CN101124332A - 用于使用内面朝外全细胞构型的自动多通道膜片钳记录的灌注系统和装置 - Google Patents

Abstract

提供一种用于高通量膜片钳测量的系统和方法，来研究各化学制品对离子运输通道的影响。建立一个或多个膜片钳构型，每个包括密接到吸管的细胞。所述吸管被固定到吸管固定装置。所述吸管固定装置和包括一个或多个孔的板可相对移动，从而每个细胞位于孔内。测量所述细胞的电性质。

Description

用于使用内面朝外全细胞构型的自动多通道膜片钳记录的灌注系统和装置

技术领域

本发明涉及一种用于执行膜片钳技术来研究生物膜的多通道系统。更具体地，本发明涉及具有高通量和低体积要求的膜片钳系统。本发明更广泛地涉及测试药物和其它化学制品的电生理效果。本发明还提供一种用于高通量化学制品筛选的装置及其使用方法。

背景技术

通过因载体蛋白和离子通道作用引起的细胞膜电势的变化来控制许多细胞过程。载体蛋白结合特定的溶质，以及通过构象变化来转移其跨过生物细胞膜的脂双层，该构象变化顺序地在膜的一侧露出溶质结合位点，然后在另一侧露出该位点。

与载体蛋白不同，离子通道蛋白是跨膜的蛋白，其在生物膜中形成孔隙，该孔隙允许离子和其它分子从一侧通过到另一侧。有多种离子通道，例如，“渗漏通道”、“电压门控通道”、“配体门控通道”和受到与蛋白例如G蛋白的相互作用的调节的通道。

离子通道蛋白主要调节特定离子的透过性。例如，已鉴定钠(Na⁺)、钾(K⁺)、氯(Cl^-)和钙(Ca²⁺)通道。离子通道主要负责产生细胞膜电势，该细胞膜电势为细胞膜的相对侧的电荷差(B.Alberts等人，同上)。

广泛的多种载体蛋白和离子通道提供用于药物试剂的新靶的富裕聚集。已知许多化学制品、化合物和配体影响载体蛋白和/或离子通道活性。

使用膜片钳分析技术可测量离子通道活性。Neher、Sakmann和Steinback在“The Extracellular Patch Clamp，A Method For ResolvingCurrents Through Individual Open Channels In BiologicalMembranes，”Pflueger Arch.375；219-278，1978，中概述了使用微量吸管电离析一片膜以及研究电压钳状况下该片膜中的通道蛋白的总构思。

膜片钳技术代表生物和医学中的主要发展。例如，该技术允许测量单离子通道蛋白中的离子流，以及允许研究单离子通道对药物的响应。简要地讲，在标准膜片钳技术中，相对细胞膜的表面按压细玻璃吸管(具有直径一般约1μm的末端)。该吸管末端紧紧地与细胞密接，且离析膜的微片中的少许离子通道蛋白。可电测量这些通道的活性(单通道记录)，或可替换地，可破裂膜的片，这允许测量整个细胞膜的通道活性(全细胞记录)。

在单通道记录和全细胞记录中，通过跨膜施加“电压钳”，可进一步分辨各通道子类型的活性。通过使用反馈回路，该“电压钳”施加跨膜的电压梯度，这限制和控制整个通道活性，以及允许分辨离散的通道子类型。

这种实验中的时间分辨率和电压控制是惊人的，通常为毫秒甚至微秒范围。然而，作为药物筛选中的一般方法，膜片钳技术的主要障碍为每日可试验的化合物的有限数量。另外，由于更换样品化合物的缓慢速度以及膜片钳吸管所需要的空间精确度，进一步限制了该标准技术。

限制膜片钳技术通量的主要因素为灌注系统，该灌注系统将溶解的试验化合物导引到细胞和膜片。换言之，用一种溶液灌注(即浸)细胞，并将试验化合物导入该溶液，从而可测量其对该细胞的影响。在常规膜片钳装置中，将细胞置于大实验槽(0.2-2mL孔)，用生理盐水连续地灌注。然后，通过将该槽的入口切换到与小数量的包含一种(多种)化学制品的溶液瓶连接的阀，来施加该化学制品。然而，此技术具有一些缺点。首先，一次可连接的不同化合物的数量受到供料瓶数量的限制。第二，试验样品以及支持流体所需要的体积需要大量昂贵的化学制品。第三，改变细胞和膜片周围的溶质组合物所需要的时间仍然是高的，且这是限速步骤。因此，存在一些尝试来增加膜片钳记录的通量能力。

用于局部应用化合物来激活神经递质调节的通道的精密系统，如U毛细管和其它系统的开发已降低了有效的应用时间。然而，这些快速应用系统所交换的浴溶液的体积是相当大的。这样的大体积要求限制这些处理在医药业的使用，这是因为试验不同浓度的数万种化学制品需要大量的时间和高成本试剂。这些现有技术的系统进一步受到灌注U毛细管的进给系统的不灵活性以及低容量的限制，该进给系统实际上与常规膜片钳试验所使用的系统相同。

Weaver等人(“Weaver”)的于2001年7月6日提交的美国申请No.09/900,627公开了一种可测量细胞的电性质的系统。Weaver的系统不使用吸管末端附着到细胞膜。而是，多孔隙表面上的多个孔隙与多个细胞膜连接并密接。多孔隙表面的一侧耦合到地电极，同时另一侧耦合到测量电极。在多孔隙表面是微芯片的一实施方案中，每个细胞可附着到其自己的地和测量电极，这允许特定的细胞测量。当将试验溶液施加给多孔隙表面的一侧或多侧时，可对所附着的细胞测量膜片钳记录。该系统可自动化，从而在多孔板上同时测试多个多孔隙表面。

Norwood等人(“Norwood”)的于2001年3月21日提交的美国专利申请No.10/239,046(公布No.US2003/0139336A1)提供了一种自动化系统，该系统用于建立膜片钳构型。Norwood的系统限制于将膜片吸管与一细胞连接，该细胞位于悬浮的液体例如从毛细管的底部悬浮的液滴的液体空气交界面处。增加(或降低)管内的压强引起弯面(液体空气交界面)向外(或向内)凸出。在Norwood的系统中，在细胞被封接之前，该细胞位于膜片吸管的外面。此外，对第二管施加气压系统，该第二管支持和悬浮细胞液体；不对膜片吸管本身施加气压。

Olesen等人(共同地，“Olesen”)的美国专利No.6,063,260、No.6,117,291和No.6,470,226公开了一种高通量膜片钳系统，其中计算机化的电动机控制系统引起膜片吸管自动封接从细胞浴中选择的细胞。然后，对于膜片钳测量，该吸管的末端和细胞在灌注槽中保持固定。自动取样器控制一阀，可替换地，该阀将来自多种源的流体引导入灌注槽，其包括一种或多种试验化学溶液和冲洗液。因此。在Olesen的系统中，多个管和泵用于将试验化合物和冲洗浴液抽入和抽出灌注槽。

Farb等人(“Farb”)的美国专利No.6,048,722公开了一种自动膜片钳灌注系统，其用多种试验和冲洗溶液灌注封接的细胞。试验和冲洗溶液通过多筒的总管从多个容器中注入进记录槽中，其容纳膜片细胞。阀控制在给定时间中由哪一种溶液灌注细胞。如在Olesen系统中，Farb系统涉及许多管和泵将试验化合物和冲洗浴液抽入和抽出记录槽。

Weaver、Norwood、Olesen和Farb的公开全部合并于此以作参考。

需要用于高通量筛选的更快、更便宜的方法。这样的高通量筛选对于寻找和鉴别调节离子通道活性的试剂是非常重要的。再者，这样的试剂对治疗多种疾病将是有用的。

发明内容

根据本发明的一实施方案，提供一种用于高通量膜片钳测量的系统和方法，来研究各化学制品对离子运输通道的影响。建立一个或多个膜片钳构型，每个包括密接到吸管的细胞。所述吸管被固定到吸管固定装置。所述吸管固定装置和包括一个或多个孔的板可相对移动，从而每个细胞在一孔内。测量所述细胞的电性质。

根据本发明的另一实施方案，提供一种计算机可读介质，其用计算机程序代码编码以自动化膜片钳测量系统。所述程序代码有效执行下列步骤。将一个或多个细胞装入一个或多个吸管的一个或多个末端。将所述一个或多个吸管附接到吸管固定装置。使所述吸管固定装置和包括一个或多个孔的板相对移动，从而一个或多个细胞的每个分别在一个或多个第一孔的每个内。测量所述一个或多个细胞的每个的至少一种电性质。

根据本发明的另一实施方案，提供一种测量膜的性质的装置。吸管固定装置耦合到一个或多个吸管，其中每个吸管适合于在每个吸管末端在膜片钳构型中提供与膜的高电阻密接。电动平台包括一个或多个多孔板。电动机控制器被构造成使所述电动平台和所述吸管固定装置相对移动，从而所述一个或多个吸管的每个末端在所述一个或多个孔内。

