CN101213212A - 削弱hiv-1增殖的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

一种结合出现在HIV－1多种毒株和亚型中的HIV－1 Tat蛋白表位内的多种变体序列的单一分离的抗体或其抗体片段。这种“泛－表位”抗体被用于治疗性和预防性组合物及治疗HIV－1感染而无论是何种毒株。这种泛－表位抗体被用于基于测量生物样品中Tat蛋白的量而检测HIV－1水平的试验。

Description

削弱HIV-1增殖的方法和组合物
发明背景
本发明总的涉及用于抑制有症状或无症状的慢性感染患者中的人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)增殖、从而尽可能减少发展成AIDS的组合物和方法。
目前采用了或正在研究多种治疗人免疫缺陷病毒(HIV-1)患者的治疗方法。某些治疗HIV-1的方法关注于HIV-1的反式激活基因(tat)，该基因产生病毒高水平转录必需的蛋白质(Tat)。已测定了tat基因及其蛋白质的序列，并检测了它们在HIV的建议治疗中的作用(例如可参见美国专利6,525,179)。Tat蛋白在细胞外释放，使它可被其它感染细胞摄取，以增强这些细胞中HIV-1的转录，它也可被未感染的细胞摄取，从而改变宿主细胞的基因激活作用并使细胞易于被病毒感染。细胞对Tat的摄取非常强烈，已报道这种摄取由该蛋白质的一条短的碱性序列介导(S.Fawell等，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：664-668)。
已经在动物中制得了Tat蛋白的单克隆和多克隆抗体，这两种抗体显示能在体外阻断Tat蛋白的摄入，将Tat蛋白的这种单克隆或多克隆抗体加入组织培养介质能在体外减弱HIV-1感染(例如可参见美国专利6,524,582中提到的文献)。
本发明共同发明人之一先前发表的科学论著和专利(例如，G.Goldstein，1996Nature Med.2：960；G.Goldstein，2000 Vaccine，18：2789；1995年11月30日公布的国际专利申请WO 95/31999；1999年1月21日公布的国际专利申请WO 99/02185；2002年11月8日公布的国际专利申请WO 01/82944；美国专利5,891,994；6,193,981；6,399,067；6,524,582；和6,525,179；公布的美国专利申请US 2003/0,166,832和US2003/0,180,326)指出，HIV-1 Tat蛋白上某些表位的抗体可作为AIDS疫苗和治疗剂。
例如，这些公布涉及与跨越下述Tat氨基酸残基4-12的“HIV-1 Tat表位1”序列内的表位特异性结合的抗体：Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-Trp-Z12-(SEQ ID NO：1)，其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn，Y9是Glu或Asp，Z12是Lys或Asn，以及由该抗体和HIV-1 Tat的其它抗体组成的组合物。这些公布还涉及含有与跨越下式所示Tat氨基酸残基41-50的“HIV-1 Tat表位2”序列内的表位特异性结合的分离抗体的其它抗体组合物：-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-(SEQ ID NO：2)，其中，X42是Gly或Ala。此外，这些公布涉及与跨越下式所示Tat氨基酸残基56-62的“HIV-1Tat表位3”序列内的表位特异性结合的分离抗体：-Arg-ATg-X58-Z59-A60-Y61-Ser-(SEQID NO：3)，其中，X58是Ala、Pro、Ser或Gln，Z59是Pro或His，A60是Gln或Pro，Y61是Asp、Asn、Gly或Ser，或是与跨越下式所示Tat氨基酸残基62-73的“HIV-1Tat表位4”序列内的表位特异性结合的分离抗体：-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-(SEQ ID NO：4)，其中，X64是Asn或Thr，Y67是Ala或Val。
由这些抗体的组合，其中尤其包括一种表位1变体的抗体和分别结合不同表位1变体的一种或多种抗体的组合，以及这种表位1抗体和表位2抗体的其它组合，形成的组合物能够结合大量多种HIV-1毒株和亚型(B进化支和非B进化支)特有的Tat变体序列。这些抗体组合物被设计用来在感染初期和/或血清转化后病毒载量较低时抑制HIV-1感染，从而延迟发展成AIDS。再者，这些所得组合物或这种抗-Tat抗体的混合物具有可治疗病毒许多毒株和亚型的优点，因此不需要不同的、特异于毒株的治疗剂。
尽管关于HIV-1疾病发展的知识不断积累，但本领域仍需要开发治疗慢性HIV-1感染的组合物和方法，以延迟或阻止感染发展到通常致命的、全面的AIDS。
发明概述
一方面，本发明提供了一种单一分离的抗体或其片段，其结合多种HIV-1 Tat表位1变体序列(以后称为“泛-表位(pan-epitope)1”抗体)，从而结合多种毒株和亚型的HIV-1 Tat蛋白。一实施方案中，所述单一泛-表位1抗体结合HIV-1 Tat表位1的5种或至少5种变体序列，这将在以下本发明的详细描述中详细定义。
另一实施方案中，所述单一泛-表位1抗体结合HIV-1 Tat表位1的至少2种变体序列。再在其它实施方案中，所述单一泛-表位1抗体或片段结合至少一种如下文所定义的变体Tat表位1序列(a)-(d)和至少一种如下文所定义的变体序列(e)-(h)。另一实施方案中，所述单一泛-表位1抗体结合至少3种、或者至少4种变体HIV-1Tat表位1序列。
另一实施方案中，所述单一泛-表位1抗体结合这些序列中的至少6种。另一实施方案中，所述单一泛-表位1抗体结合至少7种或者至少8种变体HIV-1 Tat表位1序列。另一实施方案中，所述单一泛-表位1抗体结合9种或更多变体HIV-1 Tat表位1序列。另一实施方案中，单一泛-表位1抗体与95％以上的HIV-1 Tat蛋白(B进化支和非B进化支)的已知变体反应。
另一方面，本发明提供了一种含有一种上述单一泛-表位1抗体的药物组合物。另一实施方案中，所述组合物含有多种不同上述泛-表位1抗体。再在另一实施方案中，所述组合物含有其它HIV-1抗体。这种组合物被用来使导致AIDS的慢性病毒血症最小化。这种组合物对于有或没有症状慢性感染患者或对于接受其它抗逆转录病毒治疗的患者有用。
再一方面，本发明提供了一种诊断试验试剂，其中含有上述单一泛-表位1抗体或片段以及可检测标记或标记系统。
另一方面，本发明提供了一种用于进行夹心试验的试剂盒，其中装有一种或多种泛-表位1抗体或片段、一种或多种结合HIV-1 Tat上除表位1之外的表位的其它HIV-1Tat抗体，以及任选的一种或多种用于鉴定抗体的结合的可检测标记或标记系统。
在其它方面，本发明提供了一种用于进行某种试验的试剂盒，其中装有一种或多种泛-表位1抗体或片段以及一种或多种用于鉴定泛-表位1抗体与Tat的结合的可检测标记或标记系统。本发明的另一种试剂盒还包括有涂层的固态支持物、混杂基材和引起或检测由标记提供的信号的装置，以及采集血样的常规装置、合适的试管和其它诊断试验组件。
再在另一方面，本发明提供了一种通过给予受感染的人类对象这里所述的药物组合物以在所述对象中抑制HIV-1复制或降低HIV-1病毒水平的方法。一实施方案中，所述方法包括给予本发明的组合物以在慢性感染对象中维持较低的HIV-1病毒水平。
另一方面，本发明提供了泛-表位1抗体在制备用于在人类对象中抑制HIV-1复制的药物中的应用。一实施方案中，该应用采用结合5种或更多不同表位1变体序列的泛-表位1抗体。另一方面，本发明提供了泛-表位1抗体或抗体片段以及抗-表位2抗体或抗体片段在制备用于在人类对象中抑制HIV-1复制的药物中的应用。
