27、OV-TL3、MOv18、B3(ATCC HB10573)、KS1/4(获自含载体pGKC2310(NRRL B-18356)或载体pG2A52(NRRL B-18357)的细胞)、260F9(ATCC HB8488)或D612(ATCC HB 9796)。D612参阅美国专利5,183,756，ATCC编号为HB9796；B3参阅美国专利5,242,813，ATCC编号为HB10573；以及重组及嵌合KS1/4抗体参阅美国专利4,975,369；分别收编于此作为参考。
肿瘤细胞的可靶向组分另外还包括自坏死或受损肿瘤细胞释放的成分，包括胞质和/或核肿瘤细胞抗原。它们优选不溶性的细胞内抗原，所说抗原是可被诱导而变得可通透的细胞或者基本上所有肿瘤和正常细胞的细胞裂解物中存在的在哺乳动物正常活细胞的外部不存在或不易接近。
为了更进一步描述和指导如何制备和使用特异于体内恶性细胞中易接近的细胞内抗原的抗体，将Alan Epstein和同事拥有的美国专利5,019,368、4,861,581和5,882,626分别收编于此作为参考。所述的抗体对哺乳动物恶性细胞的内部细胞组分足够特异，但对外部细胞组分则不是这样。示范性的靶目标包括组蛋白，但特别释放自坏死肿瘤细胞的所有细胞内组分也包括在内。
通过施用于患血管化肿瘤的动物或患者，这样的抗体由于血管化肿瘤自然包含坏死的肿瘤细胞而定位于恶性细胞，这归因于体内发生并引起至少一部分恶性细胞坏死的肿瘤重塑过程。此外，这样的抗体与增强肿瘤坏死的其它疗法的联合使用提高了靶向及随后治疗的效力。如本文所述，这些类型的抗体因此可用作靶向剂。
可获得能与肿瘤内皮和基质上存在、但基本上不存在于正常细胞、内皮和基质上的标记相结合的一系列合适的靶向剂。对于肿瘤血管系统的靶向，靶向抗体或配体通常将结合被表达、吸附于、诱导于或定位于血管化肿瘤的肿瘤内血管上的标记。“肿瘤血管系统的成分”因此包括肿瘤血管内皮细胞表面分子和可结合这些细胞表面受体或分子的任何组分，诸如生长因子。为了更进一步补充本发明有关制备和使用针对被表达、吸附、诱导或定位的肿瘤血管系统标记的靶向剂的教导，将以下专利特别收编于此作为参考：美国专利5,855,866、5,776,427、5,863,538、5,660,827、5,855,866、5,877,289、6,004,554、5,965,132、6,036,955、6,093,399、6,004,555。
肿瘤和肿瘤内血管的表面表达靶目标的例子包括血管细胞表面受体和细胞粘附分子(Thorpe和Ran，2000，特别收编于此作为参考，见表1)。适当的例子包括endoglin，可被如TEC-4、TEC-11、E-9和Snef抗体所靶向；E-选择蛋白，可被例如H4/18抗体所靶向；VCAM-1，可被例如E1/6和1.4c3抗体所靶向；内皮唾液酸蛋白，可被例如FB5抗体所靶向；αVβ3整合素，可被例如LM609和肽靶向剂所靶向；VEGF受体VEGFR1，可被许多抗体(尤其是VEGF)所靶向；VEGF受体复合物，也可被许多抗体(诸如3E7和GV39)所靶向；PSMA，可被诸如J591等抗体所靶向。诸如endoglin、TGFβ受体、E-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-1、ICAM-1、与LAM-1有反应性的配体、VEGF/VPF受体、FGF受体、αVβ3整合素、pleiotropin、内皮唾液酸蛋白等实例被进一步描述于美国专利5,855,866、5,877,289、6,004,555、6,093,399并能加以实施，将它们分别收编于此作为参考。
另外合适的例子包括蛋白多糖(诸如NG2)和基质金属蛋白酶(MMPs)(诸如MMP2和MMP9)，分别被特殊肽靶向剂所靶向(Thorpe和Ran，2000)。这些是作为肿瘤(它们是血管重塑的部位)内可靶向的实体表达的重塑酶的例子。其它合适的靶目标是凝血调节蛋白、Thy-1和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。鉴定出肿瘤内皮中增加的序列的有关研究也已鉴定出了凝血调节蛋白、MMP11(溶基质素)、MMP2(明胶酶)和各种胶原可作为可靶向肿瘤血管标记，这也与特别收编于此作为参考的美国专利6,004,555和6,093,399一致。
另一合适的靶目标是PSMA(前列腺特异性膜抗原)。PSMA最初被定义为单克隆抗体7E11，原先被鉴定为前列腺癌的标记并已知是类型2整合膜糖蛋白。7E11抗体可与PSMA细胞内表位结合，后者在活细胞内不能供结合所用。在本发明的上下文中，因此用针对细胞外结构域的抗体实现对PSMA的靶向。这样的抗体与各种癌瘤中的肿瘤血管内皮反应，包括肺癌、结肠癌和乳癌，但不与正常血管内皮反应。
可结合PSMA的外部结构域的许多抗体都能够方便的获得并可用于本发明中。单克隆抗体3E11、3C2、4E10-1.14、3C9和1G3显示出针对PSMA蛋白质细胞外结构域的不同区域有特异性并适于在此使用。针对PSMA细胞外结构域的另外三种抗体是J591、J415和PEQ226.5，它们证实了在肿瘤相关血管系统中PSMA的表达，可应用于本发明中。由于编码PSMA和其变体的核酸也可以方便的获得(美国专利5,935,818和5,538,866)，如果需要还可生产另外的抗体。
美国专利6,150,508特别收编于此作为参考，其中描述了与PSMA的细胞外结构域可结合的各种其它单克隆抗体，它们可用于本发明中。与表达于细胞表面上的PSMA有反应性的35种示范性单克隆抗体中的任一种或多种都是可以使用的。它们包括：3F5.4G6(ATCC HB 12060)、3D7-1.I(ATCC HB12309)、4E10-1.14(ATCC HB12310)、3E11(ATCCHB12488)、4D8(ATCC HB12487)、3E6(ATCC HB12486)、3C9(ATCCHB12484)、2C7(ATCC HB12490)、1G3(ATCC HB12489)、3C4(ATCCHB12494)、3C6(ATCC HB12491)、4D4(ATCC HB12493)、1G9(ATCCHB12495)、5C8B9(ATCC HB12492)、3G6(ATCC HB12485)和4C8B9(ATCC HB12492)。
识别PSMA的细胞外结构域的更多抗体或其结合片段参阅美国专利6,107,090和6,136,311，它们分别被收编于此作为参考。其中特别描述了四种杂交瘤细胞系，它们是E99、J415、J533和J591(ATCC HB-12101、HB-12109、HB-12127和HB-12126)，其中的任一种或多种都因此可用作本发明的靶向剂。
可结合“被吸附”的靶目标的靶向剂是另一类合适的基团，诸如与结合肿瘤或肿瘤内血管系统细胞表面受体的配体或生长因子可结合的靶向剂。这样的抗体包括结合VEGF、FGF、TGFβ、HGF、PF4、PDGF、TIMP或肿瘤相关纤连蛋白同种型的抗体(美国专利5,877,289、5,965,132、6,093,399和6,004,555，分别收编于此作为参考)。
其它合适的靶向剂或其片段是可结合配体-受体复合物或生长因子-受体复合物上存在、而单独配体或生长因子以及受体二者上不存在的表位可结合的靶向抗体或其片段。这样的抗体将识别并结合呈递于细胞表面的配体-受体或生长因子-受体复合物，但不会结合游离配体或生长因子或未复合的受体。因此，当用于此处时，“结合的受体复合物”指当配体或生长因子特异性结合其受体(诸如生长因子受体)时所产生的复合物。
VEGF/VEGF受体复合物示范性的说明了这些方面。这样的配体-受体复合物在肿瘤相关内皮细胞上存在的数目将显著高于出现于非肿瘤相关内皮细胞上的数目，因此可能被抗复合物抗体所靶向。抗复合物抗体包括单克隆抗体2E5、3E5和4E5及其片段。
细胞因子和凝血剂天然和人工可诱导的抗原也可被靶向。示范性的细胞因子可诱导抗原是E-选择蛋白、VCAM-1、ICAM-1、endoglin、与LAM-1有反应性的配体，甚至还有II类MHC抗原，它们可以被例如IL-1、IL-4、TNF-α、TNF-β或TNF-γ诱导，同样可以由单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、辅助T细胞、CD8阳性T-细胞、NK细胞或甚至肿瘤细胞释放。
另外的可诱导抗原包括可被凝血剂诱导的那些，诸如可被凝血酶、因子IX/IXa、因子X/Xa、血纤维蛋白溶酶或金属蛋白酶(基质金属蛋白酶，MMP)诱导的抗原。一般而言，凝血酶可诱导的抗原也可使用。此类型抗原包括P-选择蛋白、E-选择蛋白、PDGF和ICAM-1，通常优选P-选择蛋白和/或E-选择蛋白的诱导和靶向。
在其它实施方案中，本发明的血管结构和基质靶向剂(见下文)将是本身为生物学配体或其部分、而非抗体的靶向剂。在此意义上的“生物学配体”将是可与基质中或血管细胞上可接近的细胞表面分子(诸如受体)相结合或联合的那些分子；举例说来就是细胞因子、激素、生长因子，等等。可以使用任何这样的生长因子或配体，只要它可结合疾病相关基质或血管结构、如肿瘤血管内皮细胞表面上存在的特异生物学受体即可。
可用于本发明这些方面的合适生长因子包括例如VEGF/VPF(血管内皮生长因子/血管通透因子)、FGF(成纤维细胞生长因子蛋白质家族)、TGFβ(转化生长因子B)、肿瘤相关纤连蛋白同种型、消散因子/肝细胞生长因子(HGF)、血小板因子4(PF4)、PDGF(血小板衍生生长因子)、TIMP或甚至是IL-8、IL-6或因子XIIIa。VEGF/VPF和FGF常常是优选的。
其它合适的靶向剂是可结合肿瘤相关基质的靶向剂。在肿瘤发展期间，周围组织的细胞外基质通过两个主要的过程被重建：正常组织中细胞外基质组分的蛋白水解降解；和通过肿瘤诱导的细胞因子激活肿瘤细胞和基质细胞从头合成细胞外基质组分。这两个过程产生了“肿瘤细胞外基质”或“肿瘤基质”，它允许肿瘤发展，并在质和量上与正常组织的细胞外介质或基质不同。
“肿瘤基质”因此具有不存在于正规组织中的可靶向组分。用于本发明的某些优选肿瘤基质靶向剂是与基底膜标记、IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖、纤连蛋白、活化血小板、LIBS、RIBS和腱生蛋白可结合的药剂。为了进一步补充本发明关于制备和使用肿瘤基质靶向剂的教导，将以下专利特别收编于此作为参考：美国专利5,877,289、6,093,399、6,004,555和6,036,955。
肿瘤相关基质的组分包括基质、细胞外介质和结缔组织的结构和功能性组分。肿瘤基质靶向剂因此包括可与基底膜标记、IV型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖、糖蛋白、诸如肝素和肝素样化合物等阴离子多糖和纤连蛋白等组分结合的药剂。
示范性的有用抗体是与腱生蛋白可结合的抗体，腱生蛋白是表达于各种良性和恶性肿瘤基质中的大分子量细胞外糖蛋白。抗腱生蛋白抗体因此可用作靶向剂(美国专利6,093,399和6,004,555，特别收编于此作为参考)。
另外合适的靶向剂包括可结合平滑肌细胞、周皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和浸润性淋巴细胞或白细胞的抗体和配体。“活化的血小板”是肿瘤基质另外的组分，因为血小板在活化时可结合基质，故这样的血小板可被本发明所靶向。
另外的合适基质靶向剂、抗体和其抗原结合区可结合“可诱导的”肿瘤基质组分，诸如细胞因子可诱导的组分，尤其是诸如凝血酶等凝血剂可诱导的那些组分。一类优选的抗基质抗体是可结合纤维蛋白原上的RIBS(受体诱导的结合位点)的那些抗体。因此“RIBS”是一种可靶向抗原，它在基质内的表达由活化的血小板控制。可与活化血小板上的配体诱导结合位点LIBS结合的抗体也是有用的。
肿瘤相关基质特别优选的可靶向成分目前是肿瘤相关性纤连蛋白(FN)同种型。纤连蛋白是细胞外基质和体液中都有的多功能的、高分子量糖蛋白成分。它们参与许多不同的生物学过程，诸如正常细胞形状的建立和保持、细胞迁移、止血和血栓形成、伤口愈合和致癌性转化。
纤连蛋白同种型是可与受体整合素家族结合的配体。“肿瘤相关纤连蛋白同种型”可以被视作肿瘤血管结构和/或肿瘤基质的一部分。纤连蛋白同种型具有广泛的结构异质性，它是在转录、转录后和翻译后水平上产生的。
纤连蛋白的结构多样性首先是由主要的纤连蛋白转录物的三个区域(ED-A、Ed-B和IIICS)的不同剪接方式引起的，产生至少20种不同的同种型。正如以组织特异性和发育特异性方式被调节一样，已知纤连蛋白前mRNA的剪接方式在转化细胞和恶性肿瘤中失控。事实上，含ED-A、ED-B和IIICS序列的纤连蛋白同种型在转化细胞和恶性肿瘤细胞中比在正常细胞中有更高程度的表达。
具体而言，含ED-B序列(B+同种型)的纤连蛋白同种型在胎儿和肿瘤组织中以及伤口愈合期间有高表达，但在正常成年组织中则表达受限。B+纤连蛋白分子在成熟血管中是检测不到的，但在正常情形下(如，子宫内膜发育)、病理性血管发生(如，在糖尿病视网膜病中)和肿瘤发育中的血管形成性血管内是上调的。因此，所谓的纤连蛋白B+同种型(B-FN)尤其适用于本发明。
ED-B序列是由单一外显子编码且含91个氨基酸的完整的III型同源重复片段。B+同种型本身的存在构成了肿瘤诱导的新抗原，但此外，ED的表达暴露了在III型重复片段7内通常隐蔽的抗原(在ED-B之前)；因为此表位在缺乏ED-B的纤连蛋白分子内并不暴露，由此可知ED-B的表达直接和间接诱导了新抗原的表达。此隐蔽的抗原性位点形成了单克隆抗体BC-1(欧洲动物细胞培养物收藏中心，Porton Down，Salisbury，英国，编号88042101)的靶目标。BC1抗体可用作本发明的血管靶向组分。
对ED-B同种型具特异性的改良抗体描述于阅特别收编于此作为参考的WO 97/45544中。这样的抗体已以单链Fvs(scFvs)的形式由展示于丝状噬菌体表面的人抗体可变区文库获得(也参阅WO 92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236和WO93/19172)。
利用抗体噬菌体文库，通过直接在含ED-B结构域的重组纤连蛋白片段上选择，或者当这些抗原包被在固相表面时直接在重组ED-B本身上选择(“淘选”)，可以分离特异性scFvs。抗原的这些相同来源还成功的用于在“亲和性成熟”方法中产生相对于亲本克隆来说具有改良特性的“第二代”scFvs。被分离的scFvs与人纤连蛋白的B+同种型强烈并特异地反应，优选反应前不用N-聚糖酶处理。
因此特别预计WO97/45544中的抗体可应用于此。在抗肿瘤应用中，这些人抗体的抗原结合结构域是有利的，因为它们在施用于人时具有更少的副作用。参照抗体直接结合ED-B结构域。优选的，抗体既结合人的纤连蛋白ED-B，又结合非人的(诸如小鼠的)纤连蛋白ED-B，从而可以在动物模型中进行测试和分析。抗体片段则扩展至单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Facb和二体。
如WO99/58570中所述，已产生了特异于纤连蛋白ED结构域且具有纳摩尔浓度以下解离常数的进一步改良的抗体，因此更优选用于本发明中。以L19抗体为例说明了这些靶向剂，参阅WO 99/58570，该文献特别收编于此作为参考，以教导如何制备和使用此抗体和相关抗体。这些抗体对纤连蛋白ED-B结构域的特征性表位具有特异亲和力，且对ED-B表位亲和力有所提高。
这些改良的重组抗体可以以scFv形式由抗体噬菌体展示文库获得。除了H10和L19之外(后者对于纤连蛋白ED-B结构域的解离常数在低于纳摩尔浓度的范围内)，特别收编于此作为参考的文献WO 99/58570的技术也可以用于制备类似抗体。从抗体噬菌体展示文库中分离特异于纤连蛋白ED-B结构域的人scFv抗体片段以及分离与ED-B相结合的亲和力在纳摩尔浓度以下的人scFv抗体片段的方法特别参阅WO 99/58570的实施例1和2。
因此，优选的抗体包括对纤连蛋白ED-B结构域的特征性表位具有特异亲和力的抗体，其中所述抗体对ED-B表位具有改良的亲和力，其中所说的亲和力是在纳摩尔浓度以下范围内的，且其中所述抗体识别ED-B(+)纤连蛋白。其它优选的形式是其中的所述抗体是scFv或重组抗体，以及其中亲和力由于在其CDR残基中引入了有限数量的突变而得到提高的形式。可突变的示范性残基包括VH结构域的第31-33、50、52和54位残基和VL结构域的第32和50位残基。这样的抗体能够以27-54pM的Kd结合纤连蛋白的ED-B结构域；这可以通过L19抗体或L19的功能等同变体作为范例进行说明。
Q5.抗病毒缀合物
在正常状况下，PE不暴露于细胞表面。不过，在各种疾病状态下，PE在一种或多种类型细胞的表面变得暴露。例如，在肿瘤血管结构中的内皮细胞变成PE阳性，并可被PE定向的治疗剂所靶向，正如本文所示的用与HuIgG缀合的耐久霉素进行成功肿瘤治疗所证实的。在病毒感染细胞的表面PE也变得暴露，因此这是用本发明的PE结合肽衍生物进行干预治疗的另一靶目标。事实上，本申请说明了耐久霉素衍生物(以与生物素和HuIgG连接的衍生物为例说明)是体外和体内的有效抗病毒剂。
数种抗病毒剂，包括AZT、无环鸟苷、9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤、西多福韦(胞嘧啶衍生物)和新的抗病毒药物受到毒性/效力的限制。基于对病毒感染期间有关PE变化的观察结果以及原始PE结合肽衍生物的效力，本发明的发明者已通过设计毒性减少且效力增加的新型抗病毒治疗剂而致力于解决抗病毒领域内的问题。在本发明的新型抗病毒治疗剂中，抗病毒药物与PE结合肽联接，它起到了将所附着的抗蛋白药物投递至病毒感染细胞的作用。
此外，关于本发明的PE结合肽、抗病毒衍生物的开发，本发明的发明者得到了以下的观察结果。本文提供的资料显示PE结合肽衍生物(如耐久霉素-L-生物素)在体内、尤其是在肺中被巨噬细胞摄取，甚至在全身施用后也如此。感染时，许多病毒首先通过网状内皮细胞系统(RES)的细胞，而巨噬细胞是摄取病毒的主要细胞。因此，通过将抗病毒药物连接诸如耐久霉素等PE结合肽，可将药物的抗病毒作用导向负责清除入侵病毒的主要细胞类型(巨噬细胞)。
因为PE结合肽衍生物在全身性施用后定位于肺中的巨噬细胞，全身性施用自然是有效的。而通过更直接的方式，包括通过气雾剂施用于肺也是可以预见的。因此，本发明通过提供广泛实用可行的抗病毒方案解决了抗病毒治疗领域内的重要不足之处。
本发明的新的抗病毒治疗剂因此包含与抗病毒药物连接的PE结合肽(诸如耐久霉素)，优选用生物学可释放的或可水解的不稳定键连接两种药剂。一系列抗病毒剂中的任一种，包括未来作为抗病毒剂开发的任何药剂，都可以与PE结合肽连接而形成本发明的有利抗病毒治疗剂。除了所谓的典型抗病毒剂之外，其它的DNA/RNA抑制剂也可附着于PE结合肽上，以形成抗病毒治疗剂。示范性的抗病毒剂列举于表G中，其中的任何一种或多种都可附着于PE结合肽上来制备本发明的抗病毒缀合物，或可分别用于本发明的抗病毒组合疗法中。
表G
通常引起疾病的病毒和抗病毒药物
 
引起疾病的病毒 药物种类 示范性的抗病毒药物
疱疹病毒 西多福韦、阿昔洛韦、喷苷洛韦(泛昔洛韦)、更昔洛韦、脱氧鸟苷、膦甲酸、伊屈非定、三氟胸苷、阿糖腺苷、索立夫定
逆转录病毒 核苷逆转录酶(RT)抑制剂 齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、拉米夫定、司他夫定、阿巴卡韦、多核苷耐受性A、多核苷耐受性B
非核苷RT抑制剂 奈韦拉平、地拉韦啶、依法韦仑、阿德福韦、dipivoxil
蛋白酶抑制剂 茚地那韦、利托那韦、沙奎拉韦、奈非那韦、氨普奈韦
细胞周期相特异性抗肿瘤药 羟基脲(Hydrea<sup>TM</sup>、Bristol Myers-Squibb)
乙肝病毒 Deoxycytosine iphosphate、三磷酸拉米夫定、emticitabine triphosphate、二磷酸阿德福韦、三磷酸喷昔洛韦、三磷酸洛布卡韦
丙肝病毒 干扰素α、利巴韦林
 
A型和B型流感病毒 金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、奥塞米韦
在抗病毒剂和药物的范围内，目前优选AZT和西多福韦用于连接PE结合肽。无论所选择的抗病毒药物、PE结合肽是什么，抗病毒缀合物都将与肺中的巨噬细胞结合、与病毒感染细胞结合并可能结合病毒颗粒。取决于所用的接头或缀合技术，抗病毒药物可以在靶细胞表面释放，然后被摄取入细胞。优选缀合物本身被摄取入细胞，诸如巨噬细胞或病毒感染细胞。摄取可以是自然发生的或可以是病毒介导的。一旦进入细胞内，如同用抗体缀合物一样，接头的水解将释放出活性抗病毒剂。
选用于耐久霉素-西多福韦抗病毒剂的恰当连接的一个实例参见图13R。在此实例中，耐久霉素-西多福韦缀合物被设计成结合肺中的巨噬细胞并被细胞所摄取。接头的水解导致氨基磷酸酯的分解和活性西多福韦或可裂解形成西多福韦的细胞可通透衍生物(图13R中的R)的释放。
可以使用含生物学不稳定键的其它连接，诸如二硫键、酸不稳定键、酶促可裂解键或可水解键。因此，被描述用于连接抗体与治疗剂的任何生物学可释放或选择性可水解键都可用于连接本发明的PE结合肽和抗病毒衍生物。接头的选择不受具体的PE结合肽(诸如耐久霉素)的限制，因为如上所述，肽可以通过衍生化而引入允许选定的抗病毒剂附着的官能团。
R.抗病毒治疗方法
本发明还提供了一系列抗体、免疫缀合物和PE结合肽衍生物(其任选与抗病毒剂缀合)，可用于治疗病毒感染。用药方式、尤其是剂量通常与上文关于本发明癌症治疗所述的一样，适应性是本发明整体的一个优势。尽管实施本发明的抗病毒治疗不需要理解其作用的特殊机制，根据本文中工作实施例所支持的，有关病毒疗法的某些原理如下。
最重要的机制被认为是与病毒复制和宿主细胞的活化有关。在病毒感染期间，病毒在其细胞内复制过程期间激活细胞。正如对疱疹病毒、丙肝病毒和HIV-1的研究所显示的，此细胞活化过程是病毒复制所必需的。病毒的发展激活了病毒和宿主二者的基因表达。例如，Pichinde病毒和Machupo病毒的复制在复制周期的晚期被放线菌素D所抑制，表明宿主细胞基因转录是完成病毒复制所必需的。
病毒对宿主细胞的活化引起细胞使阴离子磷脂和氨基磷脂(诸如PS和PE)外在化。具体地说，发明者推测，病毒活化引起Ca2+流入细胞，激活了变频酶，使阴离子磷脂和氨基磷脂(尤其是PS和PE)外在化。然后，可结合阴离子磷脂和氨基磷脂(优选PS和PE)的抗体、肽衍生物和缀合物结合并干扰活化过程，使病毒不能够正确复制。
本发明的实施例显示本发明在病毒感染过程的晚期发挥作用，阻断了病毒成熟或溢出。发明者的研究显示本发明药剂的抑制作用是广泛可用的，因为已显示对利用不同溢出机制的病毒均可起作用。例如，本发明的实施例证实阻断了疱疹病毒(CMV)(它从高尔基体衍生的胞外囊泡中释放出来)，还阻断了沙粒病毒(Pichinde病毒)和副粘病毒(RSV)直接从原生质膜中出芽)。
病毒感染细胞使阴离子磷脂和氨基磷脂(尤其是PS和PE)外在化，正常情况下这些磷脂是细胞内的，即局限于原生质膜的内表面。在病毒释放期间，磷脂在释放的部位重新分布，在病毒出芽或从质膜进行胞吐的期间接纳膜弯曲，在此过程中阴离子磷脂和氨基磷脂被外在化。本发明的抗体、肽衍生物和缀合物因此与外在化的阴离子磷脂和氨基磷脂(尤其是PS和PE)结合，并阻止了病毒从被感染细胞中的释放。本发明构建物与病毒感染细胞的结合在本发明的实施例中也有显示。
本发明的抗体、肽衍生物和缀合物可进一步结合外在化的阴离子磷脂和氨基磷脂(尤其是PS和PE)并干扰病毒基因表达和/或复制所必需的一种或多种信号传导途径。
此外，有包膜的病毒粒子本身在其外表面很可能有阴离子磷脂和氨基磷脂(诸如PS和PE)。由于病毒缺乏转位酶来保持或恢复磷脂的不对称性，所以预期存在诸如PS和PE等磷脂的持续暴露。本发明抗体、肽衍生物和缀合物因此可引起调理作用、补体的结合、诸如巨噬细胞等宿主细胞的内吞作用以及自由病毒颗粒的清除。
在本发明的另一方面，病毒很可能需要阴离子磷脂和氨基磷脂用于感染和/或syncitia形成。本发明的抗体、肽衍生物和缀合物可通过结合阴离子磷脂和氨基磷脂而进一步阻断病毒生命周期的这些方面。
依照前述观察结果并根据本发明的实施例，本发明病毒疗法的范围可以扩展到任何病毒，可以是包膜或没有包膜的，DNA或RNA。由于本发明的阴离子磷脂和氨基磷脂结合抗体、肽衍生物和缀合物至少在部分程度上阻断了病毒在细胞内的复制并/或阻止了病毒从细胞中释放，因此本发明并不只限于治疗有包膜的病毒，也不限于任何具体的病毒，这是一个重要的有利之处。例如，本发明随后发表的工作报道了膜联蛋白V和PS囊泡能抑制巨噬细胞的HIV-1感染，但不能抑制T细胞的HIV-1感染或抑制其它病毒，诸如水泡性口炎病毒G和兼嗜性小鼠白血病病毒(Callahan等，2003)。
自然的，本发明的抗体、肽衍生物和缀合物确实作用于有包膜的病毒，尤其是在包膜外表面有阴离子磷脂和氨基磷脂(尤其是PS和PE)的那些病毒，其中所述抗体、肽衍生物和缀合物使病毒被清除并/或抑制了病毒进入靶细胞。
因此本发明的重要方面是它可普遍应用，适于治疗重组、基因工程化和合成的病毒，如作为生物恐怖主义而发展的病毒。事实上，本发明并不限于治疗动物和人。由于在病毒分类群中发现的宿主类型包括藻类、archaea、细菌、真菌、无脊椎动物、支原体、植物、原生动物、螺旋质体和脊椎动物，本发明可用于抑制在任何这样类型宿主中的病毒感染和复制，包括农业上重要的病毒。目前优选脊椎动物中病毒感染和相关疾病的治疗，而表H中感染脊椎动物的任一种或多种病毒都可用本发明的制剂进行抑制并治疗所产生的感染。
表H
脊椎动物的病毒
 
