CN101175994A - 稳定的金属/导电聚合物复合物胶体及其制造和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了稳定的金属/导电聚合物复合物胶体及其制造方法。本发明胶体用于包括分析物检测应用的各种不同应用中。本发明还提供了包含本发明胶体的试剂盒。

Description

稳定的金属/导电聚合物复合物胶体及其制造和使用方法
相关申请的交叉引用
根据美国法典第35章第119条，本申请要求2004年10月21日提交的美国临时申请序号60/621,258的优先权；该申请的公开内容通过引用结合到本文中来。
导言
发明背景
贵金属(例如金或银)的纳米颗粒可以各种几何形状，例如球形、棒形或棱锥形来制备。这些小物体包含化学还原形式的金属元素，根据制备这些小物体的方法，可将其以还原的粉末化固体形式储存或以在溶剂(例如水或各种有机溶剂)中的稳定悬浮液形式(即，作为胶体)保持。因为颗粒的纳米尺寸，虽然显微镜可以分清这类悬浮液与真溶液，但是肉眼却不能将其分清，因此这类悬浮液称为胶体溶液。因此，这些颗粒易于浇铸到各种载体上以形成规整的电路。
因为这种金属纳米颗粒独特的电子、光学和催化性质，所以近年来对于这种金属纳米颗粒的研究已成为及其活跃的领域。因为光与电磁场相关，所以纳米颗粒的光电性质尤其受人关注。的确，因为贵金属纳米颗粒具有金属性且能够导电，所以贵金属纳米颗粒在其表面上由稠密的导电电子云所围绕。当这些电子由光激发时，电磁辐射与这种电子结合形成由颗粒表面发射的集体振荡。因此，这类颗粒展现出可成功用于各种领域(例如分析物检测、电子转移或信息存储)的特定的光吸收、反射、发射和散射性质。至今研究的大多数颗粒都是由相同金属均质地制成。然而，最近已经表明，有可能构造出由交替于结构中的不同金属制成的纳米物体。这种新进展开辟了在许多应用中将其用作纳米条码的道路。
因为纳米颗粒在多种应用中的领域认可潜能，因此持续存在对于发展新型纳米颗粒和应用的关注。
发明概述
本发明提供了稳定的金属/导电聚合物复合物胶体及其制造方法。本发明胶体可用于包括分析物检测应用的各种不同应用中。本发明还提供了包含本发明胶体的试剂盒。
附图简述
图1.聚(噻吩-3-羧酸)[左]溶液的GP-HPLC图和PANI-COOH[右]溶液的GP-HPLC图。指明牛血清白蛋白(BSA)的洗脱时间(箭头)以供参考。
图2.在不同pH值下，PANI-COOH使胶体金纳米颗粒针对盐絮凝的稳定化。
图3.在固定pH下，浓度渐增的PANI-COOH使胶体金纳米颗粒针对盐絮凝的稳定化。PANI-COOH和金纳米颗粒的最初吸收波长分别由向上空心三角形和向下空心三角形表示。
图4.由加入盐后最大波长下的O.D.值衡量，在固定pH下，浓度渐增的PANI-COOH使金纳米颗粒针对盐絮凝的逐渐稳定化。
图5.PANI-COOH溶液、胶体金纳米颗粒和PANI-COOH-金复合物的可见光吸收光谱。
图6.在pH 9下缓冲的复合材料在合成后立即获取的吸收光谱(实线)和室温储存三个半月后获取(虚线)的吸收光谱。
图7.复合材料(实线)和PANI-COOH溶液(虚线)在pH 4.95和pH9之间的差异光谱。
图8.PANI-COOH(空心圈)溶液或胶体纳米复合物(实心圈)溶液在与渐增剂量的抗坏血酸反应之后分别观察到的剂量反应曲线。数据为三次重复测量结果的平均值±S.D.。
图9.由差异光谱衡量的，甘油对金纳米胶体的影响。
图10.由差异光谱衡量的，甘油对PANI-COOH-金复合物纳米胶体的影响。
图11.PANI-COOH-金复合物纳米颗粒在典型波长下的吸光度随介质折射率改变的演变。
图12.复合材料在350nm下吸光度随介质折射率改变而改变和金纳米颗粒在575nm下吸光度随介质折射率改变而改变的比较。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。然而，出于清楚和易于参考的目的，下文定义了某些要素。
术语“胶体”是指微观颗粒悬浮在液体介质中的流体组合物。在代表性胶体中，其中的颗粒的尺寸在1纳米与1微米之间。
术语金属胶体是指其中悬浮的微观颗粒为金属颗粒的胶体。
术语“贵金属”是指周期表第VIII族金属，包括但不限于：铂、铱、钯等等，以及金、银等。
术语“导电聚合物”是指导电聚合材料。在代表性实施方案中，导电聚合物为有机聚合物，例如p-共轭有机聚合物。例如，可使用聚吡咯类，例如聚吡咯、聚(N-取代的吡咯)、聚(3-取代的吡咯)和聚(3，4-二取代的吡咯)；聚噻吩类，例如聚噻吩、聚(3-取代的噻吩)、聚(3，4-二取代的噻吩)和聚苯并噻吩；聚异硫茚类，例如聚异硫茚；聚亚噻吩基亚乙烯基类，例如聚亚噻吩基亚乙烯基；聚(对亚苯基亚乙烯基)类，例如聚(对亚苯基亚乙烯基)；聚苯胺类，例如聚苯胺、聚(N-取代的苯胺)、聚(3-取代的苯胺)和聚(2，3-取代的苯胺)；聚乙炔类，例如聚乙炔；聚二乙炔类，例如聚二乙炔；聚甘菊环类，例如聚甘菊环；聚芘类，例如聚芘；聚咔唑类，例如聚咔唑和聚(N-取代的咔唑)；聚哂吩类，例如聚哂吩；聚呋喃类，例如聚呋喃和聚苯并呋喃；聚(对亚苯基)类，例如聚(对亚苯基)；聚吲哚类，例如聚吲哚；聚哒嗪类，例如聚哒嗪；多并苯类，例如萘并萘、并五苯、并六苯、并七苯、二苯并五苯、四苯并五苯、芘、二苯并芘、
Figure A20058004351800111
(chrysene)、二萘嵌苯、六苯并苯、涤纶、卵苯、quoterylene和循环蒽(circumanthracene)；衍生物(例如三苯并二嗪、三苯并二噻嗪、并六苯-6，15-醌)，其通过用例如N、S和O的原子或例如羰基的官能团取代多并苯的一些碳原子来制备；聚合物，例如聚乙烯咔唑、聚苯硫醚和聚乙烯硫醚。在代表性实施方案中，尤其受关注的是聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺或其衍生物。
如本领域中所公知，导电聚合物中可通过以下方式掺入掺杂剂：在具有例如二甲基氨基、氰基、羧基和硝基等官能团的聚合物材料中，加入例如苯醌衍生物和四氰基乙烯以及四氰基对醌二甲烷及其衍生物等材料，作为接受电子的受体；或者，例如在具有例如氨基、三苯基、烷基、羟基、烷氧基和苯基等官能团的材料中，加入取代的胺类，例如苯二胺；蒽、苯并蒽、取代的苯并蒽、芘、取代的芘、咔唑及其衍生物，和四硫富瓦烯及其衍生物，作为起电子供体作用的供体。本文所述的掺杂是指接受电子的分子(受体)或提供电子的分子(供体)被加入所述使用掺杂的薄膜中。作为掺杂剂用于本发明的可以是受体或供体。
术语“金属/导电聚合物复合物胶体”是指由在其表面上存在有导电聚合物的金属颗粒制成的胶体。
术语“吸附”是指极薄的分子(例如水溶性聚合物分子)层被粘附到其接触的固体(例如金属颗粒)的表面上。
如果材料溶于水中，则该材料为“水溶性的”。就本发明的导电聚合物而论，如果在标准温度和压力(STP)条件下至少约0.02g溶于至少约100ml水中，那么认为这类导电聚合物为水溶性的。
本文所用的术语“接触”是指使在一起或放在一起。因而，当使两种物质在一起或放在一起，例如使其彼此触及时，则第一物质与第二物质接触。术语“结合”是指以使两种不同组分变成单一组分的方式使两种不同组分接触。
术语“搅拌”是指对组合物施加物理动作，以使其组分相对于彼此运动。因而，术语搅拌用以泛指混合、搅拌等等。
本文所用的术语“配体”是指作为特异性结合对的一员的任何类型的分子。所关注的配体包括但不限于生物分子，其中术语“生物分子”是指所关注的任何有机或生物化学分子、基团或物质，例如，其可与所关注的分析物特异性结合。示例性生物分子包括肽、蛋白质、氨基酸和核酸、有机小分子和无机小分子等。
本文所用的术语“肽”是指由一个氨基酸的羧基和另一基团的氨基之间形成酰胺而产生的任何化合物。
本文所用的术语“寡肽”是指具有少于约10个到20个残基(即氨基酸单体单元)的肽。