本发明提供一种用于多通道膜片钳的系统，以及使用所述系统进行对化学物质例如药物化合物的筛选。具体地，所述系统可用于加速化学化合物在离子通道运输上的效果的研究。

本发明的一个实施方案提供对全细胞的离子通道的细胞内区域的试验。本发明的另一实施方案提供全细胞构型，其稳定性足以实现对单细胞进行多次试验。本发明的另一实施方案提供具有高扩散特征的全细胞构型，其能够实现对细胞快速地冲洗掉药物化合物，这加速离子通道的筛选过程。

本发明的一个实施方案可用于进行单细胞测量和记录。本发明的另一实施方案可用于自动化的膜片钳记录，其中多个单细胞附着到多个电极。根据此实施方案，使膜片钳自动化降低了与手动操纵和波形分析有关的错误。根据此实施方案，使多个膜片钳自动化增加了膜片钳实验的速度和通量。具体地，自动化实现对试剂应用(例如，化学制品、化合物或配体的添加)的精确定时，以及通过降低疏忽造成的错误、不同研究者之间实验方案中特殊变化以及由手动操纵引起的噪声，而改善了试验数据的质量。由于增加了试验的效率和速度，自动化允许对大化学制品库的大量的平行筛选。这对于筛选影响离子通道活性以及因此影响细胞电性质(例如，细胞膜状况)的试剂是特别有利的。

本发明的另一实施方案补充了现有的技术以及简化了现有的处理程序，以降低自动化膜片钳的成本。

在本发明的另一实施方案中，提供一种执行高通量膜片钳测量的装置。所述装置包括用于执行膜片钳测量的常规电子装置，包括：前置装置、主放大器和电极；多通道吸管固定装置，其用于在膜片钳测量期间保持一个或多个吸管；吸管保持器，其用于沿垂直方向保持一个或多个吸管；平台，其用于支持所述吸管保持器和一个或多个多孔化合物板，所述化合物板包括试验化合物；气压控制系统，其能够使细胞移动到吸管的末端；XYZ导螺杆自动机，其用于沿x、y和z方向控制所述平台、所述一种(多种)化合物板和所述一个(多个)吸管保持器的移动；以及数据获取和控制系统，其用于获取数据、控制自动机的移动以及调节气压。由于自动化操纵设备和自动机在商业上可获得，因此此装置是尤其有利的。例如，这样的自动机系统为可从Velmex，Inc.获得的BiSlide XYZ。

本发明的另一实施方案提供一种用于从细胞除去试验化合物的流体冲洗系统，包括：一个或多个圆柱或锥形的槽，其能够用液体灌注；和连接到所述一个(多个)槽的泵，所述泵能够用液体灌注所述一个(多个)槽。可选地，所述流体冲洗系统包括用于引导液体的流动的内叶片。

在本发明的另一实施方案中，提供一种执行膜片钳测量的方法。所述方法包括：通过将至少一个细胞置于至少一个吸管的末端内、然后将所述细胞暴露到周围的空气，来产生内面朝外全细胞膜片钳构型；布置包括一系列试验化合物的化合物板，使其与第一行吸管接合；当所述一个(多个)细胞与所述试验化合物接触时，进行对其的膜片钳测量；使所述化合物板脱离所述吸管固定装置；进行冲洗步骤；布置所述化合物板，使其与第二行吸管接合；当所述一个(多个)细胞与所述试验化合物接触时，进行对其的膜片钳测量；以及按需要多次重复所述冲洗和测量步骤，其中在每个重复期间，将所述相同的化合物板或不同的化合物板与一行吸管接合。

本发明的另一实施方案集中在一种执行高通量膜片钳测量的方法，包括：将细胞装入吸管，其中所述吸管包括电极；将所述吸管置于吸管保持器中，所述吸管保持器位于可移动的平台上，其中所述平台能够支持一个或多个化合物板和/或流体冲洗系统；相对吸管固定装置移动所述平台，其中所述吸管固定装置连接到气压控制系统，以及其中布置所述吸管以连接到所述吸管固定装置；相对所述吸管固定装置移动所述平台，其中将所述吸管脱离所述吸管保持器，以及其中所述吸管稳固地附接到所述吸管固定装置；相对所述吸管固定装置移动所述平台，其中所述吸管的末端与所述化合物板接触，所述化合物板包括多个孔，其包含第一组试验化合物；使用所述气压控制系统将所述细胞置于所述吸管的末端，其中所述细胞接触所述电极和所述第一试验化合物；以及测量与所述第一试验化合物接触的所述细胞的电活性。

在所述执行高通量膜片钳测量的方法的可选实施方案中，在测量与所述第一组化合物接触的所述细胞的电活性之后，再次相对移动所述板和固定装置，从而将所述吸管从所述第一组孔移走，然后插入相同板上的第二组孔。将所述细胞再次移走以及重新插入新的一组孔，以及多次重复所述移走和插入过程。冲洗系统和所述固定装置可相对移动，从而将所述细胞插入所述冲洗系统，以及通过使冲洗流体在所述细胞上通过，所述冲洗系统可冲洗所述细胞。在每个细胞测量之前或之后或在其它时间，可冲洗所述细胞。

本发明的前述和其它目的、优点和特征，通过结合附图、下面描述的所考虑的其的一些示例性实施方案而变得显而易见，其中在各附图中，相同的标号表示相同的元件。

附图说明

图1示出示例性多通道膜片钳系统的俯视图；

图2示出图1的多通道吸管系统的前视图；

图3示出示例性的XYZ导螺杆自动机；

图4A-4C示出示例性吸管固定装置的子组件；

图5A-5D示出示例性吸管保持器的子组件；

图6示出示例性板；

图7示出示例性气压控制系统；

图8示出示例性吸管冲洗槽；

图9示出一流程图，该流程图示出执行膜片钳测量的示例性方法；

图10A-10C示出将细胞布置成内面朝外构型的示例性过程；

图11示出“内面朝外”全细胞膜片钳的示例性等效电路；

图12示出示例性内面朝外膜片钳构型的钾电流的曲线图，其示出4-AP和冲洗的效果；

图13示出示例性内面朝外膜片钳构型的稳定的峰电流幅度；

图14示出具有试验化合物的示例性内面朝外膜片钳构型的外向钾电流；

图15示出示例性内面朝外膜片钳构型的钾电流幅度行为与所施加的膜电压的关系；

图16示出具有化学制品4-AP的示例性内面朝外膜片钳构型的钾电流行为；

图17示出示例性内面朝外膜片钳构型的钾电流幅度时间图。

具体实施方式

本发明的主题涉及于2004年5月3日提交的、名为“Fast PerfusionSystem and Patch Clamp Technique Utilizing An Interface ChamberSystem Having High Throughput And Low Volume Requirements”的美国申请Attorney Docket No.38523.000061。该申请在此引用作为参考。

图1-10示出本发明的优选实施方案。平台1用于保持一个或多个多孔化合物板3、吸管保持器7和可选的流体冲洗系统21。对吸管40预装入要试验的细胞30。吸管保持器7可用于贮存具有预装入的细胞30的吸管40。可选地，处理区49可用于收集使用过的和抛弃的吸管40。吸管固定装置5包括固定连接件17，该吸管固定装置5构造成在膜片钳期间，稳固和悬置吸管40。台6可用于保持前置电子装置18和固定连接件17。气压控制系统70可用于推和拉细胞30和/或操纵吸管40。为冲洗每个孔3A行间的吸管40的末端，可使用分离的流体系统21来去除化合物。自动机23可用于控制平台1、96-孔板3和/或吸管固定装置5的移动。数据获取和控制系统25可用于获取数据、控制自动机23的移动以及调节气压。

图1示出根据本发明的实施方案的多通道膜片钳系统的俯视图。该系统包括XYZ自动机23、电动机驱动的平台1、用于贮存吸管的吸管保持器7、包括一个或多个容器3A的孔板3、用于用过的吸管的处理区49、包括固定连接件17的吸管固定装置5和前置电子装置18。法拉第筒20围绕和封闭该膜片钳系统。

优选，可移动的平台1足够大以容纳一个或多个多孔化合物板3、一个或多个吸管保持器7和流体冲洗系统21。(图6示出平台1的等角图)。优选，平台1为电动机驱动，以及更优选地，由使用步进电动机的3轴导螺杆自动机23(见图3)驱动。如图1所示，平台1可栓接到安装在导螺杆上的托架。3轴导螺杆自动机23可从商业上可获得，且可从Velmex，Inc购买。

可移动的平台1耦合到一个(多个)孔板3和一个(多个)预装载的吸管保持器7。例如，孔板3和吸管保持器7可以为置于和/或固定到可移动平台1上的平台。平台1沿x-、y-和z-方向可移动。因此，平台1可上、下、左、右移动、沿任何方向斜向移动或沿任何非线形3维路径移动。平台1被构造成移动孔板3和吸管保持器7。例如，其可将吸管保持器7和孔板3(在不同时间)移动到正好在吸管固定装置5之下的位置。

