CN101001646B - 稳定化的合成免疫原投递系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了特别适合于作为佐剂和作为肽免疫原稳定剂的免疫刺激复合物。免疫刺激复合物包含CpG寡核苷酸和生物学活性肽免疫原。免疫刺激复合物是颗粒状的，而且能够将肽免疫原有效呈递给免疫系统细胞从而生成免疫应答。免疫刺激复合物可以配制成用于肠胃外给药的混悬液。免疫刺激复合物还可以配制成w/o乳剂，像联合无机盐混悬液或原位胶凝聚合物的混悬液，用于通过肠胃外给药将免疫原有效投递给受试者的免疫系统细胞从而生成免疫应答，这也可能是保护性免疫应答。

Description

稳定化的合成免疫原投递系统

发明领域

本发明涉及稳定化的免疫刺激复合物和用于制备稳定化的免疫刺激复合物的方法。更具体的说，本发明提供了可用于改善体内免疫应答的疫苗投递系统的稳定化的合成免疫刺激复合物。这些免疫刺激复合物还可用于制备设计作为贮存库而受控释放免疫刺激复合物的疫苗制剂。免疫刺激复合物还可以掺入到设计靶向特定细胞类型以协同改善所引发的免疫应答的质量的制剂中。

发明背景

疫苗在用于预防传染性疾病的预防性组合物中已经成功采用了许多年，最近又在用于治疗癌症和非传染性疾病的治疗性组合物中得到了应用。

传统疫苗衍生自减毒或灭活的病毒或细菌病原体，而且已经证明对疾病诸如脊髓灰质炎病毒和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)非常有效。尽管获得了这些成就，人们仍然越来越关注这些疫苗的安全性。这已经导致衍生自这些病原体的成分或完全合成的肽免疫原的亚基疫苗的发展。

亚基疫苗的范例包括破伤风类毒素和乙型肝炎表面抗原。这些抗原常常具有微弱的免疫原性，而且需要佐剂来改善所获得的免疫应答。出于安全性和调控目的，充分表征的生物学活性化合物诸如合成肽是用于诱导生物学应答的优选物质。然而，这些免疫原并不是最佳的，而且在动物模型中只诱导部分或可忽略的保护性应答。为了在体内诱导有效的免疫应答，合成肽需要稳定化和佐剂化作用。

已经采用了多种方法来保护合成肽免疫原免于由多种过程包括化学和物理途径介导的体外和体内降解。¹(上标数字指更完整描述本发明所述领域的状况的出版物。这些参考文献的内容因此结合作为参考。在这节的结尾可以找到每一篇参考文献的引用。)

已经采用了多种方法来改善肽的溶解性或保护肽免于体内降解。²这些方法通常包括简单步骤如改变溶液的盐浓度和/或pH。还可以化学修饰肽，通过缀合水溶性化合物如聚乙二醇(PEG)或聚环氧乙烷(PEO)来改善它们的水溶性和体内循环时间。³已经证明由PEG或PEO衍生的佐剂能够下调免疫系统。⁴因此，预计经PEG或PEO修饰的肽将不如佐剂那样有效的发挥功能。添加多个赖氨酸而增加肽的电荷能够改善其水溶性，但是通常不能导致免疫原性的改善。

这些各种策略的目标是在疫苗制剂中采用肽时改善体内循环时间或最小化或消除与物理状态(如盐、pH、温度、缓冲类型)和/或化学不相容性有关的免疫原性问题。

Kabanov等人在美国专利号5,656,611⁵中公开了用于稳定多核苷酸或寡核苷酸的聚醚嵌段共聚物，其包括聚阳离子聚合物。采用聚醚嵌段共聚物-多核苷酸复合物来便于转运多核苷酸穿过细胞膜而改善生物学活性。然而，这些多核苷酸-聚醚嵌段共聚物不具有免疫原性，而且不适合于作为疫苗。

Allcock等人在美国专利号5,562,909⁶中描述了由膦腈聚合电解质衍生的免疫佐剂。直接将免疫佐剂与抗原在溶液中混合，而且可以通过喷雾干燥聚合物与抗原的溶液或者通过Cohen在美国专利号5,149,543⁷中描述的方法来制备成微粒。尽管这些系统显示了辅助性增强，然而制备微粒组合物存在困难，因为所采用的繁琐机械过程将难以放大规模而进行商业生产。此外，所形成的聚合物-抗原复合物的稳定性高度依赖于盐浓度和pH条件。

Moss等人在WO91/04052⁸中描述了不同的方法，其中由抗原(其可以是肽)、皂苷和聚阳离子佐剂诸如DEAE-葡聚糖制备了固体疫苗组合物。由这种组合配制的疫苗提供了改善的寿命，使得这些组合适合于用作为植入物。然而，首先必须将抗原化学缀合载体分子并彻底纯化。然后将纯化的抗原-载体联合皂苷和聚阳离子佐剂而提供固体组合物。这种方法无法控制产品的物理特性，诸如颗粒大小。

为了增强免疫应答，已经开发了意欲用于人或牲畜疫苗的许多佐剂和/或基于贮存库的肠胃外、粘膜或经皮肤投递系统。这些包括使用无机盐、油包水(w/o)乳剂、脂质体、聚合微粒、纳米微粒和凝胶/水凝胶。⁹已经进行了采用各种(w/o)乳剂组合物的大量临床试验。

尽管进行了大量的临床研究，皮下或肌肉内给药的典型肠胃外制剂仍是用衍生自铝盐诸如磷酸铝或氢氧化铝的佐剂制备的。铝盐对于基于减毒病原体、灭活病原体和衍生自生物学试剂的亚基抗原的许多疫苗而言是合适且有效的。然而，基于铝的佐剂对于基于合成肽的免疫原而言常常是完全无效的，因为需要大剂量的肽且需要更强的辅佐作用。疫苗组合物中大剂量免疫原与弱佐剂铝的组合并不理想，因为它能够导致免疫原耐受和反应原性，即不希望得到的副作用，诸如注射部位的肿胀和发红。

已经认识到弗氏完全佐剂(FCA)即加热灭活的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)在含表面活性剂的矿物油中的混悬液是最有效的佐剂之一。然而，已经有严重不良反应的记录，由注射部位的轻微发炎至损伤和无菌性脓肿。由于这些不良反应，FCA被禁止用于人和牲畜应用。

因此，显然需要开发没有与明矾或FCA有关的毒物学和/或反应原性问题且能够有效增强肽免疫原的免疫原性并延长其效力的安全佐剂以避免与明矾有关的耐受问题。同样最希望开发在单一组合物中既稳定肽免疫原又辅助免疫应答的组合物和方法。

Jones等人¹⁰公开了两种特异的CpG寡核苷酸，它们可以在Aotus猴中与基于肽的疟疾疫苗共施用而增强免疫应答。在Jones的研究中，所用肽的电离点(IP)是5.96。这符合肽将具有理论零电荷的pH。¹¹根据其氨基酸组成，所用肽在所选水性溶剂的生理学pH将有效放电。因此，两种CpG寡聚物不会发生络合。在w/o乳剂中配制得到的混合物预计将获得瞬时辅佐。为了获得有用水平的免疫原性，可能需要多次注射和大量佐剂。另外，这种组合物的长期稳定性也有问题。事实上，Jones等人公开的CpG寡核苷酸必需大剂量施用，每次注射500μg。此外，用于制备w/o乳剂的方法不易于放大规模而进行商业应用。值得注意的是，Jones等人教导不同的CpG寡聚物可用于不同的哺乳动物物种。例如，一种CpG寡聚物即CpG ODN 1826对小鼠和低等灵长类而言是促有丝分裂的，但对黑猩猩和人而言则不是，而且效果是不可预测的。

Krieg等人在美国专利号6,194,388 B1¹²中描述了未甲基化的CpG寡核苷酸，基于它们在与抗原混合后刺激免疫应答的能力，因而对治疗性应用特别有效。Krieg等人在美国专利号6,207,646 B1¹³中进一步描述了未甲基化的CpG寡核苷酸将Th2应答改向Th1应答的用途。在这两种情况中，CpG寡聚物的效力是通过B细胞刺激显示的，其中B细胞与经硫代磷酸酯修饰的CpG寡聚物一起培养。尚无关于CpG寡聚物如何能够用于提供稳定免疫刺激复合物或疫苗的报道或提议。

深受关注和研究的另一个领域已经聚焦于配制用于其它投递路径诸如粘膜、经皮或口服的合成免疫原的方法。粘膜免疫性是由在外分泌(如肠、支气管或鼻洗物)中发现的分泌性免疫球蛋白(sIgA)的诱导介导的。相信经皮或粘膜投递疫苗对于大多数经粘膜表面进入体内的致病生物将是有效的。例如，口服给药的霍乱疫苗已经显示远远优于肠胃外给药的类似物。¹⁴

Friede等人在WO99/52549¹⁵中教导了可以由抗原与聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯作为主要佐剂的联合物衍生意欲粘膜使用的疫苗组合物。建议靶抗原可以是合成肽。Friede等人还建议将CpG寡核苷酸加到疫苗组合物中以提供改善的应答。他们显示了聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯与CpG寡核苷酸的联合物在与抗原共施用后可以改善粘膜应答。然而，结果显示所述CpG寡核苷酸与抗原的简单混合物缺乏任何辅佐作用。

经皮施用的疫苗代表了最近关注的领域。理想的是，可以采用装置即贴片或无针喷射注射器来靶向皮内郎格罕氏细胞即树突细胞。这些特化细胞负责免疫原的有效加工和呈递，而且可用于直接诱导全身的体液和细胞应答。在有些情况中，通过经皮方法实现了肌肉内免疫。¹⁶例如，最近的一篇论文描述了作为贴片施用的diptheria疫苗。在与佐剂共施用后，对多种组合物都发现了针对diptheria毒素的全身抗体。¹⁷

尽管现有技术已经例示了多种疫苗制剂的潜力，然而用于粘膜或经皮投递的基于合成肽的疫苗制剂的开发存在大量的实践限制。这些包括：

1)粘膜流体或分泌物和/或粘膜表面或皮内蛋白水解酶对免疫原的降解；

2)穿过粘膜上皮或穿过皮层的吸收微不足道；和

3)免疫原被稀释后的浓度低于诱导合适水平免疫应答所需要的浓度。

存在很少的策略能够在单一疫苗组合物中即稳定又辅佐基于合成肽的免疫原。这种组合物对于开发高度有效的肠胃外、粘膜或经皮施用的基于肽的疫苗将是不可缺的。

还希望延长免疫原性应答的持续时间以减少所需要的给药次数。这将改善顺应性和降低接种的全部成本。

可以采用多种方法来辅助基于合成肽的免疫原，但是有效的长期免疫原性应答常常需要载体或贮存库系统。值得注意的实例包括将免疫原吸附到无机盐或凝胶上。例如，将肽免疫原装入聚合基质(整体基质(monolithicmatrix))或凝胶中或者用聚合材料包裹肽免疫原(核-壳)可能是有效的策略。或者，可以将免疫原掺入脂质体或囊泡型制剂中，其中免疫原或是包埋在脂质基质中或是物理束缚于内部水相中。另一种策略可以采用各种比例的基于矿物、植物或动物的油以及免疫原的水溶液来制备油包水(w/o)乳剂或水包油包水(w/o/w)双重乳剂¹⁸。

不同的颗粒大小、形态、表面疏水性和残基表面电荷是需要考虑的取决于制剂的可能变量。已知对于经过肠胃外给药的微米大小颗粒的胞噬作用^19，20和对于口服投递的肠道内淋巴集结的特化M细胞对微粒的摄取^{21， 22}而言，控制这些参量是重要的。类似的，对于进入鼻咽道的鼻相关淋巴组织(鼻内投递靶)而言，这些参量已经显示是重要的。^23，24

Krone等人在美国专利号5,700,459²⁵中描述了微粒形式的由多元酸和多元碱衍生的聚合电解质复合物的使用，其中络合剂是聚合物。描述了这些复合物的多种用途，包括包含抗原或抗原性肽的疫苗组合物。有些组合物是采用潜在生物可降解材料的受控释放制剂。在一个实例中，描述了将抗原掺入聚合电解质复合物微粒的方法。然而，所描述的用于制备微粒的机械过程是繁琐的，将混合物的100μm大小颗粒研磨至大约1-4μm。这将难以放大规模而进行商业生产。

Eldridge等人²⁶开发了由聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯共聚物制造的聚合生物可降解微球体，用于抗原的体内受控释放。公开的用于将抗原包裹到微粒中的聚合物包括聚-D，L-丙交酯、聚乙交酯、聚己酸内酯、聚酐、聚原酸酯和聚(α-羟基丁酸)。

尽管现有技术已经实现了抗原的受控释放，但在通过所述方法制造微粒时还是遭遇到了困难。所述方法难以放大规模。此外，生物学材料暴露于有机溶剂和机械加工能够引起变性和低至适度的包裹效率。另外，亲水性抗原在所述方法中的包裹效率低。

Henry等人在美国专利号5,126,141和5,135,751^27，28中描述了由聚氧化烯聚合物和离子多糖形成的水性热可逆凝胶组合物，应用于身体的受伤部位以预防粘连。Rosenberg等人在WO93/01286²⁹中描述了相同类型的聚氧化烯聚合物用于将反义寡核苷酸局部投递至手术暴露的血管表面以治疗再狭窄的用途。Henry等人和Rosenberg等人都没有教导或暗示凝胶组合物作为疫苗的用途。

Dunn等人在美国专利号4,938,763和5,702,716^30，31中描述了可用于受控释放生物学活性物质的聚合组合物。使用生物相容溶剂来制备用于直接肠胃外注射的抗原溶液或混悬液，在此原位胶凝导致植入物的形成。主张了多种抗原包括小的基于合成肽的免疫原的效用。然而，Dunn等人在美国5,702,716³¹中声称受控释放组合物需要高达15％(以重量计)的凝胶速率阻滞剂。添加阻滞剂以调控胶凝速率，而且阻滞剂也是以较高效率捕获在体内易于提取的抗原所需要的。由于溶剂萃取受到扩散的极大支配，由此可以推理小合成免疫原比基于较大亚基或蛋白质的抗原更成问题。

美国4,938,763³⁰和5,702,716³¹都未能教导或提示基于合成肽的免疫原作为悬浮于生物相容溶剂的免疫刺激复合物得到稳定化作用。此外，美国4,938,763³⁰和美国5,702,716³¹都未能教导或提示自我辅佐的、在引发和加强两个阶段都能够上调免疫应答的组合物。

本发明的一个目标是由合成肽免疫原和在体内具有自我辅佐特性的稳定分子开发稳定化的免疫刺激复合物。本发明的另一个目标是提供在体外和在体内稳定化的合成肽免疫原的简易方法。

本发明的还有一个目标是提供与这些基于稳定化的合成肽的免疫刺激复合物相容的持续或受控释放投递载体。

本发明的还有一个目标是开发在受控释放投递系统中使用基于稳定化的合成肽的免疫刺激复合物和未络合的免疫原的制剂来实现包括保护性应答的免疫应答的协同增强。

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发明概述

本发明致力于包含阳离子肽和阴离子分子或寡核苷酸或多核苷酸的稳定化的免疫刺激复合物以及通过静电结合阴离子分子或寡核苷酸或多核苷酸而络合来稳定阳离子肽的方法。稳定化的免疫刺激复合物可以掺入药物组合物作为免疫原投递系统。

“阳离子肽”在用于本文时指在pH范围5.0-8.0带正电荷的肽。肽或肽混合物的净电荷是通过指定序列内每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)为+1电荷，每个天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)为-1电荷，其它氨基酸为0电荷而计算得出的。每个肽N末端氨基(+1)和C末端羧基(-1)的电荷分布在未取代时有效的相互抵消。对每种肽将电荷相加，并表述成净平均电荷。合适的肽免疫原具有净平均正电荷+1。优选的是，肽免疫原所具有的净正电荷处于大于+2的范围内。

肽免疫原包括B细胞表位和Th表位。Th表位可以是肽固有的，或是如现有技术所述另外添加的。合适的肽免疫原描述于本文下文。

“阴离子分子”在用于本文时指在pH范围5.0-8.0带负电荷的分子。寡聚物或聚合物的净负电荷是通过指定寡聚物内每个磷酸二酯或硫代磷酸酯基团为-1电荷而计算得出的。合适的阴离子寡核苷酸是具有8-64个核苷酸碱基的单链DNA分子，其中CpG基序重复数目在1-10范围内。优选的是，CpG免疫刺激性单链DNA分子包含18-48个核苷酸碱基，其中CpG基序重复数目在3-8范围内。

更优选的是，阴离子寡核苷酸由通式：5’X¹CGX²3’表示，其中C和G是未甲基化的；且X¹选自A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)，而X²是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，阴离子寡核苷酸由通式：5’(X³)₂CG(X⁴)₂3’表示，其中C和G是未甲基化的；且X³选自A、T或G，而X⁴是C或T。

最优选的是，CpG寡核苷酸选自：5’TCG TCG TTT TGT CGT TTTGTC GTT TTG TCG TT 3’(CpG1)SEQ ID NO：1，长度为32个碱基的寡聚物；和5’nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3’(CpG2)SEQ IDNO：2，长度为24个碱基的寡聚物，加上一个硫代磷酸酯基团(在5’末端以n表示)。

由此产生的免疫刺激复合物处于颗粒形式，大小通常处于1-50μm范围内，且是许多因素包括相互作用物种的相对电荷化学计量和分子量的函数。³²颗粒状免疫刺激复合物具有额外优势，即在体内提供辅佐作用和上调特定免疫应答。另外，稳定化的免疫刺激复合物适合用于通过多种方法制备疫苗制剂，包括油包水乳剂、无机盐混悬液和聚合凝胶。

术语“稳定”在用于本文时可以是通过使用任何材料而实现的，其保护合成肽免疫原免于在体外或在体内降解。这可以是通过化学修饰和/或物理结合而实现的。稳定剂可以增加合成肽免疫原、经寡糖修饰的糖肽或脂化肽的生理学特性以提供更有效的制剂。

术语“佐剂”在用于本文时指能够增强或上调由免疫原在人或动物体内所引发的免疫应答的任何物质。佐剂自身可以或不能诱导免疫原性应答。

优选的是，稳定剂还可以在疫苗中发挥佐剂的功能，有效上调免疫应答。稳定剂可以担当佐剂，积极推动将免疫原呈递给免疫系统的专职加工细胞诸如巨噬细胞和树突细胞。在本发明中，理想的是，稳定化的免疫刺激复合物在施用时在溶液中保持为完整的单元。

还可以配制稳定化的免疫刺激复合物用于受控释放，并在施用部位附近的“贮存库”保持浓缩形式的复合物。这些制剂将偶联了向免疫效应物细胞局部持续释放免疫原的稳定化、佐剂化免疫原的好处协同联合起来。在有些组合物中，佐剂自身的作用还可能包括将免疫系统细胞吸引到免疫原贮存库附近并刺激这些细胞引发免疫应答。

本发明的第二个方面提供了用于制备包含免疫刺激复合物的疫苗组合物的方法。在一个优选的实施方案中，免疫刺激复合物具有额外优势，即在体外作为基于稳定化的合成肽的免疫原同时在体内自我辅佐特定免疫应答的上调。

本发明的第三个方面提供了用于由免疫刺激复合物制备疫苗组合物的方法。免疫刺激复合物或免疫刺激复合物与未络合免疫原的混合物可以配制成溶液中的混悬液、油包水乳剂、联合无机盐混悬液的混悬液或生物相容溶液中的复水混悬液。单独的免疫刺激复合物或与未络合免疫原的混合物还可以在聚合凝胶的生物相容溶剂中一起配制。

