CN101180389A - 采用哺乳动物细胞确立人胚胎干细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纯化的并具有某些谱系特异性状的人胚胎干细胞制剂。鉴定所述制剂是通过阳性表达下述多能细胞表面标记:SSEA-1(-)、SSEA-4(+)、TRA-1-60(+)、TRA-1-81(+)、碱性磷酸酶(+)、和一组ES细胞标记包括Oct-4、Nang、Rex1、Sox2、Thy1、FGF4、ABCG2、Dppa5、UTF1、Criptol、hTERT、间隙连接蛋白43和间隙连接蛋白45。所述制剂细胞对下述谱系特异标记是阴性的:角蛋白8、Sox-1、NFH(外胚层),MyoD、brachyury、心-肌动蛋白(中胚层),HNF-3β、白蛋白和PDX1(内胚层)。所述制剂的细胞是人胚胎干细胞,具有正常核型,显示高端粒酶活性且在连续传代培养超过40代后能够以未分化状态继续繁殖。胚胎干细胞系RelicellTMhES1在整个培养过程也保持这种能力,直到分化为细胞和组织类型,其衍生自所有三层胚胎生殖层(内胚层、中胚层和外胚层)。本发明也公开了分离人胚胎干细胞的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2005年5月17日提交的、申请号为595/MUM/2005的印度临时专利申请的优先权。
关于联邦政府赞助的研究或研发的申明
不适用
“缩微胶片附件”的引用
不适用
发明背景
1.发明领域
本发明涉及从剩余胚胎的内细胞团分离、维持和繁殖人胚胎干细胞(hESC)。本发明也涉及鉴定分离的人ES细胞系,从而验证其体外分化潜能及其在细胞治疗和药物筛选中的预期用途。
2.相关文献的描述
来自胚泡内细胞团的多能干细胞称作胚胎干细胞,而来自发育的生殖(腺)嵴原生殖细胞的干细胞称作胚胎干细胞(Shamblott等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(23):13726-31)。已经从哺乳动物胚泡的内细胞团(ICM)获得胚胎干(ES)细胞((Evans和Kaufman,(1981)Nature,292(5819):151-9;Martin,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78:7634-8)。这些细胞是多能的,能够发育成任何器官或组织类型。ES细胞能够在未分化状态体外增殖,在延长培养过程中维持正常核型,和维持分化为所有三层胚胎层(也就是中胚层,外胚层和内胚层)的潜能(Itskovitz-Eldor等,(2000)MoL Med.,6(2):88-95)。ES细胞是有用的模型系统的代表,可用于研究多能细胞生物学的机制和早期胚胎的分化机制,以及提供遗传操作的机会。ES细胞适当的增殖和分化可用于产生无限制的细胞源,适用于基于细胞的治疗由细胞损坏或细胞功能失调导致的疾病。
已经从鼠胚泡阶段的胚胎ICM中分离出ES细胞(Solter和Knowles,(1975)72(12):5099-5102),也从其他几种物种中分离。例如,多能干细胞已经得自几种家养和实验室动物的植入前胚胎,例如牛(Evans等,(1990).Theriogenology,33:125-8),猪(Evans等,(1990)supra;Notarianni等,(1990)J.Reprod.Fertil.SuppL,41:51-6),绵羊和山羊(Meinecke-Tillmann和Meinecke,(1996),J.Animal Breeding and Genetics,113:413-26;Notarianni,等,(1991),J.Reprod.Fertil.SuppL,43:255-60)兔(Giles等,(1993)MoI.Reprod.Dev.,36(2):130-8;Graves等,(1993)MoI.Reprod.and Dev.,36:424-33),貂(Sukoyan等,(1992),MoL Reprod.and Dev.,33:418-31),鼠(Iannaccona等,(1994),Dev.Biology,163:288-92),仓鼠(Doetschman等,(1985)J.Embryol.Exp.MorphoL,87:27-45),和恒河猴和狨猴(Thomson等,(1995)Proc.Natl.Acad.ScL92(17):7844-8;和Thomson,等,(1996),Biol.Reprod.,55:254-59)。Thomson等(1998)Science,282(5391):1145-7;和Reubinoff等(2000)Nat.Biotech.,18(5):559)已经报道了人ES细胞系的衍生。
关于ES细胞的早期工作是在鼠中进行的(Doetschman等,(1985)J.Embr.Exp.MorphoL,87:27-45)。鼠ES细胞是未分化的多能细胞,其得自体外植入前胚胎,且在成纤维细胞饲养层和白血病抑制因子(LIF)的存在下培养时,其能在连续传代过程中维持未分化状态。尽管源于鼠ES细胞的研究有助于理解发育过程和遗传疾病。人和鼠发育的重大差异限制了鼠ES细胞用于人发育的模型。得自其他物种的ES细胞的形态学、细胞表面标记和生长需要与鼠ES细胞的相差很大。此外,鼠和人胚胎的重要差别在于胚胎基因的暂时表达,例如卵柱体与胎盘的形成(Kaufman,The Atlas of Mouse Development;London;Academic Press,1992),某些早期谱系的预期分化(O′Rahilly和Muller;Developmental stages in Human Embryos,Washington;Carnegie Institution of Washington,1987),外胚胎膜和胎盘的结构和功能(Mossman,Vertebrae Fetal membranes;New Brunswick;Rutgers,1987),发育的生长因子需求(例如,造血系统-Lapidot Lab.AnimalSciences 1994),以及成体结构和功能(例如,中枢神经系统)。为了克服这些差异和对人胚胎发育更好的认识,已经成功地从灵长类制备ES细胞(Thomson等,1995和1998)。
目前可获得的与人ES细胞最相似的细胞系是人胚胎癌(EC)细胞,其是源自畸胎癌的多能的、不死的细胞(Andrews,等,Lab.Invest.50(2):147-162,1984;Andrews,等,in:RobertsonE.,ed.Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach.Oxford:IRL press,pp.207-246,1987)。EC细胞可在培养基中被诱导分化,该分化的特征是特异性细胞表面标记(SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,和TRA-1-81)的缺失和新标记的出现(Andrews,等,1987,见上(supra))。人EC细胞在裸鼠中形成畸胎癌,且在肿瘤中的带有多发胚细胞系衍生物。类似的鼠EC细胞系已经得自畸胎癌,通常,其发育潜能与鼠ES细胞相比,更受限制(Rossant,等,(1984),CellDiffer.15:155-161)。畸胎癌是源自生殖细胞的肿瘤,尽管生殖细胞(如ES细胞)理论上是全能的(也就是能够在体内形成任何细胞类型),EC细胞更受限制的发育潜能和不正常核型被认为是由于畸胎癌肿瘤环境中的选择压力造成的(Rossant和Papaioannou,1984)。另一方面,ES细胞被认为维持更强的发育潜能,这是由于它们源自体外正常的胚胎细胞,没有畸胎癌环境的选择压力。
1998年(Thomson等,(1998)见前)公开了第一株人多能ES细胞系。几年后,由人胚泡建立了人胚胎干细胞系(“人ES细胞系”)(Reubinoff等,(2000)见前)。至今,绝大多数描述的人ES细胞系得自,5到8天的胚泡,该胚泡是在体外受精(IVF)或精子卵浆内注射(ICSI)后用于临床目的而产生的。另外,已经报道了从桑椹胚阶段(4天的胚胎)分离ICM(Giles等,1993)。
人ES细胞分离自人胚泡。人胚泡得自人体外植入前胚胎或IVF胚胎、精子卵浆内注射、卵质转移,或其他本领域技术人员已知的方法。人ES细胞得自胚泡,其中可采用在美国专利5,843,780和6,200,806、Thomson等,(1998)见前,和Reubinoff等,(2000)见前(每篇在此以引用的方式纳入本文)中公开的标准免疫外科技术,完整的胚胎培养方法,或独特的激光消融方法(美国专利申请号10/226,711,在此以引入的方式纳入本文)。另外,单细胞人胚胎可扩增到胚泡阶段。尽管至今已经获得出众多的人ES细胞系,但是在其独特的标识、自我恢复的能力和分化的潜能方面只表征了其中的几个(Brimble等,(2004),Stem Cells Dev.,13:585-7)。
本领域技术人员已知的一种产生人ES细胞的方法是通过免疫外科技术。这种方法涉及通过免疫外科去除胚泡中的透明带和分离ICM,其中溶解饲养外胚层被融解并通过温和的吸取从完整的ICM上移去。然后ICM平铺在组织培养烧瓶中,其中包含能使其向外生长的合适的培养基。9到15天后,通过机械分离或酶促裂解的方式将ICM衍生的生长晕(outgrowth)分裂为块,所述细胞重新平铺在新鲜的组织培养基上。用微量吸管分别地选择已证实形态学未分化的克隆,然后将所述克隆机械裂解成块,并将其重新平铺培养。将所得ES细胞每隔1-2周进行常规分离,以维持细胞处于大体上未分化状态。有关免疫外科的更详细描述,参见美国专利号5,843,780、Thomson等,(1998)见前、Thomson等,(1998)Curr.Top.Dev.Biol.38:133、Thomson等,(1995)见前、Bongso等,(1989)Hum.Reprod.4(6):706-13、Gardner,等,(1998),Fert.and Sterility,69(1):84-8,上述每篇文献在此以引用的方式纳入本文。
维持人ES细胞处于未分化的多能阶段的方法包括,但不限于在下列情况下培养细胞:在饲养层存在下培养,在不含饲养的条件下培养,在条件培养基存在下培养,和/或在加有血清或条件培养基的胞外基质上培养。饲养层可以是,例如,γ-照射的或丝裂霉素-C处理过的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或人成纤维细胞。当培养在不含饲养层的标转培养基时,人ES细胞可快速分化或不能存活。不像鼠ES细胞,所添加的外源性LIF的存在并不阻止人ES细胞的分化。饲养细胞层用于提供微环境(或生态位)以预防干细胞沿着自然过程分化。这些的饲养层似乎提供干细胞外部信号,所述外部信号例如为因子的分泌和由整合膜蛋白介导的细胞与细胞之间的相互作用。Watt和Hogan,(2000)Science 287(5457):1427-30。根据分泌因子和直接的细胞之间的相互作用控制干细胞体外存活、增殖和分化的事实,理想的环境由健康的饲养组织组成,所述组织具有正常的显微结构和功能,或能够模拟这样的环境。饲养细胞的例子包括,但不限于:(1)辐射失活的鼠胚胎成纤维细胞;(2)有丝分裂(丝裂霉素C)失活的鼠胚胎成纤维细胞;和(3)辐射失活的STO成纤维细胞饲养层。参见Thomson等,(1998)见前、Reubinoff等,(2000)见前;和Shamblott等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(23):13726-31。