科 属 模式种
腺病毒科 乳腺腺病毒属禽腺病毒非洲猪瘟样病毒 人腺病毒2禽腺病毒1非洲猪瘟病毒
砂粒病毒科 砂粒病毒Arterivirus 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒马动脉炎病毒
星状病毒科 星状病毒属 人星状病毒1
双节RNA病毒科 AquabirnavirusAvibirnavirus 传染性胰腺坏死病毒传染性囊病病毒
布尼亚病毒科(Bunyaviridae) 布尼亚病毒汗坦病毒内罗毕羊病毒白蛉热病毒 布尼奥罗病毒汗坦病毒内罗毕绵羊病病毒白蛉热西西里病毒
嵌杯样病毒科 嵌杯状病毒 猪水疱疹病毒
Circoviridae circovirus 小鸡贫血病毒
冠状病毒科 冠状病毒环曲病毒(torovirus)δ病毒 鸟类传染性支气管炎病毒berne virus肝炎δ病毒
丝状病毒科 丝状病毒 马尔堡病毒
黄病毒科 黄病毒瘟病毒(pestivirus)丙型肝炎样病毒 黄热病病毒牛痢疾病毒丙肝病毒
嗜肝DNA病毒科 正嗜肝DNA病毒鸟嗜肝DNA病毒 乙型肝炎病毒鸭乙型肝炎病毒
疱疹病毒科亚科：α疱疹病毒亚科亚科：β疱疹病毒亚科亚科：γ疱疹病毒亚科 单纯疱疹病毒水痘病毒巨细胞病毒MuromegalovirusRoseo1ovirusLymphocryptovirusRhadinovirus 人疱疹病毒1人疱疹病毒3人疱疹病毒5小鼠巨细胞病毒1人疱疹病毒6人疱疹病毒4Ateline herpesvirus 2
虹彩病毒科 Ranavirus淋巴囊肿病毒金鱼病毒样病毒 蛙病毒3比目鱼(flounder)病毒金鱼病毒1
正粘病毒科 流感病毒A、B流感病毒CThogoto-like viruses A型流感病毒C型流感病毒Thogoto virus
乳多空病毒 多瘤病毒乳头瘤病毒 小鼠多瘤病毒棉尾兔乳头瘤病毒(shope)
副粘病毒科亚科：副粘病毒亚科：肺病毒 副粘病毒麻疹病毒Rubulavirus肺病毒 人副流感病毒1麻疹病毒腮腺炎病毒人呼吸道合胞病毒
细小病毒科亚科：细小病毒 细小病毒 小鼠细小病毒
 
Erythovirus依赖病毒 B19病毒腺伴随病毒2
小核糖核酸病毒科 肠道病毒鼻病毒肝病毒心脏病毒口疮病毒(Aphthovirus) 脊髓灰质炎病毒1人鼻病毒1A甲型肝炎病毒脑心肌炎病毒口蹄疫病毒0
痘病毒科亚科：脊椎动物痘病毒(Chordopoxvirinae) 正痘病毒副痘病毒禽痘病毒山羊痘病毒野兔痘病毒猪痘病毒Molluscipoxvirus亚塔痘病毒 痘苗病毒口疮病毒禽痘病毒羊天花病毒粘液瘤病毒猪痘病毒传染性软疣病毒亚巴猴瘤痘病毒
呼肠孤病毒科 正呼肠孤病毒环状病毒轮状病毒ColtivirusAquareovirus 呼肠孤病毒3蓝舌病病毒1猿猴轮状病毒SA11科洛拉多蜱传热病毒Golden Shiner virus
逆转录病毒科 B型哺乳动物逆转录病毒C型哺乳动物逆转录病毒C型鸟类逆转录病毒D型逆转录病毒Blv-htlv逆转录病毒慢病毒属Spumavirus 小鼠乳腺瘤病毒鼠白血病病毒禽类白血病病毒梅-帕猴病毒(Mason-Pfizermonkey virus)牛白血病毒人免疫缺陷病毒1Human spumavirus
弹状病毒科 水疱性病毒狂犬病病毒类短命病毒 水疱性口炎印第安纳病毒狂犬病病毒牛三日烧病(Bovine ephemeralfever)
披膜病毒科 甲病毒风疹病毒属 新培斯病毒风疹病毒
优选将本发明用于治疗哺乳动物中的病毒感染和相关疾病，尤其是有价值的或赋予价值的动物(诸如赛马和家养宠物)和用于直接产生(如肉类)或间接产生(如牛奶和蛋)食物供人类消耗的动物和鸟类。除了对人的治疗外，本发明示范性的实施方案包括治疗马、狗、猫等等；治疗牛、猪、野猪、绵羊、山羊、水牛、野牛、骆驼、鹿、麋鹿和其它大型动物，以及它们的幼崽，包括牛犊和羔羊。
尤其优选对人的治疗，无论是针对天然产生的病毒或由于生物恐怖主义产生的病毒。对于天然存在的病毒和所引起的疾病来说，本发明在其应用中是不受约束的。因此，表J中的任一种或多种病毒都可用本发明进行抑制，并由此治疗所产生的感染和疾病。
表J
人体中的病毒疾病
 
疾病 病毒 病毒类型
AIDS 人免疫缺陷病毒(HIV) 逆转录病毒
细支气管炎和病毒性肺炎 呼吸道合胞病毒 副粘病毒
细支气管炎 副流感病毒 副粘病毒
子宫颈癌 人乳头瘤病毒 乳多空病毒
水痘 水痘带状疱疹病毒 疱疹病毒
登革热 登革病毒 黄病毒
埃博拉出血热 埃博拉病毒 线状病毒
生殖器疱疹 单纯疱疹病毒-2 疱疹病毒
汗坦病毒出血热 汗坦病毒 布尼亚病毒
肝炎 甲型肝炎 小核糖核酸病毒
乙型肝炎 Hepadavirus
丙型肝炎 黄病毒
丁型肝炎 δ病毒
戊型肝炎 calcivirus
流感 流感病毒A、B和C 正粘病毒
junin argentinian出血热 junin virus 砂粒病毒
拉沙出血热 拉沙病毒 砂粒病毒
马秋博出血热 马秋博沙粒样病毒 砂粒病毒
麻疹 麻疹病毒 副粘病毒
单核细胞增多症 E.B.病毒 疱疹病毒
CMV病(病毒性肺炎、单核细胞增多症样综合症) 巨细胞病毒 疱疹病毒
重症急性呼吸道综合症(SARS) 人冠状病毒 冠形病毒
带状疱疹 水痘带状疱疹病毒 疱疹病毒
天花 天花病毒 痘病毒
黄热病 黄热病病毒 黄病毒
西尼罗河热 西尼罗河病毒
西方马脑炎 西方EE病毒 披膜病毒
肺炎、肝炎、急性呼吸道疾病 腺病毒 腺病毒
肠胃炎 轮状病毒 轮状病毒
脑炎 Semliki forest virus 甲病毒
牛痘 痘苗病毒 痘病毒
脑炎 委内瑞拉EE 甲病毒
脑膜炎、脑炎、脑膜脑炎 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 砂粒病毒
委内瑞拉出血热 Guanarito virus 砂粒病毒
里夫特裂谷热(出血热、脑炎) 里夫特裂谷热病毒 布尼亚病毒
马尔堡出血热 马尔堡病毒 线状病毒
蜱传性脑炎 蜱传脑炎病毒(TBEV) 黄病毒
脑炎 Hendra virus 副粘病毒
脑炎 Nipah virus 副粘病毒
克里米亚-刚果出血热 克里米亚-刚果出血热病毒 布尼亚病毒
巴西出血热 Sabia virus 砂粒病毒
本发明尤其预计可用于治疗CMV相关疾病，诸如病毒性肺炎、单核细胞增多症类综合症和相关的先天畸形(耳聋和精神发育迟缓)；呼吸道疾病，诸如RSV引起的疾病，包括细支气管炎和病毒性肺炎、流行性感冒、普通的感冒和SARS；AIDS；肝炎；与病毒感染相关的癌症；单核细胞增多症；和天花。
在其它实施方案中，发明者尤其考虑对在人体中有致病性的沙粒病毒进行抑制。沙粒病毒包括造成拉沙热(拉沙病毒)和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCMV)的Old World病毒。拉沙热是西非的地方流行病，每年感染多达300,000人并引起高达3000人死亡。拉沙热的感染在约10天内导致发热和不适。腹痛、恶心、呕吐和腹泻是常见的。可能发生咽炎和咳嗽。神经上的症状经常是轻微的。诸如浮肿和胸腔积液等血管渗漏综合症在更严重的病例中存在。在约四分之一的患者中可见到出血。此疾病可在心血管系统中引起改变并最终导致休克和死亡。
拉沙病毒还包括造成大腹菌出血热(Junin病毒)、波利维亚出血热(Machupo病毒)和委内瑞拉出血热(Guanarito病毒)的抗原独特型新世界病毒(New World viruses)。所有这些病毒均在可能的生物恐怖主义武器的A类型CDC名单上。
尽管与氨基磷脂或阴离子磷脂无关，直接与病毒结合的其它抗体也已被开发成批准的药物。如用于抑制免疫抑制患者中的CMV感染的CytoGam和用于保护新生婴儿不受呼吸系统syncitial病毒感染的Synagis。因此，利用单克隆抗体接近并中和组织中的病毒是没有问题的。
适用于抗肿瘤实施方案的剂量还适于抗病毒治疗。类似的，多重施用可用于慢性感染，高剂量可用于急性感染。任何适当的施用途径都可应用，如同针对癌症治疗方面所公布的，包括IV、IM、SC，针对肺或气道的气雾剂等等。
本发明所提供的治疗剂是具有广谱抗病毒活性的有用药剂。除了对多种潜在的致命病毒有效外，还可以在暴露于病毒后施用所说的药剂，甚至在病毒的确切特性未知的情况下也可应用。因此，本发明的抗病毒疗法不要求病原体鉴别和进行治疗给药之间的很长时间，与特异性疫苗的开发、生产或投递所需的时间和费用形成了鲜明的对照。
提供下列实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到，下列实施例中公开的技术代表了发明人发现的技术可在本发明的实施中良好运用，由此认为构成了其实施的优选方法。然而，本领域技术人员根据本公开书应当认识到，在公开的特定实施方案中可以进行许多变化而仍获得相同或相似的结果，这并不偏离本发明的精神和范围。
实施例I
用抗VCAM-1-tTF凝血配体进行肿瘤治疗
本实施例显示了在将靶向肿瘤血管结构的凝血剂(“凝血配体”)施用于患肿瘤的动物后造成的体内肿瘤血管系统的特异凝血以及由此产生的抗肿瘤效果。在此凝血配体中，针对VCAM-1(血管内皮粘附分子-1，VCAM-1)的抗体被用作靶向剂而将截短的组织因子(tTF)-一种修饰形式的人凝血剂投递至肿瘤血管。
分泌抗小鼠VCAM-1的大鼠IgG1抗体的MK2.7杂交瘤获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD；ATCC CRL1909)。分泌抗小鼠病毒蛋白p30gag的大鼠IgG1抗体的R187杂交瘤获自ATCC，并被用作抗VCAM-1抗体的同种型匹配对照。
用抗VCAM-1抗体免疫组化检测具有皮下L540人Hodgkin’s肿瘤的小鼠主要器官和肿瘤的血管中VCAM-1的表达。大体上，在作为阳性对照的抗-endoglin抗体MJ7/18染色的20-30％总肿瘤血管上观察到VCAM-1的表达。在患肿瘤动物和正常动物的心脏和肺中都发现了VCAM-1的组成型血管表达。在VCAM-1严格表达于血管外的睾丸中观察到强的基质染色。
用抗VCAM-1抗体静脉注射带皮下L540肿瘤的小鼠，两小时后，将小鼠放血。切下肿瘤和正常器官，制备冷冻切片并进行免疫组化检测以确定抗体的位置。在肿瘤、心脏和肺的内皮上检测到抗VCAM-1抗体。染色是特异的，因为在用无关特异性的物种同种型匹配抗体R187注射的小鼠内肿瘤和器官中观察到无内皮染色。在睾丸和除了心脏和肺之外的任何正常器官中均发现无抗VCAM-1抗体的定位。
用已截短的组织因子(tTF)制备抗VCAM-1·tTF缀合物或“凝血配体”。抗VCAM-1·tTF凝血配体的静脉内施用诱导了患肿瘤小鼠中肿瘤血管的选择性血栓形成，与正常组织中的血管相反。
将抗VCAM-1·tTF凝血配体施用于皮下带直径为0.4-0.6cm的L540肿瘤的小鼠。在注射凝血配体前，肿瘤正常，具有无坏死区的均衡的形态。肿瘤是很好的血管化的，完全无自发形成血栓的血管或出血。在凝血配体注射4小时后，40-70％的血管形成血栓，尽管最初只有20-30％的肿瘤血管染色。形成血栓的血管包含堵塞的血小板聚集、压紧的红细胞和纤维蛋白。在许多区域中，血管已破裂，红细胞溢出至肿瘤间质组织中。
凝血配体注射后24小时，血管仍然被堵塞，并且广泛的出血已扩散至整个肿瘤。肿瘤细胞已相互分离，具有固缩核并正经历细胞溶解。72小时时，整个肿瘤中都可见明显的高程度坏死。有可能起始的凝血配体诱导的凝血酶沉积作用导致了主要血管上VCAM-1靶抗原的诱导增加，因此扩大了靶向和肿瘤破坏作用。
抗VCAM-1·tTF在肿瘤血管上的血栓形成作用是抗原特异性的。同等量施用的对照药剂(只有tTF、只有抗VCAM-1抗体、tTF加抗VCAM-1抗体或无关特异性的对照凝血配体)均不造成血栓形成。
除了肿瘤血管的血栓形成外，此研究还显示了抗VCAM-1·tTF凝血配体的静脉内施用不会诱导正常器官中血管的血栓形成。尽管VCAM-1在正常小鼠或患L540肿瘤的小鼠的心脏和肺血管上均表达，在施用抗VCAM-1·tTF凝血配体后不发生血栓形成。在4或24小时前注射了5-45μg凝血配体的25只小鼠中未观察到血栓形成、组织损伤或形态改变的迹象。来自较多肿瘤血栓形成的同一小鼠的心脏和肺具有正常组织学外观。所有其它的主要器官(脑、肝、肾、脾、胰腺、肠、睾丸)也具有未改变的形态。
当用抗TF抗体、10H10或抗大鼠IgG抗体显影时，来自经凝血配体处理的小鼠的器官和肿瘤冷冻切片显示出一致的染色模式，证实了凝血配体已定位于心脏、肺和肿瘤中的血管。染色强度与凝血配体直接以高浓度施用于切片随后用抗TF或抗大鼠IgG显影的情况下观察到的相等，表明体内已达到结合饱和。
这些研究显示，凝血配体与心脏和肺中正常血管系统内VCAM-1的结合不足以诱发血栓形成，且肿瘤血管系统提供了更多的因子来支持凝血。
在带有0.3-0.4cm3L540肿瘤的SCID小鼠中测定抗VCAM-1·tTF凝血配体的抗肿瘤活性。间隔4天静脉内注射药物3次。与所有其它组相比，处理后21天时抗VCAM-1·tTF处理小鼠的平均肿瘤体积显著减小(p<0.001)。用特异性凝血配体处理的总共15只小鼠中有9只显示出肿瘤体积有超过50％的降低。此作用是特异的，因为未缀合tTF、对照I gG凝血配体以及游离抗VCAM-1与tTF的混合物不会影响肿瘤的生长。
实施例II
肿瘤血管上的磷脂酰丝氨酸表达
为了解释为何抗VCAM-1·tTF在心脏和肺的VCAM-1阳性血管系统中无血栓形成作用，某些发明者提出了正常血管和肿瘤血管之间存在有差异的氨基磷脂和阴离子磷脂(如PS和PE)定位的设想。具体的说，他们猜测正常组织中的内皮细胞将氨基磷脂和阴离子磷脂(如PS和PE)隔离于质膜磷脂双分子层的内表面，在此PS不能参与血栓形成反应；而肿瘤中的内皮细胞则将氨基磷脂和阴离子磷脂转位至质膜的外表面，在此PS能支持凝血配体的凝血活动。细胞表面的PS表达使凝血得以形成，因为它使凝血因子能附着于膜上并协调凝血起始复合物的装配。
如本文所提出的，发明者将氨基磷脂和阴离子磷脂转位至肿瘤血管内皮细胞表面的模型是不寻常的，其中PS的表达不是在细胞死亡之后发生，也不会不可避免地引起细胞死亡。肿瘤内皮细胞表面的氨基磷脂和阴离子磷脂因此足够稳定，能使氨基磷脂和阴离子磷脂(如PS和PE)能用作干预治疗的可靶向实体。
为了证实肿瘤血管内皮在质膜内腔表面表达PS的猜测，发明者利用以下的免疫组化研究来确定抗PS抗体在静脉内注射入患L540肿瘤的小鼠体内后的分布。
A.方法
抗PS和抗心磷脂抗体均为小鼠单克隆IgM抗体，如实施例IV所述由Rote等人(1993，收编于此作为参考)生产和鉴定。3SB的主要反应性是与PS反应，但它也与氨基磷脂磷脂酸(质膜上相对较少的一种组分，它也紧密的被隔离于正常细胞内表面)有反应性。
用20μg抗PS或抗心磷脂小鼠I gM抗体静脉内注射患L540肿瘤的小鼠。10分钟后，将小鼠麻醉并用肝素化的盐水灌注其血液循环系统。切下肿瘤和正常组织并速冻。用检测抗PS抗体的HRP标记抗小鼠IgM或者用抗VCAM-1抗体并随后加HRP标记的抗大鼠Ig对器官和肿瘤的连续切片染色。
为了在冷冻切片上保留膜磷脂，提出了以下方法。用含2.5mM Ca2+的DPBS灌注动物。将组织放置于3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷包被的载片上并在24小时内染色。在载片的固定或清洗中不使用有机溶剂、甲醛或去污剂。用含2.5mM Ca2+和0.2％明胶的DPBS将载片再水合。同样的溶液也用于漂洗切片以去除过量的药剂。将切片与HRP标记的抗小鼠IgM室温保温3.5小时以检测抗PS IgM。
B.结果
此免疫组化研究显示抗PS抗体在10分钟内定位于大多数肿瘤血管，包括可能缺乏VCAM-1的肿瘤中心区内的血管。对VCAM-1呈阳性的血管对PS也呈阳性。因此，PS在肿瘤内表达VCAM-1的血管上有一致的表达。
在体内定位研究中，包括心脏和肺的VCAM-1阳性血管系统在内的正常器官中没有血管被染色，表明内皮细胞外表面没有PS。相反，当用抗PS抗体体外直接对正常组织和肿瘤的切片染色时，在正常的和肿瘤的内皮或其它细胞类型之间没有明显的不同，表明PS存在于这些细胞内，但只在肿瘤内皮细胞表面表达出来。
通过两个独立的实验证实了PS检测的特异性。首先，针对不同的带负电磷脂-心磷脂的小鼠IgM单克隆抗体在体内不归于肿瘤或任何器官。其次，将冷冻切片用丙酮预处理消除了抗PS抗体的染色，据推测可能是因为它将脂质连同结合的抗PS抗体一起萃取掉了。
实施例III
膜联蛋白阻断了凝血配体的活性
本实施例从利用高亲和力PS结合配体-膜联蛋白V在体外和体内阻断PS功能的有关研究中提供了进一步的证据证明表面PS表达在凝血配体活性中的作用。
A.膜联蛋白V在体外阻断了因子X的凝血配体活化作用
用呈色试验测定膜联蛋白V影响凝血配体所诱导的因子X形成的能力。将IL-1α刺激的bEnd.3细胞与抗VCAM-1·tTF一起保温并用皂素使其透化。添加0.1-10μg/ml范围浓度的膜联蛋白V，将细胞保温30分钟，然后加入稀释的ProplexT。测定在膜联蛋白V存在或缺乏的条件下产生的因子Xa的量。用双份平行试样进行各个测定并重复至少两次。
在凝血配体的作用中需要表面PS的表达通过发明者的下述发现得到了进一步的证明，即可与PS以高亲和力结合的膜联蛋白V在体外阻断了抗VCAM-1·tTF结合bEnd.3细胞从而产生因子Xa的能力。
向与抗VCAM-1·tTF预保温过的透化细胞中加入膜联蛋白V会以剂量依赖型的方式抑制因子Xa的形成。在缺乏膜联蛋白V的情况下，细胞结合的凝血配体每60分钟在每10000个细胞内产生95ng因子Xa。逐步增加所加入膜联蛋白V的量(在μg/ml的范围内)抑制了因子Xa的产生。当添加量为10μg/ml时，膜联蛋白V抑制了58％的因子Xa的产生。在试验期间逐步提高膜联蛋白V的浓度未观察到更多的抑制，表明在10μg/ml时膜联蛋白V饱和了所有可供利用的结合位点。
B.膜联蛋白V阻断了体内的凝血配体活性
在患L540 Hodgkin的SCID小鼠中检测膜联蛋白V抑制体内凝血配体诱导血栓形成的能力。在小鼠中生成肿瘤，两只小鼠一组(肿瘤尺寸为直径0.5cm)用以下药剂中的一种从尾静脉处静脉内注射：a)生理盐水；b)100μg膜联蛋白V；c)40μg抗VCAM-1·tTF；d)100μg膜联蛋白V并在2小时后注射40μg抗VCAM-1·tTF。
最后一次注射4小时后，麻醉小鼠并用肝素化的盐水灌注。切下肿瘤，用4％的福尔马林固定、石蜡包埋并用苏木精-伊红染色。对形成血栓和未形成血栓的血管进行计数，并计算血栓形成的百分率。
膜联蛋白V还封闭了体内抗VCAM-1·tTF凝血配体的活性。用对照或实验药剂之一处理带肿瘤的小鼠组。给小鼠施加a)生理盐水；b)100μg膜联蛋白V；c)40μg抗VCAM-1·tTF；d)100μg膜联蛋白V并在2小时后施加40μg抗VCAM-1·tTF凝血配体。在每组的两只小鼠中都得到了相同的结果。
在盐水注射小鼠的肿瘤中未观察到自发的血栓形成、出血或坏死。单独用膜联蛋白V处理不改变肿瘤的形态。
按照本文所提供的其它结果，40μg抗VCAM-1·tTF凝血配体在总共70％的肿瘤血管中引起血栓形成。大多数血管被聚集的红细胞和血凝块堵塞，肿瘤细胞相互分离。通过用膜联蛋白V预处理小鼠，完全消除了凝血配体诱导的抗肿瘤作用，即血管内血栓形成和肿瘤细胞形态的改变。
这些发现证明了凝血配体的抗肿瘤效果是通过肿瘤血管的堵塞介导的。这些数据还证明了PS是体内凝血配体诱导的血栓形成所必需的。
实施例IV
抗氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体的产生
此实施例描述了发明者根据其对肿瘤血管内皮细胞中氨基磷脂和阴离子磷脂转位的观察设计的、且已发现在抗氨基磷脂和阴离子磷脂抗体产生中运作良好的免疫接种方法。获得了许多与诸如PS和PE等氨基磷脂和阴离子磷脂有反应性的抗体。在本实施例和以下实施例中，为了简便起见，与PS有反应性的抗体可称为“抗PS抗体”，尽管某些这样的抗体的结合并不局限于PS，而是如本文所示延伸到了某些其它的氨基磷脂和阴离子磷脂。
A.免疫接种方法
为了将氨基磷脂和阴离子磷脂作为较强的免疫原呈递于免疫系统中，将氨基磷脂和阴离子磷脂制备成氨基磷脂阳性和阴离子磷脂阳性细胞。插入膜且被其它膜组分所包围的氨基磷脂和阴离子磷脂对于产生抗体来说具有更好的构象和清除率。
意图用表达氨基磷脂和阴离子磷脂(在此实施例中以PS为示范说明)的自体细胞免疫有免疫能力的动物，其中所述动物不会产生抗所有自身表面抗原的抗体，但会将膜暴露的磷脂(如PS)识别为外源成分。此方案可应用于任何标准实验室动物的使用中，诸如有免疫能力的BALB/c小鼠和Lewis大鼠，以及任何氨基磷脂阳性或阴离子阳性细胞。
首先选择BALB/c小鼠和小鼠内皮细胞bEnd.3(永生化的小鼠(BALB/c株系)内皮细胞)。在10％CO2培养箱中将bEnd.3培养于含9ml/500ml HEPES缓冲液的10％DMEM中。将bEnd.3细胞在T175 TC摇瓶中扩大培养，直到获得所期望的细胞数目。一般而言，各摇瓶在细胞汇合至约70-80％时有约3 x 106个细胞，各小鼠应接受1 x 106至20 x 106个细胞，多达1 x 107个细胞。
在37℃用50μM至200μM过氧化氢处理bEnd.3细胞1小时或2小时，以便在免疫前暴露阴离子磷脂(诸如PS)。H2O2的贮液是[9.8M]；30％(v/v)。将其1:1000稀释，然后将0.4ml加入含40ml培养基的T175 TC摇瓶中至终浓度为100μM H2O2。将细胞在37℃保持1小时。为了收获，用温的PBS(+10mM EDTA)漂洗细胞3次以去除培养基中所有的BSA或血清蛋白。用胰蛋白酶温和处理以取下细胞，漂洗并1000rpm离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬于无添加剂的DMEM中至适当体积(每只小鼠接受在200μl中的约1 x 107个细胞)并保存于冰上。
用1ml注射器和23号针头将以此方式处理的细胞(200μl细胞悬浮液)腹膜内注射入各个小鼠中。间隔3-4周免疫小鼠3-7次。从第二次激发开始，每次激发后10天给小鼠放血收集免疫血清。用ELISA测定抗PS的血清滴度。
这些用自体PS阳性细胞进行的免疫不会导致自身抗体不受控的产生，而只局限于与PS有反应性或与联合了其它氨基磷脂和阴离子磷脂的PS有反应性的抗体的产生。
在另一项研究中，用经200μM过氧化氢处理2小时的bEnd.3内皮细胞免疫雌性Lewis大鼠。根据125I-标记的膜联蛋白V检测，此处理在70-90％的细胞中造成阴离子磷脂转位至外表面。将处理后的细胞漂洗、分离并计数。将200万细胞悬浮于无菌PBS中并每隔3周腹膜内注射5次。每次免疫后2天测定针对阴离子磷脂的多克隆抗体的滴度。
B.高滴度抗血清
得到了具有高效价的与诸如PS等阴离子磷脂有反应性的抗体的小鼠(表1)。小鼠未显示出任何的毒性迹象。尽管总体而言此免疫方法在小鼠中比在大鼠中更有效，对大鼠的免疫也是有效的，并且产生了9D2抗体(见下文)。
表1
抗PS IgG抗体产生
 