本发明还致力于用于通过多种路径包括肠胃外、口服、鼻内、直肠、口腔、阴道和经皮路径施用的有用的免疫原投递系统的生产。

附图简述

通过参考附图能够进一步理解本发明。

图1的示意图显示了阳离子肽免疫原与CpG寡核苷酸的络合过程。

图2显示了通过激光衍射测量法测定的由多种比例的LHRH肽免疫原和CpG1寡核苷酸制备的稳定化的免疫刺激复合物的典型大小分布。

图3的示意图显示了采用均化或挤压技术制备油包水乳剂的方法。

图4显示了经均化由ISA

51与LHRH∶CpG1免疫刺激复合物制备的w/o乳剂的典型显微照片，其中LHRH∶CpG1是4∶1且最终总肽浓度固定为100μg/ml。

图5显示了经挤压由ISA720与LHRH∶CpG1免疫刺激复合物制备的w/o乳剂的典型显微照片，其中LHRH∶CpG1是4∶1且最终LHRH肽浓度固定为200μg/ml。

图6的示意图详述了采用重建(reconstitution)的原位聚合物凝胶方法。

图7显示了依照实施例7中所述免疫方案经肌肉内(I.M.)免疫的豚鼠中的血清IgG应答。

图8显示了依照实施例7中所述免疫方案经肌肉内(I.M.)免疫的豚鼠中的血清IgG应答。第17周没有由经衍生自CD4肽和CpG2的免疫刺激复合物免疫的动物获取血清。这在图8中用星号指示。

图9显示了依照实施例7中所述免疫方案经肌肉内(I.M.)免疫的豚鼠中的血清IgG应答。

图10显示了依照实施例7中所述免疫方案经肌肉内(I.M.)免疫的豚鼠中的血清IgG应答。第17周没有由经衍生自CD4肽和CpG2的免疫刺激复合物免疫的动物获取血清。这在图10中用星号指示。

图11显示了依照实施例8中所述免疫方案经肌肉内(I.M.)免疫的豚鼠中的血清IgG应答。

图12显示了依照实施例8中所述免疫方案经肌肉内(I.M.)免疫的豚鼠中的血清IgG应答。

图13a和13b分别显示了依照实施例10中所述免疫方案经肌肉内(I.M.)免疫的雄性大鼠中的血清IgG应答和总血清睾酮。

图14a和14b分别显示了依照实施例11中所述免疫方案经肌肉内(I.M.)免疫的雄性狒狒中的血清IgG应答和总血清睾酮。

图15a、15b和15c分别显示了依照实施例13中所述免疫方案在整个试验期间经肌肉内(I.M.)免疫的公猪中的血清IgG应答、总血清睾酮和每组平均重量增加。

图16的示意图详述了制备免疫刺激复合物和无机盐的混合混悬液的过程。

发明详述

依照本发明的第一个方面，将阳离子肽免疫原与阴离子单链DNA络合而形成稳定的免疫刺激复合物。

阳离子肽免疫原是在pH范围5.0-8.0内具有净正电荷的肽。肽或肽混合物的净电荷是通过指定序列内每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)为+1电荷，每个天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)为-1电荷，其它氨基酸为0电荷而计算得出的。每个肽N末端氨基(+1)和C末端羧基(-1)的电荷分布在未取代时有效的相互抵消。对每种肽将电荷相加，并表述成净平均电荷。优选的是，肽免疫原的净平均电荷是至少+2。

正如上文根据其氨基酸序列所计算得出的，阳离子肽免疫原可能内在的具有净正电荷。也可以通过在肽免疫原的N端或C端添加赖氨酸、精氨酸或组氨酸或者这些氨基酸的混合物而使之具有正电荷。还可以添加在水溶液中为肽免疫原提供正电荷的其它合成部分诸如聚乙烯亚胺或聚胺。

阳离子肽免疫原包括Th表位和靶B细胞表位。Th表位可以是肽固有的，或是通过合成添加到担当靶B细胞表位的肽上。合适的肽免疫原包括引发保护性或治疗性免疫应答且由病原体或已知引起疾病的蛋白质衍生的肽，这些包括：用于变态反应免疫疗法的人或动物IgE肽，如WO99/67293⁵¹中描述的IgE肽免疫原；US 5,763,160⁵²中描述的用于针对HIV感染的保护性免疫和免疫疗法的HIV肽；US 6,090,388⁵³中描述的用于HIV的保护性免疫和针对HIV感染和免疫紊乱的免疫疗法的CD4肽；US5,749,551⁵⁴和US 6,025,468⁵⁵中描述的用于雄激素和雌激素依赖性肿瘤的免疫疗法、避孕和免疫阉割、和消除公猪膻味的黄体激素释放激素(LHRH)肽；USSN 09/865,294⁵⁶中描述的用于阿耳茨海默氏病的预防和免疫疗法的β-淀粉样肽；US 6,107,021⁵⁷中描述的用于针对口蹄疫的保护性免疫的口蹄疫病毒肽；USSN 09/747,802⁵⁸中描述的用于针对尿道感染的保护性免疫的来自细菌菌毛的肽；WO 99/66957⁵⁹中描述的用于针对疟疾的保护性免疫的疟原虫肽；和WO 99/66950⁶⁰中描述的用于促进家畜生长的促生长素抑制素肽。本文只是出于例示目的而提到特定肽免疫原作为实例，而不能以任何方式解释为限制本发明的范围。

“阴离子单链DNA”是在pH范围5.0-8.0内带负电荷的多核苷酸或寡核苷酸。多核苷酸或寡核苷酸的净负电荷是通过指定寡聚物内每个磷酸二酯或硫代磷酸酯基团为-1电荷而计算得出的。合适的阴离子寡核苷酸是具有8-64个核苷酸碱基且具有重复CpG基序的单链DNA分子，其中CpG基序重复数目在1-10范围内。优选的是，CpG免疫刺激性单链DNA分子包含18-48个核苷酸碱基，其中CpG基序重复数目在3-8范围内。

优选的是，阴离子寡核苷酸由通式：5’X¹CGX² 3’表示，其中C和G是未甲基化的；且X¹选自A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)，而X²是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，阴离子寡核苷酸由通式：5’(X³)₂CG(X⁴)₂3’表示，其中C和G是未甲基化的；且X³选自A、T或G，而X⁴是C或T。CpG寡核苷酸可以在5’端用硫代磷酸酯或硫羟乙酰氨基糖聚合物(thiolacetamido glycopolymer)进行修饰。³⁴

最优选的是，CpG寡核苷酸选自：5’TCG TCG TTT TGT CGT TTTGTC GTT TTG TCG TT 3’(CpG1)SEQ ID NO：1，长度为32个碱基的寡聚物；和5’nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3’(CpG2)SEQ IDNO：2，长度为24个碱基的寡聚物，加上一个硫代磷酸酯桥连基团(在5’末端以n表示)。

此外，已知由未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸衍生的DNA序列激活淋巴细胞并能够增强受试者的免疫应答，包括IL-6、TNF-α、IL-12、IFN-γ应答³³。根据这些发现，这些分子代表了既能够稳定合成的阳离子肽免疫原又能够提供新型免疫原投递系统的优选补充物质。本发明的稳定化的免疫刺激复合物还提供了体内免疫应答的自我辅佐，且注射部位无显著稀释。

由阳离子肽免疫原衍生的不同免疫刺激复合物的形成主要是电荷中和的作用。预计可以由衍生自天然或合成修饰的核苷酸序列的含CpG的免疫刺激DNA分子形成稳定的复合物。此外，可以通过增加肽免疫原上驻留的阳离子电荷来实现免疫刺激复合物稳定性的改善。这包括如上文所述用在水溶液中为经修饰的肽提供正电荷的额外赖氨酸、精氨酸或组氨酸或其它合成部分来延伸肽链。

预计能够鉴定得到不含CpG的免疫刺激序列(ISS)，并期望这些单链DNA物质将证明是能够在适当水性溶剂中与合成的阳离子肽免疫原联合而形成免疫刺激复合物的有用物质。

还设想了修饰的CpG基序，其中限定的阴离子单链DNA已经化学缀合了另一种生物学功能性分子，诸如用于增强细胞特异摄取和靶向的外源凝集素、糖或脂，或是用于改善体内循环的聚合物、共聚物和接枝共聚物诸如PEG。化学缀合的DNA可以是聚阴离子的，而且可以随后络合阳离子肽免疫原以提供具有潜在的物理学或生物学新特性的经修饰的免疫刺激复合物。^34，35

设想由聚阴离子寡聚物和聚乙二醇衍生的嵌段和接枝共聚物代表了还可以提供改善的稳定性和改善的辅助性的另一类阴离子分子。

在本发明的另一个方面，可以由经修饰的CpG寡核苷酸制备免疫刺激复合物，其中寡聚物5’端添加了额外的硫代磷酸酯或另一种桥连基团以改善络合作用。

优选的是，免疫刺激复合物所具有的平均聚集物颗粒大小分布处于大约1-50μm范围内。更优选的是，免疫刺激复合物所具有的平均聚集物颗粒大小分布处于大约1-30μm范围内。最优选的是，免疫刺激复合物所具有的平均聚集物颗粒大小分布处于大约1-15μm范围内。

有证据显示CpG基序重复的数目影响内在辅助性和免疫刺激的程度，而且最小数目的CpG重复是必需的。此外，有强力证据显示邻近CpG的侧翼核苷酸碱基的选择是非常重要的，因为这似乎以物种特异方式直接影响辅助性。^10，36例如，Kreig等人¹³证明了当包含CpG基序的寡核苷酸具有通式X¹X²CGX³X⁴时(其中C和G是未甲基化的；且X¹X²选自GpT、GpG、GpA和ApA和/或X³X⁴选自TpT、CpT和GpT)，人类细胞的免疫刺激活性得到增强。

尽管CpG寡核苷酸能够发挥B细胞促细胞分裂剂的功能³⁷而且是有用的佐剂，然而对于以可溶性形式与CpG寡核苷酸混合的抗原而言，已经显示免疫应答通常在施用后2周达到峰值。这使得多次重复注射以维持高抗体滴度进而确保保护作用成为必要。³⁸因此，强烈需要用于有效投递在受控释放制剂中包含这些寡核苷酸的构建物的方法。

在稳定性方面，CpG主链中的磷酸二酯键对体内核酸酶的降解作用敏感。³⁹因此，为了改善免疫应答的持续时间，可以将磷酸基团修饰成硫代磷酸基团。

本发明的免疫刺激复合物可以配制用于通过多种途径包括肠胃外、粘膜和经皮的投递。本发明的免疫刺激复合物特别希望配制成疫苗制剂，因为复合物中的CpG寡核苷酸是在体内上调肠胃外和粘膜应答的有用佐剂。^40，41

我们的试验结果显示免疫刺激复合物的聚集物颗粒大小随着肽免疫原与CpG寡核苷酸的比例而变化。免疫刺激复合物的内在稳定性和控制组合物大小的能力增加了经肠胃外路径的吞噬作用的潜力。¹⁹通过靶向特定细胞的粘膜免疫，诸如经口服路径的位于淋巴集结的M细胞²¹或经鼻内路径的鼻相关淋巴组织(NALT)²³，通过施用本发明的稳定化的免疫原得到类似的促进。

通过受控自我装配过程来制备本发明的免疫刺激复合物，其中将阴离子CpG寡核苷酸的水溶液加到阳离子肽免疫原的水溶液中。用于制备免疫刺激复合物的合适水性溶液选自：蒸馏去离子水(DDW)、生理盐水(NS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。蒸馏去离子水和生理盐水通常显示pH大约5.5，而PBS的pH控制在7.2-7.4范围内。络合过程是相互作用电解质的电荷比例、分子量、介质的pH和离子强度的函数。³²

当水性溶液pH处于5.5-7.4范围内时，多价带电阴离子分子诸如短CpG寡聚物具有净负电荷。肽免疫原的净电荷取决于肽的氨基酸组成，而且可能受到水性溶液pH的影响。因此，为了有效的络合，选择水性介质来确保净正电荷。个别肽的电离点(IP)或零电荷点检查能够指导选择过程。一般而言，通过在等电聚焦试验中使分子运动经过pH梯度来测定IP。11为了确保肽带正电荷，所选水性介质的pH应当低于所讨论肽的等电点。

遵循下列步骤来制备免疫刺激复合物。首先，根据混合在一起的肽摩尔比例，对期望肽免疫原或肽免疫原混合物测定平均摩尔正电荷分布以及每种肽成分在最终疫苗组合物中的电荷分布。其次，根据寡聚物摩尔比例，对络合寡核苷酸测定摩尔负电荷分布以及这种成分在最终疫苗组合物中的电荷分布。再其次，根据总的平均摩尔正电荷，肽免疫原的量取决于络合所用寡核苷酸的量及其总摩尔负电荷。此相互关系用于确定在水性溶剂中结合的肽免疫原与寡核苷酸的相对量，从而形成免疫刺激复合物。可以采用过多的阳离子免疫原肽以提供免疫刺激复合物与过量未络合肽的混合物。或者，也可以采用过多的寡核苷酸以提供过量寡核苷酸。根据期望的疫苗制剂来选择肽免疫原与寡核苷酸的相对量。

最后，加入计算量的溶于相容水性溶剂的阴离子寡核苷酸，并与计算量的类似溶于相容水性溶剂的阳离子肽免疫原混匀。所用的阳离子肽免疫原的nmol用量对于提供1个负电荷的阴离子寡核苷酸的nmol用量，通常处于提供8-0.5个正电荷的范围内。这称为电荷比例。当电荷比例为8∶1时，肽免疫原大大过量。当电荷比例为1∶2时，阴离子寡核苷酸适度过量。复合物在溶液中以混悬液的形式自发形成。将复合物与溶液分开并通过紫外分光光度法(UV)或反相高效层析(RP-HPLC)分析上清液，由此可以估算肽免疫原或寡核苷酸的残余量。

以混悬液制备的免疫刺激复合物可以用作疫苗组合物。若免疫刺激复合物将肠胃外注射，则选择水性溶剂使得最终疫苗组合物是等渗的且适合于这种目的。在蒸馏去离子水中首先形成复合物的情况中，加入合适盐浓度的水性缓冲液以确保最终疫苗组合物是等渗的。

以混悬液或溶液制备的免疫刺激复合物可以冻干。然后可以依照期望的投递模式将冻干组合物重建并掺入到不同疫苗制剂中。本发明的免疫刺激复合物还可以配制成油包水乳剂，并联合无机盐混悬液或生物相容聚合凝胶。

依照本发明的另一个方面，本发明描述了通过冻干分离稳定颗粒形式的稳定化的免疫刺激复合物的方法。稳定化的免疫刺激复合物在水性溶剂或生物相容溶剂中重建形成混悬液后，颗粒大小分布或体内效力基本上显示没有变化。与需要冷藏以维持功效的制剂诸如基于明矾的疫苗组合物相比，这展示了重要优势。这一特性延伸了这些系统的潜在效用而包括在免疫前直接重建和需要稳定的固态剂型的候选投递模式，诸如用于肺或鼻内投递的干粉气溶胶或喷雾法。⁴²

依照本发明的另一个方面，本发明提供了用于制备包含本发明稳定化的免疫刺激复合物的稳定的油包水乳剂⁴³的多种方法。在这种乳剂中，优选的是，水相包含免疫刺激复合物或免疫刺激复合物与未络合的肽免疫原的混合物；且连续油相包含合成、矿物、动物或植物油。另外，油相还可以包含免疫刺激性乳化剂、生物相容或可代谢成分。

具体而言，可用于制备本发明油包水乳剂的油包括但不限于合成油(如肉豆蔻酸异丙酯)、植物油(如花生油)、矿物油(如Drakeol^TM或Marcol^TM)、可代谢动物油(如角鲨烯或角鲨烷)及其混合物。矿物油是优选的。可用于稳定乳剂的基于油的乳化剂包括但不限于二缩甘露醇油酸酯家族及其衍生物。

所需乳化剂的相对量是在特定条件下生成的油包水乳剂的亲水-亲脂平衡(HLB)和内在稳定性的函数。用于选择油和乳化剂组合的方法对本领域熟练技术人员是众所周知的。

w/o乳剂可以在内部水相中包含10v/v％-80v/v％的水。对于大多数目的，最佳水浓度的范围为30v/v％-50v/v％。内部水相的特征是由很细的小滴构成，小滴大小范围通常为1-10μm，优选1-5μm。当维持于室温或冷藏时，制剂是稳定的。

还可以使用其它稳定剂来制备乳剂。这些包括表面活性剂、胶体颗粒、蛋白质及本领域熟练技术人员知道的其它聚合和稳定剂。

w/o乳剂还可以包含至少一种油溶性亲脂佐剂，诸如3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂A(MPL)、N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、N，N-双十八烷基-N’，N’-二(2-羟乙基)丙二胺(Avridine)、N-(2-脱氧-2-1-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基-十二烷酰酰胺氢乙酸酯(BAY-1005)、3β-[N-(N，N’-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、NAc-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-甘油二棕榈酰(Murapalmitine)及其混合物或衍生物。w/o乳剂还可在分散相中包含至少一种水溶性佐剂，如聚[二(carboxylatophenoxy)]膦腈(PCPP)、Quillaja皂苷(QS-21)、霍乱全毒素(CT)或霍乱毒素B亚基(CTB)、来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素(LT)或来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素B亚基(LTB)以及细胞因子诸如白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)及其混合物和衍生物。水溶性佐剂可以是合成的或天然的。具有成膜特性的水溶性佐剂诸如寡聚物或多聚物的存在能够额外用于稳定乳剂。w/o乳剂能够推动将免疫原呈递给免疫系统从而提供更有效的疫苗。

包含免疫刺激复合物或其与未络合免疫原的混合物的油包水乳剂可以如下制备。首先，以确保只形成免疫刺激复合物或其与过量残余肽免疫原的混合物的比例由肽免疫原和寡核苷酸在水溶液中制备免疫刺激复合物。其次，将水性溶液与含乳化剂的油混合并均化以提供油包水乳剂，其中水相分散于连续油相中。这种油包水乳剂同样适合于肠胃外注射。

可以通过均化或者通过两个注射器之间的转移或者通过挤压成分穿过受控孔径大小的膜滤器来实现水相与油相的乳化。低能量半手工方法是快速的。然而，由于剪切显著少于其它方法，因此所生成的乳剂不如使用高剪切机械系统所生成的精细。高剪切系统的实例包括rotostator、微流化仪(microfluidizer)和超声波仪。还可以采用众所周知的用于乳化的其它装置，与这些高剪切系统类似。

依照本发明的另一个方面，本发明提供了用于制备包含本发明稳定化的免疫刺激复合物的生理学可接受无机盐混悬液的多种方法。在这种混合系统中，水相包含无机盐混悬液与免疫刺激复合物的联合物，溶液中还可包含残余的未结合的肽免疫原。

具体而言，可用于制备本发明完全基于水的混悬液的无机盐包括但不限于氢氧化铝(如

Rehydragel

Rehydragel

)、磷酸铝(如

或

)或磷酸钙(如

)及其混合物。

用于选择将要采用的无机盐并测定无机盐优选浓度或其组合的方法对本领域熟练技术人员是众所周知的。

其它稳定剂也可用于制备无机盐混悬液。这些包括表面活性剂，抗氧化剂，生理上可接受的缓冲剂，tonifiers，防腐剂和本领域的熟练技术人员已知的其它试剂。

无机盐混悬液还可包含至少一种额外佐剂(如MPL、MDP、DDA、N，N-Avridine、BAY-1005、DC-Chol、Murapalmitine、PCPP、QS-21、CT或CTB、LT或LTB以及细胞因子诸如IL-1β、IL-2、IL-12、IFN-γ及其混合物和衍生物)。无机盐能够推动以贮存库的形式将免疫原呈递给免疫系统或通过称为趋化性的过程吸引免疫系统的特定细胞。

包含免疫刺激复合物或免疫刺激复合物联合残余未络合免疫原的混合物的无机盐混悬液可以如下制备。首先，以确保所有肽免疫原与寡核苷酸在溶液中完全络合的电荷比例由肽免疫原和寡核苷酸制备免疫刺激复合物。或者，以确保肽免疫原与寡核苷酸成分在溶液中部分络合的电荷比例由肽免疫原和寡核苷酸制备免疫刺激复合物；其次，混合水性混悬液与无机盐混悬液以提供所有成分的完整水性混悬液。这种混悬液联合物适用于肠胃外注射。