尽管有效培养ES细胞的进展,这些方法仍旧存在一些重要的缺点。例如,在MEF条件培养基或基质胶基质中暴露于动物病原体仍旧是可能发生的事。在人类治疗中使用人ES细胞的主要障碍在于:原始描述的用于增殖人ES细胞的方法包括在非人源的营养血清存在下在非人源的饲养细胞层上培养人EX细胞。最近,关于增强人ES细胞培养系统的大量研究集中在无血清/无饲养条件下生长ES细胞的能力。例如,为了保证人ES细胞生长的无饲养环境,已经尝试了基于添加有血清替代品(SR)、转移生长因子β1(TGF-β1)、LIF、bEGF和纤维结合素基质的替代系统(Amit等(2004),Biol.Reprod.70(3):837-45)。对在人饲养或无饲养基质上分化和增殖未分化ES细胞的方法的评价仍在进行。
详细表征人ES细胞可包括在细胞和分子水平上的分析,和细胞周期调节的分析、高端粒末端转移酶活性的表达、遗传稳定性、特定的HLA和STR类型、和体外和体内条件下的分化潜能。在未分化人ES细胞上显示的表面抗原图谱与人ES细胞和人EC细胞的匹配。未分化的人ES表达球状系列(globo-series)表面标记,如阶段特异性胚胎抗原(SSEAs),例如SSEA-3和SSEA-4,和肿瘤识别抗原,例如TRA-1-60和TRA-1-81。另外,人ES细胞表达POU5F1,启动子编码的(promoter-encoded)转录因子OTC-4、E-钙粘蛋白和间隙接头蛋白间隙连接蛋白43(connexin-43)(Andrews等,2002)。不象鼠ES细胞,未分化的人ES细胞并不表达SSEA-1。未分化的人ES细胞用碱性磷酸酶着色显阳性,证实了高的端粒末端转移酶活性,这表明了其具有增强的自我更新功能。
人ES细胞遗传稳定性的评估可采用标准的G-显带技术,所述技术对于本领域技术人员来说事已知的。正常的人ES细胞维持稳定的核型,或为46XX,或为46XY,即使在延长的连续传代后也是如此。随着传代次数的增加,然而,细胞趋向于显示不正常的核型包括染色体12-17和X染色体的三体性。ES细胞无限的增殖潜能与端粒末端转移酶活性直接相关。进行端粒末端转移酶重复扩增步骤(TRAP)分析用于评估特定ES细胞系的端粒末端转移酶活性。所述分析的进行可采用放射性同位素的方法(Thomson等,(1998),见前),或可采用非放射性同位素的方法(Oh等,(2004)StemCells,23(2):211-19)。
人ES细胞具有分化为人体所有细胞类型的潜能。研究这些细胞在延长培养后的发育潜能,体外研究通过SCID鼠中胚状体的形成,体内研究通过SCID鼠中畸胎瘤形成(Evans M J和Kaufman M,(1983)见前)。为了确证人ES细胞维持其体外分化能力,在悬浮培养中形成胚状体,并通过RT-PCR分子和免疫组织化学分析代表三个胚层的每一层的标记(Itskovitz-Eldor,(2000)见前,和Shamblott等,(1998)见前)。
人ES细胞提供关于发育事件的启示,所述事件不可能在外植体系统中研究。基于人ES细胞体外分化为特定谱系的筛选可以鉴定目标基因,可用于设计或调整组织产生或再生,和鉴定产生畸形的化合物或毒性化合物。采用ES细胞技术替换无功能细胞、组织或器官可为退化性疾病提供治疗的处理方式,所述退化性疾病如帕金森、中风、心脏缺血、肝脏衰竭、青少年糖尿病,或其他由于一种或几种细胞类型的死亡或功能障碍导致的疾病或状况(Wobus和Boheler,(2005),Physiol.Rev.,85(2):635-8)。然而,为了实现人ES细胞技术的潜在治疗用途,所述技术必须在限定的条件下、无病原体的环境中产生丰富的人ES细胞衍生的专一细胞类型,并且在体外条件下能够存活。
目前,获得的人ES细胞系的数量有限,所述细胞系代表了人口遗传多样性的一小部分样本。因此,迫切需要产生和鉴定其它的细胞系,这是因为每种细胞系都有自身的特征,在特定人口中具有不同的应用。而且,获得更多的人ES细胞系用于比较有助于全球致力于定义人ES细胞的标准和建立合适并且充满活力的维持和扩增人ES细胞的方法。
发明简述
本申请针对分离和鉴定特定遗传性状的人多能胚胎干(ES)细胞,所述的遗传性状使得人ES细胞更有效的应用至特定的人群,如印度人。优选地,人ES细胞具有人白细胞抗原(HLA)等位基因,所述基因表达HLAs,通常大多数目标人口的HLAs是一致的。尽管目标人口中不到一半表达已鉴定的特定HLAs,但是该频率仍旧是高的,因为由表达一致HLAs的ES细胞系产生的治疗性处理对于目标人群中的某一部分更加有效。
本申请公开的一个实施方案指的是纯化的人多能ES细胞制剂,其中所述细胞包括:
(i)能够分化为内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物
(ii)正常核型
(iii)能够在体外培养物中增殖至少约25代,和
(iv)如表4所列的一种或更多种等位基因
人多能ES细胞制剂进一步包括任意种如表4所列的HLA等位基因。优选地,所述细胞包括如表4所列的所有HLA。本申请公开的人ES细胞优选具有一种或更多种另外的特征,所述特征与人ES细胞相同。例如,本申请公开的人ES细胞(1)可在体外培养物种增殖至超过1年;(2)在成纤维细胞饲养层(例如,鼠或人成纤维细胞饲养层)环境中或在无饲养条件下培养能抑制其分化;(3)SSEA-3和SSEA-4标记阳性;(4)TRA-1-60和TRA-I-81标记阳性;(5)表达碱性磷酸酶;(6)高表达端粒末端转移酶;或(7)在悬浮培养时能够形成胚状体。在优选的实施方案中,在传代培养约40代后,所述制剂基本保持未分化,更优选在传代培养约60代后,和更优选在传代培养约100代后。虽然制剂中未分化ES细胞克隆与分化的临近细胞接连,但是所述制剂在合适条件下培养或传代时,所述制剂基本上保持未分化,单独的未分化ES细胞构成细胞群的主要部分。基本上未分化的制剂包括至少约20%未分化的ES细胞,和可包括至少约40%、60%、80%或90%的ES细胞。在另一个优选的实施方案中,本申请公开的人ES细胞进一步包括一个或多个如表5所列的短串联重复序列(STR)基因座,并可包括任意种(包括所有种)表5中所列的STR。
本申请公开的另一个实施方案指的是筛选人多能ES细胞系的方法,其为特定目标人群的个体提供了改良的HLA匹配,如对于印度人,所述方法是通过筛选特定HLA等位基因表达的人ES细胞,其中所述的HLA等位基因通常存在于目标人群中。如果目标人口中至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的个体存在HLA等位基因,则HLA等位基因通常存在于目标人口中,。目标人口是基于特定群体中个体的国籍、种族或遗传特征的。通常在不同目标人群中发现的HLA等位基因对本领域技术人员来说是已知的。典型的HLA匹配标准决定衍生自人ES细胞的细胞、组织或器官的潜在移植治疗,例如潜在的受体必须与供体人ES细胞系的合适HLA基因座相匹配。因此,鉴定这样的人ES细胞对于治疗用途具有极大的潜在价值。
附图简述
下述附图组成本说明书的一部分,并且在本文中用于进一步说明本申请公开的某些方面,参照一个或多个这些附图,并结合本文公开的具体实施方案的详细描述可以更好的理解本发明。
附图1是人胚泡在低(100X)和高(200X)倍率下的显微照片。所述的胚泡用于建立RelicellTMhES1细胞系。图1.2显示高倍下6天的胚泡,从该图可见清楚的透明带、单层饲养外胚层和未发育好的ICM。胚胎的等级是C-级(参见Gardner等,(2000)Fertil.Sterility,73:1155-58)。
附图2是鼠胚泡成纤维(MEF)细胞的显微照片,所述的细胞用于培养和增殖RelicellTMhES1细胞系。图2.1显示铺满80-90%、严板接种48小时后的MEF细胞;图2.2显示用于形态学分析的MEF上的hESC克隆,证实hESC克隆的健康生长;图2.3和2.4显示,分别用Oct-3/4和SSEA-4抗体免疫染色MEF上hESC,结果呈现阳性;图2.5RT-PCR证实下述在MEF细胞上生长的hESC的ES-细胞标记的表达:GAPDH、Oct-4、Nanog、Rexl、TDGFl,、Sox-2、Thyl,和FGF4基因。
附图3是在一组相差显微照片,显示了RelicellTMhES1细胞平板接种在培养基MEF层上后随时间的形态学变化,所述培养基中包含人LIF(10ng/ml)。平板接种1天后ICM粘附并逐渐在MEF细胞上扩展,直到第12天。在第12天,人ES细胞克隆分离并传代繁殖细胞系。平板1:平板接种第1天;平板2:平板接种第4天;平板第3:平板接种第5天;平板4:平板接种6天;平板4:平板接种第8天;平板1:平板接种12天。
附图4是在一组相差显微照片,显示了未分化hES1克隆处于从10代到30代时的不同代的形态。图3.1显示健康的MEF细胞上的10代致密的hESC克隆,所述MEF细胞不仅提供营养给ES细胞,而且有助于其维持未分化状态。图3.2显示15代的hESC克隆。图3.3显示20代的hESC。图3.4拍摄于更高的倍率(200X)下,其显示了30代未分化hESC的清晰的细胞边界、细胞核与细胞质的高比率和显著的核仁。HESC维持在包含DMEM-F12的培养基中,所述培养基添加有10%FBS和人LIF(10ng/ml)。
附图5是一组8张的显微照片,显示了通过免疫细胞化学检测在MEF细胞上生长的细胞的不同ES细胞标记的表型表达。图5.1显示Oct-3/4(+)hESC;图5.2显示SSEA-3(+)hESC;图5.3显不SSEA-4(+)hESC;图5.4显示Tra-1-60(+)hESC;图5.5显示Tra-1-81(+)hESC;图5.6显示Connexin-43(+)hESC;图5.7显示E-钙粘蛋白(+)hESC;和图5.8显示碱性磷酸酶(+)免疫染色hESC,其中所述hESC用4%多聚甲醛固定。所有分析的标记都是富含碳水化合物的细胞表面抗原(除了Oct-3/4之外),其是POU5F1启动子编码的转录因子和Connexin-43,其中Connexin-43是间隙连接分子。在RelicellTMhES1增殖期间,每隔5代时进行免疫荧光分析,并且所有抗体都是FITC标记的。
附图6照片说明RelicellTMhES1细胞系第22代的未分化基因表达格局,因此证实了长期培养细胞系的多能性。在RelicellTMhES1细胞系繁殖中每隔5代进行RT-PCR分析。包括如下从左到右的标记:条带1:100bp标记;条带2:GAPDH(892bp);条带3:Oct-4(247bp);条带4:Nanog(262 bp);条带5:Rexl(306 bp):条带6:Sox2(448bp):条带7:Thyl(272 bp);条带8:FGF4(374bp);条带9:ABCG2(684bp):条带10:Dppa5(353bp);条带11:UTF1(230bp);条带12:Criptol(217bp);条带13:FoxD3(165bp);条带14:hTERT(187bp);条带15:Connexin-43(295 bp);条带16:Connexin-45(819bp);和条带17:100 bp标记。hTERT基因的增强表达表明人ES细胞系的高度自我更新能力。GAPDH用作持家基因对照。用于扩增未分化基因的具体引物列在表1。
附图7显示了对在把RelicellTMhES1细胞注射到SCID鼠后形成的畸胎瘤的分析。在注射到SCID鼠时,多能hESC系分化为所有三层胚胎胚层衍生的细胞。平板A:低倍率观察畸胎瘤;平板B:显示内胚层衍生物(肠上皮);平板C和D:显示外胚层衍生物(神经组织);和平板E和F:显示中胚层衍生物(分别是血液细胞和骨)。