本文所用的术语“多肽”是指具有多于约10个到20个残基的肽。术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。
本文所用的术语“蛋白质”是指多于约50个残基的特定顺序的多肽并且包括D和L型、修饰型等。
本文所用的术语“核酸”是指由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的聚合物，或指合成产生的化合物(例如美国专利第5,948,902号及其引用的参考文献中所述的PNA)，所述化合物可以与天然存在的核酸以序列特异性方式杂交，杂交方式类似于两种天然存在的核酸的杂交方式，例如，其可参与Watson-Crick碱基配对相互作用。
术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括那些不但包含已知嘌呤和嘧啶碱基部分而且包含其他已修饰的杂环碱基部分的部分。这类修饰物包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰基化的嘌呤或嘧啶、或其他杂环。另外，术语“核苷”和“核苷酸”包括那些不但包含常规核糖和脱氧核糖糖类而且还包含其他糖类的部分。修饰的核苷或核苷酸还包括对糖部分的修饰物，例如，其中一个或多个羟基用卤素原子或脂族基团替换，或者将其官能化为醚、胺等等。
所关注的还有有机小分子和无机小分子。例如，对于有机分子来说，在某些实施方案中，分子量大于50且小于约2,500道尔顿的小有机化合物作为配体受到关注。小有机化合物可包含与蛋白质在结构上相互作用，特别是氢结合所必需的官能团，且通常包含至少氨基、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。这类化合物可包括被一个或多个上述官能团取代的环碳结构或杂环结构和/或芳族结构或多芳族结构。
在某些实施方案中，使用连接基团来使配体与复合物纳米颗粒的表面间接结合。如果使用连接基团，那么选择这类基团以使配体部分与该表面通过连接基团共价连接。所关注的连接基团可根据目标和阻断(blocking)配体部分的性质而广泛变化。各种连接基团为本领域的技术人员所公知且在本发明双官能分子中得到应用。通常，这类连接基团包括间隔基团，所述间隔基团在任一末端具有能够与配体或表面共价结合的反应性官能团。所关注的间隔基团可能包括脂族和不饱和烃链、含有例如氧(醚，例如聚乙二醇)或氮(多胺)等杂原子的间隔基团、肽、碳水化合物、可包含杂环子的环状或非环体系。间隔基团还可包含与金属结合的配体，从而使所存在的金属离子与两个或更多个配体配位以形成复合物。具体的间隔成分包括：1，4-二氨基己烷、二亚甲苯基二胺、对苯二甲酸、3，6-二氧杂辛二酸、乙二胺-N，N-二乙酸、1，1′-亚乙基双(5-氧-3-吡咯烷甲酸)、4，4′-亚乙基二哌啶。潜在的反应性官能团包括亲核官能团(胺、醇、硫醇、酰肼)、亲电子官能团(醛、酯、乙烯基酮、环氧化物、异氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺)、能够进行环化加成反应、形成二硫键或与金属结合的官能团。具体实例包括伯胺和仲胺、异羟肟酸、N-羟基琥珀酰亚氨酯、N-羟基琥珀酰亚氨碳酸酯、羟基羰基咪唑(oxycarbonylimidazole)、硝基苯基酯、三氟乙基酯、缩水甘油醚、乙烯基砜和顺丁烯二酰亚胺。可用于本发明双官能分子中的具体连接物包括杂官能化合物，例如叠氮苯甲酰基酰肼、N-[4-(对叠氮水杨基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫]丙酰胺)、双磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯、己二酰亚氨酸二甲酯(dimethyladipimidate)、二琥珀酰亚氨基酒石酸酯、N-马来酰亚氨丁酰基氧基琥珀酰亚氨酯、N-羟基磺基琥珀酰亚氨基-4-叠氮苯甲酸酯、N-琥珀酰亚氨基[4-叠氮苯基]-1，3′-二硫丙酸酯、N-琥珀酰亚氨基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛和琥珀酰亚氨基4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-甲酸酯、3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚氨酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酸N-羟基琥珀酰亚氨酯(SMCC)等等。
本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸组成的聚合物。
“均质的”是指组合物所有部分具有相同或类似的性质，即组合物所有部分具有均一的结构或组成。
本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。
本文所用的术语“寡核苷酸”表示长度为约10到100个核苷酸且最高达200个核苷酸的单链核苷酸多聚体。
“生物聚合物”为一种或多种类型的重复单元的聚合物。生物聚合物通常见于生物体系中(尽管其可以合成方式制造)，并且可包括肽或多核苷酸以及由氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团组成的或包含这些的化合物。这包括多核苷酸，其中常规主链已由非天然存在的或合成的主链替换；还包括核酸(或合成的或天然存在的类似物)，其中一个或多个常规碱基已由能够参与Watson-Crick型氢结合相互作用的基团(天然的或合成的)替换。多核苷酸包括单链或多链构型，其中一个或多个链可能与另一链完全排列对齐或者可能没有完全排列对齐。例如，不管来源如何，“生物聚合物”可包括DNA(包括cDNA)、RNA、寡核苷酸和如美国专利第5,948,902号及其引用的参考文献(所有这些文献都通过引用结合到本文中)所述的PNA及其他多核苷酸。
短语“光学性质”是指光学参数，即性质，其值确定某物的特征或行为，其中代表性光学性质包括但不限于：光吸收、光发射、光反射和光散射。
术语“参考”和“对照”可互换使用，用来指可与观测值相比较的已知值或已知值的组。本文所用“已知”是指该值代表已了解的参数，例如光吸收、光发射等。
术语“评估”和“评价”可互换使用，用来指任何形式的测量，且包括确定要素是否存在。术语“确定”、“测量”、“评估”和“检验”可互换使用且包括定量测定和定性测定。评估可以是相对的或绝对的。“评估某物的存在”包括确定某物的存在量以及确定其是否存在。
本文所用的术语“检测”是指定性地或定量地确定信号。
术语“结合”是指两个物体彼此联系以产生稳定的复合结构。在某些实施方案中，两个互补核酸之间的结合可被称为特异性杂交。术语“特异性杂交”和“选择性杂交”可互换使用，是指在严格条件下核酸分子优选与特定核苷酸序列结合、双联或杂交。
术语“筛检”是指确定所关注的某物(例如分析物、事件等)的存在。本文所用的术语“测定”是指鉴定(即确立、确定、评价或测量)所关注的特定参数(例如杂交参数)的值。该值的测定可为定性的(例如存在或不存在)或定量的，其中定量测定可为相对的(即值的单位与对照值(即参考值)相关)或绝对的(例如，测定实际分子数量)。
本文所用的术语“样品”是指流体组合物，其中在某些实施方案中，该流体组合物为含水组合物。
具体实施方案的描述
本发明提供了稳定的金属/导电聚合物复合物胶体及其制造方法。本发明胶体用于包括分析物检测应用的各种不同应用中。本发明还提供了包含本发明胶体的试剂盒。
在更详细地描述本发明之前，应该理解的是，本发明不限于所描述的特定实施方案，因而其理所当然可以变化。还应该理解的是，本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的，且并不是意图限制本发明的范围，因为本发明的范围仅由附加权利要求书来限制。