效价范围 每组小鼠的数目(占总数的％)
1:100-1:1,000 2/30(6.66％)
1:1000-1:10,000 5/30(16.6％)
1:10,000-1:100,000 18/30(60％)
1:100,000-1:1,000,000 5/30(16.6％)
在进一步的免疫中，用经过氧化氢处理的bEnd.3细胞免疫多种小鼠3次，并在首次免疫后54天检测血清。用抗小鼠IgG，即Fc特异性二抗，检测血清中与PS有反应性的IgG抗体，用抗小鼠IgG mu特异性二抗检测血清中的IgM抗体。用此免疫方法获得了许多具有对PS有反应性的IgG和IgM的有效抗血清，其中含IgG抗体的抗血清通常更有效。
这些方法现在可用于产生更多的特殊抗PS抗体，例如包括如下所述经筛选有效竞争3G4抗体的抗体。一般而言，当预期的抗PS抗血清的IgG滴度达到大于200000，而PC滴度小于50000时，可进行融合而产生单克隆抗体。
此外，这些方法并不局限于用H2O2开始处理细胞，因为诱导氨基磷脂和阴离子磷脂表达的其它方法也可应用。例如，用TNF和放线菌素D进行处理是另一种有用的方法。在一种情况下，在37℃培养箱中用10ng/ml小鼠TNF和1μg/ml放线菌素D处理亚汇合(约85％汇合)的bEnd.3细胞16小时。然后通过上述免疫步骤获得细胞。
C.IgG和IgM单克隆抗体
通过将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤配偶体P3X63AG8.653细胞(ATCC，Rockville，MD)融合得到杂交瘤。
本发明者用于制备肿瘤治疗中有用的单克隆抗体的技术中一个重要方面是选择的策略，它包括通过筛选而选择可结合氨基磷脂或阴离子磷脂但不结合中性磷脂的抗体。另一重要的方面是选择在血清存在时结合PS包被平板的强度与血清缺乏时一样的抗体。进行此实验来排除识别PS和血清蛋白质复合物的抗体，后者被认为能引起或造成抗磷脂综合症。
分离与PS有反应性的单克隆抗体的方法包括例如用抗小鼠IgG，即Fcγ特异性二抗，在PS包被平板上筛选杂交瘤上清液。首先进行针对四种磷脂(PS，磷脂酰丝氨酸；PE，磷脂酰乙醇胺：CL，心磷脂：和PC，卵磷脂)以及bEnd.3细胞的筛选。丢弃与中性磷脂PC有反应性的克隆与bEnd.3细胞无反应性的克隆。选择高度结合抗PS的克隆。首先亚克隆只具有PS反应性或强烈倾向于PS的孔，其次亚克隆展示了PS反应性并且可与其它阴离子磷脂结合的孔。
在以下研究中，按Rote等人(1993)所述生产且被称为3SB、D11和BA3的小鼠单克隆IgM抗体也包括在内。3SB抗体在该文献中被描述为抗PS抗体，而D11抗体在该文献中被描述为抗心磷脂(抗CL)抗体。Rose等人(1993，收编于此作为参考)报道了这些抗体的产生和鉴定的详情。
测定发明者所制备的各选定杂交瘤的同种型。IgG类抗体具有许多优越于IgM之处，包括通常亲和力较高、体内清除率较低以及纯化、修饰和处理的简便性，所以它们的产生是尤其合乎需要的。为了集中于具有均一IgG同种型的孔，将含IgM或不同Ig混合物的孔丢弃或重克隆。高阳性克隆的亚克隆被重复3-4次。
根据ELISA所测定的代表性的IgG和IgM抗体同种型见表2。在将其命名改变成3G4之前，发明者最初将3G4抗体称为“F3-G4”。这并未反映生物材料的任何变化。抗体的血清依赖性或不依赖性也参见表2。
表2
抗PS抗体的同种型和血清依赖型
 
名称 来源 物种/同种型 血清依赖型
3SB Rote等，1993 小鼠IgMκ 无
D11 N.Rote 小鼠IgMκ
BA3 Rote等，1993 小鼠IgMκ
9D2 此研究 大鼠IgMκ 无
1B12 此研究 小鼠IgG<sub>1</sub>κ
3G4 此研究 小鼠IgG<sub>3</sub>κ 无
1B9 此研究 小鼠IgG<sub>1</sub>κ 完全的
3B10 此研究 小鼠IgG<sub>3</sub>κ 无
2G7 此研究 小鼠IgG<sub>1</sub>κ 完全的
7C5 此研究 小鼠IgG<sub>1</sub>κ 完全的
D.ELISA方法和单克隆抗体鉴定
用ELISA进一步研究抗体并与3SB和D11比较。用于本发明中的抗-PS ELISA进行如下。除非详细说明具体的差异，这是本申请整个研究中所用的ELISA形式。
用抗原PS(在2.5ml瓶中的P-664125mg10mg/ml(溶剂是氯仿：MeOH95∶5)示范说明ELISA。其它的磷脂可以相同的方法利用。PS(或其它磷脂)贮液应等分分装并在-30℃贮存于密封容器中。优选的96孔板是DynatechU形底Immulon1(来自Dynatech Labs，目录号011-010-3550)。
本文所用的标准封闭缓冲液是溶于PBS中的10％牛血清。其它的封闭溶液也是合适的，但封闭和漂洗溶液中应不含任何去污剂。一抗是待测样品或混合物。优选的二抗是山羊抗小鼠IgG-HRP。显影溶液是：10ml0.2M Na2PO4、10ml0.1M柠檬酸、一片10mg的OPD和10μl过氧化氢。终止液是0.18M H2SO4。
此方法按如下步骤用PS包被96孔板：将PS贮液在正己烷中稀释至10μg/ml并混合均匀。在每个孔中添加50μl并使其蒸发1小时。在各孔中添加200μl 10％的血清(或其它封闭缓冲液)，覆盖并室温放置2小时或在4℃过夜。用PBS漂洗平板3次。添加一抗(稀释于封闭缓冲液中)并在37℃保温2小时。用PBS漂洗3次。添加100μl/孔二抗(通常是山羊抗小鼠IgG-HRP或其它合适的二抗)并在37℃保温1小时。用PBS漂洗平板3次。ELISA的显影进行如下：添加100μl显影溶液至各孔中，显影10分钟，然后在各平板中加入100μl终止液并读取490nm处的O.D.值。
以下是9D2、1B12、3G4和1B9的结果。测定这些抗体对PS的亲和力并与3SB进行比较。与3SB相比，新抗体的某些相对亲和力有了很大的提高(表3)。
表3
抗PS抗体的相对亲和力
 
名称 EC<sub>50</sub>(μg/ml)<sup>1</sup> 相对3SB的结合(提高倍数) EC<sub>50</sub>(nM)<sup>2</sup> 相对3SB的亲和力(提高倍数)
3SB 0.468 1 0.518 1
D11 >40.0 0.011 >44.4 0.011
9D2 0.104 4.50 0.115 4.50
1B12 0.312 1.50 2.07 0.25
3G4 0.040 11.7 0.266 1.94
1B9 0.019 24.6 0.126 4.11
膜联蛋白V<sup>3</sup> 0.100 4.68 2.77 0.18
1基于组织培养上清液的稀释液；用抗小鼠或大鼠Igs作为俘获抗体通过夹心ELISA测定IgG和IgM的浓度。所有克隆平均分泌10-15μg/ml的Ig。
2用于转换的分子量：IgM-900kDa，IgG-150kDa，膜联蛋白V-36kDa
3膜联蛋白对PS的亲和力在0.1nM至1nM的范围内。此表中的值代表了用与抗PS抗体相同的ELISA条件通过链霉亲和素-HRP检测的市售生物素化膜联蛋白V的结合。
用被以下磷脂包被的平板通过ELISA测定抗体的特异性：PS，磷脂酰丝氨酸；PE，磷脂酰乙醇胺；PI，磷脂酰肌醇；PA，磷脂酸；PG，磷脂酰甘油；PC，卵磷脂；CL，心磷脂；和SM，鞘磷脂。将9D2、1B12、3G4和1B9的特异性模式与3SB和D11进行比较，如表4中所显示的。
表4
抗PS抗体的磷脂特异性
 
名称 在ELISA反应性相对强度<sup>1，2</sup>
3SB PS＝PA>>CL、PI、PE、PG
D11 CL＝PA>>PS、PI、PE、PG
9D2 PA>PS＝CL>PG＝PI>>PE
1B12 PS＝PA>CL>PE＝PI、PG
3G4 PS＝PA＝PI＝PG＝CL>>PE
3B10 PS＝PA＝PI>>PE
1B9 只有PS反应
2G7 只有PS反应
7C5 只有PS反应
膜联蛋白V PS＝PE＝PI＝PA>CL>PG
1符号>表明在相同抗体浓度下测试时与各种磷脂的结合至少有2倍的差异。
2符号>>表明在相同抗体浓度下测试时与各种磷脂的结合至少有10倍的差异。
1B9、2G7和7C5抗体表现基本上相同。这些抗体只识别PS，并在结合PS时需要血清或血清蛋白质。1B9、2G7和7C5与多种磷脂的结合只有在存在10％牛血清的条件下才能检测到，而其它抗体则在缺乏或存在血清的条件下都可检测到。对于除了1B9、2G7和7C5之外的抗体，血清的存在不会改变其与特定磷脂结合的优先性。后一组，包括3G4、3B10和9D2，在缺乏血清的条件下具有优先结合PS的特性。
在存在和缺乏血清的条件下3SB抗体均识别完整细胞上的PS。3SB的主要反应性是针对PS的，但它也可与磷脂酸反应，磷脂酸是质膜中相对较少的组分(Hinkovska-Galcheva等，1989)。3SB基本上不与磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇以及卵磷脂和鞘磷脂反应(表4)。
PS是质膜中最丰富的阴离子磷脂，并在正常条件下在正常细胞中被紧密隔离于质膜内表面。PS是氨基磷脂。PE也是氨基磷脂，但PE是中性的，非阴离子的。除了是中性氨基磷脂之外，PE的表现与PS类似并通常紧密隔离于质膜的内表面。
PI是质膜的另一主要阴离子磷脂，它在正常条件下更紧密的隔离于正常细胞内表面。PA和PG是质膜中较少的阴离子磷脂，它们通常也隔离于内表面。CL是存在于线粒体膜中的阴离子磷脂，通常在质膜中没有。
PC和SM是质膜中含胆碱的中性磷脂。PC和SM在正常条件下均主要位于外表面。
与本发明者关于正常血管和肿瘤血管之间氨基磷脂和阴离子磷脂表达不同的模型一致，用选定方法开发的抗不有与中性磷脂PC和SM反应。1B9抗体特异于PS，而9D2、1B12和3G4以表4中所示的优先性结合阴离子磷脂和氨基磷脂。9D2抗体在实施例VI中也有描述。
实施例V
外在化的磷脂酰丝氨酸是肿瘤血管的总体标记
本实施例显示在小鼠中生长的10种不同实体瘤中每一种的内皮细胞上都存在PS的暴露，而不是局限于实施例II中所述的L540肿瘤模型中。
通过将针对PS的单克隆抗体静脉内注射入携带各种类型人或小鼠肿瘤的小鼠中来检测体内的外在化PS。抗PS抗体显示出在所有10种不同的肿瘤模型中均特异性结合血管内皮。来自同一小鼠正常器官的血管内皮则不被染色。同种型匹配的对照单克隆抗体不定位于肿瘤或正常细胞。免疫组化方法还鉴定了凋亡细胞，其中肿瘤中很少内皮细胞表达凋亡的标志。
本实施例因此显示了肿瘤中的血管内皮细胞使PS外在化，而正常血管内的内皮细胞则不会使PS外在化。大部分具有暴露的PS的肿瘤内皮细胞不是凋亡细胞。因此PS是肿瘤血管系统中丰富且易接近的标记，能用于肿瘤血管的成像和治疗。
A.L540、H358和HT29肿瘤
用于这些研究中的抗PS抗体是被称为3SB的小鼠单克隆IgM抗体(实施例IV，Rote等，1993)。3SB主要结合PS，但也与PA(一种分布类似于PS但相对较少的阴离子磷脂)有反应性。所用的抗CL抗体是被称为D11的小鼠单克隆IgM抗体(实施例IV，Rote等，1993)。
首先在三种动物肿瘤模型中检测肿瘤血管和正常血管内皮上的PS暴露：L540人Hodgkin’s淋巴瘤、NCI H358人非小细胞肺癌(NSCLC)和HT29人结肠直肠癌。为了在体内形成肿瘤，将2 x 106个细胞注射入SCID小鼠的右侧，使肿瘤长到直径0.8-1.2cm。
通过尾静脉将20μg抗PS或抗CL抗体静脉内注射入携带大肿瘤(体积大于800mm3)的小鼠。注射后1小时，麻醉小鼠并用肝素化的盐水灌注其血液循环系统。切下肿瘤和正常器官并速冻制备冷冻切片。用山羊抗小鼠IgM(μ特异性)-HRP缀合物并随后以咔唑显影来检测小鼠IgM。以40倍的放大倍数在每张切片上观察至少10个随机视野，计算阳性血管的平均百分率。
抗PS抗体在体内特异导向于所有这三种肿瘤(HT29、L540和NCI-H358)的血管系统，与用小鼠IgM检测所显示的一样。在此第一组研究中，肿瘤中被染色的血管的平均百分率对于HT29来说是80％，对于L540来说是30％，对于NCI-H358是50％。肿瘤中所有区域内的血管都被染色，并且小的毛细血管和较大的血管都被染色。
在任何正常组织中都未观察到抗PS抗体对血管的染色。在肾中，抗PS和抗CL接受者二者的小管都被染色，这与IgM通过此器官分泌有关。除了肾之外，在任何肿瘤或正常组织中都未检测到抗CL抗体。这些发现表明只有肿瘤内皮将PS暴露于质膜外侧。
B.小的和大的L540肿瘤
为了估计肿瘤血管丧失将PS隔离于膜内侧的能力的时间点，对体积在140-1600mm3之间的L540肿瘤检测抗PS的定位。
按照肿瘤的尺寸将小鼠分成3组：140-300、350-800和800-1600mm3。在携带小L540肿瘤(不超过300mm3)的三只小鼠中都未检测到抗PS抗体。抗PS抗体定位于5只携带中等大小L540肿瘤小鼠中的3只内以及携带大L540肿瘤的所有小鼠(每组4只，4只都是)内(表5)。PS阳性血管占总血管的百分率(通过泛内皮标记Meca32进行鉴定)在L540中等大小组中是10-20％，在大L540肿瘤组中是20-40％(表5)。
表5
在中等大小和大肿瘤中检测到的PS外在化
 
肿瘤大小(mm<sup>3</sup>) 阳性肿瘤数目/总数<sup>*</sup> ％PS阳性血管/总数<sup>**</sup>
350-800 3/5 10-20
850-1600 4/4 20-40
*按照肿瘤大小将携带L540Cy肿瘤的小鼠分成3组。静脉内注射20μg抗PS抗体并使其循环1小时。用抗小鼠IgM-过氧化物酶缀合物检测冷冻切片上的小鼠抗体。
**用泛内皮抗体Meca32测定血管的总数。在肿瘤的每张横切片上4个视野计数PS阳性和Meca阳性血管。表中显示了同一组中PS阳性血管的百分率范围。
C.L540、H358、HT29、Colo26、B16和3LL肿瘤
利用相同的抗PS(3SB)和抗CL(D11)抗体，通过另外三种动物肿瘤模型(总共6种)在进一步的研究中检测肿瘤血管和正常血管内皮上PS的暴露：L540人Hodgkin’s淋巴瘤、NCI H358人非小细胞肺癌(NSCLC)、HT29人结肠直肠癌、Colo26小鼠结肠癌、B16小鼠黑素瘤和3LL小鼠肺肿瘤。
在这些研究中，使肿瘤在SCID小鼠中皮下生长至体积达到0.4-0.7cm3。每组用3只或更多的小鼠。静脉内注射溶于200μl盐水中的抗PS或抗CL小鼠IgM抗体(30μg/小鼠)。30分钟后，将小鼠处死、放血并用肝素化的盐水灌注其血液循环系统。收获主要器官和肿瘤并速冻制备冷冻切片。用山羊抗小鼠IgM(μ特异性)-HRP缀合物并随后以咔唑显影检测小鼠IgM。
用针对小鼠血管泛内皮标记的单克隆抗体MECA32对肿瘤的系列切片染色。通过形态学和它们与抗小鼠IgM和MECA32一致的染色来识别PS阳性血管。由两个独立的观察者以盲法检测每张切片上至少10个随机视野(0.317mm2/视野)。计数PS染色阳性的MECA 32-阳性血管百分率。在两个独立试验中的每一个中检测每种类型的三个肿瘤。计算平均值和标准偏差(SE)。各组中，肿瘤间的总血管和PS阳性血管数目差异约为10％。
此研究中的所有6种肿瘤都包含PS阳性血管(表6)。用3SB进行的PS检测是特异的，因为用抗CL抗体未观察到肿瘤内皮的染色(表6；图1)。在除了肾(在抗PS和抗CL接受者二者中均有小管染色，反映了IgM的分泌通过此器官)以外的正常器官中未观察到抗PS或抗CL抗体的血管定位。
表6
抗PS抗体对肿瘤血管的特异定位
 