附图8是1.5%琼脂糖凝胶电泳图,其显示了通过基于PCR的SYBER-Green染色分析37代ReliCellTM hES1细胞系的真实端粒末端转移酶活性。每次分析上样6μg总蛋白。条带1:NTERA-2;条带2:NTERA-2(热失活的);条带3:MEF;条带4::MEF(热失活的);条带5:ReliCellTM hES1(p37);条带6:ReliCellTM hES1(ρ37,热失活的);条带7:内部对照;条带8:TSR8对照模板(1.5μl,同试剂盒一起提供)。
附图9是悬浮培养过程中的4张胚状体照片,所述培养维持在合适培养基(W/O hLIF)中,以诱导体外分化。图8.1显示悬浮培养6天后形成的人ES细胞松散凝集体/克隆;图8.2显示培养10天形成的致密胚状体;图8.3显示培养14天后形成的血岛;和图8.4显示培养14天后形成的致密血岛,其是体外血管发生的证明。
附图10的显微照片显示,通过免疫化学分析2-孔腔式载波片上固定的胚状体(14天)来说明ReliCellTM hES1细胞系体外分化潜能。图10.1显示巢蛋白(+)免疫染色(外胚层);图10.2和10.3显示分别用平滑肌肌动蛋白和Brachyury(+)免疫染色(中胚层);图10.4和10.5显示分别用AFP和GAT A-4(+)免疫染色(内胚层),从而验证RT-PCR的结果。用于研究的所有抗体都连接有FITC。照片拍摄采用了Nikon E600倒置显微镜。
附图11显示一组谱系特异性标记的差别基因表达,所述标记标识来自胚状体(32代)的三个胚层的细胞,所述胚状体源自ReliCellTMhES1细胞系,所述标记包括:(1)角蛋白8、角蛋白15、角蛋白18、NFH、Sox-1(外胚层);(2)Brachyury、MyoD、Msxl、HAND1、心肌肌动蛋白(中胚层);和(3)GATA-4、AFP、HNF-3b、HNF-4a、白蛋白和PDX1(内胚层)。照片显示在胚状体形成的第10到14天时前述标记的mRNA水平很高,因此证明了人ES细胞系体外分化为三种谱系的潜能。HEF细胞作为阴性对照,和GAPDH作为持家基因对照。
附图12显示评价ReliCellTM hES1体外分化潜能。相差显微照片显示从不同表型细胞至胚状体形成的例子,其中所述的不同表型细胞是在合适的体外条件下,由从未分化人ES细胞形成。具体如下所述:平板A:多重处理的神经元;平板C:心肌细胞;平板E:胰岛;和平板G:椭圆形的肝胚。另外,免疫染色这些分化的细胞是采用一些细胞特异性标记:平板B:MAP-2;平板D:心肌肌钙蛋白-I;平板I:PDX-1;和平板H:CK18。
附图13显示将肝癌细胞系、HepG2间隔不同时间暴露于四氯化碳(0.6%)的图解表示。另外,生化方法测定下述酶的含量:平板A:血清谷草转氨酶(SGOT);平板B:血清谷丙酸转氨酶(SGPT);平板C:碱性磷酸梅(ALP);和平板D:乳酸脱氢酶(LDH)。
附图14显示作为体外肝脏毒性模型的鼠ES细胞衍生的肝细胞的建立。干细胞由鼠ES细胞分化而得,并将其在存在和不存在N-乙酰半胱氨酸(NAC)的情况下暴露于四氯化碳(0.6%)180分钟,所述N-乙酰半胱氨酸(NAC)为一种抗氧化剂,将其。生化方法测定下述酶的浓度:平板A:SGOT;平板B:SGPT;平板C:ALP;和平板D:LDH。
发明详述
本申请涉及根据其独特的特性、自我更新能力和分化潜能建立详细表征的人ES细胞系。具体地,产生人ES细胞系,该细胞系具有特别适合于特定受体人群的治疗用途的特性。所述的人群是基于国籍、种族、或遗传特性的个体的特定群体。这样的人ES细胞系可为特定人群提供特性和优势,以用于多种用途,如细胞替换治疗、药物筛选、和功能基因组学。人ES细胞被鉴定为具有某些用于治疗特定人群的优势,所述特定人群是通过某些遗传特性而鉴定的,例如一些主要组织相容性复合物(MHC)等位基因、人白细胞抗原(HLA)、或短串联重复(STR)标识广泛存在于目的人群。分离与普通人群具有相同的一种或多种遗传特性的人ES细胞,将增加这些ES细胞用于开发治疗应用或开发通常会有利于所述人群的其他信息的可能性。例如,人ES细胞与通常的目的人群的的组织相容性越高,ES细胞用于产生治疗效果的可能性就越大。在具体地,优选实施方案中,目的人群是印度人。
MHC是包含HLA或MHC基因的染色体部分,其可分为三种:类别I、类别II和类别III。人体中,MHC类别I基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C,而MHC类别II基因包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR(Golub and Green,1991,Immunology:A Synthesis,SecondEdition,Chapter 15)。MHC类别I和类别II分子结合自体或外源抗原的蛋白片段,并在细胞表面被T淋巴细胞检阅。因而,这些分子刺激细胞或体液免疫攻击(Germain,1994,Cell 76:287-299)。完整的产品系列可商业获得,以用于对所有典型HLA位点进行分类,包括A、B、C、DRA、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1。通过鉴定ES细胞系的遗传因子(如,举列来说,HLA等位基因,其普遍存在于普通人口),所述细胞系可用于衍生治疗性处理,所述治疗性处理对于目标人群更有效。例如,本发明公开的一个优选实施方案涉及产生人ES细胞系,与随机分离的人ES细胞系相比,其具有更高比率的与印度人一样的标记,如免疫遗传标记。这将会降低人群中由ES细胞而产生的免疫注射的风险,所述免疫注射属于治疗性处理。
例如,研究北印度人群中HLA同种型的遗传多样性揭示某些HLA等位基因在所述人群中的出现率高。例如,Mehra等,(2001)Tissue Antigens 57(6):502-7,观察到HLA-A*0201(3.8%)在亚洲印度人中出现出乎意料的低频率,而其在西部高加索样人群的分布中,构成HLA-A2所有组成成分的95%。这个例子表明鉴定人ES细胞系的重要性,其通常与目的人群的病人组织相容。
本发明公开的人ES细胞具有特别好的优点,这应归于这些细胞的如下几个特性:
(1)能够分化为多种组织类型,且这些组织类型属于三层胚胎层(内胚层、外胚层和中胚层);
(2)能自我更新并且能够繁殖传代培养至少约40到约100代或更多代,同时保留多能性、高的端粒末端转移酶活性和正常核型;
(3)能够形成胚状体(EBs);
(4)拥有独特的HLA等位基因,在移植到所选定的患者群,例如印度人的过程中,其能提供与受体更好的匹配性;
(5)拥有独特的短串联重复序列(STR)类型,在移植到所选定的患者群,例如印度人过程中,其能提供与受体更好的匹配性;
(6)根据其作用于细胞群、细胞毒性、或基因调节或蛋白表达,可用于筛选化合物,例如小分子和药物;和
(7)采用,例如,肝细胞,心肌细胞、神经元、胰岛细胞、或衍生自本发明公开的人ES细胞的其他细胞类型,这些细胞可用作传统体外毒性模型的选择,所述模型用于药物代谢和毒性研究,。
本文所述的一个特别优选的人ES细胞系是RelicellTM hES1细胞系(Mandal等,(2006)Differentiation 74:81-90,其在此以引入的方式纳入本文)。这种细胞系保存于细胞科学国家中心(NCCS),在印度的Pune,将申请国际保藏。这种细胞系表达高水平的细胞表面标记如SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81,转录因子Oct-4,碱性磷酸酶和端粒末端转移酶。如通过STR分析的DNA指纹所示,这种细胞系在长期培养过程中保持正常核型和具有显著的特征,。检测所述细胞体外分化潜能,证实其能够引起多巴胺能神经元、心肌细胞、胰岛、和肝细胞样细胞发生,其分别属于外胚层、中胚层和内胚层谱系。
本文公开的人ES细胞产生于哺乳动物胚胎胚泡阶段的内细胞团(ICM)。在优选的实施方案中,多能人ES细胞能够自我再生,并且可以引起所有的三层谱系细胞(外胚层、中胚层和内胚层)的产生。本文所用的术语“多能人ES细胞”指的是得自哺乳动物胚胎胚泡阶段的ICM的细胞。多能细胞能自我再生并且能够分化为所有的三种谱系的细胞。本文所用的术语“分化”指的是一个过程,未分化的ES细胞藉此获得一种状态,其中细胞更专一,具有特定组织的特征。这些特定组织显示在细胞和分子水平上的组织特异性标记的表达。ES细胞系分化潜能是所述细胞系能够产生属于所有三层胚层(外胚层、中胚层和内胚层,包括畸胎瘤)的细胞类型。将所述细胞在合适分化的条件下培养验证体外ES细胞分化潜能。另外,将ES细胞注射到SCID鼠中显示其分化潜能。
本文公开的多能ES细胞是未定型的(也就是说,其不属于具体的胚层如外胚层、中胚层和内胚层)。人多能ES细胞也具有高度自我更新能力和拥有分化潜能,无论是体内还是体外,或在细胞、组织或器官内能保持休眠或静止。分离的胚泡(从中分离人ES细胞)的获得可通过本领域技术人员已知的一系列方法,例如体外受精、精子卵浆内注射技术、和卵质转移。在一些实施方案中,分离的人ES细胞生长在胚胎成纤维细胞上,所述成纤维细胞包括,但不限于鼠胚胎成纤维细胞、人胚胎成纤维细胞或得自成人组织的成纤维细胞样细胞。在另外一些实施方案中,人ES细胞生长在无饲养的条件下。
如在优选实施方案中所述的得自胚泡的人ES细胞群,表达ES细胞的特异性标记,该标记包括但不限于,Oct-4、Nanog、Rexl、Sox-2、FGF4、Utfl、Thyl、Criptol、ABCG2、Dppa5、hTERT、Connexin-43、Connexin-45。人ES细胞并不表达分化细胞的特征性标记,如角蛋白5、角蛋白15、角蛋白18、Sox-1、NFH(外胚层);brachyury、Msxl、MyoD、HAND、 心肌肌动蛋白(中胚层);GATA4、AFP、HNF-4alρha、HNF-3beta、白蛋白、和PDX 1(内胚层)。人ES细胞也表达细胞表面标记,如阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-4)、SSEA-4、肿瘤识别抗原1-60(“TRA-1-60”)、TRA-1-81、Oct-4、E-钙粘蛋白、Connexin-43、和碱性磷酸酶。免疫细胞化学技术检测表达水平。本文公开的人ES细胞系详尽的分子特征给早期胚胎发育提供了有价值的见识。
在本发明公开的某些实施方案中,分离的人ES细胞培养在营养培养基中,并通过手工传代培养维持,所述培养基优选包含生长因子。本文所用的术语“生长因子”指的是结合细胞表面受体的蛋白,通过激活信号途径,主要导致激活细胞增殖和分化。绝大多数生长因子/添加物具有相当的多种用途,能够刺激细胞分化成许多种不同细胞类型,而一些生长因子的特异性却被限制于某些细胞类型。可采用对多能ES细胞特异性的生长因子,其诱导分化成多种谱系如神经元、肝细胞、心肌细胞、β-胰岛、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、等等。ES细胞培养基的一个例子包含80%DMEM/F-12、15%ES-测试FBS(ES-tested FBS)、5%血清替代品、1%非必需氨基酸溶液、1mM谷氨酰胺(GIBCO)、0.1%β-巯基乙醇、4ng/ml人bFGF和10ng/ml人白血病抑制因子(LIF)。手工传代细胞的方法比一般酶处理传代的方法要好,因为其有助于维持细胞系的遗传稳定性。维持细胞系的正常核型对于其治疗用途是很重要的。