如果提供一定范围的值，那么应该理解，在该范围的上下限和所述范围中的任何其他所述值或中间值之间的每个中间值(精确到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确说明)都包含在本发明之内。这些更小范围的上下限可独立地包含在该更小的范围内并且也包括在本发明之内，除非是所述范围内任何具体排除的限值。当所述范围包括一个限值或同时包括两个限值，那么排除那些所包括的限值中任一个限值或同时两个限值的范围也包括在本发明之内。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的实施或测试中还可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，现描述代表性的说明性方法和材料。
本说明书中所引用的所有公开案和专利都以引用的方式结合到本文中来，仿佛已具体且个别地指出每个个别公开案或专利是以引用的方式结合一样，并且将其以引用的方式结合到本文中以公开和描述与所引用公开案有关的方法和/或材料。任何公开案的引用都是在申请日期前的公开内容，不应解释为承认本发明无权先于这样的公开而成为先有发明。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立证实。
还应该注意到，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所用的“一个”、“一种”和“这种”包括多个、多种。还应注意到，可撰写权利要求书以排除任何任选的要素。因而，这种叙述旨在作为先行基础以便使用与陈述所要求要素有关的那些排他性术语，如“只”“仅仅”等等，或使用“负面”限制。
如本领域的技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的，本文所描述和说明的每一个别实施方案具有分立的构成部分和特征，其可在不脱离本发明的范围和精神的情况下容易地与其他几个实施方案中任何特征分开或组合。任何所述方法都可按所述事件的次序或以逻辑上可能的任何其他次序进行。
如上概述，本发明提供了稳定的金属/导电聚合物复合物胶体及其制造和使用方法。在进一步描述本发明的过程中，首先更详细地评述了本发明胶体的代表性实施方案，接着讨论了代表性制造方案和使用本发明胶体的方法。另外，提供了对包含本发明胶体的代表性试剂盒的评述。
金属/导电聚合物复合物胶体
如上概述，本发明提供了金属/导电聚合物复合物胶体。本发明胶体的特征是它是稳定的。本文所用的术语稳定是指胶体颗粒在胶体的载体介质中保持悬浮的能力，例如颗粒不以任何显著的程度从悬浮液中沉淀出。就本发明胶体而论，当保持在STP条件下，胶体稳定至少约1个月之久，例如至少约3个约之久，包括至少约6个约之久的时间，且在代表性实施方案中，胶体稳定长达一年或更久，例如长达两年或更久，包括长达5年或更久的时间。
因为本发明胶体为金属和导电聚合物的复合物，所有它们包括金属组分和导电聚合物组分两者。在代表性实施方案中，本发明胶体的金属组分为贵金属。如上所指出，所关注的贵金属包括但不限于：周期表第VIII族金属，包括但不限于：铂、铱、钯等等，以及金、银等。
术语“导电聚合物”是指导电聚合材料。在代表性实施方案中，导电聚合物为有机聚合物，例如p-共轭有机聚合物。例如，可使用聚吡咯类，例如聚吡咯、聚(N-取代的吡咯)、聚(3-取代的吡咯)和聚(3，4-二取代的吡咯)；聚噻吩类，例如聚噻吩、聚(3-取代的噻吩)、聚(3，4-二取代的噻吩)和聚苯并噻吩；聚异硫茚类，例如聚异硫茚；聚亚噻吩基亚乙烯基类，例如聚亚噻吩基亚乙烯基；聚(对亚苯基亚乙烯基)类，例如聚(对亚苯基亚乙烯基)；聚苯胺类，例如聚苯胺、聚(N-取代的苯胺)、聚(3-取代的苯胺)和聚(2，3-取代的苯胺)；聚乙炔类，例如聚乙炔；聚二乙炔类，例如聚二乙炔；聚甘菊环类，例如聚甘菊环；聚芘类，例如聚芘；聚咔唑类，例如聚咔唑和聚(N-取代的咔唑)；聚哂吩类，例如聚哂吩；聚呋喃类，例如聚呋喃和聚苯并呋喃；聚(对亚苯基)类，例如聚(对亚苯基)；聚吲哚类，例如聚吲哚；聚哒嗪类，例如聚哒嗪；多并苯类，例如萘并萘、并五苯、并六苯、并七苯、二苯并五苯、四苯并五苯、芘、二苯并芘、(chrysene)、二萘嵌苯、六苯并苯、涤纶、卵苯、quoterylene和循环蒽(circumanthracene)；衍生物(例如三苯并二嗪、三苯并二噻嗪、并六苯-6，15-醌)，其通过用例如N、S和O的原子或例如羰基的官能团取代多并苯的一些碳原子来制备；聚合物，例如聚乙烯咔唑、聚苯硫醚和聚乙烯硫醚。在代表性实施方案中，尤其受关注的是聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺或其衍生物。在代表性实施方案中，聚合物为水溶性导电聚合物。在某些实施方案中，该水溶性导电聚合物为取代的有机导电聚合物，其中该聚合物包含可离子化的基团。可离子化的基团是指在适当pH下能够携带净正电荷或负电荷的基团。所关注的可离子化的基团包括但不限于：羧基、氨基等。在某些实施方案中，水溶性导电聚合物为取代的聚苯胺，例如被可离子化的基团(例如羧基)取代的聚苯胺，例如聚(苯胺-2-羧酸)。
在本发明胶体中，金属颗粒用导电聚合物进行表面包覆且悬浮于液体介质，通常为含水介质中。“表面包覆”是指如果不是颗粒的整个表面，至少也是颗粒的部分表面被导电聚合物分子层所覆盖。在代表性实施方案中，导电聚合物的层或涂层可为单层，以使单层聚合物分子覆盖颗粒表面。
颗粒的尺寸可以变化，但在代表性实施方案中，颗粒尺寸为约1纳米到约1微米，例如约1nm到约100nm，包括约30nm到约60nm。在代表性实施方案中，颗粒具有窄粒度分布。窄粒度分布是指颗粒的标准偏差不超过平均直径的约30％，并且在某些代表性实施方案中，不超过平均直径的约20％，例如不超过平均直径的约17％，包括不超过平均直径的约10％。
就本发明复合物的聚合物组成而论，聚合物组分的平均分子量为约1,500Da到约32,000Da，例如约5,000Da到约7,000Da，包括约23,000Da到约27,000Da。该聚合物组成的进一步的特征为尺寸分散度窄，以使吸附到颗粒表面上的聚合物分子中至少约45％数量，尤其是至少约25％数量的聚合物分子的分子量为吸附到该表面上的所有分子的平均分子量的至少约55％，例如至少约75％。
由于以上与窄粒度分布和窄尺寸分散度有关的特征，胶体就其聚合物包覆颗粒而论为同质的或均匀的。
胶体的密度可以变化，但在代表性实施方案中，与20℃下水的密度相比，范围为至少约1.01，例如至少约1.05，并且可高达1.30或更高，其中，该密度可为约1.07到约1.10，例如约1.085到约1.095。
在本发明胶体中颗粒在液体介质中的浓度可以变化，但在某些实施方案中，范围为约1×1010到约1×1015个颗粒/毫升，例如约1×1011到约5×1011个颗粒/毫升，包括约2×1011到约3.75×1011个颗粒/毫升。
在某些实施方案中，金属组分和导电聚合物组分就光学参数(例如吸光度)而论相匹配。在代表性实施方案中，金属组分和导电聚合物组分当在以下实验部分中使用以下所述的方案单独测定时，最大吸收波长的差异小于约50nm，例如小于约40nm，包括小于约25nm。“共同的”最大吸收波长(即两个单独的最大吸收波长的平均值)可以变化，范围为约1到约10，例如约3到约4。所关注的代表性相匹配的金属/导电聚合物对包括但不限于：金/聚苯胺类(例如金/聚(苯胺-2-羧酸))；银/聚(噻吩-3-羧酸)；等等。
在某些实施方案中，与由未用导电聚合物包覆的金属颗粒制成的对照胶体相比，复合物胶体对颗粒悬浮于其中的液体介质的折射率的变化更灵敏。更灵敏是指，用以下实验部分所报道的检验方法测定，与对照相比，至少更灵敏约10倍，例如至少更灵敏约100倍，包括至少更灵敏约1,000倍。