再一方面，本发明提供了一种制造单个分离泛-表位1抗体或其片段的方法。
再在另一方面，本发明提供了一种测定对象中HIV-1 Tat水平的诊断试验。一实施方案中，所述试验是一种采用本发明的泛-表位1抗体的竞争性试验。在其它实施方案中，所述泛-表位1抗体是一种结合至少5种Tat表位1变体序列的抗体，即泛-表位1抗体#5。
在以下对本发明优选实施方案的详细描述中将进一步描述本发明的其它方面和优点。
附图简述
图1比较了在接触升高剂量(μg/ml)的本发明的泛-表位1 IgG抗体(pan-Ep-1aby，菱形)和抗体对照(方形)的被HIV-1感染的(1％最初感染)Jurkat细胞中HIV-1毒株IIIB复制的抑制情况。泛-表位1 IgG抗体结合HIV-1 Tat表位1的5种变体。这5种变体存在于95％以上的HIV-1B和非B毒株中。病毒水平在感染后的第7天通过HIV-1 p24蛋白检测ELISA测定。数据显示了相比对照，在抗体浓度增加下的抑制情况。
图2显示了在图1的试验中，剂量为10 TCID50的相同的泛-表位1 IgG抗体(pan-Ep-1；菱形)、结合表位2的单克隆抗体(Ep 2 aby；方形)、同时使用的两种单克隆抗体(三角形)以及抗体对照(X)的抑制图。所得曲线(三角形)表明，与单独使用泛-表位1抗体(菱形)或表位2抗体(方形)得到的结果相比，同时使用泛-表位1抗体和表位2抗体产生了协同效应。
图3显示了竞争性试验的结果，其中，用200ng/ml Tat包被平板。在缓冲液中含有升高量HIV-1 Tat的样品与包被的Tat竞争结合10ng用生物素标记的检测剂泛-表位1抗体。随着样品中Tat量的增加，结合到平板的泛-表位1抗体的量减少。用羊抗人抗体IgG-辣根过氧化物酶(HRP)试剂检测结合，该试剂结合结合的泛-表位1抗体上的生物素。所述抗体与图1所用抗体相同。
图4是通过类似于图3所述的在50％血浆中进行的竞争性试验产生的人血浆中重组Tat剂量反应曲线。产生了典型的剂量反应曲线，该曲线表明，血浆对泛-表位1抗体与样品中Tat的结合没有影响。所述抗体与图1所用抗体相同。
图5比较了用类似于图3的试验得到的重组Tat(rTat)和对应于Tat表位1变体的肽在缓冲液中的剂量反应曲线。用Tat(200ng/ml)包被平板。肽用E1-RE(“RE”)、E1-NE(“NE”)、E1-SE(“SE”)、E1-KE(“KE”)、E1-ND(“ND”)和全长Tat(“Tat”)标记。这些肽和其它肽都称为“alt”，其定义见下表1。泛-表位-1抗体的浓度为10ng/ml。所有所得结合曲线都类似地表明，所有变体提供类似的结果。注意，在整篇说明书中，较短的生物素化的肽和较长的(“alt”)生物素化的肽产生相同结果。
图6A是用类似于图3的竞争性试验在3名HIV-1感染的人类对象中得到的图。对象用编号和符号区别，即，对象A(圆形)、对象B(方形)和对象C(菱形)。采用图1所示泛-表位1抗体的本发明的竞争性试验可用于在未感染血浆中进行RNA检测数天后鉴定Tat RNA的水平(ng/ml)。
图6B是与图6A类似的患者的图，该图测量了最初的RNA检测之后每天的病毒效价(RNA拷贝数/ml)。注意，对象B在第0天时就从极性感染中恢复。
图7显示了正常人外周血单个核细胞(PMBC)中HIV-1复制与IgG1泛表位#5抗体(即结合5种表位1变体的抗体)激活和抑制Tat的函数关系。前5根柱表示可变水平，即Tat浓度为0、0.1、1.0、10和100ng/ml。由图可见，诱导HIV-1复制的最佳浓度为10ng/ml。后6根柱显示了在接触10ng/ml最佳浓度的Tat的PBMC中，IgG1泛-表位#5抗体浓度不同时对HIV-1复制的抑制。在该图中，泛-表位#5抗体用任意参考符号“E”表示，显示了抗体浓度为0.2μg/ml、1μg/ml和10μg/ml时以及对照IgG1抗体浓度为1、10和50μg/ml时的结果。注意，在所有对照及IgG1泛-表位#5抗体浓度为0.2μg/ml中对HIV-1复制的抑制不显著(NS)(用任意参考符号“C”表示)，即p＞0.05。
发明详述
本发明满足了本领域对用于治疗和诊断多种毒株和亚型HIV-1感染的治疗和诊断剂及组合物的需要。本发明的泛-表位1组合物的一个独特优点包括，疗法的组成和应用比较简单，使用较少的试剂，但可有效抵抗全部的HIV-1毒株和亚型。类似地，本发明能够用一个试验和最少数量的试剂检测多种HIV-1毒株和亚型，从而无需许多单独的试验和用于可能感染对象的各种HIV-1毒株或亚型的试剂。
HIV-1 Tat表位1和泛-表位1抗体
文中，术语“变体HIV-1 Tat表位1序列”指下式表示的序列：
R1-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQ ID NO：5)，其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn；Y9是Glu或Asp；R1不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val；和R2不存在或是Trp-Z12-R3，其中，Z12不存在或是Lys或Asn，R3不存在或是是序列-His-Pro-Gly-Ser-(SEQ ID NO：27)的全部或部分。根据一个优选的实施方案，表位1序列在X7、Y9位含有可变氨基酸，R1是Val，R2不存在，即Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro(SEQ ID NO：28)。根据另一个实施方案，表位1序列含有三个可变位置X7、Y9和Z12位，不存在R1，R2是Trp-Z12-R3，其中，R3不存在，例如，Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-Trp-Z12(SEQ IDNO：29)。在上述式中，变体表位1序列的完整范围可以是长度约为7-14个氨基酸的序列，含有上述SEQ ID NO：5的片段或是包含SEQ ID NO：5的片段或整个SEQ IDNO：5的更长的序列。因此，下面的实施例中具体给出了8种以上的表位1变体序列。
另一个实施方案中，其它变体HIV-1Tat表位1序列包含下式表示的序列：Glu-Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro(SEQ ID NO：30)、Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Trp-Z12-(SEQ ID NO：31)和Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Trp-Z12-His-Pro-Gly-Ser-(SEQ ID NO：32)，以及上式范围内的其它。在下面的一个具体实施方案中，某些选出的变体HIV-1表位1序列可用以下8种序列表示：
(a)-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-(SEQ ID NO：33)
(b)-Val-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-(SEQ ID NO：34)
(c)-Val-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-(SEQ ID NO：35)
(d)-Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-(SEQ ID NO：36)
(e)-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Asp-Pro-(SEQ ID NO：37)
(f)-Val-Asp-Pro-Lys-Leu-Asp-Pro-(SEQ ID NO：38)
(g)-Val-Asp-Pro-Ser-Leu-Asp-Pro-(SEQ ID NO：39)