在一个补充方法中，包含免疫刺激复合物或其与未络合肽免疫原的混合物的无机盐混悬液可以如下制备。首先，将肽免疫原与无机盐混悬液混合。根据无机盐、肽免疫原和水性缓冲液的物理特性，无机盐在此阶段可以直接吸附多种比例的免疫原；其次，一边搅动一边向此混悬液中加入寡核苷酸。结果溶液中的残余未结合肽免疫原部分或完全络合。这种混悬液联合物同样适用于肠胃外注射。在图16中显示了这两种方法。

依照本发明的另一个方面，提供了用于制备原位胶凝生物可降解聚合物的方法，其中分散着稳定化的免疫刺激复合物或稳定化的免疫刺激复合物与未络合免疫原的混合物。免疫刺激复合物可以分散于溶液或是在生物相容溶剂内作为混悬液。生物相容溶剂还可包含合成或天然的可溶性佐剂。生物可降解胶凝聚合物中的溶液或混悬液设计用于将免疫原投递给宿主。原位胶凝聚合物是生物可降解的，且是聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLG)和聚-D，L-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)的共聚物，分子量范围为大约2,000-大约100,000道尔顿，固有粘度范围为大约0.2-1.0dl/g。原位胶凝聚合物的通式是：

R1＝O烷基(PLG)或OH(PLGA)

R2＝H

其中R1是OH或具有1-5个碳的烷氧基，R2是H；x∶y是共聚物中每种单体单元的比例且x+y＝1。

在PLG的情况中，R1是烷氧基，单体单元是丙交酯和乙交酯；而在PLGA的情况中，R1是OH，单体单元是乳酸和乙醇酸。

稳定化的免疫刺激复合物或其与未络合免疫原的混合物及原位胶凝聚合物可以制备成单相或在生物相容溶剂中的混悬液。

可用于本发明的生物相容溶剂选自下组：二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷(NMP)、甘油三乙酸酯和甘油。DMSO是优选的。DMSO具有溶解大量(以重量百分比计)聚合物的高容量。它已经广泛作为溶剂用于聚合物的原位胶凝。DMSO还可用于制备本发明稳定化的免疫刺激复合物的混悬液。

重要的是，已经在动物模型中证明了对少量使用DMSO的高耐受。⁴⁴因此，在经肠胃外路径施用含DMSO组合物时对毒性的担忧是最低限度的。

适用于本发明的生物可降解聚合物包括但不限于PLA或PLGA家族的聚酯。这些物质可以5w/w％-50w/w％的浓度范围溶于多种生物相容溶剂。几种物理因素能够影响可以溶于生物相容溶剂的聚合物的实际量。这些包括聚合物的结构、分子量、固有粘度和结晶性。对于PLG/PLGA系列的共聚物，这些因素是高度可变的。例如，聚D，L-乳酸(PLA)或聚D，L-丙交酯(PL)的均聚物以及PLG或PLGA与乳酸单体成分长嵌段的共聚物是具有相对较高固有粘度的高晶体物质。

能够溶解的这些晶体物质的相对重量百分比显然低于无定形PLG或PLGA类似物，在所述类似物中乳酸与乙醇酸成分的比例大致相等即1∶1。预计可通过注射给药的聚合物不同总量将显著影响基质降解速率并影响所包裹免疫原的释放动力学。设想有可能通过改变在生物相容溶剂中具有不同物理特性的生理学相容聚合物和共聚物的混合比例来实现新的生物学效果。

设想了适用于本发明的其它生物可降解聚合物，包括但不限于聚己酸内酯、聚酐、聚原酸酯和聚(α-羟基丁酸)。这些聚合物能够以有用的重量百分比溶于生物相容溶剂并提供有用的基质形成底物。

依照本发明，提供了稳定形式的受控或延迟释放疫苗制剂以及生成这种疫苗制剂的方法。受控或延迟释放疫苗组合物的凝胶基质包含选自下组的生物可降解聚合物：聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLG)和聚-D，L-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚己酸内酯、聚酐、聚原酸酯和聚(α-羟基丁酸)、生物相容溶剂和稳定化的免疫刺激复合物。

聚合凝胶还可包含至少一种额外佐剂，如MPL、MDP、DDA、N，N-Avridine、BAY-1005、DC-Chol、Murapalmitine、PCPP、QS-21、CT或CTB、LT或LTB、或者细胞因子诸如IL-1β、IL-2、IL-12、IFN-γ及其混合物和衍生物。

本发明受控释放组合物的优点包括：

(a)完全生物可降解且生物相容的凝胶制剂；

(b)持续释放免疫原而呈递给免疫效应物细胞并导致免疫原性改善；

(c)凝胶高度加载稳定组合物中的期望免疫原；和

(d)灵活的投递模式，包括自我辅佐的稳定化的免疫刺激复合物的混悬液。

聚合物的分子量和结晶度直接影响体内俘获功效。聚合胶凝材料在极性非质子溶剂诸如DMSO中是可混合的。然而，在肌肉内或皮下注射后，DMSO被吸取到周围体组织中，同时水可逆地渗透富含聚合物的溶液。这个过程充当了控制原位凝胶形成的主要机制。在当生物相容溶剂被主动吸取到身体组织中并与生理溶液交换时和在免疫原被形成的凝胶所捕获之前的间隔时段里，这个过程的进行速率直接影响免疫原释放的初次暴发。⁴⁵已知控制结晶过程是能够改善凝胶内免疫原保持的重要关键机制。⁴⁶这与所形成的凝胶的内部形态学密切相关，后者限制了可以释放免疫原的扩散途径。

捕获或保持的免疫刺激复合物随后以限制量以持续方式由凝胶释放，当大量的基质形成聚合物被销蚀时，释放了较大暴发。这因影响胶凝的许多相同条件而变化，诸如分子量、结晶度、结构、疏水性和添加剂的存在。

在最近的研究中⁴⁴已经提出了溶剂DMSO的不利毒物学反应的潜在性，其中通过手术将含悬浮于DMSO中的肽激素的装置皮下植入狗和人。研究中所采用的DMSO的量是150μl。设计植入物在长达1年的时间里释放肽，并在研究结束时通过手术拆除。在狗或人的研究中都没有观察到任何不利的组织反应。由植入物将肽/DMSO混合物受控释放到生理组织中，作为有用模型可用于评估完全生物可降解的原位胶凝聚合组合物的潜在毒性忧虑。期望可用于本发明的DMSO的量与研究中所用基本上相同。

期望在超过聚合物的溶解度限制前，DMSO中的免疫刺激复合物被初次吸取到身体组织中。固化发生了，阻碍了稳定化的免疫刺激复合物的释放。随后，稳定化的免疫刺激复合物与DMSO一起通过扩散控制途径得到释放或者保持在凝胶中，此时的释放速率是聚合物特性的函数。显然这些分子在凝胶中的扩散系数受到几种因素的控制，诸如内部凝胶形态学和多孔性、水进入凝胶的渗透程度以及大块聚合物的水解。⁴⁵

在本发明稳定化的免疫刺激复合物作为混悬液散布于整个凝胶的情况中，初次抽提主要是DMSO的，同时小量免疫刺激复合物位于胶凝前线附近。因此，在初次胶凝阶段过程中未被有效捕获的少量免疫刺激复合物将负责体内免疫应答的初次引发。其后，预计DMSO将通过扩散继续释放，而大量免疫刺激复合物仍然被捕获在凝胶基质中直至大量聚合物充分被水解而导致捕获的免疫刺激复合物完全释放。

具体而言，由衍生自α-羟基酸的较高分子量和较高晶质的聚合物配制的聚合凝胶的降解时间长于低分子量的无定形类似物。已知这种现象与水对水解不稳定酯键的可达性有关。⁴⁶

已经证实了由50％D，L-丙交酯与50％乙交酯组成的、分子量范围为8,000-50,000道尔顿的随机无定形共聚物展示最高降解速率。将聚合物浸泡在PBS缓冲液中大约6-8周后只剩下50％重量或更少。⁴⁷

期望更改控制胶凝速率、免疫原释放动力学、和内部凝胶形态学的参数。具体而言，多种孔形成剂、增塑剂和稳定剂诸如表面活性剂、糖、蛋白质、聚合物和本领域熟练技术人员知道的其它赋形剂对此目的是有用的。

制剂在冷藏或室温时是稳定的。采用DMSO的本发明疫苗组合物在冷藏时将冻结，因为DMSO的凝固点是大约18℃。已经发现解冻不会改变疫苗的体内功效。

依照本发明，原位胶凝生物可降解聚合物和稳定化的免疫刺激复合物可以分开配制。可以在一个小瓶中将原位胶凝聚合物溶于生物相容溶剂，而另一个小瓶中是干燥形式的稳定化的免疫刺激复合物。可以通过喷雾干燥法或优选冻干法来制备干燥形式的免疫刺激复合物。^48，49然后将干燥的免疫刺激复合物在生物相容溶剂中重建，并作为溶液或混悬液通过注射器分配到生物可降解聚合物溶液中。然后立即或不久后将混合物用于免疫。

采用分开的瓶具有附加优势即将任何潜在的稳定性问题缩减至最小。这些问题包括存在可能具有反应性功能侧链诸如游离胺基或羧基的肽免疫原时的聚合物降解，⁵⁰或者选择性氨基酸诸如存在DMSO时肽免疫原中的半胱氨酸和色氨酸的氧化。¹

为了制备包含免疫刺激复合物的可重建原位胶凝聚合物组合物，如上文所述制备免疫刺激复合物。然后将此水性溶液冻干而形成干燥的组合物。然后将干燥的组合物在包含计算重量百分比的生物可降解胶凝聚合物的生物相容溶剂中重建成混悬液。最终的疫苗组合物提供了原位胶凝聚合物且适用于肠胃外注射。

本发明的组合物试图可作为疫苗或用于治疗目的。可以通过修饰而在pH范围4.0-8.0内通常具有阳离子电荷从而能够与CpG寡核苷酸有效络合的其它生物学材料可以包括蛋白质、蛋白质模拟物、细菌、细菌裂解物、病毒、病毒感染的细胞裂解物、抗原、抗体、药理学试剂、抗生素、碳水化合物、脂、细胞因子、趋化因子、脂化的氨基酸、糖脂、半抗原及其联合物和混合物。

这些组合物可以通过皮下或肌肉内注射而进行肠胃外施用。肠胃外施用后，免疫应答可能是由细胞介导的应答或是提供中和抗体的局部或血清抗体应答。对于粘膜施用的组合物，免疫应答将额外包括局部分泌性抗体应答。

对于本领域熟练技术人员显而易见的是，免疫刺激复合物还可以掺和在基于水包油(o/w)的乳剂中。其它可能性包括将稳定化的免疫刺激复合物包裹在水包油包水(w/o/w)双重乳剂、生物可降解聚合微粒、脂囊泡或脂质体结构中。这些投递系统的大多数对持续释放制剂的开发是有吸引力的。

优选的是，可以将本发明的肽免疫刺激复合物用于基于w/o的乳剂，所述乳剂采用SEPPIC的基于油的佐剂且联合无机盐诸如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙；或者用于基于生物可降解的聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLG)或聚-D，L-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)共聚物的单剂受控释放原位胶凝制剂。

最优选的是，本发明的疫苗组合物包含肽免疫原与CpG寡核苷酸的稳定化的免疫刺激复合物且混合了未络合的肽免疫原。

对本领域熟练技术人员显而易见的是，本发明的多个实施方案在医学领域具有许多应用，特别是疫苗接种、病原体包括细菌和病毒感染的诊断和治疗。下文描述了本发明的其它用途。

疫苗制剂

可以由本发明的免疫刺激复合物制备适合于作为疫苗使用的免疫原性组合物，作为w/o乳剂、联合无机盐混悬液的混悬液、或原位胶凝聚合物或本文所公开的这些系统的联合物。包含免疫刺激复合物的免疫原性组合物用于在接受给药的宿主中引发免疫应答。免疫应答包括由宿主产生抗体。

免疫原性组合物可以制备成注射剂，作为液体溶液或混悬液、作为冻干或喷雾干燥的粉剂或乳剂。可以将包含免疫刺激复合物的组合物与生理学可接受缓冲剂或赋形剂混合，诸如水、盐水、右旋糖苷、甘油、乙醇及其联合物。疫苗还可包含额外物质以进一步增强其功效，诸如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、或佐剂。疫苗还可包含额外的生物相容物质，特别是联合原位胶凝聚合物诸如二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷(NMP)、三甘油乙酸酯、甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

本发明的疫苗可以肠胃外施用，如皮下、肌肉内或经皮注射。本发明的疫苗可以通过口腔、鼻内、直肠、阴道或眼睛而粘膜施用。

以与制剂相容的方式且以治疗有效、保护性和免疫原性的量施用疫苗。施用量取决于待治疗的受试者或物种，包括例如受试者或物种免疫系统合成抗体(根据需要)以生成由细胞介导的免疫应答的能力。

实现效果所需要施用的乳化油、无机盐或胶凝聚合物和具有生物学活性的物质的精确量取决于从业者或兽医的判断。然而，本领域熟练技术人员易于确定适用的剂量范围，量级可以是微克至毫克。初次施用和加强剂量的合适方案也是可变的，但是可以包括初次施用后继以后续施用。疫苗的剂量还可能取决于施用路径，并因而随宿主或物种的不同而变化。

实施例

上述内容一般性的描述了本发明。通过参考下文具体实施例能够获得更完整的理解。仅仅出于举例说明目的而描述了这些实施例，而非意欲限制本发明的范围。设想了形式的变化和等同物的替代，因为境况可能要求必须达到某一特定目标。尽管本文采用了特定术语，这些术语意指描述性意义而非限制目的。

本内容和这些实施例中使用但未明确描述的化学、有机化学、聚合物化学、蛋白质生物化学和免疫学方法在科学文献中有详细报道且完全属于本领域熟练技术人员的能力之内。

免疫刺激复合物的制备

一般而言，通过将适当水性溶剂中的肽储液逐滴加到装有经过温和搅动的溶于适当水性溶剂的CpG寡核苷酸储液的小瓶中制备了合成肽免疫原与CpG寡核苷酸在水性溶液中的免疫刺激复合物。添加的相反模式同样有效。相容水性溶剂包括但不限于蒸馏去离子水、生理盐水(NS＝0.9％NaCl)、或磷酸盐缓冲盐水(PBS＝10mM磷酸盐缓冲液、0.9％NaCl)或其混合物。络合过程很大程度上不受生理学缓冲剂的影响，在为合成肽免疫原和CpG寡核苷酸选择相容溶剂系统时提供机动性。

复合物立即形成，且能够通过观察溶液中悬浮的精细沉淀而在视觉上得到鉴定。如此形成的混悬液的数量是溶液中CpG寡核苷酸与阳离子肽相对量的函数。沉淀过程受到相反带电分子的静电中和作用的控制。在热力学有利过程中，高度带电的聚阴离子单链DNA结合带正电的阳离子肽免疫原。⁶¹

CpG寡核苷酸选自：5’TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTGTCG TT 3’(CpG1)SEQ ID NO：1，长度为32个碱基的寡聚物；和5’nTCGTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3’(CpG2)SEQ ID NO：2，长度为24个碱基的寡聚物，加上一个硫代磷酸酯基团(在5’末端以n表示)。通过Oligo的Etc(Wilsonville，俄勒冈州)合成CpG寡核苷酸，并以冻干状态获得。在使用前将这些物质在适当水性溶剂中重建。CpG1具有8核苷酸碱基序列内隔离的CpG基序，而且与较短寡核苷酸相比通过以更高亲合力结合阳离子肽可能在体内提供更强的佐剂化作用和改善的稳定性。CpG2 5’端的硫代磷酸酯修饰基团增加了摩尔负电荷密度且潜在促进结合改善。

合成肽免疫原并使用适当的水性缓冲液来确保肽在溶液中是阳离子。在期望肽免疫原络合CpG寡核苷酸的疫苗中这是一项重要的考虑。使用每种肽免疫原的电离点或IP和介质的pH来指导适当缓冲液的选择。溶于蒸馏去离子水或生理盐水(NS)的肽储液的水性混合物的pH是大约5.5，而在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中肽储液的pH显著较高，大约7.2。小心选择水性溶剂系统以确保由具有微弱碱性侧链的氨基酸特别是组氨酸衍生的肽的完全质子化。

表1列出了用于形成免疫刺激复合物的合成肽免疫原和CpG寡核苷酸的物理特性。表1描述了三种例示性肽免疫原靶。使用两种或三种肽免疫原的混合物或者在一种情况中是包含肽类似物的肽组合库来制备每种疫苗。每种肽免疫原包含两个区段，一个B细胞靶表位和一个T辅助表位。包括Th表位以改善肽免疫原的免疫原性。

在适当动物模型中筛选肽文库后选择B细胞表位和T辅助表位。通过参考美国专利号6,090,388⁵³、美国专利号5,759,551⁵⁴、WO99/67293⁵¹和US 6,107,021⁵⁷可以找到关于这些构建物的鉴定和组成的详细信息。表1中的SEQ ID NO：7-9包含LHRH免疫原肽，而且可用于前列腺癌免疫疗法的疫苗，设计用于激素消除治疗。SEQ ID NO：10-11可用于抗IgE免疫治疗疫苗，用于治疗变态反应。SEQ ID NO：4-6可用于抗CD4免疫治疗疫苗，用于治疗HIV感染。SEQ ID NO：12-13包含FMD肽组合库，且可用于抗FMD疫苗，用于针对口蹄疫的保护性免疫。

可以用多种比例的阳离子肽与CpG寡核苷酸来制备本发明的免疫刺激复合物，以提供不同物理特性，诸如微粒状复合物的大小。表2显示了混合物中肽免疫原的计算平均摩尔正电荷和平均制剂重量。表2还分别提供了CpG1(SEQ ID NO：1)和CpG2(SEQ ID NO：2)的计算平均摩尔负电荷分布。

实施例1：LHRH免疫原与CpG1寡核苷酸的免疫刺激复合物的制备

此实施例举例说明了多种比例的LHRH肽免疫原与CpG1寡核苷酸的免疫刺激复合物的制备。图1的流程图显示了如本文所述的复合物的形成过程。

所有的玻璃器皿、搅棒和移液枪枪头都在使用前于121℃高压灭菌40分钟。所有的试剂都在层流通风橱中称量、分装、转移或添加至反应容器中以防止污染。

以1∶1∶1的摩尔比例混合SEQ ID NOS：7-9的肽(以3mg/ml的浓度溶于蒸馏去离子水)而制备LHRH肽免疫原储液。向一系列装配有微型搅棒的2ml小瓶中每瓶加入33μl储液(100μg肽免疫原)。向此溶液中加入0.5ml蒸馏去离子水作为稀释剂。在蒸馏去离子水中制备2.0μg/μl的CpG1寡核苷酸储液。向每个小瓶中加入不同量的CpG1寡核苷酸储液以形成免疫刺激复合物。为了提供LHRH∶CpG1电荷比例范围8∶1(LHRH大大过量)至1∶2(CpG1过量)，通过计算决定加入到各个小瓶中的CpG1寡核苷酸的量。表3显示了用于制备这些组合物的各个CpG1用量。应当注意的是，LHRH∶CpG1比例表述为摩尔电荷比例，而且是以表3所示的计算为基础的。

添加是在室温下进行的，需要连续搅拌及平衡30分钟。在所有的情况中，添加CpG寡核苷酸储液时都能立即观察到反应混合物的浑浊。在CpG1寡核苷酸添加完毕后，观察到精细的白色颗粒混悬液。颗粒逐渐沉降且轻轻摇动就能够容易的重悬起来。

