CN101072868B - 灵长类胚胎干细胞的培养 - Google Patents

灵长类胚胎干细胞的培养 Download PDF

Info

Publication number
CN101072868B
CN101072868B CN200580032533.7A CN200580032533A CN101072868B CN 101072868 B CN101072868 B CN 101072868B CN 200580032533 A CN200580032533 A CN 200580032533A CN 101072868 B CN101072868 B CN 101072868B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
substratum
serum
fgf
embryonic stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200580032533.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101072868A (zh
Inventor
J·A·托马森
M·莱文斯坦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wicell Research Institute Inc
Original Assignee
Wicell Research Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/952,096 external-priority patent/US20050148070A1/en
Application filed by Wicell Research Institute Inc filed Critical Wicell Research Institute Inc
Publication of CN101072868A publication Critical patent/CN101072868A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101072868B publication Critical patent/CN101072868B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)

Abstract

本发明涉及培养人胚胎干细胞的方法，该方法是在基本不含哺乳动物胎儿血清的环境中和在干细胞培养基中培养干细胞，所述干细胞培养基含有氨基酸、维生素、盐、矿物质、运铁蛋白、胰岛素、白蛋白并添加有不止是饲养层来源的成纤维细胞生长因子。还公开了能够支持人胚胎干细胞的培养和增殖但不需要饲养细胞或者使培养基接触饲养细胞的组合物。

Description

灵长类胚胎干细胞的培养
关于联邦政府资助研究的声明
待定。
发明背景
本发明涉及培养灵长类胚胎干细胞培养物的方法以及与其一起使用的培养基。
已经从着床前胚胎获得了灵长类(例如，猴和人)多能胚胎干细胞。参见，例如，美国专利5,843,780和J.Thomson等，282 Science 1145-1147(1998)。这些公开的内容以及这里提及的所有其它公开通过引入纳入本文，这就如同已经在文中全文列出。尽管延长了培养时间，但这些细胞稳定保持形成所有三个胚层的高级衍生物的发育潜能。
灵长类(尤其是人类)ES细胞系被广泛用于人类发育生物学、药物发现、药物测试和移植药物。例如，目前对着床后人胚胎的了解主要是基于数量有限的静态组织切片。由于伦理原因，实质上还未研究控制早期人胚胎发育决定的根本机制。
尽管实验哺乳动物发育生物学主要依赖于小鼠，且尽管有许多控制发育的基本机制在小鼠和人之间是保守的，但小鼠和人的早期发育之间有显著区别。因此需要灵长类/人ES细胞以深入了解它们的分化和功能。
灵长类ES细胞的分化衍生物可用来鉴定新药的基因靶点、用来测试新化合物的毒性或致畸性、以及用于移植以替代疾病部位的细胞群。通过移植ES细胞衍生细胞有可能治疗的疾病包括帕金森病、心脏梗塞、青少年糖尿病和白血病。参见，例如，J.Rossant等，17 Nature Biotechnology 23-4(1999)和J.Gearhart，282 Science 1061-2(1998)。
长期增殖能力、长期培养后的发育潜能以及核型稳定性是利用灵长类胚胎干细胞培养物的关键特征。这种细胞的培养物(尤其是在成纤维细胞饲养层上的)通常补充有动物血清(尤其是胎牛血清)以在这种培养期间进行所需的增殖。
例如，在美国专利5,453,357、5,670,372和5,690,296中公开了各种培养条件，其中包括使用一类碱性成纤维细胞生长因子和动物血清的一些条件。不幸的是，各批次血清的特性都有所不同，因此会影响培养物的特征。
WO 98/30679讨论了用无血清补充物来代替动物血清支持培养物中的某些胚胎干细胞生长。该血清替代品中含有白蛋白或白蛋白替代物、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种运铁蛋白或运铁蛋白替代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代物、一种或多种胶原前体以及一种或多种痕量元素。注意，这种替代品中还可补充白血病抑制因子、青灰因子或睫状节神经细胞营养因子。不幸的是，对于灵长类胚胎干细胞培养物(尤其是生长在成纤维细胞饲养层上的那些细胞)，这些培养基不令人满意。
对于营养血清培养基(例如，胎牛血清)，WO 99/20741讨论了在培养灵长类干细胞时使用各种生长因子(如bFGF)的益处。然而其中未描述不含营养血清的培养基。
美国专利5,405,772描述了造血细胞和骨髓基质细胞的生长培养基。其中提到，在缺乏血清的培养基中使用成纤维细胞生长因子以用于该目的。然而其中未描述灵长类胚胎干细胞的生长条件。
首先用成纤维细胞饲养细胞层培养人胚胎干细胞培养物，这种饲养细胞层能够使人胚胎干细胞增殖同时保持未分化状态。然后发现，使培养基接触饲养细胞足以形成所谓的调节培养基(conditioned medium)，这种培养基具有与直接使用饲养细胞相同的特性。不使用饲养细胞或调节培养基，培养的人胚胎干细胞就不能保持未分化状态。由于使用了饲养细胞，或者即便是使培养基接触饲养细胞，培养物都有被不需要的物质污染的风险，因此最好避免使用饲养细胞和调节培养基。未曾接触过饲养细胞的培养基在这里被称为非调节培养基(unconditioned medium)。
因此可以看出，仍旧需要在不使用动物血清时稳定培养灵长类胚胎干细胞的技术。
发明概述
在本发明的一个方面提供了培养灵长类胚胎干细胞的方法。一种方法是在基本不含哺乳动物胎儿血清(也优选基本不含任何动物血清)并在含有不止是成纤维细胞饲养层来源的成纤维细胞生长因子的培养物中培养干细胞。在优选的形式中，通过加入足量成纤维细胞生长因子就不再需要之前维持干细胞培养物所必需的成纤维细胞饲养层。