优选，一个或多个多孔板3的每个包括一个或多个孔3A。如本文使用的，术语“孔”指的是能够容纳小体积液体的任何表面。这包括容器和凹进结构，以及平的表面，其中小体积的液体形成不同的液滴，通过该液体的表面张力保持在一起。孔板3可以具有高密度的浅孔3A，例如48到384孔板，其中浅孔3A在孔板3上沿行和/或列，如以8×12矩阵构型排列。例如，板3可包括48(6×8)或96(8×12)孔形式的化合物板。这样的布置用于自动化对孔3A的充注，以及使吸管40的末端接触孔3A中的液体。优选，每个化合物板上的高密度的孔3A降低了试验期间所需要的试验化学制品或化合物的量，以及加快在孔之间的移动。

孔3A被构造成容纳一种或多种试验物质、中性溶液或冲洗溶液。该试验物质可包括药物或其它化学制品。优选，该试验物质包括对膜的离子通道有影响的化学制品。该中性溶液可包括任何惰性液体，例如惰性水溶液或盐溶液。优选，该中性溶液与细胞和细胞膜不起化学反应或不干扰其。该冲洗溶液可包括，例如可通过冲洗掉试验物质来冲洗细胞的任何溶液。

优选，每个孔3A可以容纳的液体的最小体积(例如试验溶液的体积)为约10μL，且容纳的液体的最大体积为约10mL。这些体积与进行准确的膜片钳测量所需要的试验溶液的体积相应。孔3A可容纳的最小的体积可以为10μL、20μL、30μL、50μL和80μL。可容纳的最大体积为0.5mL、1mL、2mL和5mL。该试验溶液的体积可以是这些最小和最大值的任何组合；例如体积可以在30μL和0.5mL间、或50μL和5mL间。更优选，体积为20μL和1mL间。例如，可以具有96孔板，其中的每个孔被设计成容纳0.3-0.35mL溶液。孔3A还可包括诸如盐溶液的中性溶液。例如，一些孔3A(或孔行)可包括一种或多种不同浓度的试验物质，而相同或不同板上的其它孔(或孔行)可包括中性溶液或冲洗液。

吸管保持器7可包括任何用于保持和/或贮存一个或多个吸管的装置。吸管保持器7可包括多个保持机构7A，例如环形开口，其尺寸和形状使得吸管可插入开口7A以及由开口7A的壁保持在位。例如，吸管可具有吸管末端，该吸管末端比开口7A窄，以及吸管的中央部分可比开口7A宽。当吸管插入吸管保持器7时，吸管末端可适合通过孔，但该吸管的较宽部分可与开口7A耦合，以及引起该吸管由开口7A保持在位。因此，在膜片钳测量之前(之后)，吸管保持器7可保持一个或多个吸管。

吸管保持器7被固定到可移动的平台1。通过移动平台1，可移动由吸管保持器7保持的吸管。例如，可通过可移动的平台1来移动预装载的吸管，从而可将其固定到吸管固定装置5(见图4B)。

吸管固定装置5也被构造成保持吸管，尽管优选地，其不耦合到可移动的平台1。通过移动平台1(以及因此移动吸管保持器7)，由吸管保持器7保持的吸管可转移到吸管固定装置5，从而由吸管保持器7保持的吸管正好在吸管固定装置1之下。然后，吸管保持器7可向上向着固定装置5移动，从而吸管附接到固定装置5。例如，吸管可插入该固定装置，其中该固定装置被构造成固定该吸管。然后可降低吸管保持器7，该吸管保持器7不再与吸管耦合。在一个实施方案中，在吸管耦合到吸管固定装置5之后，吸管保持器7松开其对该吸管的握持。

通过使用可移动的平台1将孔板3向上向着吸管固定装置5移动，吸管末端中的细胞可有效地插入孔3A中的试验物质(或冲洗流体)。在此位置，使用电极和前置电子装置18可进行膜片钳测量，下面对其进行解释。

根据本发明，所公开的装置使用常规的电子装置进行膜片钳测量，该常规的电子装置包括前置装置、HEKA EPC9/2膜片钳放大器、和/或任何其它商业可获得或本地制造的一(多)放大器和一个或多个电极。优选，本发明的装置使用被设计成处理多通道数据以及帮助同时记录的放大器。对于每个放大器，可获得电流、电压、电阻、电容和其它电记录。可应用数据过滤和模拟到数字处理，以及可以将数据存储在计算机，例如数据获取和控制系统25上。

前置电子装置18被构造成控制膜片钳测量的电子装置。这样的电子装置在本领域中是公知的。例如，前置电子装置18可包括HEKA EPC92通道放大器。前置电子装置18可与主放大器和一个或多个电极结合使用。例如，如在膜片钳测量中，电子装置18可测量通过与电子装置18连接的一个或多个电极的电压和/或电流。在这样的膜片钳测量中，使用分离的电极(优选为线)作为参考电极，以及使用另一电极作为测量电极。连接件17将前置电子装置18连接到电极，连接到数据获取和控制系统25，以及从参考电极连接到前置装置。

数据获取和控制系统25可包括处理器、数据库和/或计算机。数据获取和控制系统25优选地通过线耦合到前置电子装置18。数据获取和控制系统25还可(例如，通过线和其它电子控制机构)耦合到气压控制系统70、自动机23和平台1。

数据获取和控制系统25控制自动机23的移动、膜片钳电子和信号捕获以及气压控制。例如，例如visual basic 6.0界面的程序(或另外的程序)可用于调整Velmex’s XYZ-3D平台软件25、HEKA’s Pulse软件以及进入和来自气压控制系统70的信号。该软件控制部件1、70、23以及该系统中的任何其它电子部件的操作。例如，该软件可控制用于进行膜片钳测量的电极的测量功能。用于控制和监测自动化的细胞电生理装置的计算机软件已详细地描述以及在本领域中公知(见，例如，Farb等人的美国专利No.6,048,722)。

优选，该软件或自动例程通过屏上界面集成试验化学制品或化合物的运输、仪器控制、数据获取和波形分析。例如，用户使用传统的计算机输入，例如鼠标、键盘、控制杆或其它输入设备，可面对和/或控制图1的膜片钳系统的操作。以这种方式，通过使用鼠标(或其它输入设备)来调整仪器控制，可通过屏上界面来控制膜片钳记录期间的所有方面。例如，可开发自动协议来用单键按压启动和执行剂量响应、反向电势、调制器效果以及重复应用实验。另外，波形分析例程可自动测量例如响应幅度、开始时间和脱敏时间常数的参数，然后将此信息直接存储到盘、例如耦合到数据获取和控制系统25的盘。

法拉第筒20围绕膜片钳系统(见图2)。法拉第筒20消除筒内不需要的电场，例如由筒外的源另外引起的那些不需要的电场。这是有利的，因为膜片钳测量需要高灵敏的电子测量，而此高灵敏的电子测量会受到不需要的电场的损害。因此，法拉第筒20封闭膜片钳测量部件(例如吸管、细胞和电极)，并将其与数据获取和控制系统25与可引起对膜片钳测量的不需要的电干扰的其它电部件和布线隔离开。

处理区49为这样的区域，在该区域中，可存储进行膜片钳测量之后用过的吸管。例如，当将吸管固定到吸管固定装置5时，通过对该吸管40施加高压脉冲，可将该吸管从固定装置5放出到处理区49。例如，若吸管固定装置5松开其对吸管的连接，或换句话说与吸管分开，那么该吸管也可简单地落入处理区49。可考虑其它将一个或多个吸管或其它物体从一地方转移到另一地方的方法。

图2示出图1的多通道吸管系统的前右视图。图2示出支撑台6、气压控制系统70、数据获取和控制系统25、XYZ自动机23、可移动的平台1、一个或多个孔板3、吸管保持器7和法拉第筒20。

支撑台6可支撑前置电子装置18和/或吸管固定装置5(未示出)。支撑台6可包括任何本领域公知的支撑台。优选，支撑台6为静止的。然而，在一个实施方案中，支撑台为可以移动吸管固定装置5的可移动设备。例如，支撑台6可引起吸管固定装置移动到处理区49之上的位置，从而吸管可从吸管固定装置5落入处理区49。

气压控制系统70被构造成控制每个吸管内的气压。通过对吸管内施加气压，气压控制系统70可引起吸管内的细胞向吸管的末端移动，在图10进一步进行描述。

图3更详细地示出自动机23的示例性实施方案。如该图中所示，自动机23包括由PC通过RS232通信协议控制的来自Velmex的3轴电动(通过步进电动机)平台。有机玻璃板包括48(或96等)孔板，其耦合到Velmex3轴平台。优选地，自动机23控制该平台的移动，以及因此控制一个(多个)孔板3、一个(多个)吸管保持器7和或流体冲洗系统21的移动。如上所述，自动机23的移动可受数据获取和控制系统25的控制。

