CN101072572A - 富含结缔组织生长成分的骨髓组分的分离及其促进结缔组织形成的用途 - Google Patents

Abstract

本说明书描述了一种富含一种或多种结缔组织生长成分的骨髓分离物，制备该分离物的方法，和用该分离物促进结缔组织生长的方法。离心含有骨髓的生物样品，将该样品分成不同组分，包括富含结缔组织生长成分的组分。然后从分离的样品中分离得到富含结缔组织生长成分的组分。可以直接使用该分离物或与运载体混合，将其植入病人的组织(如骨)缺损部位。该生物样品可包含骨髓和全血。可修饰(例如通过用编码操作性连接于一启动子的成骨诱导多肽的核酸转染)该分离物，然后施加于组织缺损部位。可以在一个步骤中(即手术中)制备该分离物并将其施加于组织缺损部位。

Description

富含结缔组织生长成分的骨髓组分的分离及其促进结缔组织形成的用途

本申请要求2003年7月9日提交的美国专利序列号60/485,445的权益，以整体纳入本文作为参考。该申请也涉及2002年4月4日提交的美国专利申请序列号10/116,729(2002年12月5日公布为美国专利申请公告号2002/0182664)，以整体纳入本文作为参考。

本申请总地涉及促进组织生长的组合物和方法，具体涉及富含一种或多种结缔组织(如骨)生长促进成分的骨髓分离物，形成该分离物的方法以及用该分离物促进结缔组织生长的方法。

近年来，当在骨移植步骤中采用骨髓时，一般从髂嵴中抽取骨髓，并且不对该骨髓进行任何次级加工就直接用作骨移植物。该骨髓抽取物的大部分是促进骨生成作用最小的血液。而且，血液中大量的血小板释放出不良的生长因子，如PDGF(血小板衍生生长因子)、TGF-β(转化生长因子β)和FGF(成纤维细胞生长因子)，在一些情况下它们显示具有抑制骨形成的作用。

因此，需要分离骨髓的诸成分，具体是促进结缔组织形成的成分，和将该分离成分用于结缔组织修复，如骨移植和软骨修复改进或替代技术。

在一个实施方式中，本发明提供了一种获得骨髓组分的方法。该方法包括：离心含有全血和骨髓的生物样品，根据密度对样品的诸成分进行分离。该分离提供了以下密度降低顺序的组分：(1)富含血细胞的组分；(2)暗黄层组分；(3)富含血小板的组分和(4)血小板含量很少的组分。分离单独的或者与全部或部分富含血小板组分混合的暗黄层组分，制备富含结缔组织生长促进成分的分离物。

在另一实施方式中，本发明提供了一种治疗病人的方法。该方法包括分离得到包含促进结缔组织形成成分的骨髓组分，并将该骨髓组分植入病人的组织缺损部位。根据本发明，在植入手术中进行该骨髓组分的分离。

在另一实施方式中，本发明提供了治疗病人的方法，包括获得病人的骨髓样品，离心该样品根据密度将样品分成不同组分，这些组分包括富含组织促进成分的组分。分离得到富含组织生长促进成分的组分将其植入病人中。根据本发明，在植入手术中进行所述获得、离心、分离步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了获得富含结缔组织生长促进成分的骨髓组分的方法。该方法包括离心含有骨髓的生物样品，根据密度将该样品分成(不同)组分，这些组分包括富含生长促进成分的组分。然后分离得到富含组织生长促进成分的组分。

从本说明书中可以明白本发明的其它实施方式，以及特征和优点。

图1-6显示从6名不同供者抽取的含有全血和骨髓的生物样品中分开和分离富含结缔组织生长促进成分的组分的测试结果，其中图1显示编号30500供者的测试结果，图2显示编号30501供者的测试结果，图3显示编号30506供者的测试结果，图4显示编号30526供者的测试结果，图5显示编号30527供者的测试结果，图6显示编号30561供者的测试结果。

为了促进对本发明原理的理解，将参考本发明的某些实施方式，用具体化的语言对其进行描述。然而应理解，它们不应限制本发明的范围，应认为本发明相关领域的技术人员通常能够对示例性植入物进行改变和改进，以及对本文所述原理进行进一步应用。

如上所述，本发明提供富含衍生自骨髓的一种或多种结缔组织(如骨)生长促进成分的分离物，制备该分离物的方法和用该分离物促进结缔组织生长的方法。

全血包含以下成分：血浆、红细胞、白细胞和血小板。全血的液体部分称为血浆，是一种蛋白质-盐溶液，其中悬浮着红细胞、白细胞和血小板。血浆的90％是水，它占血液总体积的55％。血浆含有清蛋白(主要蛋白成分)、纤维蛋白原(部分负责凝血)，球蛋白(包括抗体)和其它凝血蛋白。血浆起着各种功能，从维持合适血压到提供一定量的凝血和免疫力所必需的蛋白质。通过将液体部分与悬浮于血液的细胞分开而获得血浆。红细胞(红血球)所含的血红蛋白是一种在整个机体中携带氧气并赋予血液红色的含铁蛋白。红细胞占血液体积的百分数称为“血细胞比容”。白细胞(白血球)负责保护机体免受外界物质如细菌、真菌和病毒的侵袭。用于此目的的白细胞有以下几种类型，如保护机体免受环境感染并破坏侵入的细菌和病毒的粒细胞和巨噬细胞，和有助于免疫防御的淋巴细胞。血小板(凝血细胞)是血液的小细胞成分，它通过粘结于血管内壁帮助凝血过程。血小板防止外伤和血管渗漏引起的大量失血。