成纤维细胞生长因子是哺乳动物发育所必需的分子。目前有20多种已知的成纤维细胞生长因子配体和5种上述配体的成纤维细胞生长因子信号转导受体(以及它们的剪接变体)。通常可参见D.Ornitz等，25 J.Biol.Chem.15292-7(1996)；美国专利5,453,357。预计这些因子在物种之间有微小变化，因此术语成纤维细胞生长因子不受物种限制。然而，我们优选使用人成纤维细胞生长因子，更优选由重组基因产生的人碱性成纤维细胞生长因子。这种化合物不难从Gibco BRL-Life Technologies以及其它公司大量购得。
注意，出于本发明的目的，尽管已经从血清分离出单独的组分(例如，牛血清白蛋白)且随后外源性提供这些组分，所述培养物仍可基本不含特定的血清。关键是，加入血清本身就增加了变数。然而，当加入这种血清中的一种或多种良好定义的纯化组分时则不会这样。
优选的，用这种方法培养的灵长类胚胎干细胞是真ES细胞系的人胚胎干细胞，它们：(i)能够在体外以未分化状态无限增殖；(ii)即便在长期培养后也能够分化成所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物；和(iii)在长期培养中维持正常核型(整倍体)。因此这些细胞被称为多能细胞。
这种培养能够使胚胎干细胞在培养物中稳定增殖1个月以上(优选6个月以上；更优选12个月以上)同时维持干细胞分化成内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，同时维持干细胞的核型。
在本发明的另一方面，提供了另一种培养灵长类胚胎干细胞的方法。一种方法是在基本不含哺乳动物胎儿血清(也优选基本不含任何动物血清)并在含有能够激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的生长因子的培养物中培养干细胞，其中所述生长因子的来源不止是成纤维细胞饲养层。虽然生长因子优选是成纤维细胞生长因子，但也可以是其它物质，如设计用来激活成纤维细胞生长因子受体的某些合成的小肽(例如，由重组DNA变体或突变体产生的)。通常可参见T.Yamaguchi等，152 Dev.Biol.75-88(1992)(信号转导受体)。
在本发明的又一方面，提供了培养灵长类胚胎干细胞的培养系统。其中具有不止是成纤维细胞饲养层来源的人碱性成纤维细胞生长因子。该培养系统基本不含动物血清。
本发明的再一方面提供了用上述方法衍生的细胞系(优选克隆细胞系)。“衍生的”以其广义含义使用，包括直接和间接衍生的细胞系。
因此可以避免由于各批次动物血清之间的差异而导致的变化。此外，还发现，在使用成纤维细胞生长因子时避免使用动物血清能够提高克隆率。
因此，本发明的一个优点是提供灵长类胚胎干细胞系的培养条件，该条件的可变性较低并能够更加有效地克隆。通过研究说明书和权利要求书将了解本发明的其它优点。
优选实施方案的详细描述
在以下一些实验中，发明人之一在这里使用本发明的方法和培养系统来培养人ES细胞系，而未在培养基中加入血清。在不含血清成分的培养基中培养时，两个克隆衍生的人ES细胞系在克隆衍生后增殖8个月以上，并且维持了分化成所有三个胚层的高级衍生物的能力。
在下述另一实验中，现在已经证实，即便在不含血清和饲养细胞时，加入相对大量的人成纤维细胞生长因子(FGF)也有助于人胚胎干细胞的培养和生长。这使得可以培养从未接触过动物细胞或接触过已经培养过动物细胞的培养基的干细胞。这些干细胞培养条件(即，无饲养细胞、无调节培养基)在这里被称为不依赖于饲养细胞的。已经描述过的基于使用经饲养细胞调节的培养基的现有培养条件被称为不含饲养细胞的。然而，使用调节培养基未解决对使用饲养细胞的依赖性，仍旧必需用饲养细胞来调节培养基。这里描述的技术能够无限地且不依赖于饲养细胞地培养具有正常核型并维持未分化的人胚胎干细胞。
最初的衍生、培养和表征人ES细胞系H9的技术描述于J.Thomson等，282 Science1145-1147(1998)。可用这种和其它细胞系进行下述实验，但实验过程和结果与特定ES细胞系无关。
这里描述到加入成纤维细胞生长因子(FGF)有助于培养和克隆人ES细胞。加入FGF在两个方面具有重要意义。首先，加入中等水平(例如，4ng/ml)的FGF能够在不含血清的培养基中培养未分化的人ES细胞。与较低水平的FGF相比，在该水平上干细胞的分化速率降低，但细胞最终将分化。其次，加入较高水平的FGF使得培养基的培养条件变得不依赖于饲养细胞，因为无限维持培养物中的整倍体未分化人ES细胞的多能性根本不需要饲养细胞。
第一个现象被认为是FGF与人ES细胞的FGF受体相互作用造成的。为避免使用血清，在培养时使用何种已知FGF变体并不非常重要。通常使用碱性FGF(或称bFGF，也叫做FGF2)，但这只是因为bFGF是FGF因子家族中容易购得的成员之一。已经鉴定了20多种不同的FGF家族成员，它们被称为FGF-1到FGF-27。虽然在这里用bFGF的量表示FGF浓度，但应该理解这旨在量化FGF受体的刺激量，且对于FGF家族的其它成员可上调或下调FGF浓度。对bFGF而言，ES细胞培养基中的优选FGF浓度约为0.1-1000ng/ml，超过约4ng/ml的浓度可有效避免在培养基中使用血清。
令人惊讶的是，发现对于FGF在人ES细胞培养基中的第二个作用，对FGF变体的选择很关键。出于该目的，已经发现bFGF的浓度约为100ng/ml时，该条件足以避免对血清和饲养细胞的需要，使得培养不依赖于饲养细胞。出于该目的，发现FGF家族成员FGF2(bFGF)、FGF4、FGF9、FGF17和FGF18在每毫升培养物100纳克时都足以使得人ES细胞的培养不依赖于饲养细胞。相反，发现FGF家族成员FGF1(酸性FGF)、FGF1β、FGF3、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF10、FGF16、FGF19和FGF20在100ng/ml时不足以支持不依赖于饲养细胞的培养。我们认为，使用这些形式的FGF得到的结果不是浓度造成的，且更高浓度的特定FGF也不能成功支持不依赖于饲养细胞的培养，但目前还没有数据证明。对FGF9而言，我们的数据说明，在该水平(100ng/ml)上FGF9支持人ES细胞的培养，但该数据略微可疑。
此时不能准确知道足以支持人ES细胞不依赖于饲养细胞的FGF有效变体的准确最小量，但可根据经验试验测得。已知对于FGF2，单独在培养基中加入4ng/ml不足以无限维持整倍体未分化人ES细胞的培养，而单独在培养基中加入100ng/mlFGF2就足够了。尽管使ES细胞在含有少至4ng/ml的非调节培养基中生长将在一段时间内维持未分化，并可能传代一次或两次，但细胞最终将分化。在我们看来，当细胞被培养至少6代并维持增殖、未分化、整倍体且同时维持人ES细胞特征性形态时，便可证明该培养基能够以无限维持未分化和整倍体的状态培养ES细胞。文中，FGF的维持浓度(maintenance concentration)是支持维持人ES细胞未分化、整倍体和增殖状态至少6代所必需的FGF浓度。对FGF2而言，最低维持浓度在4ng/ml和100ng/ml之间，可采用以下方法内插那些量来确定精确的最低维持浓度。对于其它各有效FGF，如FGF4、FGF9、FGF17和FGF18，可用类似的测试确定各FGF相应的最低维持浓度。