图4A-4C示出根据本发明的实施方案的吸管固定装置5。优选，吸管固定装置5包括固定连接件17，其可用于在膜片钳期间稳固和悬置吸管40。因此，可将吸管固定装置5附接到吸管40(或可选的，吸管40可与吸管固定装置5连接)。吸管固定装置5可在不变且基本垂直的位置保持吸管40。吸管固定装置5还可用于连接气压控制系统70和参考电极45。

注意，对于电流系统中的每个通道，可具有两个电极：在膜片吸管外的电极(浴液和/或参考电极45)和在膜片吸管内的电极4。两个电极4、45都可耦合到相同的放大器。该放大器可测量这两电极4、45间的电流和/或电压。该测量信息可用于测量细胞膜的特性。进一步应注意，吸管可以为玻璃吸管、膜片吸管或微电极，这依赖于其形状和电阻。

图4A示出吸管固定装置5的俯视图。吸管固定装置5包括多个容纳一个或多个吸管40的开口51。较小的开口52接近每个大的开口51，该较小的开口52可容纳参考电极45(例如浴液电极)，其可用于执行膜片钳测量。支撑孔53可用于例如使用螺杆或其它耦合装置来稳固该固定装置。

图4B示出由吸管固定装置5保持在一不变垂直方向的参考电极45和八个吸管40的截面侧视图。通过保持器57的侧端来对吸管中施加气压。

吸管40可包括任何管状装置，或形状为管状和/或圆柱形的装置的任何部分。吸管40在一或两端为中空的。例如，吸管40可为任何毛细管，例如微量吸管。该吸管包括吸管末端40A。优选，末端40A界定大致环形形状的开口。吸管40的末端可具有允许其附接到细胞30或细胞膜30A的尺寸和形状(见图10A-10C)，该细胞例如为哺乳动物细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或其它细胞。例如，末端10A的开口可具有约0.1到10微米的直径。优选，末端10A的开口具有约1微米的直径。当吸管40与细胞30附接时，有时将其称作膜片吸管。如本文所使用的，术语“膜片吸管”指的是膜片钳技术中所使用的与细胞30附接的任何管。

优选，吸管40可由这样的任何非传导材料制成：其紧紧密接生物膜，具有有利于膜片钳测量的介电性质，以及对于广泛范围的化学制品是基本惰性的。更优选，吸管40可由玻璃和/或塑料(聚苯乙烯)制成。

在本发明的一个实施方案中，聚氨酯管置于倒钩连接件和倒钩丁字接头之间，其可用于将吸管40保持在位，以及维持对气压控制系统70的气密连接。吸管固定装置5可在沿每个吸管40轴的多个点，与吸管40接合并固定其，以将每个吸管40保持在位。每个吸管40的末端可延伸超过吸管固定装置5的表面，从而露出吸管40的末端，以对于膜片钳测量和细胞冲洗，容易接近细胞30。

对于膜片钳测量，吸管40的基本垂直的位置帮助将细胞30稳定在吸管40的末端。不变的位置帮助维持细胞30和吸管末端40A间的千兆欧密接。此外，一般，细胞30比吸管40内的流体41浓密，因此吸管的垂直位置帮助将细胞保持在吸管40的底末端40A。

图4C示出耦合到吸管固定装置5的(图4B的)单个吸管40的截面侧视图。如图4C所示，每个吸管可由聚氨酯(或其它聚合物或相似材料)管54保持在位。例如，当电动平台1引起吸管固定装置5耦合到吸管40时，吸管40可耦合到吸管固定装置5。例如，吸管固定装置5可从吸管保持器7“夺取”吸管40。在“夺取”每个吸管(和/或同时“夺取”一组吸管40)时，吸管40可插入吸管固定装置5的图4C所示的位置。如图4C所示，吸管可通过吸管固定装置5的孔、通过固定到吸管固定装置5的底部塑料固定装置59、以及向上通过管54，垂直延伸。吸管40的上部末端40B可停留在底部塑料固定装置59和上部塑料固定装置55之间。因此，吸管40可由吸管固定装置5、塑料固定装置59和管54保持在位。上部末端40B可以是开口的，从而空气可通过末端40B进入和离开吸管。

应理解，管54和图4C所示的一些其它元件形状可为圆柱形或另外的环形，尽管此截面侧视图未示出环形形状。例如，管54可包括一单件圆柱管，其在该图的页面上和下延伸，且该管54可界定一腔，该腔可容纳吸管40的一部分、塑料固定装置56，以及可流入和流出吸管40的空气。

上部塑料固定装置55可包括倒钩“t”形状。面向下的部分可包括倒钩塑料固定装置56，其沿吸管40的方向延伸。面向上的部分可包括固体部分55A，该固体部分允许电极4通过(例如，到DAS 25)，但产生围绕电极4的气密密封，以及防止空气进入或逃离塑料固定装置55。水平部分可包括另一倒钩塑料固定装置56，其耦合到柔性管58(和由其围绕)。柔性管58、上部塑料固定装置55和柔性管56一起可包括气密通道，该气密通道用于在压力控制器73和吸管40间行进的空气(和气压变化)。

聚氨酯管54可连接塑料固定装置56。塑料固定装置56可包括倒钩配件，以帮助确保管54和塑料固定装置56间的气密密封，其可帮助防止外面的空气进入吸管40。对于给定的吸管40，管54(如图4B和4C所示)可自与吸管40耦合的一塑料固定装置59垂直延伸到位于吸管的顶边缘40B之上的另一塑料固定装置55。塑料固定装置59可耦合到吸管固定装置5。

吸管40可压配进入在塑料固定装置56间的聚合物管54(其可以顺从)。吸管40可迫使管54沿该吸管的外壁膨胀然后收缩，例如当该吸管首次插入图4B所示的位置时。

另一组管58(或可以为相同的管54)可连接到压力控制器73(见图7)。管54、58和塑料固定装置可包括压力控制器73(未示出)和吸管40内之间的连续的气密连接。换言之，该管可提供在压力控制器73和吸管40之间的不阻塞、连续的空气通道。每个吸管40可具有连接到压力控制器73的分离的管系统58。以这种方式，可单独地产生和监测每个吸管的千兆欧密接。在其它实施方案中，多个吸管40可共享一连接。

优选，每个吸管40包括电极4(也参见图10A-C)。电极4可在吸管40的内部，以及其可连接到电子放大器。如本文所使用的，术语“电极”指的是物理发送器或导体，其可将来自吸管溶液的电信号送到放大器。当电极4在吸管40内以及接触毛细管溶液41时，吸管40为膜片电极(patchelectrode)。如本文所使用的，术语“膜片电极”指的是还包括电极4的膜片吸管，其都附接到细胞(未示出)。因此，对于本发明的目的，术语“膜片电极”和“毛细管电极”可互换。

电极4可连接到设备(例如，膜片钳放大器)，该设备测量电极4和另一参考例如参考或浴液电极45间的电流和/或电压。在一些实施方案中，一个或多个电极4、45可包括微电极。如本文所使用的，术语“微电极”指的是具有适当尺寸的用于记录来自各细胞30的信号的膜片电极。优选，膜片电极4的末端可接触细胞(或与细胞接触的溶液41)，以在膜片钳构型中能够测量细胞30的电性质。如本文所用的，术语“膜片钳”指的是膜片电极的构型，其允许通过将膜片电极布置成与细胞膜30A的小区域接触，来记录自生物膜的信号。该膜片钳可以为“全细胞膜片钳”(见图10A-C)，其指的是这样的膜片电极构型：允许通过将膜片电极4布置成与细胞膜30A的小区域接触，然后使膜30A的此小区域(膜片)破裂，来记录来自细胞30的整个膜的信号。一般，当将细胞置于吸管40内以及通过暴露到空气而使膜的膜片破裂时，上述可实现为“内面朝外的全细胞”。

如图4B和4C所示，在吸管40内的膜片电极4的端部可具有卷曲。在一些实施方案中，当向上推吸管40通过固定装置5、以及进入产生密封的柔性管54时，卷曲可避免连结和干扰问题。

图5A-5D示出吸管保持器7的示例性实施方案。图5A示出吸管保持器7的俯视图，以及图5B示出吸管保持器7的侧视图。

吸管保持器7可包括具有一个或多个孔、槽或耦合装置的任何表面，该耦合装置允许将吸管40固定在其上或贮存在其中。例如，吸管40可插入吸管保持器7中的孔，从而该吸管40可在垂直或基本垂直位置置于吸管保持器7中，其中吸管保持器7在水平面为大体平的表面。吸管40的末端可伸出吸管保持器的底侧，以及吸管40的其余部分可伸出到吸管保持器7的表面之上(见图5A-D)。