优选地,本发明公开的ES细胞显示高水平的端粒末端转移酶活性,这一点由基于非放射性PCR的Syber-Green检测方法评估。这显示了本发明公开细胞的高度自我更新能力,该能力为在培养物中至少约40代,更优选地至少约60代,和最优选地至少约100代。甚至在培养一年后,人ES细胞优选拥有正常整倍体核型,并且没有表现出染色体的总体改变。
本发明进一步描述人ES细胞的独特的特征,这一点由HLA和STR分类所示。HLA分类分析在干细胞移植治疗中发挥重要作用。利用STR基因分型开发基因组的串联重复元件也在几个领域变得重要,所述领域包括:遗传作图、连锁分析、和人同一性试验。目前公开的人ES细胞系拥有独特的HLA和STR类型,其在为印度人移植过程中提供更好的匹配性。
本发明公开的人ES细胞本质上是多能的,其能在体内分化成所有三层胚层的代表细胞。在注射入SCID鼠时,人ES细胞分化为衍生自所有三层胚层的细胞,其包括但不限于,骨、软骨、平滑肌、横纹肌、造血细胞(中胚层)、肝脏、原始消化管和呼吸上皮细胞(内胚层)、神经元、神经胶质细胞、毛囊、和牙蕾(外胚层)。对在鼠的本文所述的人ES细胞注射位点形成的肿瘤的组织切片检查可证实这些特征性状。
得到的人ES细胞也可在悬浮培养中形成胚状体(EBs)。本文所用的术语“胚状体”指的是分化或未分化的多能ES细胞的凝集,悬浮培养中产生的原始内胚层包围所述的ES多能细胞。胚状体包含三种谱系的细胞,所述谱系包括外胚层、中胚层和外胚层。在成熟的人类配体中,可观察到细胞具有多种细胞类型的标记,如神经元细胞、造血细胞、肝细胞、心肌细胞和胰岛细胞。胚状体和其具体特征为决定ES细胞的分化结果提供有价值的信息。进一步,可以进行如下研究,即通过施用合适的生长因子和他们的添加物使ES细胞分化为所需要的表型。
在一种产生EBs的方法中,悬浮凝集物允许在无LIF的ES培养基中分化10-14天。产生的EBs表达一组谱系特异性标记如角蛋白5、角蛋白15、角蛋白18、Sox-1、NFH(外胚层)、Branchyury、Msxl、MyoD、HAND1、心肌肌动蛋白(中胚层)GATA4、AFP、HNV-4α、HNF-3β、白蛋白、和PDX1(内胚层)。一组分化标记的明确表达清楚地验证了人ES细胞系的分化潜能,例如,根据培养条件,其中至少80%的分化细胞可能是神经元,30-50%的可能是心肌细胞,80-90%的可能是肝细胞,和40-60%是胰腺细胞。
在某些实施方案中,本文描述的人ES细胞用于筛选化合物,例如,小分子和药物,用于作用于细胞群。也筛选用于细胞毒性或调节表达的化合物。在另外的实施方案中,本文描述的人ES细胞可用于研究发育方面的细胞生物学和分子生物学、功能基因组学和分化细胞的产生,以用于治疗性或预防性移植、治疗、药物筛选、或体外药物开发。例如,人ES细胞用于基因组分析,产生mRNA、cDNA、或基因组文库,产生特异性多克隆或单克隆抗体,包括但不限于,人源化单克隆抗体(WO01/51616,特将其以引用的方式纳入本文),或检测不同待测化合物或生物活性分子在人ES细胞或其衍生的细胞或组织上的作用,例如药物研究中的制药化合物。筛选的待测化合物或生物活性分子源自,例如,植物、植物提取物、或合成原料。人ES细胞也用于筛选影响培养的人ES细胞特征性状的和影响人ES细胞分化为多种特异性细胞和组织类型的因素(例如小分子药物、肽、多核苷酸、等等)或条件(例如细胞培养条件或处理)。
最近,已经报道了在毒理学研究中使用干细胞(Davila等,(2004)Toxicol.Sci.,79(2):214-23)。干细胞在应用于毒理学的极大好处源于其与原始人细胞(primary human cell)相比的独特特性(也就是无限制的增殖能力、产生其他细胞类型的可塑性、和人细胞来源的易获取性)。当在已经报道了鼠ES细胞体外分化为干细胞(Hamazaki等,2001;Jones等,2002)时,还没有广泛的研究使用这些分化的肝细胞作为体外筛选潜在的候选药物的模型。基于鼠ES细胞的试验,产生自鼠ES细胞的肝细胞可证明是传统体外毒性模型的合适选择,用于药物代谢和毒性研究。
本发明描述使用得自ES细胞的肝细胞研究异生素诱导的肝毒性的应用,该应用借助于测定酶的释放,所述酶包括但不限于,血清谷丙转氨酶(SGPT)、血清谷草转氨酶(SGOT)、碱性磷酸酶(ALP)、和乳酸脱氢酶(LDH)。尽管所述应用并不限于采用ES细胞衍生的肝细胞研究毒性,这种细胞类型特别适合于毒性测试,这是因为在细胞、分子和功能水平上的性状测试都是详细限定好的,从ES细胞可有效的获得高百分比的肝细胞,且肝细胞在形态学上可清楚的辨别,从而可降低于由混合群相关的混淆(参见Kulkarni和Khanna,Functional hepatocyte-like cells derived from mouse embryonic stemcells:A novel in vitro hepatotoxicity model for drug screening,2006,Toxicology In Vitro(in press),在此以引用的方式纳入本文)。通过使用本申请的人ES细胞衍生的肝细胞,本概念可作为用于药物代谢和毒性研究的传统体外毒性模型的选择。
人ES细胞与多能人胚胎癌(EC)细胞共有某些特征。因此推定的人ES细胞的鉴定可通过形态学和人EC细胞特征性细胞表面标记的表达。另外,推定的人ES细胞的鉴定可通过发育潜能、核型和不死性。鉴定人ES细胞特征的例子如下。
a)形态学:人ES细胞克隆的形态学类似于,但有区别与鼠ES细胞。鼠和人ES细胞都具有未分化干细胞的特征,和高的核/胞质比率、明显的核仁、和致密的克隆形成。但是人ES细胞的克隆要比鼠ES细胞克隆更扁平,和单个ES细胞可清楚辨别。
b)细胞表面标记:基于下述某些细胞表面标记的存在或缺失,本发明公开的人ES细胞区别于鼠ES细胞系。一组已知的糖脂细胞表面标记是阶段特异性胚胎抗原(SSEA)1到4。这些抗原在人和鼠ES细胞上差异表达,并可采用所述抗原的抗体鉴定。NTERA-2 CL.D1细胞系选作阳性对照,因为其已被广泛研究过并在文献中报道过,但也可以使用其他的人EC细胞系作为阳性对照。
鼠ES细胞(ES J10用作SSEA-1的阳性对照,也作为SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81的阴性对照。其他常规的阴性对照包括缺失原始或二级抗体和用无特异性的初级抗体代替。细胞用4%的多聚甲醛固定后,可对碱性磷酸酶进行检测。球状系列糖脂SSEA-3和SSEA-4构成性出现在人EC细胞上。体外NTERA-2 CL.D1细胞系分化导致SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的表达缺失和乳糖系列糖酯SSEA-1的表达增加。这与未分化的鼠ES细胞有差异,该鼠ES细胞表达SSEA-1,不表达SSEA-3也不表达SSEA-4。尽管这些抗原的功能是未知的,ReliCellTM hES1细胞都和人EC细胞表达这些抗原,表明胚胎学的密切相似性。碱性磷酸酶也存在于所有的人ES细胞。本发明公开的成功人ES细胞培养物与这些细胞表面标记相关,所述标记也发现在其他已经建立的人ES细胞系中。
c)畸胎瘤形成的发育潜能:本发明公开的人ES细胞是多能的。在注射入SCID鼠时,成功的人ES细胞系将分化成三层胚层的细胞,包括骨、软骨、平滑肌、横纹肌、造血细胞(中胚层)、肝脏、原始消化管和呼吸上皮细胞(内胚层)、神经元、神经胶质细胞、毛囊、和牙蕾(外胚层)。
d)核型:成功的人ES细胞具有正常核型。可衍生XX和XY细胞系。人ES细胞系的正常核型与人EC细胞中发现的不正常核型形成反差,所述EC细胞得自自发产生的人胚细胞肿瘤(畸胎瘤)。尽管肿瘤衍生的人EC细胞系具有与ES细胞系某些相同特性,至今获得的所有人EC细胞系都是非整倍体。因而,人ES细胞系和人EC细胞系可通过人ES细胞系中发现的正常核型和人EC细胞系不正常核型区分。“正常核型”意思是所有染色体保持所述物种的正常特性,无明显的改变。人ES细胞系正常核型表明所述细胞系反映正常的分化。
e)不死性:永生细胞能够在体外持续的无限制复制。持续培养增殖超过1年就足以证明其不死性,这是因为无此特性的原代细胞培养物无法持续分化这么长时间。优选地,在合适培养条件下,人ES细胞体外持续增殖超过一年,并且保持具有发育成所有三层胚层的潜能。所述的发育潜能的证实,是通过将培养很长时间(超过一年)的ES细胞注射到SCID鼠后组织学检查产生的肿瘤而完成的。尽管在延长培养时可随机发生核型改变,决大多数ES细胞在持续培养超过一年仍保持正常核型。为了证实这一点,可通过检测繁殖后期阶段的人ES细胞的端粒末端转移酶活性。在胚胎发育过程中高水平的端粒末端转移酶活性与细胞繁殖相关,以及与细胞转化和癌症相关。
f)培养条件:预防分化所需要的生长因子对于本发明公开的人ES细胞系和鼠ES细胞系而言是不同的。对于鼠ES细胞,未分化细胞在不存在饲养时LIF可支持其自我更新和繁殖,这是个重大的发现。不幸的是LIF对于人ES细胞培养物似乎不具有这种能力(Jones,等,(1998);Bongso等,(2000)见前)。
或者,人饲养来源包括,但不限于人胚胎成纤维细胞、人包皮、骨髓间(充)质细胞、各种成人的基质细胞,或其任意组合,都可用于本发明公开的鼠胚胎饲养(MEF)的替代,从而使人ES细胞生长(目的是为人ES细胞培养物创造无异源环境)。然而无饲养的人ES细胞培养是理想的。不仅消除带有潜在病原体的外源污染的可能来源,也极大地简化ES细胞培养的后勤,特别是在较大规模时。鼠胚胎成纤维细胞制成的条件培养基将支持培养在细胞外基质制剂Matrigel(INVITROGEN)的人ES细胞在不存在饲养时繁殖(Carpenter等,2001)。尽管其提供一些实际的好处,但还未鉴定出条件培养基中的活性因子,这种方法无法消除鼠内源性逆转录病毒污染的可能性。g)胚胎外组织的分化:当生长在胚胎成纤维细胞上并使其在获得融合后生长2周(也就是持续覆盖培养物表面),本发明公开的人ES细胞自发分化为神经元、心肌细胞、肝细胞和胰岛细胞。可通过使用目的基因特异性引物和抗体的半定量RT-PCR和免疫组织化学来检测上述细胞类型的特征标记。
h)再生药物中分化的干细胞:本发明公开的人ES细胞体外可诱导分化为特定表型。采用这样的技术可产生所需要细胞类型的纯化群体,其可注射到,例如损坏的器官中以修复损伤。这样的损伤可由多种疾病或状态所导致,例如但不限于神经性退化疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肝衰竭和糖尿病。神经性退化疾病,包括但不限于中风、脊髓损伤、帕金森(氏)病、阿耳茨海默(氏)病、多发性硬化症等等。因此,分化的人ES细胞在细胞替换治疗或组织再生的细胞移植中拥有巨大的潜能。另外,本发明公开获得的细胞系可用作多种治疗性活性分子的运输载体。例如,特异基因可传递到人体的多个部位,优选为了在细胞内进行遗传操作和传递给靶位点,以用于基因治疗。i)用于药物筛选和治疗的分化的干细胞:本发明公开提供使用人ES细胞和其独特能力分化为所有三种谱系细胞(外胚层、中胚层和内胚层)的可能性,以用于制药学上的介入(pharmaceutical intervention)和基于细胞的分析和体外毒性测试,所述制药学上的介入和基于细胞的分析的目的是为了发现药物。本发明公开的另一个方面提供了使用这些分化细胞的机会,包括但不限于神经元细胞、心肌细胞、肝细胞和β胰岛细胞,以用于筛选多种生物活性分子,例如,那些得自植物提取物或合成源的生物活性分子。筛选方法可用于开发用于不同疾病的新药物分子,所述疾病例如为帕金森(氏)病、阿耳茨海默(氏)病、亨廷顿病、心脏疾患、糖尿病和肝脏疾病。