固体微粒复合物基本上可在沉降后去除，从而能够通过紫外分光光度法对分离的上清液分析残余的未络合肽免疫原(波长280nm)或残余CpG1寡核苷酸(波长260nm)。对于使用过量LHRH(其中LHRH∶CpG1为8∶1、4∶1或2∶1)制备的免疫刺激复合物而言，能够检测到过量的肽。

由于以下原因，紫外分光光度法获得的结果只是估计值而且可能有±20％的误差。与CpG寡核苷酸相比，肽生色团具有小很多的消光系数，而且用于检测肽和CpG1的最大波长彼此相当接近。因此，对于游离残余肽的估计值有可能被夸大了。此外，上清液中可能存在少量的肽CpG复合物的纳米微粒。由于观察到提高肽免疫原相对于CpG的过量通常导致复合物以较小平均颗粒大小聚集，因此对这些结果的解释就更加复杂了。

由图2能够观察到LHRH/CpG1复合物就平均聚集物颗粒大小分布而言的排列顺序为LHRH∶CpG1 2∶1＞4∶1＞8∶1。预计络合过程的效率将根据所选择的肽免疫原和CpG寡核苷酸的物理特性以及各自在疫苗组合物中的相对比例而变化。对于LHRH∶CpG1系统而言，通过紫外分光光度法测定的未络合肽残余水平的范围分别为超过背景60-90％(LHRH∶CpG1＝8∶1)、40-80％(LHRH∶CpG1＝4∶1)和25-65％(LHRH∶CpG1＝2∶1)。对于以1∶1电荷比例制备的LHRH∶CpG1复合物而言，只能检测到很小浓度的残余肽免疫原(约3％)或残余CpG寡核苷酸(约2％)。此复合物聚集物大小的大幅增加与免疫原的基本完全络合相偶合，符合处于中性电荷时的预期聚合电解质表现。对于LHRH∶CpG1＝1∶2电荷比率的免疫刺激复合物而言，CpG1过量，在波长260nm处发现了48％的CpG1残余水平。若第一等份量的CpG1与肽免疫原在溶液中完全络合，则此CpG1残余量接近预计的CpG1量。

紫外法的结果证明以肽相对于寡核苷酸大大过量的比例(如LHRH∶CpG1＝8∶1的电荷比例)制备的免疫刺激复合物组合物导致溶液中存在相当大量的游离肽。类似地，以寡核苷酸相对于肽中度过量的比例(如LHRH∶CpG1＝1∶2的电荷比例)制备的免疫刺激复合物导致组合物中存在过量的游离寡核苷酸。如图2所示，过量寡核苷酸的存在有助于稳定较小的聚集物。

此实施例证明了以大大过量的LHRH如LHRH∶CpG1＝8∶1的电荷比例制备免疫刺激复合物可能没有实践上的优势，其中相当大量的肽在溶液中保持游离状态。类似的，用中度过量的CpG1如LHRH∶CpG1＝1∶2的电荷比例制备免疫刺激复合物也没有实践上的优势，其中可以合理的设想在电中性点处完全络合后，过量的寡核苷酸只能如图2所示用于稳定聚集物。此结果确实揭示了可继续添加相容的阴离子分子和/或聚合物来预先形成1∶1电中性复合物，从而降低组合物的有效颗粒大小。这呈现了与颗粒大小控制相偶联的完全免疫刺激络合的一种新策略。

本发明的一个目标是为了某些应用而有效结合溶液中的肽免疫原从而使疫苗在体内的稳定性最大化。因此，分别以4∶1至1∶1范围内的肽免疫原对CpG寡核苷酸电荷比例制备的免疫刺激复合物是优选的。本发明的另一个目标是通过使用较小的更分散颗粒(约10微米或更小)使免疫刺激复合物在体内的辅佐作用最大化从而呈递给免疫系统。

已经发现残余的游离未络合肽的存在对于更复杂的疫苗制剂诸如油包水乳剂或吸附于无机盐上而言是更合适的。在这些制剂中，免疫应答的辅佐作用可能来自结合成免疫刺激复合物的免疫原，也可能来自分散于w/o乳剂中或直接吸附于无机盐上的未络合免疫原。因此，发现以8∶1至2∶1范围内的肽免疫原对CpG寡核苷酸电荷比例制备的免疫刺激复合物对于这些应用是有用的。

更优选的是，对于以4∶1至2∶1范围内的肽免疫原对CpG寡核苷酸电荷比例制备的免疫刺激复合物而言，发现了最大肽络合作用(对稳定性而言)与小颗粒大小(对改善辅佐作用而言)的联合。

最优选的免疫刺激复合物是那些制备成具有使其适合于选择性投递形式的物理特性的复合物。具体而言，量级为10微米或更小的平均颗粒大小对直肠、阴道、口服和鼻内投递而言是特别合适的。

实施例2：通过RP-HPLC定量肽免疫原与寡核苷酸的络合效率

此实施例举例说明了采用反相高效液相层析法(RP-HPLC)来测定肽免疫原与寡核苷酸疫苗成分的络合效率的优选方法。此技术能够定量肽混合物中需要分离和鉴定的每种残余未络合个别肽(波长226nm)，而且能够用于确认CpG寡核苷酸的完全络合(波长260nm)。通过离心及随后的过滤可以将固体微粒络合物与上清液分开。对上清液样品进行两个分离的RP-HPLC程序，从而鉴定并定量溶液中的残余LHRH肽免疫原和CpG1寡核苷酸。

通过高效液相层析法(HPLC)解析肽，使用Vydac 4.6×250mm C-18柱，产品目录编号218TP54，在40分钟内梯度由95％溶液A(0.05％TFA溶于HPLC级水)和5％溶液B(0.05％TFA溶于HPLC级乙腈)至24％溶液A和76％溶液B，流速1ml/min。监测226nm处的UV波长吸光度。使用标准肽并通过保留时间来确定肽的身份。

通过高效液相层析法(HPLC)来解析寡核苷酸，使用PerSeptiveBiosystem 4.6×100mm Oligo R3柱，产品目录编号R330-050，在40分钟内梯度由95％溶液A(0.1M TEAA溶于HPLC级水，pH＝8)和5％溶液B(HPLC级乙腈)至24％溶液A和76％溶液B，流速1ml/min。监测260nm处的UV波长吸光度。使用标准寡核苷酸并通过保留时间来确定肽的身份。

如实施例1和实施例11所述制备LHRH和CpG1范围8∶1至1∶1的免疫刺激复合物用于此项研究。表3和表9显示了用于制备这些组合物的各个CpG1用量。需要注意的是LHRH∶CpG1的比例表述成摩尔电荷比例，而且是以表3和表9所示的计算为基础的。

对于使用过量LHRH(其中LHRH∶CpG1＝8∶1、4∶1或2∶1)制备的免疫刺激复合物，通过RP-HPLC检测到上清液中不等量的残余肽，指示络合过程是选择性的。此项技术能够根据结合亲合力将偏爱溶液中CpG1寡核苷酸的LHRH肽免疫原分等级。在所有情况中，通过RP-HPLC都未能检测到残余的未络合CpG1寡核苷酸，指示此成分完全络合。

对于根据电荷比例LHRH∶CpG1＝1∶1使用等量LHRH与CpG1寡核苷酸制备的免疫刺激复合物，通过RP-HPLC基本上没有检测到肽和CpG1，指示所有成分完全络合。

表8描述了这些分析的整套结果。显然LHRH肽免疫原与CpG1寡核苷酸的结合可以分等级成p607E＞p667＞p500。这三种肽具有接近相同的电离点，而且根据表1的计算都带正电荷。CpG1寡核苷酸偏爱p607E(+4电荷)甚过p667(+5电荷)，二者又都甚过p500(+4电荷)，这有可能与这些肽的分子量和电荷分布有关。

实施例3：干燥的免疫刺激复合物的制备

此实施例举例说明了用于制备干燥状态的免疫刺激复合物的流程。

将如实施例1所述制备的LHRH/CpG1复合物在0.5-1.0ml水性溶剂即蒸馏去离子水、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水中的混悬液置于干冰/丙酮浴中并冷冻15分钟。然后将冷冻样品置于冻干机(Vertis 25LEZ)上，并通过于200毫托升华3天而除去水。此流程在小瓶中提供了接近透明的玻璃样成品。回收的剩余固体的外观依赖所使用的水性溶剂，而且能够跨度接近透明的玻璃样至白色绒毛样固体。

干燥物质在相同体积的水性溶剂中的重建再生离散颗粒的混悬液。如实施例2所述测定的颗粒大小分布显示基本上没有变化。

这证明干燥和重悬过程不影响所制备的免疫刺激复合物的物理特性。因此，可以以混悬液、固体或干燥粉末的形式提供包含本发明免疫刺激复合物的疫苗组合物。

实施例4a：使用高剪切均化制备油包水乳剂

此实施例举例说明了使用均化技术以多种比例由衍生自LHRH肽免疫原(SEQ ID NO：7-9，溶液中的摩尔比例为1∶1∶1)、IgE肽免疫原(SEQID NO：10-11，溶液中的摩尔比例为2∶1)CD4肽免疫原(SEQ ID NO：4-6，溶液中的摩尔比例为2∶1∶1)的阳离子肽或者衍生自LHRH、IgE或CD4免疫原及CpG1或CpG2寡核苷酸的免疫刺激复合物制备油包水(w/o)乳剂的过程。图3显示的流程图例示了通过如本文所述的均化形成乳剂的过程。

所有的玻璃器皿、搅棒和移液枪枪头都在使用前于121℃高压灭菌40分钟。所有的试剂都在层流通风橱中称量、分装、转移或添加至反应容器中以防止污染。

在所需水相对油相的体积比例方面优化w/o乳剂的稳定性。对于采用Montanide

ISA 720油(SEPPIC公司)的组合物而言，水对油的体积比例是30∶70。对于采用ISA Montanide

51或ISA Montanide

50v油(SEPPIC公司)的组合物而言，水对油的体积比例是50∶50。

实施例4b：由ISA Montanide

720与免疫刺激复合物制备油包水乳剂

向10ml容器中加入溶于适当水性缓冲液的3333μg肽免疫原(1111μl，3mg/ml)或由溶于适当水性缓冲液的3333μg肽免疫原(1,111μl，3mg/ml)及CpG1或CpG2寡核苷酸制备的免疫刺激复合物。表3和表4显示了用于确定所采用的每种试剂的相对量的计算。

具体而言，为了以LHRH∶CpG1电荷比例4∶1由LHRH肽免疫原制备免疫刺激复合物，使用244μg CpG1寡核苷酸(122μl，2.0μg/ml)。

具体而言，为了以IgE∶CpG1电荷比例4∶1制备IgE肽免疫原的免疫刺激复合物，使用387μg CpG1寡核苷酸(193.5μg，2.0μg/μl)。为了形成IgE∶CpG1的1∶1中性复合物，使用1,548μg CpG1寡核苷酸(774.0μl，2.0μg/μl)。

具体而言，为了以CD4∶CpG2电荷比例2∶1制备CD4肽免疫原的免疫刺激复合物，使用402μg CpG2寡核苷酸(201μl，2.0μg/μl)。为了形成CD4∶CpG2电荷比例1∶2，使用1608μg CpG2寡核苷酸(804μl，2.0μg/μl)。

分别向每个容器中加入额外的稀释用水性溶剂使得水相的终体积固定为3.0ml，用于制备ISA Montanide

720w/o乳剂。

对于LHRH或IgE肽，发现生理盐水或PBS适合于络合。每种肽免疫原的计算IP高于9.0(表1)，大大高于所选择水性溶剂的pH。

在CD4肽的情况中，水性溶剂的选择证明是重要的。在用生理盐水或PBS稀释后，观察到溶液中快速形成固体沉淀。这种不稳定性将排除这种免疫原联合肠胃外路径的使用。对肽免疫原的检查揭示肽序列SEQ IDNO：6(表1)的计算电离点为6.91。在PBS(pH约7.2)中，这种肽将趋向于聚集且预计展示不稳定性。这个问题的一种解决办法是首先在蒸馏去离子水中制备免疫刺激复合物，随后用具有足够离子强度的盐水或PBS稀释以确保混悬液是等渗的且适合于注射。

此实施例证明了稳定溶液中LHRH、IgE或CD4肽免疫刺激复合物形式的免疫原的优势。

然后将稀释后的水性溶液或混悬液缓慢加入装有7.0ml ISAMontanide

720的干的25ml反应容器中。在添加时以低速(2000-3000rpm)均化(高剪切实验室混合仪，密闭单元，Silverson)混合物以生成粗糙乳状液。维持这一加工速度直至水性样品添加完毕，然后继续整整2分钟以确保水相与油相的均一预混合。然后将均化速度调高(5000-8000rpm)并再维持5-10分钟，导致均匀的白色精细分散w/o乳剂的形成。

一旦如上文所述配制成混悬液或油包水乳剂，免疫原的终浓度为200μg/ml。

实施例4c：通过均化方法制备的油包水乳剂的稳定性评估

通过多种方法检查了通过均化制备的w/o乳剂的一致性和稳定性。为了证明乳剂是油包水(w/o)而非水包油(o/w)或水包油包水(w/o/w)，将一小滴组合物加到装有蒸馏去离子水的烧杯中。w/o乳剂小滴将漂浮在表面上而不会分散到水中。相反，o/w乳剂小滴将立即分散到水中，而w/o/w双重乳剂小滴将既分散在表面上又分散到大量水相中。观察到由ISAMontanide720制备的乳剂的小滴漂浮在表面上，只有很小的分散；而观察到由ISA Montanide

51油制备的乳剂的小滴漂浮在表面上，基本上没有分散。这些结果指示乳剂是w/o，而且趋向分散的倾向高于由ISAMontanide

720制备的w/o乳剂。这与油自身的初始粘度及由此生成的乳剂的粘度有关。对于将由此生成的疫苗制剂的贮存库潜力最大化而言，这是一项重要的考虑因素。

检查了成品乳剂和油的表观粘度(Brookfield DV-1+旋转粘度计)，即大量对大量一致性和长期稳定性试验。ISA Montanide

720在25℃具有约15mPa的粘度，而由ISA Montanide

720制备的w/o乳剂在25℃具有约45-50mPa的粘度。这提供了相当流动性的产品，这对于促进操作和用注射器分发疫苗是理想的。

相反，ISA Montanide

51在20℃具有约50mPa的粘度，而由ISAMontanide

制备的w/o乳剂在25℃具有约1500-2900mPa的粘度。发现粘度的大幅度变化是缓冲液选择的函数。(PBS为约2900mPa，NS为约2500mPa，而蒸馏去离子水为约1500mPa)这种高粘度物质在用注射器转移和分发时会呈现一些困难。然而，这些组合物的长期稳定性得到了改善。评估了乳剂的长期稳定性，即将1ml每种乳剂置于1.5ml离心管中，并以高速(5000rpm)离心内容物10分钟。这些条件不是模拟真实的储藏条件，但是能够用于预测乳剂对分离的抵抗力。在ISA Montanide

720的情况中，5-10％的体积析出，在表面上观察到清澈或淡黄色的油相。在ISAMontanide

51的情况中，0-2％的体积析出，在表面上观察到清澈或淡黄色的油相。ISA Montanide

51乳剂产品的较高粘度就是较高沉降稳定性和分离抵抗力的原因。

通过光学显微术(Nikon DIAPHOT 200)进一步表征了w/o乳剂的颗粒大小和分布。获得了每种组合物的显微照片，并使用计算机生成标尺估算了颗粒的大小范围。标尺自身外部参考了已知颗粒大小标准(NIST可追踪微粒-Duke Scientific)。对于由ISA Montanide720或ISAMontanide

51及肽免疫原制备的w/o乳剂，颗粒大小基本上是相同的(大约1-2微米)，同时有最低限度的聚集或聚结。对于由ISAMontanide720或ISA Montanide

51及免疫刺激复合物制备的w/o乳剂，颗粒大小略大一点(大约1-3微米)，同时有最低限度的聚集或聚结。图4是由w/o乳剂获得的显微照片，所述乳剂是通过均化由ISA Montanide

51及衍生自100μg LHRH肽免疫原的免疫刺激复合物制备的，LHRH∶CpG1的最终电荷比例为4∶1。

初始平均颗粒大小的量级为10微米。在高剪切下均化免疫刺激复合物水性混悬液的过程导致较小的平均聚集物颗粒大小。得到了稳定的w/o乳剂，小滴的大小在1-3微米范围内。

实施例5a：利用低剪切挤压的油包水乳剂的一般性制备

此实施例举例说明了使用挤压技术以多种比例由衍生自LHRH、IgE或CD4免疫原的阳离子肽或者衍生自LHRH、IgE或CD4免疫原及CpG1或CpG2寡核苷酸的免疫刺激复合物形成w/o乳剂的过程。表3和表4显示了用于测定所采用每种试剂的相对量的一般计算。图3显示的流程图例示了经本文所述挤压形成乳剂的过程。

所有的玻璃器皿、搅棒和移液枪枪头以及整个挤压机械都在使用前于121℃高压灭菌40分钟。所有的试剂都在层流通风橱中称量、分装、转移或添加至反应容器中以防止污染。

挤压过程涉及反复使一个注射器中的水相通过连接两个注射器的细孔管进入第二个注射器中的油相。当流体在压力(通常是100psi)下通过细孔时发生乳化。相反，均化系统通常是在超过1000psi的压力下运作的。对于上述挤压过程而言，在形成视觉上均一的w/o乳剂之前所必需的往返通过次数常常超过20-30次。这种手工挤压过程不会产生显著的剪切力，而且有效生成w/o乳剂所需要的交换次数是高度变化的。w/o乳剂的物理特性不一致，而且整体稳定性及由此产生的体内效力通常高度不可再现。尽管存在这些问题，通过这种方法生成的产品仍然具有大量的可能应用。

为了克服这些缺点，已经开发了一种挤压机械(LiposoFast^TM Basic，Avestin公司，渥太华，加拿大)。该装置由通过luer锁固定的两个注射器(0.5ml或1.0ml)组成，并以细孔通道连接支架，支架装有限定孔径大小的聚碳酸酯膜，所述膜置于两个注射器之间。该装置最初设计用于制备大小受控的脂质体。⁶³这种装置及相容的基于油的产品用于制备w/o乳剂的应用似乎尚未尝试。膜的孔径是可以选择的(WhatmanNucleopore，0.05μm-10μm)。较小的孔径容许在升高的剪切力下挤压分散体。可以选择较大的孔径用于配制较大尺寸的颗粒。使用这种装置能够提高乳化效率。只需要较少的往返次数来提供更加均一且稳定的产品。这种制剂的体内效力预计将更加可重现。然而，由于能够具体采用的最小体积较小即大约1.0ml且油成分的选择存在实践限制，因此这种方法仍然存在限制。

对于制备由ISA Montanide

720衍生的w/o乳剂，这种方法效果较好。然而，由ISA Montanide

51衍生的乳剂粘度较高，导致显著的反压力，从而排除了这种挤压装置的用途。同样的，这种方法最好看成是由表观粘度低于1500mPa的油制备瞬时w/o乳剂的方法。

具体而言，当需要考虑与疫苗贮存和稳定性有关的费用时，或者当患者的配合成为问题或涉及作为镇静剂的应用时，这种投递方法的花费可能是有效且实际的。理想的是，能够依靠经过专门训练的从业人员诸如医生或药剂师现场制备瞬时w/o制剂用于一般用途。

这种装置和方案可以用于制备需要控制剪切力和挤压的瞬时o/w和w/o/w微滴乳剂，或者用于制备精制产品。

实施例5b：由ISA Montanide720制备油包水乳剂

向1.0ml玻璃注射器(不透气的)中加入溶于适当水性缓冲液(111μl，3mg/ml)的333μg LHRH、IgE或CD4肽免疫原或者分别如表3和表4所述以适当比例与CpG1或CpG2寡核苷酸由溶于适当水性溶剂(111μl，3mg/ml)的333μg LHRH或IgE肽免疫原(电荷比例4∶1)或333μg CD4肽免疫原(电荷比例2∶1)制备的免疫刺激复合物。