吸管保持器7可包括多个开口71，以在吸管40装入吸管固定装置5之前容纳预装载的吸管40。接近每个大开口71的较小的开口72可容纳参考电极45。优选，吸管保持器7具有多行开口71，其用于保持多组预装载的吸管40。例如，一组吸管可容纳给定尺寸、年龄、测量历史、类型、温度、浴溶液或其它相似特征的细胞。吸管保持器7还可包括支撑腿702，其可支撑吸管保持器7，并保持保持器7距地(或其它表面)足够的距离，从而当吸管40布置在吸管保持器7中时，该保持器中的该吸管40不接触地。

在本发明的优选实施方案中，吸管保持器7将预装载的吸管40保持在基本垂直的方向，从而吸管固定装置5可容易地与吸管40接合。当自动机23将吸管40移动到吸管固定装置5下面的位置，然后升高吸管保持器7时，可将吸管保持器7中的预装载吸管40装入吸管固定装置5，从而吸管40由吸管固定装置5固定。

图5C和5D示出使用吸管保持器5将吸管40保持在位的两种不同的方法，该吸管保持器可在建立膜片钳构型之前和/或在执行膜片钳测量之前，将一个(多个)吸管40保持在位。

图5C示出一种方法，其使用锥形孔穴或插入以保持悬置在平台1之上的吸管40(见图1)。吸管40可插入锥形孔穴701。孔穴40可具有的宽度使得吸管40在不接触孔穴701的内表面，即吸管保持器7的内表面的情况下，不能通过该孔穴。由于孔穴701和吸管40之间的摩擦，吸管保持器7可有效握持吸管40，以及防止其在保持器7中垂直移动。保持器7还一定程度地防止吸管的侧向移动。

图4D示出另一种方法，其可使用弹性可变形的聚合物O环将吸管40保持在位。这里，吸管保持器7可包括上支撑件704和下支撑件705，以及致动器703，其控制支撑件704、705的移动。吸管40通过上支撑件704中的孔穴以及下支撑件705中的另一相应孔穴插入。在图4D所示的时间，吸管40不必牢固地保持在位。即，吸管40可松松地装配在上支撑件704和下支撑件705内。具体地，吸管40可不接触分别耦合到上支撑件704和下支撑件705的上O环706和下O环707。即，O环的内径708可大于吸管40的直径。因此，为了在此时间将吸管40保持在位，人或其它保持装置可保持吸管40，或防止吸管40通过支撑件704、705中的孔穴滑动。可替换地，该孔穴可具有足够小的尺寸，使得孔穴表面和吸管40之间的摩擦可防止吸管40垂直移动。

当吸管40在图4D所示的位置时，致动器703可引起上支撑件704和下支撑件705彼此相向移动。致动器703可以为电动机驱动或气动驱动的。当支撑件704、705被置于一起(未示出)时，上O环706和下O环707可彼此接触并压缩。压缩O环可引起每个O环的内径708减少(例如，O环可变平)。移动两支撑件704、705彼此更接近可导致O环的额外压缩以及内径708的尺寸的进一步减少。O环的直径可最终降低成使得O环706、707接触和握持吸管40的外壁。在此位置，吸管40可由O环706、707有效保持在位。

图5C和5D每个示出一吸管，应理解，该图中所示的方法可用于任何数量的吸管40。例如，除了保持单个吸管40外，图5C的吸管保持器5可在八个不同的锥形孔穴中保持八个吸管40。

图6示出有机玻璃板1A的实施方案，其可以是由电动机驱动的平台1的部件。有机玻璃板1A可用于支撑许多对于执行膜片钳实验必要的设备。在本发明的一优选实施方案中，电动机驱动的平台1用以支撑孔板3。

图7示出根据本发明的实施方案的气压控制系统70。气压控制系统70可包括(或耦合到)数据获取和控制系统25、压力调节器/控制器73(其可由电压或电流输入信号控制，其可由控制系统25控制)、以及用于分别对压力控制器73提供正气压和负气压的气压(+p)和真空(-p)源74。气压源74和真空源75可通过输气管(未示出)连接到系统70。压力控制器73可耦合到正供给口76和负供给口77，用于从气压源74、75接收压力变化。压力控制器73还可包括输送口78，其用于将正和负压输送到吸管40。以这种方式，DAS 25可控制压力控制器73，从而其引起细胞30向吸管的末端40A移动，当其暴露到空气时破裂，然后在细胞膜30a和吸管末端40A之间形成千兆欧密接(见图10A-10C)。

气压控制系统70控制施加在吸管40内的气压(未示出)。可由数据获取和控制系统25控制压力调节器73的功率和信号。对吸管内施加气压引起细胞30向吸管的末端40A迁移或流动。如图7所示，根据所测量的膜片钳密接阻抗，可通过数据获取和控制系统25调整软件调节气压。用于千兆欧密接施加的压力从0.7至3.0psig。

在本发明的一实施方案中，气压控制系统70可如下操作。首先，例如通过visual basic程序建立设定点。该设定点可通过数据获取和控制系统25传送到压力调节器73。第二，然后，压力调节器73可例如使用内部比例、积分和微分(PID)控制环来改变其的阀位置以满足所输入的设定点压力。第三，然后可将压力信号传送回DAS 25，以用于用户反馈。该压力信号可由压力调节器73测量。阻抗测量可例如以1-20Hz的频率更新(依赖于计算机和DAC 25的性能)，以及气压可例如在500毫秒(或另外的周期，例如1秒)更新到的新的设定点值。例如，使用RS-232连接来传送这些信号。

本领域已知的各压力控制协议可用于细胞30在吸管40内的布置。这些可包括以上升(连续增加)或脉动(阶跃增加)方式施加气压。图8示出流体冲洗系统21的实施方案。在本发明的实施方案中，分离的流体冲洗系统21可用于在膜片钳测量之前或之后，从细胞30(例如经受多膜片钳试验的细胞30)冲洗掉化学制品。图8示出吸管冲洗系统21的简图，其中可灌注锥体或槽22以冲洗各吸管40或多行吸管40。示出单个锥体22，但应理解可使用多个锥体。例如，一行(或一系列行)锥体22可实现同时冲洗一行(或一系列行)吸管40。泵可用于将冲洗液灌注进这些槽22。可仔细控制图8中箭头所示的螺旋状流体通道以确保最小的细胞30密接干扰。优选，通过使流体冲洗液与吸管的环形表面相切进入来实现此流体通道。可选，可使用内叶片来引导流体的移动。

流体冲洗系统21的优点在于，其允许试验更多的化合物。在试验化合物行之间通常需要冲洗行以用于充分的冲洗。然而，流体冲洗系统21消除了对于这样的冲洗行的需要，因此允许更多的行用于试验化合物而不是洗/冲洗。

图9示出根据本发明的一实施方案的方法的流程图，该方法使用本文所描述的系统(例如图1中)来测量细胞的特性。在下面详细描述的此示例性方法中，对于多个微量吸管建立膜片钳构型。当多个细胞的每个细胞暴露到试验物质，例如药物时，对于该多个细胞进行膜片钳测量。冲洗吸管和膜，然后膜暴露到其它的试验物质，以进行另外的膜片钳测量。

在步骤1601中，将细胞30(例如，CHO-K1细胞)装入吸管40。每个吸管40在其内部具有一电极，用于膜片钳测量。优选，通过注射器或其它装置，例如通过小毛细管，优选地通过WPI，Inc.MicroFil^TM毛细针，将细胞30注入吸管40，来装入该细胞30。

在步骤1602中，将吸管40置于吸管保持器7中，其位于可移动的平台1上。例如，八个吸管40可成行布置在吸管保持器7中。平台1还支持一个或多个多孔化合物板3，每个化合物板3容纳试验化合物、对照物质或冲洗液。

应注意，在将吸管40置于吸管保持器7中之后，可将细胞30装入吸管40。

在步骤1603中，平台1可相对于吸管固定装置5移动，从而稳固地将吸管40(例如多个以行或其它方式排列的吸管)附接到吸管固定装置5。该平台可首先移动以使吸管保持器7与吸管固定装置5排齐，在该吸管保持器7中将吸管40保持在位。在此步骤中，吸管保持器7可首先移动到正好在吸管固定装置5之下的位置。然后，平台1可向上向着吸管固定装置移动，从而将由吸管保持器7保持的吸管40稳固地附接到吸管固定装置5。吸管固定装置5可包括用于将吸管40耦合到吸管固定装置5的耦合装置。

然后，吸管保持器7可与吸管40分开，从而吸管40仅耦合到吸管固定装置5。在优选实施方案中，吸管40沿基本垂直方向稳固地从吸管固定装置5悬置，从而吸管末端40A面对朝下的方向，例如向着地板。

在步骤1604中，通过气压控制系统21对吸管40内施加气压，引起每个细胞30在吸管40中移动。本文参考图7描述了实现此步骤的一个方法。在优选实施方案中，细胞30将最后到达吸管40的末端40A。在此步骤1604期间，在吸管末端40A和细胞膜30A间建立适当的密接，例如千兆欧密接。当在吸管末端和细胞(或其部分，例如膜)间建立密接时，认为细胞和吸管处于膜片钳构型。在吸管末端40A，细胞30可暴露到周围空气，引起细胞壁的一部分30A可自发破裂，产生“内面朝外全细胞”构型(见图10A-10C)。