在某些实施方案中，颗粒在其表面上展现配体，例如那些与所关注的分析物、治疗部分等特异性结合的配体。展现是指该配体固定在颗粒表面上，其中配体可与颗粒表面共价或非共价结合。颗粒表面上配体的密度可以变化，但范围可为约2到约50个分子/颗粒，例如约5到约25个分子/颗粒。
如上所指出，在胶体的颗粒表面上可展现各种不同类型的配体。在某些实施方案中，存在的特定配体取决于特定应用(例如下文所述的分析物检测应用)中将被该配体结合的分析物的性质。所关注的代表性配体包括但不限于以上讨论的配体，例如核酸、肽等。
胶体的pH可以变化，在代表性实施方案中，范围为约2到约12，例如约4.5到约9.0。胶体可包含除聚合物包覆的金属颗粒以外的许多不同的其他组分，其中所关注的其他组分包括但不限于：盐、缓冲剂、清洁剂、稳定剂等等。
在某些代表性实施方案中，胶体基本不含未被吸附的聚合物，也就是说，胶体的液体组分仅有少量(如果有)游离聚合物存在于其中。因而，胶体的液体介质溶液中的游离聚合物(如果存在，以总体计)的浓度不超过所用量的约5％，且更详细来说不超过所用量的约1％。
制造方法
例如，如上所述，本发明胶体可使用导致本发明胶体产生的任何简便的方案来制备。在代表性实施方案中，将最初和前体金属胶体与水溶性导电聚合物以足以使水溶性导电聚合物吸附到金属胶体的颗粒表面上从而产生本发明的复合物胶体产物的方式彼此混合。
在代表性实施方案中，将第一体积的金属胶体与第二体积的水溶性聚合物溶液合并。胶体与聚合物溶液的体积比可以变化，但在某些实施方案中，该比率为约100到约1，例如约50到约20，包括约10到约5。在某些实施方案中，通过将所述体积的胶体引入该聚合物溶液中，将胶体和溶液聚合物合并。在其他实施方案中，通过将所述体积的聚合物溶液引入胶体中，使胶体和溶液聚合物合并。在某些实施方案中，这些体积的合并利用搅拌完成，例如通过搅拌一种流体，同时向其中加入另一种流体；通过在合并这些体积的同时，使这些流体在其中合并的容器运动(例如摇动)等。
在代表性实施方案中，与水溶性聚合物混合的金属胶体为悬浮在含水液体介质中的贵金属的金属胶体。在代表性实施方案中，胶体就金属颗粒的性质而论为均匀的，其中颗粒的平均直径为约2nm到约1μm，例如约3nm到约60nm，包括约5nm到约30nm，并且颗粒具有如上所述的窄粒度分布。在代表性实施方案中，介质中颗粒的密度为约1.01到约1.30，例如约1.02到约1.10。在某些实施方案中，选择胶体的pH以保证胶体的金属颗粒具有带负电的表面，其中该pH可为约2到约12，包括约1到约10，例如约3到约5。
在代表性实施方案中，水溶性聚合物溶液为如上所述的水溶性导电聚合物的溶液，其中溶液中聚合物的浓度可为约0.02到约2g/100ml，例如约0.02到约0.5g/100ml，包括约0.2到约0.3g/100ml。在代表性实施方案中，聚合物的平均分子量为约1,500Da到约32,000Da，例如约5,000Da到约7,000Da，且该聚合物具有窄尺寸分散度，其中存在于溶液中的聚合物中，至少约55％，例如至少约75％的聚合物的分子量为该平均分子量的至少约90％到约110％，例如至少95％到约105％。在某些实施方案中，选择水溶性聚合物溶液的pH，以使水溶性聚合物带正电荷，其中在代表性实施方案中，该pH可为约2到约7，例如约3到约5。
在某些实施方案中，金属胶体和水溶性聚合物溶液的体积以及其结合于本发明该步骤中的参数(例如密度、pH、浓度等)已经预先确定，以制备出稳定且基本不含溶液相聚合物的复合物胶体产物，其中“基本不含”是指溶液相聚合物的浓度小于约5％，例如小于约1％。这些实施方案的特征在于该产物胶体的制备没有任何洗涤步骤和其他从胶体中除去溶液相聚合物的步骤。实施本发明方法的这些实施方案的适当体积和参数可使用以下实验部分中所讨论的方案来确定。
在混合金属胶体和水溶性聚合物的过程中，将两种组分混合成反应混合物，且使所得反应混合物维持足以产生所需胶体的一段时间。通常，使反应混合物在约15℃到约30℃，例如约18℃到约22℃下维持约5分钟到约60分钟，例如约10分钟到约20分钟。
在某些实施方案中，这些方法还可进一步包括修饰胶体的复合物颗粒的表面，以展现配体(例如与所关注的分析物特异性结合的配体)的步骤。如果需要，可使用任何简便的方案直接或间接地(例如经连接基团)将配体固定在颗粒的表面上，该方案包括使配体共价结合或非共价结合到颗粒上的方案，例如直接结合到金属组分上，或者例如通过与聚合物上存在的官能团反应而结合到颗粒表面上存在的聚合物上。配体可为许多不同类型分子中的任一种，例如以上评述的核酸、肽、有机和无机小分子等等。如上所指出，如果需要，可搅拌反应混合物。
效用
如上所述，本发明胶体可用于各种不同应用中。例如，本发明胶体可用来针对样品中一种或多种目标分析物的存在或不存在筛选样品。因而，本发明提供了检测样品中一种或多种目标分析物是否存在的方法。
在这类应用中，使一定体积的胶体(例如包含分析物特异性配体的胶体)与欲筛选的样品接触，且监测胶体的光学参数以检测其中的变化，例如在给定波长下胶体吸光度的变化。在这个步骤中，可评估或监测任何简便的光学参数，其中代表性参数包括但不限于：吸收、散射、荧光、发光等等。光学参数可使用任何简便的装置和方案监测，其中合适的方案为本领域的技术人员所公知，代表性方案在以下实验部分中更详细地描述。随后将光学参数有或没有变化用以确定所关注的分析物是否存在于样品中。
在最广泛意义上讲，这些方法可为定性的或定量的。因而，如果检测是定性的，那么这些方法提供了目标分析物是否存在于所检验样品中的判读或评价(例如评估)。在其他实施方案中，这些方法提供了目标分析物是否存在于所检验样品中的定量检测，即在所检验的样品中目标分析物的实际量的评价或评估。在这类实施方案中，定量检测可为绝对的，或者如果该方法为检测样品中的两种或多种不同目标分析物的方法，那么定量检测为相对的。因而，当在量化样品中的目标分析物的上下文中使用时，术语“量化”可以指绝对或相对的量化。可通过包含已知浓度的一种或多种对照分析物，并用已知的对照分析物作为目标分析物检测含量的参照(例如通过标准曲线的生成)，从而完成绝对量化。或者，可通过比较两种或多种不同目标分析物的检测含量或量，以提供两种或多种不同分析物中每一种(例如相对于彼此)的相对量化，从而完成相对量化。
本发明方法可用来检测在各种不同类型的样品中一种或多种目标分析物的存在，这些样品包括具有大量非目标实体的复杂样品，其中，本发明方法提供目标分析物的高灵敏度检测。因而，本发明方法为在简单或复杂样品中检测一种或多种目标分析物的高灵敏度方法。在某些实施方案中，在本发明方法中检验的样品来自生理学来源。生理学来源可为真核的或原核的，所关注的生理学来源包括源于单细胞生物体(例如细菌或酵母)和多细胞生物体(包括植物和动物，尤其是哺乳动物)的来源，其中来自多细胞生物体的生理学来源可源于多细胞生物体的特定器官或组织，或源于所述器官或组织的分离的细胞或亚细胞/细胞外部分。
本发明的方法可用来检测多种分析物。所关注的分析物可以液体、固体或气体形式存在(例如有机磷酸酯等)。所关注的分析物可为蛋白分子，例如但不限于蛋白分析物，包括肽和蛋白质及其片段，以及朊病毒及其他蛋白类分析物，其中该分析物可为单一分子；包括两个或多个分子亚单位的复合物，这些分子亚单位可能是彼此共价结合的，也可能不是；微生物，例如病毒或单细胞病原体；细胞；多细胞生物体或其部分；等等。
另外，本发明方法还可用于筛选调节给定的特异性结合成员对相互作用的化合物。术语“调节”包括降低(例如抑制)和提高两种分子之间的相互作用。例如，当胶体展现结合对的第一成员，并且使胶体在候选物质存在下与第二成员接触时，可以评价或评估候选物质对结合成员对相互作用的影响。