具体而言，为了由LHRH肽免疫原以LHRH∶CpG1电荷比例4∶1制备免疫刺激复合物，加入24.3μg CpG1寡核苷酸(12.2μl，2.0μg/ml)。

为了由IgE肽免疫原以IgE∶CpG1电荷比例4∶1制备免疫刺激复合物，加入38.7μg CpG1寡核苷酸(19.4μl，2.0μg/μl)；或者，为了形成IgE∶CpG1的1∶1中性复合物，加入154.8μg CpG1寡核苷酸(77.4μl，2.0μg/μl)。

为了由CD4肽免疫原以CD4∶CpG2电荷比例2∶1制备免疫刺激复合物，加入40μg CpG2寡核苷酸(20μl，2.0μg/μl)；或者，为了形成CD4∶CpG2电荷比例1∶2的复合物，加入160μg CpG2寡核苷酸(80μl，2.0μg/μl)。

加入额外的稀释用水性溶剂使得水相的终体积为300μl。

向第二个1.0ml玻璃注射器(不透气的)中加入700μl ISA Montanide

720。将注射器通过luer锁连接含有膜持有者和支架(用于支持聚碳酸酯膜滤器)的挤压驾单元。选择孔径3μm或5μm的膜滤器用于由水相中的肽免疫原制备w/o乳剂。反之，选择孔径5μm或10μm的膜滤器用于由水相中悬浮的免疫刺激复合物制备w/o乳剂。然后首先使水相穿过膜进入油相，通常极其容易。随后的交换需要额外压力，因为乳化过程中产生升高的反压力。8-12次流通后，挤压反压力达到均衡，而且通常获得均一的白色乳剂。

一旦如上文所述配制成溶液或油包水乳剂形式的免疫刺激复合物，免疫原的终浓度为200μg/ml。

实施例5c：通过挤压制备的油包水乳剂的稳定性评估

稳定性测试与实施例4c中所进行的类似，通过挤压过程制备确认这些组合物是w/o乳剂。观察到置于蒸馏去离子水表面的小滴漂浮着且具有最低限度的分散。发现由此生成的乳剂的粘度范围为约35-40mPa，与实施例4c中的高能均化系统相比有略微下降。乳剂小滴的大小分布大于类似的均化系统。由肽免疫原制备的w/o乳剂为大约1-3微米，由免疫刺激复合物制备的w/o乳剂为2-5微米。为了进行比较，图5是由通过挤压由ISA Montanide

720与免疫刺激复合物制备的w/o乳剂样品获得的显微照片，所述免疫刺激复合物衍生自200μg LHRH肽免疫原和CpG1寡核苷酸，最终的LHRH∶CpG1电荷比例是4∶1。

一般而言，如图5所示通过低能挤压方法获得的小滴的大小与图4所示的高能均化小滴相比较大且更加高度聚集。总之，这些瞬时w/o乳剂对于立即或当天使用而言足够稳定。

实施例6a：原位聚合凝胶的制备

此实施例举例说明了形成原位凝胶基质和使用直接重建技术包裹以多种比例由IgE或CD4免疫原及CpG1或CpG2寡核苷酸衍生的免疫刺激复合物的过程。图6显示的流程图显示了如本文所述通过重建由肽免疫原或免疫刺激复合物制备原位凝胶制剂的过程。

所有的玻璃器皿、搅棒和移液枪枪头都在使用前于121℃高压灭菌40分钟。所有的试剂都在层流通分橱中称量、分装、转移或添加至反应容器中以防止污染。

一般而言，将不同重量百分比的PLG或PLGA共聚物(BoehringerIngelheim)溶于生物相容溶剂诸如二甲基亚砜(DMSO，Aldrich)。对于较高分子量的聚合物，溶解过程需要剧烈搅动并持续搅动维持4-6小时以确保完全溶解。然后将聚合物溶液滤过孔径0.45微米的有机溶剂相容膜(Phenomenex，PTFE)。向滤出液中加入阳离子肽免疫原溶液，或者更优选的是免疫刺激复合物在适当生物相容溶剂中的混悬液。首先将肽免疫原或肽/CpG复合物或其混合物冻干(如实施例3所述)，随后溶解或重悬于适当的生物相容溶剂，诸如DMSO。

极性非质子溶剂诸如DMSO的使用在长期肽稳定性方面可能会有一些问题。已知DMSO是有力的氧化剂，而包含敏感氨基酸诸如半胱氨酸和色氨酸的肽在这些溶液中可能在化学上不相容。因此，包含这些残基的肽免疫原可能不得不在立即使用地点重建。

在使用时直接在小瓶中将冻干的肽免疫原或免疫刺激复合物或其混合物重建成DMSO中的聚合物溶液，从而避免肽免疫原长时间暴露于DMSO。肽免疫原的溶解或者免疫刺激复合物或免疫刺激复合物与肽免疫原的混合物的重悬是快速的，需要温和摇动以确保样品的均一性。

对于这些普通组合物，预计稳定性和制造问题是最低限度的。与溶解或悬浮于水性溶液中的肽免疫原相比，无水DMSO中的聚合物溶液不易受水解降解的影响。可以将聚合物溶液冷冻(DMSO在大约18℃冻结)，且融化后物理特性没有可检测的变化。还预计以冻干状态分离的肽或免疫刺激复合物将在不存在水时展示稳定性升高。

如此的聚合物与肽免疫原或免疫刺激复合物的混合物构成了适合于皮下或肌肉内注射的单相溶液或混悬液。

对两种系统同样重要的是溶液或混悬液的粘度。这直接影响通过皮下或肌肉内路径注射组合物的能力。

这些系统的表观粘度是多种因素的函数，包括PLG或PLGA共聚物的组成、分子量、结晶度和固有粘度。这些因素界定了每种聚合物能够溶解同时维持实际流动特性的有用量(以重量计)。表5显示了所选择的PLG或PLGA聚合物的物理特性以及可以溶于DMSO以获得实际使用的溶液粘度的相应重量百分比。通过Brookfield DV-1+旋转粘度计测定了这些溶液的表观粘度。

随意选择了100mPa作为这些组合物的预期上限。在大多数情况中，作为表观粘度低于200mPa的原位胶凝聚合物溶液而配制的溶液或混悬液能够通过常规注射器均一投递。

与提供100mPa表观粘度的需要相比聚合物相对于溶剂过量的聚合物/DMSO溶液对于其它投递形式将是有价值的，包括常规注射器或无针方法。注射后的胶凝行为和免疫原的爆发式释放与组合物中的聚合物浓度部分有关。因此，使胶凝速率最大化和降低免疫原的爆发式释放将是考虑开发任选的单剂受控释放组合物时的两个额外设计参数。

实施例6b：由PLGA Resomer

-RG 503H或RG 504H制备聚合物凝胶

向装配有搅棒的两个分开的25ml烧瓶中分别加入2200mg RG 504H或2750mg RG 503H。用移液管向每个烧瓶中加入10.0ml无水DMSO(1.1mg/ml)。将混合物于室温剧烈搅动大约2-3小时，此后共聚物完全溶解。完全溶解后，将储液滤过0.45μm有机溶剂稳定的膜滤器(Phenomenex，PTFE)。RG 504H和RG 503H聚合物对DMSO溶剂的最终重量百分比分别是20％和25％。

然后用注射器将10ml如此制备的聚合物/DMSO溶液加到装有冻干IgE或CD4肽免疫原(2000μg)或由2000μg IgE肽混合232μg CpG1寡核苷酸(116μl，2.0μg/μl)或2000μg CD4肽混合241μg CpG2寡核苷酸(120.5μl，2.0μg/μl)而衍生的冻干免疫刺激复合物(IgE∶CpG1电荷比例4∶1或CD4∶CpG2电荷比例2∶1)的小瓶中。溶液中的免疫原或混悬液中免疫刺激复合物的形式的终浓度为200μg/ml。立即将免疫原或免疫刺激复合物在溶液或混悬液中重建，同时温和摇动以确保内容物均一。

发现以特定重量比例由这些聚合物制备的溶液的表观粘度接近100mPa。(见表5)。对于粘度接近100mPa的溶液而言，Resomer

RG503H、Resomer

RG 504H和Resomer

RG 756的浓度是至关重要的，Resomer

RG 503H和Resomer

RG 504H具有低得多的固有粘度，而且二者都衍生自具有无定形特征的PLGA，其中单体组成大约是50％的D，L-丙交酯和50％的乙交酯。预计这些物质将在体内以6-8周50％聚合物的速率降解。因此，包裹的成分将具有2-3个月的释放特性，并由Resomer

RG 503H或Resomer

RG 504H制备凝胶。由这些物质制备的凝胶将最适合于短期单剂受控释放应用。相反，Resomer

RG 756是更加结晶的聚合物，由75％的D，L-丙交酯和25％的乙交酯残基组成。50％的聚合物在体内降解可能需要4-6个月，因此包裹成分的释放速率将更加延长。预计Resomer

RG 756将更加适合于长期单剂受控释放应用。

实施例7：配制成免疫刺激复合物或w/o乳剂或联合物中的IgE和CD4肽免疫原的免疫原性

此实施例举例说明了与CpG1或CpG2寡核苷酸一起配制成免疫刺激复合物、w/o乳剂或分散于w/o乳剂中的免疫刺激复合物的IgE和CD4肽免疫原在经肌肉内免疫的豚鼠中的免疫原性。w/o乳剂是通过实施例4a/4b所述的均化或实施例5a/5b所述的挤压而制备的。

第0、3和6周用下列组合物肌肉内(I.M.)免疫每组3只6-8周龄雌性豚鼠(Covance Research Product Inc，丹佛，宾夕法尼亚州)：100μg如表4所述制备的IgE肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1和电荷比例1∶1)，悬浮于终体积250μl PBS pH7.4；75μl如表4所述制备的CD4肽/CpG2免疫刺激复合物(电荷比例2∶1和电荷比例1∶2)，悬浮于终体积250μlPBS pH7.4；溶于75μl PBS pH7.4并用ISA Montanide

720乳化的IgE肽(175μl)；溶于75μl蒸馏去离子水并用ISA Montanide

720乳化的CD4肽(175μl)；如表4所述制备的溶于75μl PBS pH7.4并用ISA Montanide

720乳化的IgE肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1和电荷比例1∶1)(175μl)；或如表4所述制备的溶于75μl蒸馏去离子水并用ISAMontanide720乳化的CD4肽/CpG2免疫刺激复合物(电荷比例2∶1和电荷比例1∶2)(175μl)。

豚鼠在接受免疫刺激复合物、包含肽免疫原的w/o乳剂或包含免疫刺激复合物的w/o乳剂后不显示宏观病理学或行为变化。第+3、+5、+9、+11和+17周采集血清，并通过免疫原特异性ELISA评估抗IgE抗体(在IgE免疫原的情况中)或抗CD4抗体(在CD4免疫原的情况中)的存在与否。

抗IgE抗体的测量

通过IgE肽ELISA测定了抗IgE肽滴度，并通过人IgE ELISA测定了与人IgE的交叉反应性。如先前所述⁶⁴，用于测定抗IgE肽反应性的肽ELISA是在用有靶抗原位点而无T辅助位点的肽包被的微量滴定板中进行的。为了测定抗人IgE交叉反应性，在以同样方式用人IgE骨髓瘤蛋白质(American Biosystems Inc，产品目录编号A113)以5μg/ml包被的微量滴定板中进行了人IgE ELISA。

用辣根过氧化物酶标记的抗豚鼠IgG山羊抗体检测捕获的抗肽或抗IgE抗体。根据吸光度的线性回归分析来计算以log₁₀稀释度倒数表述的ELISA滴度，截止A₄₉₂设置为0.5。此截止值是严格的，因为每次测定时稀释后正常豚鼠对照样品的数值均低于0.15。将超免疫豚鼠的抗IgE肽免疫原抗血清用作阳性对照。将免疫前血清用作阴性对照。

抗CD4抗体的测量

针对结合重组可溶性CD4的ELISA是在用rsCD4(AmericanBioTechnologies)以0.25μg/ml(每个孔使用100μl，在10mM NaHCO₃缓冲液pH9.5中)包被的96孔微量滴定板中进行的。将孔用250μl 3％明胶封闭，用溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)的0.05％吐温20清洗，并干燥。将测试孔与100μl稀释后的免疫血清于37℃反应1小时。将孔用溶于PBS的0.05％吐温20清洗，与100μl经1∶1000稀释(稀释剂为溶于PBS的1％山羊血清、0.05％吐温20)的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Pierce)反应，并清洗。加入100μl溶于柠檬酸钠缓冲液pH5.0的0.04％(重量)邻苯二胺(OPD)底物(Pierce)和0.12％H₂O₂，进行15分钟。加入100μl 1.0M H₂SO₄终止反应，并测定A₄₉₂。将超免疫豚鼠抗CD4肽免疫原抗血清用作阳性对照。将免疫前血清用作阴性对照。

通过竞争性ELISA测量功能抗原性

在此竞争性ELISA中，通过测试所引发的抗体竞争性抑制功能性单克隆抗体即mAb B4(它的已知特异性是针对宿主细胞表面上结合HIV的CD4复合物)的能力而为CD4免疫原定量功能抗原性。这种抗结合位点单克隆抗体已经详细鉴定了与HIV结合复合物的高亲合力、结合可溶性重组CD4(rsCD4)的结构域1、和中和HIV-1主要分离物的能力。⁶⁵

通过蛋白A亲和层析纯化抗结合位点单克隆抗体，并缀合辣根过氧化物酶。将mAb B4-HRP缀合物在测定中用作示踪剂，浓度为0.5μg/ml。用溶于0.1M碳酸钠缓冲液pH9.5的1μg/ml重组可溶性CD4蛋白质包被96孔微量滴定板，保温过夜。在微量滴定板中进行反应，在100μl总体积的PBS/山羊血清/明胶/吐温20中含有连续稀释的免疫血清(豚鼠、猪、或狒狒)和30μl mAb B4-HRP日常储液。将稀释后的血清和mAb B4-HRP预先保温，然后将混合物加到孔中。竞争性ELISA的阳性对照是5μl溶于正常血清的0.5μg/ml未标记抗结合位点mAb，阴性对照是正常血清。向包被孔中加入100μl血清/抗体稀释液混合物，并于37℃保温1小时。将板吸干并清洗，通过与生色团的反应来检测结合的mAb B4-HRP。生色团是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，且于A₄₅₀检测TMB结合mAb B4缀合物。由10μg/ml纯化mAb B4在适当物种正常血清中的连续稀释液获得校准曲线，以获得竞争性抑制mAb B4-HRP结合人重组可溶性CD4的免疫血清稀释液的mAb等效值。

病毒中和测定法

如先前所述⁶⁶进行MT-2微斑测定法，只是热灭活血清在含15％FBS、抗生素、2％谷氨酰胺和碳酸氢盐缓冲液的50％高葡萄糖DMEM和50％合并的除去纤维蛋白的正常人血浆中连续稀释。在此测定法中，将稀释血清与20pfu HIV在微量滴度孔中一起保温。加入对HIV敏感的MT-2细胞，并通过离心力在熔化的琼脂糖下形成单层。通过一周后存在的碘化丙锭染色斑来检测残余病毒感染力。终点是噬斑计数减少50％或90％时的血清稀释度。

免疫原性结果

图7(均化系统)和图9(挤压系统)显示了经IgE免疫原免疫后的血清抗体滴度，而图8(均化系统)和图10(挤压系统)显示了经CD4免疫原免疫后的血清抗体滴度。表6比较了由CD4肽研究(均化和挤压w/o乳剂系统)中分别于第9周、第11周和第17周获得的血清测定的B4单克隆抗体的竞争性抑制。表7比较了由CD4肽研究(均化和挤压w/o乳剂系统)中分别于第9周和第11周获得的血清测定的病毒中和活性(分别为50％和90％抑制)。对照试验证明了在所有情况中无辅佐的肽都没有免疫原性或者有微弱免疫原性。

如图7-10所示，对于IgE和CD4疫苗二者而言，免疫的结果指示免疫刺激复合物有辅佐作用，而且第9周的滴度略低于或相当于由w/o乳剂获得的滴度，无论乳剂是通过均化或挤压技术获得的。

通过两种方法制备的免疫刺激复合物分散成w/o乳剂的联合系统一致提供最高的持续免疫应答。如图7-10所示，发现由IgE和CD4免疫原引发的抗体滴度自第11周至第17周都处于对数单位的量级，或者高于由免疫刺激复合物单独或w/o乳剂与肽单独获得的抗体滴度。对此唯一例外是通过均化制备的CD4 w/o乳剂，直至第17周也没有发现这种分离。

这一观察结果进一步得到了表6和表7中加粗的由CD4肽竞争性抑制和病毒中和研究获得的数据的支持，其中与简单w/o乳剂或单独含CD4肽免疫刺激复合物相比，由含CD4肽/CpG2寡核苷酸(CD4∶CpG2电荷比例2∶1)的w/o乳剂联合系统获得的免疫血清竞争性抑制最高水平的B4单克隆抗体。此外，相同制剂显示引发针对感染性病毒的中和活性的最高效率。

注意到均化或挤压制剂之间存在较小差异，包括所观察到的通过ELISA获得的针对IgE或CD4免疫原所引发的滴度达到峰值的速率。挤压制备的w/o乳剂较早达到免疫应答峰值(第9周)，尽管所获得应答的持续时间良好(第11周基本上相当而第17周略微降低)。类似的均化系统稍后达到峰值(第11周)，而且提供了持续应答，正如可以通过在第17周看到的高滴度持续。

这种趋势还得到了表6和表7中加粗的由CD4肽/mAb B4-HRP竞争性抑制测定法和病毒中和研究获得的数据的支持。

到第9周，对由经w/o乳剂系统免疫的动物获得的血清进行的测定显示竞争性抑制高水平B4单克隆抗体，所述w/o乳剂系统由未络合CD4肽通过均化(87.2％)或通过挤压(88.6％)。发现这些数据的量级(在试验误差范围内)与由经CD4肽/CpG2寡核苷酸(2∶1)的w/o乳剂联合系统免疫的动物获得的血清的数据相同，所述w/o乳剂联合系统通过均化(70.1％)或通过挤压(94.9％)制备。到第17周，对由经w/o乳剂系统免疫的动物获得的血清测定竞争性抑制显著较低水平的B4单克隆抗体，所述w/o乳剂系统由未络合CD4肽通过均化(11.2％)或通过挤压(42.6％)制备。抑制程度不再大体相当于由经CD4肽/CpG2寡核苷酸(2∶1)的w/o乳剂联合系统免疫的动物获得的血清的抑制程度，所述w/o乳剂联合系统通过均化(85.0％)或通过挤压(77.2％)过程制备。

此外，由CD4肽制剂获得的血清在测定感染性HIV-1病毒中和活性时显示相同趋势。

到第9周，对由经w/o乳剂系统免疫的动物获得的血清的测定基本上中和相同百分比的感染性HIV-1病毒(在试验误差范围内)，所述w/o乳剂系统由未络合CD4肽通过均化(对于50％病毒中和是73％或对于90％病毒中和是27％)或通过挤压(对于50％病毒中和是31％或对于90％病毒中和是12％)制备。对由经CD4肽/CpG2寡核苷酸(2∶1)的w/o乳剂联合系统免疫的动物获得的血清的测定显示均化系统在此时间点生成针对感染性HIV-1病毒中和抗体的效率明显较低，所述w/o乳剂联合系统通过均化(对于50％病毒中和是12％或对于90％病毒中和＜10％)或通过挤压(对于50％病毒中和是103％或对于90％病毒中和是33％)制备。到第11周，对由经w/o乳剂系统免疫的动物获得的血清的测定证实中和感染性HIV-1病毒的能力降低或消除(在试验误差范围内)，所述w/o乳剂系统由未络合CD4肽通过均化(对于50％病毒中和是57％或对于90％病毒中和是17％)或通过挤压(对于50％病毒中和＜10％或对于90％病毒中和＜10％)制备。对由经CD4肽/CpG寡核苷酸(2∶1)的w/o乳剂联合系统免疫的动物获得的血清的测定清楚显示均化和挤压这两种系统现在都有效引发针对感染性HIV的中和抗体应答，所述w/o乳剂联合系统免疫通过均化(对于50％病毒中和是40％或对于90％病毒中和是30％)或通过挤压(对于50％病毒中和是120％或对于90％病毒中和是39％)制备。均化系统的应答显示相对迟于挤压组合物。