培养在下面实施例中所述确定的人ES细胞培养基中的人ES细胞可在完全不含成纤维细胞饲养细胞且没有调节培养基时无限培养并维持整倍体。因此该ES细胞的确是不依赖于饲养细胞的。该人ES细胞保留了人ES细胞的所有特征，包括特征形态(小且致密，细胞膜不清晰)、增殖以及分化成人体内的许多(如果不是全部)细胞类型的能力。该人ES细胞还将保留当注射入免疫削弱小鼠时能够形成所有三个原生细胞层的特征。具体地说，该ES细胞保留了分化成外胚层、中胚层和内胚层的能力。该ES细胞仍显示出指示ES细胞状态的标记，如表达与多能性相关的核转录因子Oct4。该人ES细胞在此过程中及结束时保持正常核型。
实施例
在这里描述的第一个实验中，将人ES细胞接种到经过照射(35戈瑞γ射线照射)的小鼠胚胎成纤维细胞上。该实验的培养基由80％“KnockOut”Dulbeco改进的Eagle培养基(DMEM)(Gibco BRX，Rockville，MD)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇和1％非必需氨基酸原液(Gibco BRL，Rockville，MD)构成，补充有20％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)或20％KnockOut SR(一种最初为小鼠ES细胞优化的无血清替代品)(Gibco BRL，Rockville，MD)。KnockOut SR的组成见WO 98/30679中对血清替代品的描述。
在另一个实验中，在培养基中补充血清或上述血清替代品KnockOut SR，并补充或不补充人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，4ng/ml)。培养物中bFGF的优选浓度范围在1ng/ml至500ng/ml之间。
为确定不同培养条件下的克隆率，用0.05％胰蛋白酶/0.25％EDTA处理H-9培养物7分钟以使其分散成单细胞，离心洗涤，并接种到有丝分裂失活(mitoticallyinactivated)的小鼠胚胎成纤维细胞上(6孔板的每个孔中105个ES细胞)。为证实单细胞生长形成了克隆ES细胞系，在立体显微镜下直接观察以选择各个细胞，并用微量移液器转移到96孔板的各孔中，各孔中含有小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞和含有20％血清替代品和4ng/ml bFGF的培养基。
每5-7天用1mg/ml IV型胶原酶(Gibco BRL，Rockville，MD)通过常规传代扩展克隆。衍生6个月后，通过标准G显带技术证实H9细胞具有正常XX核型(分析20条染色体展开物(chromosomal spread))。然而，衍生7个月后，在单核型制品中，16/20的染色体展开物显示出正常的XX核型，但4/20的展开物显示出随机异常(randomabnormality)，其中包括一个13号染色体短臂易位、一个20号染色体反向、一个4号染色体短臂易位、还有一个为多片段化。随后，在衍生8、10和12.75个月后，在检测的所有20个染色体展开物中H9细胞显示出正常核型。
我们观察到，在上述含有动物血清的培养条件下人ES细胞的克隆率低下(无论存在或不存在bFGF)。我们还观察到，在不存在动物血清时克隆率升高，且在含有bFGF时进一步升高。现在已证实，加入FGF通常有助于培养人ES细胞且特别有助于克隆人ES培养物。
下面的数据表示为接种105各种ES细胞后得到的集落总数+/-平均值的标准误差(集落克隆率百分比)。20％胎儿血清和无bFGF的结果为240+/-28。20％血清和bFGF(4ng/ml)的结果大致相同，为260+/-12。无血清(含有20％血清替代品)且无bFGF的结果为633+/-43，而无血清、有bFGF的结果为826+/-61。因此，血清对克隆率有不利影响，而在不含血清时存在bFGF对克隆率有协同作用。
在存在血清时长期培养人ES细胞不需要添加外源提供的bFGF，并且(如上所述)，在含有血清的培养基中加入bFGF不会显著提高人ES细胞的克隆率。然而，在无血清培养基中，bFGF提高了人ES细胞的初始克隆率。
此外还发现，添加外源bFGF对于在不含动物血清时灵长类胚胎干细胞的持续未分化增殖非常重要。在缺乏外源bFGF的无血清培养基中，人ES细胞通常在培养两周后一致地分化。加入其它因子如LIF(不含bFGF)不能防止这种分化。
所得结果特别适用于克隆系。在这个方面，通过直接显微镜观察将单个细胞置入96孔板的孔中，从而选择要扩展的克隆。在接种到96孔板孔中的192个H-9细胞中，成功扩展了2个克隆(H-9.1和H-9.2)。然后在补充有血清替代品和bFGF的培养基中连续培养这两个克隆。
克隆后，H9.1和H9.2细胞即便在连续培养8个多月之后都维持正常的XX核型。H-9.1和H-9.2克隆即便在无血清培养基中长期培养之后还维持形成所有三个胚层衍生物的潜能。培养6个月之后，H9.1和H9.2克隆被证实具有正常核型，然后被注射入SCID-beige小鼠。
H9.1和H9.2细胞都形成含有所有三个胚层衍生物的畸胎瘤，这些衍生物包括肠道上皮(内胚层)；胚肾、横纹肌、平滑肌、骨骼、软骨(中胚层)以及神经组织(外胚层)。将多次传代H9.1和H9.2细胞的畸胎瘤内观察到的分化程度与低传代亲本H9细胞形成的畸胎瘤中观察到的分化程度相当。
从上面的描述可知，尽管动物血清可支持生长，但它是一种复杂的混合物，其中可含有对于人ES细胞培养有益和有害的化合物。此外，不同批次血清支持人ES细胞有力(vigorous)未分化增殖的能力差别巨大。用明确成分代替血清能降低与这种血清批次变化有关的结果可变性，因此应该能够进行更加明确的分化研究。
此外，含血清培养基的克隆率较低说明，通常使用的血清中存在对干细胞(尤其是当细胞分散成单个细胞时)存活有害的化合物。因此迫切需要避免使用这些化合物。
不依赖于饲养细胞的培养
后面的补充研究涉及在含有较高浓度FGF但不存在血清和饲养细胞时培养ES细胞系。该工作中采用三种不同的培养基配方，这些培养基配方在这里被称为UM100、BM+和DHEM。UM100指添加有100ng/ml bFGF的非调节培养基。UM100培养基含有Gibco Knockout血清替代品产品，但不含或不需要使用任何类型的成纤维细胞饲养细胞。BM+培养基是基础培养基(DMEM/F12)加下述添加物，它也能在不含饲养细胞时培养细胞，但该培养基省略了血清替代品产品。最后，DHEM指确定的人胚胎干细胞培养基。下面也将描述的这种培养基足以培养、克隆和无限增殖人ES细胞，它完全由无机成分和人类蛋白质构成，与含有牛白蛋白的BM+培养基相反。
在UM100/BM+/DHEM中培养人ES细胞系H1和H9