组织 抗PS<sup>*</sup> 抗CL
L540肿瘤 19.3±3.3 0
H358肿瘤 15.6±4.1 0
HT29肿瘤 4.2±1.6 0
B16肿瘤 40.6±5.4 0
3LL肿瘤 5.3±3.7 0
Colo26肿瘤 12.4±2.4 0
肾上腺 0 0
脑 0 0
心脏 0 0
肾 0<sup>**</sup> 0<sup>**</sup>
肠 0 0
肝 0 0
肺 0 0
胰腺 0 0
脾 0 0
睾丸 0 0
*结果表示为每0.317mm2的视野中MECA32染色血管中PS阳性血管的平均(±SE)百分率。分析每种类型的6个肿瘤。对于L540、H358、HT29、B16、3LL和Colo26肿瘤来说，每0.317mm2的视野中MECA32阳性血管的平均数目分别是25、21、17、18、27和22±10％血管。
**在抗PS和抗CL接受者中都可见无抗原特异性的小管染色。
在这些研究中，PS阳性血管的百分率变动范围是从Colo26肿瘤中的10％至B16肿瘤中的40％。抗PS IgM存在于肿瘤所有区域毛细血管和小静脉内腔表面。PS阳性血管看起来在坏死区内和周围特别普遍。阳性血管通常未显示出形态异常，这在光学显微镜下是显而易见的。定位于坏死区的偶发血管显示出衰退的形态学迹象。抗PS抗体(但不是抗CL抗体)也定位于坏死的和凋亡的肿瘤细胞。
这些对照研究证明了PS一致地暴露于各种肿瘤的血管内皮内腔表面，但在正常组织中不会如此，且肿瘤血管系统表达不是模型特异性的。
D.大部分PS阳性肿瘤血管不是凋亡性的
用双标记技术鉴定肿瘤切片中的凋亡内皮细胞。用泛内皮细胞标记MECA32鉴定内皮细胞。用两种独立的标记通过免疫组化方式鉴定凋亡细胞：鉴定垂死细胞中胞质变化的活性形式caspase-3(Krajewska等，1992)和鉴定具有核变化的细胞的片段化DNA(Gavrieli等，1992)。
通过兔抗caspase-3特异性抗体(R&D，Minneapolis，MN)并随后与缀合了碱性磷酸酶的抗兔IgG(AP，Pierce，Rockford，IL)一起保温来检测活性caspase-3。以抗毛地黄毒苷-碱性磷酸酶缀合物作为检测药剂通过隧道检测法(ApopTagTM药剂盒，Oncor，MD)分析其它的肿瘤切片。用凋亡标记(粉色)和内皮细胞标记MECA32(褐色)对切片双染色。如果内皮细胞和凋亡细胞的标记一致，则两种颜色在同一细胞上都清晰可见。
在6种类型肿瘤中有5种(HT29、H358、B16、Colo26、L540)的内皮细胞不展示任何一种凋亡标记(表7)。第六种肿瘤3LL展示了定位于坏死区内的一些凋亡内皮细胞。相反，在所有类型肿瘤中凋亡的恶性细胞是常见的。凋亡肿瘤细胞的百分率是从L540肿瘤中的1-2％到3LL肿瘤中的12.6-19.6％的范围。
表7
肿瘤中凋亡标记的表达
Figure C03816751D01991
*在每张切片的10个高倍视野下测定caspase3阳性或Tunel阳性的肿瘤细胞或肿瘤血管百分率。沿着从边缘通过肿瘤中心的两个垂直方向随机选择视野。表中显示了来自6只小鼠的肿瘤中阳性细胞或血管的平均(±SE)百分率。
**3LL肿瘤坏死区中的偶发血管(大于100条中有1条)展示了两种凋亡标记。
E.MDA-MB-231和Meth A肿瘤
还在小鼠内生长的MDA-MB-231人乳癌和皮下生长的小鼠Meth A纤维肉瘤内检测肿瘤血管内皮上的PS暴露。这些研究中所用的抗体是9D2抗体，按实施例IV中所述产生，它对阴离子磷脂有反应性。
如实施例VI中所述，9D2定位于以下肿瘤的肿瘤血管：L540、NCI-H358和B16肿瘤，以及同位生长于SCID小鼠乳房脂垫中的MDA-MB-231模型以及皮下生长的MethA纤维肉瘤。9D2定位于所有5种肿瘤的肿瘤血管。肿瘤中的血管内皮显示出独特的膜染色。9D2抗体还定位于坏死肿瘤细胞和凋亡肿瘤细胞的膜和胞质上。在被检测的10种正常器官中的9种内未观察到9D2抗体的血管定位，在肾中观察到小管的非特异染色。
还进行了双染色研究，其中用生物素化的9D2抗体静脉内注射携带同位MDA-MB-231乳房肿瘤的小鼠，稍后用FITC缀合的MECA32对冷冻切片染色(实施例VI)。约40％MECA32阳性血管可结合9D2。
F.MD-MBA-435肿瘤
在进一步的乳癌模型中，在小鼠内生长的MDA-MB-435人乳癌细胞中检测肿瘤血管内皮上的PS暴露。用于这些研究中的抗体是嵌合形式的3G4抗体(ch3G4)。3G4抗体的产生如实施例IV所述，而嵌合3G4抗体的生产则详见实施例XIX。ch3G4对MDA-MB-435模型中肿瘤血管内皮的定位更详述于实施例XIX中并如图22中所示。
简而言之，用MDA-MB-435s细胞建立肿瘤，并施用生物素化形式的嵌合3G4抗体和无关特异性的对照IgG。肿瘤切片用Cy3-缀合的链霉亲和素染色来检测生物素化的蛋白质。用MECA32抗体及随后加入的FITC标记抗大鼠IgG二抗进行双染色以检测血管内皮。此检测方法用红色和绿色标记生物素化的蛋白质和血管内皮，所以在会聚的图像中结合在内皮上的生物素化蛋白质呈现黄色(图22)。此研究显示嵌合3G4抗体对肿瘤血管内皮有特异性定位。
G.RIP-标志肿瘤
对于第十种模型，在多阶段癌发生的“RIP-标志”转基因小鼠模型(RIP1-标志2)中检测肿瘤血管内皮上的PS暴露。在此转基因小鼠模型中，由于SV40T抗原(标志)癌基因在产生胰岛素的β细胞中的表达，每只小鼠在12-14周龄前发生胰腺的胰岛肿瘤。肿瘤分多阶段自过度增殖的胰岛发展，且需要有血管发生的开关从而发展成恶性。基质金属蛋白酶-9调控血管发生开关(REF)。
与UCSF病理系教授Donald McDonald博士合作在RIP1-标志2模型中进行9D2定位研究。当所有小鼠都具有小的、高度血管化的实体瘤时，将9D2静脉内注射入10周龄以上大的RIP1-标志2小鼠。进行厚肿瘤切片(80μm)的双染色来鉴别肿瘤和正常胰腺中的定位9D2和CD31。胰腺肿瘤中约50％的血管(CD31阳性)具有已定位的9D2，而正常胰岛中的血管则未被染色。用对照大鼠IgM注射的小鼠具有弱的且不频繁的肿瘤血管染色。9D2和对照大鼠IgM向内皮外的血管外组织的某些渗漏也是明显的。
本实施例因此证实了肿瘤中的血管内皮细胞使PS和阴离子磷脂外在化至其内腔表面，在此它们能被体内的抗PS抗体结合。在正常组织中血管内皮细胞外表面无PS，表明识别PS的抗体、膜联蛋白V和其它配体可用于投递细胞毒性药物、凝血剂和放射性核素以供实体瘤中血管的选择性成像或破坏。
在极大程度上，PS阳性肿瘤内皮看起来在此研究所用的肿瘤中是有活力的。它没有呈现出凋亡的标记，在形态上是完整的且代谢活跃，正如其中VCAM-1、E-选择蛋白和其它快速转换蛋白的表达所显示的。尽管经常被认为是凋亡的指示特征，PS的暴露还在几种类型的存活细胞中观察到，包括恶性细胞(Rao等，1992)、(Utsugi等，1991)活化的血小板(Rote等，1993)以及在迁移、基质入侵和融合各阶段的胚胎营养细胞(Adler等，1995)。
在去除凋亡原刺激物后恢复PS不对称性且正常生长的凋亡前B淋巴瘤细胞上也显示出PS的暴露与细胞死亡命运之间无相关性(Hammill等，1999)。在正常存活细胞中，通过诸如配体-受体相互作用等诱导Ca2+流入细胞的表面活动可能引发PS暴露(Dillon等，2000)。Ca2+流激活了变频酶(Zhao等，1998)，并同时抑制了氨基磷脂转位酶(Comfurius等，1990)。
由于以下几个原因，肿瘤血管上的PS作为癌症摄像或治疗的靶目标来说是引入注目的：它很丰富(约3 x 106个分子/个细胞)；位于肿瘤内皮的内腔表面，对于血液中血管靶向剂的结合来说是完全易接近的；它存在于多种实体瘤中高百分率的肿瘤内皮细胞上，而在迄今所检测的所有正常组织的内皮上都没有。因此针对肿瘤血管系统中的PS的未缀合抗体、血管靶向剂和成像剂能用于人类中癌症的检测和治疗。
实施例VI
阴离子磷脂暴露于肿瘤血管的表面
正常条件下哺乳动物细胞质膜外表面基本上没有阴离子磷脂。磷脂酰丝氨酸在例如细胞表面的暴露是在凋亡、坏死、细胞损伤、细胞活化和恶性转化期间发生的。本实施例显示出体内肿瘤血管上阴离子磷脂上调，这通过结合阴离子磷脂的特异性抗体和天然配体二者的定位得到证实。
将特异性识别阴离子磷脂的单克隆抗体9D2注射入携带多种同位或异位肿瘤的小鼠中。其它小鼠接受可结合阴离子磷脂的天然配体膜联蛋白V。9D2和膜联蛋白V特异性地定位于所有肿瘤的血管内皮上，还定位于坏死区内和周围的肿瘤细胞处。肿瘤血管中15-40％的内皮细胞被染色。在正常内皮上未检测到定位。
根据9D2和膜联蛋白V的结合进行评估的，检测已知存在于肿瘤微环境中的各种因子和肿瘤相关状态引起培养内皮细胞中阴离子磷脂暴露的能力。低氧/复氧、酸性、凝血酶和炎性细胞因子都诱导了阴离子磷脂的暴露。过氧化物酶也是一种强诱导剂。用炎性细胞因子和低氧/复氧的组合处理效果大于加成作用。因此，已证实的体内肿瘤内皮上阴离子磷脂的暴露有可能是通过损伤以及细胞因子和反应性氧类的活化引起的。无论是何机制，阴离子磷脂都是目前能用于肿瘤血管靶向、成像和治疗中的肿瘤血管标记。
A.材料和方法
1.材料
Na125I获自Amersham(Arlington Heights，IL)。Dulbecco’s改良型Eagle’s组织培养基和含Ca2+和Mg2+的Dulbecco PBS获自Gibco(Grand Island，纽约)。胎牛血清获自Hyclone(Logan，Utah)。L-α-磷脂酰丝氨酸、L-α-卵磷脂、心磷脂、L-α-磷脂酰乙醇胺、L-α-磷脂酰肌醇、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、O-苯二胺、过氧化氢和凝血酶获自Sigma(St.Louis，MO)。24孔平底板获自Falcon(Becton Dickinson和Co.，Lincoln Park，NJ)。
重组肝细胞生长因子(HGF或扩散因子)和放线菌素D来自Calbiochem(San Diego，CA)。重组小鼠白介素-1α、β和肿瘤坏死因子α(TNFα)购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。I型通用干扰素(取代所有类型干扰素的杂合蛋白质)购自PBL BiomedicalLaboratories(New Brunswick，NJ)。重组人血管内皮生长因子121(VEGF)、人血小板衍生生长因子-BB、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)和人成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)购自PeproTech(Rocky Hill，NJ)。
2.抗体
泛小鼠内皮细胞抗体MECA32获自E.Butcher(斯坦福大学，加州)并用作免疫组化研究的阳性对照。有关此抗体的详情已发表(Leppink等，1989)。与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的兔抗大鼠免疫球蛋白、大鼠抗小鼠免疫球蛋白以及山羊抗小鼠和抗大鼠二抗购自Daco(Carpinteria，CA)或Jackson Immunoresearch Labs(West Grove，PA)。
这些研究中所用的9D2抗体按实施例IV所述产生。9D2抗体是与阴离子磷脂有反应性的大鼠单克隆抗体。9D2的磷脂特异性的进一步表征参见此实施例的结果部分。
3.细胞
来自末期疾病患者的L540Cy Hodgkin淋巴瘤细胞由V.Diehl教授(Koln，德国)提供。NCI-H358人非小细胞肺癌由AdiGazdar博士(西南医学中心，达拉斯，德州)提供。Meth A小鼠纤维肉瘤和MDA-MB-231人乳癌获自美国典型细胞保藏中心(Rockville，MD)。小鼠脑内皮瘤细胞系bEnd.3由Werner Risau教授提供(Max Plank研究所，Munich，德国)并保持于含10％FBS的DMEM中。成年牛主动脉内皮(ABAE)细胞购自Clonetics(San Diego，加州；Walkerville，MD)。ABAE细胞保持于含10％血清和2ng/ml bFGF的DMEM中。
4.组织培养
bEnd.3、ABAE细胞和除L540Cy淋巴瘤之外的所有肿瘤细胞均保持于补充了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、2单位/ml青霉素G和2μg/ml链霉素的DMEM中。L540Cy细胞保持于含相同添加剂的RPMI1640中。细胞每周传代培养一次。用溶于含0.2％EDTA的PBS中的0.125％胰蛋白酶进行bEnd.3细胞的胰酶消化。为了进行体外研究，以10 x 103个细胞/ml的密度将内皮细胞接种于24孔板内的1ml培养基中，并在用于本试验前保温48-96小时。每次研究前24小时更换培养基。
5.与塑料固定化的磷脂的反应性
将磷脂溶于正己烷中至浓度为50μg/ml。将100μl此溶液加入96孔微量滴定板的孔内。待溶剂在空气中蒸发后，用稀释于含2mM Ca2+的DPBS(结合缓冲液)中的10％胎牛血清封闭平板2小时。
将9D2抗体或膜联蛋白V以6.7nM的起始浓度稀释于含10％血清的结合缓冲液中。在平板中配制两倍的系列稀释液(100μl/孔)。然后将平板在室温保温2小时。漂洗平板并分别用与HRP缀合的山羊抗大鼠IgM和兔抗人膜联蛋白V以及随后的与HRP缀合的山羊抗兔IgG(均为1:1000稀释)检测9D2和膜联蛋白V。用生色底物OPD检测二级药剂，然后用微量平板读数仪(Molecular Devices，Palo Alto，CA)在490nm处对平板读数。
用无关特异性的对照大鼠IgM(Pharmingen，San Diego，CA)证实了9D2抗体结合的特异性。膜联蛋白V结合磷脂的特异性是Ca2+依赖型的，通过将药剂稀释于含5mM EDTA的DPBS中对其进行测定。另外的阴性对照是用含0.2％去污剂吐温20的结合缓冲液漂洗平板。此处理将脂抽提出来，因此去除了吸附于塑料上的磷脂。9D2抗体和膜联蛋白V都不结合经去污剂漂洗过的平板。
6.培养内皮细胞表面上的阴离子磷脂的检测
将内皮细胞培养至约70％汇合。为了诱导PS暴露，在37℃用H2O2(200μM)处理细胞1小时。用含Ca2+和Mg2+的DPBS漂洗对照和处理过的载片，并用稀释于相同缓冲液中的0.25％戊二醛固定。通过与50mM NH4Cl保温5分钟淬灭过量的醛基。为了检查去污剂和有机溶剂对磷脂检测的影响，将一些载片与丙酮(5分钟)或含1％(v/v)TritonTMX-100的PBS一起预保温。
细胞用DPBS(含Ca2+、Mg2+和0.2％(w/v)明胶)漂洗并与1μg/ml生物素化膜联蛋白V(Pharmingen，San Diego，CA)或1μg/ml9D2抗体保温。保温2小时后，用0.2％明胶缓冲液漂洗细胞并与链霉亲和素-HRP(1:500稀释)保温。无关特异性的大鼠I gM和链霉亲和素单独使用作为这些试验中的阴性对照。所有步骤都在室温进行。加入溶于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH5.5中的邻苯二胺(0.5mg/ml)和过氧化氢(0.03％w/v)检测HRP的活性。15分钟后，将100μl上清液转移至96孔板中，加入100μl0.18MH2SO4并检测490nm处的吸收值。或者，通过加入咔唑底物，产生不溶性红褐色沉淀来检测PS阳性细胞。每个试验都以双份试样进行并重复至少两次。
7.通过脂质体抑制9D2和膜联蛋白V与磷脂的结合
通过用各种脂质体进行的竞争性试验进一步证实了磷脂识别的特异性。脂质体是从氯仿中含5mg单一磷脂的溶液制备的。将溶液在氮气中干燥，使其在圆底玻璃瓶中形成薄层。然后加入10ml Tris缓冲液(0.1M，pH7.4)并将摇瓶超声处理5次，每次2分钟。将9D2或膜联蛋白V(6.66nM)与200μg/ml脂质体溶液室温预保温1小时。将混合物加入经磷脂包被的平板或内皮细胞单层上。如上所述测定在存在或缺乏不同脂质体的条件下9D2结合固定化磷脂或细胞表面的能力。
8.9D2和膜联蛋白V对固定化PS结合的竞争
通过将纯化蛋白质与10倍摩尔浓度过量的N-羟基琥珀酰亚胺生物素(Sigma，MO)在室温保温1小时来制备生物素化9D2抗体和膜联蛋白V。用PBS透析除去游离的生物素。生物素化的步骤不会削弱任一蛋白质的PS结合能力。为了进行竞争性试验，将未修饰的和生物素化的蛋白质与10倍摩尔浓度过量的未修饰蛋白质预混合。然后将混合物加到PS包被平板上。用1:1000稀释的链霉亲和素-HRP缀合物检测所结合的药剂。在无竞争剂的条件下各药剂与PS的结合值作为100％。
9.皮下移植肿瘤的生长
为了进行定位研究，将2 x 107个L540人Hodgkin’s淋巴瘤细胞或1 x 107个其它肿瘤类型细胞皮下注射入SCID小鼠(Charles River，Wilmington，MA)的右侧。使肿瘤长至体积0.4-0.7cm3。每组最少用3只动物。研究重复至少3次。
10.人MDA-MB-231乳癌的同位模型
雌性nu/nu或SCID小鼠购自Charles River。按照所公布的方法(Price，1996)将MDA-MB-231人乳腺癌细胞移植入乳房脂垫中。简而言之，将小鼠麻醉并在侧面胸腔上方皮肤处做一5mm的切口。使乳房垫暴露以保证重悬于0.1ml盐水中的1 x 107个MDA-MB-231细胞注射的位点正确。
11.患肿瘤小鼠体内阴离子磷脂的检测
将9D2或膜联蛋白V直接施加到冷冻组织切片上的免疫组化技术不能区别质膜内表面和外表面上的阴离子磷脂。为了检测外部定位的磷脂，基本上如前文所述进行操作(实施例V；Ran等，1998)，将50μg9D2或生物素化9D2抗体或100μg生物素化膜联蛋白V静脉内注射入患肿瘤的SCID小鼠。60分钟后，如前文所述(Burrows等，1992)，处死小鼠并将其血放干，用肝素化的盐水灌注。收获所有主要器官和肿瘤并速冻以制备冷冻切片。
用含10％血清的PBS封闭切片。为了防止磷脂在载片处理过程中丢失，在封闭和漂洗缓冲液中避免使用去污剂和有机溶剂。用山羊抗大鼠IgM(μ特异性)-HRP缀合物及随后用咔唑或DAB显影来检测大鼠IgM(Fries等，1993)。用与HRP缀合的链霉亲和素检测生物素化的药剂。
将来自注射了盐水或无关特异性大鼠IgM的小鼠的肿瘤切片作为阴性对照。另外的对照包括将载片在1％Triton溶液或丙酮中保温10分钟。这些处理将磷脂抽提出来。在这些条件下检测不到信号。以100X的放大倍数测定每个高倍视野中阳性血管的数目。每张切片上至少检查10个视野并计算阳性血管的平均百分率。用此方法对切片进行染色以分析9D2或膜联蛋白V存在情况的研究检测到具有体内药剂易靠近结合的外在化阴离子磷脂的细胞。
12.PS阳性肿瘤血管的鉴别和定量
具有定位化9D2抗体或膜联蛋白V的结构通过DAB染色切片上的形态学外观和冷冻组织连续切片上泛内皮细胞标记MECA32的一致染色被确认为血管。通过对肿瘤连续切片中被MECA32、9D2或膜联蛋白V染色的血管计数，进行DAB染色切片的定量。检查由注射了9D2抗体、对照大鼠IgM或膜联蛋白V的6只小鼠来源的各肿瘤类型的6张切片。由两个独立的观察者以盲法对每张切片上至少10个随机视野(0.317mm2/视野)进行评分。计算被9D2、膜联蛋白V或MECA32染色的血管的平均数目和标准偏差。将各肿瘤类型组中测定的9D2或膜联蛋白V阳性血管的平均数目与同一肿瘤组中MECA32阳性血管的平均数目进行比较。计算9D2或膜联蛋白V阳性血管的百分率。
在进一步的研究中，将50μg生物素化9D2、对照IgM或膜联蛋白V(每组6只小鼠)静脉内注射入患MDA-MB-231肿瘤(体积0.3-0.7cm3)的SCID小鼠中。生物素化的药剂首先与链霉亲和素-Cys缀合物一起保温，在PBS中漂洗，然后与MECA32抗体保温，再与FITC标记的抗大鼠IgG二抗保温。分别用针对Cy3(红色)和FITC(绿色)荧光的适当滤镜通过数码相机捕捉单一的图像并传输到计算机上。通过Metaview软件将表现为黄色(融合了绿色和红色荧光的结果)10个随机视野(0.317mm2/视野)的图像叠加。用同样的方法分析来自注射了对照大鼠I gM或盐水的小鼠的肿瘤。如下计算具有定位化9D2或膜联蛋白V的血管的百分率：用每个视野中黄色血管的平均数目除以绿色(总)血管的平均数再乘以100。
B.结果
1.9D2抗体和膜联蛋白V的磷脂特异性
在ELISA中，9D2抗体特异性识别阴离子磷脂(PS、PA、CL、PI、PG)，而对中性磷脂(PE、PC和SM)无显著的反应性(图2A；表8)。在ELISA中9D2与磷脂结合的强度顺序是PA>PS＝CL>PG＝PI。结合是抗原特异性的，因为用几个无关特异性大鼠IgM对照未观察到结合。9D2与吸附于ELISA平板上的任何阴离子磷脂的结合都会被由任何阴离子磷脂制备的脂质体封闭，但不会被由任何中性磷脂制备的脂质体所封闭。
表8
9D2和膜联蛋白V的磷脂特异性
Figure C03816751D02081
a总磷脂的百分数，来自Fridrikkson等，1999。不同细胞类型间百分数可能有变化。
膜联蛋白V也与阴离子磷脂结合，但它的结合特异性小于9D2与阴离子磷脂结合的特异性，因为它也与中性磷脂PE强结合。在ELISA中膜联蛋白V与磷脂结合的强度顺序是PI>PS＝PE＝PA＝CL>PG(表8)。这些有关膜联蛋白V的发现与较早的资料是一致的(Andree等，1990)。
9D2的结合不受5mM EDTA存在的影响，表明它与阴离子磷脂的结合不需要Ca2+。相反，5mM EDTA存在时会消除膜联蛋白V与阴离子磷脂的结合，正如由它与阴离子磷脂或PE的结合依赖于Ca2+这一已有知识可预计到的(Schlaepfer等，1987；Blackwood和Ernst，1990)。
9D2或膜联蛋白V都不与包被了磷脂、但随后用含0.2％Tween的盐水漂洗过的ELISA平板结合，证实了它们是结合于所吸附的磷脂上。9D2和膜联蛋白V没有可检测到的与肝素、硫酸乙酰肝素或者双链或单链DNA的结合。
2.9D2抗体和膜联蛋白V不会交叉阻断彼此与PS的结合
为了检查9D2抗体和膜联蛋白V是否竞争结合PS，在PS包被平板上用生物素化的蛋白质进行交叉封闭研究。生物素化的9D2抗体和膜联蛋白V分别被10倍摩尔浓度过量的未修饰9D2和膜联蛋白V封闭(表9)。然而，未修饰的膜联蛋白V不会影响生物素化9D2与PS平板结合的能力。同样的，添加未修饰的9D2抗体也不会改变生物素化膜联蛋白V结合PS平板的能力(表9)。
表9
9D2和膜联蛋白V不会交叉阻断与PS的结合
 
PS结合蛋白质 竞争剂<sup>a</sup> 结合(％对照)<sup>b</sup>
生物素化膜联蛋白V 膜联蛋白V 8％
生物素化9D2 膜联蛋白V 93％
生物素化膜联蛋白V 9D2 95％
生物素化9D2 9D2 5％
a将膜联蛋白V或9D2抗体以比生物素化的药剂10倍摩尔浓度过量的量预混合。用链霉亲和素-HRP检测微量滴定板上生物素化药剂与PS的结合。
b将缺乏竞争剂的条件下生物素化药剂的反应性作为100％。表中显示了三份试样测定的平均值。SD小于平均值的10％。
这些结果表明，9D2抗体和膜联蛋白V不会交叉阻断彼此与PS包被平板的结合，这是因为它们或者识别PS分子上的不同表位，或者识别塑料上所吸附PS的不同构象。
3.与细胞表面上的外在化阴离子磷脂的结合
用小鼠bEnd.3内皮细胞或牛ABAE细胞检测9D2抗体和膜联蛋白V与细胞表面的结合。9D2或膜联蛋白V都不结合静止条件下任一细胞类型的未透化单层。这表明大部分质膜阴离子磷脂通常隐蔽于胞质结构域内。相反，当细胞在引起90-100％内皮细胞凋亡的条件下与TNFα和放线菌素D预保温时，观察到强染色。
为了证实9D2和膜联蛋白V结合于细胞表面上的磷脂，在存在或缺乏各种竞争性脂质体的条件下将经H2O2处理过的bEnd.3细胞与9D2抗体或膜联蛋白V一起保温。在细胞用低于毒性浓度(100-200μM)的H2O2预处理后，阴离子磷脂在未凋亡的存活bEnd.3细胞上变得暴露(Ran等，2002)。
9D2抗体与经H2O2处理过的bEnd.3细胞的结合被含阴离子磷脂的脂质体所抑制，但不被含中性磷脂的脂质体抑制(图3)。对9D2与细胞的结合发生抑制的幅度变化顺序为PA>PS>CL>PG>PI，与利用塑料固定化磷脂所获得的结果接近一致(图2A和图2B)。类似的，膜联蛋白V与经H2O2的处理过的细胞的结合被含PS、PA、PE、CL和PI及PG的脂质体阻断，后两者的阻断程度较低一些。含SM或PC的脂质体不会阻断膜联蛋白V与细胞的结合，所有这些均与利用塑料固定化的磷脂获得的结果一致。
这些结果证实了9D2与经H2O2处理过的内皮细胞中的阴离子磷脂相结合，而膜联蛋白除了阴离子磷脂外还与PE结合。
4.体内细胞上外在化阴离子磷脂的检测
将9D2或膜联蛋白V直接施加到冷冻组织切片上的直接免疫组化技术不能区别质膜内表面和外表面的阴离子磷脂。为了检测外部定位的磷脂，将9D2和膜联蛋白V静脉内注射入患肿瘤的小鼠并通过间接的免疫组化方法测定它们对肿瘤血管的定位。
用9D2抗体或生物素化膜联蛋白V静脉内注射带各种类型实体瘤的小鼠，1小时后，给小鼠放血，切下肿瘤和正常组织并制备冷冻切片。将冷冻组织块切片并用被HRP标记的抗大鼠IgM或被HRP标记的链霉亲和素进行染色，以确定9D2和膜联蛋白V在注射后结合到哪些细胞上。在连续切片上通过形态学和泛内皮细胞抗体MECA 32的阳性染色对血管进行鉴定。
5.携带肿瘤的小鼠中9D2抗体和膜联蛋白V的生物分布
在此研究所包括的所有5种肿瘤中9D2抗体和膜联蛋白V都定位于肿瘤血管处(图4；表10)。这些肿瘤是：SCID小鼠乳房脂垫中原位生长的人MDA-MB-231乳房肿瘤；皮下生长的人L540 Hodgkin’s肿瘤；皮下生长的人NCI-H358NSCLC；皮下生长的小鼠B16黑素瘤和皮下生长的小鼠Meth A纤维肉瘤。
表10
9D2和膜联蛋白V对肿瘤血管的特异性定位
 