各种不同的候选物质可通过以上方法筛选。候选物质涵盖许多化学类别，但是其通常为有机分子，优选分子量大于50且小于约2,500道尔顿的小有机化合物。候选物质包含结构上与蛋白质相互作用，特别是与氢结合所必需的官能团，且通常包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。候选物质经常包括被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。候选物质还见于生物分子中，包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤类、嘧啶类以及他们的衍生物、结构类似物或组合。
候选物质得自多种来源，包括合成化合物或天然化合物库。例如，有许多随机合成和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。或者，可以得到或容易制备细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库。另外，天然或合成产生的库和化合物可通过常规的化学、物理和生物化学方式容易地修饰，并且可用来制备组合的库。已知的药理学物质可经受定向或随机的化学修饰，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。
在以上筛选检验中所鉴定的物质可用于多种方法，包括调节目标分析物活性，和目标分析物存在和/或活性相关条件的方法。
本发明胶体的其他应用包括治疗应用，例如作为药物传送载体。例如，治疗物质可展现在纳米颗粒表面上，并且给予患者有效量的由纳米颗粒构成的胶体，以治疗患者。如果需要，可进一步修饰胶体的纳米颗粒以包含靶向部分，例如将纳米颗粒引向所需位置的部分。
试剂盒和体系
如上所概述，还提供了用于实施本发明方法的试剂盒和体系。试剂盒和体系至少包含如上所述的本发明胶体或其组分。试剂盒和体系还可包含用于本发明方法中的许多任选组分。所关注的任选组分包括缓冲剂等等。
在本发明试剂盒的某些实施方案中，试剂盒还将进一步包含实施本发明方法的说明或得到这些说明的方式(例如指引使用者找到提供这些说明的网页的网址URL)，其中这些说明通常印刷在基体上，该基体可为以下的一种或多种：包装说明书、包装、试剂容器等等。在本发明试剂盒中，从方便或理想的角度出发，所述一种或多种组分存在于相同容器或不同容器中。
以下实施例是以说明而不是限制的方式提供。
实验
以下描述了制备聚(苯胺)-胶体金纳米颗粒的方法，且报道了所合成材料的光电特性。
I.合成
A.合成水溶性聚(苯胺-2-羧酸)(PANI-COOH)。
该合成是用氯化铁氧化水溶液中的单体，详细方法先前已有描述(Englebienne，P.，Weiland，M.，Water-soluble conductive polymerhomogeneous immunoassay(SOPHIA)，a novel immunoassay capable ofautomation(水溶性导电聚合物均相免疫测定(SOPHIA)，一种能够自动化操作的新免疫测定)，J.Immunol.Methods，1996，191，159-170；Englebienne，P.，Weiland，M.，Synthesis of water-soluble carboxylic andacetic acid-substituted poly(thiophenes)and application of theirphotochemical properties in homogeneous competitive immunoassays(水溶性的羧酸和乙酸取代的聚(噻吩)类的合成及其光化学性质在均相竞争性免疫测定中的应用)，Chem.Commun.，1996，1651-1652；Englebienne，P.，Indicator reagents for the detection or dosage of ananalyte，kits containing them and detection or dosage procedures(用于检测或定量分析物的指示剂，包含这些指示剂的试剂盒和检测或定量方法)，欧洲专利0623 822，1994)。聚(噻吩)类也可由相同方法得到，但是氧化除使用氯化铁外还使用过氧焦硫酸铵。在合成的最后，为了使氯化铁以氢氧化物形式沉淀并且分解过氧焦硫酸盐(peroxydisulfate)，用NaOH颗粒使pH升高到12。过滤除去氢氧化铁，且就此使用聚合物溶液。在本实施例中，通过两种方式提高了合成产率：提高了单体在二甲基甲酰胺∶水(1∶10)中的溶解性；和利用加热和回流，在搅拌下进行聚合。
如图1所示的凝胶渗透(GP)色谱图所示，聚合的聚(噻吩-3-羧酸)溶液和PANI-COOH溶液相当均匀，主峰大小分别大约为18,000道尔顿(20.5min)和6,000道尔顿(24min)处，且次峰大小分别为大约25,000道尔顿(19min)和15,000道尔顿(21min)处。对于PANI-COOH来说，这样的大小分别对应于由45个重复单元和110个重复单元构成的低聚物。请注意，这些值不是绝对值，因为色谱柱是用球状蛋白质校准的，而聚合物的形状不一定为球状。
色谱分析条件：
HPLC柱：TSK 2000SW，7.5×600mm。
洗脱：50mM磷酸盐pH 7.4。
流速：1ml/min。
进样量：50μl。
检测：O.D.254nm，0.5 AUFS。
走纸速度：1mm/min。
B.合成胶体金纳米颗粒。
纳米颗粒通过由柠檬酸钠还原沸腾的四氯金酸(hydrogentetrachloroaurate)溶液得到。该方法是公知的并且描述于以下出版物中(Englebienne，P.，Van Hoonacker，A.，Verhas，M.，High throughputscreening using the surface plasmon resonance effect of colloidal gold(利用胶体金的表面等离激元共振效应的高通量筛选)，Analyst，2001，126，1645-1651)。用以得到各种大小的纳米颗粒的详细方法在以上参考的书中提供。本发明所用的纳米颗粒具有大约50nm的直径，且为均匀分散的。
C.合成复合聚(苯胺-2-羧酸盐)-胶体金纳米颗粒。
胶体贵金属纳米颗粒在很宽的pH范围内带负电荷。用蛋白质包覆这类纳米颗粒所用的方法利用了这种性质。将纳米颗粒与蛋白质在低于蛋白质pI的pH下混合，且蛋白质通过电荷相互作用吸附在颗粒表面上。这类蛋白质包覆颗粒是稳定的并且在高盐浓度下不絮凝。常用方法涉及将过量蛋白质加到金中，从而避免由蛋白质分子在个别纳米颗粒之间形成桥。蛋白质吸附之后，离心纳米颗粒，并且洗涤以除去过量的蛋白质。随后将胶体再悬浮于合适的缓冲液中。在之前几年中，我们开发了一种明显简化该方法的工艺，它描述于我们的书和以上参考的我们的J.Mater.Chem.出版物中。原理是，在合适的pH下使金胶体与浓度渐增的蛋白质在试管中混合。混合之后，加入1M NaCl溶液。在管中，具有蛋白质层的颗粒未完全稳定化，纳米颗粒絮凝，这使得其可见光吸收光谱强烈红移，天然表面等离激元共振(SPR)峰从520nm(金)移到600-800nm，导致在SPR峰O.D.值下降。因此，由光谱数据和加到金胶体中的蛋白质的浓度构成的结合等温线可用以确定使金溶胶完全稳定化所需的最小蛋白质浓度，换句话说，用完整的蛋白质层包覆各个纳米颗粒所需的蛋白质浓度。随后，将该工艺按比例放大以用于大量制备。
在本发明中，我们推断，沿主链被可离子化基团取代的水溶性导电聚合物可以完全相同的方式实现。例如，对于PANI-COOH来说，我们认为在低pH下，所有羧基都将质子化并且将因此能够通过电荷吸附包覆胶体金纳米颗粒，产生稳定的胶体复合物。为了验证该假设，我们首先检验pH对PANI-COOH稳定胶体金纳米颗粒的可能性的影响。