UM100培养基制备如下：在由80％(v/v)DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)和20％(v/v)Knockout-血清替代品(Gibco/Invitrogen)构成的非调节培养基(UM)中补充1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma-St.Louis，MO)和1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)。加入100ng/ml bFGF并通过0.22μM尼龙滤器(Nalgene)过滤培养基以完成该培养基。
BM+培养基制备如下：将16.5mg/ml BSA(Sigma)、196μg/ml胰岛素(Sigma)、108μg/ml运铁蛋白(Sigma)、100ng/ml bFGF、1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)和1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)混合在DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)中，并用5M NaCl将重量克分子渗透压浓度调制340mOsm。然后通过0.22μM尼龙滤器(Nalgene)过滤该培养基。
DHEM培养基制备如下：将16.5mg/ml HSA(Sigma)、196μg/ml胰岛素(Sigma)、108μg/ml运铁蛋白(Sigma)、100ng/ml bFGF、1mM谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)、1％非必需氨基酸原液(Gibco/Invitrogen)、补充维生素(Sigma)、痕量矿物质(Cell-gro)和0.014-0.07mg/L硒(Sigma)混合在DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)中，并用5M NaCl将重量克分子渗透压浓度调制340mOsm。注意，培养基中的补充维生素可包括硫胺素(6.6g/L)、还原型谷胱甘肽(2mg/L)和抗坏血酸PO4。同时，用于培养基的痕量矿物质是痕量元素B(Cell-gro，目录号：MT 99-175-C1)和C(Cell-gro，目录号：MT 99-176-C1)的组合；它们各自以1,000X溶液出售。本领域已知痕量元素B和C的组分分别与Cleveland痕量元素I和II相同。(见Cleveland，W.L，Wood，I.Erlanger，B.F.，J.Imm.Methods 56：221-234，1983)。然后通过0.22μM尼龙滤器(Nalgene)过滤该培养基。最后加入无菌的规定脂类(Gibco/Invitrogen)以完成该培养基。
用分散酶(1mg/ml)机械传代之前生长在MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)饲养细胞上的H1或H9人胚胎干细胞，并将细胞接种到基质胶(Becton Dickinson，Bedford，MA)上。每日更换合适的培养基直到测定的细胞密度足以进行细胞传代。然后用分散酶传代细胞并维持在基质胶(Becton Dickinson)上。
生长速率
为确定各种培养基中人ES细胞的生长速率，将细胞以约5×105细胞/孔的密度一式三份接种到6孔组织培养皿(Nalgene)中。在第3、5和7天用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)处理三复孔、分成单个细胞(individualized)并对细胞计数。在第7天，用胰蛋白酶处理其它的孔，计数，并以约2×105细胞/孔的细胞密度再接种新的平板。通过FACS分析对已经用胰蛋白酶处理过的第7天的培养物进行分析以了解ES细胞表面标记Oct4、SSEA4和Tral-60。收集连续3次传代的生长速率。生长速率实验显示，用UM100-培养的人ES细胞与用CM-培养的人ES细胞生长得同样迅猛。
贴壁(Attachment)动力学
为确定各种培养基中人ES细胞的贴壁速率，将细胞以2×105细胞/孔的密度接种到6孔组织培养皿(Nalgene)中。在30分钟-48小时的各时间点上洗去未贴壁的细胞，用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)剥离贴壁细胞并计数。进行这些实验是为了检测UM100生长速率数据是否由于细胞贴壁较好和生长较慢的组合(与UM100和CM的生长速率相同相反)。我们发现，在所有测试时间点这两个培养基的贴壁百分数都是相等的。因此它们以相同速率生长。
人ES细胞的FACS分析
在37℃用胰蛋白酶/EDTA(Gibco/Invitrogen)+2％鸡血清(ICN Biomedicals，Inc.，Aurora，OH)处理6孔组织培养平板(Nalgene)10分钟以除去其上的人ES细胞。将细胞稀释入等体积FACS缓冲液(PBS+2％FBS+0.1％叠氮化钠)并通过80μM细胞过滤器(Nalgene)过滤。1000rpm离心5分钟，收集细胞团并将其重悬于1ml 0.5％低聚甲醛。将人ES细胞在37℃固定10分钟，然后如上所述收集细胞团。将ES细胞重悬于2ml FACS缓冲液并用血球计数板计算总细胞数。如上所述使细胞形成细胞团并在90％甲醇中冰上通透30分钟。如上所述使人ES细胞形成细胞团，将1×105细胞稀释入FACS管(Becton Dickinson)中的1ml FACS缓冲液+0.1％Triton X-100(Sigma)。如上所述使hESC形成细胞团并重悬于50μl用FACS缓冲液+0.1％TritonX-100(Sigma)稀释的第一抗体中。平行处理合适对照抗体的样品。hESC在4℃孵育过夜。倒出上清，细胞用50μl第二抗体(Molecular Probes/Invitrogen)室温避光孵育30分钟。在Facscalibur(Becton Dickinson)细胞分选仪中用CellQuest软件(BectonDickinson)进行FACS分析。用这种方法进行FACS分析能够检测细胞表面标记，因此显示是否得到了ES细胞。观察到的结果是，培养在UM100中的人ES细胞有90％为Oct-4阳性群体。该结果与CM-培养的ES细胞相当，证实该细胞为ES细胞群体。在分析SSEA4和Tral-60时采用和Oct-4一样的方法，但细胞不用低聚甲醛或甲醇处理。细胞染色后，将细胞重悬于FACS缓冲液(无Triton)并如上所述在FACS缓冲液(同样无Triton)中用合适的抗体分析。未分化的ES细胞培养物平均也有90％对这两种细胞表面标记呈阳性。这一点已经通过上述FACS分析加以证实。
结果
现在已经将人ES细胞系H1的细胞在UM100培养基中培养33代以上(164以上的群体倍增)同时保持了人ES细胞的形态和特征。H1细胞在BM+培养基中培养6代以上(70天)同时保持了人ES细胞的形态和特征。H9细胞已经在DHEM培养基中培养5代以上(67天)。H9和H7人ES细胞也都在UM100培养基中以未分化状态分别培养了22代和21代。之后对BM+和UM100-培养的细胞进行测试显示具有正常核型。
FGF形式的研究