组织 9D2抗体<sup>a</sup> 大鼠IgM对照 膜联蛋白V<sup>b</sup>
肿瘤
MDA-MB-231L540cyNCI-H358B16Meth A 40.6±5.419.3±3.315.6±4.123.4±4.525.7±6.8 ----- 45.3±5.616.7±3.9ND21.3±6.6ND
正常
肾上腺脑心脏肾肠肝肺胰腺脾睾丸 ----<sup>c</sup>------- ----<sup>c</sup>------- -----------
a通过注射抗体(50μg)、用盐水灌注小鼠的血循环系统并用抗小鼠IgM-过氧化物酶缀合物检测组织切片上的抗体来测定患肿瘤小鼠中9D2抗体和大鼠IgM对照的定位。结果表示为每个0.317mm2的视野内MECA32-染色血管的PS阳性血管平均(±SE)百分数。每种类型分析6个样品。对于MDA-MB-231、L540cy、H358、B16和Meth A肿瘤来说，每个0.317mm2的视野内MECA 32-阳性血管的平均数分别为23、25、21、18和19±10个血管。
b通过注射生物素化膜联蛋白V随后用链霉亲和素-过氧化物酶缀合物检测冰冻切片来测定膜联蛋白V的定位。
c在9D2和对照抗体接受者中都可见非抗原特异性小管染色。
9D2和膜联蛋白V基本上有相同的染色模式。9D2抗体对肿瘤血管的定位是特异的，因为用无关特异性的大鼠IgM未观察到肿瘤内皮的染色。推测起来，大概是发生了某种程度的对照大鼠IgM从肿瘤血管中向外的渗漏，但血管外IgM的染色太分散或太弱以致不能被间接的免疫组化方法所辨别。
在被检测的10种正常器官中有9种未观察到9D2抗体或膜联蛋白V的血管定位(表10)。在肾中，观察到了非抗原特异性的小管染色。小管在9D2和对照大鼠IgM接受者中都被染色，大概是因为IgM或其代谢物通过此器官分泌。生理学上的血管发生部位卵巢则未检测。
9D2和膜联蛋白V阳性血管的百分数包括从MDA-MB-231肿瘤中的40％至H358肿瘤中的15％。阴离子磷脂阳性血管存在于肿瘤所有区域内毛细管和血管的内腔表面，但在坏死区内和周围尤其普遍。大部分阴离子磷脂阳性血管未显示出光学显微镜下明显的形态异常。偶发的血管，尤其是那些定位于坏死区的血管显示出形态退化的迹象。9D2抗体和膜联蛋白V也定位于坏死的和凋亡的肿瘤细胞处，而对照IgM的定位则检测不到(图4)。
这些发现证实了阴离子磷脂存在于各种肿瘤血管内皮细胞内腔表面但不存在于正常组织中。
6.双染色研究
还进行了双染色研究，其中将生物素化9D2抗体、生物素化对照IgM或生物素化膜联蛋白V静脉内注射入带同位MDA-MB-231乳腺肿瘤的小鼠。1小时后，处死小鼠，切下肿瘤并对冷冻块进行切片。然后用Cy3-缀合的链霉亲和素染色肿瘤切片来检测生物素化的蛋白质以及用FITC缀合的MECA32染色来检测血管内皮。此检测方法用红色和绿色标记了生物素化蛋白质和血管内皮。其中生物素化蛋白质与内皮结合，合并的图像呈现出黄色。
在这些研究中，生物素化9D2和膜联蛋白V似乎大部分与血管内皮结合，因为它们的染色模式与MECA 32的模式合并在一起。约40％的MECA 32阳性血管结合9D2和膜联蛋白V，与用间接免疫组化方法获得的结果接近一致。不过，通过双染色检测到了生物素化蛋白质向肿瘤间质组织内的渗漏，而用间接免疫组化方法则不明显。
在少数(约5％)血管周围的血管内皮外可见生物素化的蛋白质。在来自注射了生物素化无关特异性大鼠IgM的小鼠的肿瘤中，生物素化IgM已渗漏入相似百分数(约5％)血管周围的肿瘤间质组织中，但通常未呈现出被血管内皮结合。推测起来，用双染色技术可以检测溢出的9D2和膜联蛋白V，但用间接的免疫组化技术则不可以，反映了前一种技术具有较高的灵敏度且更准确，从而可用于比较两种染色模式。未注射的对照肿瘤完全不被链霉亲和素-Cy3所染色，表明红色荧光相应于被定位的蛋白质。
实施例VII
肿瘤环境中阴离子磷脂膜的移位
有关氨基磷脂和阴离子磷脂作为肿瘤血管内皮细胞独特的体内表面标记的发现促使发明者进一步研究肿瘤微环境对这些分子移位和外膜表达的影响。本实施例显示了将体外内皮细胞暴露于模拟肿瘤微环境的一定条件中再现了较早观察到的氨基磷脂和阴离子磷脂在完整、存活细胞中的表面表达。
A.材料和方法
1.膜联蛋白V的碘化
从ET12a-P阴离子磷脂1质粒(获自J.Tait博士，华盛顿大学，西雅图)转化的大肠杆菌纯化重组人膜联蛋白V。分别在SDS-PAGE上和PS包被的塑料板上验证蛋白质的纯度和与PS的结合。用亲和纯化的兔多克隆抗膜联蛋白V抗体检测与PS结合的膜联蛋白V。如Bocci(1964)所述用氯胺T对膜联蛋白V进行125I放射标记。根据Bradford检测法(1976)所检测的，比活性约为1 x 106cpm/μg蛋白质。
2.内皮细胞的处理
用表11所列浓度的细胞因子或生长因子处理内皮细胞。所有试剂都稀释于含10％血清的培养基中，并在37℃与细胞一起保温24小时。
为了研究低氧的作用，将细胞接种于24孔板中并在潮湿的含氧量正常的空气(21％O2，5％CO2)中保温48小时，然后转移至在一密封舱(Billups Rothenberg Inc.，Del Mar，Ca)中潮湿且含氧量低的空气(1％O2，5％CO2，94％N2)中。将细胞在低氧舱中37℃保温24小时，然后转回到含氧量正常的环境中，37℃ 4小时。将此细胞与相同代数的同一天接种且完全保持于含氧量正常条件下的平行培养物进行比较。在某些研究中，在转移到低氧舱中之前将IL-1α(10ng/ml)和TNFα(20ng/ml)加入培养基中。
为了检测酸性微环境的影响，将细胞暴露于缺乏碳酸氢盐的生长培养基中，用必需量的HCl调节成不同的pH(在7.3和6.2之间变动)。在缺乏CO2的条件下37℃保温细胞。确认培养基在24小时的培养期间保持给定的pH值。这些实验条件对牛或小鼠内皮细胞是无毒的，且对贴壁单层的细胞形态或生存能力是没有影响的。
3.用125I-标记的膜联蛋白V检测人工培养内皮细胞上的PS
用上述药剂处理后，将处理过的细胞和对照细胞与结合缓冲液中的7.1pmol125I-标记的膜联蛋白V(200μl/孔)一起保温。室温保温2小时后，细胞经大量漂洗后溶于0.5M NaOH中。将总体积0.5ml转移至塑料管中并在γ计数器中计数。在存在5mM EDTA的条件下测定非特异性结合并从实验值中将其减去。结果表示为细胞结合型膜联蛋白V的净pmol值，标准化为每1 x 106个细胞中的值。
在以放线菌素D和TNFα(各组分50ng/ml)同时处理的细胞上测定膜联蛋白V的最大结合。正如事先已报道的(Lucas等，1998)，这些药剂在90-100％的内皮细胞中引起凋亡和PS暴露。在含10％血清的培养基中测定125I-膜联蛋白V与未处理细胞的基础结合。将与未处理培养物结合的125I-膜联蛋白V的量从处理过的培养物的结合值中减去。按照以下公式计算PS的暴露：用实验条件下的细胞结合型膜联蛋白V的量(pmoles)除以最大膜联蛋白V结合量(pmoles)，乘以100。每一项研究都以双份试样进行并至少重复3次。计算平均值。从这些独立实验所得平均值的SE小于5％。
B.结果
1.用H2O2诱导
以50000个细胞/孔的起始密度接种小鼠bEnd.3内皮细胞。24小时后将细胞与渐增浓度(从10μM至500μM)的H2O2在37℃一起保温保温1小时或者不对其进行处理。在结束保温后，用含0.2％明胶的PBS漂洗细胞3次并用0.25％戊二醛固定。同样的孔用抗PS IgM染色或胰酶处理并通过Trypan Blue排斥试验评估存活力。为了进行抗PS染色，在用2％明胶封闭10分钟后，将细胞与2μg/ml抗PS抗体一起保温，随后用抗小鼠IgM-HRP缀合物进行检测。
将内皮细胞暴露于高浓度的H2O2中会在约90％细胞中引起PS移位。另一方面，这伴随着细胞从基底上脱离且细胞的存活力下降到约50-60％。表面PS表达与细胞存活力下降之间的关联是可以理解的，尽管我们仍感兴趣的注意到观察到了约90％的PS移位，而细胞存活力只下降了50-60％。
用较低浓度的H2O2导致了显著的PS表达，而细胞存活力没有任何可察觉的降低。例如，在用低达20μM的浓度的H2O2处理的所有孔中约50％细胞的表面检测到PS。值得指出的是，在这些低H2O2浓度下，细胞保持牢固的附着于塑料上以及牢固的相互结合，显示出无形态改变且没有细胞毒性的迹象。详细的分析揭示出基本上100％的细胞-细胞接触、正确细胞形状的保持和完整的细胞骨架。
因此在细胞存活力与未处理细胞对照相同(即95％)的细胞群中观察到由低水平H2O2所诱发的50％PS表面表达。与高H2O2浓度相关的PS表达伴随着细胞损伤，而暴露于高H2O2浓度的PS阳性细胞脱离下来、漂浮着并具有被破坏的细胞骨架。
在低浓度H2O2存在条件下细胞存活力的保持与来自其它实验室的结果相符。例如，Schorer等人(1985)揭示了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用15μMH2O2处理后仍保持平均90-95％的存活力(据报道有5％-10％受损)，而暴露于1500μMH2O2中的那些细胞则只有0％-50％存活(50％-100％受损)。
利用H2O2体外模拟肿瘤环境也是恰当的，因为其中肿瘤环境富含诸如巨噬细胞、PMNs和粒细胞等炎性细胞，它们产生H2O2和其它反应性氧类。尽管过去从未将其与稳定的肿瘤血管标记联系起来，现已知炎性细胞通过涉及反应性氧类且需要H2O2存在的机制介导了内皮细胞的损伤(Weiss等，1981；Yamada等，1981；Schorer等，1985)。事实上，研究已显示了PMNs的体外刺激产生的H2O2浓度足以引起致死水平以下的内皮细胞损伤，而不引起细胞死亡(用铬释放检测法检测)或细胞脱离；且这些H2O2浓度是体内局部可达到的(Schorer等，1985)。
这些体外移位结果与显示抗PS抗体特异定位于体内肿瘤血管内皮细胞而不结合正常组织细胞的已有结果有关。体内类似浓度H2O2诱导PS转移至内皮细胞表面而不会破坏细胞完整性这一发现除了证实了最初的体内结果和发明者的治疗方法外，还具有重要的含义。
已知人、牛和小鼠内皮细胞在正常条件下都是PS阴性的。任何过去证明的PS表达通常与细胞损伤和/或细胞死亡相关。这不是本研究中的情形，其中保持了正常的生存能力。这表明了肿瘤血管内皮中的PS移位是通过与细胞损伤无关的生化机制介导的。这被认为是形态完整的内皮细胞中PS表面表达的第一个证明和PS表达能与凋亡途径分离开的第一个指征。就本发明的可操作性而言，这些观察再次证实了PS是可维持的、而非瞬时的肿瘤血管标记和干预治疗的适当候选剂。
2.用凝血酶诱导
还观察到凝血酶增加了PS的表达，尽管增加的程度与H2O2引起的不同。此数据还是本发明发明者开发的PS表达的肿瘤诱导模型中完整的一部分：正常组织中凝血酶诱导的PS表面表达还将进一步诱导凝血，因为PS表达对凝血起始复合物的装配能起到协调作用。
已知肿瘤环境是血栓形成前状态的，从而使肿瘤血管倾向于凝血(美国专利5,877,289)。因为凝血酶是凝血级联反应的产物，它存在于肿瘤血管中。事实上，凝血酶的存在诱导了VCAM的表达，使发明者能将VCAM开发成为肿瘤血管的可靶向标记(美国专利5,855,866；5,877,289)。因此目前显示凝血酶还诱导了PS表达的资料与用裸抗体和治疗缀合物靶向于氨基磷脂都相关，这还进一步解释了含组织因子的抗VCAM凝血配体的有利影响(实施例I)。
3.氧化应激的其它药剂
用存在于许多肿瘤微环境中的各种浓度的因子和条件处理体外小鼠bEnd.3或牛ABAE细胞24小时(Lichtenbeld等，1996；Harris等，1996)，诸如低氧/复氧、凝血酶、酸度、炎性细胞因子和过氧化氢(表11)。
通过检测125I-膜联蛋白V的结合对PS和阴离子磷脂的外在化进行定量。将膜联蛋白V结合的量与通过放线菌素D和TNFα的组合处理诱导了90-100％的细胞凋亡的细胞中的量相比较。放线菌素D和TNFα在两种细胞类型上都诱导了每106个细胞上6.2pmol膜联蛋白V的结合(每个细胞结合3.8 x 106个分子)，与文献所报道的结果很相符(Rao等，1992)。以此数值作为外在化阴离子磷脂的最高水平。
表11
通过再造肿瘤环境诱导PS
在表11中，所用细胞因子、生长因子和凝血酶的浓度是从文献值中选择的以便对人工培养内皮细胞具有最大刺激作用。由形态学上的外观、缺乏分离和缺乏台盼蓝的摄取判断这些浓度在试验期间(24小时)不会引起毒性。所用H2O2的浓度是在选定条件下不会引起细胞毒性的最大浓度。
在只有生长培养基存在的条件下测定125I-膜联蛋白V的基本结合。在用放线菌素D和TNFα联合处理诱导凋亡后测定最大PS暴露。显示了来自三项独立研究的双份试样的平均值。标准偏差小于5％。
按照由膜联蛋白V或抗PS(9D2)抗体结合所判断的，未处理的细胞基本上无外在化的PS(表11)。对于ABAE和bEnd.3细胞来说，单独存在生长培养基条件下的基本结合分别是0.44和0.68pmols 125I-膜联蛋白V，这相当于ABAE和bEnd.3细胞最大结合的约7.1％和10.9％，与在相同条件下有约10％的细胞结合生物素化膜联蛋白V的有关发现一致。
VEGF、HGF、FGF、TGFβ1、PDGF、IL-6、IL-8和IL-10不会将125I-膜联蛋白V的结合提高至未处理细胞的基础水平之上。炎性介质(IL-1α、IL-1β、TNFα和干扰素)引起了小的但可重复的PS和阴离子磷脂移位的增加，变动范围对于ABEB细胞来说是最高水平的5-8％，对于bEnd3细胞来说是最高水平的3-14％。
低氧/复氧、凝血酶或酸性外部条件(pH6.8-6.6)诱导了中等高程度的PS和阴离子磷脂的外在化，变动范围包括对于ABEB细胞来说的最高水平的8-20％到对于bEnd3细胞来说的最高水平的17-22％。在用100-200μM过氧化氢处理后观察到PS和阴离子磷脂移位的最大增加。按照用125I-膜联蛋白V结合进行的判断，此处理引起了PS在两种细胞类型中几乎完全(95％)的外在化(表11)。按照免疫组化的判断，超过70％的ABAE和bEnd.3细胞结合生物素化的膜联蛋白V。
用低氧/复氧、凝血酶、酸性、TNFα、IL-1或H2O2处理产生了PS和阴离子磷脂移位的内皮细胞在试验期间(24小时)保持附着于基质上，维持细胞-细胞接触，并保留了它们排除台盼蓝染料的能力。在诱导因子去除或培养条件回复正常后，在24-48小时后大部分细胞细胞中恢复了正常的PS和阴离子磷脂取向。这些结果表明，通过应用H2O2直接产生或通过低氧/复氧、酸性、凝血酶或炎性细胞因子间接产生的中等氧化压力引发了PS和阴离子磷脂在存活内皮细胞上的瞬时移位。
4.炎性细胞因子和低氧/复氧的组合作用
在IL-1α或TNFα存在条件下将ABAE和bEnd.3细胞放在低氧/复氧环境中，观察到了PS和阴离子磷脂暴露的增加。在缺乏细胞因子的条件下，低氧/复氧使ABAE细胞上的PS暴露增加至用凋亡浓度的放线菌素D和TNFα处理细胞后所能达到的最高水平的15％-17.5％。在亚毒性浓度的IL-1α或TNFα存在条件下，低氧/复氧使阴离子磷脂暴露分别增加到最大值的26％和33％(图5；表11)。与不存在低氧/复氧时细胞因子的作用的比较表明，细胞因子和低氧/复氧的联合对PS暴露具有大于简单加成的影响效果。在bEnd.3细胞中观察到相似的效果。
因此，在肿瘤环境中，由低氧/复氧诱导的PS和阴离子磷脂的暴露可以通过炎性细胞因子和可能通过诸如酸性和凝血酶等这样的其它刺激物所放大。
这些体外研究显示了体内肿瘤内皮细胞上PS暴露的机制。它们表明了多种因子诱导了内皮细胞上PS暴露而不引起细胞毒性，它们摹拟了体内肿瘤中的条件。低氧随后复氧、酸性和凝血酶显著增加了存活内皮细胞上PS的暴露。炎性细胞因子(TNFα和IL-1α)也引起了微弱但明确的PS暴露的诱发。
这些条件有可能是体内肿瘤的主要诱发刺激物，因为：i)PS阳性内皮在坏死区内和周围是普遍的，在此通常可以观察到低氧、酸性、形成血栓的血管和浸润的宿主白细胞；ii)低氧/复氧放大了TNFα和IL-1对体外内皮细胞的微弱PS暴露活性，此发现与肿瘤体内状况相关，其中低氧和分泌细胞因子的肿瘤和宿主细胞共存；iii)已报道低氧/复氧和凝血酶通过激活NADPH氧化酶样膜酶而在内皮细胞中产生了反应性氧类(ROS)(Zulueta等，1995)。恶性细胞产生的ROS可能造成内皮细胞损伤(Shaughnessy等，1989)。过氧化氢是目前研究中发现的人工培养内皮细胞上PS暴露的最强诱导剂，为ROS的参与提供了间接的支持。
外在化的PS提供了一个凝血因子聚集和装配的阴性磷脂表面。这可能造成很久以来所认识到的肿瘤内皮上的前凝血状态。PS还为辅助白细胞浸润入肿瘤的循环巨噬细胞(McEvoy等，1986)、T淋巴细胞(Qu等，1996)和多形核白细胞提供了附着位点。活化巨噬细胞、多形核白细胞和血小板对肿瘤内皮的PS的粘附可能导致了反应性氧类的更多分泌，并进一步增强了PS的暴露。
实施例VIII
膜联蛋白缀合物的抗肿瘤作用
氨基磷脂和阴离子磷脂是肿瘤血管系统的稳定标记，这一惊人的发现意味着抗体-治疗剂构建物可用于癌症治疗中。除了利用抗体作为靶向剂之外，膜联蛋白和其它特异的结合蛋白质也可用于将治疗剂特异投递至肿瘤血管。以下结果显示了体内施用膜联蛋白-TF构建物所产生的抗肿瘤作用。
A.方法
制备膜联蛋白V-tTF缀合物并施用于患实体瘤的nu/nu小鼠。由人HT29结肠直肠癌细胞形成肿瘤，所形成的肿瘤至少约1.2cm3。静脉内施用膜联蛋白V-tTF凝血配体(10μg)并使其循环24小时。另外培养经盐水处理的小鼠作为对照动物。处理1天后，处死小鼠并放血，收获肿瘤和主要器官以供分析。
B.结果
发现膜联蛋白V-tTF缀合物在患HT29肿瘤的小鼠内诱发了特异的肿瘤血管凝血。在单次注射膜联蛋白V-tTF缀合物处理后的动物内约55％的肿瘤血管形成血栓。相反，在对照动物的肿瘤血管中只有极少血栓形成的迹象。
实施例IX
3SB抗PS抗体的抗肿瘤作用
本实施例利用同种和异种肿瘤模型显示了抗PS抗体的抗肿瘤作用。此研究中所用的3SB抗体结合PS(和PA)，但基本上不与PE反应。此抗PS抗体引起肿瘤血管损伤，伴随着血栓形成和肿瘤坏死。
首先利用3SB抗体在同种和异种肿瘤模型中检测抗PS抗体的作用。对于同种模型来说，将1 x 107个小鼠结肠直肠癌Colo26细胞(获自IanHart博士，ICRF，伦敦)皮下注射入BALB/c小鼠的右侧。在异种模型中，通过在雄性CB17SCID小鼠右侧皮下注射1 x 107个细胞产生人Hodgkin’s淋巴瘤L540异种移植物。在处理前使肿瘤长至约0.6-0.9cm3大小。
将20μg3SB抗PS抗体(IgM)、对照小鼠IgM或生理盐水腹膜内注射入患肿瘤的小鼠(每组4只动物)。每隔48小时重复此处理3次。每天监测动物，检查肿瘤和体重。如实施例I所述计算肿瘤体积。当肿瘤长至2cm3时处死小鼠，或者如果肿瘤显示出坏死或溃疡的迹象则更早一些时间处死小鼠。
用3SB抗PS抗体进行的处理有效抑制了同种和异种肿瘤的生长(图6A和图6B)。抗PS抗体引起肿瘤血管损伤，伴随着血栓形成和肿瘤坏死。血凝块的出现和被堵塞血管周围肿瘤块的瓦解是明显的。
定量的说，3SB抗PS抗体疗法在患大Colo26(图6A)和L540(图6B)肿瘤的小鼠内抑制了肿瘤的生长，抑制程度高达对照肿瘤体积的60％。在用盐水或对照IgM处理的小鼠中未发现肿瘤生长的延缓。在用抗PS抗体处理的小鼠内未观察到毒性，正常器官保持未改变的形态，与未处理的或盐水处理的小鼠无区别。
在首次处理24小时后肿瘤开始衰退，在接着的6天内肿瘤体积继续减小。在同种和无免疫应答的肿瘤模型中都观察到了此结果，表明这一作用是由不依赖于免疫状态的机制所介导的。而且，与患大于1500mm3的肿瘤的对照小鼠相比，肿瘤的减轻与动物警觉性的增加和通常的健康外观有关。肿瘤的再生长发生在首次处理7-8天后。
用抗PS处理L540肿瘤获得的结果更多的是由以下原因造成的。值得注意地，尽管事实上在L540肿瘤中PS染色阳性的血管百分数小于在HT29和NCI-H358肿瘤中的，但在L540肿瘤处理中确实出现了肿瘤坏死。这意味着在处理其它肿瘤类型时可能产生更快速的坏死。此外，通常选择L540作为实验模型，因为它们提供了清楚的组织学切片且事实上已知它们对坏死具有一定的抗性。
实施例X
抗阴离子磷脂抗体(9D2)的抗肿瘤作用
此实施例证实了可结合PS和其它阴离子磷脂的9D2抗体在体内抗肿瘤研究中的作用。
将可结合阴离子磷脂的高剂量(>150μg)大鼠抗体9D2注射入患H358肿瘤的裸鼠中。免疫定位研究显示了它强烈地定位于肿瘤内皮(4+)，尽管由于高剂量而观察到9D2与正常血管有某些低水平的非特异结合(正如对无关特异性对照IgM抗体所观察到的一样)。
当将9D2腹膜内注射入患L540肿瘤的SCID小鼠中以产生腹水时，肿瘤坏死并分解。将对照抗体(MK2.7，大鼠IgG)注射入患L540肿瘤的SCID小鼠时，未观察到类似的效果。
随后更精确的测定9D2抗-PS抗体对体内L540肿瘤生长的影响。当肿瘤达到200-250μl(0天)时开始进行处理。在第0天至第7天，将约150μgIgM(200μl上清液)或200μl 10％DMEM腹膜内注射入小鼠。在第7天至第22天，将约300μg IgM(400μl上清液)或400μl10％DMEM腹膜内注射入小鼠。第22天是处理的最后一天，并在这天处死小鼠。
如表12中所示，从第10天到第22天，肿瘤的生长通常被抑制约40％-50％。在结束研究的时候，被处理组中只有4只小鼠的肿瘤体积大于2000μl，而对照组中9只均如此。
表12
抗PS抗体对体内L540肿瘤的影响
Figure C03816751D02221
在另一体内实验中，在肿瘤细胞注射后45天内研究大鼠抗PS抗体对CB17SCID小鼠中的L540肿瘤生长的影响。每天用300μg抗PS抗体腹膜内注射处理这些患肿瘤的小鼠，或每天腹膜内注射300μl10％DMEM作为对照。与对照相比，被处理组中肿瘤治疗的各种参数明显较好(表13)。
表13
抗PS抗体对体内L540肿瘤的影响
 