所用方案如下。向一系列包含0.01ml PANI-COOH溶液的塑料管中，用正排量(positive)移液管快速注入1ml胶体金溶液并且立即涡旋混合该管。分别用10mM碳酸钠溶液或300mM HCl溶液将加到每个独立管中的胶体金溶液的pH调整到各种值。随后，将0.5ml 1M氯化钠溶液加到每个管中，将该管进一步涡旋混合，以便使不稳定的颗粒絮凝。记录每一溶液的紫外可见光谱。记录峰值波长和在最大(SPR)波长下的吸光度，并且对pH绘图。结果见图2。
如图2所示，金胶体的SPR峰值波长随pH 2到5的变化逐渐红移，即从550nm到660nm，随后在pH高于5时快速降回到560nm。峰值处的O.D.在pH约为3时显示最大值，且在pH高于5时快速降到一半。在pH高于5时SPR峰值处的低O.D.表明，絮凝使得大部分颗粒在试管底部沉淀。观察到的稳定的最大波长和O.D与保留在上清液中的可溶性PANI-COOH相对应。在pH低于5时，颗粒可能在pH最佳接近于3时稳定。这第一项实验使我们推断，水溶性PANI-COOH能稳定金纳米颗粒，即使浓度不是最佳的。十分受人关注的是，这些结果还与显示两种pKa值(分别为2.10和4.94)的单体得到的离子化数据一致(Handbook of Chemistry and Physics，CRCPress)。因此，在第一pKa值附近，分子质子化并且能够通过电荷吸附稳定金颗粒，而在第二pKa值以上，由于金和PANI-COOH的负电荷而产生的排斥作用，让所加入的盐使颗粒桥接和絮凝。
一旦确定了稳定颗粒的最佳pH值，就必须确定稳定颗粒所需的最小PANI-COOH浓度。使用以下方案进行该最佳化。向各个塑料管中加入渐增体积的PANI-COOH溶液(从0.001ml直至0.1ml)。通过加入适当体积的蒸馏水，将每个管中的体积调整到0.1ml。混合后，使用正排量移液管将1ml胶体金溶液(所述胶体金溶液的pH值已用300mM的HCl调至2.38)快速注入各管中，并且立即涡旋混合每个管。随后，将0.5ml 1M氯化钠溶液加到每个管中，再将管涡旋混合，以便絮凝未稳定化的颗粒。记录每一溶液的紫外可见光谱。记录最大吸收波长以及在750nm(代表胶体絮凝)下的光密度(O.D.)。结果见(图3)曲线。金和PANI-COOH溶液的最大吸收波长在图中分别由下空心三角形和上空心三角形表示。
图3所示的数据表明，每毫升溶胶用0.01-0.02ml PANI-COOH保温处理之后，金颗粒被稳定化(最小波长和O.D.750nm)。这些结论由图4所示的数据进一步证实。在此，将SPR峰值处的O.D.以及峰值波长相对于所加PANI-COOH溶液体积的对数值作图。由于将渐增体积的PANI-COOH加到金中，并且假设PANI-COOH在接近于金胶体的吸收波长(560nm)的波长下吸收，所以将SPR波长下各体积的PANI-COOH对O.D.的贡献从所绘数据中减去。如图所示，PANI-COOH所加体积为0.01-0.02ml时，观察到金的SPR峰值处的最大O.D.。
用这些已掌握的最佳化数据，将该方法按比例扩大到较大体积。如下成功地制备批量复合材料。在包含磁力搅拌棒的烧杯中，将如上所述合成的PANI-COOH溶液(1.5ml)用8.5ml蒸馏水稀释。在单独容器中，在磁力搅拌下使用300mM HCl将100ml如上所述合成的胶体金溶液的pH调至2.94。将PANI-COOH溶液置于磁力搅拌器上并且以最高速度混合。随后将已调整pH的金溶液快速加到PANI-COOH溶液中。混合后，混合物的pH为4.67。通过加入0.5％吐温20而使复合溶胶进一步稳定化。随后将批料分成两等份，第一份用50mM乙酸钠在pH 4.95下缓冲，另一份用50mM硼酸钠在pH 9下缓冲。重要的是，注意在该方法中逆转试剂混合的顺序同样可行。
II.材料的物理化学特性
A.基本结果
在制备由导电聚合物和贵金属的胶体纳米颗粒制成的复合材料的过程中，我们关注的主要是分别采用的两种材料的光电性质的可能的改变。这些材料对于其物理环境的各种改变的灵敏度由其电子光谱的改变反映。因此，为了能观察到所考虑的复合材料的光谱的一致性改变，非常理想的是考虑天然材料，这些材料以其天然状态被采用，呈现类似的光吸收能量。这就是我们选择胶体金和PANI-COOH的理由。金纳米胶体(直径为50nm的颗粒悬浮于水中)的可见光谱在520nm处呈现局部化的SPR吸收带(见图5)。一致地，PAINI-COOH水溶液的可见光谱在560nm处呈现吸收带。最初的金、PANI-COOH的可见光谱，和金与PANI-COOH组合得到的复合材料的可见光谱见图5。如所预期，复合材料光谱的特征是由用于制备该复合材料的最初材料的那些光谱特征相加而得。
B.稳定性。
图6比较了合成后复合材料的可见光吸收光谱和超过3个月后复合材料的可见光吸收光谱。最大吸收波长相同，且在此波长下吸光度没有发现显著损失。复合物可能在储存期间成熟，因为在后一时间得到的光谱中，吸收峰更均匀。
另外，制备后经过超过3个月的时间，没有观察到沉淀。复合材料不管是在酸性pH下还是在碱性pH下都为稳定的胶体溶液。在那一方面，在相同材料浓度和pH的条件下比较，肉眼基本上不能将复合材料胶体与胶体金对照溶液及PANI-COOH对照溶液相区别。
C.对于氧化还原的反应性。
C.1.pH灵敏度。
众所周知导电聚合物对于pH的改变灵敏。对于电子结构随pH改变的聚(苯胺)来说，尤其如此。通过使不导电的无色苯胺绿(leucoemeraldine)质子化成为导电的苯胺绿(emeraldine)的逐渐p掺杂(氧化)，引起高能光子(343nm，3.61eV)吸收向更高能光子(330nm，3.75eV)吸收和更低能光子(637nm，1.94eV)吸收转移。进一步的氧化产生绝缘的完全醌构型的全苯胺黑(pernigraniline)。在逐渐质子化时，PANI-COOH溶液对光的表现类似(参看，例如Englebienne，P.Synthetic materials capable of reporting biomolecular recognition eventsby chromic transition.(能够通过铬跃迁反映生物分子识别事件的合成材料。)J.Mater.Chem.，1999，9，1043-1054)。因此，在第一种情况下令人关注的是，检验复合材料是否还能够通过其紫外可见光谱的类似改变反映出由于质子化而发生在聚合物结构中的结构改变。为了这个目的，我们比较了在pH 4.95下缓冲的复合物的电子光谱和在pH9下缓冲的溶液的电子光谱。为了进行对比，我们制备了制备复合物所用浓度的PANI-COOH缓冲溶液，并且调整pH到其各自相同值。当比较处于各自pH下的两种材料的光谱时，我们观察到的确有所预期的改变。导电聚合物和复合物的波长迁移相同，且对于复合物和简单聚合物而言，吸光度改变的重要性类似。为了说明这些改变，我们记录了pH 4.95下的材料和pH 9下的材料(参比池)之间的差异光谱。这些差异光谱见图7。对于复合物(实线)和天然的导电聚合物(虚线)来说，在高能量光子(380nm和420nm)和低能量光子(680nm)下质子化材料的新谱带的出现相同。聚合物在580nm处的负峰在复合物光谱中向更短波长(即金SPR峰的区域中)迁移。这些结果可能产生自金属表面上传导电子能量的改变。
C.2.对于还原的反应。
水溶性PANI-COOH的另一个令人关注的特征为材料对于氧化还原的光子灵敏度，不溶性聚(苯胺)也享有该特征。苯胺绿盐氧化态的质子化和改变产生显著的光谱跃迁(Grummt，U.-W.等，Anal ChIm.Acta 1997，547，253)。最近将该性质用于抗坏血酸的高灵敏度检验，其中，使用沉积在微量滴定板中的聚(苯胺)薄膜(Bosi，A.等，Anal.Chem.2000，72，4296)。在与现用的分析技术比较时，这种新的检验呈现若干显著的优势，因为其使用较小的样品体积，这种新检验方法表现出较低的检测限，并且证明在较宽的分析物浓度范围内可重现。