根据相似的路线,鼠ES细胞衍生的肝细胞可用于研究异生素诱导的肝毒性,所述研究是通过测定酶的释放而完成的,所述酶包括但限于,血清谷丙转氨酶(SGPT)、血清谷草转氨酶(SGOT)、碱性磷酸酶(ALP)、和乳酸脱氢酶(LDH)。本发明公开的细胞也可用于研究药物诱导的细胞色素P450亚型的诱导作用和采用分析技术鉴定药物代谢,所述亚型包括但不限于CYP1A1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4,所述分析技术包括但不限于,高效液相色谱(HPLC)、液相层析色谱-质谱(LC-MS)和气相层析色谱-质谱(GC-MS)。
本发明公开所衍生的细胞也可用于产生多克隆和单克隆抗体,用于研究或治疗潜能,优选用于产生治疗多种疾病的单克隆抗体。
下述实施例用于阐明本发明的优选实施方案。本领域技术人员可理解实施例中公开的技术,其代表发明人开发的技术,且在实施本发明中表现的效果良好,因而认为构成实施的优选模式。然而,本领域的技术人员,应根据本发明公开的内容,根据公开的具体实施方案作出修改而获得类似的或相似的结果,应当理解并为不偏离本发明的主旨和范围。
实施例1
当前的实施例公开了体外受精制备胚泡。
1)分离胚泡
可从多种来源分离胚泡阶段的胚胎(胚泡)。这些胚泡分离自回收的体内受精的植入前胚胎、或体外受精(IVF) (例如,胚胎受精通过传统授精、精子卵浆内注射技术或卵质转移)。人胚泡获自其自愿捐献其多余胚胎的夫妇或供体。在获得这些夫妇或供体书面的和自愿同意后,这些胚胎用于研究目的。或者,将体细胞或细胞核转入去核的人或非人来源的卵母细胞后刺激发育为胚泡阶段,从而获得胚泡。所用的胚泡已经冷藏保存,或获自早期阶段冷藏保存的胚胎并继续发育成胚泡阶段的胚胎。优选地,用于当前公开的是拥有良好形态级别的胚泡,例如,其内细胞团发育良好的胚泡。胚泡和内细胞团的发育根据种类的不同而变化,这是本领域技术人员已知的。胚胎培养在条件培养基中,该条件培养基使其保持存活并且增强其发育为胚泡阶段的胚胎(Fong和Bongso(1999),每篇文献以引用的方式纳入本文)。
在获得机构伦理委员会的批准后,启动采用人胚泡的本文公开的任何研究。优选取得供体的书面同意,即同意在完成不孕治疗后,捐献其多余胚胎用于所述研究。从不孕患者获得有用的胚胎采用通常的步骤,描述如下:
2)体外受精
对于IVF,妇女必须首先经历使用GnRH拮抗剂的脑下垂体抑制治疗所述抑制剂如为醋酸亮丙瑞林(Lupron)。随后注射促性腺激素(hMG)7-12天以控制卵巢过度刺激,其中用超声(波)检查法和血浆雌二醇水平监控卵泡的生长。当至少一个或多个卵泡长成直径18mm时,肌内注射hCG 10,000 IU(Profasi)以促发排卵。
3)提取卵母细胞和胚胎复苏
在超声波检查指导下34-36小时时卵泡抽吸提取卵母细胞。评估受精是根据2个原核(2 PN)的存在和受精的卵母细胞转移到胚胎培养皿中。每个平板2个受精的原核(2 PN)转移到0.75-1ml的卵裂培养基(Quinn′s cleavage Medium(Sage Biopharma Cat.#ART-1026))。这些培养皿在含5%CO2的环境、37℃下温箱中培养2天。第二天更换卵裂培养基。在第三天,用胚泡培养基(SageBiopharma Cat.#ART-1029))替换卵裂培养基,胚胎培养至5到7天,直到获得扩展的胚泡。每隔一天更换培养基。培养过夜后,立体显微镜下可观察到胚胎。如果胚胎发育成桑葚胚或良好扩展的胚泡则认为整合是成功的(附图1.1和1.2)。本文公开的人ES细胞自桑葚胚阶段到胚泡阶段分离。
实施例2
当前的实施例公开了鼠胚胎成纤维细胞(饲养)的衍生和储存。
1)妊娠鼠的获得和解剖
鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)获自近亲品系C57黑鼠或其他合适的种系。在一个例证性的方法中,颈脱位法处死交配(dpc)后或妊娠13.5天的鼠。70%异丙醇涂抹鼠腹部后切开一小口。相反方向拉开腹部皮肤以暴露内脏。在后腹腔可见装满胚胎的子宫。无菌镊子和剪刀分离子宫,放入50ml带有螺旋帽的圆锥形离心管中,所述离心管中包含20ml无菌的杜伯科(氏)磷酸缓冲盐溶液,且其不含Ca-和Mg(GIBCO-BRL,Cat No.14190-144)。从所有处死的妊娠鼠中分离包含胚胎的子宫。在层流通风橱中,用无菌的无Ca-和Mg的杜伯科(氏)磷酸缓冲盐溶液冲洗子宫5到6次。使用无菌尖头钳和剪刀收集胚胎,去除胎盘、膜和软组织。
2)鼠胚胎分级
立体显微镜下分级鼠胚胎。根据多种标准对鼠胚胎进行分级,最常规的如Theiler在“The House Mouse:Atlas for Mouse Development”(1989)(在此以引入的方式纳入本文)中描述的。Theiler的标准太宽泛以至于无法区分早期发育的许多重要阶段,因此需要补充其他的,例如,细胞数、体节数、或其他Downs和Davis(1993),Dev.,118(4):1255-66(在此以引入的方式纳入本文)所用的特征。同样妊龄的胚胎在早期发育的阶段可能是不同的。Downs和Davis识别的阶段适用于C57黑X CBA鼠、近亲品系C57黑鼠、和其他相近种系的F1杂种。获得用于生长ES细胞的饲养源的最能接受阶段是Theiler级21和22。Theiler级21是13dpc,在12.5-14dpc的范围内,和52-55体节。这一级的特征是前面锯齿状的脚板、可辨认的肘和腕、5排腮须和明显清楚的脐疝。另外,这一阶段的区别特征为毛囊不存在和手指末梢分离。Theiler级22公认为14dpc,在13.5到14dpc范围内,和56-60体节。这一级的显著特征是末梢分离的手指、后端脚板指头之间的缺口、和存在长肢体骨以及胸部、骨盘和躯干部位存在毛囊。其他特征包括开放眼睑缺失和头侧区存在毛囊。
3)处理鼠胚胎
进一步处理胚胎包括在立体显微镜下用无菌的尖头镊子首先去除头部,然后是所有的内脏。动物尸体转移到有盖的96mm无菌培养皿中,然后采用无菌弯形(手术)剪适当的绞碎。绞碎后转移到50ml圆锥形离心管中,离心管中含大约15-20ml 0.25%的胰蛋白酶-EDTA(GIBCO-BRL,Catalog No.25200-056),并37℃下预热。绞碎的块用10ml吸管在胰蛋白酶-EDTA溶液中研磨3-4次,然后经过配有18计量注射针的20ml注射器2-3次。细胞悬浮液在37℃下温浴10-15分钟。细胞悬浮液再次用10ml的吸管研磨。细胞悬浮液中的胰蛋白酶通过加入20ml完整培养基(90%达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基-高糖、10%胎牛血清、1mM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和0.1mM β-巯基乙醇)失活,最后将细胞悬浮液平铺在组织培养基的烧瓶中。此后,细胞生长至汇合,其中每隔一天更换培养基,同时定期监测。
4)冷冻鼠胚胎成纤维细胞
在融合时将细胞冷冻在冷冻培养基中,所述培养基包含60%胎牛血清、20%DMSO和20%的完全培养基。为了冷冻,细胞重悬在完全培养基中,然后与冷冻培养基以1∶1比例混合。冷冻悬浮液分装成1ml的冷冻小瓶,其中1ml含5百万细胞。这些小瓶储存在液氮下供长期使用。
5)鉴定MEFs
每批饲养源是否符合条件是通过测试人ES细胞在MEF上生长5代。鉴定的过程包括评估重要参数如人ES细胞克隆的形态学分析(附图2.1和2.2),免疫化学分析ES细胞标记的表达(附图2.3和2.4),RT-PCT(附图2.5)和通过内毒素和支原体测试检测无菌。只有合格的饲养能够用于分离、传代和维持ReliCellTM hES1细胞系。
实施例3
当前的实施例描述了人ES细胞的衍生和维持。
1)灭活和平铺鼠胚胎成纤维细胞(饲养源)
储存在液氮中的饲养细胞解冻后根据需要培养。将冷冻小瓶放置在37℃水浴中直到内含物半融。将内含物收集在试管中,并与温热培养基混合以稀释冷冻保护剂。细胞用吸管吹吸悬浮后平铺在包含新鲜的MED培养基(90%达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基-高糖(GIBCO)、10%胎牛血清(Hyclone)、1mM L-谷氨酰胺(GIBCO)、1%非必需氨基酸(GIBCO)和0.1 mM β-巯基乙醇(Sigma))的组织培养烧瓶中。一旦细胞到达汇合阶段,就准备灭活。细胞灭活用丝裂霉素C处理或γ照射。这里细胞灭活是指使用丝裂霉素C处理两个半小时。10ng/ml丝裂霉素C的使用条件是在37℃和5%CO2下。冲洗细胞几次以完全除去丝裂霉素C,然后采用酶(如胰蛋白酶-EDTA)进行胰蛋白酶化。然后计数这些细胞,并且以6.25×104细胞/cm2浓度平铺在0.2%的凝胶平板上。这些细胞平铺后培养在37℃和5%CO2下。这些平板用于平铺培养分离的人ES细胞。
2)ICM分离
为了无细胞损失风险的分离ICM,将完整的胚胎培养方法施用于6天的胚胎培养物(附图1和3)。透明带用0.5%链霉蛋白酶消化约2分钟。ICM接着平铺在有丝分裂分裂失活的MEF细胞上。用在这种技术中的人ES细胞培养基的组成如下:80%DMEM/F-12(GIBCO,带有4500mg/L葡萄糖)、15%ES测试FBS(Hyclone,USA)、5%血清替代品(GIBCO,#10828-028)、1%非必需氨基酸溶液(GIBCO)、1mM谷氨酰胺(GIBCO)、0.1%β巯基乙醇(Sigma)、4ng/ml人bFGF(R&D系统)和10ng/ml人白血病抑制因子(Sigma)。7天后,分离用微量吸管机械分离ICM团块与其他细胞。随后ICM团块重新平铺在新鲜的饲养细胞层上并加入新鲜的培养基。
3)培养和手工传代人ES细胞
未分化克隆的随后传代的进行是用尖锐边缘的微量吸管系统地切下团块中的克隆,其中团块中约含100个细胞(附图4)。通过去除任何不需要的分化区域的克隆进行筛选。一旦分离团块,用同样的带有口吹吸设备的微量吸管(内径梢大于团块大小)吸取并转移到新鲜的成纤维细胞饲养层上。培养系统维持在恒定的温度37℃,并放置在5%CO2的温箱中。细胞系ReliCellTM hES1体外生长40代,所述细胞系仍旧主要由形态学上是人ES细胞的细胞组成。
4)冷冻保存人ES细胞
三天龄的“好”的未分化人ES克隆用于冷冻。采用细胞刮层器具将ES克隆与饲养层一起分成小份。然后,细胞收集在无菌的5ml离心管(Nunc)中,200G离心3分钟。吸去上清液。测定细胞小球的体积后重悬在ES培养基中,并使其体积至0.5ml。下一步,等体积的冷冻培养基,其中包括60%ES测试FBS(Hyclone,USA)、20%ES培养基,和20%DMSO HYBRIMAX(Sigma),轻轻的加入到hES细胞悬浮液中,伴随着不时的搅拌。ES细胞团块转移到包含冷冻培养基的1.2ml冷冻小瓶(Nalge-Nunc,USA)中。小瓶在冷冻柜(Sigma)中缓慢地冷冻(~1°c/min)至-80℃,第二天保存在液氮中。关于复苏率,发现冷冻人ES细胞解冻后的存活率大约为50%或更高。
实施例4
目前的实施例鉴定分离的人ES细胞。
1)产生胚状体
为了产生胚状体(EBs)人ES细胞克隆需要手工分割成小份或者用胶原酶或胰蛋白酶EDTA酶促处理溶解成小份。在此,人ES细胞克隆手工被分割成小份用于胚状体形成。EB培养基(80%DMEM/F-12(GIBCO,带有葡萄糖4500mg/L)、15%ES测试FBS(Hyclone,USA)、5%血清替代品(GIBCO,#10828-028)、1%非必需氨基酸溶液(GIBCO)、1mM谷氨酰胺(GIBCO)、和0.1%β巯基乙醇(Sigma))中的小份转移到细菌平板上集合。使细胞集合在此培养基上生长10-14天,每3天换一次培养基。鉴定这种方法产生的EBs采用悬浮培养不同天数的细胞和分子标记,例如,0天、6天、10天和14天(附图9.1-9.4),以评价人ES细胞系的体外分化潜能。