用于定位细胞30的典型压力为0.7到3psig。此步骤1604优选地进行2和60秒间，更优选地在5和15秒间。当细胞30位于吸管末端40A时，吸管40内的压力可改变到0.0psig(其可表示吸管内和吸管外压力间的零差压力)。吸管内的压力还可改变到0-1psi正压力差。可能需要一些正压力来确保密接稳定性。

不施加气压，而可使用其它将细胞30附接到吸管末端40A的方法，例如上述的申请中所公开的那些方法。此外，除了内面朝外全细胞构型外，可实现其它类型的细胞构型。例如，如果吸管40的末端暴露到盐或另外的溶液而不是空气，那么细胞30可不破裂，而且细胞30可处于用于其它类型膜片钳测量的状态。

在步骤1605中，可对一个或多个吸管40检验膜片钳构型。例如，可进行电阻测量以检验膜30A和吸管40的吸管末端40A间形成的适当密接，如千兆欧密接。当检验膜片钳构型时，膜30A准备用于膜片钳测量，例如内面朝外全细胞膜片钳测量。在本文所述的方法的各随后的整个步骤中，可连续监测密接。

在步骤1606中，细胞可暴露到空气。例如，细胞可处于吸管的末端，以及不面对吸管内或接触吸管壁的细胞膜的一部分可暴露到周围空气。此步骤1606可按对于图10C(见图10A-10C)所描述的进行。在暴露到空气的情况下，细胞膜可破裂，然后细胞可成为内面朝外全细胞膜片钳构型。应注意，在细胞破裂之后而不是之前，在步骤1605中可检验膜片钳构型。

在步骤1607中，孔板3和吸管固定装置5可相对移动，从而将位于由吸管固定装置5保持在位的吸管40的末端40A处的膜30A插入孔板3的第一孔3A中所容纳的一个或多个第一物质中。孔3A中的物质可包括不同浓度的药物、盐溶液、冲洗液、对照物质或其它化学制品。例如，一个孔可容纳一种药物溶液、以及另一个孔可容纳相同但具有不同浓度的药物溶液。优选，第一孔3A的每个容纳相同的物质。

优选，孔3A中的每种物质与参考电极45电接触，该参考电极45耦合到测量装置例如前置电子装置18。例如，参考电极45可位于孔3A内，并与试验溶液物理接触。以这种方式，参考电极45可传导通过该物质和膜30A的电流，以用于膜片钳测量。

在此步骤1607中，由于孔3A，膜30A应与该物质和电极接触，以及该膜还应与位于吸管40内的另一电极4接触。根据传统膜片钳技术，该电极4还可在吸管40内的另外的地方(例如在吸管的主体中)。

在步骤1608中，测量膜30A的电性质。例如，当膜30A接触第一孔3A中的第一物质时，对该膜30A进行膜片钳测量。以这种方式，例如，可测量一种(多种)第一试验物质对一种(多种)膜30A的离子通道的影响。

在优选实施方案中，在细胞30中可测量下列参数中的一个或更多(例如，电性质)：通过一个或多个电极和/或通过细胞30或细胞膜30A的电流、跨电极和/或跨细胞30或细胞膜30A的电压、电阻、阻抗、荧光、等离子共振、机械共振、流动性和/或刚度。细胞膜中表达的蛋白质受到所施加的电、机械等力，因此可改变其构象。

在步骤1609中，吸管固定装置5和孔板3可相对移动，从而第一孔3A与吸管末端40A(以及其中的膜30A)分开。例如，当吸管固定装置5(以及稳固地附接到其的吸管40)保持在位时，孔板3可向下移动而远离吸管固定装置5沿。可选的是，吸管固定装置5可向上移动且远离孔板3，这实现相同的效果。

在步骤1610中，可选地，冲洗膜30A和/或吸管40。在该过程的此点或在膜片钳测量之后的任何其它时间可进行冲洗步骤1610。优选，进行2到5次冲洗，从而残留在围绕膜30A的流体中的任何试验物质最后被稀释到低于其对膜30A的活性的水平。

在一个实施方案中，吸管和流体冲洗系统21可相对移动，从而如图8所示，吸管末端40A位于流体冲洗系统21内。然后，流体可在每个吸管末端40A和相应的膜30A之上通过。使用多个流体冲洗系统21可同时冲洗多个吸管40，或使用单个流体冲洗系统21可单独顺序地冲洗每个吸管40。

在另一个实施方案中，通过将膜30A和/或吸管末端40A插入容纳冲洗流体的一孔3A中来冲洗其。容纳冲洗流体的孔3A可邻近容纳一种(多种)第一物质的孔3A。例如，冲洗流体可以处于与容纳第一试验物质的一行孔3A邻近的一行或多行孔3A中。在步骤1608中的膜片钳测量之后，可将一行吸管末端40A插入2-5行容纳冲洗流体的孔3A中，结果进行2-5次冲洗。这样定位物质和冲洗流体，最小化了移动和冲洗吸管末端40A所需要的活动和时间。

在冲洗后，可将吸管末端40A从流体冲洗系统21或冲洗孔3A移走。然后，吸管40准备进行另外的膜片钳测量。如果将膜片30A从容纳较低浓度的试验物质的孔3A移动到容纳较高浓度的试验物质的孔3A，那么根实验室的标准惯例，可取消冲洗步骤1610。

在步骤1611中，对容纳第二组物质的第二组孔3A重复步骤1607-1609。即，吸管末端40A(和容纳在其中的膜30A)与不同的一组孔3A相对移动，从而吸管末端40A与容纳在该孔3A中的第二物质接触。当进行一个或多个膜片钳测量时，通过相对移动吸管固定装置5和孔板3，从而将吸管末端40A从孔3A移走，膜30A再次从该物质移走。优选，第二组孔3A不同于且邻近第一组孔3A(或邻近步骤1610的冲洗孔3A)。可选的是，在另一实施方案中，在此步骤1611中，膜30A重新与相同的一组孔30A相接。

在步骤1612中，可对相同或不同的膜30A进行另外的膜片钳试验。例如对于容纳第三组试验物质的第三行孔3A，可对吸管40重复步骤1607-1609。该试验物质可包括不同的药物或不同浓度的先前已试验的药物。

此外，使用相同或不同的孔3A，可使用不同的吸管40(例如不同行的吸管)进行一个或多个系列的膜片钳测量和/或冲洗。按需要多次重复此过程。以此方式，可对多个膜和多种药物(或浓度不同的药物)进行多次膜片钳测量。单个细胞30可用于多种测量。

在步骤1613中，吸管40可与吸管固定装置5分开。吸管可被传送(例如落)到废弃区或贮藏器49。例如，在对一行吸管40完成膜片钳试验的情况下，通过使平台1远离(例如向下)吸管固定装置5移动，吸管40可与化合物板3分开。然后，通过向该行吸管40提供高压脉冲，将其排入处理区49，吸管40可与吸管固定装置5分开。可选的是，用于将吸管40耦合到吸管固定装置5的装置可释放吸管40，从而将其传送到处理区49。

在步骤1614中，可对另一组(例如，行)吸管40和细胞30重复整个过程。根据第二组吸管40是否已装有细胞30，以及吸管40是否已置于吸管保持器7中，可以从步骤1601、1602或1603开始重复该过程。

在步骤1615中，在数据获取和控制系统25处理膜片钳测量结果。可在任何时间，例如在每个测量时间，处理该结果。可使用多种商业可得软件产品，例如Pulsefit或Origin 7进行分析。

可考虑其它的方法，例如本文所公开的另外的那些方法。

应理解，不必使用所有的吸管和孔。对于一系列膜片钳测量，一些孔和吸管可保持为空的。在一个实施方案中，该方法使用仅一个吸管和一个孔。类似，应认识到，尽管上述的步骤实施使用该装置的优选方法，然而本领域的技术人员可添加或删除一些步骤来适合特定的应用。

优选，根据本发明的方法使用多个记录元件，该多个记录元件通过多个电压钳放大器多路复用到数据获取装置。这样的放大器还可以以电流钳或锁相放大器模式使用。该配置提供极高的时间分辨率，以及实际上允许同时从所有孔测量。