其它参数 对照 处理
％衰退肿瘤<sup>1</sup>(处理后60天) 0 40％
％衰退肿瘤<sup>1</sup>(处理后90天) 0 20％
次级肿瘤的平均体积(μl)<sup>2</sup> 537±30 366±56
1在治疗后的指定时间(60天与90天)内被处理小鼠内肿瘤太小以致不能检测
2淋巴结中的转移
在进一步的研究中，每周3次以100μg的剂量将9D2抗体腹膜内注射入携带L540肿瘤的小鼠。每周两次用卡尺测量肿瘤的大小。抗肿瘤效果与对照组的比较见图7。括弧内的数字表示每组小鼠总数目中具有衰退肿瘤的小鼠数目。
实施例XI
抗PS抗体3G4的抗肿瘤作用
本实施例证实了利用抗PS抗体3G4在同种和异种肿瘤模型中另外的抗肿瘤效果。此研究中所用的3G4抗体是可结合PS和其它阴离子磷脂的IgG抗体(实施例IV)。
A.动物肿瘤研究的方法
在同种和异种肿瘤模型中检测3G4的作用。用于动物肿瘤治疗研究的一般方法进行如下。除非特别提及具体的差异，否则这就是本申请研究中所用的方法。
动物获自Charles Rivers实验室。小鼠为4-5周龄，雌性，C.B-17SCID或Fox Chase SCID小鼠。将小鼠关在高压灭菌的笼子里，喂无菌食物和水，进行无菌处理。所有步骤都在层流净化罩内进行。让小鼠适应1周，然后做耳垂标记并从尾静脉处取血样(约75-100μl)，用ELISA检查泄漏程度。任何在泄漏ELISA试验中失败的小鼠都不能用于实验中。在耳垂标记和取血样2-3天后将肿瘤细胞同位注射入小鼠乳房脂垫(MFP)或皮下注射入小鼠右侧。
在同位模型中，通常将0.1ml DMEM中的1 x 107个细胞注射入麻醉小鼠的MFP处。腹膜内注射0.075ml小鼠混合物麻醉小鼠。小鼠混合物是5ml氯胺酮(100mg/ml)、2.5ml甲苯噻嗪(20mg/ml)、1ml乙酰丙嗪(10mg/ml)、11ml无菌水。剂量是每20-30克体重通过腹膜内途径注射0.1ml，持续时间为30分钟。
一旦小鼠被麻醉，即通过它对脚趾/足钉无反应来检查，则使小鼠左侧位躺并用70％的酒精擦拭头正后方和右前臂/后背周围区域。在右前臂(侧胸)正后方开一2-3mm切口，揭开皮肤片就显露出白色的脂垫。用1ml注射器和27号针头将0.1ml细胞注射入脂垫中，在脂垫中产生一大泡。用9mm的无菌伤口夹闭合切口。将小鼠放回笼子中并观察直至其从麻醉中苏醒并能活动。检测手术后的健康状况，如果观察到任何疼痛的迹象，在小鼠饮用水中添加对乙酰氨基酚(0.24mg/ml)和可待因(0.024mg/ml)。1周后去除伤口夹。使用此方法将细胞准确的放入选定的位置而不会进入皮下区域。在14-15天内肿瘤体积(LxWxW)将约为200μl，收获率基本上为100％。
在皮下模型中，通常用0.2ml中的1 x 107个细胞注射小鼠。不用麻醉小鼠，但通过牢固夹紧暴露右侧的小鼠皮肤而将束缚住。用1ml注射器和23号针头将1 x 107个细胞(200μl)注射入小鼠皮肤正下方，然后将看到一大泡。看到少量的液体从注射位点处渗漏的现象并不罕见。在皮下注射退针时可以采用转动的方式来减少此渗漏。通过LxWxH检查肿瘤体积。
在灌注方案中，用溶于0.2ml盐水中的1000U肝素静脉内注射小鼠。然后通过腹膜内注射0.1ml小鼠混合物使其安静。一旦小鼠足够安静(通过它对脚趾/足针刺无反应来检查)，即打开其胸腔以暴露心脏和肺。将附着于管子和灌注泵上的30号针插入左心室。将右心室剪开使血液能滴出来。以1ml/分钟的速度泵入盐水12分钟。结束灌注后，取下针头和管子。切下组织以供进一步研究，可以是免疫组化或病理学研究。
B.肿瘤治疗结果
对于同种模型，使用MethA小鼠纤维肉瘤细胞。在一异种模型中，将人MDA-MB-231乳房肿瘤细胞接种于乳房脂垫中。在另一异种模型中，通过注射细胞并使肿瘤在处理前长到超过500mm3大小来产生大的人Hodgkin’s淋巴瘤L540异种移植物。将100μg3G4抗PS抗体(IgG)腹膜内注射入携带肿瘤的小鼠(每组10只动物)，与对照相对应。每周重复处理3次。每周监测动物两次以检查肿瘤的状况。
用3G4抗PS抗体处理有效抑制了同种和异种肿瘤二者的生长。在前20-30天的处理如图8A、图8B和图8C中所示。抗体引起了肿瘤血管损伤、局部的血栓形成和肿瘤坏死。
同种MethA肿瘤细胞的治疗尤其成功，而对生长于乳房脂垫中的人MDA-MB-231乳房肿瘤细胞的处理也造成了肿瘤消退(图8A和图8B)。即使在携带已知抗坏死的大L540肿瘤的小鼠内，与对照相比，3G4抗体治疗也抑制了肿瘤的生长。在对照小鼠中未发现肿瘤生长的延缓。在用抗PS抗体处理的小鼠中未观察到毒性。
还用MD MBA-435s细胞产生了肿瘤并如上所述进行处理。用3G4抗体处理也有效抑制了这些肿瘤的生长。对大L540肿瘤MDA-MB-231和MD-MBA-435s肿瘤细胞处理60天的结果如图8D、图8E和图8F中所示。抗体引起了肿瘤血管损伤、血栓形成和坏死并延缓了肿瘤生长，且没有毒性的迹象。
MD-MBA-435s lucerifase细胞获自Angels Sierra Jimenez博士，Barcelona，西班牙，并培养于10％DMEM中。如上所述将肿瘤细胞注射入小鼠，在注射2周后，检查肿瘤并记录体积。用按照实施例XIX产生的3G4抗体和嵌合3G4抗体对携带肿瘤平均体积(200mm3)相似的小鼠进行处理，与对照相对比。在第15天通过腹膜内注射(800μg)开始进行处理，每2-3天继续注射200μg，直至最终在第35天注射400μg。在注射当天检查肿瘤体积和小鼠体重。处死小鼠并用盐水灌注12分钟。取下器官和肿瘤，在液氮中速冻并将肿瘤切片以供免疫组化分析之用。
此研究显示了，与对照相比，3G4抗体和嵌合3G4抗体二者都有效延缓了肿瘤的生长(图8G)。
实施例XII
抗PS抗体针对CMV的抗病毒作用
通过从肿瘤血管到病毒感染领域的惊人转变，发明者紧接着推断针对氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体还有可能发挥抗病毒作用。本实施例的确证明了这一点，首先将3G4抗体用于治疗巨细胞病毒(CMV)感染。
A.方法
1.CMV感染细胞的体外治疗
如前文所述(Bresnahan等，1996)，以感染复数为0.01用表达绿色荧光蛋白(GFP)的人CMV AD169感染6孔板中汇合的人二倍体包皮成纤维细胞(HHF-R2)单层。简而言之，以每孔1ml的总体积将细胞与病毒在37℃保温90分钟。在感染期间，每30分钟轻轻摇动平板一次。感染后，去除细胞上清液并在每个孔中加入DMEM/10％FBS/pen-strep(2ml/孔)。
将3G4或同种型匹配的对照抗体GV39G(100μg/ml和50μg/ml)的稀释液加入孔中。将感染后的细胞在37℃保温共19天。每3天更换一次各孔中的培养基和抗体。在第19天，收获各孔中的细胞和上清液并冻存于-80℃直至进行噬斑检测。
2.荧光显微镜检查法
重组CMV在SV40启动子调控下表达GFP。因此，在荧光显微镜下被感染的细胞呈现绿色。在这些研究中，在第2、3和9天用荧光显微镜观察经抗体处理的CMV感染细胞。
3.噬菌斑检测
用标准方案进行噬斑检测。简而言之，在37℃快速融化冻存细胞的悬浮液并在1000rpm离心1分钟去除碎片。将不同稀释度的细胞上清液加入6孔板中的亚汇合HHF-R2细胞单层上，并在37℃保温细胞90分钟(每30分钟轻摇平板一次)。感染后，去除细胞上清液，并换入2ml DMEM/10％FBS。在第4天，去除各孔中的上清液，并用0.01％低熔点琼脂糖/DMEM/10％FBS覆盖细胞。感染后将平板在37℃共保温14天。在第14天，用10％缓冲福尔马林固定被感染的细胞单层，并用亚甲蓝染色使噬斑显现。
B.结果
1.3G4抑制了CMV的病毒扩散
为了研究3G4对CMV感染和复制是否具有抑制作用，在以低感染复数加入CMV之前用3G4预处理汇合的人成纤维细胞。这些研究中所用的CMV表达绿色荧光蛋白(GFP)。因此，在荧光显微镜下观察时被感染的细胞呈现绿色。
在用50μg/ml和100μg/ml抗体处理的第3天，在未处理孔和用3G4或同种型匹配的对照抗体GV39G处理的孔中都有单个被感染的细胞。因此，用3G4处理成纤维细胞未显示出显著抑制病毒进入细胞。
不过，在第9天，在3G4处理孔和对照GV39G处理孔之间被感染细胞数目有了显著的不同(图9A和图9B；将右上方组图与中间和右下方组图进行比较)。当病毒传播至对照孔中约80％的细胞单层时，在3G4处理孔中病毒还局限于最初的个别被感染细胞内。因此，3G4限制了CMV从最初的被感染细胞向周围细胞的传播。用100μg/ml(图9A)和50μg/ml(图9B)处理细胞都观察到了病毒传播的这种抑制。
2.病毒抑制是抗体浓度依赖型的
为了确定在低感染复数下发挥抗病毒作用所必需的3G4浓度，用不同浓度的3G4和对照抗体GV39G处理被感染的细胞。如图10中所示，用100μg/ml和50μg/ml3G4观察到细胞间传播的完全抑制。当用25、12.5和6.25μg/ml3G4处理细胞时，有渐增数目的GFP阳性CMV感染细胞。尽管在这些低浓度下3G4不会完全阻止病毒从原来的被感染细胞中向外传播，它仍然具有有意义的抗病毒作用，因为与GV39G处理的对照孔相比，在3G4处理孔中观察到较少的GFP-阳性CMV-感染细胞(图10)。
3.低感染复数下病毒负荷的定量
通过进行噬菌斑试验测定抗体处理后的病毒负荷来对3G4的抗病毒作用定量。对照包括未处理细胞、GV39G抗体和利用抗秋水仙碱的小鼠IgG2a同种型抗体-C44抗体的附加抗体对照。
用100μg/ml3G4处理被感染的细胞(感染复数＝0.01pfu/细胞)导致病毒滴度与对照-GV39G处理细胞相比显著下降6个log10(图11A)。此抑制作用说明约99.9999％的病毒复制被抑制。在浓度为50μg/ml时，用3G4处理导致了与对照-GV39G处理细胞相比病毒滴度显著下降3.5个log10。使用25μg/ml和12.5μg/ml 3G4，结果仍然是显著的，甚至在6.25μg/ml时仍能观察到抑制作用(图11A)。
4.高感染复数下病毒负荷的定量
对以高感染复数3被感染的成纤维细胞进行3G4处理还导致了病毒滴度显著下降。在浓度为100μg/ml时，用3G4处理导致了与对照-GV39G处理细胞相比病毒滴度显著下降5个log10(图11B)。在浓度为50μg/ml时，与GV39G相比3G4抑制病毒复制3个log10(图11B)。
5.晚期复制的抑制
为了确定CMV复制周期的哪一个阶段被3G4阻断，进行定时的附加研究。为此，在感染后不同的时间点将3G4添加入以高感染复数被感染的成纤维细胞中。用标准噬斑检测法对病毒负荷(在细胞和上清液中)定量。
感染长达24小时后添加3G4导致病毒滴度有5-6个log10的下降(图11C)。不过，当3G4的添加延迟至48小时时，3G4的抑制作用降低到2个log10，而当添加延迟至72-96小时时，抑制作用进一步降低。这表明3G4干扰了在感染后24-48小时之间发生的CMV晚期复制。因此，3G4未显著干扰感染或早早期或早期基因表达。它在稍晚的病毒复制中发挥作用，如在晚期基因表达、病毒DNA合成、病毒包装或流出中。
实施例XIII
抗PS抗体针对RSV的抗病毒作用
除了实施例XII中所显示的针对CMV的显著抗病毒作用外，本实施例证明了可使用三种不同的抗PS抗体抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的复制。
A.方法
1.体外RSV感染细胞的处理
将A-549细胞在三个Costar12孔组织培养板中培养至100％汇合。将200μL极限必需Eagle培养基加入所有的孔中。在各板的9个孔中加入抗磷脂抗体(Ab)(100μg/100μl)，30分钟后以感染复数为1用RSV长链100μl感染最初9个孔中6个孔的细胞。剩下3个孔作为未感染的、抗体处理孔。以上述相同感染复数的RSV感染无抗体的另三个孔。
各板用于检测三种不同的抗体：3G4、3SB和1B9(实施例IV)。将细胞在5％CO2中40℃保温2小时，然后在各个孔中加入600μl培养基至完整的1mL体积。在同一条件下保持A-549细胞平板作为对照。在感染后4、24和72小时收集上清液。在各时间点，从各板的4个孔采样：一个孔中为只用抗体处理的细胞，两个孔具有经抗体处理/RSV感染的细胞，而另一个孔中有仅被RSV感染的细胞。将样品冻存于-80℃直至噬斑试验。
2.噬斑试验
如前所述进行噬斑试验(Kisch等，1963；Graham等，1988)。简而言之，将冻存细胞的细胞上清液在37℃迅速解冻。从未稀释的细胞上清液制备三份10倍稀释液：10-1、10-2和10-3。将各稀释液100μl加上未稀释样品接种于80％汇合的Hep-2细胞系平板中，均一成三份。将平板放置于5％CO2、40℃培养箱中5天。在第5天，将平板显影并用苏木精和伊红染色来展现各个孔中的噬斑。用解剖显微镜对噬斑进行计数来计算RSV病毒负荷pfu(噬斑形成单位)/mL。
B.结果
如图12中所观察到的，用3SB或1B9处理经RSV感染的细胞导致病毒复制发生对数式减少。用3G4处理感染细胞时，抗病毒效果更显著。用3G4处理导致了病毒滴度降低2个log10(图12)。抑制作用比用CMV观察到的低，这很可能是因为3G4浓度低之故(25-50μg/ml)。
实施例XIV
单链抗PS抗体
鉴于本文所述的抗PS抗体的许多用途，包括单独作为抗肿瘤剂、作为靶向剂将附着的治疗剂投递至肿瘤以及作为抗病毒剂，本实施例描述了适于产生单链(scFv)抗PS抗体的技术，即其中VH和VL结构域存在于单一多肽链中，通常通过肽接头连接。
A.噬菌体抗体文库的制备
将细菌文库(约1 x 1010个克隆)的次级原种接种于含100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的2xYT 100ml中。在37℃振荡培养至600nm的OD值达到0.5。
加入1013pfu的M13K07辅助噬菌体，在不摇动的条件下于37℃水浴中保温30分钟。将被感染的细胞在3500g离心10分钟。将沉淀重悬于含100μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素的2xYT200ml中并于30℃振荡培养过夜。
将培养物于10800g离心10分钟。向上清液中加入1/5体积的PEG/NaCl，混合均匀并在4℃放置1小时。然后10800g离心30分钟。将沉淀重悬于40ml PBS中并加入8ml PEG/NaCl。混合并在4℃放置20分钟。然后将其10800g离心10分钟以并吸出上清液。沉淀重悬于2ml10％人血清中，在微量离心管中11600g离心10分钟以去除大部分残留的细菌碎片。
为了进行预淘选，将10％人血清中的噬菌体抗体文库加入被PC包被的平皿中并室温保温60分钟。
B.生物素化脂质体的选择
将20μmol磷脂酰肌醇和20μmol生物素化磷脂酰丝氨酸溶于10ml己烷中。用旋转蒸发器干燥此溶液使其在摇瓶表面形成一薄层。加入2mlPBS并4℃水浴超声30分钟。
然后在存在10％人血清的条件下混合100μl噬菌体scFv和100μl生物素化脂质体，并在室温轻轻旋转1小时。通过加入600μl 2.5％酪蛋白/0.5％BSA用100μl链霉亲和素M-280dynabeads于室温进行封闭30分钟。用MPC-E(磁性颗粒浓缩仪，来自Dynal)4-5分钟使珠子从封闭缓冲液中分离出来。
将珠子重悬于100μl PBS中。将100μl封闭后的链霉亲和素Dynabeads加入结合了生物素化抗原的噬菌体中并于室温轻轻旋转15分钟。用MPC-E5分钟完成分离并倒出上清液。用1ml PBS漂洗5次。每一次漂洗时，都将珠子重悬浮并用MPC-E沉降。
最后，通过重悬于300μl 100mM triethalamine中30分钟将噬菌体从珠子上洗脱下来。加入150μl 1M Tris pH7.4中和。用MPC-E再次分离珠子。
用150μl噬菌体上清液感染10ml对数期的TG1细菌。在20μg/ml氨苄青霉素存在的条件下将10ml培养物37℃振荡培养1小时。加入氨苄青霉素至终浓度50μg/ml并再振荡培养1小时。在此培养物中加入1013pfuM13辅助噬菌体，转移到含100μg/ml氨苄青霉素的100ml 2YT培养基中并7℃振荡培养1小时。加入卡那霉素至终浓度100μg/ml并30℃振荡培养过夜。
再重复噬菌体制备步骤和选择步骤3-4次。
C.单克隆单链抗体ELISA
将平板上的HB2151单菌落(经过4轮筛选后)接种于96孔板中含100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的500μl 2×YT培养基中并37℃振荡(300rpm)培养过夜。从此平板中取5μl转移到每孔装有含100μg/ml氨苄青霉素的500μl 2×YT培养基的另一96孔板中并37℃振荡培养3小时(OD600＝0.9)。
在各孔中加入含100μg/ml氨苄青霉素、10mM IPTG(终浓度1mM)的50μl2×YT培养基，30℃振荡培养过夜。1800g离心10分钟，并将100μl上清液用于以下ELISA中。
用以10μg/ml浓度(P6641 10mg/ml，溶剂是氯仿:甲醇95:5)溶于乙醇中的PS包被96孔板(DYNEX 1B)。以相同方式用10μg/mlPC包被。这些平板在冷室内4℃挥发。在各孔中加入250μl 2.5％酪蛋白，盖上平板并在37℃封闭1小时。
用PBS漂洗孔3次，加入10％人血清100μl/孔和含可溶性scFv的上清液100μl/孔并在37℃保温60分钟。弃溶液并用PBS洗6次。在各孔中加入溶于5％酪蛋白/0.5％BSA-PBS(1:5000稀释)的9E10 100μl，37℃保温1小时并用PBS洗6次。在各孔中加入100μl HRP-山羊抗小鼠抗体(1：10000稀释)，37℃保温1小时并用PBS洗5次。在各孔中加入0.05％OPD 100μl并显影5分钟。加入100μl 0.18M H2SO4终止反应并在O.D.490读数。
将抗原阳性克隆在2xTYAG平板上划线并30℃培养过夜。挑出阳性单菌落接种于3ml 2xTYAG培养基中并在37℃培养12小时。提取质粒并通过酶消化和PCR检查scFv基因插入片段。对具有正确大小插入片段的菌落进行测序。
将具有正确大小插入片段的菌落培养于100ml 2xTYAG培养基中并37℃振荡培养至OD600＝0.5。将它们转移入900ml 2xTYA中并培养至OD600＝0.9。加入1M IPTG至终浓度1mM并30℃振荡培养过夜。用如前所述的相同ELISA方法检查上清液。用Ni++-琼脂糖亲和层析从周质部分纯化scFv蛋白质。
D.结果
淘选4轮后，以下克隆在PS平板上给出了有希望的ELISA信号并且具有正确大小的插入片段：3E5、3A2、G5、C8、E4和4D5。这些克隆已被亚克隆，其中E4给出了5个阳性亚克隆，而4D5给出了5个阳性亚克隆(表14)。
表14
PS平板上的ELISA
Figure C03816751D02321
阳性克隆一旦被确定，就进行测序。克隆3A2的scFv核酸和蛋白质序列分别见SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。大量培养阳性克隆并用镍琼脂糖亲和层析纯化scFv。已用Phast-凝胶电泳法获得了纯化的scFv。
实施例XV
PE结合肽衍生物的合成
本发明涉及用于治疗肿瘤和病毒疾病的示范性PE结合肽衍生物和缀合物的设计和合成。示范性耐久霉素衍生物的结构参阅从图13A至图130的组图，同时配合以下说明。
A.DLB
将溶于0.387ml 0.1M NaHCO3水溶液的0.5mg(0.25μmole)耐久霉素加入0.113mg(0.25μ mole)NHS-LC-生物素(Sigma)中。将反应混合物于室温保温1小时然后4℃过夜。将样品加到氧化硅柱上，用0.1％三氟乙酸(TFA)清洗，用0.1％TFA和70％CH3CN洗脱。收集洗脱液并离心浓缩。总产量是0.5mg(图13A)。
B.DIB
将溶于0.286ml 0.1M NaHCO3水溶液中的0.5mg(0.25μmole)耐久霉素加入0.034mg(0.25μmole)盐酸2-亚氨基硫(2-IT)中。将反应混合物室温保温1小时。加入0.13mg(0.26μmole)碘乙酰-LC-生物素(Pierce)并将反应液室温保温1小时并4℃过夜。将样品加到氧化硅柱上，用0.1％TFA清洗，用0.1％TFA和70％CH3CN洗脱。收集洗脱液并离心浓缩。总产量是0.5mg(图13B)。
C.(DLB)4NA
将1.9mg(0.94μmole)耐久霉素溶于0.5ml 0.1M NaHCO3水溶液中。在其中加入溶于200μl二甲基甲酰胺(DMF)的0.4mg(0.88μmole)NHS-LC-生物素(Sigma)中。将混合物室温保温4小时。将10mg(0.17μmole)中性亲和素(NA)1ml加入反应混合物中，室温保温2小时并4℃过夜。将反应混合物加到PBS缓冲液平衡的G25柱(体积50ml)上。收集各级分并用SDS PAGE(phast凝胶)进行分析。将含蛋白质的级分(7-16)合并在一起，通过0.22μm滤器过滤除菌并通过检测280nm处的吸收值测定浓度。总产量是5.1mg。
然后用FPLC分部收集样品。收集相应于以下级分的三个峰：峰1：[(DLB)4NA]3(级分17-23)；峰2：[(DLB)4]2(级分24-33)和峰3：(DLB)4NA(级分35-48)。所有这些样品均通过0.22μm滤器过滤除菌。获得的终产量是：0.34mg[(DLB)4NA]3；0.59mg[(DLB)4]2和1.41mg(DLB)4NA(图13C)。
D.(DLB)4NA-F
将PBS缓冲液中的0.61mg(DLB)4NA加入溶于DMF的0.005mg N-羟基琥珀酰亚胺荧光素(NHS-荧光素)(Sigma)中。将混合物室温保温1小时。然后将反应混合物分级分离于PD10柱(10ml)上。(DLB)4NA-F洗脱于含蛋白质的级分(3-4)中，将它们合并在一起并通过0.22μm滤器过滤除菌。总产量是0.5mg(图13D)。
E.(DIM)nHIgG
人IgG(HIgG)首先如下纯化：将1.3ml HIgG(包括100mg/ml HIgG、22.5mg/ml甘氨酸和3mg/ml清蛋白，溶于含1mM EDTA的硼酸盐缓冲液中，pH9)加到FPLC(S200，250ml)柱上。收集级分并在phast凝胶上用SDSPAGE进行分析。将含单体IgG的级分(21-32)合并在一起，通过0.22μm滤器过滤除菌。按280nm处的吸收值测定的总产量是111mg。
将纯化的HIgG(55mg溶于13ml硼酸盐缓冲液中，pH9)加入溶于DMF的1.003mg SMCC(Pierce)0.5ml中。混合物室温保温1小时。同一时间，将含6mg耐久霉素的另一反应混合物(3μmole，溶于0.5ml0.1M NaHCO3中)和0.413mg2-IT(3μmole；在0.1M NaCO3中)室温保温1小时。反应结束后，将两反应混合物合并并室温保温2小时，4℃过夜。反应产物在phast凝胶上用SDS PAGE进行分析。将反应产物加样到硼酸盐缓冲液(pH9)中的FPLC柱上。合并相应于三体(5-14)、二体(15-24)和单体(25-37)的FPLC级分并通过0.22μm滤器过滤除菌。单体的总产量是54.6mg。在每个HigG分子上附着了5-7个耐久霉素基团(图13E)。
F.(DIM)nHI gG-F
将(DIM)nHI gG1mg(0.7ml)加入溶于DMF的NHS-荧光素5μl中。反应混合物室温保温1小时并用PD-10柱脱盐。合并含蛋白质的级分(2-3)并通过0.22μm滤器过滤除菌。总产量是0.9mg(图13F)。
G.(DIM)nHIgG-B和[(DIM)nHIgG]2-B
为了合成生物素化的[(DIM)nHIgG]2衍生物，将[(DIM)nHIgG]20.66mg(1ml)加入溶于DMF的1mg/ml NHS-LC-生物素8μl中。反应混合物室温保温1小时并用PD-10柱脱盐。合并含蛋白质的级分(3和4)并通过0.22μm滤器过滤除菌。终产量是0.46mg。
以相同方式进行单体(DIM)nHIgG的生物素化。简而言之，将(DIM)nHIgG 1.06mg(0.75ml)加入溶于DMF的1mg/ml NHS-LC-生物素12μl中。反应混合物室温保温1小时，然后用PD-10柱脱盐。合并含蛋白质的级分(3和4)并通过0.22μm滤器过滤除菌。终产量是0.62mg(图13G)。
H.(DIB)4NA
将2mg(0.99μmole)耐久霉素溶于0.5ml 0.1M NaHCO3水溶液并加入0.136mg(0.99μmole)2-IT中。将反应混合物室温保温1小时。之后，加入0.483mg(0.95μmole)碘乙酰-LC-生物素(Pierce)并将反应液室温保温1小时。加入溶于1ml水中的10mg(0.17μmole)中性亲和素并4℃保温过夜。用FPLC分部收集反应混合物。收集并合并三个不同的峰：峰1：[(DIB)4NA]3(级分17-23)；峰2：[(DIB)4NA]2(级分24-33)和峰3：(DIB)4NA(级分35-48)。所有这些样品均通过0.22μm滤器过滤除菌。获得的总产量是：0.87mg[(DIB)4NA]3；1.25mg[(DIB)4NA]2和1.83mg(DIB)4NA(图13H)。
I.(DIB)4NA-B
将(DIB)4NA 0.023mg(0.3μmole)加入0.9μg NHS-LC-生物素(Pierce)中。反应液室温保温1小时，然后用PD-10柱脱盐。总产量是0.04mg(图13I)。
J.DS-1
将溶于0.5ml 0.1M NaHCO3水溶液的5mg(2.5μmole)耐久霉素加入0.319mg(2.6μmole)1，3丙磺酸内酯中。将混合物4℃保温过夜。将样品加到二氧化硅柱上，用0.1％TFA清洗，用0.1％TFA和70％CH3CN洗脱。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。总产量是5mg(图13J)。
K.DS-2
将溶于0.3ml 0.1M NaHCO3水溶液的1mg(0.497μmole)耐久霉素加入0.072mg(0.523μmole)2-IT中。将反应混合物室温保温1小时。加入0.125mg(0.49μmole)SBF-氯化物(Pierce)。反应混合物室温保温1小时并4℃过夜。在二氧化硅柱上纯化肽。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。总产量是1mg(图13K)。
L.DS-3
将溶于0.4ml 0.1M NaHCO3水溶液的1mg(0.497μmole)耐久霉素加入0.109mg(0.592μmole)2-磺基苯甲酸环酸酐中。将反应液室温保温1小时并4℃过夜。在二氧化硅柱上纯化得到的肽。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。总产量是1mg(图13L)。
M.DS-4
将溶于0.5ml 0.1M NaHCO3水溶液的0.25mg(0.124μmole)耐久霉素加入0.017mg(0.124μmole)2-IT中。将反应混合物室温保温1小时。然后将混合物加入0.049mg(0.124μmole)Ellman’s药剂中。反应混合物室温保温2小时并4℃过夜。将250μl 1mg/ml 4-氨基-5-羟基-2，7-萘二磺酸单钠盐水合物加入100μl 1mg/ml 2-IT中。反应液室温保温1小时。将50μl此反应混合物加到前述反应液中并室温保温1小时。在二氧化硅柱上纯化肽。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩(图13M)。
N.DS-5
将溶于0.5ml 0.1M NaHCO3水溶液的5mg(2.5μmole)耐久霉素加入0.356mg(2.6μmole)1，3-丙磺酸内酯中。将混合物4℃保温过夜。将样品加到二氧化硅柱上，用0.1％TFA清洗，用0.1％TFA和70％CH3CN洗脱。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。总产量是5mg(图13N)。
0.DC-1
将溶于0.5ml 0.1M NaHCO3水溶液的0.25mg(0.124μmole)耐久霉素加入0.017mg(0.124μmole)2-IT中。将反应混合物室温保温1小时。然后将混合物加入0.049mg(0.124μmole)Ellman’s药剂中。混合物室温保温2小时并4℃过夜。在二氧化硅柱上纯化肽。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩(图130)。
实施例XVI
耐久霉素衍生物特异性结合PE
本实施例证明了实施例XV中合成的耐久霉素衍生物对PE是特异的，因此通过与细胞不渗透剂连接可用作特意的靶向剂或抗病毒剂并用于肿瘤和病毒疾病的治疗中。
为了测试耐久霉素衍生物的特异性，尤其是与其它磷脂相比优先结合PE的特异性，进行了一系列的竞争性ELISAs。用以下方法测试耐久霉素衍生物与DIB或DLB竞争结合PE的能力。
将PE和PC分别溶于乙醇中。终浓度为5μg/ml。将100μl加到96孔板(DYNEX 1B)的各孔中。使这些平板在冷室内4℃挥发。在各孔中加入250μl 2.5％酪蛋白，盖上平板并在37℃封闭1小时。弃封闭缓冲液并在各孔中加入100μl 2.5％酪蛋白。在平板上加入耐久霉素化合物的系列稀释液，诸如(DIM)nHI gG、(DIB)4NA、(DLB)4NA、DS、耐久霉素和DIB。
(DIM)nHIgG起始浓度是1.4mg/ml，(DIB)4NA起始浓度是800μg/ml而(DLB)4NA的起始浓度是800μg/ml。将它们37℃保温1小时并用PBS洗5次。在各孔中加入100μl HRP-链霉亲和素(1:5000稀释)，37℃保温1小时并用PBS洗5次。在各孔中加入0.05％OPD 100μl并显影5分钟。加入100μl 0.18M H2SO4终止反应并在O.D.490读数。
将得到的数据制表，然后作图。如图14C和图14D中结果所示范说明的，渐增浓度的耐久霉素衍生物使490nm处的吸收值下降，表明耐久霉素衍生物与DIB和DLB竞争性结合磷脂酰乙醇胺。
用进一步的ELISAs证实耐久霉素构建物的磷脂结合特性。将各试验脂类PS、PE、PI、CL、PC、PG、SM和胆固醇分别溶于乙醇中并用于包被ELISA平板。将耐久霉素化合物系列稀释液加到平板上。保温和漂洗后，在各孔中加入次级检测药剂并用上述比色方法测定反应性。
耐久霉素生物素衍生物DIB和DLB的代表性磷脂结合模式见图14A中。它显示出DIB和DLB对PE特异，而与PS、PI、CL、PC、PG和SM的结合是可忽略的或检测不到的。(DIM)nHIgG-B和[(DIM)nHIgG]2-B具有与DLB基本上相同的结合特性。尽管在高浓度DIB下只观察到极微弱的与PS的结合(图1A)，这在本研究的范围内并没有很大的意义，因为在饱和及达到最大PE结合一半时的DIB浓度下未检测到与PS的结合。因此，耐久霉素构建物特异结合磷脂酰乙醇胺。
还显示了血清对于耐久霉素衍生物与PE的结合没有显著的影响。这是通过在血清(BSA)存在和缺乏条件下耐久霉素生物素衍生物DLB与PE包被ELISA平板的结合来举例说明的，其中的结合特性未显示出明显的差异(图14B)。
实施例XVII
PE结合肽衍生物的抗病毒作用
除了如实施例XII和实施例XIII中所示的抗PS抗体介导的抗病毒作用外，本实施例证明了特异结合另一常见氨基磷脂PE的肽衍生物的抗病毒作用。
A.方法
1.CMV感染细胞的体外处理
如实施例XII中所述(Bresnahan等，1996)以感染复数0.01用表达绿色荧光蛋白(GFP)的人CMV AD169感染汇合的人二倍体包皮成纤维细胞(HHF-R2)单层。以每孔1.5ml的总体积将细胞与病毒在37℃保温90分钟。在感染期间，每30分钟轻轻摇动平板一次。感染后，去除细胞上清液并在每个孔中加入DMEM/10％FBS/pen-strep(2ml/孔)。
在添加病毒之前，将耐久霉素衍生物(DLB)4NA、(DIM)nHIgG、DS-1、DS-2、DS-3和DC-1的不同稀释液加入孔中，然后进行感染。将感染后的细胞在37℃保温共14天。每3天置换一次各孔中的培养基和耐久霉素衍生物。
2.荧光显微镜检查法
如同在实施例XII中一样，重组CMV在SV40启动子调控下表达GFP。因此，在荧光显微镜下被感染的细胞呈现绿色。在这些研究中，在第4和6天用荧光显微镜观察用耐久霉素衍生物处理过的CMV感染细胞。
B.结果
在第4天，在未处理孔和用(DLB)4NA和(DIM)nHIgG处理的孔中都有个别被感染的GFP阳性绿色细胞(图15，左边的组图)。因此，用这些耐久霉素衍生物处理HHF-R2细胞似乎不会抑制病毒进入细胞。有一些初步的迹象表明耐久霉素衍生物DS-1、DS-2和DS-3抑制病毒进入细胞。
在用(DLB)4NA和(DIM)nHIgG处理后的第6天，在未处理孔和耐久霉素衍生物处理孔之间被感染的GFP阳性细胞数目有了显著的不同(图15，中间组图)。到第6天，未处理孔中的病毒已从第4天所观察到的个别被感染细胞传播至周围细胞(图15，上方，比较左边组图和中间组图)。不过，第6天，在用(DLB)4NA和(DIM)nHIgG处理过的孔中，病毒仍局限于最初的个别被感染细胞中(图15，中间和下方，比较左边组图和中间组图)。
因此，(DLB)4NA和(DIM)nHIgG限制了CMV从最初的被感染细胞向周围细胞的传播。用不同浓度的(DLB)4NA(100μg/ml和50μg/ml)和(DIM)nHIgG(200μg/ml和100μg/ml)处理细胞都观察到了对病毒传播的这种抑制。
实施例XVIII
3G4抗体的优势
如实施例IV中所述，用发明者独一无二的方案开发的3G4抗体具有许多优越于文献中的抗PS抗体的特点，包括著名的抗PS抗体3SB(Rote等，(1993))。本实施例描述了其中的某几个优点。
A.种类和特异性
3G4是IgG抗体，而3SB是IgM。IgG类抗体具有许多优越于IgM之处，包括更高的亲和力、体内的清除率较低以及纯化、修饰和处理的简便性。IgM抗体3SB与3G4和另一IgG抗体的PS结合之间的比较参见图19A和图19B。
3G4与阴离子磷脂PS、PA、PI、PG和CL以大约相同的强度强反应，而与氨基磷脂PE的结合则没有这么强。它与PC和SM无反应性，结合特异性趋势如下：PS＝PA＝PI＝PG>CL>>PE(实施例IV；表4)。3G4与肝素、硫酸乙酰肝素或者双链或者单链DNA没有可检测到的结合，在蛋白质印迹检测中，与提取自bEnd.3细胞的细胞蛋白质也没有可检测到的结合。3G4的结合不受5mM EDTA存在的影响，表明3G4与阴离子磷脂的结合不需要Ca2+。3G4不与已包被了磷脂但随后用0.2％Tween 20的盐水溶液漂洗过的ELISA平板结合，证明了结合的是被吸附的磷脂。
被3G4所识别的表位看起来位于阴离子磷脂的磷酸甘油核中，它在所有哺乳动物物种的磷脂中是相同的。因此抗体与小鼠和人二者的磷脂都反应，这对于临床前和临床开发都很重要。3G4对阴离子磷脂比对天然配体膜联蛋白V更特异。与3G4不同，在生理浓度Ca2+中膜联蛋白V还强烈结合中性磷脂。
3G4对阴离子磷脂的特异性通过下述试验得到证实，其中将由不同磷脂形成的脂质体用于与3G4竞争结合固定化的PS。脂质体是由5mg单一磷脂在氯仿中形成的溶液制备的。将溶液在氮气中干燥，使其在圆底玻璃摇瓶中形成一薄层。然后加入10ml Tris缓冲液(0.1M，pH7.4)，并将摇瓶超声处理5次，每次2分钟。将3G4抗体(0.1μg/ml)加入缓冲液或不同的磷脂脂质体中，并室温预保温30分钟。将混合物加入PS包被的平板(在标准封闭后)，保温1小时，洗涤并添加二抗。1小时后，漂洗平板并用OPD显影5分钟。