2)免疫细胞化学
生长在2-孔腔式载波片(Becton Dickinson,USA)的细胞被固定在新鲜制备的4%多聚甲醛,并使用0.2%Triton X-100的PBS进行透化处理。非特异性结合位点用含1%小牛血清白蛋白的PBS封闭。细胞随后同初级抗体在4℃温浴过夜。采用这种方法,分析一组未分化干细胞标记如Oct-3/4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、碱性磷酸酶、Connexin 43、E-钙粘蛋白(图5.1到5.8),同时分析一组分化标记如巢蛋白(外胚层)、平滑肌肌动蛋白和Brachyury(中胚层)、AFP和GAT A-4(内胚层)(附图10.1-10.5)。(表1列出所用抗体的相关信息)。随后冲洗细胞并与合适的FITC标记的二级抗体在室温黑暗中放置1小时。下一步,细胞用DAPI(lug/ml;Sigma)对比染色。计数后,在荧光显微镜(Nikon Eclipse E600)下观察细胞,以评价免疫阳性区域。人ES细胞表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和Oct-4(是典型的人ES细胞),以及表达E-钙粘蛋白和间隙连接蛋白43(Connexin-43)(附图5)。由荧光显微镜可知人ES细胞也显示碱性磷酸酶活性(附图5.8)。进一步,14天的EBs对分化标记如巢蛋白(外胚层),平滑肌肌动蛋白和短尾(Brachyury)(中胚层)、GAT A-4和AFP(内胚层)显示出阳性染色(附图10)。
表1:详述所用的抗体
抗体名称 | 制造商 | 稀释度 |
Oct-3/4 | Santacruz, USA | 1∶100 |
SSEA-1 | ES细胞鉴定试剂盒(Chemicon;Cat#SCR001) | 1∶40 |
SSEA-3 | ||
SSEA-4 | ||
TRA-1-60 | ||
TRA-1-81 | ||
碱性磷酸酶 | ||
E-钙粘蛋白 | Santacruz,USA | 1∶200 |
Connexin 43 | Santacruz,USA | 1∶200 |
巢蛋白 | Chemicon,USA | 1∶200 |
平滑肌肌动蛋白 | Santacruz,USA | 1∶100 |
GATA4 | Santacruz,USA | 1∶100 |
3)RT-PCR分析基因表达
根据制造商说明通过TRIzol方法(Invitrogen)分离本文公开的ES细胞的总RNA。1μg用RNase-OUT核糖核酸酶抑制剂(Invitrogen)处理后的RNA被用于cDNA分析。采用Superscript逆转录酶-II(Invitrogen)和寡dT(Invitrogen)启动反应进行逆转录。选择的PCR引物可区分cDNA和基因组DNA这是采用针对不同外显子特异性的单独引物来实现的。通过聚合酶链反应(PCR)扩增1μl of cDNA,其中采用Abgene 2X PCR master mix(Abgene,Surrey,UK)和合适的引物。评价一系列标记的表达,所述标记包括未分化干细胞标记和谱系特异性标记,其中未分化干细胞标记例如为Oct-4、Nanog、Rexl、Sox-2、FGF4、Utfl、Thyl、Criptol、ABCG2、Dppa5、TERT、Connexin-43和Connexin-45,所述谱系特异性标记例如为角蛋白5、角蛋白15、角蛋白18、Sox-1NFH(外胚层),Brachyury、Msxl、MyoD、HAND1、心肌肌动蛋白(中胚层),GATA4、AFP、HNF-4α、HNF-3β、白蛋白和PDX1 (内胚层)。表2列出了具体的引物。对于所有的基因,PCR进行35个循环,具体为:94℃起始变性1分钟后,进行35个循环的“94℃下30秒,相应基因引物的退火温度下45秒和72℃下1分钟。在最后一个循环后,在72℃下保持5分钟。早期传代和晚期传代的人ES细胞均清楚的表达一组与多能相关的基因,所述基因包括Oct-4、Nanog、Rex-1、Sox-2、Criptol、FGF4、Thyl、Utfl、ABCG2、Dppa5和hTERT,和间隙连接蛋白如Connexin-43和Connexin-45(图6和表3)。用作阴性对照的HEF细胞缺乏任何这些标记的表达。进一步,分别在0天、6天、10天和14天EBs评价有关谱系特异性分化的所有列表基因的表达格局(附图11和表3)。EBs被观察到从分化的第6天到14天期间的早期阶段外胚层标记的一致表达,所述标记例如为角蛋白5、角蛋白15和角蛋白18。有趣的是,这些基因在第0天分化时并不表达,后期阶段神经外胚层标记Sox-1和NFH只存在于第10天到第14天分化时(附图11)。在中胚层谱系标记中,Msxl(前心肌转录因子),在分化过程中均一的表达。其他中胚层标记被证明在ES细胞中表达很少或没有表达,所述标记包括brachyury、HAND1、MyoD和心肌肌动蛋白(附图11)。类似地,早期内胚层细胞标记在细胞聚集体形成的第6天和第10天表达,尽管GATA4水平被证实在悬浮培养第10天到第14天有暂时的升高,其中所述标记包括AFP、HNF-4α和HNF-3β(附图11)。分别检测到成熟肝细胞、胰岛细胞的标记(分别为白蛋白和PDX1)表达很弱,因此证明了成熟内胚层衍生物的缺乏(附图11)。
表2:所用引物的详细信息
基因 | 引物序列 | 退火温度(deg C) | 预期的产物大小(bp) |
持家基因 | |||
GAPDH | 5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’(SEQ IDNO:1)5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’(SEQ ID NO:2) | 60 | 892 |
多能干细胞标记 | |||
Oct-4 | 5’-CGATGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG-3’(SEQ IDNO:3)5’-CAAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC-3’(SEQ ID NO:4) | 58 | 247 |
Nanog | 5’-CCTCCTCCATGGATCTGCTTATTCA-3’(SEQ ID NO:5)5’-CAGGTCTTCACCTGTTTGTAGCTGAG-3’(SEQ ID NO:6) | 52 | 262 |
Rexl | 5’-GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA-3’(SEQ ID NO:7)5’-CAGCATCCTAAACAGCTCGCAGAAT-3’(SEQ ID NO:8) | 56 | 306 |
Sox2 | 5’-CCCCCGGCGGCAATAGCA-3’(SEQ ID NO:9)5’-TCGGCGCCGGGGAGATACAT-3’(SEQ IDNO:10) | 55 | 448 |
Thy1 | 5’CATGAGAATACCAGCAGTTCACCCA-3’(SEQ ID NO:11)5’CACTTGACCAGTTTGTCTCTGAGCA-3’(SEQ ID NO:12) | 55 | 272 |
FGF4 | 5”-CTACAACGCCTACGAGTCCTACA-3’(SEQ ID NO:13)5’-GTTGCACCAGAAAAGTCAGAGTTG-3’(SEQ ID NO:14) | 53 | 370 |
ABCG2 | 5’-GTTTATCCGTGGTGTGTCTGG-3’(SEQ ID NO:15)5’-CTGAGCTATAGAGGCCTGGG-3’(SEQ ID NO:16) | 62 | 684 |
Dppa5 | 5’-ATGGGAACTCTCCCGGCACG-3’(SEQ ID NO:17)5’-TCACTTCATCCAAGGGCCTA-3’(SEQ ID NO:18) | 62 | 353 |
Utfl | 5’-ACCAGCTGCTGACCTTGAAC-3’(SEQ ID NO:19)5’-TTGAACGTACCCAAGAACGA-3’(SEQ ID NO:20) | 60 | 230 |
Criptol | 5’-ACAGAACCTGCTGCCTGAAT-3’(SEQ ID NO:21)5’-ATCACAGCCGGGTAGAAATG-3’(SEQ ID NO:22) | 62 | 217 |
hTERT | 5’-AGCTATGCCCGGACCTCTAT-3’(SEQ ID NO:23)5’-GCCTGCAGCAGGAGGATCTT-3’(SEQ ID NO:24) | 60 | 165 |
基因 | 引物序列 | 退火温度(deg C) | 预期的产物大小(bp) |
间隙连接蛋白 | |||
Connexin43 | 5’-TACCATGCGACCAGTGGTGCGCT-3’(SEQ ID NO:25)5’-GAATTCTGGTTATCATCGGGGAA-3’(SEQ ID NO:26) | 64 | 295 |
Connexin45 | 5’-CTATGCAATGCGCTGGAAACAACA-3’(SEQ ID NO:27)5’-CCCTGATTTGCTACTGGCAGT-3’(SEQ ID NO:28) | 64 | 819 |
外胚层标记 | |||
角蛋白8 | 5’-TGAGGTCAAGGCACAGTACG-3’(SEQ ID NO:29)5’-TGATGTTCCGGTTCATCTCA-3’(SEQ ID NO:30) | 60 | 161 |
角蛋白15 | 5’-CACAGTCTGCTGAGGTTGGA-3’(SEQ ID NO:31)5’-GAGCTGCTCCATCTGTAGGG-3’(SEQ ID NO:32) | 62 | 196 |
角蛋白18 | 5’-GGAGGTGGAAGCCGAAGTAT-3’(SEQ ID NO:33)5’-GAGAGGAGACCACCATCGCC-3’(SEQ ID NO:34) | 60 | 164 |
Sox-1 | 5’-TACAGCCCCATCTCCAACTC-3’(SEQ ID NO:35)5’-GCTCCGACTTCACCAGAGAG-3’(SEQ ID NO:36) | 60 | 201 |
NFH | 5’-TGAACACAGACGCTATGCGCTCAG-3’(SEQ ID NO:37)5’-CACCTTTATGTGAGTGGACACAGAG-3’(SEQ ID NO:38) | 58 | 400 |
中胚层标记 | |||
Brachyury | 5’-TAAGGTGGATCTTCAGGTAGC-3’(SEQ ID NO:39)5’-CATCTCATTGGTGAGCTCCCT-3’(SEQ ID NO:40) | 60 | 251 |
MyoD | 5’-GTCGAGCCTAGACTGCCTGT-3’(SEQ ID NO:41)5’-GGTATATCGGGTTGGGGTTC-3’(SEQ ID NO:42) | 60 | 217 |