(h)-Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-(SEQ ID NO：40)
因此，一实施方案中，例如，泛-表位1抗体结合变体(a)、(b)、(c)、(d)和(h)。另一实施方案中，泛-表位1抗体结合(a)-(h)中多个变体的不同组合。
表位1的定义还包括同源或类似修饰的表位序列，其中，SEQ ID NO：5中的非可变氨基酸(即不是用单个字母和下标表示的氨基酸)可用具有类似特性的氨基酸残基保守性取代。例如，SEQ ID NO：5的非可变氨基酸残基可用具有相同电荷和/或类似侧链长度的其它氨基酸残基取代。类似地，SEQ ID NO：5中的非可变的天然产生的氨基酸可用非天然氨基酸残基(即在化学结构上具有修饰的氨基酸，如D-氨基酸、具有非天然产生的侧链的氨基酸、N-甲基化氨基酸等)取代。参见与N-甲基化氨基酸有关的参考文献。例如可参见L.Aurelio等，2002 Organic Letters，4(21)：3767-3769以及其中提到的参考资料。
因此，本发明提供了“泛-表位1抗体”，该术语是指能够结合多种HIV-1表位1氨基酸序列的单一分离的抗体或其片段。如下面的实施例中所证实的，希望泛-表位1抗体对其结合的所有变体序列的KD为1.0×10-9或更小。精通本领域的技术人员将容易理解，解离常数KD是通过测量缔合(ka)和解离(kd)得到的。希望本发明的所有泛-表位1抗体都具有类似的KD值。
如这里所例证的，泛-表位1抗体的一个实施方案是能够结合至少5种变体HIV-1表位1序列的单一分离的抗体或片段，在进一步的实施方案中，所述泛-表位1抗体是能够结合5种变体HIV-1表位1序列的单一分离的抗体或片段，再在进一步的实施方案中，所述泛-表位1抗体是能够结合以下5种变体HIV-1表位1氨基酸序列的单一分离的抗体或片段：VDPRLEPW-Z12-R3(SEQ ID NO：6)；VDPKLEPW-Z12-R3(SEQ ID NO：7)；VDPSLEPW-Z12-R3(SEQ ID NO：8)；VDPNLEPW-Z12-R3(SEQ ID NO：9)；和VDPNLDPW-Z12-R3(SEQ ID NO：10)，其中，Z12是Lys或Asn，R3不存在或是是序列-His-Pro-Gly-Ser-(SEQ ID NO：27)的全部或部分。在下面的试验中显示，这种结合5种变体的示例性IgG1泛-表位1抗体对所有5种变体序列的KD为1.0×10-9或更小。
泛-表位1抗体的另一种实施方案是能够结合至少2种变体HIV-1表位1序列，如上述变体表位1序列(a)-(h)中的两种的单一分离的抗体或其片段。再在其它实施方案中，泛-表位1抗体是能够结合至少3种变体HIV-1表位1序列的单一分离的抗体或其片段。在其它实施方案中，泛-表位1抗体是够结合至少4种变体HIV-1表位1序列的单一分离的抗体或其片段。另一实施方案中，结合2-4种不同表位1变体的本发明的泛-表位1抗体是结合至少1种在Y9位为Glu的变体HIV-1表位1序列和至少1种在Y9位为Asp的变体HIV-1表位1序列的抗体或片段。
另一实施方案中，所述单一分离的抗体或片段是结合至少6种变体HIV-1表位1序列的泛-表位1抗体。其它实施方案包括能够结合至少7种变体HIV-1表位1序列的单一分离的抗体或其片段。该术语还指能够结合至少8种变体HIV-1表位1序列的单一分离的抗体或其片段。当考虑Z12位的其它变化或任何侧翼氨基酸时，该术语还指能够结合至少9种或更多变体HIV-1表位1序列的单一分离的抗体或其片段。再在其它实施方案中，如下面的实施例所证实的，所述泛-表位1抗体对各变体序列的KD为1.0×10-9或更小。
一实施方案中，如下面的实施例中详细教导的，选出的单一泛-表位1抗体结合用上述8种序列(a)-(h)表示的序列变体HIV-1表位1序列中的2种到至多8种。
因此，一种单个分离泛-表位1抗体或片段结合变体序列(a)-(h)中的至少2种。本发明的另一种单一分离的抗体或片段结合2-4种所述不同变体序列。在一个具体的实施方案中，这种单个分离泛-表位1抗体或片段结合所述变体序列(a)-(d)中的至少一种和所述变体序列(e)-(h)中的至少一种。再其它的单个分离泛-表位1抗体或片段结合变体序列(a)-(h)中的任何5种到所有的8种。如下文所例证的，所述泛-表位1抗体由一种结合表位1(a)-(d)和(h)这5种变体的特定克隆产生。这种特定的抗体在本说明书中被称为泛-表位抗体#5。
然而，如上所述，泛-表位1抗体的其它例子可结合含Z12氨基酸的其它表位1序列或是用(a)-(h)表示的其中至少一个非可变氨基酸是非天然氨基酸的同源序列。
因此，本发明的单一泛-表位抗体或片段结合多种毒株和亚型的HIV-1 Tat蛋白。一实施方案中，单一泛-表位抗体或片段结合95％以上的已知HIV-1毒株和亚型，其中包括B进化支和非B进化支的毒株和亚型。
文中，术语“抗体”指含有两条轻链和两条重链的完整的免疫球蛋白。因此，单一分离的抗体或片段可以是单克隆抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。术语“抗体片段”指不完整的抗体结构，包括但不限于分离的单一抗体链、Fv构建物、Fab构建物、Fc构建物、轻链可变区或互补决定区(CDR)序列等。
这种泛-表位1抗体或片段是用例如下面实施例所述的连续选择和筛选技术或用其它合成或重组技术产生的。根据上文，本发明的单个分离泛-表位1抗体或片段可用包括从抗体或抗体片段库中连续和依次选择和筛选的方法制备。例如，选择包括使各个单链人Fv库与合成表位1肽和/或重组Tat蛋白接触，并将变体Tat表位1序列引入该库。例如，单链抗体可变序列(scFv)库可用于选择结合第一表位1变体氨基酸序列的序列，如含有该变体序列的生物素化的肽。获得结合到该第一序列的scFv混合物并弃去库中未结合的scFv。然后使选出的scFv混合物再连续并依次接触上述多种不同的表位1序列并连续弃去未结合的scFv，直到得到结合表位1的多种变体，如2、3、4、5、6、7或8种或者更多种表位1的不同序列的scFv混合物。然后处理并克隆所得结合所需数量表位1变体的scFv以提供选择的scFv的来源。例如，可对scFV进行处理以使其以所需的抗体或片段形式出现。
之后对各克隆进行筛选以确定其与不同HIV-1毒株和亚型的不同HIV-1 Tat表位1变体的反应性。可将筛选放大直到获得能结合选出的多种变体序列，如SEQ ID NO：5的2、3、4、5、6、7或8种或者更多种表位1变体序列的抗体或抗体片段或构建物。
泛-表位1抗体必需含有能够介导与多种表位1变体结合的scFv的可变区。然而恒定区可用现在常用的方法改变。例如，可将各泛-表位1scFv的可变区插入恒定区主链，如人IgG1主链。这种抗体描述于下面的实施例1。如此得到的泛-表位1抗体可以是含有人轻链可变区和人或非人来源(如猴子等)的重链的嵌合抗体、或是采用人IgG抗体主链的人源化抗体、或是抗体片段。在本说明书和免疫学常规技术中，选择合适的抗体主链和插入泛-表位1scFv是本领域的公知技术。
根据本说明书的指导，精通本领域的技术人员可得到这里所述的任何不同的泛-表位1抗体。
本发明的药物组合物和方法
因此，本发明的另一方面涉及一种用于治疗HIV-1的含有泛-表位1抗体或片段及药学上可接受的载体的药物组合物。这种药物组合物优选含有结合表位1结构式所示的8种X7/Y9变体的单一泛-表位1抗体或片段。另一种药物组合物可含有结合表位1的5种或更多种X7/Y9变体的单一泛-表位1抗体或片段。再一种药物组合物可含有结合表位1的2-7种X7/Y9变体的单一泛-表位1抗体或片段。再另一种组合物可含有结合表位1的9种或更多种X7/Y9/Z12变体的单一泛-表位1抗体或片段。
药物组合物的其它实施方案可含有两种或多种本发明的不同泛-表位1抗体，例如，两种或三种各自结合多个不同变体的抗体。例如，组合物中的一种泛-表位1抗体可仅结合其中的Y9是Glu的表位1变体，而组合物中的第二种表位1抗体仅结合其中的Y9是Asp的变体。通过这里的公开，精通本领域的技术人员可方便地制备许多这种组合。