如果收集全血并通过加入合适的抗凝剂防止凝血，可将血液离心成各成分部分。离心将导致密度最高的红细胞压积到旋转容器的最外侧部分，而密度最低的血浆迁入旋转容器的内侧部分。将血浆和红细胞分开的是一层薄的白色或淡灰色层，称为暗黄层。暗黄层包含白细胞和血小板，它们共约占血液总体积的1％。

骨髓是一种复杂的组织，它包含造血干细胞、红白细胞及其前体细胞、间充质干细胞和祖细胞、基质细胞及其前体细胞和形成称为“基质”的结缔组织网络的一组细胞，包括成纤维细胞、网织红细胞、脂肪细胞和内皮细胞。来自基质的细胞通过直接与细胞表面蛋白相互作用和分泌生长因子在形态上调节造血细胞的分化，并参与骨结构的基础和支持。动物模型研究说明含有“基质前”体细胞的骨髓具有分化为软骨、骨和其它结缔组织细胞的能力。Beresford“骨和骨髓的成骨干细胞和基质系统”(Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow)，Clin.Orthop.，240：270，1989。近年来的证据显示，这些称为多能间充质干细胞或间充质干细胞的细胞在激活后能够产生几种不同类型的细胞系(即骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等)。然而，间充质干细胞在组织中与各种其它细胞(即红细胞、血小板、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞等)在一起，其存在量非常少，并与年龄呈逆相关，受许多生物活化因子的影响，它们能够分化成各种结缔组织。

根据本发明的一个实施方式，将含有骨髓的生物样品离心，根据密度将样品的成分分成各种组分，包括富含结缔组织生长促进成分的组分如间充质干细胞。然后分离得到富含结缔组织生长促进成分的组分。所得的分离物可含有一种或多种结缔组织生长成分，其浓度高于初始样品的浓度。可将所得的分离物直接施加于骨或其它组织缺损部位。或者，可将该分离物与运载体组合，将得到的植入物施加于骨或其它组织缺损部位。在这个方面，在本发明某些实施方式中，可将含有细胞的分离物组分单独或与运载体或其它物质(例如另一治疗物质)组合施加于组织缺损部位，对该分离物无需任何离体扩增或其它培养。在这种应用中，如果需要，可将该分离组分装入合适的递送设备，如注射器、导管等中，无需扩增或其它培养。在施加于骨或其它组织缺损部位或用于其它应用之前，也可修饰(例如用编码骨形成多肽的核酸转染)该分离物。该分离物基本上由骨髓(例如，骨髓抽取物)组成。例如，根据本发明的一个实施方式，骨髓抽取物可以是该分离物中唯一的含细胞成分。

同时，经离心的生物样品可不含细胞培养基物质，在本发明的某些形式中，经离心的生物样品可基本上由来自准备植入得到的分离物组分的病人的组织材料(如任选地与血液或其它组织材料组合的骨髓材料)组成，任选地含有一种或多种抗凝剂。

根据本发明的另一实施方式，离心含有全血(如外周血)和骨髓的生物样品，根据密度分离样品各成分。分离样品导致产生密度降低顺序的以下组分：富含红细胞的组分；富含白细胞的组分或暗黄层组分；富含血小板的组分和血小板含量很少的组分。然后，可分离暗黄层组分，可能还有与暗黄层组分相邻的全部或部分富含血小板的组分，制备富含结缔组织生长促进成分的分离物，得到的分离物可含有一种或多种结缔组织生长成分，其浓度高于初始样品的浓度。结缔组织生长成分包括但不限于：单核细胞如造血干细胞和间充质干细胞。该结缔组织生长成分可包含例如，结缔组织的祖细胞。

在制备待离心加工的生物样品过程中，除了用全血与骨髓材料形成混合物以外，或作为其替代方式，可将全血的某一组分与骨髓材料混合。根据本发明的说明，在待加工生物样品中可以采用全血的含有红细胞的组分或血浆组分。

在本发明待加工生物样品的制备中采用的全血或其组分可以是，例如人组织材料。当用于产生供植入病人中的材料时，全血或全血组分可以是病人自体的、同种异体的或异种的。在同种异体的情况下，全血或组分可以配型，采用与病人HLA相匹配的血液。

富含结缔组织生长促进成分的生物样品和/或分离物也可含有抗凝剂。合适的抗凝剂包括但不限于：肝素、柠檬酸钠和EDTA。

而且，富含结缔组织生长促进成分的分离物可以与一种溶液(如无菌等渗溶液)组合。合适的等渗溶液包括但不限于：磷酸缓冲盐水和组织培养基如最低必需培养基。

如上所述，可用离心法将含有骨髓的生物样品分成各种组分，包括富含结缔组织生长促进成分的组分。然后可分离富含结缔组织生长促进成分的组分，再将得到的分离物用于骨移植步骤。例如，可将该分离物置于自体骨移植物上和/或骨移植替代物上或与其结合，提高它们的骨形成潜能和移植物的融合速率。

根据本发明的其它实施方式，可通过从含有骨髓的生物样品中选择性分离促进骨形成的成分或通过降低该样品中抑制骨形成的成分的浓度来优化骨形成效果。根据本发明的一个实施方式，可在手术室中用手提式离心机，如Medtronic，Inc制造的Magllan^TM离心机系统进行这种优化。然后，将得到的富含结缔组织生长成分的骨髓分离物直接使用或与运载体如自体骨移植物或骨移植替代物组合使用。可在一个步骤中(即手术中)制备该分离物(即可获得含有骨髓的生物样品，将其分成(不同)组分，和分离富含结缔组织生长成分的组分)并施加于组织缺损部位。所述组织缺损部位可以是骨缺损部位。

在本发明另一实施方式中，可在不同的步骤中制备该分离物并施加于病人的组织缺损部位。例如，在第一个步骤中，获得病人的骨髓样品。可根据本发明加工如此获得的骨髓样品，以获得富含组织生长促进成分的分离物。该加工可包括与在第一步骤中获得病人的全血如外周血的样品相结合的加工。在第二步骤中，可将获得的含有组织生长促进成分的分离物植入病人的组织缺损部位，如骨缺损部位。

如上所述，从中分离得到富含结缔组织生长(成分)的组分的生物样品可包含血液(例如外周血)和骨髓(例如骨髓抽取物)的混合物。根据本发明的一个实施方式，该样品可含有一份(体积)骨髓和两份体积的血液(即骨髓和血液的体积比是1∶2)。也可采用骨髓与血液其它体积比的样品。例如，骨髓与血液的体积比可以是1∶1、2∶1、1∶3、3∶1等。骨髓与血液的体积比可以在，例如1∶100至100∶1的范围内，更通常是1∶3至3∶1的范围内，可对其进行调整以实现分离物的所需加工特征和用量。

骨髓可来自任何来源，包括例如：来自网状骨或松质骨的小梁之间的空隙，来自长骨的髓腔和/或来自哈弗斯骨管。骨髓可以是人或其它哺乳动物来源，当骨髓用于制备植入病人的材料时，该骨髓可以是病人自体、同种异体或异种的。例如，骨髓可以是抽取骨髓(例如抽取自髂嵴的骨髓)。血液和骨髓可以各自取自病人，混合成样品，分离(例如通过离心)样品中富含结缔组织生长成分的组分，将富含结缔组织生长成分的分离物施加于组织缺损部位。该步骤包括制备此种分离物和将分离物施加于缺损部位，可在一次操作中(即手术中)进行该步骤。

根据本发明的其它实施方式，富含结缔组织生长成分的分离物的血小板产率(即分离物中的血小板浓度除以初始样品中的血小板浓度)可以比初始样品高2倍、3倍或4倍。富含结缔组织生长成分的分离物的血细胞比容也可低于50体积％、低于25体积％或低于12.5体积％。根据本发明的一个实施方式，富含结缔组织生长成分的分离物比初始样品的血小板产率(即分离物中的血小板浓度除以初始样品中的血小板浓度)高4倍，血细胞比容低于12.5体积％。

如上所述，可用离心机系统将含有骨髓的生物样品分成各种组分包括富含结缔组织生长成分的组分。可采用能将生物样品(例如含有血液的样品)分成(不同)组分的任何离心机系统。离心机的例子是Medtronic，Inc生产的Magellan^TM AutologousPlatelet Separator(APS)系统。以下美国专利申请中公开了将血液分成各种组分的离心机系统和方法：2001年4月9日提交的美国专利申请序列号09/832,517，2002年2月21日公开为美国专利申请公告号20020022213；2001年4月9日提交的美国专利申请序列号09/832,463，2002年10月10日公开为美国专利申请公告号20020147094；2001年4月9日提交的美国专利申请序列号09/833,234，2001年12月27日公开为美国专利申请公告号20010055621；2001年9月24日提交的美国专利申请序列号09/961,793，2003年3月27日公开为美国专利申请公告号20030060352；2002年4月4日提交的美国专利申请公告号10/116,729，2002年12月5日公开为美国专利申请公告号20020182664；以及2001年4月9日提交的美国专利申请序列号09/833,230，2002年10月10日公开为美国专利申请公告号20020147098。将这些申请各自以整体纳入本文作为参考。可用这些申请中公开的方法和系统从含有骨髓的生物样品中分离得到富含结缔组织生长成分的组分。具体说，可以离心含有血液和骨髓的样品，可用上述申请中公开的装置和方法分离对应于暗黄层的组分(即第二高密度的组分)和全部或部分富含血小板的血浆组分(即与暗黄层组分相邻血浆层的密度较高的区域)。根据本发明的一个实施方式，该装置可包含一个传感器组件，用于根据液体密度的改变来鉴定样品不同组分之间的界面。例如，可用上述申请中所述的传感器组件鉴定富含红细胞的区域和暗黄层组分或富含血小板的血浆组分之间的界面，以及富含血小板的血浆组分和血小板含量很少的血浆组分之间的界面。可利用样品不同组分之间界面位置的知识从样品中分离所需组分。

从生物样品中分离得到的富含结缔组织生长成分的组分，可含从含有血液和骨髓的样品分离产生的暗黄层组分(即第二高密度组分)和全部或部分富含血小板的血浆组分(即与暗黄层组分相邻血浆层的密度较高的区域)。根据本发明的其它实施方式，该分离物可包含高达50体积％的样品。例如，该分离物可包含40体积％、30体积％或20体积％的样品。根据本发明的优选实施方式，从生物样品中分离得到的富含结缔组织生长成分的组分可包含5-17体积％的初始样品。例如，对于60毫升样品，分离物的体积可以为3-10毫升。根据其它实施方式，分离物可包含约10体积％的初始样品(例如60毫升样品为6毫升分离物)。虽然上面公开了60毫升样品体积，但也可采用较大或较小体积的生物样品。例如，可以根据可利用的血液或骨髓的量和/或给定步骤所需分离物的量，选择生物样品的体积。例如，生物样品的体积可以高达100毫升、75毫升、50毫升或25毫升。

以足以实现所需程度分离的时间和转速离心样品。例如，可以0-5,000rpm之间的转速离心约60秒-10分钟。根据本发明的一个实施方式，离心17-20分钟。本领域技术人员知道，转速越快通常分离生物样品的时间越短。通常需要约60分钟或更少时间实现分离。而且，当从病人获得骨髓材料来产生用于再植入的组分时，需要在获得骨髓后马上，例如在约2小时内，宜1小时内离心含有骨髓的生物样品。同样，可在得到本发明分离组分后马上，例如在约2小时内，宜1小时内再植入该分离组分。在本发明的又一实施方式中，获得骨髓组分，离心得到该分离组分以及植入该分离组分都可在同一天，例如在不多于约3小时内进行。

如上所述，在一种应用模式中，本发明的分离组分可用于植入病人。同样，本发明分离物可用作例如从该分离组分中回收分离的细胞和/或涉及其中成分的诊断或研究，如涉及分离组分中所含细胞的研究中，进一步纯化各组分的来源。

可植入本发明分离物，以治疗各种疾病的组织缺损。可治疗的组织缺损例子包括骨缺损、神经缺损、肌肉缺损、肌腱缺损、真皮缺损和骨髓基质组织缺损。通常在涉及骨囊肿的组织损伤修复中，可修饰骨组织的例子包括胸骨、颅骨、长骨、脊椎部件如椎骨的骨组织。可修复神经组织的例子包括中枢和外周神经组织。也可用本发明植入物治疗软骨组织(缺损)，通常包括关节损伤的治疗，提供对骨质疏松症的治疗，或修复肌腱和韧带。

在治疗肌肉组织过程中，可将该植入物植入心血管或骨骼肌中。在修复或支撑椎间盘核组织中，可将本发明植入物植入椎间盘间隙中，该植入物也可用于牙科应用，例如包括牙骨和/或齿龈组织。在这些和其它治疗中，可以将本发明分离物与蛋白质或其它治疗物质、基因或其它有益物质一起引入。

在修复骨组织中，可任选地将本发明分离物与诱导或加速祖细胞或干细胞分化成成骨谱系细胞的至少一种生物活性因子相混合。可在植入该分离物之前、期间或之后使该分离物与所述生物活性物质离体接触，或将其注射入缺损部位。所述生物活性物质可以是包括各种组织生长因子的TGF-ss超家族成员，包括骨形态发生蛋白如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6和BMP-7。

在修复软骨组织中，可植入本发明分离物以治疗浅表软骨缺损或全厚度软骨缺损，以治疗例如骨质疏松症患者的膝盖骨或椎间盘软骨，或再生关节软骨。可用本发明分离物治疗的关节包括但不限于：膝关节、髋关节、肩关节、肘关节、踝关节、跗和跖关节、腕关节、脊椎关节、腕和掌关节以及暂时性(temporal)颌关节。

根据本发明的其它实施方式，可在修饰富含结缔组织生长成分的分离物后再植入。例如，可用合适的基因和/或蛋白修饰富含结缔组织生长成分的分离物中的细胞(例如间充质干细胞)，以指导谱系特异性细胞扩增和/或分化或多谱系细胞扩增或分化。

根据本发明的一个实施方式，可用含有编码成骨诱导蛋白或多肽的核苷酸序列的核酸转染富含结缔组织生长因子成分中的细胞(例如间充质干细胞)。可由该核苷酸序列编码的成骨诱导蛋白的例子包括但不限于：BMP、LMP或sMAD蛋白或其活性(即成骨诱导)部分。编码成骨诱导蛋白或多肽的核苷酸序列可操作性连接于一个启动子。例如，该核苷酸序列可以位于载体如表达载体(如腺病毒)中。

以下的美国专利申请中公开了包含编码LIM矿化蛋白(LMP)的核苷酸序列的核酸和载体以及用含有编码LIM矿化蛋白的核苷酸序列的核酸转染细胞的方法：1998年7月29日提交的美国专利申请序列号09/124,238，现在是美国专利号6,300,127；2000年4月28日提交的美国专利申请序列号09/959,578，待审中；2002年11月13日提交的美国专利申请序列号10/292,951，2003年9月25日公开为美国专利申请公告号20030180266；以及2003年3月7日提交的美国专利申请序列号10/382,844，2003年12月4日公开为美国专利申请公告号20030225021。将这些申请各自以整体纳入本文作为参考。可采用这些申请中公开的任何材料和技术修饰富含结缔组织生长因子成分中的细胞。

该核酸编码的成骨诱导多肽可以是人LIM矿化蛋白(如hLMP-1或hLMP-3)的活性(即成骨诱导)部分。例如，成骨诱导多肽可包含来自hLMP-1或hLMP-3序列的至少″n″个连续氨基酸，其中n是5、10、15或20。