对于这些趋势的一种可能解释是通过低能挤出过程制备的w/o乳剂能够在较早时间点更有效的与免疫效应物细胞相互作用或向其呈递络合的免疫原，而高能均化过程提供了更均一的乳剂且基本上担当更有效的贮存库。通过这种系统获得的免疫应答预计将延迟且潜在的更加持久。

发现分散于w/o乳剂中的免疫刺激复合物与残余未络合肽的联合物协同增强IgE和CD4免疫原的总体滴度。制备方法能够影响应答的动力学和持续时间，均化和挤压都显示适合于制备有效的疫苗。

另外，在不同的研究中，我们检查了CpG剂量对免疫应答的影响。对于IgE和CD4两种免疫原，由不同剂量的CpG1或CpG2寡核苷酸制备免疫刺激复合物(即IgE∶CpG1＝4∶1或1∶1和CD4∶CpG2＝2∶1或1∶2)，并在水性缓冲液或w/o乳剂中进行施用。发现所有组合物都具有免疫原性，然而在这两项研究中，就绝对滴度和持续时间而言，较小的寡核苷酸相对剂量(合成肽免疫原相对于寡核苷酸过量)引发较高的免疫应答。在IgE肽/CpG1寡核苷酸的情况中，排列顺序是4∶1电荷比例＞1∶1中性电荷比例，而对于CD4肽/CpG2寡核苷酸，排列顺序是2∶1电荷比例＞1∶2电荷比例。最常见的是，辅佐作用的改善可能与佐剂剂量的增加有关。在这些实施例中，我们已证明共配制的稳定化的免疫刺激复合物和未络合肽在免疫应答最大协同方面的意想不到的优点。

因此，可以推断如本实施例所述由IgE或CD4免疫原制备的免疫刺激复合物能够在体内有效辅佐免疫应答。所获得的应答相当于这些相同免疫原分散于w/o乳剂中时发现的应答，然而预计合成免疫原的完全水可分散性免疫刺激复合物的使用与将合成免疫原分散成w/o乳剂相比将产生较少的反应原性问题。

在此实施例中我们已证实了作为免疫刺激复合物的IgE或CD4免疫原联合分散于油包水乳剂载体中的未络合肽的投递提供了将免疫原最有效地呈递给免疫系统。由联合系统获得的应答显著高于由各个系统单独获得的免疫应答的总和。

此外，由经CD4免疫原的免疫刺激复合物联合分散于油包水乳剂载体中的未络合CD4免疫原免疫的动物获得的血清的测定显示比未络合CD4免疫原的简单w/o乳剂在竞争性抑制B4单克隆抗体方面更加有效。此外，这些相同系统显示在中和感染性HIV-1病毒方面最有效。

在豚鼠模型中，所获得的免疫应答的数量和寿命指示由IgE/CpG1和CD4/CpG2联合物所衍生的免疫刺激复合物是优选的。通过实验测定了由备选配对IgE/CpG2和CD4/CpG1衍生的组合物有辅助作用，但是未达到相同程度。

这些结果指出了更少和更低(免疫原/佐剂)剂量方案的可能性。在反应原性成问题的情况中，联合系统打开了施用较小体积的乳剂同时具有相似或更高水平免疫原性的可能性。

具体而言，本实施例强烈指示基于这些新联合物的制剂开发成有效剂型的潜力。

实施例8：配制成免疫刺激复合物或原位胶凝聚合物溶液或联合的IgE和CD4肽免疫原的免疫原性

此实施例举例说明了在与CpG1或CpG2寡核苷酸一起配制成免疫刺激复合物或与生物相容溶剂一起配制成原位胶凝聚合物或与生物相容溶剂一起配制成悬浮于原位胶凝聚合物中的免疫刺激复合物的IgE和CD4肽免疫原在经肌肉内免疫的豚鼠中的免疫原性。如实施例3所述制备冻干的肽免疫原或由肽免疫原和CpG寡核苷酸衍生的免疫刺激复合物。如实施例6a/6b所述制备原位胶凝聚合物。

为了检验IgE和CD4肽免疫原在配制成依照本发明形成的原位胶凝聚合物(Resomer

RG 504H)或配制成具有CpG1或CpG2寡核苷酸的悬浮于原位胶凝聚合物(ResomerRG 504H)中的免疫刺激复合物后的免疫原性，第0周用下列剂量的免疫原肌肉内(I.M.)免疫每组3只6-8周龄雌性豚鼠(Covance Research Products Inc，丹佛，宾夕法尼亚州)：如表4所述制备的、在终体积200μl PBS pH7.4中重建和悬浮的300μg冻干的IgE肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1)；或如表4所述制备的、在终体积200μl PBS pH7.4中重建和悬浮的300μg CD4肽/CpG2免疫刺激复合物(电荷比例2∶1)；或在200μl溶于二甲基亚砜(DMSO)的Resomer

RG504H(重量百分比20％)中重建和悬浮的300μg IgE肽；或在200μl溶于二甲基亚砜(DMSO)的Resomer

RG 504H(重量百分比20％)中重建和悬浮的300μg CD4肽；或如表4所述制备的、在200μl溶于二甲基亚砜(DMSO)的Resomer

RG 504H(重量百分比20％)中重建和悬浮的300μg冻干的IgE肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1)；或如表4所述制备的、在200μl溶于二甲基亚砜(DMSO)的Resomer

RG 504H(重量百分比20％)中重建和悬浮的300μg冻干的CD4肽/CpG2免疫刺激复合物(电荷比例2∶1)。

豚鼠在接受免疫刺激复合物、包含肽免疫原的DMSO中的原位胶凝聚合物或包含免疫刺激复合物的DMSO中的原位胶凝聚合物后不显示严重病理学或行为变化。第+3、+6、+9和+12周采集血清，并遵循实施例7中描述的步骤通过免疫原特异性ELISA评估抗IgE抗体(在IgE免疫原的情况中)或抗CD4抗体(在CD4免疫原的情况中)的存在与否。

免疫原性结果

图11显示了经IgE免疫原单剂免疫后的血清抗体滴度，而图12显示了经CD4免疫原单剂免疫后的血清抗体滴度。对照试验证明在两种情况中无辅佐的肽都没有免疫原性或者有微弱的免疫原性。在两项研究中，免疫的结果指示单独使用的免疫刺激复合物有适度辅佐作用，而且滴度在第9周达到峰值。相反，悬浮于原位胶凝聚合物中的未络合免疫原也得到微弱的辅佐，而且在第12周观察到峰值应答。

对于IgE和CD4免疫原二者而言，所衍生的免疫刺激复合物在悬浮成原位胶凝聚合物后引发最高的免疫应答。看到这些应答在大约第9周达到峰值，并持续到第12周。没有找到免疫刺激复合物独自或在包含原位胶凝聚合物的组合物中施用的未络合免疫原独自所获得免疫应答的数量和持续时间。

预计小分子量的免疫原诸如肽能够容易的扩散穿过聚合物植入物和凝胶，导致注射后大量的爆发式释放。可以调节控制胶凝的物理因素以迟滞这一过程；然而，如此释放的肽的大部分基本上没有得到辅佐，并且进行体内通常经历的标准降解过程。另外，仍然被包裹的小量物质预计可能不足以在聚合物降解后进行有效增强，从而必须施用剂量大得多的肽。基质内捕获的残余DMSO也存在稳定性问题，其中肽中所包含的敏感氨基酸能够被氧化。另外，已经确实证明了根据多种因素诸如凝胶微观形态学、聚合物疏水性和结晶度，水能够以不同速率穿透这些物质^45，46。穿过基质的水将促进大量的水解，即PLG/PLGA共聚物在体内进行的主要降解机制。已知这一过程伴随着显著的局部pH变化，其基本上能够将pH降至2或3。⁶⁷游离的未络合稳定化的肽对于这种环境可能不稳定，而这进一步限制了这些系统的潜力。可以采用酸性缓冲剂来帮助弥补这些问题，但是不能认为这就是理想的。以免疫刺激复合物的形式包裹肽免疫原混悬液赋予这种系统以许多稳定性和辅佐优势。一旦注射了聚合物凝胶，未被凝胶有效包裹的小量复合物(假设位于胶凝前线的表面)能够促进免疫应答的发起或引发，比单独的未络合肽免疫原更加有效。CpG寡核苷酸仍然紧密接触肽免疫原并处于复合物颗粒的形式，可以进一步保护和稳定肽免疫原免于体内酶促消化或可能由于基质内所含DMSO溶剂引起的化学不稳定性。

此外，仍然被基质捕获的颗粒形式的肽免疫原预计将比游离的未络合肽得到更好的保护而免于酸化过程。与其它可能的单剂受控释放制剂相比，以这种形式呈递的免疫原预计能够为免疫系统提供更有效的免疫原增强而引发更强烈和更长久的免疫应答。

在对照试验中，测定得出溶于RG 504H聚合物组合物(重量百分比20％)的DMSO溶液中的未络合肽免疫原的溶液在接触PBS溶液后快速胶凝。将这些样品的溶液与凝胶相分开，并通过紫外分光光度法(波长280nm)分析溶液，揭示了相当多的未络合肽(大约50-70％)与DMSO一起得到抽提。

已经发现悬浮于原位胶凝聚合物中的免疫刺激复合物与未络合肽免疫原的联合物在这些受控释放制剂中协同增强IgE和CD4免疫原的总体滴度。

在这项研究中没有分开进行用于检验CpG寡核苷酸剂量对免疫应答的影响的研究。预计可以通过采用接近电中性制备的免疫刺激复合物或者由CpG寡核苷酸提供过量负电荷或者额外的相容赋形剂来获得绝对滴度的进一步改善。在这些组合物中，大部分肽免疫原结合成免疫刺激复合物，而且由于生物相容溶剂中的共提取，注射后的胶凝过程不会导致无辅佐肽的大量损失。

因此，可以推断免疫刺激复合物能够稳定免疫刺激复合物形式的肽免疫原，而且这些组合物在联合原位胶凝聚合物后能够在体内有效辅助免疫应答。这对于意欲单剂使用的这些聚合物系统而言是尤为重要的。作为悬浮于原位胶凝聚合物载体中的免疫刺激复合物来投递免疫原提供了将免疫原最有效地呈递给免疫系统。联合系统所获得的应答显著高于由各个系统单独获得的免疫应答的总和，而且是持续的，不像通过来自聚合物的未络合肽免疫原在生物相容溶剂中的简单重建而制备的原位凝胶。

在豚鼠模型中，所获得的应答的数量和寿命指示由IgE/CpG1和CD4/CpG2联合物所衍生的免疫刺激复合物是优选的。通过实验测定了由备选配对IgE/CpG2和CD4/CpG1衍生的组合物有辅助作用，但是未达到相同程度。

这些结果指出了单剂方案的可能性。具体而言，本实施例强烈指示基于这些新的即时重建的联合的制剂用于开发成有效受控释放剂型的潜力。

实施例9：免疫刺激复合物和无机盐混悬液的联合物的制备

此实施例举例说明了由衍生自LHRH肽免疫原(SEQ ID NOS：7-9，溶液中的摩尔比例为1∶1∶1)的阳离子肽或以多种比例衍生自LHRH肽免疫原及CpG1寡核苷酸的免疫刺激复合物制备无机盐混悬液的过程。图16显示的流程图例示了如本文所述制备混合混悬液的过程。

所有的玻璃器皿、搅棒和移液枪枪头都在使用前于121℃高压灭菌40分钟。所有的试剂都在层流通风橱中称量、分装、转移或添加至反应容器中以防止污染。

向装配有搅棒的5.0ml玻璃瓶中加入100μg(250μl，0.4mg/ml)或1600μg(534μl，3.0mg/ml)溶于水性溶液的LHRH肽免疫原。在蒸馏去离子水中由LHRH免疫原和CpG1寡核苷酸制备两种电荷比例(即4∶1或1.5∶1)的免疫刺激复合物。

具体而言，由100μg或1600μg LHRH免疫原制备4∶1复合物分别需要7.3μg或116.8μg CpG1寡核苷酸(2.0mg/ml)，而由1600μg LHRH免疫原制备1.5∶1复合物分别需要350.4μg CpG1寡核苷酸(2.0mg/ml)。

表9显示了用于确定对于特定电荷比例与LHRH肽免疫原络合形成固定最终剂量25μg/0.5ml或400μg/0.5ml所需要的CpG1寡核苷酸相对量的计算。

向第二个5.0ml玻璃瓶中加入1.0ml溶于蒸馏去离子水的

(3.2mg/ml铝)无机盐混悬液。首先通过加入0.1N NaOH将所采用Alhydrogel

贮存混悬液的pH调至pH7.1-7.4。pH测量是使用分辨率+/-0.3pH单位的pH指示条进行的。

将无机盐混悬液加到装有免疫刺激复合物及残余未结合免疫原的瓶中，并搅动30分钟平衡。

向Alhydrogel

与免疫刺激复合物的混合物中加入90μl 20％NaCl(用于张力)、5.0μl 2-苯氧基-乙醇(2-PE)防腐剂(在选择的情况中)和额外的蒸馏去离子水以确保制剂的终体积为2.0ml。

一旦如上所述配制成免疫刺激复合物联合无机盐的混悬液，免疫原的终浓度分别为25μg/0.5ml或400μg/0.5ml。所制备的Alhydrogel

的终浓度取决于靶物种。在0.4mg铝/0.5ml条件下制备意欲用于啮齿类的制剂，而在0.8mg铝/0.5ml的条件下制备意欲用于非人灵长类的制剂。在所有情况中，调整最终制剂的张力(0.9％NaCl)，而且用于非人灵长类的制剂包含防腐剂(0.25％v/v，2-PE)。

实施例10：与无机盐一起配制成免疫刺激复合物混悬液的LHRH肽免疫原在啮齿类中的免疫原性

此实施例举例说明了与CpG1寡核苷酸一起配制成免疫刺激复合物并联合无机盐的LHRH肽免疫原在经肌肉内免疫的雄性大鼠中的免疫原性。无机盐混悬液是如实施例9所述制备的。

第0、4和8周用下列组合物肌肉内(I.M.)免疫每组4只6-8周龄Sprague-Dawley雄性大鼠：将25μg LHRH肽悬浮于500μl蒸馏去离子水中；将25μg LHRH肽悬浮于250μl蒸馏去离子水并添加250μl(1.6mg铝/ml)；将如表9所述制备的25μg LHRH肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1)悬浮于500μl蒸馏去离子水；将如表9所述制备的25μgLHRH肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1)悬浮于250μl蒸馏去离子水并添加250μl(1.6mg铝/ml)。向每种制剂中加入45μl 20％盐溶液和455.0μl蒸馏去离子水。每种制剂的终体积是1.0ml。

大鼠在接受包含肽免疫原的无机盐或包含免疫刺激复合物的无机盐后不显示严重病理学或行为变化。第+0、+4、+6、+8和+12周采集血清，并通过免疫原特异性ELISA评估抗LHRH抗体的存在与否，通过RIA免疫测定法评估血清睾酮。

抗LHRH抗体的测量

通过ELISA使用以LHRH肽⁵⁴作为免疫吸收剂包被的96孔微量滴定板测定了抗体活性。

将浓度为5μg/ml的等分试样(100μl)肽免疫原溶液于37℃保温1小时。随后将孔用3％明胶/PBS溶液于37℃封闭1小时。然后将板干燥并用于测定。将等分试样(100μl)待测免疫血清加到肽包被板中，以样品稀释缓冲液中的1∶100稀释度起始，然后10倍连续稀释。将板于37℃保温1-1.5小时。将板用溶于PBS的0.05％吐温20清洗6次。以缀合物稀释缓冲液(含0.5M NaCl和正常山羊血清的PBS)中的适当稀释度加入100μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG(Cappel)用于对大鼠血清进行的测定、100μl山羊抗猪辣根过氧化物酶标记的IgG(Pierce)用于对猪血清进行测定或100μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(Anogen)用于对狒狒血清进行测定。将板于37℃保温1小时，并如上文所述清洗。加入溶于柠檬酸钠缓冲液pH5.0的等分试样(100μl)0.04％(重量)邻苯二胺(OPD)底物(Pierce)和0.12％H₂O₂，进行15分钟。加入50μl 2N H₂SO₄终止反应，并对每个孔测定A₄₉₂。

根据吸光度的线性回归分析来计算ELISA滴度，截止A₄₉₂设置为0.5。此截止值是严格的，因为每次测定时稀释后正常对照样品的数值均低于0.15。

血清睾酮的测量

评估免疫原的功效，即通过RIA评估血清睾酮值。使用来自DiagnosticProducts(洛杉矶，加利福尼亚州)的RIA试剂盒依照制造商的指示测量血清睾酮水平。睾酮的检测下限的范围为0.01-0.03nmol/L。每个样品分析两份。

当睾酮水平低于检测下限时，将血清样品评为阉割水平；而当睾酮水平低于0.1nmol/L时，将血清样品评为“接近阉割”。

免疫原性结果

图13a显示了经LHRH免疫原免疫后的血清抗体滴度。图13b显示了相应的血清睾酮水平。

在此项研究中由得自雄性大鼠的血清测定的抗体滴度证明LHRH肽在缓冲液中的组合物或LHRH肽与Alhydrogel

无机盐的联合物都没有免疫原性。相反，如图13a所示，由LHRH/CpG1免疫刺激复合物独自或联合Alhydrogel

无机盐衍生的组合物都显示具有免疫原性。

这些稍后两组的抗体应答证明在前8周是相似的。到第12周，由LHRH免疫刺激复合物与Alhydrogel

无机盐的联合系统发现的抗体滴度只是略微好于(即约0.5个对数单位)由LHRH免疫刺激复合物单独测定的抗体滴度。

由LHRH肽在缓冲液中的组合物和LHRH肽联合Alhydrogel

无机盐测定的相应血清睾酮水平类似证明LHRH肽或LHRH肽及无机盐制剂都不能在雄性大鼠中实现免疫阉割。

相反，如图13b所示，由LHRH肽/CpG1单独和LHRH肽/CpG1寡核苷酸联合Alhydrogel

无机盐衍生的免疫刺激复合物都能有效的免疫阉割每组中的所有大鼠。

由LHRH免疫刺激复合物联合Alhydrogel

无机盐衍生的组合物在第6周(首次增强后两周)实现了每只大鼠的完全免疫阉割。由LHRH免疫刺激复合物单独衍生的组合物直到第10周(第二次增强后两周)也未实现相似的免疫阉割水平。

在此实施例中，我们已证明了新的接种方案以获得有效的免疫阉割(通过血清睾酮来测量)，使用由LHRH免疫刺激复合物(在三剂免疫策略中)或LHRH免疫刺激复合物联合无机盐(在两剂免疫策略中)制备的组合物。

单独与LHRH肽免疫原施用的Alhydrogel

无机盐证明是无效的佐剂。然而，一旦与免疫刺激复合物形式的LHRH免疫原一起配制，这种联合物协同产生甚为优异的结果。无机盐自身可能以两种模式发生作用。第一种可能是提供贮存库将免疫刺激复合物局限于注射部位，第二种可能是募集能够推动将免疫原呈递给免疫系统的免疫系统特化细胞。