本发明的药物组合物也可含有其它HIV-1表位的抗体，如之前鉴定的HIV-1Tat表位2。文中，术语“HIV-1Tat表位2”指序列-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-(SEQ ID NO：2)，其中X42是Gly或Ala。因此，一种药物组合物可含有与特异性结合表位2中的表位序列的抗体组合的本发明的泛-表位1抗体。
可方便地产生HIV-1病毒上其它蛋白质和免疫位点的其它抗体并使其含在本发明的合适的药物组合物中。或者，本发明的组合物可与其它HIV-1抗病毒疗法或药物方案联合使用或交替使用。
如文中所定义的，适用于本发明的蛋白质性免疫组合物的药学上可接受的载体是精通本领域的技术人员熟知的。这种载体包括但不限于：水、盐水、缓冲盐水、磷酸缓冲液、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液。根据常规技术也可加入其它常用稀释剂、佐剂和赋形剂。这种载体可包括乙醇、多元醇及其适当的混合物、植物油以及可注射的有机酯。也可采用缓冲剂和pH调节剂。缓冲剂包括但不限于从有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括但不限于：有机酸的盐，如柠檬酸(例如柠檬酸盐)、抗坏血酸、葡糖酸、产生、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐，Tris，盐酸氨基丁三醇(trimethanmine hydrochloride)或磷酸盐缓冲液。肠胃外载体可包括氯化钠溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格溶液或不挥发油。静脉内载体可包括体液和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格葡萄糖溶液的载体等。防腐剂和其它添加剂如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等也可提供在药物载体中。本发明对载体的选择没有限制。从上述组分制备这些具有合适pH等渗性、稳定性和其它常规特性的药学上可接受的组合物是本领域的公知技术。例如可参见《雷明顿药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，Lippincott Williams & Wilkins，publ.2000；和《药物赋形剂手册》(The Handbook ofPharmaceutical Excipients)，第4版，R.C.Rowe等编，APhA Publications，2003。
因此，本发明提供了泛-表位1抗体在制备用于在人类对象中抑制HIV-1复制的药物中的应用。
本发明的这种药物组合物可用于在接触HIV-1的人类对象中抑制HIV-1复制的方法。给予人类对象的本发明组合物的合适剂量是有效结合受感染细胞释放的HIV-1Tat蛋白的量。一实施方案中，所述药物组合物可治疗性地给予受HIV-1感染的人以治疗或控制病毒感染。这种受感染的人可以是无症状或是有症状的。泛-表位1抗体能减轻受感染对象的慢性病毒增殖并使发展成AIDS的进展最慢。例如可参见上述图1中的抑制试验的体外结果。
该方法通过使泛-表位1抗体阻断Tat从被感染的细胞转移到其它被感染或未感染的细胞而发挥作用。这种作用降低了感染复数并阻断了HIV-1病毒扩散的爆发，从而降低了病毒水平。在已经被感染的患者中，这种降低病毒水平的方法可减轻慢性病毒血症和向AIDS的发展。该方法可包括长期给予组合物。适合用这种方法治疗的患者是对疾病免疫妥协且无法产生强免疫应答的HIV-1感染患者。在HIV感染的晚期阶段，由于疾病造成免疫力受损，几乎没有产生有效抗体效价的可能性。这种患者还包括被HIV-1感染的怀孕妇女、受感染母亲的新生儿以及推定被感染的未免疫的患者(例如，由于疏忽而被受到HIV-1感染的人用过的针头“刺中”的人)。
这些泛-表位1抗体组合物被作为被动免疫疗法给予以抑制病毒增殖和降低病毒载量。与95％以上、或99％以上的已知HIV-1 Tat蛋白反应的外源抗体在患者中可立即阻止Tat从病毒感染的细胞转移到其它被感染或未感染的细胞。根据该方法，可在一长期治疗方案中用所述抗体组合物长期治疗患者。
本发明的另一特有方面涉及另一种抑制HIV-1复制的方法，该方法包括同时给予被感染的患者泛-表位1抗体和表位2抗体。预计这种方法可给予泛-表位1抗体和表位2抗体的组合作为单一组合物。或者，各抗体可作为单独的组合物同时或依次给予患者。令人吃惊的是，这两种抗体或抗体片段的组合产生了协同结果。这种结果表明，当一起使用时，使用比单独使用各抗体时所用的剂量低的抗体剂量可实现所需治疗结果，即减轻病毒血症。
抑制试验证实了这两种试剂之间的协同作用。当用于用来测定被HIV-1感染的细胞培养物中HIV-1 Tat抑制水平的体外抑制试验时，将泛-表位1抗体和表位2抗体作为药物组合物单独使用时产生了平行的病毒抑制结果。例如可参见图2。然而，出乎意料的是，当同时给予这两种抗体时提供了比单独使用任何一种抗Tat单体所提供的相对相等的抑制更强的对病毒水平的抑制。该试验的结果描述于图2。泛-表位1抗体和表位2抗体的这种协同活性是未曾料到的。
在上述各方法中，本发明的这些组合物是通过适当途径给予的，如通过皮下、口服、粘膜、静脉内、腹膜内、肌内、鼻或吸入途径。目前优选的给药途径是皮下、静脉内或肌内。
各剂中有或没有其它抗HIV-1抗体存在时，本发明的泛-表位1抗体的量将根据患者年龄、体重、性别、一般健康状况等加以选择。在患者中产生外源效应且没有显著不良副作用所需的抗体的量将根据所采用的药物组合物而变化。在感染患者中，各剂通常含有约5-400mg/mL泛-表位1抗体的无菌溶液注射液。另一种剂量约为200mg抗体。再一种剂量约为100mg抗体。再其它的实施方案是剂量约为50mg抗体。进一步的实施方案是剂量约为10mg抗体。当一起使用时，如上所述，在一实施方案中，泛-表位1抗体表位2抗体的剂量是相同的。另一实施方案中，由于两种抗体之间的协同作用，组合剂量低于单独使用各抗体的单一添加剂量。
长期给药的频率可从每天1次到每周1次或2次到每月1次，并取决于抗体的半衰期(例如，约7-21天)。然而，对这种感染患者的长期治疗时间估计是不确定的，但是会持续很久。其它剂量范围也是精通本领域的技术人员可以预计的，尤其是与其它抗病毒治疗联合或依次给予抗体组合物时。
本发明的组合物可用于长期治疗由于针头刺穿或母婴感染而有急性感染风险的对象。本发明的抗体组合物也可用于长期治疗受感染的患者或进行性HIV患者。
本发明的诊断试剂、试剂盒和试验
本发明的其它实施方案包括将本发明的泛-表位1抗体或片段用作诊断试验试剂，并可与可检测标记或标记系统一起使用，或者固定在基质上，或者与介导固定作用的其它试剂联合。
这种诊断试剂可含有结合表位1公式的8种X7/T9变体的单一泛-表位1抗体或片段。另一种诊断试剂可含有结合表位1的5种或更多种X7/T9变体的单一泛-表位1抗体或片段。再另一种诊断试剂可含有结合表位1的2-8种X7/T9变体的单一泛-表位1抗体或片段。再另一种诊断试剂可含有结合表位1的9种或更多种X7/T9变体的单一泛-表位1抗体或片段。
本发明的再一个实施方案包括本发明的诊断试剂盒，试剂盒中可装有本发明的单一泛-表位1抗体或者装有一些不同的本发明的泛-表位1抗体。例如，试剂中的一种泛-表位1抗体可仅结合其中的Y9是Glu的表位1变体，而试剂中的第二种表位1抗体仅结合其中的Y9是Asp的变体。通过这里的描述，精通本领域的技术人员可方便地制备各种此类组合。这种诊断或试验试剂盒还可含有其它HIV-1表位或非Tat蛋白的抗体。