Msxl | 5’-CCTTCCCTTTAACCCTCACAC-3’(SEQ ID NO:43)5’-CCGATTTCTCTGCGCTTTTC-3’(SEQ ID NO:44) | 62 | 287 |
HAND1 | 5’-GCCTAGCCACCACTGCGCTTTTC-3’(SEQ ID NO:45)5’-CGGCTCACTGGTTTAACTCC-3’(SEQ ID NO:46) | 62 | 389 |
心肌肌动蛋白 | 5’-TCTATGAGGGCTACGCTTTG-3’(SEQ ID NO:47)5’-CCTGACTGGAAGGTAGATGG-3’(SEQ ID NO:48) | 50 | 630 |
内胚层标记 | |||
AFP | 5’-AGAACCTGTCACAAGCTGTG-3’(SEQ ID NO:49)5’-GACAGCAAGCTGAGGATGTC-3’(SEQ ID NO:50) | 62 | 577 |
基因 | 引物序列 | 退火温度(degC) | 预期的产物大小(bp) |
GATA4 | 5’-CTCCTTCAGGCAGTGAGAGC-3’(SEQ ID NO:51)5’-GAGATGCAGTGTGCTCGTGC-3’(SEQ ID NO:52) | 52 | 680 |
HNF-4alfa | 5’-TCTCATGTTGAAGCCACTGC-3’(SEQ ID NO:53)5’-GGTTTGTTTCTCGGGTTGA-3’(SEQ ID NO:54) | 50 | 501 |
HNF-3 beta | 5’-GACAAGTGAGAGAGCAAGTG-3’(SEQ ID NO:55)5’-ACAGTAGTGGAAACCGGAG-3’(SEQ ID NO:56) | 56 | 237 |
白蛋白 | 5’-CCTTTGGCACAATGAAGTGGGTAACC-3’(SEQ IDNO:57)5’-CAGCAGTCAGCCATTTCACCATAGG-3’(SEQ ID NO:58) | 58 | 450 |
PDX1 | 5’-GTCCTGGAGGAGCCCAAC-3’(SEQ ID NO:59)5’-GCAGTCCTGCTCAGGCTC-3’(SEQ ID NO:60) | 62 | 362 |
表3:基因表达分析概述
系列号 | 基因名称 | 观察到的表达 | ||
RelicellTMhES1 | BG01人ES细胞系,如(BRIMBLE,等,2004,见前) | HEF | ||
持家基因 | ||||
1. | GAPDH | + | + | + |
多能干细胞标记 | ||||
2. | OCT-3/4 | + | + | - |
3. | Nanog | + | + | - |
4. | Rex1 | + | + | - |
5. | TDGF1 | + | + | - |
6. | Thy1 | + | NR | + |
7. | Sox-2 | + | + | - |
8. | FGF4 | + | NR | - |
9. | Utf1 | + | + | - |
10. | ABCG2 | + | + | - |
11. | Dppa5 | + | + | + |
12. | Cripto | + | + | - |
13. | TERT | + | + | - |
间隙连接蛋白 |
14. | Connexin43 | + | + | - |
15. | Connexin45 | + | + | - |
细胞聚集物的外胚层标记 | ||||
16. | 角蛋白8 | + | + | - |
17. | 角蛋白15 | + | + | - |
18. | 角蛋白18 | + | + | - |
19. | NFH | + | + | - |
20. | Sox-1 | + | + | - |
细胞聚集物的中胚层标记 | ||||
21. | Brachyury | + | + | - |
22. | MyoD | + | + | - |
23. | Msx2 | + | + | + |
24. | HAND1 | + | + | - |
25. | C-actin | - | + | - |
细胞聚集物的内胚层标记 | ||||
26. | GATA4 | + | + | - |
27. | AFP | + | + | - |
28. | HNF4a | - | NR | - |
29. | HNF3b | + | + | - |
30. | 白蛋白 | - | NR | - |
31. | PDX1 | + | + | - |
4)HLA分类
由于人ES细胞表达的HLA抗原谱系具有临床相关特征,从而要建立ReliCellTM hES1细胞系的HLA格局。简要地,HLA DNA分类的进行是采用PCR扩增的DNA的适宜性杂交(adoptedhybridization),其中使用序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)作为HLA分型的主要技术(Tepnel Lifecodes Corporation,Wythenshawe,Manchester,UK)。对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB和HLA-DQB基因座进行测试分析。
表4
HLA-A | HLA-B | HLA-C | HLA-DRB1 | HLA-DQB1 | |
RelicellhES1 | A*01 | B*5601 | 01 | 01 | 05 |
A*02 | A*35 | 04 | 01 | 05 |
如表4显示,结果证明ReliCellTM hES1细胞系代表如下范围的HLA表型:等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB和HLA-DQB。
5)STR分类
建立ReliCellTM hES1细胞系的DNA指纹图谱。为STR分析所分析的基因座包括D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、vWA、THOl、牙釉蛋白、TPOX和CSFlPO(多重-PCR-为基础的PowerPlex 1.2试剂盒(Promega,Madison,WI,USA))。分析的基因座包括D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、vWA、THOl、牙釉蛋白、TPOX和CSFlPO,结果列在表5。这一组包含的所有基因座都是真正的的四-核甘重复。电泳分离扩增子,采用应用生物系统的Genotyper2.0软件分析。根据这些9个基因座的研究,很明显该细胞系来源自印度人的胚胎,这与至今报道的细胞系不同。这些指纹图谱的结果也在细胞系分散后提供了有用的细胞系信息。
表5
D5S818 | D13S317 | D7S820 | D16S539 | VWA | THO1 | TPOX | CSF1P0 | 牙釉蛋白 |
11,12 | 10,11 | 9,12 | 11,12 | 18 | 9 | 10,11 | 10,11 | X |
6)核型
分离的人ES细胞核型分析采用秋水仙酰胺阻止和G带显带技术的标准方法。简要地,60mm培养皿中培养的人ES细胞达到60%汇合。细胞与溴化乙锭(12ug/ml)在37℃,5%CO2下温育40分钟,随后用秋水仙酰胺(120ng/mL)处理40分钟。下一步,细胞用预先温热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶解。离心收集细胞,在低渗KCl溶液(0.075 M)中悬浮15分钟,然后在卡诺依(氏)固定液(冰醋酸∶甲醇;3∶1)固定。中期展开在湿的载波片上,空气干燥,90℃烘烤1小时,进行Giemsa染色。使用Olympus BX40显微镜对20个分裂中期进行完全的核型分析,并且使用数字成像系统拍摄图像。
7)端粒末端转移酶分析
端粒末端转移酶的分析采用非放射性同位素的凝胶基标准TRAP(端粒末端转移酶重复扩增)方案(Zhang等,(2000)Cell Res.,10(1):71-7和Rubiano等,(2003),Mem.Inst.Oswaldo Cruz.,98(5):693-5),其中采用Chemicon,USA(Catalog No.S7700)的TRAPeze端粒末端转移酶检测试剂盒。大约50-70个人ES细胞克隆沉淀,并用200μl IX CHAPS溶解缓冲液溶解。IX CHAPS溶解缓冲液中的细胞悬浮液在冰上孵育30分钟后在4℃以12,000g离心20分钟。上清液快速冷冻并储存在-80℃。使用Bradford化验测定总蛋白量。采用1-6μg总提取物分析端粒末端转移酶。热失活样品作为每个分析的阴性对照。对于端粒末端转移酶PCR,根据试剂盒指示,加入dNTP、TRAP引物混合物、TS引物和TAQ聚合酶制备主要混合物。下一步,加入细胞提取物,总反应体积维持在50μl。进行两步PCR反应(94℃下30秒和59℃下30秒),上述反应需要33到35个循环。PCR产物在12.5%非变性聚丙烯酰胺垂直凝胶上以400伏电泳,直到二甲苯蓝染料前沿到达整个电泳通道长度的三分之二。凝胶用1∶5000稀释度的SYBR GREEN I染色(分子探针,编号S-7567),在UV透照灯下可视,和采用凝胶文档系统(geldocumentation system)进行照相。产生的端粒末端转移酶产物(TPG)的相对定量是根据Zhang等,(2003)的方法进行的。TPB解释为公式:TPG={[(TP-B)/T I]/[(R8-B)/RI]}。其中,TP是测试提取物中产生的端粒末端转移酶产物;B是Blank溶解缓冲液中产生的端粒末端转移酶产物;R8是定量标准中产生的端粒末端转移酶产物,TSR8对照模板;T1是测试提取物的内部参照;和RI是定量标准的内部参照,TSR8对照模板。附图8显示37代ReliCellTM hES1的高端粒末端转移酶活性,其中采用NTERA-2 hEC细胞作为阳性对照,MEF作为阴性对照。
8)无菌和病原体试验
对ReliCellTM hES1细胞培养物进行进一步的细菌和真菌试验。培养物分别在温育的48小时、14天和21天时进行常规监测和报道。
另外,进行内毒素和支原体试验,其中采用Hoechst分析每个培养物。最后,筛选存在人病原体的培养物,所述病原体包括HIV-I、HIV-2、人T-CeIl淋巴营养性病毒I/II、HSV1、HSV2、EBV、CMV、乙肝病毒和丙肝病毒。
9)畸胎瘤形成
成体裸鼠用于畸胎瘤形成研究。未分化的人ES细胞悬浮液(每只动物5-10百万细胞)肌内注射动物。注射后,动物仍关在单独过滤器顶部的笼子里。这些笼子具有特殊动物隔离装置以预防任何可能的感染。8-10周后,用过量克他命(100mgg/kg i.p.)处死动物,和经颈动脉的灌注肝素盐水(0.9%盐溶液中含0.1肝素),接着灌注磷酸盐缓冲液制备的4%多聚甲醛。从动物分离肿瘤,将肿瘤在4%多聚甲醛和20%蔗糖中固定过夜。肿瘤用冷冻切片机切片(20μm),切片收集在明胶涂铺的载波片上。肿瘤切片用苏木精/伊红染色,显微镜下观察属于三个胚层(外培层、中胚层和内胚层)的细胞。附图7显示这个试验的结果。所有动物试验的进行都是依据机构动物伦理委员会的指导。
10)采用鼠ES细胞的分化肝细胞确立体外肝毒性模型