H1系的人ES细胞在标准条件下用调节培养基培养3代，然后换成测试培养基。测试条件为，细胞在调节培养基上培养24小时(第0天)，第二天换成测试培养基(第1天)。之后用相应的测试培养基培养细胞。人ES细胞系H9也在调节培养基配制的基质胶上培养5代，然后平行换成测试培养基。
细胞按以下方法传代。使细胞培养物在6孔组织培养平板中生长至合适密度(需要大约7天)，然后在37℃用1ml分散酶(Dipase)(1mg/ml)(Gibco/Invitrogen)处理培养物5-7分钟。然后除去分散酶并换成2ml合适的生长培养基。用5ml移液管从组织培养平板上机械除去细胞，然后通过上下吹打分散细胞。然后用医用离心机1000rpm离心5分钟使细胞形成细胞团。然后将细胞团重悬于适当体积的培养基中并以所需稀释度重新接种。
培养基配方相同，但加入的FGF不同。基础培养基为UM100，根据所需测试条件改变FGF。测试以下FGF变体，分别以100ng/ml加入培养基：FGF1(酸性FGF)、FGF1β(酸性FGF的同种型)、FGF2(碱性FGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20。所有FGF都通过商业购得或由重组宿主中产生。
每次传代后判断特定FGF形式支持人ES细胞培养物的能力。被判定为支持人ES细胞培养物的条件为：在培养时支持培养物以未分化状态适当增殖，不依赖于饲养细胞，可有效传代以及连续表达人ES细胞标记Oct4、SSEA4和Tral-60。被判定为在培养时不支持人ES细胞的条件为：通过形态观察显示培养物中有明显的细胞分化，且细胞在集落传代时无法增殖。支持人ES细胞培养物的FGF变体为FGF2、FGF4、FGF17和FGF18。不支持将人ES细胞维持于未分化状态的FGF变体为FGF1、FGF1β、FGF3、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF10、FGF16、FGF19和FGF20。添加FGF9的培养基的结果起初是边缘值。通过重复该过程发现，以100ng/ml补充FGF9似乎也能支持培养物中未分化的人ES细胞。
目前，补充有FGF4、FGF17和FGF20的培养基已经支持未分化的H1系人ES细胞培养物传代8次。用FGF4、FGF9、FGF17和FGF18对人ES细胞系H9和H14进行类似重复试验发现分别能延长3代和2代。
上面已经根据优选实施方案描述了本发明。该概念的其它形式也包含在权利要求书的范围之内。例如，尽管上述试验采用的是重组制造的人碱性成纤维细胞生长因子，但天然分离的成纤维细胞生长因子也是适用的。此外，这些技术应该也适用于猴或其它灵长类细胞培养物。
因此，权利要求将被视为用来判定本发明的完整范围。
工业应用性
本发明提供了培养灵长类胚胎干细胞的方法以及用于该方法的培养基。

Claims (2)

1.一种细胞培养基，基本不含哺乳动物胎血清，含有氨基酸、维生素、矿物质、运铁蛋白、胰岛素、白蛋白以及简称FGF的成纤维细胞生长因子，所述FGF选自FGF2、FGF4、和FGF17，其浓度至少为能够激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的最低维持浓度，所述最低维持浓度为100ng/ml，所述培养基能够在不含血清、不含饲养细胞且无需使培养基接触饲养细胞的情况下支持H1人胚胎干细胞系的未分化整倍体胚胎干细胞培养和增殖至少6代。
2.一种培养基，含有非调节培养基，由80％(v/v)DMEM/F12和20％(v/v)Knockout-血清替代品构成的非调节培养基(UM)中补充了1mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和1％非必需氨基酸原液，还含有100ng/ml简称FGF的成纤维细胞生长因子，所述FGF选自FGF2、FGF4、和FGF17，所述培养基能够在不含血清、不含饲养细胞且无需使培养基接触饲养细胞的情况下支持H1人胚胎干细胞系的未分化增殖整倍体胚胎干细胞培养和增殖至少6代。
CN200580032533.7A 2004-09-28 2005-09-27 灵长类胚胎干细胞的培养 Active CN101072868B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/952,096 US20050148070A1 (en) 2000-03-09 2004-09-28 Cultivation of primate embryonic stem cells
US10/952,096 2004-09-28
US11/078,737 2005-03-11
US11/078,737 US7439064B2 (en) 2000-03-09 2005-03-11 Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
PCT/US2005/034510 WO2006036925A1 (en) 2004-09-28 2005-09-27 Cultivation of primate embryonic stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101072868A CN101072868A (zh) 2007-11-14
CN101072868B true CN101072868B (zh) 2015-04-15

Family

ID=35759203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200580032533.7A Active CN101072868B (zh) 2004-09-28 2005-09-27 灵长类胚胎干细胞的培养

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7439064B2 (zh)
EP (1) EP1799811B1 (zh)
JP (1) JP2008514230A (zh)
KR (1) KR101437927B1 (zh)
CN (1) CN101072868B (zh)
AU (1) AU2005289597B2 (zh)
CA (1) CA2582566C (zh)
GB (1) GB2433943B (zh)
WO (1) WO2006036925A1 (zh)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7439064B2 (en) * 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US20100173410A1 (en) * 2000-03-09 2010-07-08 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of Primate Embryonic Stem Cells
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