优选，本发明的方法使用很小体积的试验化合物。更小的体积意味着，在随后的试验之前需要冲洗的化合物更少，因此需要更少的冲洗。

优选，在控制温度和大气压的环境下进行该方法。这允许更准确地近似有助于研究细胞30的生理缓冲液、气体交换和温度。

本系统可研究多种不同的细胞类型。可示例细胞的不完全名单包括：Jurkat淋巴瘤细胞；HEK293细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，包含离子通道/转运蛋白的细胞系)；来自神经组织的原代细胞，例如海马、皮层、脑干、丘脑、扁桃体、下丘脑、中脑、脊髓和其它CNS神经元、节神经元、背根节神经元和神经内分泌细胞；骨骼肌；平滑肌；心肌；免疫细胞；血细胞；上皮细胞；内皮细胞；植物以及基因工程细胞。在本发明的优选实施方案中，与吸管2密接且受测验的细胞30是动物细胞。细胞30可为哺乳动物、昆虫或两栖动物细胞。更优选，细胞30包含在其细胞膜30A中的离子通道或转运蛋白，其通过公知的分子生物学技术自然或人工导入。更为优选地，细胞30为哺乳动物细胞，例如人类细胞。

图10A-10C示出根据本发明的实施方案将细胞30布置成内面朝外膜片钳构型的过程。图10A-10C示出吸管40和细胞30，该细胞30移入该吸管40内的用于膜片钳的位置。细胞30可开始位于该吸管内的其它位置，如图10A所示。例如，未受扰细胞30可通过吸管40的较宽的顶部装入吸管40的内部。当细胞30到达末端，以及被适当构型(例如细胞膜30A形成与吸管末端40A的千兆欧密接)时，暴露到周围空气引起细胞自发破裂，如图10C所示。

图10A示出在吸管40中的内部位置的细胞30。气压控制系统70可对吸管40中的细胞30或流体41施加气压，因此引起细胞30向下向着吸管末端40移动。重力可帮助此过程。

如图10B所示，细胞30最终达到吸管40的末端。在此位置，该细胞暴露到周围空气，这引起暴露的细胞膜30A破裂。

如图10C所示，破裂的细胞31导致内面朝外构型，其停留在或接近吸管40的末端。这里，破裂的全细胞31在吸管40内，以及细胞膜30A里面的一部分面向吸管40外面地暴露在吸管40的末端。可对吸管40内施加吸力以在细胞膜30A和吸管末端40A间产生千兆欧姆密接(也称作千兆欧密接)，但是吸力不是必需的。然后，跨过暴露在吸管40的末端40A的膜30A的部分，对破裂的细胞31准备进行内面朝外全细胞膜片钳测量。

图11示出根据本发明的实施方案的“内面朝外”全细胞膜片的等效电路。该构型具有此名字，是因为全细胞30位于吸管40内，其中细胞30的膜30A的内部面向外。

该电路可包括用于进行膜片钳测量的任何典型电路。这里，可使用HEKA EPC 9/2放大器。

在细胞30和吸管40间形成千兆欧密接401。由于密接401，吸管40内侧的压强(P_i)可不同于吸管40外侧通常为大气压的压强(P_atm)。与外侧相比，吸管40内侧的不同的相对压强P_i可产生千兆欧密接。离子通道402沿着且跨过形成千兆欧密接401的膜而存在。

电路图示出形成基本的膜片钳测量电路的电阻器和电容器间的连接。在该电路中可测量电流(I)和电压(V)。一般，所测量的电流为流过一个或多个离子通道402的电流。

实施例：使用本发明的方法所获得结果

使用本文所描述的方法进行了一些实验。图12-17示出离子通道结果。

图12示出根据本发明的实施例的单个吸管和单个细胞的外向钾电流。通过从-70mV的保持电势，到-110mV的500ms长的脉冲，再为+40mV的试验电压来获得这些电流。图12中所发现的信号噪声的缺少示出高质量的信号。以5分钟的时间间隔获得电流曲线。

图13示出示出根据本发明的实施方案的稳定的峰电流幅度的图。根据图12使用的设置，对单个吸管和单个细胞测量峰电流。图13所示，在全部多次测量中，峰电流保持相对稳定(接近13nA)。具有稳定的峰电流测量使研究者能够清楚地分辩药效以及不好的膜片钳构型。大部分膜片钳实验方案对试验的每个化合物浓度需要仅10分钟相对稳定的测量。如图13所示，本发明的实施方案中的峰电流持续超过40分钟保持很稳定(接近13nA)，仅在下一20-30分钟具有稍微的降低(5-10％，0.5-1nA)。

图14-17示出根据本发明的实施方案的系统的快速开始和冲洗特征。这些特征与“内面朝外”全细胞构型的高扩散速率是一致的。图8-11示出两个代表性实验。

图14示出根据本发明的实施方案的试验化合物的外向钾电流的曲线图。具体地，图14示出对于范围自-60mV到40mV，以20mV增量的0.5秒试验脉冲，单个吸管中的第一细胞的外向钾电流。每个试验增量跟随于-110mV的0.5秒长的超极化脉冲，同时保持膜电势在脉冲间为-70mV。在第一(最左)曲线图中，电流的测量是当细胞浸在对照溶液中时进行的。然后，将该细胞置于10mM 4-AP的浴溶液中，以及记录第二(中间)曲线图的测量结果。称作4-AP的化学制品是这些离子通道的药物阻断剂。然后，对该细胞冲洗掉4-AP溶液，以及将该细胞再次浸在对照溶液中。测量结果记录在第一和第二曲线中，以及结果示出在第三(最右)曲线图中。对于内面朝外全细胞膜片钳测量，对照和4-AP浴液表示细胞内的区域。

图14所示的结果示出，代表细胞内区域的10mM 4-AP的浴溶液阻挡了约50％的钾电流幅度(见与第一和第三曲线图相比的中间曲线图)。这些结果还示出，在冲洗灌注下，效果完全(或至少基本)逆转，这是因为冲洗后的结果(右曲线图所示)几乎与应用4-AP浴液之前，最初的对照环境下所获得的结果一致。

图15示出根据本发明的实施方案的钾电流幅度(I)行为与所施加的(V)的关系。这些结果以电流幅度的与膜电压的曲线图示出图14的结果。这里，黑方点对应图14的最左曲线图，黑圆点对应图14的中间曲线图，其示出在存在10mM 4-AP的浴溶液下，降低的钾电流，以及白圆点对应图14最右方的曲线图中的、4-AP被冲洗之后的测量结果。如图15所示，当细胞在10mM 4-AP的浴溶液(由实心黑圆点表示)时的通过膜的电流低于当细胞在对照溶液中时电流的50％。此外，在冲洗后使用对照溶液的测量结果(由白圆点表示)与改变浴液之前所获得的结果(由实心黑方点表示)几乎一致，这表示冲洗化学制品的可逆过程成功地将细胞返回到其以前的状态。

图16示出第二细胞的行为。图16示出4-AP对第二细胞膜中的离子通道的药物阻断，很象在图14中对于第一细胞示出的阻断。中间的曲线图示出在4-AP存在下所获得的测量结果。中间曲线图示出药物4-AP作用期间的电流。此电流低于左和右曲线图中的电流约50％，该左和右曲线图分别对应药物作用之前和之后，对照溶液中的测量结果。图17示出对于此数据进行的电流与时间关系的分析。

使用高质量的吸管玻璃电极，对于许多细胞系包括CHO-K1、U937和HEK293，通常观察到70-80％的成功率(真正的千兆欧密接以及随后的全细胞形成)。尽管许多其它的系统已自动化，然而在此文献中还必须清楚地陈述密接质量。本发明的系统允许每天试验数百个细胞。

图17示出该系统的冲洗能力，其示出同样对应于左、中和右曲线图的在药物作用之前、期间、之后的电流幅度。该结果示出，冲洗后所获得的测量结果(最右数据集)几乎相等于当细胞暴露到对照物质所获得的测量结果。

以10秒间隔进行测量，以及测量对每个种试验物质是很一致的。因此，需要仅10秒的间隔来返回到各稳定状态水平，这再次示出内面朝外构型的高扩散速率特征。

根据本发明，例如，在膜片钳测量中，任何小的分子、有机化合物、肽、毒素、抗体、或蛋白质、特别是医药或农业库中所出现的那些物质可用作试验物质并施加给细胞膜。

根据本发明，本文所公开的装置和方法可用于筛选，以鉴别影响细胞电性质的化合物和过程。可鉴别的化合物的非限制性实例包括神经递质、神经递质类似物、酶抑制剂、离子通道调节物、G蛋白和其配体、调节物和受体、转运抑制剂、激素、肽、毒素、抗体、药剂、化学制品以及这些化合物的任何组合。

关注的具体化合物包括离子通道调节物(阻断剂、开启剂、门控调节剂)、嘌呤能(purinergics)、胆碱能药物、5-羟色胺能药物、多巴胺能药、麻醉药、苯化重氮、巴比妥类药物、类固醇、醇、金属阳离子、大麻素、缩胆囊素、细胞因子、兴奋性氨基酸、γ-氨基丁酸能类化合物、神经节苷脂、组胺能类化合物、褪黑激素、神经肽、神经毒素、内皮缩血管肽、NO化合物、阿片物质、σ受体配体、生长激素抑制素、速激肽、血管收缩素、铃蟾肽、缓激肽、前列腺素以及这些化合物的任何组合。