鼠ES细胞分化成肝细胞,上述分化借助于在不含LIF的培养基中Ebs的形成。4天悬浮培养后,15-20EBs平铺在35mm的培养皿上,并使其分化20-25天,所述培养皿涂抹1%基质胶(BD Biosciences,USA)。优化生长因子、细胞因子(例如,骨形成蛋白(BMP2和BMP4)、肝细胞生长因子(HGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、和碱性-FGF(bFGF))和皮质激素(例如,地塞米松)的浓度,从而利于肝分化。通过RT-PCR和免疫细胞化学检测肝标记的阳性表达以证实获得的分化细胞是肝细胞。处于亚汇合阶段(通常在平铺培养48小时)的HepG2(人肝癌细胞系)可用作阳性对照,以优化基于分化的ES细胞的肝毒性模型。HepG2以剂量依赖性模式暴露于CCl4(Sigma)一段时间(30,90,120,150,180和240分钟)(0.1%,0.3%,0.6%和1.0%)。根据这些观察,对从鼠ES细胞分化的肝细胞(第20天)试验条件进行选择,结果为0.6%的CCl4和暴露时间180分钟(附图13)。在包含5%FBS的DPBS(Gibco-BRL,USA)中制备CCl4。在温育阶段的末期,收集悬浮液,并在1000rpm离心2分钟。悬浮液用于测定SGOT、SGPT、LDH和ALP水平。用细胞刮棒取出细胞,细胞悬浮液收集在eppendorf管中。细胞悬浮液在2000rpm离心4分钟,细胞沉淀溶解在200μl M-PER溶解缓冲液(Pierce,USA)中用于蛋白测定。
按照制造商的说明,细胞悬浮液用于测定SGPT、SGOT、(ALP)、和LDH水平。对于SGPT和SGOT,采用试剂盒(manul);对于LDH和ALP,采用HUMAN试剂盒(manul)。样品分析采用Konelab20i自动分析仪(Thermo Clinical Lab Systems,Finland)。水平表示为单位/升。
0.6%的CCl4导致SGPT、SGOT、ALP和LDH水平的时间依赖性增加,这表明随时间的增加,肝细胞损害也增加。这些酶的最大释放在180分钟时。事先用N-乙酰半胱氨酸处理(24hr,25μM)可有效阻断这些酶释放的增加。这表明事先用N-乙酰半胱氨酸处理可预防CCl4导致的肝细胞损害。
实施例4
目前实施例验证了ReliCellTM hES1和体外分化潜能。
为启动分化,诱导人ES细胞在悬浮培养中经历6-14天的EB形成,上述形成是通过将所述克隆机械分割成由100-150个细胞组成的小或中等大小的块,并在无LIF的和无饲养层的基础培养基中培养而完成的,且所述所述EB形成是在细菌学上的培养皿上。根据EBs上谱系特异性标记的表达格局判定适于分化诱导为不同表型的EBs的分化龄,所述谱系特异性标记由RT-PCR所证实。
神经外胚层分化:为了测定人ES细胞系分化为神经元的潜能,进行了多重步骤操作。在无血清的ITSFn培养基中温育6天龄的EBs7到10天,以筛选神经前体细胞。随后细胞在N2培养基上扩增,所述培养基补包含DMEM/F12,并添加有bFGF(10ng/ml)和EGF(10ng/ml)。分化步骤包括去除bFGF,并在添加GDNF(5ng/ml)的N2培养基中培养细胞2-3周。MAP-2(1∶200,chemicon)(一种神经元细胞标记)的表达是通过免疫荧光分析而进行评估,从而证实神经元分化。
中胚层分化:产生EBs后,8天龄的EBs接种在35mm的组织培养皿(Nunc,Roskilde,丹麦)上,所述培养皿事先涂铺包含0.1%明胶(Sigme,USA)的80%DMEM培养基,该培养基添加有15%FBS、1%非必需氨基酸、1mM谷氨酰胺、0.1%β-巯基乙醇和12.5ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子。EBs有规律的跳动出现在分化培养的第17-18天,这表明了心肌的分化,并且在相差显微镜下每天仔细观测监控所述跳动超过45天。EBs完整的收缩区域用无菌的玻璃拉伸的吸管在立体显微镜下机械分离,平铺到明胶包被的2孔腔式载波片(Nunc,Roskilde,丹麦)上用于进一步的鉴定。
内胚层分化:为了诱导胰腺的分化,进行Segev等,(2004)的经典操作规程。10天龄的EBs平铺在35mm的塑料组织培养皿(Nunc,Roskilde,丹麦)上,并使其生长于培养基I中,所述培养基包含DMEM F/12、胰岛素(10ng/l)、运铁蛋白(6.7ng/l)、硒(5.5mg/l)和1mM L-谷氨酰胺(所有来自Gibco),并添加有5μg/ml纤连蛋白(Sigma)。一周后,细胞用0.05%胰蛋白酶-EDTA(Gibco-Invitrogen)溶解并重新平铺于预先涂铺0.1%明胶的35mm塑料组织培养皿(Nunc,Roskilde,丹麦)上,细胞浓度达2x105细胞/ml,所述培养皿内含培养基II,且所述培养基II包含DMEM F/12、500μg/ml胰岛素、10,000μg/ml运铁蛋白、0.63μg/ml孕酮、1.611μg/ml putrascine、和0.52μg/ml亚硒酸盐(添加有N2和B27,两者都来自Gibco),和1mM L-谷氨酰胺和10ng/ml bFGF(R&D systems)。在这个阶段,监测胰岛样凝块的出现,并对其采用组织特异性标记(如PDX-1)进行免疫化学分析。
为了诱导肝细胞分化,10天龄的EBs平铺在35mm的塑料组织培养皿(Nunc)上,并使其在培养基中分化25-30天,所述培养皿预先涂铺1%基质胶(BD Biosciences,Bedford,MA,USA),所述培养基包含DMEM(高糖)、10%FBS、L-谷氨酰胺(ImM)、非必需氨基酸(1%)、β-巯基乙醇(0.1mM)、肝细胞生长引子(HGF)20ηg/ml、FGF4(10ηg/ml)、人制瘤素(10ηg/ml)、胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸(ITS)(1X)、地塞米松(10-5mM)和EGF(20ηg/ml)(所有的生长因子都来自R&D Biosystems)。在分化过程中,监控培养物中椭圆形细胞出现。为了进一步鉴定,分析包含分化20天的细胞的2-孔腔式载波片。
检查细胞系分化为多种表型细胞的分化潜能。在吸附到培养皿后,从人ES细胞克隆形成的EBs注定被诱导分化为神经外胚层、中胚层和内胚层。添加ITSFn培养基后,一周内EBs开始增生扩散并发育成多种神经突起样衍生物。这些神经前体细胞在培养在组织培养平板中的N2培养基时发育成圆形细胞体,所述平板事先涂铺聚-1-鸟氨酸和层粘连蛋白,所述细胞体将逐渐呈现神经元形态,发展为双极或多极延伸,并最后形成网络状。在撤掉bFGF和添加分化培养基后,这些细胞显示典型的神经元外观,其进一步显示初级的分支和二级分支(附图12.1)。间接免疫染色显示这些细胞对神经元特异性蛋白标记MAP-2具有免疫活性(附图12.2)。因为细胞的尺寸和定向对于心肌细胞网络至关重要,所以研究了人ES细胞衍生的心肌克隆的结构特性。在分化15-18天时鉴定出自发收缩区域存在于Ess的生长晕处,(附图12.3)。进一步,免疫化学显示心肌肌钙蛋白I(cTnI)(1∶200,Chemicon,Temecula,CA,USA)的存在,其为一种心肌特异性蛋白,并涉及分化Ebs的心肌收缩调节(附图12.4)。在胰腺祖细胞扩展后,观察到胰岛样凝块,这一点由PDX-1标记免疫染色来证实(附图12.5和12.6)。在分化15-18天后,可见椭圆形细胞凝块,这说明了肝细胞的分化。AFP是一种内胚层特异性标记,其在分化15天后被检测到。进一步,采用CK18的免疫染色证实了角蛋白的存在,这对肝胚细胞而言是正确的(附图12.7和12.8)。
本文公开的所有组合物和方法都可以制备和实施,根据目前的公开内容并不需要过多的试验。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选的实施方案描述,很显然,对于本领域技术人员来说,对本发明的组合物和/或方法和方法中的步骤或步骤顺序所做的变更,并不偏离本发明的内容、精神和范围。更具体地,很显然某些化学或生理相关的试剂,可替代本文描述的试剂而获得相同或相似的结果。所有这样的取代或修饰对于本领域技术人员来说是显而易见的,属于本发明的精神、范围和内容之内。
Claims (21)
1.人多能胚胎干细胞的纯化制剂,其中所述细胞包括:
(i)能够分化为如下衍生物:内胚层、中胚层和外胚层组织,
(ii)正常核型,
(iii)能够体外培养增殖至少约25代,和
(iv)一种或多种如表4所列的人白细胞抗原(HLA)等位基因。
2.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞包含两种或两种以上的如表4所列的HLA等位基因。
3.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞包含三种或三种以上的如表4所列的HLA等位基因。
4.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞包含四种或四种以上的如表4所列的HLA等位基因
5.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞包含所有如表4所列的HLA等位基因。
6.如权利要求1所述的制剂,其中所述制剂在体外繁殖培养超过1年。
7.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞在成纤维细胞饲养层上培养时,其分化受到抑制。
8.如权利要求7所述的制剂,其中所述成纤维细胞饲养层是人成纤维细胞饲养层。
9.如权利要求7所述的制剂,其中所述成纤维细胞饲养层是鼠成纤维细胞饲养层。
10.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞进行无饲养层体外培养时,其分化受到抑制。
11.如权利要求1所述的制剂,其中所述制剂在培养40代后基本上保持未分化。
12.如权利要求1所述的制剂,其中所述制剂在培养100代后基本上保持未分化。
13.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞进一步包含如表5所列的一种或多种短串联重复序列基因座。
14.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞进一步包含如表5所列的两种或多种短串联重复序列基因座。
15.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞进一步包含如表5所列的三种或多种短串联重复序列序列基因座。
16.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞进一步包含如表5所列的所有短串联重复序列序列基因座。
17.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞对SSEA-3和SSEA-4标记呈阳性。
18.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞对TRA-1-60和TRA-1-81标记呈阳性。
19.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞表达碱性磷酸酶。
20.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞表达高水平的端粒末端转移酶。
21.如权利要求1所述的制剂,其中所述细胞在悬浮培养时能形成胚状体。
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