JP2008532550A (ja) * 2005-03-17 2008-08-21 ストラタテック コーポレーション 純度が改良された代用皮膚
WO2006133052A2 (en) * 2005-06-08 2006-12-14 Centocor, Inc. A cellular therapy for ocular degeneration
AU2006285467A1 (en) * 2005-09-02 2007-03-08 Agency For Science, Technology And Research Method of deriving mesenchymal stem cells
US8278104B2 (en) * 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
US8129187B2 (en) * 2005-12-13 2012-03-06 Kyoto University Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2
CN103113463B (zh) * 2005-12-13 2015-02-18 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
US20090227032A1 (en) * 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
WO2007101130A2 (en) * 2006-02-23 2007-09-07 Novocell, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
EP2021462B1 (en) 2006-04-28 2019-01-09 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
GB0613756D0 (en) * 2006-07-12 2006-08-23 Univ Sheffield Cell culture medium
GB2458863B (en) * 2007-01-17 2011-10-12 Wisconsin Alumni Res Found Improved culture of stem cells
FI20075417A0 (fi) * 2007-06-05 2007-06-05 Marjo-Riitta Suuronen Koostumuksia ja menetelmiä alkion kantasolujen kasvatukseen
AT505008B1 (de) 2007-06-06 2008-10-15 Angewandte Biotechnologie Gmbh Verfahren zum kultivieren von sehnenzellen aus nicht embryonalen pluripotenten zellen mesenchymaler herkunft
JP2008307007A (ja) * 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US9213999B2 (en) 2007-06-15 2015-12-15 Kyoto University Providing iPSCs to a customer
KR101732952B1 (ko) 2007-07-01 2017-05-08 라이프스캔, 인코포레이티드 단일 다분화성 줄기 세포 배양
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
CN101861386A (zh) 2007-07-18 2010-10-13 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
ES2665434T3 (es) 2007-07-31 2018-04-25 Lifescan, Inc. Diferenciación de células madre pluripotentes usando células alimentadoras humanas
DK2185693T3 (da) * 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
CN107574142B (zh) * 2007-11-27 2021-07-06 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
CA2715878C (en) 2008-02-21 2017-06-13 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment
US20100087002A1 (en) * 2008-02-21 2010-04-08 Benjamin Fryer Methods, Surface Modified Plates and Compositions for Cell Attachment, Cultivation and Detachment
EP2271770B1 (en) * 2008-03-31 2018-08-22 Genentech, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing asthma
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) * 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
JP5346925B2 (ja) * 2008-05-02 2013-11-20 国立大学法人京都大学 核初期化方法
KR20180018839A (ko) 2008-06-30 2018-02-21 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포의 분화
US20100028307A1 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
US9234178B2 (en) 2008-10-31 2016-01-12 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human pluripotent stem cells
JP2012507289A (ja) 2008-10-31 2012-03-29 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
MX356756B (es) 2008-11-20 2018-06-11 Centocor Ortho Biotech Inc Células madre pluripotentes en microportadores.