这种试剂盒和试剂可用于测量和检测被HIV-1感染或可能被感染的对象中HIV-1和HIV-1 Tat的效价。抗体可被固定在合适的基质上，如结合到包被抗生物素蛋白的固体支持物如平板、杆或珠上。当然，也可采用精通诊断试验领域的技术人员已知的其它结合剂。
试剂盒中还提供了检测抗体与HIV-1 Tat结合的试剂，如非人抗体，例如羊抗人免疫球蛋白，等等。其它试剂包括常用的诊断标记或标记系统。例如，可用以下物质直接或间接标记抗体，例如，放射性化合物、放射性同位素，如32p、125I、tecnicium；荧光或化学发光化合物，如FITC、罗丹明或荧光素；和蛋白质，如生物素或酶以及酶辅因子，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；和/或分子标记，如FLAG等，例如可参见Chubet RG，Brizzard BL.1996 Biotechniques 20(1)：136-141；和KnappikA，Pluckthun A.1994 Biotechniques 1994；17(4)：754-761。标记系统的其它元件包括用来在与标记系统的其它组分反应时产生信号的物质，例如，链霉抗生物素蛋白和辣根过氧化物酶系统。也可采用本领域已知的将抗体单独偶联到可检测分子的任何方法，包括Hunter等，1962 Nature 133：945；Pain等，1981 J.Immunol.Meth.40：219和其它常用教科书中所述的那些方法。
或者，还可使用除抗体之外的标记。因此，该试剂盒中还包含阅读标记的多种试剂和装置，例如，某些与酶类标记反应产生有色信号的物质等等、采取血样的装置、以及合适的试管和其它诊断试验组分。
本发明的抗体可用于任何已知的试验方法，如竞争性结合试验、直接和间接夹心试验以及免疫沉淀试验。例如可参见Zola，《单克隆抗体技术手册》(MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques)第147-158页(CRC Press，Inc.1987)以及有关许多试验方法的其它常用试验教科书。一个实施方案是，用来检测患者HIV-1Tat水平的试剂盒可包含一种或多种泛-表位1抗体或片段、一种或多种与HIV-1上不同于表位1序列的表位结合的任选的其它HIV-1Tat抗体；以及一种或多种用来鉴定这些抗体的结合的可检测标记或标记系统。精通本领域的技术人员还可以方便地选择用于这种试剂盒的其它常用诊断组分。
另一实施方案中，用于检测患者HIV-1Tat水平的试剂盒包含单一泛-表位1抗体或片段，或者多种泛-表位1抗体and片段，以及一种或多种用于鉴定这些抗体的结合的可检测标记或标记系统。这种试剂盒适用于竞争性试验。
这种试剂盒和试剂可用于多种评估患者HIV-1效价的试验模式。这种患者可以是未感染的、感染的或正在用本发明的药物组合物或其它抗HIV-1疗法治疗的。
在本发明的一个实施方案中，所述泛-表位1抗体还可用于竞争性试验。在该实施方案中，测量对象中HIV-1 Tat水平的诊断试验包括使其上固定有已知量HIV-1 Tat蛋白的基材接触含未知量HIV-1的对象的生物样品以及与可检测标记相连的本发明的单个分离泛-表位1抗体或片段。泛-表位1抗体或片段的存在量相对于基材上结合的Tat的量不完全饱和(subsaturation)。冲洗基材并测量结合到所述基材的泛-表位抗体或片段的量。
将结合的泛-表位1抗体的量与标准结合曲线比较，该标准结合曲线测量不存在所述样品时各种已知量的泛-表位1抗体或片段与所述已知量的结合的Tat的结合。从而可通过与结合到所述基材的所述抗体的量的倒数关系确定所述样品中Tat的量。
这种竞争性试验采用结合2-8种(即2、3、4、5、6、7或8)或更多数量的表位1变体序列的泛-表位1抗体或片段，并可进行简单且更加有效的试验。本发明的依次试剂检验能够检测多种毒株和亚型的HIV-1感染而无需多种试剂和多次试验。
例如，测量HIV-1 Tat水平的诊断试验的另一个实施方案包括使对象的生物样品如体液，优选血液、血清或血浆，但也可以是尿液、唾液及其它液体或组织，接触与样品中的HIV-1 Tat结合的固定的“捕获”抗体。这种固定的捕获抗体可以是泛-表位1抗体或是结合不同于表位1的HIV-1 Tat表位的抗体。
固定是将捕获抗体结合到固体支持物如平板、杆或珠实现的。一旦生物样品暴露于固定的抗体足够时间，即可洗涤支持物以除去生物样品中任何未结合到肽上的物质。这种洗涤步骤是诊断试验中常用的，并优选采用常规缓冲液。
如果样品中存在HIV-1 Tat蛋白，则Tat将结合到结合的捕获抗体而被固定。之后，使结合的材料接触HIV-1 Tat的第二“检测”抗体。检测抗体可以是泛-表位1抗体或是结合不同于表位1的HIV-1 Tat表位的抗体，或是不同种类的非人抗体，只要该检测抗体不同于捕获抗体几何。检测抗体在HIV-1 Tat上结合的表位不同于捕获抗体结合的表位，因此能够检测固体支持物上的捕获抗体与生物样品中的HIV-1 Tat的结合。
第二检测抗体可用可检测标记或能够产生可检测信号的组分标记，如被生物素化或者可含有分子标签，如FLAG。或者，标记可以不是抗体的一部分。合适的标签选自上述通常使用的诊断标记。一实施方案中，所述标记可以是酶，当该酶与基材接触后可产生可检测的颜色或化学发光信号。颜色或化学发光的存在和/或强度表明了样品中Tat的量。
采用本发明抗体的任何常规试验可用来确定治疗方法的功效以及对疾病进行最初的诊断。
以下实施例例证了本发明的组合物和方法的某些实施方案。这些实施例不是要限制权利要求书和说明书的范围。
实施例
实施例1：制造泛-表位1抗体IgG的选择和筛选过程
A.肽
在以下实施例中，氨基酸用熟知的单个字母代码表示。用于以下实施例的肽示于下面的表1。这些肽是在N-末端用生物素-Ser-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO：11)合成的。N-末端序列作为间隔区以确保有关肽序列延伸到抗生物素蛋白的生物素结合口袋。某些示例性肽序列的典型Z12位为Ser，Z12位也可作为间隔区并可被取代。
表位1可变位置X7、Y9的氨基酸残基在表中用黑体表示。
表1
  肽的名称   肽/蛋白质(Bio表示生物素化)   SEQ IDNO
  完整的TAT   1MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKCCFHCQVCFIT KALGISYGRK KRRQRRRPPQGSQTHQVSLS KQPTSQSRGD PTGPKE86   12
  E2-bio   Bio-SGSG-LGISYGRKS   13
  E1-RE   Bio-SGSG-VDPRLEPW   14
  E1-KE   Bio-SGSG-VDPKLEPW   15
  E1-NE   Bio-SGSG-VDPNLEPW   16
  E1-SE   Bio-SGSG-VDPSLEPW   17
  E1-RD   Bio-SGSG-VDPRLDPW   18
  E1-KD   Bio-SGSG-VDPKLDPW   19
  E1-SD   Bio-SGSG-VDPSLDPW   20
  E1-ND   Bio-SGSG-VDPNLDPW   21
  E1-RE(alt)   Bio-SGSG-EPVDPRLEPWS*   22
  E1-KE(alt)   Bio-SGSG-EPVDPKLEPWS*   23
  E1-SE(alt)   Bio-SGSG-EPVDPSLEPWS*   24
  E1-NE(alt)   Bio-SGSG-EPVDPNLEPWS*   25
  E1-ND(alt)   Bio-SGSG-EPVDPNLDPWS*   26
*文中，较短的生物素化的肽和较长的(“alt”)生物素化的肽都产生相同结果。因此，较长的肽上的其它氨基酸的差别是微不足道的，不会影响表位序列本身的抗体结合功能。
B.选择scFv
从Lib-2000单链片段(ScFv)库(Biolnvent International AB，瑞典)选择克隆。用展现变体表位1序列的肽和完整的Tat蛋白筛选选出的scFv，步骤如下。