根据本发明的其它实施方式，成骨诱导多肽可以是hLMP-1或hLMP-3的成骨诱导部分，包含以下氨基酸序列的至少″n″个连续氨基酸：ASAPAADPPRYTFAPSVSLNKTARPFGAPPPADSAPQQNG(SEQ ID NO：1)或以下氨基酸序列的至少″n″个连续氨基酸：ASAPAADPPRYTFAPSVSLNKTARPFGAPPPADSAPQQN(SEQ ID NO：2)其中n是5、10、15或20。根据本发明的其它实施方式，成骨诱导多肽可以是hLMP-1或hLMP-3的成骨诱导部分，包含以下氨基酸序列的至少″n″个连续氨基酸：PPPADSAPQ(SEQ ID NO：3)，其中n是4、5、6、7或8。根据本发明的其它实施方式，成骨诱导多肽可以是hLMP-1或hLMP-3的成骨诱导部分，包含序列：PPPAD(SEQ ID NO：4)。

成骨诱导多肽(例如hLMP-1或hLMP-3蛋白的成骨诱导部分)可包含多达15个氨基酸残基。根据本发明的其它实施方式，成骨诱导多肽(例如hLMP-1或hLMP-3蛋白的成骨诱导部分)可包含多达20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。

成骨诱导多肽可以是合成的多肽。例如，成骨诱导多肽可以是含有与hLMP-1或hLMP-3的成骨诱导部分对应序列的合成多肽。

也可用蛋白转导结构域(PTD)与成骨诱导蛋白的偶联物或编码成骨诱导蛋白的核酸修饰富含结缔组织生长促进成分的分离物。例如，可使富含结缔组织生长因子成分中的细胞(如间充质干细胞)与蛋白转导结构域(PTD)与成骨诱导多肽的偶联物或编码成骨诱导蛋白的核酸接触。成骨诱导多肽可以是BMP、LMP、sMAD蛋白或成骨诱导蛋白的活性(即成骨诱导)部分。2003年3月24日提交的临时美国专利申请序列号60/456,551中公开了PTD和成骨诱导蛋白的偶联物，以整体纳入本文作为参考。可将该申请中公开的任何偶联物和技术用于修饰富含结缔组织生长因子成分中的细胞。也可将如上所述PTD与人LIM矿化蛋白(如hLMP-1或hLMP-3)活性(即成骨诱导)部分的偶联物用于修饰富含结缔组织生长成分分离物中的细胞。

也可使富含结缔组织生长成分分离物中的细胞(如间充质干细胞)与成骨诱导多肽接触。例如，可将分离物与成骨诱导蛋白(例如BMP-2)混合。然后将修饰的分离物置于运载体上植入病人。

在这个方面，可用于本发明分离材料的运载体可以是空间结构稳定的或不稳定的(例如糊或泥)运载体。

运载体可以是，例如可吸收性多孔基质。在这个方面，可吸收性多孔基质在某些实施方式中是成胶性基质。各种胶原物质都适用于该可吸附性基质。可根据氨基酸序列、碳水化合物含量和是否存在二硫键交联将天然存在的胶原细分为几种不同类型。I型和III型胶原是胶原的两种最常见亚型。I型胶原存在于皮肤、肌腱和骨中，而III型胶原主要见于皮肤中。可从皮肤、骨、肌腱或软骨的基质中得到胶原，并通过本领域公知方法纯化。或者，可购得胶原。该多孔基质组合物宜包括I型牛胶原。

运载体基质的胶原还可以是非端肽(atelopeptide)胶原和/或端肽(telopeptide)胶原。而且，可采用非纤维和/或纤维胶原。非纤维胶原是经溶解不能被重建为其天然纤维形式的胶原。

除了胶原或胶原的替代物外，也可用其它有机材料如天然或合成聚合材料制备合适的可吸收性运载体基质材料。例如，可吸收运载体可包括明胶(如发泡明胶)，或可吸收性合成聚合物如聚乳酸聚合物、聚乙醇酸聚合物或它们的共聚合物。已知其它天然和合成聚合物也可用于制备生物相容性可吸收基质材料，可用于本发明。

运载体也可以是或包括天然和/或合成矿物成分。例如，可通过颗粒性矿物质，包括粉末形式或较大的颗粒矿物质提供该矿物成分。在某些实施方式中，随着可吸收基质材料被吸收，颗粒性矿物成分能为生长中的骨提供有效支架。矿物质可以是，例如骨尤其是皮质骨矿物质，或合成的生物陶瓷如生物相容性磷酸钙陶瓷。陶瓷的例子包括磷酸三钙、羟基磷灰石和两相磷酸钙。可以购得或通过本领域已知方法获得或合成这些矿物成分。

如上所述，在本发明中可采用两相磷酸钙提供含矿物质的运载体。这种两相磷酸钙所含的磷酸三钙∶羟基磷灰石的重量比宜为约50∶50-95∶5，优选约70∶30-95∶5，更优选约80∶20-90∶10，最优选约85∶15。

运载体可包括提供支架的矿物质量，该支架能在病人需要骨生长的空隙中有效保留足够长的时间以形成骨。一般地，这个时间约为8-12周，但是在具体情况下也可能更长或更短。为这些目的必须在运载体中提供最低水平的矿物质，这也取决于该分离物中的组织生长促进成分的活性水平，和其它物质如BMP或其它成骨蛋白是否与该分离物的组织生长促进成分组合一起加入到运载体中。

在本发明的某些形式中，运载体可包括包裹在用胶原、明胶或可吸收性合成聚合物等物质制备的多孔有机基质中的颗粒性矿物成分。在这个方面，第一个植入材料中的颗粒性矿物质∶可吸收性多孔基质的重量比可为至少约4∶1，更通常约为10∶1。在高度矿化的运载体中，颗粒矿物质将占第一个植入材料的至少95重量％。例如，可提供含有约97-99重量％的颗粒性矿物质和约1-3％的胶原或其它基质形成材料的运载体材料。而且，该矿物成分的平均粒度，例如，至少约为0.5毫米，更优选约0.5-5毫米，最优选约1-3毫米。

用于与该分离物组合的运载体可以是空间结构不稳定的，例如是可流动或有韧性的物质，如糊或泥。这种运载体的例子可包括植入后能保持在组织缺损部位的生物可吸收性、空间结构不稳定性材料。这种运载体可包括可吸收性有机材料如生物或合成来源的大分子，例如明胶、透明质酸、羧甲基纤维素、胶原、肽、糖胺聚糖、蛋白聚糖等。可与掺入了本文上述颗粒性矿物成分一起或不与其一起使用这种材料。在某种形式中，可将可吸收性运载体配制成组合物，以使组合物在高于待植入该材料的病人体温时可流动，但在等于或略高于体温时转变成不易流动。可将可吸收性运载体配制到该植入组合物中，使其可流动状态是液体或可流动的凝胶，而不可流动状态是固化凝胶或固体。在本发明的某些实施方式中，可吸收性运载体可包括明胶，和/或可掺入颗粒性矿物质，其含量约占运载体组合物的20-80体积％，更常约占40-80体积％。

在本发明的某些形式中，运载体可以是提供生物惰性表面的成骨诱导基质，该表面可接受宿主新骨的生长。例如，运载体可以是胶原海绵或上述具有这些特征的另一空间结构稳定或不稳定的运载体。

运载体可包含可调节其它细胞生长或分化的生长因子。可采用的生长因子包括但不限于：骨形态发生蛋白、sMAD蛋白和LIM矿化蛋白。运载体中也可包括脱矿物的骨基质。例如，可将的脱矿物骨基质的粉末或颗粒掺入运载体中。

也可将该分离物与同种异体移植骨和/或自体移植骨混合。例如，可将该分离物与同种异体移植骨和/或自体移植骨混合，将得到的植入物植入宿主。同样，在植入之前或之后，可将本发明分离物与一种或多种血小板激活物质，如凝血酶混合，以激活该分离物中所含的血小板，和/或与涉及凝血级联反应的其它物质如纤维蛋白原混合。

该分离物或含有该分离物的植入物可通过一种或多种机制，如骨发生、骨传导和/或骨诱导而增强或加速新骨组织的生长。例如，该分离物或含有该分离物的植入物在植入宿主时可具有骨诱导性能。因此，该分离物或含有该分离物的植入物可聚集具有修复骨组织潜能的宿主细胞。

富含结缔组织生长成分的分离物或含有该分离物的植入物可用于骨修复。例如，可将该分离物或含有该分离物的植入物施加于骨修复部位，例如损伤部位，手术、感染、恶化或进行性畸形所造成的缺损部位。该分离物或含有该分离物的植入物可用于各种整形外科、牙周、神经外科以及口腔和上颌面手术方法中，包括但不限于：修复单纯性和复合性骨折和骨不连接；外部和内部固定；关节重建如关节固定术；普通关节成形术；髋关节凹关节成形术；股骨和肱骨头置换；股骨头表面置换和全关节置换；脊柱修复包括脊柱融合术和内固定；肿瘤外科如缺陷填充；discectomy；椎板切除术；髓核肿瘤的切除；前颈椎和胸部手术；脊椎损伤的修复；脊柱侧凸、脊柱前弯和脊柱后凸的治疗；骨折的颌间固定；颏成形术；颞下颌关节置换；牙槽嵴增高和重建；镶嵌骨植入物；放置和修正植入物；窦升高；化妆增效等。可用该分离物或含有该分离物的植入物修复或置换的具体骨包括但不限于：筛骨；额骨；鼻骨；枕骨；顶骨；颞骨；下颚骨；上颌骨；颧骨；颈椎；胸椎；腰椎；骶骨；肋骨；胸骨；锁骨；肩胛骨；肱骨；桡骨；尺骨；腕骨；掌骨；指趾骨；髂骨；坐骨；耻骨；股骨；胫骨；腓骨；膝盖骨；跟骨；跗骨和跖骨。

富含结缔组织生长成分的分离物或含有该分离物的植入物也可用于软骨修复。例如，可将该分离物或含有该分离物的植入物施加于软骨缺损部位。例如，可将该分离物用于关节软骨缺损的部位。

富含结缔组织生长成分的分离物或含有该分离物的植入物也可用于软组织修复。

骨髓可以是抽取的骨髓。骨髓可以是从待治疗组织缺损的病人抽取的自体骨髓。可用公知的技术获得骨髓。根据本发明的一个实施方式，可用Jamshedi针(如从髂嵴中)抽取骨髓。

本文所述分离富含结缔组织生长促进成分的组分所用方法有许多优点。首先，该方法不需要使用分离介质，如密度梯度介质，但是应理解，在本发明的某些实施方式中，可包括使用这种分离介质。因为不能将这些分离介质引入人体中。因此，当采用了不能引入病人中的分离介质时，需要一系列洗涤步骤从分离的细胞群体中去除该分离介质。可用本文所述的优选方法分离所需细胞，无需使用这种分离介质，因此不需要单独的洗涤步骤。因此，可将本发明的待植入分离物装在递送装置，如注射器、导管等中，而无需任何洗涤步骤。本文所述的优选方法也可在手术中进行分离和将分离物用于组织修复。而且，本文所述优选方法所用的样品量较少(例如60毫升或更少)。

为了促进进一步理解本发明，提供了以下实验。应理解，这些实验是阐述性的，不限制本发明。

实验I

以下非限制性实施例旨在说明从含有全血和骨髓的生物样品中制备富含结缔组织生长促进成分的分离物的方法。

用Magellan^TMAPS系统加工含有20毫升抗凝骨髓和40毫升抗凝血液的混合物的生物样品。然后分离各轮的富含结缔组织生长促进成分的组分。评价所得分离物的血小板产率(即分离物中的血小板浓度除以初始样品中的血小板浓度)和血细胞比容。各轮分离物的体积约为6毫升，包括样品的暗黄层组分和一部分相邻的富含血小板的组分。

图1-6中列出了各轮的测试结果，其中图1显示了编号30500供者的测试结果，图2显示了编号30501供者的测试结果，图3显示了编号30506供者的测试结果，图4显示了编号30526供者的测试结果，图5显示了编号30527供者的测试结果，图6显示了编号30561供者的测试结果。在图1-6中，富含结缔组织生长促进成分的组分称为“PRP”。生物样品的其它组分中，血小板含量很少的血浆称为“PPP”(即密度最低的组分)，含有红细胞的组分称为“PRBC”(即密度最高的组分)。从分析中排除被认为是不可接受的轮次。将可接受的分离轮次定义为其中没有遇到不利事件的轮次。这些不利事件包括但不限于：由操作者失误引起的失败；未能以可靠方式进行CBC计数，和；在静脉穿刺或运输期间有过多血小板被激活，其表现为在分离过程期间或之后即刻有过多血小板凝集。

所用装置/固定/计量

Magellan^TM APS设备，s/n MAG1000185(装有软件v.2.3)

Cell Dyn 1700细胞计数仪，Medtronic Equipment#133506。

所用材料/样品

Magellan^TM一次性使用的试剂盒，无菌

Poietics人骨髓-产品编号1M-125。批号030500、030501、030506、030526、030527、030561。Poietics Normal。

人外周血-产品编号1W-406。批号030500、030501、030506、030526、030527、03056。

结果和数据

将各轮结果小结在下表中，该表显示了从各样品分离的富含结缔组织生长成分的分离物的血小板产率和以体积％表示的血细胞比容。血小板产率是分离物中的血小板浓度和初始样品中的血小板浓度的比值。

供者号	血小板产率	血细胞比容(％)
			030500	4.2	4.2
030501	5.2	6.9
			030506	5.1	5.7
030526	5.4	4.6
			030527	5.2	7.9
030561	4.7	4.2
			平均值	4.9	5.6
标准差	0.5	1.5

结论

从上述数据可以看出，用Magellan^TMAPS系统进行的所有(6)个分离轮次中，富含结缔组织生长促进成分的分离物(即PRP组分)中的血小板浓度均是初始样品的4倍以上。此外，所有(6)个分离轮次中，也导致富含结缔组织生长促进成分的分离物(即PRP组分)的血细胞比容(HCT)均低于12.5％。

实验2

分离含有血液和骨髓的样品中富含结缔组织生长成分的组分。然后用各种剂量的含hLMP-1的腺病毒载体(即AdVLMP)转染分离物中包括间充质干细胞在内的细胞。然后采用无胸腺大鼠异位模型，将这些细胞植入大鼠中。

虽然上述说明书介绍了本发明的原理，也提供了实施例进行说明，但是本领域技术人员应理解，通过阅读本公开内容，可进行各种形式和细节的改变，而不背离本发明的真正范围。

将上述说明书中所引用的所有刊物以整体纳入本文作为参考，如各自单独纳入作为参考并完整列明的那样。

Claims (62)

1.一种获得骨髓组分的方法，所述方法包括：

a)离心含有全血和骨髓的生物样品以根据密度对该样品的诸成分进行分离，所述分离提供了密度降低顺序的以下组分：

(i)富含血细胞的组分；

(ii)暗黄层组分；

(iii)富含血小板的组分；和

(iv)血小板含量很少的组分；以及

b)分离单独的暗黄层组分或者与全部或部分富含血小板的组分混合的暗黄层组分以形成富含结缔组织生长促进成分的分离物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全血和骨髓来自相同的哺乳动物来源。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物来源是人。

4.如权利要求1所述的方法，还包括将所述富含结缔组织生长促进成分的分离物与运载体组合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含结缔组织生长促进成分的分离物含有间充质干细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全血是外周血。

7.如权利要求1所述的方法，还包括在手术期间收获病人的所述骨髓。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述手术期间进行离心和分离。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品基本上由骨髓和全血的抗凝混合物组成。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在不存在任何合成的密度梯度物质时离心所述生物样品。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心提供的血小板产率至少约为2。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含结缔组织生长成分的分离物的血细胞比容低于50体积％。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含结缔组织生长成分的分离物的血小板浓度是所述生物样品的4倍以上，血细胞比容低于约12.5体积％。

14.一种治疗病人的方法，所述方法包括：

获得包含骨髓组分的分离物，所述骨髓组分含有促进结缔组织形成的成分；和

将所述分离物植入病人的组织缺损部位；

其中，在所述植入手术中进行所述获得的步骤。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述骨髓组分是病人自体的。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述获得的步骤包括离心含有骨髓的生物样品。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述获得的步骤包括收获病人的骨髓，离心含有所述骨髓的生物样品，和收集所述分离物。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述生物样品也包含全血。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述全血是病人的外周血。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述分离物的血小板浓度是所述生物样品的约2倍以上。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述分离物的血细胞比容低于约12.5体积％。

22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在骨缺损部位进行所述植入。

23.如权利要求22所述的方法，还包括在所述植入之前、期间或之后使所述分离物与成骨蛋白接触。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述成骨蛋白是骨形态发生蛋白(BMP)。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述BMP是BMP-2或BMP-7。

26.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在软骨缺损部位进行所述植入。

27.如权利要求17所述的方法，其特征在于，在不存在任何合成的密度梯度物质时离心所述生物样品。

28.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述生物样品基本上由病人的骨髓和全血的抗凝混合物组成。

29.如权利要求14所述的方法，还包括在所述植入之前将所述分离物与运载体混合。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述运载体是可再吸收的。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述运载体包括空间结构稳定的多孔性基质材料。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述多孔性基质材料包含天然或合成聚合物。

33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述多孔性基质材料包含选自胶原、明胶、透明质酸、羧甲基纤维素和合成聚合物的一种物质。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述多孔性基质材料包含胶原。

35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述运载体包括包裹在所述多孔性基质材料中的颗粒矿物质。

36.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述运载体是空间结构不稳定的运载体。

37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述运载体是糊或泥。

38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述运载体包含选自胶原、明胶、透明质酸、羧甲基纤维素、蛋白聚糖、糖胺聚糖和合成聚合物的有机材料。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述运载体包括胶原或明胶。

40.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述运载体包含与所述有机材料混合的颗粒矿物质。

41.一种植入组合物，所述组合物包含：与生物相容性运载体组合的含有包含组织生长促进成分的未经培养骨髓组分的分离物材料。

42.如权利要求41所述的植入组合物，其特征在于，所述运载体为组织生长提供了可再吸收性支架。

43.如权利要求41所述的植入组合物，其特征在于，通过离心含有骨髓的生物样品并收集所述含有组织生长促进成分的骨髓组分而获得所述分离物材料。

44.如权利要求41所述的植入组合物，其特征在于，所述分离物还包含外周血成分。

45.如权利要求43所述的植入组合物，其特征在于，所述生物样品还包括外周血。

46.如权利要求42所述的植入组合物，其特征在于，所述运载体包含胶原。

47.如权利要求45所述的植入组合物，其特征在于，所述分离物材料的血细胞比容低于约12.5体积％。

48.如权利要求41所述的植入组合物，其特征在于，所述组织生长促进成分包含间充质干细胞。

49.一种治疗病人的方法，所述方法包括：

提供含有病人骨髓来源组织的生物样品，所述样品包括组织生长促进成分；

离心该生物样品根据密度将样品分成不同组分，所述组分包括富含所述组织生长促进成分的组分；

分离得到所述富含组织生长促进成分的组分；

将所述富含组织生长促进成分的组分植入病人；和

其中，在所述植入手术中进行所述离心和分离。

50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，相对于所述生物样品，所述离心和分离能在所述组分中有效富集所述生长促进成分。

51.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述生长促进成分包含细胞，所述方法也包括遗传修饰所述细胞。

52.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述生物样品还包含全血。

53.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述全血是外周血。

54.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述组织是从所述骨髓来源抽取获得的。

55.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述组织是从病人的髂嵴抽取的。

56.如权利要求49所述的方法，其特征在于，在不存在任何合成的密度梯度物质时离心所述生物样品。

57.一种获得含有组织生长促进成分的分离物材料的方法，所述方法包括：

收获哺乳动物骨髓来源的组织，所述组织含有组织生长促进成分；

通过将所述组织与该哺乳动物的全血混合形成混合物；

离心含有所述混合物的生物样品以根据密度将该生物样品分离成各种组分，所述组分包括富含所述组织生长促进成分的组分；和

分离富含所述组织生长促进成分的所述组分。

58.一种获得富含结缔组织生长促进成分的骨髓组分的方法，所述方法包括：

离心含有骨髓的生物样品以根据密度将样品诸成分分成不同组分，所述组分包括富含组织促进成分的组分；和

分离所述富含组织生长促进成分的组分。

59.一种制备供递送的医用植入材料的方法，所述方法包括：

(a)在有效分离含有能促进组织生长骨髓成分的组分条件下离心含有骨髓材料的生物样品；和

(b)不洗涤该组分而将所述组分装入将该组分递送给病人的装置。

60.一种制备供递送的医用植入材料的方法，所述方法包括：

(a)在有效分离含有能促进组织生长骨髓成分的组分条件下离心含有骨髓材料的生物样品；和

(b)不培养该组分而将所述组分装入将该组分递送给病人的装置。

61.一种医用组合，所述组合包含富含促进组织生长成分的分离的未经培养的骨髓组分以及与其组合的用于将该材料递送给病人的装置。

62.按照权利要求1-13和58-59中任一项所述方法制备的分离物材料在制造用于治疗病人组织缺损的药物中的应用。

Images