EP2366022B1 (en) * 2008-11-20 2016-04-27 Janssen Biotech, Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
CN101580816B (zh) * 2009-04-23 2012-02-29 中国科学院广州生物医药与健康研究院 诱导多能性干细胞快速高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法
JP6219568B2 (ja) 2009-07-20 2017-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の分化
JP5819825B2 (ja) * 2009-07-20 2015-11-24 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の分化
US8785185B2 (en) 2009-07-20 2014-07-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP2488631B1 (en) 2009-10-13 2020-01-08 Stemcell Technologies Inc. Manipulation of osmolality for differentiating stem cells
US9708582B2 (en) * 2009-10-13 2017-07-18 Stemcell Technologies Inc. Method of differentiating stem cells
EP2501802A4 (en) 2009-11-17 2013-08-21 Advanced Cell Tech Inc METHOD FOR PRODUCING HUMAN RPE CELLS AND PHARMACEUTICAL PREPARATIONS FROM HUMAN RPE CELLS
RU2664864C1 (ru) * 2009-12-23 2018-08-23 Янссен Байотек, Инк. Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы
MX343786B (es) * 2009-12-23 2016-11-22 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
JP6013196B2 (ja) * 2010-03-01 2016-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
RU2587634C2 (ru) 2010-05-12 2016-06-20 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
WO2012009377A2 (en) 2010-07-12 2012-01-19 University Of Southern California Biocompatible substrate for facilitating interconnections between stem cells and target tissues and methods for implanting same
BR112013002811A8 (pt) 2010-08-05 2020-01-28 Wisconsin Alumni Res Found meios básicos simplificados para cultura celular pluripotente de humano
US9279107B2 (en) 2010-08-05 2016-03-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
SG10201506264QA (en) 2010-08-12 2015-09-29 Janssen Biotech Inc Treatment of diabetes with pancreatic endocrine precursor cells
KR101851956B1 (ko) 2010-08-31 2018-04-25 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
ES2659393T3 (es) 2010-08-31 2018-03-15 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre embrionarias humanas
ES2585028T3 (es) 2010-08-31 2016-10-03 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre pluripotentes
AU2011343570B2 (en) 2010-12-16 2016-11-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to TH2 inhibition
WO2012105505A1 (ja) * 2011-01-31 2012-08-09 独立行政法人国立国際医療研究センター 多能性幹細胞由来高機能肝細胞とその製造方法及び薬剤代謝毒性試験方法
US8877489B2 (en) 2011-12-05 2014-11-04 California Institute Of Technology Ultrathin parylene-C semipermeable membranes for biomedical applications
US10478206B2 (en) 2011-04-29 2019-11-19 University Of Southern California Instruments and methods for the implantation of cell-seeded substrates
US10238755B2 (en) 2011-11-30 2019-03-26 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for regulation of cell aging, carcinogenesis and reprogramming
US9248013B2 (en) 2011-12-05 2016-02-02 California Institute Of Technology 3-Dimensional parylene scaffold cage
RU2705001C2 (ru) 2011-12-22 2019-11-01 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки
CA2866590A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
JP6469003B2 (ja) 2012-06-08 2019-02-13 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 膵内分泌細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
EP4039798A1 (en) 2012-12-31 2022-08-10 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells
EP2938723B1 (en) 2012-12-31 2023-02-01 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using hb9 regulators
JP6557146B2 (ja) 2012-12-31 2019-08-07 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞膵臓内分泌細胞への分化のための、空気−液体界面での、ヒト胚性幹細胞の培養
JP2016527878A (ja) 2013-06-14 2016-09-15 ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド 腎臓前駆細胞
CA2949056A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Janssen Biotech, Inc. Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells
AU2014277667B2 (en) * 2014-12-15 2022-07-14 The University Of Queensland Differentiation of pluripotent stem cells to form renal organoids
CN113957043A (zh) * 2015-03-04 2022-01-21 迈索布拉斯特国际有限公司 间充质干细胞的细胞培养方法
EP3423158B1 (en) 2016-02-24 2023-11-15 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
CN105794772A (zh) * 2016-05-16 2016-07-27 天津市中奥天元科技发展有限公司 一种无血清细胞冻存液
AU2017335841A1 (en) 2016-09-28 2019-04-04 Organovo, Inc. Use of engineered renal tissues in assays
JP7173007B2 (ja) * 2017-06-27 2022-11-16 味の素株式会社 リボフラビン誘導体含有培地
CN107475188A (zh) * 2017-09-25 2017-12-15 广东颜值科技有限公司 一种细胞培养基和胚胎干细胞的培养方法
WO2019177420A1 (ko) * 2018-03-16 2019-09-19 사회복지법인 삼성생명공익재단 Fgf-17을 유효 성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 증식 촉진 방법