用候选无机盐即Adju-phos(衍生自磷酸铝)进行平行试验，只有由LHRH免疫刺激复合物联合Adju-phos

无机盐衍生的系统在第8周实现了所有大鼠的完全免疫阉割。

实施例11：配制成免疫刺激复合物及无机盐混悬液的LHRH肽免疫原在狒狒中的免疫原性

此实施例举例说明了以多种比例与CpG1寡核苷酸一起配制成免疫刺激复合物并联合无机盐的LHRH肽免疫原在经肌肉内免疫的雄性狒狒中的免疫原性。无机盐混悬液是如实施例9所述制备的。

第0、4和8周用下列组合物肌肉内(I.M.)免疫每组2只2年龄雄性狒狒：如表9所述制备的悬浮于500μl蒸馏去离子水的400μg LHRH肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1或5∶1)；如表9所述制备的悬浮于250μl蒸馏去离子水的400μg LHRH肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1或1.∶1)并添加250μlAlhydrogel

(3.2mg铝/ml)。向每种制剂中加入45μl 20％盐溶液、2.5μl 2-苯氧基-乙醇和452.5μl蒸馏去离子水。每种制剂的终体积是1.0ml。

狒狒在接受两种比例或联合

无机盐的免疫刺激复合物后不显示严重病理学或行为变化。第+0、+4、+6、+8、+12和+14(只是对1.5∶1复合物)周采集血清，并通过免疫原特异性ELISA评估抗LHRH抗体的存在与否，通过RIA免疫测定评估血清睾酮。

免疫原性结果

图14a显示了经LHRH免疫原免疫后的血清抗体滴度。图14b和14c分别显示了每只狒狒的相应血清睾酮水平。

如图14a所示，由得自经以电荷比例4∶1或1.5∶1制备的LHRH免疫刺激复合物或者以电荷比例4∶1或1.5∶1制备的LHRH肽免疫刺激复合物联合Alhydrogel无机盐免疫的雄性狒狒的血清测定的抗体滴度指示所有组合物都有免疫原性。

发现以电荷比例4∶1制备的两种系统的抗体滴度都略微高于由1.5∶1系统获得的抗体滴度，无论是否存在

无机盐。

如图14b所示，由得自经不含

无机盐且以电荷比例4∶1制备的LHRH免疫刺激复合物免疫的雄性狒狒的血清测定的相应血清睾酮水平证明对试验的两只狒狒都完全无效。

如图14c所示，由不含Alhydrogel

无机盐且以电荷比例1.5∶1制备的LHRH免疫刺激复合物配制的系统显示更有效下调试验中一只狒狒的血清睾酮应答，然而未实现完全的免疫阉割。

如图14b所示，对于由LHRH肽免疫刺激复合物(电荷比例4∶1)联合

制备的组合物，到第10周在一只狒狒中获得了完全的免疫阉割，并且证明持续至第14周。如图14b所示，在这一组的另一只狒狒中获得了接近阉割水平的血清睾酮，尽管这一应答证明是暂时的。

如图14c所示，对于由LHRH免疫刺激复合物(电荷比例1.5∶1)联合Alhydrogel

制备的组合物，研究中的两只狒狒都成功免疫阉割(一只狒狒是在第8周实现的，另一只是在第10周)，而且这种效果证明持续至第14周。

对于由以电荷比例4∶1或1.5∶1(LHRH肽浓度为400μg)制备的LHRH免疫刺激复合物衍生的制剂，以免疫刺激复合物形式结合的LHRH肽免疫原的实际量变化显著。表8显示了以这种形式施用的LHRH免疫原的比例，作为不同电荷比例的函数。当以电荷比例4∶1进行制备时，溶液中大约16％(约63μg)的LHRH免疫原以免疫刺激复合物的形式结合；而当以电荷比例1.5∶1进行制备时，结合了大约86％(约344μg)。

在1.5∶1比例系统中，大部分LHRH免疫原以免疫刺激复合物的形式存在，从而在狒狒中提供了较长的持续时间和较早的免疫阉割应答。我们已经用实验方法测定了

无机盐在加入后额外吸附溶液中10％的游离未结合LHRH免疫原。因此，无机盐在联合免疫刺激复合物时改善疫苗功效的机制很可能与间接免疫调控作用有关。

用候选无机盐即Adju-phos(衍生自磷酸铝)进行平行试验，到第10周在一只狒狒中证明了完全的免疫阉割，而到此时间点在试验的另一只狒狒中证明了接近阉割水平的血清睾酮。

在此实施例中，我们已经证明了LHRH免疫刺激复合物联合无机盐是能够在非人灵长类中实现免疫阉割(通过血清睾酮来测量)的有效疫苗。

此外，我们已经显示了免疫阉割应答的制剂动力学是LHRH免疫原对CpG1寡核苷酸的初始电荷比例以及无机盐选择的函数。

具体而言，此实施例指示基于这些新组合的制剂用于开发可用于在动物和人中消除激素的安全疫苗的潜力。

此外，此实施例强烈指示基于这些新组合的制剂用于开发适用于治疗人类雄激素敏感性前列腺癌的安全疫苗的潜力。

实施例12：由ISA Montanide

50v、衍生自LHRH的免疫刺激复合物在存在IL-1β衍生肽片段时制备油包水乳剂

向10ml容器中加入溶于适当水性缓冲液(2500μl，0.4mg/ml)的1000μgLHRH肽免疫原(SEQ ID NO：7-9，溶液中的摩尔比例为1∶1∶1)和CpG1寡核苷酸以制备免疫刺激复合物(电荷比例16∶1)或溶于适当水性缓冲液(2500μl，0.4mg/ml)的1000μg肽免疫原及溶液中的由IL-1β衍生的肽(SEQ ID NO：14，C^*VQGEESNDKIPC^*-CO₂H.HCl，其中C^*指示两个半胱氨酸之间的环化)；或向CpG1与IL-1β肽混合物中加入溶于适当水性缓冲液(2500μl，0.4mg/ml)的1000μg肽免疫原以制备LHRH免疫刺激复合物(电荷比例16∶1)与IL-1β肽的联合物。表9显示了用于确定对于特定电荷比例与LHRH肽免疫原络合达到固定最终剂量100μg/1.0ml所需要的CpG1寡核苷酸相对量的计算。

已知由IL-1β衍生的基于肽的片段具有辅佐特性。⁶⁹本文采用的IL-1β肽相对较小(FW＝1421.5)，而且在溶于标准生理缓冲液时带负电荷。采用实施例2所示计算，1nmol IL-1β肽贡献2nmol负电荷。同样，预计这种分子不会与LHRH免疫原发生物理相互作用，而且在混合后没有发现沉淀形式的络合证据。

具体而言，为了以LHRH∶CpG1电荷比例16∶1由LHRH肽免疫原制备免疫刺激复合物，使用了18.3μg CpG1寡核苷酸(9.2μl，2.0mg/ml)。为了制备LHRH免疫原和IL-1β的溶液，在适当水性缓冲液中加入了10μgIL-1β(5.0μl，2.0mg/ml)。为了以LHRH∶CpG1加IL-1β电荷比例16∶1由LHRH肽免疫原制备免疫刺激复合物，混合了18.3μg CpG1寡核苷酸(9.2μl，2.0mg/ml)和10μg IL-1β肽(5.0μl，2.0mg/ml)。

分别向每个容器中加入额外的水性溶剂稀释剂，使得水相的终体积固定为5.0ml，用于制备ISA Montanide

50v w/o乳剂。

为了制备安慰剂组，取5.0ml生理盐水用作水相。

对于LHRH肽免疫原，发现生理盐水适用于络合。每种肽的计算IP高于9.0(表1)，大大高于所选水性溶剂的pH。

此实施例证明了溶液中免疫刺激复合物形式的稳定免疫原的优点。已经显示络合过程在存在额外免疫调控剂时是相容的。

然后将LHRH免疫原或安慰剂溶液的稀释水性混悬液缓慢加到装有5.0ml ISA Montanide

50v的干的25ml反应容器中。在添加时以低速(2000-3000rpm)均化(高剪切实验室混合仪，密闭单元，Silverson)混合物以生成粗糙乳状液。维持这一加工速度直至水性样品添加完毕，然后继续整整2分钟以确保水相与油相的均一预混合。然后将均化速度调高(5000-8000rpm)并再维持5-10分钟，导致均匀的白色精细分散w/o乳剂的形成。

一旦如上文所述配制成油包水乳剂，免疫原的终浓度为100μg/ml。

实施例13：w/o乳剂中配制成免疫刺激复合物或与IL-1β肽一起或配制成免疫刺激复合物与IL-1β肽的联合物的LHRH肽免疫原的免疫原性和生长促进效果

此实施例举例说明了与CpG1寡核苷酸一起配制成免疫刺激复合物并联合w/o乳剂或与免疫调控剂(IL-1β肽)一起并联合w/o乳剂或配制成免疫刺激复合物并在w/o乳剂中联合额外免疫调控剂(IL-1β肽)的LHRH肽免疫原在经肌肉内免疫公猪中的免疫原性。w/o乳剂是如实施例4a和实施例12所述通过均化制备的。

第0和8周用下列组合物肌肉内(I.M.)免疫每组5只8周龄公猪(每只30kg)：如表9所述制备的悬浮于终体积500μl NaCl并以500μl ISAMontanide

50v分散的100μg LHRH肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例16∶1)；将1μg LHRH肽/IL-1β肽悬浮于终体积500μl NaCl并以500μl ISAMontanide

50v分散；或将如表9所述制备的LHRH肽/(CpG1+IL-1β肽(1μg))免疫刺激复合物(电荷比例16∶1)悬浮于终体积500μl NaCl并以500μl ISA Montanide

50v分散。制备以500μl ISA Montanide50v分散的500μl NaCl作为安慰剂对照组，并对研究中所包括的一个未免疫对照组进行手术阉割。

公猪在接受安慰剂w/o乳剂、包含肽免疫原并联合IL-1β肽的w/o乳剂或包含免疫刺激复合物或免疫刺激复合物联合IL-1β肽的w/o乳剂后不显示严重病理学或行为变化。第+0、+8、+10、+12和+14周采集血清，通过免疫原特异性ELISA评估抗LHRH抗体的存在与否，通过RIA免疫测定评估血清睾酮，并评估重量的增加。

免疫原性结果

图15a显示了经LHRH免疫原免疫后的血清抗体滴度。图15b显示了相应的血清睾酮水平。图15c显示了经LHRH免疫原免疫后的免疫阉割与手术阉割相比在试验期间对重量增加的影响。对照试验证明无辅佐肽在所有情况中没有免疫原性或者具有微弱免疫原性。

由得自经LHRH免疫刺激复合物、得到细胞因子辅佐的LHRH肽、或与细胞因子共配制并作为w/o乳剂施用的LHRH免疫刺激复合物免疫的公猪的血清测定的抗体滴度指示所有三种组合物都具有免疫原性。在试验期间所有时间点获得的滴度证明是类似的。如图15a所示，安慰剂和手术阉割阴性对照组没有获得滴度。

由得自经w/o乳剂中的LHRH免疫刺激复合物或w/o乳剂中得到IL-1β肽辅佐的LHRH肽或作为w/o乳剂施用的LHRH免疫刺激复合物联合IL-1β肽免疫的公猪的血清测定的相应血清睾酮水平指示这些组的公猪在第12周得到了有效的免疫阉割。

值得注意的是，由w/o乳剂中的LHRH免疫刺激复合物和w/o乳剂中得到IL-1β肽辅佐的LHRH肽衍生的组合物未能维持这一血清睾酮水平。到第14周，两个组的血清睾酮水平显示回弹，而且都不能再描述成免疫阉割。

如图15b所示，配制成w/o乳剂形式的免疫刺激复合物与IL-1β肽联合的LHRH疫苗证明更加有效的维持相同水平的免疫阉割且没有早期回弹的指示。

安慰剂阴性对照组在评估的多个时间点获得大范围波动的血清睾酮值，符合月度激素水平的预期变化。如图15b所示，手术阉割阳性对照组在试验期间的所有时间点获得阴性血清睾酮水平。

屠宰前公猪的血清睾酮水平已经与所产猪肉的品质直接相关。高睾酮水平的产品产生不吸引人的气味(公猪异味)，因此控制这种特性是一种重要的市场考虑。用于确保睾酮可以忽略的标准方法是手术阉割。可行的疫苗方法必须证明在将公猪正常出售的时间间隔内有效。即公猪体重达到110-130kg的时间点。

在此项研究中对8周龄时接受免疫的公猪的生长促进追踪14周。通过w/o乳剂中的LHRH免疫刺激复合物或w/o乳剂中只得到IL-1β肽辅佐的LHRH肽免疫阉割的公猪揭示了体重增加，与手术阉割组平行。如图15c所示，这些公猪在第14周达到了平均110kg。

出乎意料的是，通过配制成w/o乳剂中的LHRH免疫刺激复合物与IL-1β肽联合的LHRH疫苗免疫的组证明明显更加有效。这一组的所有公猪迅速应答，与试验的其它组相比，在评估的所有时间点报告了最高平均体重增加。如图15c所示，这一组的公猪在第12周达到的平均体重略微低于120kg，并且在第14周达到了130kg。

这一组与其它试验组的差异可能归咎于w/o乳剂中LHRH/CpG1免疫刺激复合物联合IL-1β肽和游离未络合LHRH肽呈递给免疫系统时所获得效果的协同联合。

联合制剂证明是有效的，而混悬液中存在很小量的LHRH/CpG1免疫刺激复合物。在此实施例中，LHRH∶CpG1电荷比例16∶1在所有公猪中提供了显著应答。

安慰剂对照组证明在试验期间在促进生长方面最差。如图15c所示，该组的平均体重增加显著低于所有其它组。

过去观察到相对于安慰剂对照体重增加的略微改善作为免疫阉割的后果⁷⁰，然而在此实施例中我们已经证明了用于获得有效免疫阉割以消除公猪异味(通过血清睾酮来测量)的新方法，并相对于手术阉割的标准方法在试验期间获得了优异的生长促进(通过体重增加来测量)。

此外，通过配制成w/o乳剂中免疫刺激复合物与IL-1β肽联合物的LHRH疫苗免疫阉割的公猪能够比通过任一备选制剂免疫或通过现有优选方法即手术阉割的公猪早2周出售。

具体而言，金钱上的节省(就避免手术损伤引起的损失而言)、减少饲料和猪圈花费、以及改善周转(就出售所需时间而言)将是显著的，证明免疫阉割和生长促进的这种改进方法的优势。

实施例14：由ISA Montanide

50v和衍生自FMD的免疫刺激复合物制备油包水乳剂

向20ml容器中加入溶于适当水性缓冲液(2000μl，2.0mg/ml)的4000μgFMD肽免疫原(SEQ ID NO：12-13，溶液中)或者加入溶于适当水性缓冲液(2000μl，2.0mg/ml)的4000μg肽免疫原以及CpG1寡核苷酸以制备免疫刺激复合物(电荷比例4∶1)。表9显示了用于确定对于特定电荷比例与FMD肽免疫原络合达到固定最终剂量200μg/1.0ml所需要的CpG1寡核苷酸相对量的计算。

具体而言，为了以FMD∶CpG1电荷比例4∶1由FMD肽免疫原制备免疫刺激复合物，使用了125μg CpG1寡核苷酸(62.5μl，2.0μg/ml)。

分别向每个容器中加入额外的水性溶剂稀释剂，使得水相的终体积固定为10.0ml，用于制备ISA Montanide

50v w/o乳剂。

为了制备安慰剂组，取10.0ml生理盐水用作水相。

对于FMD肽免疫原库，发现生理盐水适用于络合。由库中位置类似物衍生的每种肽的平均计算IP高于9.0(表1)，大大高于所选水性溶剂的pH。

然后将FMD免疫原或安慰剂溶液的稀释水性混悬液缓慢加到装有10.0ml ISA Montanide50v的干的25ml反应容器中。在添加时以低速(2000-3000rpm)均化(高剪切实验室混合仪，密闭单元，Silverson)混合物以生成粗糙乳状液。维持这一加工速度直至水性样品添加完毕，然后继续整整2分钟以确保水相与油相的均一预混合。然后将均化速度调高(5000-8000rpm)并再维持5-10分钟，导致均匀的白色精细分散w/o乳剂的形成。

一旦如上文所述配制成油包水乳剂，免疫原的终浓度为200μg/ml。

实施例15：配制成w/o乳剂中的免疫刺激复合物的FMD肽免疫原的免疫原性和保护作用

此实施例举例说明了配制成w/o乳剂或FMD免疫刺激复合物并联合w/o乳剂的FMD肽免疫原在经肌肉内免疫的牛中的免疫原性。w/o乳剂是如实施例4a和实施例14所示通过均化制备的。

第0和3周用下列组合物肌肉内(I.M.)免疫每组3头成年牛：悬浮于终体积1000μl NaCl并以1000μl ISA Montanide

50v分散的400μg FMD肽；或如表9所示制备的悬浮于终体积1000μl NaCl并以1000μl ISAMontanide50v分散的FMD肽/CpG1免疫刺激复合物(电荷比例4∶1)。制备以1000μl ISA Montanide

50v乳化的1000μl NaCl的安慰剂对照组。

牛在接受安慰剂w/o乳剂或包含FMD肽免疫原或FMD免疫刺激复合物的w/o乳剂后不显示严重病理学或行为变化。第+5周采集血清并评估FMD中和抗体的存在与否，第+6周用活病毒攻击牛并在持续14天的试验中测定保护水平。

抗FMD抗体的测量-中和测定法

用BHK-21细胞在平底组织培养级微量滴定板中进行FMD抗体的定量中和测定法(NA)。测试是以相等体积50μl进行的。由1∶4稀释度开始，将血清以2倍连续稀释度稀释两份。将待测试血清样品与等体积的FMDVO_Manisa血清型(200TCID₅₀/0.05ml)混合，并于37℃保温1小时。在含10％牛血清的培养基中制备10⁶细胞/ml的细胞混悬液。向每个孔中加入50μl体积的细胞混悬液。将板密封并于37℃保温2-3天。

显微镜检查在48小时后是可行的。用10％甲醛/盐水进行固定30分钟。为了染色，将板浸入10％福尔马林的0.05％亚甲蓝中达30分钟。看见阳性孔(其中病毒已经被中和而细胞保持完整)包含染成蓝色的细胞。阴性孔是空的。滴度表述成50％终点时血清/病毒混合物中存在的最终血清稀释度。

牛攻击试验方案

在第35天，将第0天和第21天接受疫苗或安慰剂对照的所有牛依照分组归入分开的饲养室。在第42天，每只动物真皮内(IDL)攻击总计10⁴BID₅₀ FMDV O，注射在舌头背面的两个部位。

攻击后，观察到牛14天发生FMD临床症状，而且每日记录体温。不受保护的动物在舌以外部位显示损伤。对照动物必须发生表现为至少3只脚上有损伤的全身感染，才可以认为病毒攻击是有效的。

免疫原性结果

表10显示了经FMD免疫原免疫后的中和抗体(N.A.)滴度和相应的保护结果。

由得自经作为w/o乳剂施用的FMD肽免疫原或FMD免疫刺激复合物免疫的牛(第+5周)的血清测定的N.A.滴度指示两种组合物都具有免疫原性。第5周时间点获得的滴度高度变化，但是在所有情况中显示超过16。由动物流行病国际办公室(Office International des Epizooties，OIE)建立的证明作为口蹄疫疫苗效力的最低要求是N.A.滴度达到16。⁷¹如表10所示，安慰剂阴性对照组中的每头公牛都获得可忽略的N.A.滴度，都低于16。

必须通过用特定滴度的活病毒攻击免疫组来获得保护作用的决定性证据。通过真皮内(IDL)施用总计10⁴BID₅₀ FMDV O活病毒，注射在舌头背面的两个部位。

攻击方案在第6周开始，一周后测定所有组的N.A.滴度，而且表10中的结果证明由FMD肽/CpG1免疫刺激复合物联合未结合的FMD肽衍生的并作为w/o乳剂施用的制剂优于(3/3得到保护)由FMD肽衍生的并作为w/o乳剂单独施用的制剂(1/3得到保护)。