由本文所公开的筛选鉴别的细胞过程包括细胞与细胞的相互作用、细胞与细胞的融合、病毒感染、内噬作用、胞吐作用、膜循环和膜配体。因为所有的细胞过程可引起细胞电性质的一种或多种的可测量的变化，因此本发明可用于研究任何这样的过程。反过来，这些研究可用于发现调节细胞过程的化合物。

本发明的优点在于，其消除了对于附加的管或附件的需要，这显著降低了成本，以及降低了对灌注系统内可能残留的残留物的意外污染。由于试验化合物通常可附着到灌注系统所用的管，因此这样的系统需要另外的清洁和/或替换该管。本发明消除了此问题。

本发明的优点在于，其实现膜自一孔到另一孔的快速转移。吸管可仅自一孔移走以及插入另一孔。不需要消耗时间的稀释化合物以及调整灌注系统的操作。重要地是，通过灌注来替换含有细胞的浴槽中的容纳物的通常缓慢的步骤，被降低到将吸管从一孔移到下一孔所花费的时间。此外，本发明消除了对于附加的管或附件的需要，这显著降低了成本，以及降低了灌注系统内可能残留的残留物的意外污染。试验化合物通常可附着到灌注系统所用的管，因此需要清洁或替换该管。本文所描述的系统和方法消除了此问题。

应该理解，本文所示和所述的本发明的具体实施方案仅是示例性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域的技术人员可进行许多变更、改变、替换和等效。具体地，本申请中使用的术语应该根据相关应用中所使用的相似术语，广义地理解。因此，旨在，本文所述的以及附图所示的所有的主题应认为是仅示例性的，而非限制性的，以及本发明的范围仅由所附权利要求决定。

Claims (44)

1.一种执行高通量膜片钳测量的方法，其包括：

建立一个或多个膜片钳构型，其包括一个或多个细胞以及一个或多个吸管，其中每个所述膜片钳构型包括密接到所述吸管的细胞；

将所述一个或多个吸管附接到吸管固定装置；

使所述吸管固定装置和包括一个或多个第一孔的板相对移动，从而所述一个或多个细胞位于所述一个或多个第一孔之一内；以及

测量所述一个或多个细胞的至少一种电性质。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述建立的过程包括建立内面朝外膜片钳构型。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述测量过程包括：

测量参考电极与膜片电极之间的电流，其中所述参考电极适合于电接触容纳在所述一个或多个孔之一中的试验溶液，以及所述膜片电极适合于电接触容纳在所述一个或多个吸管之一中的吸管溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个吸管的每个包括电极。

5.如权利要求1所述的方法，其还包括：

将所述一个或多个吸管置于吸管保持器中，所述吸管保持器耦合到可移动的平台。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述附接过程包括：

相对所述吸管固定装置移动所述平台；

将所述一个或多个吸管连接到所述吸管固定装置；以及

使所述一个或多个吸管脱离所述吸管保持器。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述可移动的平台支持所述板。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述可移动的平台被构造成支持形状为基本锥形或管状的流体冲洗系统。

9.如权利要求8所述的方法，其还包括：

使所述吸管固定装置和流体冲洗系统相对移动，从而所述一个或多个细胞的至少一个在所述流体冲洗系统内。

10.如权利要求9所述的方法，其还包括：

将流体抽入所述流体冲洗系统，以冲洗所述一个或多个细胞的至少一个。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个孔的至少一个容纳试验物质。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个孔的至少一个容纳冲洗液。

13.如权利要求6所述的方法，其还包括：

通过使所述吸管固定装置和板相对移动，而从所述一个或多个第一孔移走所述一个或多个细胞；以及

通过使所述吸管固定装置和板相对移动，来将所述一个或多个细胞插入一个或多个第二孔。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个第二孔包括一种或多种试验物质。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个第二孔包括一种或多种冲洗液。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个第一孔包括一种或多种试验物质，以及其中所述第二孔包括下列至少一个：

一种或多种不同的试验物质，或

不同浓度的相同试验物质。

17.如权利要求13所述的方法，其还包括

通过使所述吸管固定装置和板相对移动，来从所述一个或多个第二孔移走所述一个或多个细胞；以及

通过使所述吸管固定装置和板相对移动，来将所述一个或多个细胞插入一个或多个第三孔。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述一个或多个第二孔不同于所述一个或多个第三孔。

19.如权利要求1所述的方法，其还包括：

通过使所述平台和所述吸管固定装置相对移动，来从所述一个或多个第一孔移走所述一个或多个细胞；以及

通过使所述吸管固定装置和流体冲洗系统相对移动，来将所述一个或多个细胞插入所述流体冲洗系统。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述建立过程包括，建立所述一个或多个细胞的每个和所述一个或多个吸管的每个之间的高阻电密接。

21.如权利要求20所述的方法，其还包括确定是否在所述细胞的至少一个和所述吸管的至少一个之间形成高阻电密接。

22.如权利要求1所述的方法，其还包括将所述一个或多个细胞的每个暴露到周围空气。

23.如权利要求1所述的方法，其还包括根据所述测量过程来处理电测量数据。

24.如权利要求1所述的方法，其中所述建立过程包括：

在所述一个或多个吸管内施加气压，以将所述一个或多个细胞从所述吸管内的内部位置移动到所述吸管的末端。

25.一种计算机可读介质，其用计算机程序代码编码以自动化膜片钳测量系统，所述程序代码有效执行下列步骤：

将一个或多个细胞装入一个或多个吸管的一个或多个末端；

将所述一个或多个吸管附接到吸管固定装置；

使所述吸管固定装置和包括一个或多个孔的板相对移动，从而所述一个或多个细胞的每个分别在一个或多个第一孔的每个内；以及

测量所述一个或多个细胞的每个的至少一种电性质。

26.一种测量膜的性质的装置，其包括：

吸管固定装置，其耦合到一个或多个吸管，其中每个吸管适合于在每个吸管末端在膜片钳构型中提供与膜的高电阻密接；

电动平台，其包括一个或多个多孔板；以及

电动机控制器，其被构造成使所述电动平台和所述吸管固定装置相对移动，从而所述一个或多个吸管的每个末端在所述一个或多个孔内。

27.如权利要求26所述的装置，其中所述一个或多个孔的每个包括试验物质。

28.如权利要求26所述的装置，其还包括

测量装置，其被构造成测量每个膜的电性质。

29.如权利要求26所述的装置，其还包括用于进行膜片钳测量的装置，所述装置包括前置装置、主放大器和电极。

30.如权利要求26所述的装置，其中所述电动机控制器可沿x、y和z方向移动所述电动平台。

31.如权利要求27所述的装置，其还包括数据获取系统，其用于处理由所述测量装置获得的测量结果。

32.如权利要求26所述的装置，其还包括用于控制所述电动机控制器的电动机控制系统。

33.如权利要求27所述的装置，其还包括数据获取和控制系统，其用于控制所述电动机控制器以及处理所述测量装置所获得的测量结果。

34.如权利要求26所述的装置，其中所述一个或多个孔的至少一个容纳冲洗流体。

35.如权利要求26所述的装置，其还包括冲洗装置，其被构造成使冲洗流体在所述吸管末端上通过，以及由此冲洗所述膜。

36.如权利要求26所述的装置，其还包括冲洗装置，其被构造成使冲洗流体在所述细胞上通过，其中所述冲洗装置包括：

冲洗容器，其为大致锥形，其中所述冲洗容器和所述一个或多个吸管可相对移动，从而所述吸管的一部分和其中的所述细胞被装到所述冲洗容器内；以及

泵，其被构造成将冲洗流体抽入所述冲洗容器，从而所述冲洗流体以其冲洗所述细胞的方式通过所述冲洗容器。

37.如权利要求36所述的装置，其中所述泵被构造成将流体抽入所述冲洗装置，从而其以向下的螺旋移动通过所述冲洗装置。

38.如权利要求37所述的装置，其中所述泵被构造成抽送冲洗流体，从而所述冲洗流体以环形顺时针或逆时针移动通过所述冲洗容器。

39.如权利要求26所述的装置，其中所述膜为所述细胞的膜，以及其中每个吸管包括吸管末端，还包括气压控制系统，所述气压控制系统被构造成使所述一个或多个吸管内的所述细胞自其吸管的内部移动到所述吸管末端，从而所述细胞的部分暴露到所述吸管的外面。

40.如权利要求26所述的装置，其中每个吸管包括吸管末端，还包括气压控制系统，所述气压控制系统被构造成使所述一个或多个吸管内的每个细胞移动到所述吸管末端，构成内面朝外膜片钳构型。

41.如权利要求27所述的装置，其中所述试验物质包括药物。

42.如权利要求41所述的装置，其中所述药物包括小分子、肽、毒素和抗体的至少之一。

43.如权利要求26所述的装置，其中所述膜为人类细胞膜。

44.如权利要求26所述的装置，其还包括：

法拉第筒，其包围所述吸管固定装置、电动平台和电动机。

Images