如实施例IV中所示，3G4可结合固定化的PS、PA、PI、PG和CL，而以较低程度结合固定化的PE，但不与固定化的PC结合。在存在或缺乏不同脂质体的条件下3G4与固定化PS结合的能力如图20所示。来自这些脂质体竞争性试验的结果表明，3G4与吸附于ELISA平板上的PS的结合被由PS、PA、PI、PG和CL制备的脂质体阻断，但由PE和PC制备的脂质体则不导致3G4结合有可检测到的减少(图20)。此外，SM脂质体也不是抑制性的。
B.细胞增殖的抑制
3G4结合将PS和其它阴离子磷脂外在化的活化、分裂、损伤、凋亡和恶性细胞。3G4抗体抑制了内皮细胞的体外增殖，并显示出对分裂着的内皮细胞有明显的选择性抑制作用，这与静止细胞的情形相反。
测定抗PS抗体3G4、9D2、3B10、1B9、2G7、7C5和3SB对bEnd.3细胞体外生长的影响。将bEnd.3细胞(10000/孔)接种于48孔平板中并使其附着。接种后4小时只加入20％DMEM(对照)或含抗体(20μg-40μg总IgG/孔)的20％DMEM。每个克隆均在两个独立平板上以三份试样进行检测。48-96小时后使细胞分离，对各个孔测定细胞计数，并计算每次处理的平均细胞数目。
3G4和9D2抗体尤其有效，然后是3SB和3B10，而1B9、2G7和7C5具有较小的抑制作用。各抗体显示出对分裂着的(亚汇合)内皮细胞有明显的选择性抑制作用，这与静止细胞的情形相反。在比较性研究中，3G4显示了最大的抑制作用，然后是9D2，它们的抑制性都强于3SB(图16)。
C.抗肿瘤作用
3G4可结合体内肿瘤血管内皮细胞的表面。在静脉内注射入患各种肿瘤的小鼠内后，3G4特异性并一致地定位于肿瘤，但不定位于正常器官。在肿瘤血管内皮(图22)、坏死区和单个恶性细胞上观察到染色。在肿瘤中有3G4的多结合位点，这使其能同时靶向于肿瘤内皮和肿瘤细胞。
3G4抑制了体内血管发生和肿瘤生长，并且在患肿瘤的小鼠中显示出无可检测到的器官毒性。在最初的研究中，3G4已在同种和异种肿瘤模型中显示出给人深刻印象的抗肿瘤作用，其中抗体造成了肿瘤血管的损伤、血管供应的减少和肿瘤坏死(实施例XI)。在被处理动物中有30％-50％观察到已产生的肿瘤的衰退。
3G4抗体代表性的抗血管发生和血管靶向作用分别参见图17A和图17B。对来自带有MDA-MB-231同位肿瘤并已用3G4处理的裸鼠的肿瘤切片的分析证明了在所有被处理肿瘤中有抗血管发生作用。图17A显示了与用对照抗体处理相比，用3G4处理后小鼠肿瘤的代表性图像。对照肿瘤显示出无坏死的迹象且高度血管化，正如肿瘤血管上检测的泛-内皮细胞标记CD31所证实的(图17A，左组图)。相反，用3G4处理过的小鼠肿瘤有80-90％的坏死和CD31阳性结构的几乎完全消失，表明此处理产生了实质性的抗血管发生作用(图17A，右组图)。
3G4抗癌活性的另一方面是诱导肿瘤血管的损伤。参见图17B，它提供了来自相同对照试验的肿瘤H&E染色的代表性图像。对照肿瘤中的血管灌注良好、形态完整且周围是存活的正分裂的肿瘤细胞(图17B，左组图)。相反，经3G4处理的动物内的血管被频繁观察到具有分解的内皮层且被脱离的内皮细胞堵塞，并有可能被裸露血管吸附的宿主细胞堵塞(图17B，右组图)。经3G4处理的肿瘤内的代表性血管显示出功能丧失，由坏死前的周围肿瘤细胞层可显示出这一点(图17B，右组图)。
总之，用3G4处理同位MDA-MB-231肿瘤后进行的组织学检查显示：1)在约50％肿瘤血管中血管内皮分解；2)白细胞附着于肿瘤内皮且单核细胞浸润入肿瘤间质组织；3)肿瘤血管被血小板聚集物和红细胞堵塞；4)与未处理小鼠相比，经3G4处理的小鼠中肿瘤内微血管密度下降70％；以及5)肿瘤中心坏死，肿瘤外围边缘细胞存活，这是VTA的典型特征。因此，3G4抗体通过对肿瘤血管产生影响来发挥其主要的抗肿瘤作用。其它的机制，尤其是针对肿瘤细胞本身的抗体依赖型细胞毒性，有可能也造成抗肿瘤作用。这一点是重要的，且可能可以杀死更多的肿瘤细胞，包括外围边缘的肿瘤细胞。
在进一步的研究中，在其它小鼠模型上检查3G4对肿瘤生长的影响，所说的肿瘤模型包括同种(小鼠Meth A纤维肉瘤)、皮下异种移植物(L540人Hodgkin’s淋巴瘤)和同位肿瘤(人MDA-MB-231乳癌和人MDA-MB-435乳癌)。用3G4抗体处理小鼠分别导致了这些肿瘤有90％、65％以及50％和70％的生长延缓。小肿瘤(直径0.1cm)和生长良好的肿瘤(直径0.3cm，200mm3)都同样被抑制。抗PS疗法导致在50％的患Meth A肿瘤小鼠和30％的患MBA-MD-231肿瘤小鼠中长期的完全的症状缓解。3G4在免疫活性小鼠中具有最高的抑制作用。将人乳房肿瘤生长于小鼠乳房脂垫中的人乳房肿瘤(MDA-MB-231和MDA-MB-435)的同位模型尤为重要，因为这些是生长于人乳房中的人乳腺癌的实用和现实模型。
D.安全特性
3G4抗体与文献中所述的抗磷脂抗体不同。通常的，抗磷脂抗体被认为是会干扰凝血级联反应的致病抗体。它们会抑制体外凝血反应，并引起体内血栓形成。相反，3G4、9D2和类似抗体是无致病效果的治疗用抗体。
1.凝血
3G4、9D2和类似抗体的重要方面源自发明者的下述认识，即优选通过筛选鉴定在有无血清的情况下都同样强烈结合PS包被平板的抗体来选择合乎需要的抗体。这种新的方法使其具有鉴别和排除会识别PS和血清蛋白质复合物的抗体的性能，因为这样的复合物被认为是引起抗磷脂综合症和相关病症的原因或其中的重要因素。
在体外血液凝结研究中，用高剂量3G4抗体观察到对组织因子(TF)诱发的凝血有微弱抑制作用。在使用较低剂量的别的研究中，在组织因子存在下，经3G4处理的小鼠的再钙化血浆与来自经BBG3处理的小鼠的再钙化血浆以相同的速率凝结。此外，添加100μg/ml 3G4至体外细胞和组织因子中不影响凝血因子Xa在proplex(外在凝血途径)中的产生速率。
尽管体外高抗体水平对TF诱导的凝血具有微弱的抑制作用，还在体内检测了3G4抗体，它不会在正常或携带肿瘤的小鼠中引起血栓形成并发症(如参见实施例XI)。在猴子体内也测试了3G4抗体，观察到无显著的副作用。
2.低或无毒性的其它指示剂
3G4在小鼠内没有毒性或只有低毒性的第一手证据来自3G4作为杂交瘤在小鼠内生长时无毒性迹象的有关发现。此外，在腹膜内注射1mg纯3G4时，没有观察到毒性。
现在还进行了全身性的体内研究，其中对每组三只8周龄BALB/c小鼠，用100μg纯化的3G4或同种型匹配对照IgG3(BBG3)每周三次腹膜内注射小鼠，持续2-3周。未观察到毒性体征，且在3G4处理小鼠的主要器官切片中未检测到器官毒性的组织学迹象或形态异常。特别检查了以下参数。
在体重方面，经3G4处理的小鼠与经BBG3处理的小鼠以相同速率增加体重。在早期研究中未观察到体重下降。没有毒性体征，如脱发、无食欲等。血细胞计数无变化，包括红细胞、血小板、白细胞、绝对的淋巴细胞计数或绝对的嗜中性粒细胞计数。为了分析骨髓的细胞构成，检查来自经3G4或BBG3处理的小鼠(6次注射，100μg)的骨髓石蜡切片的总细胞含量和细胞组成。被处理动物内的骨髓基本上完全是细胞的(正如对年轻哺乳动物所预期的一样)。红血球、粒细胞、淋巴细胞前体和巨核细胞都以正常数目存在。
总之，在持续2-3周、每周用高剂量3G4(0.1mg)处理3次的200多只小鼠中未观察到毒性情况的发生。即使剂量高达2mg，也未观察到毒性迹象。小鼠保持正常的体征、骨髓细胞构成、白细胞计数、组织学和凝血功能。
还在安全性研究中将3G4抗体施用于猴子中，也未观察到副作用。
还在小鼠中进行了血液清除的动力学研究。用Bolton Hunter药剂放射性碘标记3G4并静脉内注射入小鼠(25g)。在多个稍后的时间点从尾静脉取血样。3G4的血液清除速率是小鼠中小鼠I gG的特征性方式。清除的α-阶段中的半衰期是3小时，而β-阶段中的半衰期是5天。分布体积是正常的(100ml/kg)。这些研究表明3G4不与正常的宿主组织相互作用，导致其清除加速。
E.抗病毒作用
3G4抗体还发挥了显著的抗病毒作用。如实施例XIII中所观察到的，用3G4对RSV感染细胞进行处理的效果优于用3SB所观察到的效果。因此这些结果突出了3G4抗体超过文献中著名的抗PS抗体3SB(Rote等，1993)的优越之处。
3G4抗体还显示出对抑制CMV非常有效，在体外(实施例XII)和在增加体内mCMV感染小鼠的存活力(实施例XXI)中都是如此。此外，3G4抗体还显示出抑制Pichinde病毒感染，此病毒是拉沙热的传染物(实施例XXIV)。此处显示的病毒感染后的细胞表面PS暴露以及3G4抗体结合牛痘病毒感染细胞的能力(实施例XXIII)，表明了3G4抗体具有作为广谱抗病毒剂的巨大潜能。
实施例XIX
3G4抗体、CDR序列和嵌合体
因此3G4抗体具有抗血管发生、抗肿瘤血管和抗病毒剂的联合特性。3G4对细胞分裂、血管发生、肿瘤生长和病毒传染性的抑制活性以及无明显的毒性，显示出此抗体有广泛的治疗性指征，包括治疗血管发生紊乱、癌症、糖尿病和病毒感染。
可产生与3G4抗体基本上识别相同表位的抗体，以用于抗血管发生、抗肿瘤血管和抗病毒治疗中的一种或多种中，如通过免疫接种并用抗体竞争性试验证实。还可从本文提供的有关3G4抗体序列的知识产生与3G4抗体基本上结合相同表位的抗体。本实施例提供了3G4抗体互补性决定区(CDRs)的序列以及此序列信息的用途。
A.3G4抗体序列
抗体可变区的原始序列是通过RACE方法由产生3G4抗体的杂交瘤获得的，并证实了该序列。3G4抗体CDR1-3重链(Vh)可变区的核酸序列和氨基酸序列分别以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2表示。
如图18A中所示，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2包括部分小鼠前导序列和恒定链序列。前导序列为SEQ ID NO：2的第1位到第19位氨基酸，成熟蛋白的起点如图18A中箭头所示。成熟蛋白质序列至完成VSS的序列部分包括足够的互补性决定区序列信息，其后的氨基酸序列就不是抗原结合所必需的了。因此，核酸序列中的BstEII位点可用作制备功能性小鼠可变区的方便的位点，例如用于移植到人的恒定区上(图18A)。
实践中，利用Lonza pEE载体在BstEII位点已将3G4-2BVH序列移植入人γ1恒定区上。产生的产物包含小鼠前导序列，且其VH以图18A中所示的方式与人CH1序列连接，其中的ASTLGPSVFPLAPSSKSTSG(SEQ ID NO：7)代表人CH1序列的第一部分。
3G4抗体CDR1-3轻链可变区(Vκ)的核酸序列和氨基酸序列分别用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4代表。如图18B中所示，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4还包括部分小鼠前导序列和恒定链序列。前导序列为SEQIDNO：4的第1位到第22位氨基酸，成熟蛋白的起点如图18B中箭头所示。成熟蛋白质序列至完成TVF的序列部分包括足够的互补性决定区序列信息，其后的氨基酸序列就不是抗原结合所必需的了。因此，核酸序列中的BbsI位点可用作制备功能性小鼠可变区的方便的位点，例如用于移植到人的恒定区上(图18B)。
实践中，利用Lonza pEE载体在BbsI位点已将3G4-2BVL序列移植入人κ恒定区上。产生的产物包含小鼠前导序列，且其VL以图18B中所示的方式与人CL1序列连接，其中的IFPPSDEQLKSGTAS(SEQ ID NO：8)代表人κ恒定区序列的第一部分。
B.3G4嵌合抗体的产生和表征
已产生了含小鼠互补性决定区和人恒定区的嵌合构建体(ch3G4)，并显示出其表现基本上与原始小鼠抗体相同。
将小鼠3G4抗体转变成人-小鼠嵌合抗体(Avanir(Xenerex)Biosciences，San Diego，CA)。克隆小鼠VH并在Lonza2BVH载体的BstEII位点植入人的γ1恒定区。克隆小鼠Vκ并在Lonza2BVL载体的BbsI位点植入人的κ恒定区。证实序列。整个构建体在CHO细胞中表达并纯化。
产生的ch3G4至少与小鼠3G4同样优良地结合磷脂包被的ELISA平板。嵌合3G4与多种磷脂的体外结合概况如图21所示，其中与PS、PA、CL、PI和PG的结合显得相似。结合是抗原特异性的，因为未观察到与无关特异性的对照抗体的结合。在某些试验中，观察到嵌合3G4有明显高于3G4抗体的结合；这可能是由于二抗的良好结合所造成的。
在体内，ch3G4定位于肿瘤血管内皮且发挥抗肿瘤作用。ch3G4在生长于小鼠内的MDA-MB-435人乳癌细胞中的抗肿瘤作用如实施例XI中所述和图8G中所示。与对照相比，用嵌合抗体治疗患MDA-MB-435肿瘤的小鼠有效延缓了肿瘤的生长。
在小鼠中生长的MDA-MB-435人乳癌细胞中检查ch3G4的定位。将生物素化的ch3G4或无关特异性的对照IgG静脉内注射入小鼠。1小时后，处死小鼠，摘除肿瘤，冷冻切片。使生物素化药剂首先与链霉亲和素-Cy3缀合物一起保温，用PBS洗，然后与MECA32抗体保温，再与FITC标记的二抗保温。分别用针对Cy3(红色)和FITC(绿色)的适当滤镜通过数码相机拍摄单一图像并传送到计算机上。借助Metaview软件将显示黄色(融合绿色和红色荧光的产物)的会聚图像叠加。
在此双染色方法中，生物素化蛋白质和血管内皮被红色和绿色所标记。其中生物素化蛋白质与内皮结合，会聚的图像呈现黄色。如图22中所示，生物素化的ch3G4结合肿瘤血管内皮，因为此染色模式汇合了MECA32的染色模式。
实施例XX
3G4抗体与多西他赛的组合疗法
本实施例涉及将3G4抗体和化疗药物多西他赛联合用于肿瘤治疗的疗法。这些药剂被设计成攻击肿瘤血管结构的内皮细胞和肿瘤细胞区室，产生协同疗法，同时毒性较低。结果显示此组合疗法确实显著增强了疗效。
A.Fc结构域介导的抗肿瘤作用
检测3G4抗体在体外肿瘤细胞上的抑制作用。未观察到对肿瘤细胞有直接的抑制作用。因此，有可能3G4抗体的抗肿瘤作用涉及Fc介导的免疫效应器功能的增强，诸如抗体介导的胞噬作用、ADCC、CDC和细胞因子产生的刺激作用或这些机制的联合。
已检测了3G4对巨噬细胞吞噬PS阳性细胞的影响作用。用H2O2处理荧光肿瘤细胞以诱导PS暴露。然后收获处理和未处理细胞，并与3G4抗体或对照抗体(BBG)接触。然后加入小鼠骨髓巨噬细胞，用荧光显微镜分析巨噬细胞吞噬荧光肿瘤细胞的能力。
经测定，3G4能将巨噬细胞对PS阳性细胞的胞噬作用提高3倍以上(图23)。此发现支持了发明者的推论，即3G4抗体的Fc结构域有助于抗体的抗肿瘤效用。也就是说，Fc结构域激活了宿主的免疫效应物功能，然后后者发挥了抗肿瘤作用。因此3G4抗体增强了NK细胞的溶胞活性，导致了更有效的ADCC。
B.多西他赛诱导内皮细胞上的PS暴露
通过FACS分析体外检测亚临床浓度的多西他赛对内皮细胞上PS暴露的诱导。用10nM多西他赛处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人微血管内皮细胞(HMVEC)24小时，然后进行FACS检测。与未处理细胞相比，处理过的HUVEC和HNVEC二者都显示出3G4结合的显著增加(分别见图24A和图24B)。还进行了48和72小时的多西他赛保温。
C.多西他赛诱导肿瘤细胞上的PS暴露
还利用一组肿瘤细胞系通过FACS检测了亚临床浓度多西他赛在体外对PS暴露的诱导。用10nM多西他赛处理小鼠lewis肺癌3LL、小鼠结肠癌Colo26和人乳癌MDA-MB-435细胞24小时，然后进行FACS检测。与未处理细胞相比，所有测试肿瘤细胞系都显示出3G4结合的显著增加(分别见图25A、图25B和图25C)。还进行了48和72小时的多西他赛保温。进一步检查了小鼠黑素瘤B16和小鼠纤维肉瘤MethA肿瘤细胞系，与未处理细胞相比，它们也显示出3G4结合的显著增加。
用10nM多西他赛处理人乳癌MDA-MB-231细胞24小时，并与嵌合3G4抗体(ch3G4)或对照-人IgG一起保温，然后进行FACS检测。这些结果显示了抗体结合的显著增加是抗原特异性的，且嵌合抗体的表现与亲本3G4抗体相似(图26)。
D.3G4和多西他赛的协同肿瘤疗法
发明者由此证明了用亚临床浓度的多西他赛处理内皮细胞和肿瘤细胞显著增强了3G4的结合。他们还证明了3G4抗体促进了巨噬细胞介导的对PS暴露于其表面的肿瘤细胞的胞噬作用。因此，由多西他赛介导的3G4结合的增加增强了肿瘤细胞的胞噬作用和由3G4抗体Fc结构域介导的其它抗肿瘤作用，诸如提高了NK细胞的裂解活性，从而导致更有效的ADCC。其它研究也显示出用多西他赛处理乳癌患者导致了血清IFN-γ、IL-2、IL-6和GM-CSF细胞因子水平的增高和NK及LAK细胞活性的增强(Tsavaris等，2002)。
因此在携带人MDA-MB-435乳癌的SCID小鼠的同位模型中检测3G4与多西他赛组合疗法的抗肿瘤作用。将3G4单独(100μg/剂)、多西他赛单独(10mg/kg)或3G4与多西他赛联合(分别为100μg/剂和10mg/kg)经腹膜内途径处理携带同位人MDA-MB-435乳房肿瘤的小鼠，持续3周，每周施药3次。在肿瘤细胞植入6天后开始处理。
这些研究显示了3G4加多西他赛的组合疗法导致了90％的生长抑制。3G4加多西他赛的生长抑制作用显著高于3G4单独处理(p<0.005)和多西他赛单独处理(p<0.01)。
E.3G4将凋亡的肿瘤细胞靶向于树突细胞上的FcγR
与对照肿瘤相比，来自用3G4加多西他赛处理后的小鼠的肿瘤还包含不常见量的淋巴细胞。尽管此现象可能代表了典型的分解肿瘤细胞对免疫细胞的化学引诱作用，它可能还反映了通过Fc结合免疫效应细胞上的FcγR而介导的3G4对免疫系统的活化。
为了鉴定施用3G4和多西他赛对肿瘤内免疫细胞浸润的影响，可以利用针对巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、NK细胞和活化淋巴细胞特异性标记的抗体通过对肿瘤组织的冰冻切片和/或石蜡切片的免疫染色鉴定这些浸润物中存在的细胞类型(Pharmingen，San Diego，CA)。可以将此浸润物的程度、表型和活化状态进行分级。由浸润的免疫细胞产生的细胞因子，包括IL-2和INF的量，还可通过免疫组化技术进行分析。血清细胞因子水平可通过ELISA进行评估，可用细胞内染色鉴定负责细胞因子产生的特殊细胞区室。因此可以全身性的评估浸润免疫细胞对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。
根据前述资料，发明者进一步考虑了增强乳癌免疫疗法效力的方法，即通过3G4介导的将凋亡肿瘤细胞靶向于树突细胞上的Fcγ受体(Fc(γ)R)。诱导有效的细胞和体液免疫反应的有效抗原呈递对于开发肿瘤疫苗和免疫疗法是重要的。树突细胞(DC)是引发抗肿瘤相关抗原的细胞毒性T淋巴细胞的最强的抗原呈递细胞(APC)。树突细胞(DC)对肿瘤抗原呈递的促进应会导致开发出更强的肿瘤疫苗。
通过Fc(γ)R受体介导的DC内在化的抗原呈递与流态抗原胞饮作用相比可提高达1000倍。凋亡肿瘤细胞(ATC)是树突细胞负载抗原的极好来源，因为多种肿瘤特异性抗原(已知和未知的)可有效呈递于天然T细胞上，由于封闭了某些表位而降低了出现免疫逃逸变体的可能性。在动物实验中，用ATCs脉冲的DCs已显示出在体外和体内产生了强的抗肿瘤免疫力。不过，最近的资料已证实单独使用ATCs在某种程度上对激活抗肿瘤免疫力无效，可能是由于它们的摄取不足且不能诱导DC成熟。
最近的研究还证明了通过抗肿瘤抗体与凋亡肿瘤细胞的结合所形成的ATC-免疫复合物可被靶向于DC上的Fc(γ)R。与单独使用ATC相比，ATC-免疫复合物更有效的被DC内在化，更有效的诱导DC活化和成熟，更重要的是，ATC-免疫复合物能显著增加MHCI和II限制性抗原呈递，因此诱发了强的抗肿瘤T辅助物和CTL免疫力。
发明者因此设想用本发明的抗PS抗体增强体液和细胞的抗肿瘤免疫力，并提高基于ATC的DC肿瘤疫苗的效力。由于PS是凋亡肿瘤细胞上普遍的和最丰富的特异标记，本发明的抗体组，尤其是3G4，可结合ATC上的PS。发明者还证明了通过Fc(γ)R介导的3G4-ATC复合物的内在化，3G4可以增加DC对凋亡肿瘤细胞的摄取达300％。通过增强Fc(γ)R介导的DC对ATC的摄取，可以推断3G4和类似抗体能大大增强MHCI和II限制性抗原呈递，诱导强的体液和细胞抗肿瘤免疫力，并提高基于ATC的DC肿瘤疫苗的效力。这可以通过测定负载了3G4-ATC免疫复合物的DC诱导Th1、CTL和体内抗体反应的效力，以及测定用负载了3G4-ATC免疫复合物的DC进行体内免疫所诱导的抗肿瘤免疫力的效力来加以证实。
实施例XXI
抗PS抗体治疗体内CMV感染
在实施例XII中所示的体外针对CMV的抗病毒作用之后，本实施例证明了感染小鼠型CMV病毒-mCMV的小鼠存活率的提高。
用5 x 105pfu的mCMV RVG102腹膜内注射感染Balb/C小鼠(6周龄，每组5只小鼠)。在第1天用3G4抗体(1mg/只小鼠)或上述人-鼠嵌合抗体ch3G4(1mg/只小鼠)腹膜内注射小鼠。未处理的小鼠用作对照。之后每4天以0.5mg/只小鼠的量用抗体或嵌合抗体处理小鼠，直至第26天。感染后90天监测小鼠的存活。
用亲本和嵌合形式的3G4抗体进行处理导致mCMV感染小鼠成活率的提高。用3G4或ch3G4处理的小鼠存活率分别为100％和80％，与之相比，未处理小鼠中只有25％的小鼠在感染中存活(图27)。
实施例XXII
PE结合肽衍生物治疗体内CMV感染
除了实施例XVII中所示的针对CMV的体外抗病毒作用外，本实施例证实了耐久霉素-生物素衍生物DLB提高了被mCMV感染的小鼠的存活率。
用5 x 105pfu的mCMV RVG102腹膜内注射感染Balb/C小鼠(6周龄，每组5只小鼠)。在第1天和每4天用20μg/只小鼠剂量的耐久霉素衍生物DLB腹膜内注射小鼠。未处理的小鼠用作对照。感染后90天监测小鼠的存活率。
用耐久霉素-生物素衍生物DLB进行的处理提高了mCMV感染小鼠的存活率。用DLB处理的小鼠存活率为100％，与之相比，未处理小鼠只有25％的小鼠在感染中存活(图28)。
实施例XXIII
抗PS抗体与病毒感染细胞相结合
本实施例显示了病毒感染诱发了PS在细胞表面的暴露且抗PS抗体结合病毒感染细胞。正如FACS分析中所证实的嵌合抗体与细胞表面结合的增加所显示的，感染了牛痘病毒的细胞变成PS阳性。
以高感染复数2用经胰酶处理的牛痘病毒感染U937细胞。简而言之，用等体积的胰酶0.25mg/ml在37℃处理牛痘病毒30分钟。将病毒加入U937细胞中，总体积0.5ml。1.5小时后，将新鲜的培养基加入细胞中，并在T25摇瓶中37℃保温细胞2天。未感染的细胞用作对照。
用一抗对感染和未感染的U937细胞染色，并用嵌合3G4抗体(ch3G4)或用人IgG(HIgG)作为对照。漂洗细胞，用正常的小鼠血清封闭，然后用一抗在冰上染色45分钟。漂洗3次后，用1：400稀释的山羊抗人FITC缀合二抗对细胞染色并在FACScan上进行分析。
FACS分析的结果显示，与在未感染U937细胞上获得的结果相比(图29A，右峰(绿色))，牛痘病毒感染的U-937细胞上的ch3G4有显著的改变(图29B，右峰(绿色))。因此此试验显示了用牛痘病毒感染细胞导致了细胞表面上的PS暴露，且嵌合形式的抗PS抗体3G4能结合这些病毒感染细胞。
实施例XXIV
抗PS抗体针对Pichinde病毒的抗病毒作用
除了针对CMV和RSV的抗病毒作用外，本实施例进一步证明了抗PS抗体体外抑制Pichinde病毒感染。Pichinde病毒是新世界沙粒病毒，它在人类中是非致病的，并用于拉沙热的动物模型中。
以低感染复数0.01pfu/个细胞用Pichinde病毒感染后，用3G4抗体或同种型匹配的对照抗体GV39G处理汇合的Vero细胞单层。简而言之，将细胞与病毒以1ml/孔的总体积37℃保温90分钟。感染期间，每30分钟轻轻旋转平板一次。感染后，去除细胞上清液并将DMEM/10％FBS/pen-strep加入各孔中(2ml/孔)。第2天，用胰酶消化收获细胞并使其贴附于Biocoat容器载片上。将载片固定，用多克隆兔抗PIC血清及随后加入的生物素缀合的山羊抗兔二抗染色(单独使用二抗不产生染色，如图30C所示)。对每100个细胞的视野计数被感染细胞的数目进行计数。
在用3G4处理过的细胞内，病毒局限于染成黑红色的单细胞中，数量大约是100个细胞中有1个(图30A)。这些可能是最初被病毒感染的细胞，如用CMV所观察到的一样(实施例XII)。不过，在用对照GV39G抗体处理的细胞中，病毒扩散且感染了所有细胞(图30B)。
此病毒复制的抑制模式类似于用3G4处理CMV感染的人成纤维细胞所观察到的。因此，根据图30D中所定量的，抗PS抗体3G4有效阻止了Pichinde病毒在细胞间的传播。
实施例XXV
用PE结合型肽衍生物进行肿瘤治疗
除了耐久霉素衍生物在体外和体内的抗病毒作用外，本实施例还证明了耐久霉素衍生物对肿瘤血管系统的定位和相关的抗肿瘤作用。
A.用耐久霉素-HuIgG缀合物进行肿瘤治疗
首先如实施例XV所述纯化人IgG(HIgG)。用SIAB接头连接纯HIgG和耐久霉素，并纯化产生的(D-SIAB)nHIgG缀合物。
培养小鼠纤维肉瘤细胞系MethA，在对数期收获并重悬于DPBS中。将约106个MethA肿瘤细胞皮下注射入6-8周龄BALB/c雄性小鼠背中部。植入5天后，将小鼠随机分成两组(n＝15)。从第10天开始，一组持续2周通过腹膜内注射接受150μg耐久霉素-HuIgG缀合物。另一组接受相等量的HuIgG作为对照。每周两次检查肿瘤体积并用公式1/2ab2(其中“a”是肿瘤的长轴，而“b”是短轴)计算。待肿瘤长至约1400mm3大小时处死小鼠。
与人IgG对照相比，耐久霉素-HIgG缀合物在150μg/天的剂量下抑制了BALB/c小鼠中MethA肿瘤的生长(图31)。
B.耐久霉素-HuIgG缀合物定位于肿瘤血管系统
利用与上文相同的MethA小鼠肿瘤模型，当肿瘤大小达到500mm3时，通过尾静脉注射溶于100μl PBS中的100μg(D-SIAB)nHIgG。注射相同量的人IgG作为对照。4小时后，处死小鼠并用正常的盐水灌注5分钟并用1％的低聚甲醛灌注10分钟。切下肿瘤和其它主要器官并在液氮中速冻。用OCT包埋后，将组织冰冻切片成10μm厚度的切片并放置于硅烷化的载片上。在冷丙酮中固定10分钟后，载片用标记了过氧化酶的山羊抗人IgG染色，以检测耐久霉素-HuIgG的生物分布。用Meca32和标记了过氧化酶的山羊抗大鼠IgG检测组织的血管结构。
此研究表明耐久霉素-HIgG缀合物定位于被处理动物的肿瘤血管系统。
实施例XXVI
耐久霉素缀合物的生物分布和特性
本实施例证实了细胞不透性耐久霉素衍生物在体外无毒性、体内给予的耐久霉素衍生物的生物分布和耐久霉素抗体缀合物增强巨噬细胞对凋亡细胞的胞噬作用的能力。
A.耐久霉素-生物素缀合物是无细胞毒性的
本发明的耐久霉素衍生物和缀合物被设计成使亲本耐久霉素分子的非特异性毒性影响最小化的形式。在许多实施例中，通过将耐久霉素与细胞不透性基团连接来达到此目的(实施例XV)。
如实施例XV所述制备生物素化的耐久霉素构建物DLB。用MTT检测法测试未修饰的耐久霉素化合物和DLB对HUVEC的细胞毒性作用。未修饰的耐久霉素显示出剂量依赖型毒性，而DLB是无毒性的，与未处理对照相符(图32)。
B.耐久霉素-生物素缀合物定位于肺中的巨噬细胞
培养人乳癌细胞系MDA-MB-435，在对数期收获并重悬于DPBS中。将约107个细胞注射入6-8周龄雌性无胸腺裸鼠的乳房脂垫中。通过尾静脉注射溶于100μl PBS中的100μg耐久霉素-生物素。4小时后，处死小鼠，用正常的盐水灌注5分钟并用1％的低聚甲醛灌注10分钟。切下包括心、肺、肝、肾、脑、肠、睾丸和脾在内的主要器官并在液氮中速冻。用OCT包埋后，将组织冰冻切片成10μm厚度的切片并放置于硅烷化的载片上。在冷丙酮中固定10分钟后，载片用标记了Cy3的链霉亲和素染色来检测耐久霉素-生物素构建物的生物分布。用Meca32和FITC标记的山羊抗大鼠IgG检测组织的血管结构。
将耐久霉素-生物素缀合物静脉内注射入携带MDA-MB-435肿瘤的裸鼠导致了药物在肿瘤细胞、肾小管和肺内巨噬细胞中的沉积。在肝中沉积最少，而在脑、肠、睾丸中无可检测到的分布。对肺内巨噬细胞的定位可应用于本发明的抗病毒实施方案中。
C.耐久霉素-抗体缀合物增强了对凋亡细胞的胞噬作用
然后对耐久霉素-抗体缀合物(耐久霉素-C44，DuC44)增强吞噬凋亡细胞的能力进行了研究。
从小鼠骨髓中分离巨噬细胞并进行人工培养。用于BM巨噬细胞分离、培养和刺激的培养基是含2mM谷氨酰胺、0.37％(w/v)NaHCO3、10％(v/v)热灭活FCS和0.5ng/ml小鼠GM-CSF的DMEM。通过25号针头用完全培养基直接冲洗从切下的股骨中洗下骨髓细胞。然后在完全培养基中将细胞调整成约3 x 105个细胞/ml的密度，并在8孔区室载片中分配成0.5ml的等份。
将细胞于37℃在含5％CO2的潮湿容器内培养，以使巨噬细胞粘附并铺展。通过下述方法去除未贴附的细胞：在每孔中加入5ml温热的PBS，适度弹击平板重悬未粘附细胞，然后轻弹载片去除未贴附的细胞。此漂洗共进行3次。将细胞于37℃在含7.5％(v/v)CO2的气氛中保持5天。每隔1天换一次完全培养基，直至细胞被使用。
以下方法用于以荧光细胞示踪剂标记HL-60靶细胞。临用前现配10mM CFDA SE贮液，即将一小瓶染料内容物溶于90μl DMSO中并用PBS稀释至10μM。离心获取HL-60细胞沉淀并吸出上清液。将细胞重悬于CFDA/PBS中并在37℃保温15分钟。将样品离心并吸出上清液。细胞重悬于培养基中并再保温30分钟。细胞活力和荧光被证实超过95％。
在此胞噬作用检测中，将标记的HL-60细胞在UV254nm暴露5分钟，然后在37℃保温1小时以诱导凋亡。将104个凋亡的HL-60细胞与巨噬细胞保温1小时。加入10μg/ml浓度的耐久霉素-C44缀合物。将相同浓度的小鼠抗体BBG3用作阴性对照，还包括3G4抗体用于对比。在最后45分钟向培养基中加入10μg/ml的Hoechst 33342。
用PBS洗载片3次，在4％低聚甲醛中固定15分钟。载片用稀释于0.2％明胶中的大鼠抗小鼠CD11抗体(CD11是巨噬细胞的标记)染色1小时，漂洗并用Texas红标记的山羊抗大鼠二抗染色。
在荧光显微镜下分析细胞。由于有CD11标记，巨噬细胞被识别为红色的细胞。由于靶细胞中的荧光示踪剂，已吞噬了凋亡细胞的巨噬细胞被识别为绿色细胞。对红色和绿色细胞进行计数，胞噬作用以摄取呈阳性的巨噬细胞百分数量化。
此研究表明，耐久霉素-抗体缀合物DuC44增强了巨噬细胞对凋亡HL-60细胞的胞噬作用(图33)。因此，耐久霉素部分结合凋亡细胞的表面，使缀合物中突出的抗体部分被巨噬细胞识别。耐久霉素-抗体缀合物由此发挥了与3G4抗体相似的功能。正如所预期的，缺少Fc区域的3G4抗体(Fab)2片段不诱发高于对照水平的胞噬作用。
由于早期研究显示耐久霉素-生物素缀合物在体内施用后定位于肺中的巨噬细胞，本试验中所显示的对巨噬细胞介导的凋亡细胞胞噬作用的刺激在本发明的治疗用途中具有重要的含义，诸如治疗肺部的病毒感染。
无需过多实验，根据本公开书即可以制备和执行本文公开和要求的所有组合物和方法。在以优选实施方案的形式描述了本发明的组合物和方法之后，对于本领域技术人员显而易见的是，可以在本文所述的组合物、方法、和方法的步骤或一系列步骤中采用变异，而不偏离本发明的概念、精神、和范围。更具体的说，显而易见的是，可以用涉及化学和生理学的某些药剂替代本文所述的药剂而仍获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员而言显而易见的所有这些相似替代和修饰，被认为是属于由所附权利要求书定义的本发明的精神、范围和概念之内。
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本文特别收入下列参考文献作为参考，它们提供了例示性方案或其它细节作为本说明书的补充。
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Figure C03816751D0281195753QIETU
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序列表
<110>The University of Texas System
     Thorpe，Philip E.
     Soares，M.Melina
     Huang，Xianming
     He，Jin
     Ran，Sophia
<120>与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的选定抗体和耐久霉素肽
     以及它们在治疗病毒感染和癌症中的用途
<130>4001.003010
<140>PCT/US03/21925
<141>2003-07-15
<150>60/396,263
<151>2002-07-15
<160>9
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>519
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>1
Figure C03816751D02831
<210>2
<211>152
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>2
Figure C03816751D02841
<210>3
<211>435
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>3
Figure C03816751D02851
<210>4
<211>144
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>4
Figure C03816751D02852
<210>5
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>5
<210>6
<211>261
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>多肽
<400>6
Figure C03816751D02871
<210>7
<211>20
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
Figure C03816751D02881
<210>8
<211>15
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
Figure C03816751D02882
<210>9
<211>19
<212>PRT
<213>Streptomycescinnamoneus
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(18)
<223>Xaa＝Abu
<400>9
Figure C03816751D02883

Claims (58)

1.包含抗病毒免疫缀合物的组合物，该抗病毒免疫缀合物包含可与氨基磷脂结合的抗体或其抗原结合片段，其中所说的抗体或其抗原结合片段可操作性地连接了抗病毒剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述抗体可结合磷脂酰乙醇胺。
3.权利要求1的组合物，其中所述抗体可结合磷脂酰丝氨酸。
4.权利要求3的组合物，其中所述抗体可与磷脂酰丝氨酸结合，并与保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4有效地竞争结合磷脂酰丝氨酸。
5.权利要求3的组合物，其中所述的抗体可与磷脂酰丝氨酸结合，该结合可通过如下ELISA方案来检测：
-用磷脂酰丝氨酸(PS)如下包被96孔板：
-将所述PS贮液在正己烷中稀释至10μg/ml并混合均匀；
-向每孔中添加50μl并使其蒸发1小时；
-在每个孔中添加200μl封闭缓冲液，覆盖并室温放置2小时或在4℃过夜，其中所述封闭缓冲液是溶于PBS中的10％牛血清；
-用PBS漂洗平板3次；
-添加稀释在封闭缓冲液中的测试样品一抗并在37℃温育2小时；
-用PBS漂洗3次；
-添加100μl/孔二抗并在37℃保温1小时；
-用PBS漂洗平板3次；
-通过加入100μl显影溶液到各孔中进行ELISA显影，显影10分钟，然后在各孔中加入100μl终止液并读取490nm处的O.D.值，
-所述标准封闭缓冲液是溶于PBS中的10％牛血清，
-所述显影溶液是：10ml的0.2M Na2PO4，10ml的0.1M柠檬酸和一片10mg的OPD和10μl过氧化氢，
-所述终止液是0.18M H2SO4。
6.一种组合物，其包含第一抗病毒剂，其中该第一抗病毒剂是可与氨基磷脂结合的第一抗体或其抗原结合片断，或该第一抗体或其抗原结合片段的抗病毒免疫缀合物；以及至少另一种不同的第二抗病毒剂。
7.权利要求6的组合物，其中所述抗体可结合磷脂酰乙醇胺。
8.权利要求6的组合物，其中所述抗体可结合磷脂酰丝氨酸。
9.权利要求8的组合物，其中所说的抗体可与磷脂酰丝氨酸结合，并与保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4有效地竞争结合磷脂酰丝氨酸。
10.权利要求9的组合物，其中所述抗体进一步地可结合磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂，并与保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4有效地竞争结合磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂。
11.权利要求9的组合物，其中所述抗体进一步地可结合磷脂酰乙醇胺。
12.权利要求9的组合物，其中所说的抗体具有与保藏为ATCC PTA4545的单克隆抗体3G4相同的如表4中所示的磷脂结合特性。
13.权利要求9的组合物，其中所说的抗体对磷脂酰丝氨酸的亲和力至少与如表3中所示的保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4对磷脂酰丝氨酸的亲和力相等。
14.权利要求9的组合物，其中所说的抗体具有与保藏为ATCC PTA4545的单克隆抗体3G4相同的如表4中所示的磷脂结合特性，并且对磷脂酰丝氨酸的亲和力至少与如表3中所示的保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4对磷脂酰丝氨酸的亲和力相等。
15.权利要求9的组合物，其中所述的抗体是通过包括下述步骤的方法制备的：用活化内皮细胞免疫动物，并从被免疫动物中选择出可与磷脂酰丝氨酸结合并与保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4有效地竞争结合磷脂酰丝氨酸的抗体。
16.权利要求8的组合物，其中所述的抗体可与磷脂酰丝氨酸结合，该结合可通过如下ELISA方案来检测：
-用磷脂酰丝氨酸(PS)如下包被96孔板：
-将所述PS贮液在正己烷中稀释至10μg/ml并混合均匀；
-向每孔中添加50μl并使其蒸发1小时；
-在每个孔中添加200μl封闭缓冲液，覆盖并室温放置2小时或在4℃过夜，其中所述封闭缓冲液是溶于PBS中的10％牛血清；
-用PBS漂洗平板3次；
-添加稀释在封闭缓冲液中的测试样品一抗并在37℃温育2小时；
-用PBS漂洗3次；
-添加100μl/孔二抗并在37℃保温1小时；
-用PBS漂洗平板3次；
-通过加入100μl显影溶液到各孔中进行ELISA显影，显影10分钟，然后在各孔中加入100μl终止液并读取490nm处的O.D.值，
-所述显影溶液是：10ml的0.2M Na2PO4，10ml的0.1M柠檬酸和一片10mg的OPD和10μl过氧化氢，
-所述终止液是0.18M H2SO4。
17.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所说的抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段。
18.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所说的抗体是scFv、Fv、Fab’、Fab、二体、线性抗体或抗体的F(ab’)2抗原结合片段，或者CDR、单价片段、骆驼源化或单一结构域抗体。
19.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、部分人抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、重组抗体或基因工程化抗体或者其抗原结合片段。
20.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述抗体包含至少第一可变区，该可变区包括具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的氨基酸序列区，或者SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的变体或诱变形式，其中所述变体或诱变形式保持了与磷脂酰丝氨酸的结合。
21.权利要求20的组合物，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸序列区，该轻链可变区包含含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸序列区。
22.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述抗体包含重链可变区或轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸位点31-35(CDR H1)、50-56(CDR H2)和95-102(CDR H3)的互补决定区(CDR)的氨基酸残基，该轻链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸位点24-34(CDRL1)、50-56(CDR L2)和89-97(CDR L3)的互补决定区(CDR)的氨基酸残基。
23.权利要求22的组合物，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸位点31-35(CDR H1)、50-56(CDR H2)和95-102(CDR H3)的CDR的氨基酸残基，该轻链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸位点24-34(CDR L1)、50-56(CDR L2)和89-97(CDR L3)的CDR的氨基酸残基。
24.权利要求1-16、21和23中任一项的组合物，其中所述抗体是保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4。
25.权利要求1-16、21和23中任一项的组合物，其中所述的组合物是隐蔽的或PEG化的脂质体组合物，其上包被了所述抗体或其抗原结合片段，或该抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物。
26.权利要求25的组合物，其中所述的隐蔽的或PEG化的脂质体还包含额外的治疗剂。
27.权利要求1-16、21、23和26中任一项的组合物，其中所述组合物是药物上可接受的组合物。
28.权利要求1-16、21、23和26中任一项的组合物，其中所述组合物还包含额外的治疗剂。
29.权利要求1-16、21、23和26中任一项的组合物，其中所述抗病毒剂是核苷、逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂。
30.权利要求29的组合物，其中所述抗病毒剂是西多福韦或AZT。
31.权利要求1-16、21、23、26和30中任一项的组合物，用于治疗中。
32.权利要求1-16、21、23、26和30中任一项的组合物，用于治疗或预防病毒感染。
33.权利要求1-32中任一项的组合物在制备可用于治疗或预防病毒感染或疾病的药物中的用途。
34.可结合氨基磷脂的抗体或其抗原结合片段，或该抗体或其结合片段的抗病毒免疫缀合物在制备可用于治疗或预防病毒感染或疾病的药物中的用途。
35.权利要求34的用途，其中所述抗体可结合磷脂酰乙醇胺。
36.权利要求34的用途，其中所述抗体可结合磷脂酰丝氨酸。
37.权利要求36的用途，其中所说的抗体可与磷脂酰丝氨酸结合，并与保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4有效地竞争结合磷脂酰丝氨酸。
38.权利要求37的用途，其中所述抗体进一步地可结合磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂，并与保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4有效地竞争结合磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂。
39.权利要求37的用途，其中所述抗体进一步地可结合磷脂酰乙醇胺。
40.权利要求37的用途，其中所说的抗体具有与保藏为ATCC PTA4545的单克隆抗体3G4相同的如表4中所示的磷脂结合特性。
41.权利要求37的用途，其中所说的抗体对磷脂酰丝氨酸的亲和力至少与如表3中所示的保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4对磷脂酰丝氨酸的亲和力相等。
42.权利要求37的用途，其中所说的抗体具有与保藏为ATCC PTA4545的单克隆抗体3G4相同的如表4中所示的磷脂结合特性，并且对磷脂酰丝氨酸的亲和力至少与如表3中所示的保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4对磷脂酰丝氨酸的亲和力相等。
43.权利要求37的用途，其中所述的抗体是通过包括下述步骤的方法制备的：用活化内皮细胞免疫动物，并从被免疫动物中选择出可与磷脂酰丝氨酸结合并与保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4有效地竞争结合磷脂酰丝氨酸的抗体。
44.权利要求36的用途，其中所述的抗体可与磷脂酰丝氨酸结合，该结合可通过如下ELISA方案来检测：
-用磷脂酰丝氨酸(PS)如下包被96孔板：
-将所述PS贮液在正己烷中稀释至10μg/ml并混合均匀；
-向每孔中添加50μl并使其蒸发1小时；
-在每个孔中添加200μl封闭缓冲液，覆盖并室温放置2小时或在4℃过夜，其中所述封闭缓冲液是溶于PBS中的10％牛血清；
-用PBS漂洗平板3次；
-添加稀释在封闭缓冲液中的测试样品一抗并在37℃温育2小时；
-用PBS漂洗3次；
-添加100μl/孔二抗并在37℃保温1小时；
-用PBS漂洗平板3次；
-通过加入100μl显影溶液到各孔中进行ELISA显影，显影10分钟，然后在各孔中加入100μl终止液并读取490nm处的O.D.值，
-所述显影溶液是：10ml的0.2M Na2PO4，10ml的0.1M柠檬酸和一片10mg的OPD和10μl过氧化氢，
-所述终止液是0.18M H2SO4。
45.权利要求34-44中任一项的用途，其中所说的抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段。
46.权利要求34-44中任一项的用途，其中所说的抗体是scFv、Fv、Fab’、Fab、二体、线性抗体或抗体的F(ab’)2抗原结合片段，或者CDR、单价片段、骆驼源化或单一结构域抗体。
47.权利要求34-44中任一项的用途，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、部分人抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、重组抗体或基因工程化抗体或者其抗原结合片段。
48.权利要求34-44中任一项的用途，其中所述抗体包含至少第一可变区，该可变区包括具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的氨基酸序列区，或者SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的变体或诱变形式，其中所述变体或诱变形式保持了与磷脂酰丝氨酸的结合。
49.权利要求48的用途，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸序列区，该轻链可变区包含含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的氨基酸序列区。
50.权利要求34-44中任一项的用途，其中所述抗体包含重链可变区或轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸位点31-35(CDRH1)、50-56(CDR H2)和95-102(CDR H3)的互补决定区(CDR)的氨基酸残基，该轻链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸位点24-34(CDR L1)、50-56(CDR L2)和89-97(CDR L3)的互补决定区(CDR)的氨基酸残基。
51.权利要求50的用途，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸位点31-35(CDR H1)、50-56(CDR H2)和95-102(CDR H3)的CDR的氨基酸残基，该轻链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸位点24-34(CDR L1)、50-56(CDR L2)和89-97(CDR L3)的CDR的氨基酸残基。
52.权利要求34-44、49和51中任一项的用途，其中所述抗体是保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4。
53.权利要求34-44、49和51中任一项的用途，其中所述的组合物是隐蔽的或PEG化的脂质体组合物，其上包被了所述抗体或其抗原结合片段，或该抗体或抗原结合片段的免疫缀合物。
54.权利要求53的用途，其中所述的隐蔽的或PEG化的脂质体还包含额外的治疗剂。
55.权利要求34-44、49、51和54中的任一项的用途，其中所述药物可抑制病毒复制。
56.权利要求34-44、49、51和54中的任一项的用途，其中所述药物可抑制病毒传播。
57.权利要求34-44、49、51和54中任一项的用途，其中所述药物可用于治疗或预防CMV、RSV、肝炎病毒、流感病毒、HIV、疱疹病毒、副粘病毒或沙粒病毒感染。
58.权利要求34-44、49、51和54中任一项的用途，其中所述药物可用于治疗或预防肝炎、流感、AIDS、病毒性肺炎或呼吸道疾病或拉沙热。
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