如表10所示，安慰剂对照组确认了用于攻击的活病毒具有足够毒性，因为这一组中的所有三头牛都受到了感染，而且在攻击后14内显示疾病症状(0/3得到保护)。

用w/o乳剂中的FMD免疫原或FMD免疫刺激复合物配制的两组在第+5周获得了显著的N.A.抗体滴度。

令人惊讶的是，攻击研究证明具有优异功效的制剂是衍生自w/o乳剂中包含FMD免疫刺激复合物的制剂。有可能的是，这种组合物不但改善N.A.应答，而且更加有效的上调特定种类的对抗击病毒感染重要的免疫应答。

具体而言，以w/o乳剂形式存在的由FMD和CpG1衍生的免疫刺激复合物可能有效增加免疫应答的Th₁分支(如IFN-γ)。在其它模型中已经充分证明了CpG寡核苷酸的这种作用，而IFN-γ自身已经显示是实现针对流感病毒的免疫保护的有效免疫调控剂。⁷²

一旦口蹄疫的爆发得到确认，常常通过剔出受感染和邻近牲口群来实现控制。重要农产品像牛、猪和羊的经济损失常常是巨大的。现有疫苗策略采用灭活的病毒，它们在有些情况中是本地生产的且质量低下。由活病毒进行生产具有多个与其有关的生产相关的问题，而且产品自身存在潜在的安全性风险。基于衍生自合成肽的免疫原的策略展示了用于有效免疫的改进方法，而且应当认为是低风险的。

具体而言，此实施例证明了基于合成肽的疫苗策略能够安全且有效的保护牛免于口蹄疫。

此外，此实施例还证明了这种疫苗方法用于全面保护易患口蹄疫的重要牲畜的效用。

表2：合成肽免疫原和寡核苷酸的摩尔电荷计算

疫苗

SEQ IDNO：

净计算电荷1

疫苗中的摩尔肽贡献％

正电荷的平均总摩尔当量2

FW

平均总肽FW3

CD4疫苗

456

4正7正2正

50％25％25％

1nmol＝4.3nmol正电荷

564656593493

5280.6

IgE疫苗

1011

7正9正

66.6％33.3％

1nmol＝7.7nmol正电荷

50685165

5132.1

LHRH疫苗

789

4正5正4正

33.3％33.3％33.3％

1nmol＝4.3nmol正电荷

316450524910

4543.9

FMD疫苗

12

～3.5正

文库肽4

1nmol～3.5nmol正电荷

6759-6851

68055

1)净电荷：通过指定序列内的每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)为+1电荷，每个天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)为-1电荷，每一个其它氨基酸为0电荷来计算。为每种肽将电荷相加，并表述成净平均电荷。

2)来自肽的正电荷的平均总摩尔当量：通过将混合物中每种成分的全面摩尔电荷贡献相加并取平均值来计算联合肽混合物的平均电荷估计值。

3)平均总肽分子量(FW)：通过将混合物中每种成分的全面摩尔质量贡献相加并取平均值来计算平均总肽FW估计值。

4)FMD疫苗衍生自肽库。假设每种成分的摩尔贡献相等，并且类似计算正电荷的平均总摩尔当量。

5)对于FMD疫苗，通过将库中多种FMD肽所找到的最低和最高FW相加并取平均值来获得平均总肽分子量。

来自CpG寡核苷酸的负电荷的摩尔当量：每个硫代磷酸酯基团贡献-1电荷。

CpG1(32个碱基的寡聚物)：-1nmol CpG1＝31.0nmol负电荷

CpG2(24个碱基的寡聚物+硫代磷酸酯)：-1nmol CpG2＝24.0nmol负电荷

Claims (73)

1.一种包含阳离子肽免疫原和阴离子CpG寡核苷酸的稳定化的免疫刺激微粒复合物，其中根据指定肽免疫原中每个赖氨酸（K）、精氨酸（R）或组氨酸（H）为+1电荷，每个天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）为-1电荷，所有其它氨基酸为0电荷而计算得出所述阳离子肽免疫原在pH范围5.0－8.0具有净正电荷，其中所述阴离子CpG寡核苷酸在pH范围5.0－8.0具有净负电荷，并且是包含8－64个核苷酸碱基的单链DNA，且具有胞嘧啶－胍基序重复，所述CpG基序重复数目在范围1－10内，其中所述肽免疫原包括靶B细胞抗原或CTL表位，以及T辅助细胞表位，其中所述肽免疫原与CpG寡核苷酸的电荷比为8:1-2:1，

其中CpG寡核苷酸是5’TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTGTCG TT3’-CpG1，SEQ ID NO：1，长度为32个碱基的寡聚物；或5’nTCGTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T3’-CpG2，SEQ ID NO：2，长度为24个碱基的寡聚物加上一个以n表示的硫代磷酸酯基团，

和

其中所述阳离子肽免疫原选自由SEQ ID NOs:4，5和6及其混合物组成的组，或由SEQ ID NOs:7，8和9及其混合物组成的组，或由SEQ ID NOs:10和11及其混合物组成的组，或由SEQ ID NOs:12和13组成的组。

2.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原是合成肽免疫原的混合物。

3.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原的净正电荷是至少+2。

4.权利要求2的免疫刺激微粒复合物，其中所述合成肽免疫原的平均净正电荷是至少+2。

5.权利要求3或4的免疫刺激微粒复合物，其中所述阴离子寡核苷酸的净负电荷是至少-2。

6.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中CpG寡核苷酸是5’TCGTCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT3’-CpG1，SEQ ID NO：1。

7.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原是与T辅助细胞表位缀合的合成肽。

8.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原是由HIV CD4衍生的合成肽。

9.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原是SEQ ID NO：4，5和6的混合物。

10.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原是由LHRH衍生的合成肽。

11.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原是SEQ ID NO：7，8和9的混合物。

12.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原是由IgE衍生的合成肽。

13.权利要求12的免疫刺激微粒复合物，其中所述由IgE衍生的合成肽是SEQ ID NO：10和11的混合物。

14.权利要求1的免疫刺激微粒复合物，其中所述阳离子肽免疫原是SEQ ID NO：12和13的混合物。

15.一种用于制备依照权利要求1的稳定化的免疫刺激微粒复合物的方法，包括下列步骤：

(a)将阳离子肽免疫原溶解或分散于水相，所述水相选自由蒸馏去离子水，盐水，PBS及其混合物组成的组，条件是所述水相的pH低于所述肽免疫原的电离点；

(b)将阴离子CpG寡核苷酸溶解于水相，所述水相选自由蒸馏去离子水，盐水，PBS及其混合物组成的组；

(c)将一定量的水相中的所述CpG寡核苷酸逐滴加到所述阳离子肽免疫原的溶液或分散体中以形成阳离子肽免疫原与CpG寡核苷酸的电荷比例在8:1至2:1的范围内的肽免疫原和CpG寡核苷酸的稳定化的免疫刺激复合物。

16.权利要求15的方法，其还包括除去步骤(c)所获得的免疫刺激复合物混悬液的水相的步骤。

17.权利要求16的方法，其中所述水相是通过冻干法或喷雾干燥法除去的。

18.权利要求15的方法，其中所述免疫刺激复合物的平均颗粒大小处于1－50μm的范围内。

19.依照权利要求15的方法，其中所述肽免疫原和CpG寡核苷酸的添加量使得阳离子肽免疫原与CpG核苷酸的电荷比例处于8:1的范围内。

20.依照权利要求16的方法，其中所述肽免疫原和CpG寡核苷酸的添加量使得阳离子肽免疫原与CpG核苷酸的电荷比例处于8:1的范围内。

21.依照权利要求15的方法，其中所述肽免疫原和CpG寡核苷酸的添加量使得阳离子肽免疫原与CpG核苷酸的电荷比例处于4:1的范围内。

22.依照权利要求16的方法，其中所述肽免疫原和CpG寡核苷酸的添加量使得阳离子肽免疫原与CpG核苷酸的电荷比例处于4:1的范围内。

23.依照权利要求15的方法，其中所述肽免疫原和CpG寡核苷酸的添加量使得阳离子肽免疫原与CpG核苷酸的电荷比例处于2:1的范围内。

24.依照权利要求16的方法，其中所述肽免疫原和CpG寡核苷酸的添加量使得阳离子肽免疫原与CpG核苷酸的电荷比例处于2:1的范围内。

25.一种用于制备包含权利要求1的免疫刺激微粒复合物的油包水乳剂的方法，包括下列步骤：

a)在水相中制备免疫刺激复合物，所述水相选自由蒸馏去离子水，盐水，和磷酸盐缓冲盐水组成的组

b)将所述水相中的免疫刺激复合物加到连续油相中，所述油相选自由合成油，植物油，矿物油，可代谢动物油及其混合物组成的组；

c)在机械剪切下将所述水相中的免疫刺激复合物分散到所述连续油相中以形成均匀的油包水乳剂。

26.依照权利要求25用于制备油包水乳剂的方法，其中步骤(c)包括：

a)将第一只注射器装载包含免疫刺激复合物的水相；

b)将第二只注射器装载固有粘度低于1,500mPa的油相；

c)通过细孔管将所述第一只和第二只注射器连接装有受控孔径0.05－20μM膜的膜支持物；

d)通过反复交换穿膜将所述水相挤到所述油相中直至形成均匀的w/o乳剂。

27.权利要求25的方法，其中所述油相选自由可代谢或不可代谢的油组成的组，所述可代谢或不可代谢的油选自由

ISA720，

ISA51，

ISA50v或其混合物组成的组。

28.权利要求26的方法，其中所述油相选自由可代谢或不可代谢的油组成的组，所述可代谢或不可代谢的油选自由

ISA720，

ISA51，

ISA50v或其混合物组成的组。

29.权利要求25的方法，其中所述水相还可包含表面活性剂，乳化稳定剂，或其组合。

30.权利要求26的方法，其中所述水相还可包含表面活性剂，乳化稳定剂，或其组合。

31.权利要求29的方法，其中所述乳化稳定剂选自由二缩甘露醇-油酸酯及其衍生物组成的组。

32.权利要求30的方法，其中所述乳化稳定剂选自由二缩甘露醇-油酸酯及其衍生物组成的组。

33.权利要求25的方法，其中所述油相还包含佐剂，所述佐剂选自由3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂A，N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，二甲基双十八烷基溴化铵，N,N-双十八烷基-N’,N’-二(2-羟乙基)丙二胺，N-(2-脱氧-2-l-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基-十二烷酰酰胺氢乙酸酯，3β-[N-(N,N’-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇，NAc-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-甘油二棕榈酰及其衍生物组成的组。

34.权利要求26的方法，其中所述油相还包含佐剂，所述佐剂选自由3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂A，N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，二甲基双十八烷基溴化铵，N,N-双十八烷基-N’,N’-二(2-羟乙基)丙二胺，N-(2-脱氧-2-l-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基-十二烷酰酰胺氢乙酸酯，3β-[N-(N,N’-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇，NAc-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-甘油二棕榈酰及其衍生物组成的组。

35.权利要求25的方法，其中所述水相还包含水溶性佐剂，所述水溶性佐剂选自由PCPP，皂苷，霍乱毒素，一种来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素和细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由IL-1β，IL-2，IL-12，IFN-γ及其衍生物组成的组。

36.权利要求35的方法，其中所述细胞因子衍生物是SEQ ID NO：14的IL-1β衍生肽片段。

37.权利要求26的方法，其中所述水相还包含水溶性佐剂，所述水溶性佐剂选自由PCPP，皂苷，霍乱毒素，一种来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素和细胞因子，所述细胞因子选自由IL-1β，IL-2，IL-12，IFN-γ及其衍生物组成的组。

38.权利要求37的方法，其中所述细胞因子衍生物是SEQ ID NO：14的IL-1β衍生肽片段。

39.权利要求16的方法，还包括下列步骤：

a)在生物相容溶剂中制备选自由聚-D,L-丙交酯-共乙交酯共聚物，聚-D,L-乳酸-共乙醇酸共聚物，聚己酸内酯，聚酐，聚原酸酯和聚(α-羟基丁酸)组成的组的原位胶凝聚合物的溶液，所述生物相容溶剂选自由二甲基亚砜（DMSO），N-甲基吡咯烷（NMP），甘油三乙酸酯和甘油组成的组；

b)将所述干燥形式的免疫刺激复合物在原位胶凝聚合物溶于生物相容溶剂制成的溶液中重建。

40.权利要求39的方法，其中步骤(b)所使用的干燥形式的免疫刺激复合物是通过冻干法得到的。

41.权利要求39的方法，其中所述聚合物是

其中R1是OH或具有1－5个碳的烷氧基，R2是H；x:y是共聚物中每种单体单元的比例且x+y=1，其中所述聚合物是生物可降解的。

42.权利要求41的方法，其中所述聚合物的分子量范围是2,000－100,000道尔顿，固有粘度范围是0.1－1.0dl/g。

43.权利要求42的方法，其中所述聚合物的分子量范围是2,000－100,000道尔顿，固有粘度范围是0.1－1.0dl/g。

44.权利要求39的方法，其中所述原位胶凝聚合物溶于所述生物相容溶剂的重量在5重量%－50重量%范围内，其中所述原位胶凝聚合物是生物可降解的。

45.权利要求39的方法，其中所述原位胶凝聚合物溶于所述生物相容溶剂的重量在5重量%－50重量%范围内，其中所述原位胶凝聚合物是生物可降解的。

46.权利要求39的方法，其还包括在所述生物相容溶剂中溶解油溶性佐剂和细胞因子，所述油溶性佐剂选自由3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂A，N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，二甲基双十八烷基溴化铵，N,N-双十八烷基-N’,N’-二(2-羟乙基)丙二胺，N-(2-脱氧-2-l-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基-十二烷酰酰胺氢乙酸酯，3β-[N-(N,N’-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇，NAc-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-甘油二棕榈酰组成的组，所述细胞因子选自由IL-1β，IL-2，IL-12，IFN-γ及其衍生物组成的组。

47.权利要求40的方法，其还包括在所述生物相容溶剂中溶解油溶性佐剂和细胞因子，所述油溶性佐剂选自由3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂A，N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，二甲基双十八烷基溴化铵，N,N-双十八烷基-N’,N’-二(2-羟乙基)丙二胺，N-(2-脱氧-2-l-亮氨酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基-十二烷酰酰胺氢乙酸酯，3β-[N-(N,N’-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇，NAc-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-甘油二棕榈酰组成的组，所述细胞因子选自由IL-1β，IL-2，IL-12，IFN-γ及其衍生物组成的组。

48.一种用于制备包含免疫刺激复合物的混悬液的方法，包括下列步骤：

a)在水相中制备权利要求1的免疫刺激微粒复合物，所述水相选自由蒸馏去离子水，盐水和磷酸盐缓冲盐水组成的组；

b)在水相中制备选自由氢氧化铝，磷酸铝和磷酸钙组成的组的无机盐的混悬液，所述水相选自由蒸馏去离子水，盐水和磷酸盐缓冲盐水组成的组；

c)将所述水相中的免疫刺激复合物加到包含所述无机盐混悬液的水相中；

d)混合所述免疫刺激复合物和无机盐混悬液以形成混合的混悬液。

49.一种用于制备包含权利要求1的免疫刺激微粒复合物的混悬液的方法，包括下列步骤：

a)在水相中制备选自由SEQ ID NO：4－13组成的组的肽免疫原的溶液，所述水相选自由蒸馏去离子水，盐水和磷酸盐缓冲盐水组成的组；

b)在水相中制备选自由氢氧化铝，磷酸铝和磷酸钙组成的组的无机盐的混悬液，所述水相选自由蒸馏去离子水，盐水和磷酸盐缓冲盐水组成的组；

c)一边混合一边将所述肽溶液加到所述无机盐混悬液中；

d)一边混合一边添加选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的组的CpG核苷酸以形成免疫刺激复合物和无机盐的混合的混悬液。

50.权利要求48的方法，其中所述无机盐选自由

及其混合物组成的组。

51.权利要求49的方法，其中所述无机盐选自由

及其混合物组成的组。

52.权利要求48的方法，其中所述水相还可以包含表面活性剂，tonifier，防腐剂或其任意组合。

53.权利要求49的方法，其中所述水相还可以包含表面活性剂，tonifier，防腐剂或其任意组合。

54.权利要求52的方法，其中所述水相包含选自由PBS或盐水及其混合物组成的组的tonifier。

55.权利要求53的方法，其中所述水相包含选自由PBS或盐水及其混合物组成的组的tonifier。

56.权利要求52的方法，其还包括向所述水相中添加选自由2-苯氧基-乙醇及其衍生物组成的组的防腐剂。

57.权利要求53的方法，其还包括向所述水相中添加选自由2-苯氧基-乙醇及其衍生物组成的组的防腐剂。

58.权利要求48的方法，其还包括向所述水相中添加佐剂，所述佐剂选自由MPL，MDP，DDA，Avridine，BAY-1005，DC-Chol，Murapalmitine，PCPP，皂苷，霍乱毒素，一种来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素和细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由IL-1β，IL-2，IL-12，IFN-γ及其衍生物组成的组。

59.权利要求49的方法，其还包括向所述水相中添加佐剂，所述佐剂选自由MPL，MDP，DDA，Avridine，BAY-1005，DC-Chol，Murapalmitine，PCPP，皂苷，霍乱毒素，一种来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素和细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由IL-1β，IL-2，IL-12，IFN-γ及其衍生物组成的组。

60.一种水性溶剂中包含权利要求1－14任一项的免疫刺激微粒复合物的混悬液的药物组合物，所述水性溶剂选自由蒸馏去离子水，盐水和磷酸盐缓冲盐水组成的组。

61.一种包含权利要求1－14任一项的免疫刺激微粒复合物的油包水乳剂的药物组合物。

62.依照权利要求60的药物组合物，其还包含佐剂，所述佐剂选自由MPL，MDP，DDA，Avridine，BAY-1005，DC-Chol，Murapalmitine，PCPP，皂苷，霍乱毒素，一种来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素和细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由IL-1β，IL-2，IL-12，IFN-γ及其衍生物组成的组。

63.一种包含权利要求1－14任一项的免疫刺激微粒复合物的凝胶的药物组合物，其中所述凝胶是通过将所述干燥形式的免疫刺激复合物加到原位胶凝生物相容聚合物溶于生物相容溶剂制成的溶液中而原位形成的，所述原位胶凝生物相容聚合物选自由聚-D,L-丙交酯-共乙交酯共聚物，聚-D,L-乳酸-共乙醇酸共聚物，聚己酸内酯，聚酐，聚原酸酯，和聚(α-羟基丁酸)组成的组，所述生物相容溶剂选自由二甲基亚砜（DMSO），N-甲基吡咯烷（NMP），甘油三乙酸酯和甘油组成的组。

64.权利要求63的药物组合物，其中所述原位胶凝生物相容聚合物是

其中R1是OH或具有1－5个碳的烷氧基，R2是H；x:y共聚物中每种单体单元的比例且x+y=1。

65.权利要求64的药物组合物，其中所述原位胶凝生物相容聚合物的分子量范围是2,000－100,000道尔顿，固有粘度范围是0.1－1.0dl/g。

66.一种包含无机盐和权利要求1－14任一项的免疫刺激微粒复合物水性混悬液的药物组合物，其中所述无机盐选自由氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝，磷酸钙组成的组。

67.权利要求66的药物组合物，其中所述氢氧化铝选自由和

组成的组。

68.权利要求66的药物组合物，其中水相选自由蒸馏去离子水，盐水，PBS及其混合物组成的组。

69.权利要求66的药物组合物，其在水相中还包含选自由2-苯氧基-乙醇及其衍生物组成的组的防腐剂。

70.依照权利要求60的组合物在制备用于在宿主中引发抗体生成作为免疫应答的药物中的应用。

71.按照权利要求15的方法制备的免疫刺激微粒复合物。

72.按照权利要求25的方法制备的包含免疫刺激微粒复合物的油包水乳剂。

73.按照权利要求48的方法制备的包含免疫刺激微粒复合物的混悬液。

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