为了比较复合纳米材料与PANI-COOH的氧化还原灵敏度，我们用渐增浓度的抗坏血酸(0.9-500mg/l)在不同pH值下保温处理两种材料，并且记录对比缺少还原剂的混合物的差异光谱。无论pH为多少，两种材料在600nm下吸光度的逐渐减小，反映出两种材料的还原。与以前微量滴定板检验报道的结果一致，我们观察到在pH值低于4时，两种材料在600nm下的吸收强度改变最大。然而，对于还原，复合纳米材料表现出比水溶性PANI-COOH更强的光学反应性。
为了进一步证明差异，我们设计了对于溶液中抗坏血酸的简单检验，其根据之前描述的方法，但使用水溶液中的试剂而不是固态膜。如图8所示(上方曲线)，由剂量-反应曲线的误差棒可见，在抗坏血酸存在的情况下，PANI-COOH的光学测量结果的重现性相当差。这很可能是由于在低pH值下PANI-COOH溶解度逐渐损失造成的。相反，如图8所示(下方曲线)，复合纳米材料对于抗坏血酸还原的光学反应可高度重现，并且剂量-反应曲线陡峭得多。对于PANI-COOH，20mg.l抗坏血酸剂量引起的吸光度的改变(0.076 AU)与在微量滴定板检验中所观察到的吸光度的改变(0.118 AU)[20]相当。然而，对于相同的分析物剂量，复合纳米材料的反应性高得多(0.22AU)。我们还比较了最低检测量(LDD)，LDD以各体系零反应标准偏差三倍衡量。对于PANI-COOH检验，计算的LDD为3.39mg/l，其接近于以前报道的微量滴定板检验的检测限。相比较来说，复合纳米材料灵敏60倍，计算的LDD为0.057mg/l。
伴有良好可重现性和溶液中线性的这样的高灵敏度，使得复合纳米材料成为需要在较低微摩尔范围内具有一定水平氧化还原灵敏度的优良的生物感应试剂。使用复合纳米材料的一些应用实例包括血浆抗氧化能力，和细胞过氧化物自由基的检测和定量。
D.对于介质折射率的反应性。
胶体金纳米颗粒溶液的局部化(localized)的SPR峰值对围绕颗粒的介质折射率的改变极其灵敏。该灵敏度使我们能够使用这种性质来测量包覆有抗体或受体的颗粒表面上发生的生物分子相互作用(Englebienne，P.，Van Hoonacker，A.，Verhas，M.Surface plasmonresonance：Principles，methods and applications in the biomedicalsciences.(表面等离激元共振：原理、方法和在生物医学科学中的应用。)Spectroscopy，2003，17，255-273；Englebienne，P.，Van Hoonacker，A.，Verhas，M.，Khlebtsov，N.G.Advances in high throughput screening：Biomolecular interaction monitoring in real-time with colloidal metalnanoparticles.(高通量筛选进展：用胶体金属纳米颗粒实时监测生物分子的相互作用。)Combin.Chem.High-Throughput Screen，2003，6，777-787)。
我们通常用甘油检验材料对于介质折射率的变化的反应性。将胶体溶液(0.5ml)与1.5ml分别含有0％、10％、20％、33.3％、50％、66.6％和100％甘油的水溶液混合。因此，介质中甘油的最终浓度分别为0％、7.5％、15％、25％、37.5％、50％和75％，甘油改变了介质的折射率，从水的折射率(1.3326)逐渐分别变为1.3418、1.3508、1.3637、1.3806、1.3968和1.4355。当金纳米颗粒经受这样的处理时，在520nm周围的局部化SPR峰稍微降低，并且该峰逐渐转移到较长波长，从550nm转移到700nm。这在图9中例示，图9显示了含有7.5％、25％、37.5％、50％和75％甘油的水溶液中的金溶胶相对于水中相同胶体的差异光谱。
因为在复合物中，金纳米颗粒被导电聚合物(PANI-COOH)层覆盖，所以可以改变乃至完全抑制这种新材料相应于纳米颗粒周围折射率的光电行为。因此，重要的是检查这种行为。在pH 9下缓冲的PANI-COOH-金复合物纳米颗粒相应于介质折射率改变的反应性通过图10所示的差异光谱例示。
引人关注的是，局部化SPR波长向较长波长的逐渐转移发生在低甘油浓度下，但是在较高浓度下，该波长逐渐减小，在更高光子能量激发(350nm，3.54eV)下出现了尖锐的强峰。在典型波长下吸光度的变化作为介质折射率变化的函数，见图11。
通常，低能量波长的峰随350nm下吸光度的一致且连续的增加而向较高能量波长逐渐转移。在渐增浓度的甘油存在的情况下，金纳米胶体与PANI-COOH溶液两者都不呈现这样的行为。复合材料的这种新行为最可能由聚合物的高能电子与金纳米颗粒表面上的导电电子的关联而产生。这在界面上产生了具有比金的导电电子能量更高的能量的集合振荡电子云。这种现象产生了复合材料在较短波长下的新SPR谱带，吸收高能量光子以产生比天然的金纳米颗粒出现的那些光子-等离激元衰逝波能量更高的光子-等离激元衰逝波。
引人关注的是，单层覆盖在石英板上的抗体包覆的金纳米颗粒和银纳米颗粒在与蛋白质抗原结合时，观察到了类似现象(Frederix，F.，Friedt，J.M.，Choi，K.H.，Laureyn，M.，Campitelli，A.，Mondelaers，D.，Maes，G.，Borghs，G.Biosensing based on light absorption of nanoscaledgold and silver nanoparticles.(基于纳米级金和银纳米颗粒的光吸收的生物感应。)Anal.Chem.，2003，75，6894-6900)。
由于这种改变的光电行为，复合材料在350nm下相对介质折射率变化的吸光度的变化，比金纳米颗粒在575nm下的同样的吸光度的变化大约灵敏4倍。这在图12中例示。
从以上讨论和结果明显可见，本发明提供可适用于多种应用的新材料和方法。
复合材料的制备包括使固定浓度的水溶性导电聚合物与金属纳米颗粒在合适的pH下混合。复合纳米材料在室温下在胶体缓冲溶液中可稳定数月。新复合纳米材料的光电性质对氧化还原和其周围介质的折射率的改变灵敏，且与单独的金纳米颗粒和导电聚合物的灵敏度相比，其灵敏度提高。与组成复合纳米材料的单独材料的光电性质相比，复合纳米材料提供了新的光电性质。
因而，在分析物检测应用中使用本发明胶体提供了相对于目前使用的敏感荧光染料或颗粒的优势，因为导电聚合物与胶体金属两者都不受限制其作为试剂的性能的光致漂白(即产生非荧光产物的不可逆的光化过程)或“闪烁”效应(即由于光致电离的间歇信号发射)的影响。本发明的检测体系在许多商业产品中得到应用，包括均相(竞争型或夹层型)免疫测定、高通量筛选、蛋白质阵列、实时的PCR产物检测和定量，以及杂交检测，以上为所列举的几个代表性应用的实例。因而，本发明代表了本领域的重大贡献。
尽管为了清楚理解起见已通过插图和实施例相当详细地描述了上述发明，但是本领域的普通技术人员根据本发明的教导易于了解，在不脱离附加权利要求书的精神或范围的情况下此外可得到某些变化和修改。
因此，上述内容仅仅说明本发明的原理。应了解，本领域的技术人员应能够想出各种方案，这些方案尽管在本文中没有明确描述或展示，但体现了本发明的原理，并且包括在本发明的精神和范围之内。
此外，本文所叙述的所有实施例和条件性措辞主要意图是帮助读者理解本发明的原理和发明者为推进本领域而提供的概念，并且应理解为不限于这些具体叙述的实施例和情况。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实施例的所有陈述涵盖其结构等效物和功能等效物两者。另外，意图使这些等效物包括目前已知的等效物和将来发展的等效物，即所开发的起相同作用的任何要素，无论其结构如何。因此，本发明的范围不限于本文所示和所述的示例性实施方案。更确切来说，本发明的范围和精神由附加权利要求书来体现。

Claims (82)

1.一种制备金属/导电聚合物复合物胶体的方法，所述方法包括：
合并：
(i)金属胶体；和
(ii)水溶性导电聚合物；
所述合并在足以使所述水溶性导电聚合物吸附到所述胶体的金属颗粒上，以产生金属/导电聚合物复合物胶体的条件下进行。
2.权利要求1的方法，其中所述金属胶体和所述水溶性导电聚合物在搅拌下合并。
3.权利要求2的方法，其中，通过将第一体积的所述金属胶体和第二水溶液体积的所述水溶性导电聚合物混合，使所述金属胶体和所述水溶性导电聚合物合并。
4.权利要求3的方法，其中，通过在搅拌所述第二体积的同时将所述第一体积引入所述第二体积，使所述金属胶体和所述水溶性导电聚合物合并。
5.权利要求3的方法，其中，通过在搅拌所述第一体积的同时将所述第二体积引入所述第一体积，使所述金属胶体和所述水溶性导电聚合物合并。
6.权利要求1的方法，其中所述金属胶体的金属颗粒和所述水溶性导电聚合物带相反电荷。
7.权利要求6的方法，其中所述金属颗粒带负电。
8.权利要求6的方法，其中，通过将第一体积的所述金属胶体和第二水溶液体积的所述水溶性导电聚合物混合，使所述金属胶体和所述水溶性导电聚合物合并。
9.权利要求8的方法，其中所述第一体积和第二体积分别具有所选择的pH值，以使所述金属颗粒与水溶性聚合物带相反电荷。
10.权利要求3的方法，其中所述第二体积中的水溶性导电聚合物浓度使所述金属/导电聚合物复合物胶体中基本不含游离的水溶性聚合物。
11.权利要求1的方法，所述方法进一步包括修饰所述金属/导电聚合物复合物胶体颗粒的表面，以展现配体。
12.权利要求11的方法，其中所述配体为核酸。
13.权利要求11的方法，其中所述配体为肽。
14.权利要求11的方法，其中所述配体为小分子。
15.权利要求14的方法，其中所述小分子为有机分子。
16.权利要求14的方法，其中所述小分子为无机分子。
17.权利要求11的方法，其中所述配体通过连接物与所述颗粒结合。
18.权利要求1的方法，其中所述金属胶体为贵金属的胶体。
19.权利要求18的方法，其中所述贵金属选自金和银。
20.权利要求19的方法，其中所述贵金属为金。
21.权利要求1的方法，其中所述水溶性导电聚合物为有机聚合物。
22.权利要求21的方法，其中所述有机聚合物包含可离子化的部分。
23.权利要求22的方法，其中所述可离子化的部分为羧酸部分。
24.权利要求1的方法，其中所述水溶性导电聚合物为取代的聚苯胺。
25.权利要求24的方法，其中所述取代的聚苯胺为聚(苯胺-2-羧酸)。
26.权利要求1的方法，其中所述金属胶体的密度为约1.01到约1.30。
27.权利要求1的方法，其中所述金属胶体包含直径为约1nm到约1μm的金属颗粒。
28.权利要求1的方法，其中所述金属胶体就其金属颗粒的大小而论为均质的。
29.权利要求3的方法，其中在所述第二体积中水溶性导电聚合物的浓度为约0.02g/100ml到约2g/100ml。
30.权利要求29的方法，其中所述第二体积的所述水溶性导电聚合物的平均分子量为约1,500Da到约32,000Da。
31.权利要求30的方法，其中所述第二体积就所述水溶性导电聚合物而论为均质的。
32.一种根据权利要求1的方法制备的金属/导电聚合物复合物胶体。
33.一种稳定的金属/导电聚合物复合物胶体，所述胶体包含表面包覆有导电聚合物层，且悬浮于水性介质中的金属颗粒。
34.权利要求33的复合物胶体，其中所述胶体就所述聚合物包覆的颗粒而论为均匀的。
35.权利要求33的复合物胶体，其中所述导电聚合物层为吸附到所述金属颗粒表面上的聚合物分子单层。
36.权利要求33的复合物胶体，其中所述金属颗粒的直径为约2nm到约1,200nm。
37.权利要求36的复合物胶体，其中所述胶体的颗粒密度为约1.01到约1.30。
38.权利要求33的复合物胶体，其中所述金属颗粒和导电聚合物在至少一种光学性质方面相匹配。
39.权利要求38的复合物胶体，其中所述光学性质为最大吸收波长。
40.权利要求33的复合物胶体，所述复合物胶体与包含未用所述导电聚合物包覆的所述金属颗粒的对照胶体相比，对所述介质的折射率的变化更灵敏。
41.权利要求33的复合物胶体，其中所述金属颗粒包括贵金属。
42.权利要求33的复合物胶体，其中所述贵金属选自金和银。
43.权利要求33的复合物胶体，其中所述导电聚合物为有机聚合物。
44.权利要求43的复合物胶体，其中所述有机聚合物包含可离子化的部分。
45.权利要求44的复合物胶体，其中所述可离子化的部分为羧酸部分。
46.权利要求33的复合物胶体，其中所述导电聚合物为取代的聚苯胺。
47.权利要求46的复合物胶体，其中所述取代的聚苯胺为聚(苯胺-2-羧酸)。
48.权利要求33的复合物胶体，其中所述金属/导电聚合物复合物胶体的所述颗粒展现配体。
49.权利要求48的复合物胶体，其中所述配体为核酸。
50.权利要求48的复合物胶体，其中所述配体为肽。
51.权利要求48的方法，其中所述配体为小分子。
52.权利要求51的方法，其中所述小分子为有机分子。
53.权利要求51的方法，其中所述小分子为无机分子。
54.权利要求48的方法，其中所述配体通过连接物与所述颗粒结合。
55.一种稳定的金属/导电聚合物复合物胶体，所述胶体包含表面包覆有导电聚合物层，并且悬浮于水性介质中的金属颗粒，其中所述颗粒展现配体。
56.权利要求55的复合物胶体，其中所述胶体就所述聚合物包覆的颗粒而论为均匀的。
57.权利要求46的复合物胶体，其中所述导电聚合物层为吸附到所述金属颗粒表面上的聚合物分子单层。
58.权利要求55的复合物胶体，其中所述金属颗粒的直径为约1nm到约1,000nm。
59.权利要求58的复合物胶体，其中所述胶体的颗粒密度为约1.01到约1.30。
60.权利要求55的复合物胶体，其中所述金属颗粒和导电聚合物在至少一种光学性质方面相匹配。
61.权利要求60的复合物胶体，其中所述光学性质为最大吸收波长。
62.权利要求55的复合物胶体，所述复合物胶体与包含未用所述导电聚合物包覆的所述金属颗粒的对照胶体相比，对所述介质的折射率的变化更灵敏。
63.权利要求55的复合物胶体，其中所述金属颗粒包括贵金属。
64.权利要求55的复合物胶体，其中所述导电聚合物为有机聚合物。
65.权利要求64的复合物胶体，其中所述有机聚合物包含可离子化的部分。
66.权利要求65的复合物胶体，其中所述可离子化的部分为羧酸部分。
67.权利要求55的复合物胶体，其中所述导电聚合物为取代的聚苯胺。
68.权利要求61的复合物胶体，其中所述取代的聚苯胺为聚(苯胺-2-羧酸)。
69.权利要求55的复合物胶体，其中所述配体为核酸。
70.权利要求55的复合物胶体，其中所述配体为肽。
71.权利要求55的方法，其中所述配体为小分子。
72.权利要求71的方法，其中所述小分子为有机分子。
73.权利要求71的方法，其中所述小分子为无机分子。
74.权利要求55的方法，其中所述配体通过连接物与所述颗粒结合。
75.一种针对分析物是否存在筛选样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与稳定的金属/导电聚合物复合物胶体接触以制备检验混合物，其中所述胶体金属颗粒表面包覆有导电聚合物层，并且展现所述分析物的配体；和
(b)检测所述检验混合物的光学参数，以针对所述分析物是否存在筛选所述样品。
76.权利要求75的方法，其中所述方法为定性的。
77.权利要求75的方法，其中所述方法为定量的。
78.权利要求75的方法，其中所述分析物为核酸。
79.权利要求75的方法，其中所述分析物为肽。
80.权利要求75的方法，其中所述分析物为气态的分析物。
81.权利要求75的方法，其中所述光学参数为光吸收度的变化。
82.一种用于检测样品中分析物是否存在的试剂盒，所述试剂盒包含：
用以制备检验混合物的稳定的金属/导电聚合物复合物胶体，其中所述胶体金属颗粒表面包覆有导电聚合物层，并且展现所述分析物的配体。
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