在步骤1中，基本上按照Griffiths A.D.等，EMBO J.1994，13，3245-3260和Hawkins，R.E.等，J.Mol.Biol，1992，226，889-896的描述，用包被链霉抗生物素蛋白的Dynabead基材(Dynal A.S.奥斯陆，挪威)捕获生物素化的肽E1-RE(alt)。对这些公开的步骤进行了修饰，即用胰蛋白酶洗脱结合的噬菌体，如Engberg J.等，Mol.Biotechnology.1996，6，287-310所述。
步骤2用称为E1-NE(alt)、E1-KE(alt)和E1-SE(alt)的生物素化的肽的混合物进行。在步骤1和2中，肽的浓度范围为1-5×10-8M。在步骤3中，将4×10-8M完整的Tat蛋白(aa 1-86，Xeptagen，意大利)固定到微量滴定板上并用于在胰蛋白酶洗脱之后进行固相选择。第一、第二和第三次选择时所用噬菌体的量分别为9.4×1012、3.4×1011和1.4 1012pfu。
为在步骤1和2之后进行噬菌粒扩增，使大肠杆菌(E.coli)HB101F’细胞在Luria-Bertani培养基(LB)中生长至OD600 0.5并在37℃用洗脱的噬菌体感染30分钟。然后继续孵育并在含有100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml四环素的500cm2 LB-琼脂平板上30℃孵育过夜。将菌落重悬于LB培养基并在37℃生长至达到OD600 0.5。菌落用6×109pfu R408/ml辅助噬菌体感染30分钟。以100μM的浓度加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并在25℃继续孵育过夜。为在步骤3之后制备质粒DNA，如上所述感染所得噬菌体并使其生长1.5小时，然后更换培养基(LB+15μg/ml四环素+100μg/ml氨苄青霉素+0.1％葡萄糖)。在30℃继续生长过夜并用质粒微制备试剂盒(BioRad，732-6100)进行微制备。
C.筛选scFv
为表达可溶性scFv，通过限制性酶消化除去基因III编码区，将所得载体转化入Top10细菌。表达的scFv克隆用针对靶的化学发光ELISA检测(用于选择步骤1和2的靶肽的混合物，对照抗原为E2-BIO，用β-FLAG检测(SIGMA，A-9469))。注意，用较短和较长(alt)的肽筛选产生的结果相同，各组短肽和长肽含有相同的表位1变体序列，即相同的X和Y变体。
第一次筛选中发现4271个克隆中总共有590个阳性克隆，即与靶E1-NE(alt)反应的克隆。在第二次筛选中用所有四种单独的肽、Tat蛋白(Xeptagen，意大利)和对照抗原(E2-BIO和BSA-噁唑酮)重新检测阳性克隆。对于所有检测的克隆，发现有322个克隆对所有四种特定的肽E1-RE(alt)、E1-KE(alt)、E1-SE(alt)和E1-NE(alt)以及对Tat蛋白呈阳性，但对对照呈阴性。通过测序对这些克隆中的288个克隆进行了进一步分析。总共发现26个克隆具有独特的反应模式和超变区序列，并以大体积表达为scFv。
筛选过程得到能识别1-4种变体序列和完整的Tat蛋白的scFv。只对识别Tat蛋白和所有四种变体的克隆进行进一步处理，并用第5种变体E1-ND进行测试。
用固定的生物素化的肽，即E1-RE(alt)、E1-SE(alt)、E1-KE(alt)、E1-NE(alt)和E1-ND进行亲和力分析。一些测试的克隆能够识别所有5种变体。识别1、2、3、4或5种序列变体的克隆的例子列在表2中。
表2
基于这些ELISA结果，发现了8种结合含有固定的表位1的Tat蛋白/肽和游离Tat蛋白的克隆。这些克隆被大规模表达并在Ni-NTA琼脂糖凝胶上纯化以在Biacore试验(采用BIA评价3.2和1∶1 Langmuir结合模型计算数据；见Biacore手册)中进一步分析。
发现8个克隆中有2个克隆(称为泛-表位1#5和泛-表位1#6)以高亲和力结合所有5种表位1肽。见表3。
表3：抗Tac scFv对固定的肽的亲和力分析
ScFv\Pep   E1-RE(alt)kakdKD   E1-KE(alt)kakdKD   E1-SE(alt)kakdKD   E1-NE(alt)kakdKD   E1-NDkakdKD
  泛-表位1#5   5×1052×10-33×10-9   4×1052×10-35×10-9   4×1052×10-35×10-9   6×1054×10-36×10-9   4×1058×10-32×10-8
  泛-表位1#6   5×1053×10-35×10-9   5×1054×10-37×10-9   6×1054×10-37×10-9   1×1061×10-29×10-9   1×1063×10-22×10-8
D.转变成完整的IgG1抗体
将克隆泛-表位1#5和泛-表位1#6转变成完整的IgG1抗体。对scFv泛-表位1#5和泛-表位1#6的VH和VL基因进行PCR扩增。产生的PCR片段用限制性酶消化并连接入将pcDNA3修饰得到的专用表达载体。该表达载体含有γ1基因组恒定区(NCBI数据库登录号Z 17370)以插入PCR扩增的VH基因或λ基因组恒定区(NCBI数据库登录号X06875)以插入PCR扩增的VL基因。
然后用NucleoBond Plasmid Mega Kit(BD Biosciences，目录号K3004-1)大规模产生所得重链和轻链构建物。质粒DNA用MicroSpin S-400 HR柱(AmershamBiosciences，目录号27-5240-01)旋转纯化并用来短暂转染COS-7绿猴细胞(ATCC登录号CRL-1651)。
COS-7细胞在添加了10％胎牛血清(Invitrogen，目录号26140-079)和1x非必需氨基酸(Invitrogen，目录号11140-035)的D-MEM(Invitrogen，目录号31966-021)中于37℃、5％CO2下培育。用Lipofectamine 2000(Invitrogen，目录号11668-019)根据制造商的方法进行转染。转染20小时后用添加了10％超低IgG胎牛血清(Invitrogen，目录号16250-078)和1x非必需氨基酸(Invitrogen，目录号11140-035)的D-MEM培养基(Invitrogen，目录号31966-021)代替细胞培养基。培育5天后收获细胞培养基并回收所有IgG分子。
E.筛选IgG
用蛋白A柱纯化在COS-7细胞中短暂表达的转化的IgG1分子。纯化的物质通过SDS-PAGE、凝胶过滤层析、等电聚焦、剂量反应性ELISA和LAL-检测进一步定性。在最初的检测中只有一种IgG1泛-表位1抗体以可接受的水平表达。对第二种IgG1泛-表位1抗体#6未作进一步分析。对IgG1泛-表位1抗体可变区H1测序，其序列为FSDYYMSWIRQAPG(SEQ ID NO：41)。
用Biacore试验测定IgG1泛-表位1抗体#5和表位1肽或完整的Tat蛋白之间的亲和力。将8种特定的生物素化的肽和对照肽固定到链霉抗生物素蛋白芯片(BiacoreSA-芯片，BR-1000-32)。由于肽被固定且IgG是二价的，下面的表5A-5B和6中的表观动力学常数可能部分是由亲和力造成的。未检测到与芯片基质或无关肽的背景结合，见表5A-5B和6。使用由美国的ATG公司表达的含氨基酸(aa)1-86的重组Tat蛋白。其序列与表1所列的序列相同，但残基42上的氨基酸丙氨酸被替换成甘氨酸。
表4A：固定的生物素化的肽和IgG1泛-表位1抗体#5之间的亲和力
  IgG1\Pep   E1-RE(alt)kakdKD   E1-KE(alt)kakdKD   E1-NE(alt)kakdKD   E1-SE(alt)KakdKD
  IgGx泛-表位1抗体#5   9.5×1059.0×10-69.5×10-12   1.3×1061.3×10-51.0×10-11   1.2×1061.6×10-51.4×10-11   1.0×1061.4×10-51.4×10-11
表4B
  IgG1\Pep   E1-RD(alt)kakdKD   E1-KD(alt)kakdKD   E1-NDkakdKD   E1-SD(alt)kakdKD
  IgG1泛-表位1抗体#5   3.4×1064.2×10-51.2×10-11   1.0×1079.4×10-59.0×10-12   7.4×1053.2×10-54.3×10-11   1.5×1071.0×10-46.9×10-12
表5：氨基偶联的α-Tat IgG1和Tat蛋白之间的亲和力
  IgG1\亲和常数   ka   Kd   KD
  IgG1泛-表位1抗体#5   7×103   3×10-5   4×10-9
实施例2：体外功能研究
在一组在瑞典斯德哥尔摩Karolinska实验室进行的实验中检测了IgG1泛-表位1抗体#5抑制HIV-1复制的能力。这些实验基于被HIV-1毒株IIIB感染的Jurkat细胞，通过直接针对HIV-1gag蛋白p24的ELISA监测该细胞中的病毒复制(Re等，1995J.Acq.Imm.Def.Syndromes and Human Retrovir.10，408-416)。
在病毒感染过程中，在37℃用病毒接种物感染指数生长的Jurkat细胞1小时，然后洗涤细胞并重悬于培养基(含Glutamax试剂、10％FCS、50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基)。将感染的细胞与各种浓度未感染的细胞混合。同时在培养物中加入升高浓度的抗Tat IgG1或对照抗FITC(
Figure A20068000472000261
等，2000 Nat.Biotech.18(8)：852-856)。培养物在37℃、5％CO2下孵育。
3-4天后拆分培养物并重新加入加有抗体的新鲜培养基。在感染后的第7天通过p24检测ELISA测定病毒水平。
图1和2提供了该实验得到的支持数据。图1显示了用1％最初感染的细胞进行的实验。从用1％和3％最初感染的细胞进行的抑制实验计算出的IgG1泛-表位1抗体#5的IC50值分别为0.14μg/ml和0.44μg/ml。因此，图1证明了本发明的泛-表位1抗体对HIV-1复制的剂量相关的抑制作用。图2证明，单独使用泛-表位1抗体和Tat表位2抗体有类似的剂量相关的抑制曲线。当组合使用这两种抗体时产生协同反应。这两种抗体的组合令人惊讶地产生了比单独使用任何一种抗体有效10倍的病毒水平抑制作用。这说明，与抗表位2抗体一起使用泛-表位1抗体产生了一种意想不到但格外有价值的治疗组合物和抑制HIV-1病毒水平的方法。
实施例3：测量TAT水平的实验
按照竞争性实验模式，采用了用可检测标记标记的单一泛-表位1抗体，优选泛-表位1抗体。在进行该试验之前，用HIV-1Tat蛋白包被平板。在平板中加入次最佳量或不完全饱量的泛-表位1抗体稀释液及含有已知量HIV-1 Tat的血浆样品。测量泛-表位1抗体与平板上Tat结合的标准结合曲线。血浆样品中的HIV-1 Tat越多则结合的泛-表位1抗体越少。
图3图示了该试验的结果。使包被200ng/ml Tat的平板接触含有升高量的HIV-1Tat和次最佳量的用生物素标记的10ng泛-表位1抗体的患者的缓冲样品。结合在包被平板上的HIV-1 Tat序列和样品中的HIV-1 Tat序列竞争性结合泛-表位1抗体。
随着样品中Tat量的增加，结合到平板的泛-表位1抗体的量降低。加入结合到链霉抗生物素蛋白的抗人IgG检测这种结合。IgG结合泛-表位1抗体。将平板洗涤之后在平板中加入辣根过氧化物酶，产生了与结合的泛-表位1抗体的量成比例的可检测信号。通过测量样品中结合到平板的泛表位1抗体的量并将其与标准结合曲线比较可计算出样品中HIV-1 Tat的量。如上所述，精通本领域的技术人员显然明白，该试验可采用其它能产生信号的标记，且对信号生成系统的选择不构成对该试验的限制。
图4是通过与上述试验类似并在50％血浆中进行的竞争性试验产生的人血浆中的重组Tat剂量反应曲线。生成了典型的剂量反应曲线，这表明血浆对泛-表位1抗体与样品中Tat的结合没有影响。该试验能够测量患者血浆中的Tat水平。
在缓冲液中进行类似的试验以产生类似的重组Tat和表位1变体肽的剂量反应曲线，结果示于图5。测试的肽是E1-RE、E1-NE、E1-SE、E1-KE、E1-ND和全长Tat。所有曲线都是类似的，说明所有变体都提供类似结果。
最后，在三名被HIV-1感染的人类对象中进行一组如上所述的竞争性试验。如图6A和6B所示，对象用编号和符号区别，即，对象A(圆形)、对象B(方形)和对象C(菱形)。采用泛-表位5抗体E9的本发明的竞争性试验可用于在未感染血浆中进行RNA检测数天后鉴定Tat RNA的水平和病毒效价。这些数据证明，采用单一泛表位1抗体的本发明的竞争性试验能够检测临床样品中的Tat水平，因此通过检测感染对象中Tat编码的蛋白质便可证实HIV-1感染。
上述实施例和数据证实，竞争性试验模式的一个优点是可减少试验所采用的试剂(抗体)的数量。我们可以用泛-表位1抗体代替针对SEQ ID NO：5中多个序列的单克隆抗体的混合物以实现在一个试验中检测多种毒株和亚型的HIV-1 Tat。
实施例4：Tat生物实验和IgG1泛-表位1抗体#5的抑制作用
正常的人外周血单个核细胞(PBMC)不支持HIV-1复制，但被促分裂原或被HIV-1Tat蛋白体外激活后允许HIV-1复制(Li CJ等，1997 Proc Natl Acad Sci USA 94：8116-1820)。此外，Li等证实，Tat诱导的允许可被Tat的多克隆或单克隆抗体抑制。这种方法被用来开发生物实验以得到抑制Tat-诱导的允许人PBMC进行HIV-1复制的单克隆抗体(Mab)。
该实验采用批号为03AP04的PBMC(Astarte Biologies)和在大肠杆菌中表达并通过反相层析纯化的重组Tat(ATG，Inc.)。
每孔使用100μl细胞(5×106/ml)，在细胞中仅加入100μl各种浓度的Tat，或加入10ng/ml与各种浓度的单克隆抗体预先孵育过的Tat，并在37℃、5-6％CO2和80-90％湿度下孵育5天。采用96孔平底组织培养平板。
5天后用移液管在各孔中加入介质以使细胞从平板表面释放，并将细胞转移到V形底96孔板并充分洗涤。在各孔中加入100μl1/10稀释的纯化的HIV-1病毒裂解液(BUT)(Zeptometrix Corp.)并培育4小时。这样使每孔有35ng单位HIV-1蛋白p24。
4小时后充分洗涤细胞，将细胞重悬于组织培养基并再培育4-5天。培育结束后将细胞400xg旋转10分钟并收获上清液。用Zeptometrix RETROtekTM HIV-1p24Antigen ELISA按照制造商的建议检测上清液中的HIV-1 p24。
10复孔用于不含Tat的对照(0Tat)；10复孔用于含10ng/ml Tat。所有其它的孔都一式5份。将数据装入Prism GraphPadTM程序并通过单向ANOVA进行统计分析，然后分析柱间的差异并对多次分析进行校正。
结果示于图7，该图显示，10ng/ml使PBMC允许进行HIV-1复制(P＜0.001)。1μg/ml(P＜0.05)和10μg/ml(P＜0.01)IgG1泛-表位1#5抗体能抑制这种允许，但1、10或50μg/ml的对照IgG1抗体则不可以。
因此，存在泛-表位1抗体，即结合5种表位1变体的单一抗体，能通过抑制Tat而抑制人PBMC中的HIV-1复制。
对本发明进行的大量修改和变动都包括在上述内容中，这些修改和变动对于本领域的熟练技术人员来说是显而易见的。对本发明的组合物和方法进行的这些修改和改动都包括在附带的权利要求的范围中。上面列出或提到的所有文献都纳入本文作为参考。
序列表
<110>西蒙有限公司(Thymon，L.L.C.)
G.戈尔茨坦(Goldstein，Gideon)
R.卡尔松(Carlsson，Roland)
E.索内森(Sonesson，Elisabeth)
Y.斯藤伯格(Stenberg，Yvonne)
L.斯特兰德伯格(Strandberg，Leif)
<120>削弱HIV-1增殖的方法和组合物
<130>GGP5APCT
<150>US 60/653,263
<151>2005-02-15
<160>41
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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1               5                   10                  15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe
            20                  25                  30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
        35                  40                  45
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
    50                  55                  60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp
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                85
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<213>1型人免疫缺陷病毒
<400>41
Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly
1               5                   10

Claims (46)

1.一种单一分离的抗体或其抗体片段，其结合HIV-1Tat蛋白表位内的多种变体序列，其中，所述表位用下式表示
R1-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQ ID NO：5)，
其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn；
其中，Y9是Glu或Asp；
其中，R1不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val；
其中，R2不存在或是Trp-Z12-R3；
其中，Z12不存在或是Lys或Asn；和
其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；
所述单一抗体或片段结合多种毒株和亚型的HIV-1 Tat蛋白。
2.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其结合5种所述变体序列。
3.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其特征在于，对于各变体序列，R1是Val，而R2不存在。
4.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其结合至少一种Y9是Glu的所述变体序列和至少一种Y9是Asp的所述变体序列。
5.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其结合至少2种所述不同变体序列。
6.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其结合至少3种所述不同变体序列。
7.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其结合4种所述不同变体序列。
8.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其结合6-8种所述不同变体序列。
9.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其结合9种或更多种所述不同变体序列。
10.如权利要求1所述的单一分离的抗体或片段，其特征在于，所述变体序列选自下组：
(a)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Arg，Y9是Glu；
(b)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Lys，Y9是Glu；
(c)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Ser，Y9是Glu；
(d)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Asn，Y9是Glu；
(e)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Arg，Y9是Asp；
(f)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Lys，Y9是Asp；
(g)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Ser，Y9是Asp；和
(h)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Asn，Y9是Asp。
11.如权利要求10所述的单一分离的抗体或片段，其结合至少一种选自(a)-(d)的所述变体序列和至少一种选自(e)-(h)的所述变体序列。
12.如权利要求10所述的单一分离的抗体或片段，其结合5种所述不同变体序列。
13.如权利要求10所述的单一分离的抗体或片段，其结合2-7种所述不同变体序列。
14.如权利要求10所述的单一分离的抗体或片段，其结合(a)-(h)中所有的所述变体序列。
15.如权利要求1所述的单一分离的抗体或抗体片段，其选自单克隆抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、分离的单一抗体链、或所述抗体或抗体链的片段。
16.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的抗体或抗体片段以及药学上可接受的载体。
17.如权利要求16所述的组合物，其含有如权利要求1所述的多种不同抗体或抗体片段。
18.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述如权利要求1所述的抗体或抗体片段结合至少一种Y9是Glu的所述变体序列和至少一种Y9是Asp的所述变体序列。
19.如权利要求16所述的组合物，其含有HIV-1的其它抗体或其它抗体片段。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述其它抗体或其它抗体片段结合HIV-1 Tat。
21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述HIV-1 Tat的其它抗体或其它抗体片段是结合位于式Lys-X-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-(SEQ ID NO：2)所示表位内的序列的抗体或抗体片段，其中，X是Gly或Ala。
22.一种诊断试验试剂，其含有如权利要求1所述的单一分离的抗体或抗体片段以及可检测标记。
23.如权利要求22所述的试剂，其特征在于，所述权利要求1所述的抗体或抗体片段结合至少一种Y9是Glu的所述变体序列和至少一种Y9是Asp的所述变体序列。
24.一种用于对生物样品进行试验的试剂盒，所述试剂盒中装有：
(a)一种或多种如权利要求1所述的抗体或抗体片段；
(b)任选的一种或多种HIV-1 Tat的其它抗体，该抗体特异性结合与(a)所述抗体结合的表位不同的HIV-1 Tat上的表位；和
(c)一种或多种鉴定所述抗体与所述样品中存在的任何HIV-1 Tat结合的可检测标记或标记系统。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体或抗体片段(a)结合至少5种所述变体。
26.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体或抗体片段(a)结合至少2-8种所述变体。
27.一种在接触过HIV-1的人类对象中抑制HIV-1复制的方法，所述方法包括给予所述对象结合受感染细胞释放的HIV-1 Tat蛋白有效量的如权利要求16所述的组合物。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述给予步骤发生在感染之后。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述给予步骤以周期性间隔重复进行。
30.一种单一分离的抗体或其抗体片段，其结合HIV-1 Tat蛋白表位内的至少5种变体序列，其中，所述表位用下式表示
R1-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQ ID NO：5)，
其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn；
其中，Y9是Glu或Asp；
其中，R1不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val；
其中，R2不存在或是Trp-Z12-R3；
其中，Z12不存在或是Lys或Asn；和
其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；所述单一抗体或片段结合多种毒株和亚型的HIV-1 Tat蛋白。
31.如权利要求30所述的单一分离的抗体或其片段，其结合：
Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Trp-Z12-R3(SEQ ID NO：6)；
Val-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Trp-Z12-R3(SEQ ID NO：7)；
Val-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Trp-Z12-R3(SEQ ID NO：8)；
Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Trp-Z12-R3(SEQ ID NO：9)；和
Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Trp-Z12-R3(SEQ ID NO：10)；
其中，Z12不存在或是Lys或Asn；和
其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-(SEQ ID NO：27)的全部或部分。
32.一种在接触HIV-1的人类对象中抑制HIV-1复制的方法，所述方法包括：
给予所述对象
(a)单一分离的抗体或其抗体片段，其结合HIV-1 Tat蛋白表位内的多种变体序列，其中，所述表位用下式表示
RrAsp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQ ID NO：5)，
其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn；
其中，Y9是Glu或Asp；
其中，R1不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val；
其中，R2不存在或是Trp-Z12-R3；
其中，Z12不存在或是Lys或Asn；和
其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；和
(b)单一分离的抗体或其抗体片段，其结合位于式Lys-X-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-(SEQ ID NO：2)所示表位内的序列，其中，X是Gly或Ala。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述抗体或片段(a)及抗体或片段(b)与药学上可接受的载体混合成单一组合物。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述抗体或片段(a)及抗体或片段(b)以任何顺序依次给予。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述抗体或片段(a)及抗体或片段(b)同时给予。
36.如权利要求1所述的抗体在制备用于在人类对象中抑制HIV-1复制的药物中的应用。
37.(a)和(b)在制备用于在人类对象中抑制HIV-1复制的药物中的应用，其中：
(a)单一分离的抗体或其抗体片段，其结合HIV-1 Tat蛋白表位内的多种变体序列，其中，所述表位用下式表示
R1-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQ ID NO：5)，
其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn；
其中，Y9是Glu或Asp；
其中，R1不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val；
其中，R2不存在或是Trp-Z12-R3；
其中，Z12不存在或是Lys或Asn；和
其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；和
(b)单一分离的抗体或其抗体片段，其结合位于式Lys-X-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-(SEQ ID NO：2)所示表位内的序列，其中，X是Gly或Ala。
38.一种制造HIV-1 Tat泛-表位1的单一分离的抗体或其抗体片段的方法，所述方法包括以下步骤：
选择具有HIV-1 Tat蛋白表位内的第一变体氨基酸序列的单链抗体可变序列(scFv)库，其中，所述表位用下式表示
R1-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQ ID NO：5)，
其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn；
其中，Y9是Glu或Asp；
其中，R1不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val；和
其中，R2不存在或是Trp-Z12-R3，
其中，Z12不存在或是Lys或Asn，和
其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；
从所述选择的库中获得结合所述第一变体序列的第一scFv混合物；
用所述表位内的第二不同变体序列连续并依次筛选所述第一变体混合物，并获得结合所述第一和所述第二变体序列的那些所得scFv的第二混合物；和
任选用含有所述表位内不同变体序列的scFv的各种连续混合物重复所述连续和依次筛选步骤，以获得结合所述表位内多种不同变体序列的所得scFv的混合物。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述表位内的所述变体序列选自下组：
(a)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Arg，Y9是Glu；
(b)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Lys，Y9是Glu；
(c)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Ser，Y9是Glu；
(d)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Asn，Y9是Glu；
(e)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Arg，Y9是Asp；
(f)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Lys，Y9是Asp；
(g)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Ser，Y9是Asp；和
(h)SEQ ID NO：5，其中，R1是Val，R2不存在，X7是Asn，Y9是Asp。
40.如权利要求38所述的方法，还包括将各个所述所得scFv插入恒定区主链的额外步骤。
41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述主链是人IgGl主链。
42.一种用权利要求38-41中任一项所述方法制备的分离抗体或抗体片段，其特征在于，所述单一抗体或抗体片段结合HIV-1的多种毒株和亚型。
43.如权利要求38所述的抗体或片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段结合至少一种Y9是Glu的所述变体序列和至少一种Y9是Asp的所述变体序列。
44.如权利要求38所述的抗体或片段，其特征在于，所述抗体结合2-8种所述变体序列。
45.一种测量对象中HIV-1 Tat水平的诊断试验，所述试验包括以下步骤：
(a)使固定有已知量HIV-1 Tat蛋白的基材接触含有未知量HIV-1 Tat的对象的生物样品及权利要求1所述的单一分离的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段的存在量相对于结合的Tat的量不完全饱和；
(b)确定与所述基材结合的如权利要求1所述抗体或抗体片段的量；和
(c)将所述量(b)与标准曲线比较，该标准曲线测量不存在所述样品时各种已知量的所述抗体或片段与所述已知量的结合的Tat的结合，从而通过与结合到所述基材的所述抗体的量的倒数关系确定所述样品中Tat的量。
46.如权利要求45所述的试验，其特征在于，所述单一分离的抗体或片段结合2-8种所述变体序列。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20080702