CN112779213A (zh) * 2021-02-04 2021-05-11 河南科技大学 一种犬米色脂肪干细胞体外分离培养方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1416345A (zh) * 2000-03-09 2003-05-07 威斯康星校友研究基金会 灵长类动物胚胎干细胞的无血清培养物

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5612211A (en) * 1990-06-08 1997-03-18 New York University Stimulation, production and culturing of hematopoietic progenitor cells by fibroblast growth factors
US5750376A (en) * 1991-07-08 1998-05-12 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
US5639046A (en) 1992-07-21 1997-06-17 Fabio Perini S.P.A. Machine and method for the formation of coreless logs of web material
US5453357A (en) * 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5690926A (en) * 1992-10-08 1997-11-25 Vanderbilt University Pluripotential embryonic cells and methods of making same
US5405772A (en) * 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US5843780A (en) * 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
AU3392697A (en) 1996-06-14 1998-01-07 Regents Of The University Of California, The (in vitro) derivation and culture of primate pluripotent stem cells and therapeutic uses thereof
JP2001508302A (ja) 1997-01-10 2001-06-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 胚性幹細胞血清置換
US6331406B1 (en) * 1997-03-31 2001-12-18 The John Hopkins University School Of Medicine Human enbryonic germ cell and methods of use
US6800480B1 (en) 1997-10-23 2004-10-05 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
DE19756864C5 (de) 1997-12-19 2014-07-10 Oliver Brüstle Neurale Vorläuferzellen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Therapie von neuralen Defekten
US6667176B1 (en) * 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) * 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
DE60026512D1 (de) 1999-05-07 2006-05-04 Univ Utah Res Found Auf eine zellinie beschränkte vorläuferzellen aus dem neuralrohr der maus und aus embryonalen stammzellen der maus
US7439064B2 (en) * 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
CA2447116A1 (en) * 2001-05-17 2002-11-21 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods for treating liver disease and liver damage with growth hormone and foxm1b
US20030073234A1 (en) * 2001-10-12 2003-04-17 Michal Amit Clonal human embryonic stem cell lines and methods of generating same
US20030232430A1 (en) * 2001-11-26 2003-12-18 Advanced Cell Technology Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells
EP1625213A2 (en) 2003-05-08 2006-02-15 Cellartis AB A method for efficient transfer of human blastocyst-derived stem cells (hbs cells) from a feeder-supported to a feeder-free culture system
EP1749091B1 (en) * 2004-05-21 2013-07-31 Wicell Research Institute, Inc. Feeder independent extended culture of embryonic stem cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1416345A (zh) * 2000-03-09 2003-05-07 威斯康星校友研究基金会 灵长类动物胚胎干细胞的无血清培养物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M Amit et al.Feeder Layer- and Serum-Free Culture of Human Embryonic Stem Cells.《BIOLOGY OF REPRODUCTION》.2003,70(03),837-845. *
富赛里,马政文,尹岚,陆佩华,徐晓明.胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞的分离和培养.《生理学报》.2003,55(03),278-283. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1799811B1 (en) 2020-03-25
AU2005289597A1 (en) 2006-04-06
US20050244962A1 (en) 2005-11-03
EP1799811A1 (en) 2007-06-27
US7439064B2 (en) 2008-10-21
CA2582566A1 (en) 2006-04-06
KR101437927B1 (ko) 2014-09-12
AU2005289597B2 (en) 2011-06-09
KR20070060135A (ko) 2007-06-12
GB2433943B (en) 2010-06-16
GB0707395D0 (en) 2007-05-23
GB2433943A (en) 2007-07-11
WO2006036925A1 (en) 2006-04-06
CA2582566C (en) 2014-09-09
JP2008514230A (ja) 2008-05-08
CN101072868A (zh) 2007-11-14
US20090023208A1 (en) 2009-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101072868B (zh) 灵长类胚胎干细胞的培养
US10968427B2 (en) Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
CN101233226B (zh) 人胚胎干细胞的悬浮培养物
US20050148070A1 (en) Cultivation of primate embryonic stem cells
AU2013230020B2 (en) Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
US20120178160A1 (en) Cultivation Of Primate Embryonic Stem Cells
MX2011005289A (es) Metodos y composiciones para union y cultivo celular sobre sustratos planares.
Moody Feeder-independent culture systems for human pluripotent stem cells
JP6446496B2 (ja) 霊長類胚性幹細胞の培養
Stavish et al. Culturing of human pluripotent stem cells in a mesoderm biased state
JP2009506785A (ja) 胚芽幹細胞の未分化増殖を誘導するオカダ酸含有培地組成物
AU2012203350B2 (en) Suspension culture of human embryonic stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant