CN101263159A - 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法 - Google Patents

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肯尼思·希尔兰
卡特穆特·凯彭
海迪·菲利普斯
保罗·波拉基斯
蔡·J·里德
坂中千惠
维多利亚·史密斯
苏珊·斯潘塞
P·米基·威廉斯
吴棣
张泽民
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Abstract

本发明致力于可用于诊断和治疗哺乳动物中的肿瘤的物质组合物及使用那些物质组合物来诊断和治疗哺乳动物中的肿瘤的方法。

Description

用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
相关申请
本申请是2002年6月19日提交的美国申请流水号10/177,488的部分延续申请，并根据35U.S.C.§120要求其优先权。后者根据35U.S.C.§119(e)要求2001年6月20日提交的美国临时申请流水号60/299,500、2001年6月29日提交的60/301,880及2001年9月18日提交的60/323,268的优先权，在此收入其公开内容作为参考。
技术领域
本发明致力于可用于诊断和治疗哺乳动物中的肿瘤的物质组合物，及使用那些物质组合物来诊断和治疗哺乳动物中的肿瘤的方法。
发明背景
恶性肿瘤(癌)是在美国位居心脏病之后的第二位致死原因(Boring et al.，CA Cancel J.Clin.43：7(1993))。癌的特征为衍生自正常组织的异常或肿瘤性细胞的数量增加，所述细胞增殖形成肿瘤块；这些赘生性肿瘤细胞侵入邻近组织；及产生恶性细胞，所述恶性细胞最终经血液或淋巴系统传播到局部淋巴结并经称为转移的过程传播到远处。在癌性状态，细胞在正常细胞不生长的条件下增殖。癌自身表现为极其多种形式，特征为不同程度的侵袭力和进攻性。
在寻找癌症诊断和治疗的有效细胞靶物的尝试中，研究人员试图鉴定在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上与一种或多种正常非癌性细胞相比特异性表达的跨膜多肽或其它方式的膜相关多肽。通常，此类膜相关多肽在癌细胞的表面上比在非癌性细胞的表面上表达的量更大。此类肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定导致了经基于抗体的疗法特异性靶向破坏癌细胞的能力。在这点上，注意到基于抗体的疗法已经证明在某些癌症的治疗中是非常有效的。例如，
Figure A20058003786000071
和
Figure A20058003786000072
(都来自Genentech Inc.，SouthSan Francisco，California)是已经分别成功用于治疗乳癌和非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤的抗体。更具体的说，
Figure A20058003786000081
是从重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，其选择性结合人表皮生长因子受体2(HER2)原癌基因的胞外结构域。HER2蛋白过表达在25-30％的原发性乳癌中观察到。是遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体，其针对在正常的和恶性的B淋巴细胞的表面上发现的CD20抗原。这两种抗体都是在CHO细胞中重组生产的。
在寻找癌症诊断和治疗的有效细胞靶物的其它尝试中，研究人员试图鉴定(1)由一种或多种特定类型的癌细胞与一种或多种特定类型的非癌性细胞相比特异性产生的非膜相关多肽，(2)以显著高于一种或多种正常非癌性细胞的表达水平由癌细胞产生的多肽，或(3)其表达特异限于处于癌性和非癌性状态的单一(或非常有限数目的不同)组织类型(例如正常的前列腺和前列腺肿瘤组织)的多肽。此类多肽可保持细胞内定位，或者可由癌细胞分泌。此外，此类多肽可以不是由癌细胞自身表达的，而是由产生和/或分泌对癌细胞具有强化(potentiating)或生长增强效果的多肽的细胞分泌的。此类分泌多肽通常是为癌细胞提供超过正常细胞的生长优势的蛋白质，包括诸如例如血管发生因子、细胞粘附因子、生长因子等物质。此类非膜相关多肽的拮抗剂的鉴定有望充当此类癌症治疗的有效治疗剂。此外，此类多肽的表达模式的鉴定可用于诊断和治疗哺乳动物中的特定癌症。
在哺乳动物中调控基因表达的能力仍然是困难的。通常，一直使用诸如表达宿主所缺乏的多肽的病毒载体等工具。将病毒载体导入宿主以降低基因表达的能力尚未完善。抑制基因表达通常在哺乳动物中以“敲除”方式进行，其中测试哺乳动物，通常是小鼠，通过同源重组使得基因消除或“敲除”。此技术在小鼠中是缓慢、费力、且困难的，而在人中是不实用的。因此，申请人转向表达干扰RNA(siRNA)以降低基因表达的载体系统。
siRNA已经证明可用作其中传统拮抗剂诸如小分子或抗体失败的调控基因表达的研究中的工具(Shi Y.，Trends in Genetics 19(1)：9-12(2003))。长度为21到23个核苷酸的体外合成的双链RNA可起干扰RNA(iRNA)的作用，且能特异性抑制基因表达(Fire A.，Trends in Genetics 391：806-810(1999))。这些iRNA通过介导其靶RNA的降解起作用。然而，由于它们的长度低于30个核苷酸，因此它们不会触发细胞抗病毒防御机制。此类机制包括干扰素生成及宿主细胞蛋白质合成的全面停止(general shutdown)。实践中，siRNA可人工合成，然后克隆到DNA载体中。此类载体可转染，并使之以高水平和/或以组织特异性方式表达siRNA。高水平的siRNA表达用于“敲除”或显著降低细胞中产生的蛋白质量，因此它可用于认为蛋白质的过表达与紊乱诸如癌症有关的试验。尽管哺乳动物癌症疗法中有一些进展，对于能够通过降低基因表达而有效抑制肿瘤性细胞生长的治疗剂仍然存在很大的需要。因此，本发明的一个目标是鉴定能调控基因表达的系统。
提高药物及其它药剂对靶细胞、组织和肿瘤的投递以实现最大功效和最小毒性，很多年来已经成为相当多的研究的焦点。尽管已经在开发在体外和在体内将生物学活性分子输入细胞的有效方法上做了很多尝试，没有一种方法证明是完全令人满意的。优化药物与其胞内靶物的联系，同时使药物的胞内重分配(例如到邻近细胞)降至最低，常常是困难或低效/无效的。
现在对患者肠胃外施用的大多数药剂不是靶向的，导致所述药剂系统投递至不必要且常常不想要的身体的细胞和组织。这可导致不良药物副作用，且常常限制可施用的药物(例如化疗剂(抗癌的)、细胞毒剂、酶抑制剂及抗病毒或抗微生物药)的剂量。通过比较，尽管认为口服施用药物是既方便又经济的施用方式，但是同样关注一旦药物吸收到系统循环中后对未病变细胞的非特异性毒性。其它因素牵涉口服生物利用度及药物在肠中的停留的问题，后者使肠另外暴露于药物，由此带来肠毒性的风险。因此，一个主要目标是开发将药剂特异性靶向细胞和组织的方法。此类治疗的益处包括避免此类介质不适当的投递至其它细胞和组织诸如未感染细胞所带来的一般生理影响。胞内靶向可通过容许生物学活性剂即活性代谢物在细胞内累积或保留的方法、化合物和配制剂来实现。
已经为患癌症、免疫学和血管发生性紊乱的患者的靶向治疗建立了单克隆抗体疗法。
可利用多种有用的毒素。例如，将auristatin肽、auristain E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)、多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物偶联：(i)嵌合的单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)；(ii)cAC10，对血液学恶性肿瘤上的CD30特异(Klussman，et al(2004)Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773；Doronina et al(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784；“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”；Franciscoet al(2003)Blood 102(4)：1458-1465；US 2004/0018194)；(iii)抗CD20抗体，诸如rituxan(WO 04/032828)，用于治疗表达CD20的癌症和免疫紊乱；(iv)抗EphB2抗体2H9和抗IL-8，用于治疗结肠直肠癌(Mao et al(2004)CancerResearch 64(3)：781-788)；(v)E-选择蛋白抗体(Bhaskar et al(2003)Cancer Res.63：6387-6394)；和(vi)其它抗CD30抗体(WO 03/043583)。单甲基auristatin(MMAE)已经与2H9偶联，它是针对EphB2R即1型TM酪氨酸激酶受体的抗体，EphB2R在小鼠和人之间具有亲密同源性，且在结肠直肠癌细胞上过表达(Mao et al(2004)Cancer Res.64：781-788)。单甲基auristatin MMAF，auristatin E (MMAE)在C-末端有苯丙氨酸的变体(US 5767237；US6124431)，已经报道不如MMAE有效，但在与单克隆抗体偶联后更加有效(Senter et al，Proceedings of the American Association for Cancer Research，Volume 45，Abstract Number 623，presented March 28，2004)。Auristatin F苯二胺(eAFP)，MMAE的苯丙氨酸变体，经苯二胺间隔物通过抗CD70mAb，1F6的C-末端与1F6连接(Law et al，Proceedings of the American Association forCancer Research，Volume 45，Abstract Number 625，presented March 28，2004)。
尽管在哺乳动物癌症疗法中有了上述进展，对于能够分别检测哺乳动物中肿瘤的存在和有效抑制肿瘤性细胞生长的另外诊断和治疗剂仍然存在很大的需要。因此，本发明的一个目标是鉴定：(1)在一种或多种类型的癌细胞上与正常细胞上或其它不同癌细胞上相比表达更大量的细胞膜相关多肽，(2)由一种或多种特定类型的癌细胞(或由产生对癌细胞的生长具有强化效果的多肽的其它细胞)与一种或多种特定类型的非癌性正常细胞相比特异性产生的非膜相关多肽，(3)以显著高于一种或多种正常非癌性细胞的表达水平由癌细胞产生的非膜相关多肽，或(4)其表达特异限于处于癌性和非癌性状态的单一(或非常有限数目的不同)组织类型(例如正常的前列腺和前列腺肿瘤组织)的多肽，及使用那些多肽及其编码核酸来生成可用于哺乳动物中的癌症的治疗性处理和诊断性检测的物质组合物。本发明的另一个目标是鉴定其表达限于单一或非常有限数目的组织的细胞膜相关的、分泌的或胞内的多肽，及使用那些多肽及其编码核酸来生成可用于哺乳动物中的癌症的治疗性处理和诊断性检测的物质组合物。
发明概述
A.实施方案
在本说明书中，申请人首次描述了多种细胞多肽(及其编码核酸或其片段)的鉴定，这些细胞多肽在一种或多种类型的癌细胞的表面上表达或由一种或多种类型的癌细胞表达的程度高于它们在一种或多种类型的正常非癌细胞的表面上表达或由一种或多种类型的正常非癌细胞表达的程度。或者，此类多肽是由产生和/或分泌对癌细胞具有强化或生长增强效果的多肽的细胞表达的。又或者，与相同组织类型的正常细胞相比，此类多肽可能并不由肿瘤细胞过表达，而是可能由单一或非常有限数目的组织类型(优选对生命而言并非必需的组织，例如前列腺等)的正常细胞和肿瘤细胞二者特异性表达。所有上述多肽在本文中称为肿瘤相关抗原性靶多肽(Tumor-associatedAntigenic Target polypeptides，“TAT”多肽)，它们有望充当哺乳动物中癌症治疗和诊断的有效靶物。
因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其具有编码肿瘤相关抗原性靶多肽或其片段(“TAT”多肽)的核苷酸序列。
在某些方面，所述分离的核酸分子包含与下述各项具有至少约80％的核酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列同一性的核苷酸序列：
(a)编码
具有本文所公开的氨基酸序列的全长TAT多肽、
本文所公开的缺少信号肽的TAT多肽氨基酸序列、
本文所公开的有或没有信号肽的跨膜TAT多肽的胞外域、或
本文所公开的全长TAT多肽氨基酸序列的任何其它具体定义的片段的DNA分子；或者
(b)(a)的DNA分子的互补序列(complement)。
在其它方面，所述分离的核酸分子包含与下述各项具有至少约80％的核酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列同一性的核苷酸序列：
(a)包含
本文所公开的全长TAT多肽cDNA的编码序列、
本文所公开的缺少信号肽的TAT多肽的编码序列、
本文所公开的有或没有信号肽的跨膜TAT多肽的胞外域的编码序列、或
本文所公开的全长TAT多肽氨基酸序列的任何其它具体定义的片段的编码序列
的DNA分子；或者
(b)(a)的DNA分子的互补序列。
在其它方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含与下述各项具有至少约80％的核酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列同一性的核苷酸序列：
(a)与本文所公开的保藏于ATCC的任何人类蛋白质cDNA的全长编码区编码相同成熟多肽的DNA分子；或者
(b)(a)的DNA分子的互补序列。
本文的另一个方面提供了分离的核酸分子，其包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码跨膜域删除的或跨膜域灭活的TAT多肽，或者与此类编码核苷酸序列互补，其中本文中公开了此类多肽的跨膜域。因此，设想了本文中所描述的TAT多肽的可溶性胞外域。
在其它方面，本发明致力于分离的核酸分子，其与下述各项杂交：
(a)编码
具有本文所公开的全长氨基酸序列的TAT多肽、
本文所公开的缺少信号肽的TAT多肽氨基酸序列、
本文所公开的有或没有信号肽的跨膜TAT多肽的胞外域、或
本文所公开的全长TAT多肽氨基酸序列的任何其它具体定义的片段的核苷酸序列，或者
(b)(a)的核苷酸序列的互补序列。
在这点上，本发明的一个实施方案致力于本文所公开的全长TAT多肽编码序列的片段或其互补序列，它们可用作例如杂交探针，所述杂交探针可用作例如诊断探针、反义寡核苷酸探针，或者用于编码全长TAT多肽的片段，可任选编码包含抗TAT多肽抗体、TAT结合寡肽、或其它结合TAT多肽的有机小分子的结合位点的多肽。此类核酸片段的长度通常为至少约5个核苷酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核苷酸，其中在此语境中，术语“约”意指所述核苷酸序列长度加上或减去所述长度的10％。注意到TAT多肽编码核苷酸序列的新片段可以常规方式确定，即使用多种众所周知的序列对比程序中的任一种将TAT多肽编码核苷酸序列与其它已知核苷酸序列对比，并确定哪个(些)TAT多肽编码核苷酸序列是新的。本文设想了TAT多肽编码核苷酸序列的所有此类新片段。还设想了由这些核苷酸分子片段编码的TAT多肽片段，优选那些包含抗TAT多肽抗体、TAT结合寡肽、或其它结合TAT多肽的有机小分子的结合位点的TAT多肽片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的TAT多肽，其由上文鉴定的任何分离的核酸序列编码。
在某一个方面，本发明涉及分离的TAT多肽，其包含与具有本文所公开的全长氨基酸序列的TAT多肽、本文所公开的缺少信号肽的TAT多肽氨基酸序列、本文所公开的有或没有信号肽的跨膜TAT多肽的胞外域、由本文所公开的任何核酸序列编码的氨基酸序列、
本文所公开的全长TAT多肽氨基酸序列的任何其它具体定义的片段具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及分离的TAT多肽，其包含与任何本文所公开的保藏于ATCC的人类蛋白质cDNA所编码的氨基酸序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一个具体的方面，本发明提供了分离的TAT多肽，其没有N-末端信号序列和/或没有起始甲硫氨酸，且由编码上文所述氨基酸序列的核苷酸序列所编码。本文还描述了用于产生它的方法，其中所述方法包括：在适于表达TAT多肽的条件下培养包含如下载体的宿主细胞，所述载体包含适宜的编码核酸分子，并从细胞培养物回收TAT多肽。
本发明的另一个方面提供了分离的TAT多肽，其是跨膜域删除的或跨膜域灭活的。本文还描述了用于产生它的方法，其中所述方法包括：在适于表达TAT多肽的条件下培养包含如下载体的宿主细胞，所述载体包含适宜的编码核酸分子，并从细胞培养物回收TAT多肽。
在本发明的其它实施方案中，本发明提供了包含编码任何本文所述多肽的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，所述宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌(E.coli)细胞或酵母细胞。还提供了用于产生任何本文所述多肽的方法，包括在适于表达期望多肽的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物回收期望多肽。
在其它实施方案中，本发明提供了分离的嵌合多肽，其包含与异源(非TAT)多肽融合的任何本文所述TAT多肽。此类嵌合分子的例子包括与异源多肽诸如例如表位标签序列或免疫球蛋白Fc区融合的任何本文所述TAT多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了抗体，其结合，优选特异性结合任何前述或后述多肽。任选的是，所述抗体是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、或竞争性抑制抗TAT多肽抗体与其各自抗原性表位结合的抗体。本发明的抗体可任选偶联生长抑制剂或细胞毒剂诸如毒素包括例如美登木素生物碱(maytansinoid)或加利车霉素(calicheamicin)、抗生素、放射性同位素、溶核酶(nucleolytic enzyme)或诸如此类。本发明的抗体可任选在CHO细胞或细菌细胞中产生，且优选诱导其所结合的细胞死亡。为了诊断目的，本发明的抗体可以被可检测的标记，附着于固相支持物，等等。
在本发明包含偶联有细胞毒素的抗体的另一个实施方案中，所述毒素可选自本领域已知的任何毒素。在一个实施方案中，所述毒素通过肽或肽模拟物接头与抗体连接。在一个实施方案中，所述毒素经包含缬氨酸-瓜氨酸(-vc-)的接头与抗体连接。在一个实施方案中，所述毒素是MMAE。在一个实施方案中，所述毒素是MMAF。在一个实施方案中，所述毒素是auristatin肽。
在本发明的其它实施方案中，本发明提供了包含编码任何本文所述抗体的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，所述宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。还提供了用于产生任何本文所述抗体的方法，包括在适于表达期望抗体的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物回收期望抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了寡肽(“TAT结合寡肽”)，其结合，优选特异性结合任何前述或后述TAT多肽。任选的是，本发明的TAT结合寡肽可偶联生长抑制剂或细胞毒剂诸如毒素包括例如美登木素生物碱或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或诸如此类。本发明的TAT结合寡肽可任选在CHO细胞或细菌细胞中产生，且优选诱导其所结合的细胞死亡。为了诊断目的，本发明的TAT结合寡肽可以被可检测的标记，附着于固相支持物，等等。
在本发明的其它实施方案中，本发明提供了包含编码任何本文所述TAT结合寡肽的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，所述宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。还提供了用于产生任何本文所述TAT结合寡肽的方法，包括在适于表达期望TAT结合寡肽的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物回收期望TAT结合多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了有机小分子(“TAT结合有机分子”)，其结合，优选特异性结合任何前述或后述TAT多肽。任选的是，本发明的TAT结合有机分子可偶联生长抑制剂或细胞毒剂诸如毒素包括例如美登木素生物碱或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或诸如此类。本发明的TAT结合有机分子优选诱导其所结合的细胞死亡。为了诊断目的，本发明的TAT结合有机分子可以被可检测的标记，附着于固相支持物，等等。
在又一个实施方案中，本发明涉及物质组合物，其包含与载体组合的：如本文所述的TAT多肽、如本文所述的嵌合TAT多肽、如本文所述的抗TAT抗体、如本文所述的TAT结合寡肽、或如本文所述的TAT结合有机分子。任选的是，所述载体是药学可接受的载体。
在又一个实施方案中，本发明涉及物质组合物，其包含与载体组合的：如本文所述的TAT多肽、如本文所述的嵌合TAT多肽、如本文所述的抗TAT抗体、如本文所述的TAT结合寡肽、TAT结合干扰RNA(siRNA)、或如本文所述的TAT结合有机分子。任选的是，所述载体是药学可接受的载体。具体而言，所述TAT多肽是TAT188，在本文中也称作E16或TAT188(E16)。本发明的一个实施方案的抗TAT188(也称作抗E16或抗TAT188(E16))抗体包括但不限于如本文所述的3B5、12B9和12G12。该实施方案的siRNA包括如本文所述的siTAT188(也称作siE16或siTAT188(E16)或TAT188siRNA或E16siRNA或TAT188(E16)siRNA)。
在又一个实施方案中，本发明涉及制品，其包括容器及该容器中容纳的物质组合物，其中所述物质组合物可包含如本文所述的TAT多肽、如本文所述的嵌合TAT多肽、如本文所述的抗TAT抗体、如本文所述的TAT结合寡肽、或如本文所述的TAT结合有机分子。该制品可任选还包括附于所述容器的标签或所述容器中包括的包装插页，其涉及所述物质组合物在肿瘤的治疗性处理或诊断性检测中的用途。
本发明的另一个实施方案致力于如本文所述的TAT多肽、如本文所述的嵌合TAT多肽、如本文所述的抗TAT多肽抗体、如本文所述的TAT结合寡肽、或如本文所述的TAT结合有机分子用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗对所述TAT多肽、嵌合TAT多肽、抗TAT多肽抗体、TAT结合寡肽、或TAT结合有机分子有响应的状况。
B.另外的实施方案
本发明的另一个实施方案致力于用于抑制表达TAT多肽的细胞生长的方法，其中该方法包括使细胞接触与所述TAT多肽结合的抗体、寡肽或有机小分子，且其中所述抗体、寡肽或有机小分子与所述TAT多肽的结合引起所述表达TAT多肽的细胞的生长抑制。在优选的实施方案中，所述细胞是癌细胞，且所述抗体、寡肽或有机分子与所述TAT多肽的结合引起表达所述TAT多肽的所述细胞死亡。任选的是，所述抗体是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、或单链抗体。本发明方法中所采用的抗体、TAT结合寡肽和TAT结合有机分子可任选偶联生长抑制剂或细胞毒剂诸如毒素包括例如美登木素生物碱或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或诸如此类。本发明方法中所采用的抗体和TAT结合寡肽可任选在CHO细胞或细菌细胞中产生。
本发明的又一个实施方案致力于治疗性处理具有癌性肿瘤的哺乳动物的方法，所述癌性肿瘤包含表达TAT多肽的细胞，其中该方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的结合所述TAT多肽的抗体、寡肽或有机小分子，由此所述肿瘤得到有效的治疗性处理。任选的是，所述抗体是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。本发明方法中所采用的抗体、TAT结合寡肽和TAT结合有机分子可任选偶联生长抑制剂或细胞毒剂诸如毒素包括例如美登木素生物碱或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或诸如此类。本发明方法中所采用的抗体和寡肽可任选在CHO细胞或细菌细胞中产生。
本发明的又一个实施方案致力于测定怀疑含有某种TAT多肽的样品中该TAT多肽的存在的方法，其中该方法包括使所述样品暴露于结合所述TAT多肽的抗体、寡肽或有机小分子，并测定所述样品中所述抗体、寡肽或有机小分子与所述TAT多肽的结合，其中此类结合的存在表明所述样品中存在所述TAT多肽。任选的是，所述样品可包括怀疑表达TAT多肽的细胞(可以是癌细胞)。本发明方法中所采用的抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子可任选被可检测的标记、附着于固相支持物，或诸如此类。
本发明的又一个实施方案致力于诊断哺乳动物中肿瘤的存在的方法，其中该方法包括检测(a)从所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中和(b)相同组织来源或类型的已知正常非癌性细胞的对照样品中编码TAT多肽的基因的表达水平，其中所述TAT多肽在测试样品中的表达水平高于对照样品表明获取该测试样品的哺乳动物中存在肿瘤。
本发明的又一个实施方案致力于诊断哺乳动物中肿瘤的存在的方法，其中该方法包括(a)使包含从所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品接触结合TAT多肽的抗体、寡肽或有机小分子，并(b)检测所述测试样品中所述抗体、寡肽或有机小分子和所述TAT多肽之间复合物的形成，其中复合物的形成表明所述哺乳动物中存在肿瘤。任选的是，所采用的抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子被可检测的标记，附着于固相支持物，或诸如此类，和/或所述组织细胞的测试样品是从怀疑具有癌性肿瘤的个体获得的。
本发明的又一个实施方案致力于治疗或预防与改变的，优选提高的TAT多肽表达或活性有关的细胞增殖性紊乱的方法，该方法包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的TAT多肽的拮抗剂。优选的是，所述细胞增殖性紊乱是癌症，且所述TAT多肽的拮抗剂是抗TAT多肽抗体、TAT结合寡肽、TAT结合有机分子或反义寡核苷酸。细胞增殖性紊乱的有效治疗或预防可以是直接杀死表达TAT多肽的细胞或抑制其生长的结果，或者通过拮抗TAT多肽的细胞生长强化活性。
本发明的又一个实施方案致力于使抗体、寡肽或有机小分子与表达TAT多肽的细胞结合的方法，其中该方法包括在适于所述抗体、寡肽或有机小分子与所述TAT多肽结合的条件下使表达TAT多肽的细胞接触所述抗体、寡肽或有机小分子，并容许它们之间的结合。
本发明的其它实施方案致力于(a)TAT多肽、(b)编码TAT多肽的核酸或包含该核酸的载体或宿主细胞、(c)抗TAT多肽抗体、(d)TAT结合寡肽、或(e)TAT结合有机小分子在制备可用于(i)癌症或肿瘤的治疗性处理或诊断性检测或(ii)细胞增殖性紊乱的治疗性处理或预防的药物中的用途。
本发明的另一个实施方案致力于抑制癌细胞生长的方法，其中所述癌细胞的生长至少部分依赖于TAT多肽的生长强化效果(其中所述TAT多肽可以是由癌细胞自身表达的，或者是由产生对癌细胞具有生长强化效果的多肽的细胞表达的)，其中该方法包括使所述TAT多肽接触结合所述TAT多肽的抗体、寡肽或有机小分子，由此拮抗所述TAT多肽的生长强化活性，继而抑制所述癌细胞的生长。优选完全抑制癌细胞的生长。甚至更优选的是，所述抗体、寡肽或有机小分子与所述TAT多肽的结合诱导所述癌细胞的死亡。任选的是，所述抗体是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。本发明方法中所采用的抗体、TAT结合寡肽和TAT结合有机分子可任选偶联生长抑制剂或细胞毒剂诸如毒素包括例如美登木素生物碱或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或诸如此类。本发明方法中所使用的抗体和TAT结合寡肽可任选在CHO细胞或细菌细胞中产生。
本发明的又一个实施方案致力于治疗性处理哺乳动物中的肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于TAT多肽的生长强化效果，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的结合所述TAT多肽的抗体、寡肽或有机小分子，由此拮抗所述TAT多肽的生长强化活性并使所述肿瘤得到有效的治疗性处理。任选的是，所述抗体是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。本发明方法中所采用的抗体、TAT结合寡肽和TAT结合有机分子可任选偶联生长抑制剂或细胞毒剂诸如毒素包括例如美登木素生物碱或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或诸如此类。本发明方法中所采用的抗体和寡肽可任选在CHO细胞或细菌细胞中产生。
C.更多另外的实施方案
在其它实施方案中，本发明致力于如下这套本申请可能的权利要求：
1.分离的核酸，其具有与下述各项具有至少80％核酸序列同一性的核苷酸序列：
(a)DNA分子，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)DNA分子，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽；
(c)DNA分子，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)DNA分子，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1至78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列；
(f)图1至78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区；或
(g)(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)的互补序列。
2.分离的核酸，其具有：
(a)核苷酸序列，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)核苷酸序列，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽；
(c)核苷酸序列，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)核苷酸序列，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1至78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列；
(f)图1至78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区；或
(g)(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)的互补序列。
3.分离的核酸，其与下述各项杂交：
(a)核酸，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)核酸，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽；
(c)核酸，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)核酸，其编码图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1至78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列；
(f)图1至78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区；或
(g)(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)的互补序列。
4.权利要求3的核酸，其中所述杂交在严格条件下发生。
5.权利要求3的核酸，其长度为至少约5个核苷酸。
6.表达载体，其包含权利要求1、2或3的核酸。
7.权利要求6的表达载体，其中所述核酸与控制序列可操作连接，所述控制序列受到用该载体转化的宿主细胞的识别。
8.宿主细胞，其包含权利要求7的表达载体。
9.权利要求8的宿主细胞，其是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。
10.用于生产多肽的方法，包括在适于表达所述多肽的条件下培养权利要求8的宿主细胞，并从细胞培养物回收所述多肽。
11.分离的多肽，其与下述各项具有至少80％的氨基酸序列同一性：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽。
12.分离的多肽，其具有：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
13.嵌合多肽，其包含与异源多肽融合的权利要求11或12的多肽。
14.权利要求13的嵌合多肽，其中所述异源多肽是表位标签序列或免疫球蛋白的Fc区。
15.分离的抗体，其结合与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽。
16.分离的抗体，其结合具有下述各项的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
17.权利要求15或16的抗体，其是单克隆抗体。
18.权利要求15或16的抗体，其是抗体片段。
19.权利要求15或16的抗体，其是嵌合或人源化抗体。
20.权利要求15或16的抗体，其与生长抑制剂偶联。
21.权利要求15或16的抗体，其与细胞毒剂偶联。
22.权利要求21的抗体，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
23.权利要求21的抗体，其中所述细胞毒剂是毒素。
24.权利要求23的抗体，其中所述毒素选自美登木素生物碱和加利车霉素。
25.权利要求23的抗体，其中所述毒素是美登木素生物碱。
26.权利要求15或16的抗体，其在细菌中产生。
27.权利要求15或16的抗体，其在CHO细胞中产生。
28.权利要求15或16的抗体，其诱导其结合的细胞死亡。
29.权利要求15或16的抗体，其被可检测的标记。
30.分离的核酸，其具有编码权利要求15或16的抗体的核苷酸序列。
31.表达载体，其包含与控制序列可操作连接的权利要求30的核酸，所述控制序列受到用该载体转化的宿主细胞的识别。
32.宿主细胞，其包含权利要求31的表达载体。
33.权利要求32的宿主细胞，其是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。
34.用于生产抗体的方法，包括在适于表达所述抗体的条件下培养权利要求32的宿主细胞，并从细胞培养物回收所述抗体。
35.分离的寡肽，其结合与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽。
36.分离的寡肽，其结合具有下述各项的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
37.权利要求35或36的寡肽，其与生长抑制剂偶联。
38.权利要求35或36的寡肽，其与细胞毒剂偶联。
39.权利要求38的寡肽，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
40.权利要求38的寡肽，其中所述细胞毒剂是毒素。
41.权利要求40的寡肽，其中所述毒素选自美登木素生物碱和加利车霉素。
42.权利要求40的寡肽，其中所述毒素是美登木素生物碱。
43.权利要求35或36的寡肽，其诱导其所结合的细胞死亡。
44.权利要求35或36的寡肽，其被可检测的标记。
45.TAT结合有机分子，其结合与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽。
46.权利要求45的有机分子，其结合具有下述各项的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
47.权利要求45或46的有机分子，其与生长抑制剂偶联。
48.权利要求45或46的寡肽，其与细胞毒剂偶联。
49.权利要求48的寡肽，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
50.权利要求48的寡肽，其中所述细胞毒剂是毒素。
51.权利要求50的寡肽，其中所述毒素选自美登木素生物碱和加利车霉素。
52.权利要求50的寡肽，其中所述毒素是美登木素生物碱。
53.权利要求45或46的寡肽，其诱导其所结合的细胞死亡。
54.权利要求45或46的寡肽，其被可检测的标记。
55.物质组合物，其包含与载体组合的：
(a)权利要求11的多肽；
(b)权利要求12的多肽；
(c)权利要求13的嵌合多肽；
(d)权利要求15的抗体；
(e)权利要求16的抗体；
(f)权利要求35的寡肽；
(g)权利要求36的寡肽；
(h)权利要求45的TAT结合有机分子；或
(i)权利要求46的TAT结合有机分子。
56.权利要求55的物质组合物，其中所述载体是药学可接受的载体。
57.制品，其包括：
(a)容器；及
(b)所述容器中容纳的权利要求55的物质组合物。
58.权利要求57的制品，还包括附于所述容器的标签或所述容器中包括的包装插页，其涉及所述物质组合物用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的用途。
59.抑制细胞生长的方法，所述细胞表达与所述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的蛋白质：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
所述方法包括使所述细胞接触结合所述蛋白质的抗体、寡肽或有机分子，由此所述抗体、寡肽或有机分子与所述蛋白质的结合引起所述细胞的生长抑制。
60.权利要求59的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
61.权利要求59的方法，其中所述抗体是抗体片段。
62.权利要求59的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化抗体。
63.权利要求59的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与生长抑制剂偶联。
64.权利要求59的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与细胞毒剂偶联。
65.权利要求64的方法，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
66.权利要求64的方法，其中所述细胞毒剂是毒素。
67.权利要求66的方法，其中所述毒素选自美登木素生物碱和加利车霉素。
68.权利要求66的方法，其中所述毒素是美登木素生物碱。
69.权利要求59的方法，其中所述抗体在细菌中产生。
70.权利要求59的方法，其中所述抗体在CHO细胞中产生。
71.权利要求59的方法，其中所述细胞是癌细胞。
72.权利要求71的方法，其中使所述癌细胞进一步暴露于放射处理或化疗剂。
73.权利要求71的方法，其中所述癌细胞选自乳癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、中枢神经系统癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、宫颈癌细胞、黑素瘤细胞和白血病细胞。
74.权利要求71的方法，其中所述癌细胞与相同组织来源的正常细胞相比更大量的表达所述蛋白质。
75.权利要求59的方法，其引起所述细胞死亡。
76.权利要求59的方法，其中所述蛋白质具有：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
77.治疗性处理具有癌性肿瘤的哺乳动物的方法，所述癌性肿瘤包含表达与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的蛋白质的细胞：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的结合所述蛋白质的抗体、寡肽或有机分子，由此有效治疗所述哺乳动物。
78.权利要求77的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
79.权利要求77的方法，其中所述抗体是抗体片段。
80.权利要求77的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化抗体。
81.权利要求77的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与生长抑制剂偶联。
82.权利要求77的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与细胞毒剂偶联。
83.权利要求82的方法，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
84.权利要求82的方法，其中所述细胞毒剂是毒素。
85.权利要求84的方法，其中所述毒素选自美登木素生物碱和加利车霉素。
86.权利要求84的方法，其中所述毒素是美登木素生物碱。
87.权利要求77的方法，其中所述抗体在细菌中产生。
88.权利要求77的方法，其中所述抗体在CHO细胞中产生。
89.权利要求77的方法，其中使所述肿瘤进一步暴露于放射处理或化疗剂。
90.权利要求77的方法，其中所述肿瘤是乳房肿瘤、结肠直肠肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、中枢神经系统肿瘤、肝肿瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤或宫颈肿瘤。
91.权利要求77的方法，其中所述肿瘤的癌性细胞与相同组织来源的正常细胞相比更大量的表达所述蛋白质。
92.权利要求77的方法，其中所述蛋白质具有：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
93.测定怀疑含有某种蛋白质的样品中该蛋白质的存在的方法，其中所述蛋白质与下述各项具有至少80％的氨基酸序列同一性：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
所述方法包括使所述样品暴露于结合所述蛋白质的抗体、寡肽或有机分子，并测定所述样品中所述抗体、寡肽或有机分子与所述蛋白质的结合，其中所述抗体、寡肽或有机分子与所述蛋白质的结合表明所述样品中存在所述蛋白质。
94.权利要求93的方法，其中所述样品包括怀疑表达所述蛋白质的细胞。
95.权利要求94的方法，其中所述细胞是癌细胞。
96.权利要求93的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子被可检测的标记。
97.权利要求93的方法，其中所述蛋白质具有：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
98.诊断哺乳动物中肿瘤的存在的方法，所述方法包括测定从所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中及相同组织来源的已知正常细胞的对照样品中编码与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的蛋白质的基因的表达水平：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一项所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
其中所述蛋白质在测试样品中的表达水平高于对照样品表明获取测试样品的哺乳动物中存在肿瘤。
99.权利要求98的方法，其中测定编码所述蛋白质的基因的表达水平的步骤包括在原位杂交或RT-PCR分析中使用寡核苷酸。
100.权利要求98的方法，其中测定编码所述蛋白质的基因的表达水平的步骤包括在免疫组化或Western印迹分析中使用抗体。
101.权利要求98的方法，其中所述蛋白质具有：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
102.诊断哺乳动物中肿瘤的存在的方法，所述方法包括使从所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品接触结合与下述各项具有至少80％的氨基酸序列同一性的蛋白质的抗体、寡肽或有机分子：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
并检测测试样品中所述抗体、寡肽或有机分子和所述蛋白质之间复合物的形成，其中复合物的形成表明所述哺乳动物中存在肿瘤。
103.权利要求102的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子被可检测的标记。
104.权利要求102的方法，其中所述组织细胞的测试样品此怀疑具有癌性肿瘤的个体获得。
105.权利要求102的方法，其中所述蛋白质具有：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
106.治疗或预防与某种蛋白质的表达或活性提高有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述蛋白质与下述各项具有至少80％的氨基酸序列同一性：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
所述方法包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的所述蛋白质的拮抗剂，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性紊乱。
107.权利要求106的方法，其中所述细胞增殖性紊乱是癌症。
108.权利要求106的方法，其中所述拮抗剂是抗TAT多肽抗体、TAT结合寡肽、TAT结合有机分子或反义寡核苷酸。
109.使抗体、寡肽或有机分子与细胞结合的方法，所述细胞表达与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的蛋白质：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
所述方法包括使所述细胞接触结合所述蛋白质的抗体、寡肽或有机分子，并允许所述抗体、寡肽或有机分子与所述蛋白质的结合发生，由此使所述抗体、寡肽或有机分子结合所述细胞。
110.权利要求109的方法，其中所述是单克隆抗体。
111.权利要求109的方法，其中所述抗体是抗体片段。
112.权利要求109的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化抗体。
113.权利要求109的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与生长抑制剂偶联。
114.权利要求109的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与细胞毒剂偶联。
115.权利要求114的方法，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
116.权利要求114的方法，其中所述细胞毒剂是毒素。
117.权利要求116的方法，其中所述毒素选自美登木素生物碱和加利车霉素。
118.权利要求116的方法，其中所述毒素是美登木素生物碱。
119.权利要求109的方法，其中所述抗体在细菌中产生。
120.权利要求109的方法，其中所述抗体在CHO细胞中产生。
121.权利要求109的方法，其中所述细胞是癌细胞。
122.权利要求121的方法，其中使所述癌细胞进一步暴露于放射处理或化疗剂。
123.权利要求121的方法，其中所述癌细胞选自乳癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、中枢神经系统癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、宫颈癌细胞、黑素瘤细胞和白血病细胞。
124.权利要求123的方法，其中所述癌细胞与相同组织来源的正常细胞相比更大量的表达所述蛋白质。
125.权利要求109的方法，其引起所述细胞死亡。
126.权利要求1-5或30任一项的核酸在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
127.权利要求1-5或30任一项的核酸在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
128.权利要求1-5或30任一项的核酸在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
129.权利要求6、7或31任一项的表达载体在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
130.权利要求6、7或31任一项的表达载体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
131.权利要求6、7或31任一项的表达载体在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
132.权利要求8、9、32或33任一项的宿主细胞在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
133.权利要求8、9、32或33任一项的宿主细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
134.权利要求8、9、32或33任一项的宿主细胞在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
135.权利要求11-14任一项的多肽在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
136.权利要求11-14任一项的多肽在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
137.权利要求11-14任一项的宿主细胞在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
138.权利要求15-29任一项的抗体在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
139.权利要求15-29任一项的抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
140.权利要求15-29任一项的抗体在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
141.权利要求35-44任一项的寡肽在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
142.权利要求35-44任一项的寡肽在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
143.权利要求35-44任一项的寡肽在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
144.权利要求45-54任一项的TAT结合有机分子在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
145.权利要求45-54任一项的TAT结合有机分子在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
146.权利要求45-54任一项的TAT结合有机分子在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
147.权利要求55或56任一项的物质组合物在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
148.权利要求55或56任一项的物质组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
149.权利要求55或56任一项的物质组合物在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
150.权利要求57或58任一项的制品在制备用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的药物中的用途。
151.权利要求57或58任一项的制品在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
152.权利要求57或58任一项的制品在制备用于治疗或预防细胞增殖性紊乱的药物中的用途。
153.用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的蛋白质的生长强化效果：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
所述方法包括使所述蛋白质接触与所述蛋白质结合的抗体、寡肽或有机分子，由此抑制所述细胞的生长。
154.权利要求153的方法，其中所述细胞是癌细胞。
155.权利要求153的方法，其中所述蛋白质由所述细胞表达。
156.权利要求153的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与所述蛋白质的结合拮抗所述蛋白质的细胞生长强化活性。
157.权利要求153的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与所述蛋白质的结合诱导所述细胞死亡。
158.权利要求153的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
159.权利要求153的方法，其中所述抗体是抗体片段。
160.权利要求153的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化抗体。
161.权利要求153的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与生长抑制剂偶联。
162.权利要求153的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与细胞毒剂偶联。
163.权利要求162的方法，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
164.权利要求162的方法，其中所述细胞毒剂是毒素。
165.权利要求164的方法，其中所述毒素选自美登木素生物碱和加利车霉素。
166.权利要求164的方法，其中所述毒素是美登木素生物碱。
167.权利要求153的方法，其中所述抗体在细菌中产生。
168.权利要求153的方法，其中所述抗体在CHO细胞中产生。
169.权利要求153的方法，其中所述蛋白质具有：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
170.治疗性处理哺乳动物中的肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的蛋白质的生长强化效果：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽，
所述方法包括使所述蛋白质接触与所述蛋白质结合的抗体、寡肽或有机分子，由此有效治疗所述肿瘤。
171.权利要求170的方法，其中所述蛋白质由所述肿瘤的细胞表达。
172.权利要求170的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与所述蛋白质的结合拮抗所述蛋白质的细胞生长强化活性。
173.权利要求170的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
174.权利要求170的方法，其中所述抗体是抗体片段。
175.权利要求170的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化抗体。
176.权利要求170的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与生长抑制剂偶联。
177.权利要求170的方法，其中所述抗体、寡肽或有机分子与细胞毒剂偶联。
178.权利要求177的方法，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
179.权利要求177的方法，其中所述细胞毒剂是毒素。
180.权利要求179的方法，其中所述毒素选自美登木素生物碱和加利车霉素。
181.权利要求164的方法，其中所述毒素是美登木素生物碱。
182.权利要求170的方法，其中所述抗体在细菌中产生。
183.权利要求170的方法，其中所述抗体在CHO细胞中产生。
184.权利要求170的方法，其中所述蛋白质具有：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
185.分离的抗体，其结合与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽。
186.分离的抗体，其结合具有下述各项的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
187.权利要求185的抗体，其是单克隆抗体。
188.权利要求185的抗体，其是抗体片段。
189.权利要求185的抗体，其是嵌合或人源化抗体。
190.权利要求185的抗体，其与生长抑制剂偶联。
191.权利要求185的抗体，其与细胞毒剂偶联。
192.权利要求191的抗体，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
193.权利要求191的抗体，其中所述细胞毒剂是毒素。
194.权利要求193的抗体，其中所述毒素选自auristatin、美登木素生物碱和加利车霉素。
195.权利要求193的抗体，其中所述毒素是美登木素生物碱。
196.权利要求185的抗体，其在细菌中产生。
197.权利要求185的抗体，其在CHO细胞中产生。
198.权利要求185的抗体，其诱导其所结合的细胞死亡。
199.权利要求185的抗体，其被可检测的标记。
200.权利要求193的抗体，其中所述毒素选自MMAE(单甲基auristatin E)、MMAF和AEVB(auristatin E戊酰基苄腙)，及AFP(Auristatin F苯二胺)。
201.权利要求193的抗体，其中所述毒素通过接头共价附着于抗体。
202.权利要求201的抗体，其中所述接头选自马来酰亚胺己酰基(MC)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit，vc)、瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)、PAB(对氨基苄基氨基甲酰基)、ME(N-甲基-缬氨酸瓜氨酸)、MC(PEG)6-OH(马来酰亚胺己酰基-聚乙二醇)、SPP(N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯)、SMCC(N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)、和MC-vc-PAB。
203.权利要求200的抗体，其中所述毒素是MMAE。
204.权利要求200的抗体，其中所述毒素是MMAF。
205.权利要求202的抗体，其中所述接头是MC-vc-PAB，且所述毒素是MMAE或MMAF。
206.权利要求185-205任一项的抗体，其中所述抗体结合TAT188多肽。
207.权利要求206的抗体，其中所述抗体抑制表达TAT188的细胞增殖或促进其细胞死亡。
208.权利要求207的抗体，其中所述细胞是癌细胞。
209.权利要求208的抗体，其中所述癌细胞选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
210.分离的抗体，其竞争与TAT188多肽的表位的结合，所述表位受到选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体结合。
211.分离的抗体，其具有选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的生物学活性，其中所述生物学活性是在表达TAT188的细胞中抑制细胞增殖或促进细胞死亡。
212.分离的抗体，其在相应的互补决定区(CDR)中包含如下氨基酸序列，该序列与选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的至少1、2、3、4、5或6种CDR具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。
213.权利要求185-205任一项的抗体，其中所述抗体在相应的互补决定区(CDR)中包含如下氨基酸序列，该序列与选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的至少1、2、3、4、5或6种CDR具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。
214.权利要求185-205任一项的抗体，其中所述抗体展现选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的生物学活性，其中所述生物学活性是在表达TAT188的细胞中抑制细胞增殖或促进细胞死亡。
215.权利要求214的抗体，其中所述细胞是癌细胞。
216.权利要求215的抗体，其中所述癌细胞选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
217.抑制表达TAT188的细胞生长的方法，该方法包括使所述细胞接触权利要求185-205任一项的抗体。
218.权利要求217的方法，其中所述细胞是癌细胞。
219.权利要求218的方法，其中所述癌细胞选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
220.权利要求219的方法，其中所述癌细胞是哺乳动物细胞。
221.权利要求220的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
222.抑制表达TAT188的细胞生长的方法，该方法包括使所述细胞接触权利要求185-205任一项的抗体，其中所述抗体在相应的互补决定区(CDR)中包含如下氨基酸序列，该序列与选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的至少1、2、3、4、5或6种CDR具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。
223.检测测试细胞中表达的TAT188多肽相对于对照细胞的水平的方法，该方法包括：
(a)使测试细胞和对照细胞接触权利要求210的分离的抗TAT188抗体；
(b)检测所述抗体的结合；并
(c)测定该抗体与测试细胞和对照细胞的相对结合。
224.权利要求223的方法，其中将所述测试细胞和对照细胞溶解。
225.权利要求223的方法，其中所述测试细胞在组织中。
226.权利要求225的方法，其中所述组织是肿瘤组织。
227.权利要求226的方法，其中所述肿瘤组织选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
228.检测测试细胞中TAT188多肽或与图115(SEQ ID NO：115)所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽相对于对照细胞的水平的方法，该方法包括：
(a)使测试细胞和对照细胞接触权利要求185-189、196-199及210-212任一项的分离的抗体；
(b)检测所述抗体的结合；并
(c)测定该抗体与测试细胞和对照细胞的相对结合。
229.权利要求228的方法，其中所述测试细胞中的TAT188多肽水平高于对照细胞中的水平。
230.权利要求229的方法，其中所述方法诊断包含着或包含过所述测试细胞的组织中的癌症。
231.TAT结合干扰RNA(siRNA)，其结合与下述各项具有至少80％序列同一性的核酸：
(a)图37(SEQ ID NO：37)所示核苷酸序列；及
(b)(a)的互补序列，其中所述siRNA降低TAT188的表达。
232.包含权利要求231的siRNA的表达载体。
233.权利要求232的表达载体，其中所述siRNA与控制序列可操作连接，所述控制序列受到用该载体转染的宿主细胞的识别。
234.包含权利要求233的表达载体的宿主细胞。
235.物质组合物，其包含与载体组合的：
(a)权利要求185的抗体，或
(b)权利要求231的siRNA。
236.权利要求235的物质组合物，其中所述载体是药学可接受的载体。
237.制品，其包括：
(a)容器；及
(b)所述容器中容纳的权利要求235的物质组合物。
238.权利要求237的制品，还包括附于所述容器的标签或所述容器中包括的包装插页，其涉及所述物质组合物用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的用途。
239.抑制癌细胞生长的方法，所述癌细胞表达与图115(SEQ ID NO：115)所示氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的多肽，该方法包括使所述癌细胞接触如下siRNA，所述siRNA结合所述癌细胞中编码所述氨基酸的核酸，由此抑制所述癌细胞的生长。
240.权利要求239的方法，其中所述核酸具有图37(SEQ ID NO：37)所示序列。
241.权利要求228的方法，其中所述多肽的表达水平的检测包括在免疫组化分析中使用抗体。
242.用于治疗或预防与如下多肽的表达或活性提高有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述多肽与图115(SEQ ID NO：115)所示氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性，该方法包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的TAT188多肽的拮抗剂。
243.权利要求242的方法，其中所述拮抗剂是权利要求1-21及23-28任一项的分离的抗TAT188多肽抗体。
244.权利要求243的方法，其中所述细胞增殖性紊乱是癌症。
245.权利要求244的方法，其中所述癌症选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
阅读本说明书后，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图简述
图1显示了TAT161cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其中SEQ IDNO：1是本文中称作“DNA77507”的克隆。
图2A-B显示了TAT101cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，其中SEQID NO：2是本文中称作“DNA80894”的克隆。
图3显示了TAT157cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，其中SEQ IDNO：3是本文中称作“DNA82343”的克隆。
图4显示了TAT160cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，其中SEQ IDNO：4是本文中称作“DNA87994”的克隆。
图5显示了TAT158cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)，其中SEQ IDNO：5是本文中称作“DNA88131”的克隆。
图6显示了TAT110cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)，其中SEQ IDNO：6是本文中称作“DNA95930”的克隆。
图7显示了TAT210cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)，其中SEQ IDNO：7是本文中称作“DNA95930-1”的克隆。
图8显示了TAT159cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)，其中SEQ IDNO：8是本文中称作“DNA96917”的克隆。
图9显示了TAT112cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)，其中SEQ IDNO：9是本文中称作“DNA96930”的克隆。
图10显示了TAT147cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)，其中SEQ IDNO：10是本文中称作“DNA96936”的克隆。
图11显示了TAT145cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)，其中SEQ IDNO：11是本文中称作“DNA98565”的克隆。
图12显示了TAT152cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)，其中SEQ IDNO：12是本文中称作“DNA246435”的克隆。
图13显示了TAT162cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)，其中SEQ IDNO：13是本文中称作“DNA98591”的克隆。
图14显示了TAT114cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)，其中SEQ IDNO：14是本文中称作“DNA108809”的克隆。
图15显示了TAT119cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)，其中SEQ IDNO：15是本文中称作“DNA119488”的克隆。
图16显示了TAT103cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)，其中SEQ IDNO：16是本文中称作“DNA143493”的克隆。
图17A-B显示了TAT130cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)，其中SEQID NO：17是本文中称作“DNA167234”的克隆。
图18显示了TAT166cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)，其中SEQ IDNO：18是本文中称作“DNA235621”的克隆。
图19显示了TAT132cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)，其中SEQ IDNO：19是本文中称作“DNA176766”的克隆。
图20显示了TAT150cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)，其中SEQ IDNO：20是本文中称作“DNA236463”的克隆。
图21显示了TAT129cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)，其中SEQ IDNO：21是本文中称作“DNA181162”的克隆。
图22显示了TAT111cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)，其中SEQ IDNO：22是本文中称作“DNA188221”的克隆。
图23显示了TAT146cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)，其中SEQ IDNO：23是本文中称作“DNA233876”的克隆。
图24显示了TAT148cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)，其中SEQ IDNO：24是本文中称作“DNA193891”的克隆。
图25显示了TAT187cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)，其中SEQ IDNO：25是本文中称作“DNA248170”的克隆。
图26显示了TAT118cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)，其中SEQ IDNO：26是本文中称作“DNA194628”的克隆。
图27显示了TAT167cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)，其中SEQ IDNO：27是本文中称作“DNA246415”的克隆。
图28显示了TAT123cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)，其中SEQ IDNO：28是本文中称作“DNA210499”的克隆。
图29显示了TAT211cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)，其中SEQ IDNO：29是本文中称作“DNA219894”的克隆。
图30显示了TAT113cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)，其中SEQ IDNO：30是本文中称作“DNA215609”的克隆。
图31显示了TAT128cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)，其中SEQ IDNO：31是本文中称作“DNA220432”的克隆。
图32A-B显示了TAT164cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)，其中SEQID NO：32是本文中称作“DNA226094”的克隆。
图33显示了TAT122cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：33)，其中SEQ IDNO：33是本文中称作“DNA226165”的克隆。
图34显示了TAT117cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：34)，其中SEQ IDNO：34是本文中称作“DNA226237”的克隆。
图35显示了TAT168cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：35)，其中SEQ IDNO：35是本文中称作“DNA246450”的克隆。
图36显示了TAT144cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：36)，其中SEQ IDNO：36是本文中称作“DNA226456”的克隆。
图37显示了TAT188cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：37)，其中SEQ IDNO：37是本文中称作“DNA237637”的克隆。
图38显示了TAT126cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：38)，其中SEQ IDNO：38是本文中称作“DNA226539”的克隆。
图39显示了TAT151cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：39)，其中SEQ IDNO：39是本文中称作“DNA236511”的克隆。
图40显示了TAT115cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：40)，其中SEQ IDNO：40是本文中称作“DNA226771”的克隆。
图41显示了TAT163cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：41)，其中SEQ IDNO：41是本文中称作“DNA227087”的克隆。
图42显示了TAT227cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：42)，其中SEQ IDNO：42是本文中称作“DNA266307”的克隆。
图43显示了TAT228cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：43)，其中SEQ IDNO：43是本文中称作“DNA266311”的克隆。
图44显示了TAT229cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)，其中SEQ IDNO：44是本文中称作“DNA266312”的克隆。
图45显示了TAT230cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)，其中SEQ IDNO：45是本文中称作“DNA266313”的克隆。
图46显示了TAT121cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)，其中SEQ IDNO：46是本文中称作“DNA227224”的克隆。
图47显示了TAT183cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)，其中SEQ IDNO：47是本文中称作“DNA247486”的克隆。
图48显示了TAT165cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：48)，其中SEQ IDNO：48是本文中称作“DNA227578”的克隆。
图49显示了TAT131cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：49)，其中SEQ IDNO：49是本文中称作“DNA227800”的克隆。
图50显示了TAT140cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：50)，其中SEQ IDNO：50是本文中称作“DNA227904”的克隆。
图51显示了TAT127cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：51)，其中SEQ IDNO：51是本文中称作“DNA228199”的克隆。
图52显示了TAT116cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：52)，其中SEQ IDNO：52是本文中称作“DNA228201”的克隆。
图53显示了TAT189cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：53)，其中SEQ IDNO：53是本文中称作“DNA247488”的克隆。
图54显示了TAT190cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：54)，其中SEQ IDNO：54是本文中称作“DNA236538”的克隆。
图55显示了TAT191cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：55)，其中SEQ IDNO：55是本文中称作“DNA247489”的克隆。
图56显示了TAT133cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：56)，其中SEQ IDNO：56是本文中称作“DNA228211”的克隆。
图57显示了TAT186cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：57)，其中SEQ IDNO：57是本文中称作“DNA233937”的克隆。
图58显示了TAT120cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：58)，其中SEQ IDNO：58是本文中称作“DNA228993”的克隆。
图59显示了TAT124cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：59)，其中SEQ IDNO：59是本文中称作“DNA228994”的克隆。
图60显示了TAT105cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：60)，其中SEQ IDNO：60是本文中称作“DNA229410”的克隆。
图61A-B显示了TAT107cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：61)，其中SEQID NO：61是本文中称作“DNA229411”的克隆。
图62A-B显示了TAT108cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：62)，其中SEQID NO：62是本文中称作“DNA229413”的克隆。
图63A-B显示了TAT139cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：63)，其中SEQID NO：63是本文中称作“DNA229700”的克隆。
图64显示了TAT143cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：64)，其中SEQ IDNO：64是本文中称作“DNA231312”的克隆。
图65显示了TAT100cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：65)，其中SEQ IDNO：65是本文中称作“DNA231542”的克隆。
图66显示了TAT284cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：66)，其中SEQ IDNO：66是本文中称作“DNA231542-1”的克隆。
图67显示了TAT285cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：67)，其中SEQ IDNO：67是本文中称作“DNA231542-2”的克隆。
图68显示了TAT285-1cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：68)，其中SEQID NO：68是本文中称作“DNA297393”的克隆。
图69显示了TAT125cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：69)，其中SEQ IDNO：69是本文中称作“DNA232754”的克隆。
图70显示了TAT149cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：70)，其中SEQ IDNO：70是本文中称作“DNA234833”的克隆。
图71显示了TAT231cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：71)，其中SEQ IDNO：71是本文中称作“DNA268022”的克隆。
图72显示了TAT153cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：72)，其中SEQ IDNO：72是本文中称作“DNA236246”的克隆。
图73显示了TAT104cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：73)，其中SEQ IDNO：73是本文中称作“DNA236343”的克隆。
图74显示了TAT141cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：74)，其中SEQ IDNO：74是本文中称作“DNA236493”的克隆。
图75显示了TAT102cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：75)，其中SEQ IDNO：75是本文中称作“DNA236534”的克隆。
图76显示了TAT109cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：76)，其中SEQ IDNO：76是本文中称作“DNA246430”的克隆。
图77显示了TAT142cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：77)，其中SEQ IDNO：77是本文中称作“DNA247480”的克隆。
图78A-B显示了TAT106cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：78)，其中SEQID NO：78是本文中称作“DNA264454”的克隆。
图79显示了衍生自图1中所示SEQ ID NO：1的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：79)。
图80显示了衍生自图2中所示SEQ ID NO：2的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：80)。
图81显示了衍生自图3中所示SEQ ID NO：3的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：81)。
图82显示了衍生自图4中所示SEQ ID NO：4的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：82)。
图83显示了衍生自图5中所示SEQ ID NO：5的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：83)。
图84显示了衍生自图6中所示SEQ ID NO：6的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：84)。
图85显示了衍生自图7中所示SEQ ID NO：7的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：85)。
图86显示了衍生自图8中所示SEQ ID NO：8的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：86)。
图87显示了衍生自图9中所示SEQ ID NO：9的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：87)。
图88显示了衍生自图10中所示SEQ ID NO：10的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：88)。
图89显示了衍生自图11中所示SEQ ID NO：11的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：89)。
图90显示了衍生自图12中所示SEQ ID NO：12的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：90)。
图91显示了衍生自图13中所示SEQ ID NO：13的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：91)。
图92显示了衍生自图14中所示SEQ ID NO：14的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：92)。
图93显示了衍生自图15中所示SEQ ID NO：15的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：93)。
图94显示了衍生自图16中所示SEQ ID NO：16的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：94)。
图95显示了衍生自图17A-B中所示SEQ ID NO：17的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：95)。
图96显示了衍生自图18中所示SEQ ID NO：18的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：96)。
图97显示了衍生自图19中所示SEQ ID NO：19的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：97)。
图98显示了衍生自图20中所示SEQ ID NO：20的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：98)。
图99显示了衍生自图21中所示SEQ ID NO：21的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：99)。
图100显示了衍生自图22中所示SEQ ID NO：22的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：100)。
图101显示了衍生自图23中所示SEQ ID NO：23的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：101)。
图102显示了衍生自图24中所示SEQ ID NO：24的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)。
图103显示了衍生自图25中所示SEQ ID NO：25的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：103)。
图104显示了衍生自图26中所示SEQ ID NO：26的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：104)。
图105显示了衍生自图27中所示SEQ ID NO：27的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：105)。
图106显示了衍生自图28中所示SEQ ID NO：28的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：106)。
图107显示了衍生自图29中所示SEQ ID NO：29的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：107)。
图108显示了衍生自图30中所示SEQ ID NO：30的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：108)。
图109显示了衍生自图31中所示SEQ ID NO：31的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：109)。
图110A-B显示了衍生自图32A-B中所示SEQ ID NO：32的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：110)。
图111显示了衍生自图33中所示SEQ ID NO：33的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：111)。
图112显示了衍生自图34中所示SEQ ID NO：34的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：112)。
图113显示了衍生自图35中所示SEQ ID NO：35的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：113)。
图114显示了衍生自图36中所示SEQ ID NO：36的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：114)。
图115显示了衍生自图37中所示SEQ ID NO：37的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：115)。
图116显示了衍生自图38中所示SEQ ID NO：38的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：116)。
图117显示了衍生自图39中所示SEQ ID NO：39的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：117)。
图118显示了衍生自图40中所示SEQ ID NO：40的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：118)。
图119显示了衍生自图41中所示SEQ ID NO：41的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：119)。
图120显示了衍生自图42中所示SEQ ID NO：42的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：120)。
图121显示了衍生自图43中所示SEQ ID NO：43的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：121)。
图122显示了衍生自图44中所示SEQ ID NO：44的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：122)。
图123显示了衍生自图45中所示SEQ ID NO：45的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：123)。
图124显示了衍生自图46中所示SEQ ID NO：46的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：124)。
图125显示了衍生自图47中所示SEQ ID NO：47的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：125)。
图126显示了衍生自图48中所示SEQ ID NO：48的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：126)。
图127显示了衍生自图49中所示SEQ ID NO：49的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：127)。
图128显示了衍生自图50中所示SEQ ID NO：50的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：128)。
图129显示了衍生自图51中所示SEQ ID NO：51的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：129)。
图130显示了衍生自图52中所示SEQ ID NO：52的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：130)。
图131显示了衍生自图53中所示SEQ ID NO：53的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：131)。
图132显示了衍生自图54中所示SEQ ID NO：54的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：132)。
图133显示了衍生自图55中所示SEQ ID NO：55的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：133)。
图134显示了衍生自图56中所示SEQ ID NO：56的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：134)。
图135显示了衍生自图57中所示SEQ ID NO：57的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：135)。
图136显示了衍生自图58中所示SEQ ID NO：58的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：136)。
图137显示了衍生自图59中所示SEQ ID NO：59的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：137)。
图138显示了衍生自图60中所示SEQ ID NO：60的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：138)。
图139显示了衍生自图61A-B中所示SEQ ID NO：61的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：139)。
图140显示了衍生自图62A-B中所示SEQ ID NO：62的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：140)。
图141显示了衍生自图63A-B中所示SEQ ID NO：63的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：141)。
图142显示了衍生自图64中所示SEQ ID NO：64的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：142)。
图143显示了衍生自图66中所示SEQ ID NO：66的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：143)。
图144显示了衍生自图67中所示SEQ ID NO：67的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：144)。
图145显示了衍生自图68中所示SEQ ID NO：68的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：145)。
图146显示了衍生自图69中所示SEQ ID NO：69的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：146)。
图147显示了衍生自图70中所示SEQ ID NO：70的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：147)。
图148显示了衍生自图71中所示SEQ ID NO：71的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：148)。
图149显示了衍生自图73中所示SEQ ID NO：73的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：149)。
图150显示了衍生自图74中所示SEQ ID NO：74的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：150)。
图151显示了衍生自图75中所示SEQ ID NO：75的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：151)。
图152显示了衍生自图76中所示SEQ ID NO：76的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：152)。
图153显示了衍生自图77中所示SEQ ID NO：77的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：153)。
图154显示了衍生自图78A-B中所示SEQ ID NO：78的编码序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：154)。
图155描绘了E16多肽(TAT188)的三维结构，作为不依赖钠离子的大型中性氨基酸转运蛋白的一个亚基。
图156显示了FACS图的绘图结果，证明抗TAT188(抗E16)抗体结合PC3细胞表面(绿线)且结合随TAT188表达的降低而降低(红线)。
图157显示了抗TAT188抗体在结合表达TAT188的PC3细胞的表面后的内在化。
图158的条形图显示了TAT188氨基酸转运活性在存在抗TAT188抗体时随时间的变化。
图159提供了PC3和Colo205细胞中存在数量渐增的MC-vc-PAB-MMAE毒素偶联的抗TAT188抗体时的细胞生存力图。
图160提供了Colo205细胞中存在数量渐增的MC-vc-PAB-MMAE或MC-vc-PAB-MMAF毒素偶联的抗TAT188抗体时的细胞生存力图。
图161显示了抗人E16抗体结合内源表达E16多肽的细胞的结果，其中所述细胞是猴COS7细胞、人MCF10A乳癌细胞、和小鼠NIH-3T3细胞。图161A显示了抗E16抗体3B5、12B9、和12G12结合猴COS的FACS结果。图161B显示了抗E16 3B5结合人乳房肿瘤细胞系MCF10A而不结合小鼠NIH-3T3细胞。
图162提供了施用裸露的(未偶联毒素的)抗E16抗体的异种移植物小鼠中平均肿瘤体积随时间变化的图。
图163提供了施用偶联有毒素的抗E16抗体的异种移植物小鼠中平均肿瘤体积随时间变化的图，其中所述毒素或是MC-vc-PAB-MMAE或是MC-vc-PAB-MMAF。
图164显示了E16-GFP融合多肽的表达在经靶向E16基因的siRNA转染的细胞中降低。顶部的图是GFP存在与否的生物发光测定法的结果的照片。下面的图是相差显像的照片，说明了GFP生物发光降低不是由细胞数减少引起的。
图165的Western印迹，说明了E16-GFP融合多肽的表达在用E16siRNA瞬时转染的PC3细胞中受到抑制。β-微管蛋白作为凝胶加样对照。
图166显示了E16siRNA对PC3细胞的瞬时转染与氨基酸转运功能降低有关，与E16表达降低一致。
图167提供了经过和未经E16siRNA瞬时转染的细胞随时间增殖的图。细胞增殖在用E16siRNA瞬时转染的PC3细胞中降低。
优选实施方案的详述
I.定义
术语“TAT多肽”和“TAT”在用于本文时且后面紧跟着数值名称时指各种多肽，其中完整名称(即TAT/数值)指本文描述的特定多肽序列。术语“TAT/数值多肽”和“TAT/数值”，其中术语“数值”作为实际数值名称提供，在用于本文时涵盖天然序列多肽、多肽变体和天然序列多肽的片段和多肽变体(本文中有进一步定义)。本文中描述的TAT多肽可从多种来源分离，诸如人组织类型或其它来源，或者通过重组或合成方法制备。术语“TAT多肽”指本文中公开的每一种个别的TAT/数值多肽。本说明书中涉及“TAT多肽”的所有公开内容适用于个别的以及共同的每一种多肽。例如，关于多肽的制备、纯化、衍生、针对该多肽的抗体的形成、针对该多肽的TAT结合寡肽的形成、针对该多肽的TAT结合有机分子的形成、施用、含有该多肽的组合物、用该多肽治疗疾病、等等的描述适用于本发明的个别的每一种多肽。术语“TAT多肽”还包括本文中公开的TAT/数值多肽的变体。
“天然序列TAT多肽”包括与衍生自自然界的相应TAT多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列TAT多肽可从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列TAT多肽”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定TAT多肽(例如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体。在本发明的某些实施方案中，本文中公开的天然序列TAT多肽是包含附图中所示全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。起始和终止密码子(如果指示的话)在图中以粗体和下划线显示。附图中以“N”指示的核酸残基是任何核酸残基。然而，尽管附图中公开的TAT多肽据显示以本文中指派为图中第1位氨基酸的甲硫氨酸残基开始，可以想到且有可能的是，可采用位于图中第1位氨基酸上游或下游的其它甲硫氨酸残基作为TAT多肽的起始氨基酸残基。
TAT多肽“胞外结构域”或“ECD”指基本上不含跨膜结构域和胞质结构域的TAT多肽形式。通常，TAT多肽ECD具有少于1％的所述跨膜结构域和/或胞质结构域，优选具有少于0.5％的所述结构域。可以理解，为本发明TAT多肽鉴定的任何跨膜结构域是依照本领域常规用于鉴定该种类型疏水性结构域的标准鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最有可能是本文中最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。因此，任选的是，TAT多肽的胞外结构域可含有实施例或说明书中鉴定的跨膜结构域/胞外结构域边界任一侧的约5个或更少氨基酸，而且本发明设想了具有或没有相关信号肽的此类多肽及编码它们的核酸。
本说明书和/或附图中可能显示了本文中所公开的各种TAT多肽的“信号肽”的大致位置。然而，应当注意，信号肽的C-末端边界可以变化，但最有可能的是本文中最初鉴定的信号肽C-末端边界任一侧不超过约5个氨基酸，其中信号肽的C-末端边界可依照本领域常规用于鉴定该种类型氨基酸序列元件的标准鉴定(例如Nielsen et al.，Prot.Eng.10：1-6(1997)和von Heinjeet al.，Nucl.Acids.Res.14：4683-4690(1986))。此外，还认识到，在有些情况中，从分泌多肽上切除信号序列不是完全统一的，导致超过一种分泌种类。本发明设想了这些成熟多肽，其中信号肽在本文中所鉴定的信号肽C-末端边界任一侧不超过约5个氨基酸内切除，及编码它们的多核苷酸。
“TAT多肽变体”意指与本文中所公开的全长天然序列TAT多肽序列、缺乏本文中所公开的信号肽的TAT多肽序列、具有或没有本文中所公开的信号肽的TAT多肽胞外结构域、或本文中所公开的全长TAT多肽序列的任何其它片段(诸如那些由只呈现全长TAT多肽的完整编码序列一部分的核酸编码的片段)具有至少约80％的氨基酸序列同一性的本文中所定义的TAT多肽，优选活性TAT多肽。此类TAT多肽变体包括例如其中全长天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的TAT多肽。通常，TAT多肽变体与本文中所公开的全长天然序列TAT多肽序列、缺乏本文中所公开的信号肽的TAT多肽序列、具有或没有本文中所公开的信号肽的TAT多肽胞外结构域、或本文中所公开的全长TAT多肽序列的任何其它特别限定片段具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。通常，TAT变体多肽的长度为至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸或更多。任选的是，TAT变体多肽与天然TAT多肽序列相比具有不超过一个保守氨基酸替代，或者与天然TAT多肽序列相比具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸替代。
关于本文中所鉴定的TAT多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定TAT多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比氨基酸序列同一性目的的序列对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。作为使用这种方法的％氨基酸序列同一性计算的例子，表2和3演示了如何计算指派为“比较蛋白质”的氨基酸序列相对于指派为“TAT”的氨基酸序列的％氨基酸序列同一性，其中“TAT”代表目的假设TAT多肽的氨基酸序列，“比较蛋白质”代表目的“TAT”多肽针对其进行比较的多肽的氨基酸序列，而“X”、“Y”和“Z”各自代表不同假设氨基酸残基。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
“TAT变体多核苷酸”或“TAT变体核酸序列”意指编码本文中所定义的TAT多肽，优选活性TAT多肽且与编码本文中所公开的全长天然序列TAT多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的全长天然序列TAT多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号肽的TAT多肽胞外结构域、或本文中所公开的全长TAT多肽序列的任何其它片段(诸如那些由只呈现全长TAT多肽的完整编码序列一部分的核酸编码的片段)的核苷酸序列具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子。通常，TAT变体多核苷酸与编码本文中所公开的全长天然序列TAT多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的全长天然序列TAT多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号序列的TAT多肽胞外结构域、或本文中所公开的全长TAT多肽序列的任何其它片段的核酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性。变体不涵盖天然核苷酸序列。
通常，TAT变体多核苷酸的长度为至少约5个核苷酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核苷酸，其中在此语境中，术语“约”意指所述核苷酸序列长度加上或减去所述长度的10％。
关于本文中所鉴定的TAT编码核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与TAT目的核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比核酸序列同一性目的的序列对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，为了本发明，％核酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US CopyrightOffice，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较核酸序列的情况中，给定核酸序列C相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：
分数W/Z乘100
其中W是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以领会，若核酸序列C的长度与核酸序列D的长度不相等，则C相对于D的％核酸序列同一性将不等于D相对于C的％核酸序列同一性。作为％核酸序列同一性计算的例子，表4和5演示了如何计算指派为“比较DNA”的核酸序列相对于指派为“TAT-DNA”的核酸序列的％核酸序列同一性，其中“TAT-DNA”代表目的假设TAT编码核酸序列，“比较DNA”代表目的“TAT-DNA”核酸分子针对其进行比较的核酸分子的核苷酸序列，而“N”、“L”和“V”各自代表不同假设核苷酸。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在其它实施方案中，TAT变体多核苷酸是编码TAT多肽且能够与编码本文中所公开的全长TAT多肽的核苷酸序列杂交，优选在严格杂交和洗涤条件下杂交的核酸分子。TAT变体多肽可以是那些由TAT变体多核苷酸编码的变体多肽。
术语“全长编码区”在涉及编码TAT多肽的核酸使用时指编码本发明全长TAT多肽的核苷酸序列(常常在附图中起始和终止密码子(含)之间显示)。术语“全长编码区”在涉及ATCC保藏核酸使用时指插入保藏在ATCC的载体中的cDNA的TAT多肽编码部分(常常在附图中起始和终止密码子(含)之间显示)。
“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种TAT多肽时，意指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原或还原条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然TAT多肽天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”TAT多肽编码核酸或其它多肽编码核酸指已经鉴定且与该多肽编码核酸的天然来源中通常与之相关的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的多肽编码核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的多肽编码核酸分子因此与存在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子有区别。然而，分离的多肽编码核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所包含的多肽编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接”的。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
杂交反应的“严格性”可以容易的由本领域普通技术人员确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的另外细节和解释，参见Ausubel等人，《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，1995。
“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴别：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，含750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃杂交过夜，以及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着在含EDTA的0.1x SSC中于55℃进行10分钟高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以如Sambrook等人，《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989所述鉴别，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含：20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1x SSC中于约37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“表位标记的”在用于本文时指包含与“标签多肽”融合的TAT多肽或抗TAT抗体的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得所述抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间(优选在约10个到约20个氨基酸残基之间)。
“有活性的”或“活性”为了本发明指保留天然或天然存在TAT的生物学和/或免疫学活性的TAT多肽形式，其中“生物学”活性指由天然或天然存在TAT引起的，诱导针对天然或天然存在TAT所具有的抗原性表位的抗体生成的能力以外的生物学功能(或是抑制性的或是刺激性的)，而“免疫学”活性指诱导针对天然或天然存在TAT所具有的抗原性表位的抗体生成的能力。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断、抑制、或中和本文中所公开的天然TAT多肽的生物学活性的任何分子。类似的，术语“激动剂”以最广义使用，包括模拟本文中所公开的天然TAT多肽的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子明确包括激动性或拮抗性抗体或抗体片段、天然TAT多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等。用于鉴定TAT多肽的激动剂或拮抗剂分子的方法可包括使TAT多肽接触候选激动剂或拮抗剂分子并测量通常与TAT多肽有关的一种或多种生物学活性的可检测变化。
“处理”或“治疗”或“缓和”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理学状况或紊乱。需要治疗的受试者包括早就患有紊乱的受试者以及倾向于患上紊乱的受试者或要预防紊乱的受试者。如果在依照本发明的方法接受治疗量的抗TAT抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子后，患者在如下一项或多项中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者或哺乳动物成功“治疗”了表达TAT多肽的癌症：癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积缩小；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌传播到软组织和骨中受到抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肿瘤生长受到一定程度的抑制；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提高。就抗TAT抗体或TAT结合寡肽可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可能是抑制细胞的和/或毒害细胞的。这些征候或症状的减轻还可以由患者感受到。
用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以容易的通过内科医师所熟悉的常规流程来测量。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展时间(TTP)和/或测定响应速率(RR)来测量功效。转移可通过分期测试(staging test)来测定，及通过骨扫描及钙水平和其它酶的测试以测定是否传播到骨。还可进行CT扫描以查明是否传播到骨盆及该区域中的淋巴结。分别使用胸腔X射线和通过已知方法进行的肝酶水平测量来查明是否转移到肺和肝。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(TRUS)和经直肠针吸活组织检查(TRNB)。
对于膀胱癌，一种更加局部化的癌症，测定疾病进展的方法包括通过膀胱镜检术进行的尿细胞学评估、监测尿液中血的存在情况、通过超声波检查术显现尿路上皮道(urothelial tract)、或静脉注射肾盂造影照片(intravenouspyelogram)、计算机断层摄影术(computed tomography)(CT)和磁共振成像(magnetic resonance imaging)(MRI)。远程转移的存在情况可通过腹部CT、胸腔X射线、或骨骼放射性核素成像来评估。
“长期”施用指以与短期模式相反的连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长的一段时间。“间歇”施用指并非连续不间断进行的处理，本质上是循环的。
对于癌症的治疗、减轻症状、或诊断而言，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人、家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选的是，哺乳动物指人。
“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的连续施用。
“载体”在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的来自包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如
Figure A20058003786000631
聚乙二醇(PEG)和
Figure A20058003786000632
“固相”或“固体支持物”意指本发明的抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子可粘着或附着其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利4,275,149中所述。
“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物(诸如TAT多肽、针对其的抗体或TAT结合寡肽)的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。
“小”分子或有机“小”分子在本文中定义为分子量小于约500道尔顿。
本文中所公开的多肽、抗体、TAT结合寡肽、TAT结合有机分子、或其激动剂或拮抗剂的“有效量”指足以实现明确规定的目的的量。“有效量”可凭经验且以常规方式，联系规定的目的来确定。
术语“治疗有效量”指在受试者或哺乳动物中有效“治疗”疾病或紊乱的抗体、多肽、TAT结合寡肽、TAT结合有机分子或其它药物的数量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。参见本文中“治疗”的定义。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。
抗TAT抗体、TAT多肽、TAT结合寡肽、TAT siRNA(诸如TAT188siRNA)或TAT结合有机分子的“生长抑制量”指能够在体外或在体内抑制细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞生长的量。抗TAT抗体、TAT多肽、TAT结合寡肽、TAT siRNA(诸如TAT188siRNA)或TAT结合有机分子为了抑制肿瘤性细胞生长的“生长抑制量”可凭经验且以常规方式来确定。
抗TAT抗体、TAT多肽、TAT结合寡肽、TAT siRNA(诸如TAT188siRNA)或TAT结合有机分子的“细胞毒性量”指能够在体外或在体内引起细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞破坏的量。抗TAT抗体、TAT多肽、TAT结合寡肽、TAT siRNA(诸如TAT188siRNA)或TAT结合有机分子为了抑制肿瘤性细胞生长的“细胞毒性量”可凭经验且以常规方式来确定。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖例如单一抗TAT单克隆抗体(包括激动性、拮抗性和中和性抗体)、具有多表位特异性的抗TAT抗体组合物、多克隆抗体、单链抗TAT抗体、及抗TAT抗体的片段(见下文)，只要它们展现出期望生物学或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。
“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常是约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在N-末端具有一个可变区(VH)，接着是三个(对于α和γ链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定区(CH)。每条轻链在N-末端具有一个可变区(VL)，接着是其另一端的一个恒定区(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定区(CH1)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。成对的一个VH和一个VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如《Basic and Clinical Immunology》，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow编，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定区氨基酸序列，可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链(CH)恒定区氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人类表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”指可变区中的某些区段在抗体序列中差异广泛的实情。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变区跨越的110个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，称作框架区(KR)的相对不变异的区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨基酸，称作“高变区”的极度变异的较短区域构成。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应物功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区(HVR)通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如VL中大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及VH中大约残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近；Kabat等人，《Sequences ofProteinsof Immunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，MD，1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。HVR还定义为涵盖2004年2月19日提交的美国申请流水号60/545,840中披露的序列，在此将其完整收入作为参考，其中根据对复合物晶体结构的分析，延伸的HVR包括可变区内定义为与抗体所结合的配体接触的一些氨基酸序列位置。在用于本文时，术语“HVR”和“CDR”可互换使用，涵盖如下定义的延伸的HVR。
术语“高变区”在用于本文时指抗体可变区中序列上高度可变且/或形成结构上限定的环的区域。通常，抗体包含6个高变区：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等人，《Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1991)。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
HVR表
 环   Kabat   AbM   Chothia   接触
 L1   L24-L34   L24-L34   L26-L32   L30-L36
 L2   L50-L56   L50-L56   L50-L52   L46-L55
 L3   L89-L97   L89-L97   L91-L96   L89-L96
 H1(Kabat编号)   H31-H35B   H26-H35B   H26-H32..34   H30-H35B
 H1(Chothia编号)   H31-H35   H26-H35   H26-H32   H30-H35
 H2   H50-H65   H50-H58   H53-H55   H47-H58
 H3   H95-H102   H95-H102   H96-H101   H93-H101
高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat et al.，见上文编号的。
“框架区”或“FR”残基指可变区中除了本文中所定义的高变区残基以外的那些残基。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原性位点。另外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的优越性体现在它们在合成时可未受到其它抗体的污染。修饰语“单克隆”不能解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望生物学活性(参见美国专利4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体。
“完整抗体”指包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列恒定区(例如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一项或多项效应物功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata et al.，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由一条完整轻链及一条重链的可变区(VH)和第一恒定区(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab′)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应物功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是受到在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中散发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成一条多肽链的抗体VH和VL结构域的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994；Borrebaeck 1995，见下文。
术语“双抗体”指通过在VH和VL结构域之间使用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见上一段)而制备的小型抗体片段，由于接头短，使得V结构域实行链间而非链内配对，导致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmannet al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“物种依赖性抗体”，例如哺乳动物抗人IgE抗体，指对来自第一哺乳动物物种的抗原具有强于该抗原来自第二哺乳动物物种的同系物的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人类抗原(即具有不超过约1×10-7M，优选不超过约1×10-8M，最优选不超过约1×10-9M的结合亲和力(Kd))，但是对该抗原来自第二非人哺乳动物物种的同系物具有比其对人类抗原的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍的结合亲和力。物种依赖性抗体可以是上文定义的各种类型抗体，但是优选人源化抗体或人抗体。
“TAT结合寡肽”指结合，优选特异性结合本文中所描述的TAT多肽的寡肽。TAT结合寡肽可使用已知寡肽合成方法而化学合成，或者可使用重组技术来制备和纯化。TAT结合寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更多，其中能够结合，优选特异性结合本文所述TAT多肽的此类TAT结合寡肽可使用众所周知的技术无需过多实验就得以鉴定。在这点上，注意到用于对寡肽库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域众所周知的(参见例如美国专利5,556,762，5,750,373，4,708,871，4,833,092，5,223,409，5,403,484，5,571,689，5,663,143；PCT公开号WO 84/03506和WO 84/03564；Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81：3998-4002(1984)；Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：178-182(1985)；Geysen et al.，in Synthetic Peptides asAntigens，130-149(1986)；Geysen et al.，J.Immunol.Meth.，102：259-274(1987)；Schoofs et al.，J.Immunol.，140：611-616(1988)，Cwirla，S.E.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378；Lowman，H.B.et al.(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson，T.et al.(1991)Nature，352：624；Marks，J.D.et al.(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Kang，A.S.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363；Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2：668。
“TAT结合有机分子”指不同于本文中所定义的寡肽或抗体，结合，优选特异性结合本文所述TAT多肽的有机分子。TAT结合有机分子可使用已知方法来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO00/39585)。TAT结合有机分子的大小通常是小于约2000道尔顿，或者大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中能够结合，优选特异性结合本文所述TAT多肽的此类有机分子可使用众所周知的技术无需过多实验就得以鉴定。在这点上，注意到用于对有机分子库筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是本领域众所周知的(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO00/39585)。
“干扰RNA”或“小干扰RNA(siRNA)”指长度小于30个核苷酸且降低靶基因表达的双链RNA分子。“TAT干扰RNA”或“TAT siRNA”结合，优选特异性结合TAT核酸分子并降低其表达。这意味着与不存在干扰RNA的对照中TAT的表达相比，存在干扰RNA时TAT分子的表达降低。TAT干扰RNA可使用已知方法来鉴定和合成(Shi Y.，Trends in Genetics 19(1)：9-12(2003)；WO 2003056012；WO 2003064621)。
“结合”目的抗原，例如肿瘤相关多肽抗原靶物的抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子指以足够亲和力结合该抗原，使得该抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向表达该抗原的细胞或组织且不显著与其它蛋白质发生交叉反应的分子。在此类实施方案中，根据荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的测定，抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子结合“非靶物”蛋白质的程度将小于该抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子对其特定靶物蛋白质的结合的约10％。对于抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子对靶分子的结合，术语“特异结合”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或对其“特异”意味着可测量的不同于非特异相互作用的结合。特异结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来测量，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如，特异结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶物相似，例如过量的未标记靶物。在这种情况中，若经标记靶物与探针的结合受到过量未标记靶物的竞争性抑制，则指示特异结合。术语“特异结合”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或对其“特异”在用于本文时可由例如对靶物的Kd为至少约10-4M，或至少约10-5M，或至少约10-6M，或至少约10-7M，或至少约10-8M，或至少约10-9M，或至少约10-10M，或至少约10-11M，或至少约10-12M或更大的分子展现。在一个实施方案中，术语“特异结合”指这样的结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。
“抑制表达TAT多肽的肿瘤细胞生长”的抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子或“生长抑制性”抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子指对表达或过表达适宜TAT多肽的癌细胞导致可测量的生长抑制的分子。TAT多肽可以是在癌细胞表面上表达的跨膜多肽，或者可以是由癌细胞生成和分泌的多肽。与适宜对照相比，优选的生长抑制性抗TAT抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子将表达TAT的肿瘤细胞的生长抑制超过20％，优选约20％至约50％，甚至更优选超过50％(例如约50％至约100％)，所述对照通常是未用所测试抗体、寡肽或其它有机分子处理的肿瘤细胞。在一个实施方案中，可在细胞培养物中在约0.1至30μg/ml或约0.5nM至200nM的抗体浓度测量生长抑制作用，其中生长抑制作用是在肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测定的。肿瘤细胞体内生长抑制作用可以多种方式测定，诸如下文实施例部分所述。若以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗TAT抗体导致在距首次施用抗体约5天至3个月内，优选约5至30天内肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖降低，则该抗体在体内是生长抑制性的。
“诱导凋亡”的抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子指根据膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊形成(称作凋亡小体)的测定，诱导程序性细胞死亡的分子。所述细胞通常是过表达TAT多肽的细胞。优选的是，所述细胞是肿瘤细胞，例如前列腺、乳房、卵巢、胃、子宫内膜、肺、肾、结肠、结肠直肠、膀胱细胞。有多种方法可用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；可通过亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是，诱导凋亡的抗体、寡肽、siRNA或其它有机分子是在膜联蛋白结合测定法中导致对膜联蛋白结合的诱导相对于未处理细胞提高约2至50倍，优选约5至50倍，最优选约10至50倍的分子。
抗体“效应物功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且随抗体同种型而变化。抗体效应物功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应物细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。所述抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对必需的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所述。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的。
“Fc受体”或“FcR”描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述
Figure A20058003786000731
Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer etal.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并执行效应物功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源分离，例如血液。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合与其关联抗原结合的(适宜亚型的)抗体起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、及白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝的癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、脑癌、以及头和颈癌，及相关转移。
术语“细胞增殖性紊乱”和“增殖性紊乱”指与一定程度的异常细胞增殖有关的紊乱。在一个实施方案中，所述细胞增殖性紊乱指癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。
“诱导细胞死亡”的抗体、寡肽或其它有机分子指引起可存活细胞变得不能存活的分子。所述细胞指表达TAT多肽的细胞，优选与同一组织类型的正常细胞相比过表达TAT多肽的细胞。TAT多肽可以是在癌细胞表面上表达的跨膜多肽，或者可以是由癌细胞生成和分泌的多肽。优选的是，所述细胞是癌细胞，例如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、结肠直肠、甲状腺、胰或膀胱细胞。体外细胞死亡可在不存在补体或免疫效应细胞时测定，以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。因此，用于细胞死亡的测定法可使用热灭活血清(即不含补体)在不存在免疫效应细胞时进行。为了确定抗体、寡肽或其它有机分子是否能够诱导细胞死亡，可相对于未处理细胞来评估膜完整性的丧失，它是通过碘化丙啶(propidium iodide)(PI)、锥虫蓝(参见Moore etal.Cytotechnology 17：1-11(1995))或7AAD的摄取来评估的。优选的诱导细胞死亡的抗体、寡肽或其它有机分子是在PI摄取测定法中在BT474细胞中诱导PI摄取的分子。
“表达TAT的细胞”指或在细胞表面上或以分泌形式表达内源或转染的TAT多肽的细胞。“表达TAT的癌”指包含在细胞表面上存在TAT多肽或生成和分泌TAT多肽的细胞的癌。“表达TAT的癌”任选在其细胞表面上生成足够水平的TAT多肽，使得抗TAT抗体、寡肽或其它有机分子可与其结合并对癌产生治疗效果。在另一个实施方案中，“表达TAT的癌”任选生成和分泌足够水平的TAT多肽，使得抗TAT抗体、寡肽或其它有机分子拮抗剂可与其结合并对癌具有治疗效果。对于后者，所述拮抗剂可以是降低、抑制或阻止肿瘤细胞生成和分泌分泌型TAT多肽的反义寡核苷酸。“过表达”TAT多肽的癌指与同一组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的TAT多肽或生成和分泌显著更高水平的TAT多肽的癌。此类过表达可以是由基因扩增或者是由转录或翻译提高引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的或细胞分泌的TAT蛋白质水平的升高(例如通过免疫组织化学测定法，使用针对分离的TAT多肽制备的抗TAT抗体，所述多肽可使用重组DNA技术从编码TAT多肽的分离的核酸制备；FACS分析；等)来确定TAT多肽过表达。或者/另外，可测量细胞中编码TAT多肽的核酸或mRNA的水平，例如通过荧光原位杂交，使用对应于编码TAT的核酸或其互补链的基于核酸的探针(FISH；参见WO 98/45479，公开于1998年10月)；Southern印迹；Northern印迹；或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。还可使用基于抗体的测定法，通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原来研究TAT多肽过表达(还可参见例如美国专利4,933,294，授权于1990年6月12日；WO 91/05264，公开于1991年4月18日；美国专利5,401,638，授权于1995年3月28日；Sias et al.，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。除了上述测定法，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查切片。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应物功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定区序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
词“标记物”在用于本文时指与抗体、寡肽或其它有机分子直接或间接偶联从而产生“经标记”抗体、寡肽或其它有机分子的可检测化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。细胞毒素可共价附着于将该毒素靶向表达某种抗原的特定目的细胞的抗体。可用的细胞毒素及其接头包括但不限于下列：
接头：
MC＝马来酰亚胺己酰基
Val Cit＝缬氨酸-瓜氨酸，蛋白酶可切割接头中的二肽位点
瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸
PAB＝对氨基苄基氨基甲酰基(接头的“自我牺牲”(self immolative)部分)
Me＝N-甲基-缬氨酸瓜氨酸，其中接头肽键经过修饰而防止其受到组织蛋白酶B的切割
MC(PEG)6-OH＝马来酰亚胺己酰基-聚乙二醇，附着于抗体半胱氨酸
SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯
SMCC＝N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯
细胞毒性药物：
MMAE＝单甲基auristatin E(MW 718)
MMAF＝auristatin E(MMAE)在药物的C-末端具有苯丙氨酸的变体(MW731.5)
AEVB＝auristatin E戊酰基苄腙，酸不稳定接头经AE的C-末端(MW 732)
AFP＝Auristatin F苯二胺；(以苯二胺间隔物经C-末端与抗体相连的苯丙氨酸变体)(MW 732)
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达TAT的癌细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期的TAT表达细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《TheMolecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycleregulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))都是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(
Figure A20058003786000771
Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(
Figure A20058003786000772
Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞有丝分裂的抑制。
“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione
术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商品包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
表1
/*
 *
 *C-C increased from 12 to 15
 *Z is average of EQ
 *B is average of ND
 *match with stop is_M；stop-stop＝0；J(joker)match＝0
 */
#define_M  -8    /*value of a match with a stop*/
int   _day[26][26]＝{
/*    A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z */
/*A*/      {2，0，-2，0，0，-4，1，-1，-1，0，-1，-2，-1，0，_M，1，0，-2，1，1，0，0，-6，0，-3，0}，
/*B*/      {0，3，-4，3，2，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，2，_M，-1，1，0，0，0，0，-2，-5，0，-3，1}，
/*C*/      {-2，-4，15，-5，-5，-4，-3，-3，-2，0，-5，-6，-5，-4，_M，-3，-5，-4，0，-2，0，-2，-8，0，0，-5}，
/*D*/      {0，3，-5，4，3，-6，1，1，-2，0，0，-4，-3，2，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，2}，
/*E*/      {0，2，-5，3，4，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，1，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，3}，
/*F*/      {-4，-5，-4，-6，-5，9，-5，-2，1，0，-5，2，0，-4，_M，-5，-5，-4，-3，-3，0，-1，0，0，7，-5}，
/*G*/      {1，0，-3，1，0，-5，5，-2，-3，0，-2，-4，-3，0，_M，-1，-1，-3，1，0，0，-1，-7，0，-5，0}，
/*H*/      {-1，1，-3，1，1，-2，-2，6，-2，0，0，-2，-2，2，_M，0，3，2，-1，-1，0，-2，-3，0，0，2}，
/*I*/      {-1，-2，-2，-2，-2，1，-3，-2，5，0，-2，2，2，-2，_M，-2，-2，-2，-1，0，0，4，-5，0，-1，-2}，
/*J*/      {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*K*/      {-1，0，-5，0，0，-5，-2，0，-2，0，5，-3，0，1，_M，-1，1，3，0，0，0，-2，-3，0，-4，0}，
/*L*/      {-2，-3，-6，-4，-3，2，-4，-2，2，0，-3，6，4，-3，_M，-3，-2，-3，-3，-1，0，2，-2，0，-1，-2}，
/*M*/      {-1，-2，-5，-3，-2，0，-3，-2，2，0，0，4，6，-2，_M，-2，-1，0，-2，-1，0，2，-4，0，-2，-1}，
/*N*/      {0，2，-4，2，1，-4，0，2，-2，0，1，-3，-2，2，_M，-1，1，0，1，0，0，-2，-4，0，-2，1}，
/*O*/      {_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，0，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M}，
/*P*/      {1，-1，-3，-1，-1，-5，-1，0，-2，0，-1，-3，-2，-1，_M，6，0，0，1，0，0，-1，-6，0，-5，0}，
/*Q*/      {0，1，-5，2，2，-5，-1，3，-2，0，1，-2，-1，1，_M，0，4，1，-1，-1，0，-2，-5，0，-4，3}，
/*R*/      {-2，0，-4，-1，-1，-4，-3，2，-2，0，3，-3，0，0，_M，0，1，6，0，-1，0，-2，2，0，-4，0}，
/*S*/      {1，0，0，0，0，-3，1，-1，-1，0，0，-3，-2，1，_M，1，-1，0，2，1，0，-1，-2，0，-3，0}，
/*T*/      {1，0，-2，0，0，-3，0，-1，0，0，0，-1，-1，0，_M，0，-1，-1，1，3，0，0，-5，0，-3，0}，
/*U*/      {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*V*/      {0，-2，-2，-2，-2，-1，-1，-2，4，0，-2，2，2，-2，_M，-1，-2，-2，-1，0，0，4，-6，0，-2，-2}，
/*W*/      {-6，-5，-8，-7，-7，0，-7，-3，-5，0，-3，-2，-4，-4，_M，-6，-5，2，-2，-5，0，-6，17，0，0，-6}，
/*X*/      {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*Y*/      {-3，-3，0，-4，-4，7，-5，0，-1，0，-4，-1，-2，-2，_M，-5，-4，-4，-3，-3，0，-2，0，0，10，-4}，
/*Z*/      {0，1，-5，2，3，-5，0，2，-2，0，0，-2，-1，1，_M，0，3，0，0，0，0，-2，-6，0，-4，4}
}；
/*
 */
#include<stdio.h>
#include<ctype.h>
#define MAXJMP    16        /*max jumps in a diag*/
#define MAXGAP    24        /*don′t continue to penalize gaps larger than this*/
#define JMPS      1024      /*maxjmps in an path*/
#define MX        4         /*save if there′s at least MX-1 bases since last jmp*/
#define DMAT      3         /*val ue of matching bases*/
#define DMIS      0         /*penalty for mismatched bases*/
#define DINS0     8         /*penalty for a gap*/
#define DINS1     1         /*penalty per base*/
#define PINS0     8         /*penalty for a gap */
#define PINS1            4       /*penalty per residue*/
struct jmp{
       short             n[MAXJMP]；    /*size of jmp(neg for dely)*/
       unsigned short    x[MAXJMP]；    /*base no.of jmp in seq x*/
}；                                     /*limits seq to 2^16-1*/
struct diag{
       int               score；        /*score at last jmp*/
       long              offset；       /*offset of prev block*/
       short             ijmp；         /*current jmp index*/
       struct jmp        jp；           /*list of jmps*/
}；
struct path{
       int               spc；          /*number of leading spaces*/
       short             n[JMPS]；      /*size of jmp(gap)*/
       int               x[JMPS]；      /*loc of jmp(last elem before gap)*/
}；
char         *ofile；             /*output file name*/
char         *namex[2]；          /*seq names:getseqs()*/
char         *prog；              /*prog name for err msgs*/
char         *seqx[2]；           /*seqs:getseqs()*/
int          dmax；               /*best diag:nw()*/
int          dmax0；              /*final diag*/
int          dna；                /*set if dna:main()*/
int          endgaps；            /*set if penalizing end gaps*/
int          gapx，gapy；         /*total gaps in seqs*/
int          len0，len1；         /*seq lens*/
int          ngapx，ngapy；       /*total size of gaps*/
int          smax；               /*max score:nw()*/
int          *xbm；               /*bitmap for matching*/
long         offset；             /*current offset in jmp file*/
struct diag  *dx；                /*holds diagonals*/
struct path  pp[2]；              /*holds path for seqs*/
char         *calloc()，*malloc()，*index()，*strcpy()；
char         *getseq()，*g_calloc()；
/*Needleman-Wunsch alignment program
 *
 *usage:progs file1 file2
 *where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.
 *The sequences can be in upper-or lower-case an may contain ambiguity
 *Any lines beginning with′；′，′＞′or′＜′are ignored
 *Max file length is 65535(limited by unsigned short x in the jmp struct)
 *A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
 *Output is in the file″align.out″
 *
 *The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback.
 *Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
 */
#include″nw.h″
#include″day.h″
static_dbval[26]＝{
      1，14，2，13，0，0，4，11，0，0，12，0，3，15，0，0，0，5，6，8，8，7，9，0，10，0
}；
static_pbval[26]＝{
     1，2|(1＜＜(′D′-′A′))|(1＜＜(′N′-′A′))，4，8，16，32，64，
     128，256，0xFFFFFFF，1＜＜10，1＜＜11，1＜＜12，1＜＜13，1＜＜14，
     1＜＜15，1＜＜16，1＜＜17，1＜＜18，1＜＜19，1＜＜20，1＜＜21，1＜＜22，
     1＜＜23，1＜＜24，1＜＜25|(1＜＜(′E′-′A′))|(1＜＜(′Q′-′A′))
}；
main(ac，av)                                                                    main
     int    ac；
     char   *av[]；
{
     prog＝av[0]；
     if(ac！＝3){
            fprintf(stderr，″usage:％s file1 file2\n″，prog)；
            fprintf(stderr，″where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.\n″)；
            fprintf(stderr，″The sequences can be jn upper-or lower-case\n″)；
            fprintf(stderr，″Any lines beginning with′；′or′＜′are ignored\n″)；
            fprintf(stderr，″Output is in the file\″align.out\″\n″)；
            exit(1)；
     }
     namex[0]＝av[1]；
     namex[1]＝av[2]；
     seqx[0]＝getseq(namex[0]，&len0)；
     seqx[1]＝getseq(namex[1]，&len1)；
     xbm＝(dna)？_dbval:_pbval；
     endgaps＝0；              /*1 to penalize endgaps*/
     ofile＝″align.out″；    /*output file*/
     nw()；             /*fill in the matrix，get the possible jmps*/
     readjmps()；       /*get the actual jmps*/
     print()；          /*print stats，alignment*/
     cleanup(0)；       /*unlink any tmp files*/
}
/*do the alignment，return best score:main()
 *dna:values in Fitch and Smith，PNAS，80，1382-1386，1983
 *pro:PAM 250 values
 *When scores are equal，we prefer mismatches to any gap，prefer
 *a new gap to extending an ongoing gap，and prefer a gap in seqx
 *to a gap in seq y.
 */
nw()                                                                            nw
{
       char        *px，*py；        /*seqs and ptrs*/
       int         *ndely，*dely；   /*keep track of dely*/
       int         ndelx，delx；/*keep track of delx*/
       int         *tmp；       /*for swapping row0，row1*/
       int         mis；        /*score for each type*/
       int         ins0，ins1； /*insertion penalties*/
       register           id；        /*diagonal index*/
register    ij；          /*jmp index*/
register    *col0，*col1；/*score for curr，last row*/
register    xx，yy；            /*index into seqs*/
dx＝(struct diag*)g_calloc(″to get diags″，len0+len1+1，sizeof(struct diag))；
ndely＝(int*)g_calloc(″to get ndely″，len1+1，sizeof(int))；
dely＝(int*)g_calloc(″to get dely″，len1+1，sizeof(int))；
col0＝(int*)g_calloc(″to get col0，len1+1，sizeof(int))；
col1＝(int*)g_calloc(″to get col1″，len1+1，sizeof(nt))；
ins0＝(dna)？DINS0:PINS0；
ins1＝(dna)？DINS1:PINS1；
smax＝-10000；
if(endgaps){
      for(col0[0]＝dely[0]＝-ins0，yy＝1；yy＜＝len1；yy++){
           col0[yy]＝dely[yy]＝col0[yy-1]-ins1；
           ndely[yy]＝yy；
      }
      col0[0]＝0；/*Waterman Bull Math Biol 84*/
}
else
      for(yy＝1；yy＜＝len1；yy++)
            dely[yy]＝-ins0；
/*fill in match matrix
 */
for(px＝seqx[0]，xx＝1；xx＜＝len0；px++，xx++){
      /*initialize first entry in col
       */
      if(endgaps){
            if(xx＝＝1)
                   col1[0]＝delx＝-(ins0+ins1)；
            else
                   col1[0]＝delx＝col0[0]-ins1；
            ndelx＝xx；
      }
      else{
            col1[0]＝0；
            delx＝-ins0；
            ndelx＝0；
      }
                                                                      ...nw
      for(py＝seqx[1]，yy＝1；yy＜＝len1；py++，yy++){
            mis＝col0[yy-1]；
            if(dna)
                  mis+＝(xbm[*px-′A′]&xbm[*py-′A′])？DMAT:DMIS；
            else
                  mis+＝_day[*px-′A′][*py-′A′]；
            /*update penalty for del in x seq；
             *favor new del over ongong del
             *ignore MAXGAP if weighting endgaps
             */
            if(endgaps‖ndely[yy]＜MAXGAP){
                  if(col0[yy]-ins0＞＝dely[yy]){
                        dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)；
           ndely[yy]＝1；
     }else{
           dely[yy]-＝ins1；
           ndely[yy]++；
     }
}else{
     if(col0[yy]-(ins0+ins 1)＞＝dely[yy]){
            dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)；
            ndely[yy]＝1；
     }else
            ndely[yy]++；
}
/*update penalty for del in y seq；
 *favor new del over ongong del
 */
if(endgaps‖ndelx＜MAXGAP){
      if(col1[yy-1]-ins0＞＝delx){
            delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)；
            ndelx＝1；
      }else{
            delx-＝ins1；
            ndelx++；
      }
}else{
     if(col1[yy-1]-(ins0+ins1)＞＝delx){
            delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)；
            ndelx＝1；
     }else
            ndelx++；
}
/*pick the maximum score；we′re favoring
 *mis over any del and delx over dely
 */
                                                                      ...nw
id＝xx-yy+len1-1；
if(mis＞＝delx&&mis＞＝dely[yy])
      col1[yy]＝mis；
else if(delx＞＝dely[yy]){
       col1[yy]＝delx；
       ij＝dx[i d].ijmp；
       if(dx[id]jp.n[0]&&(！dna‖(ndelx＞＝MAXJMP
       &&xx＞dx[i d].jp.x[ij]+MX)‖mis＞dx[id].score+DINS0)){
           dx[id].ijmp++；
           if(++ij＞＝MAXJMP){
                  writejmps(id)；
                  ij＝dx[id].ijmp＝0；
                  dx[id].offset＝offset；
                  offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)；
           }
       }
                        dx[id].jp.n[ij]＝ndelx；
                        dx[id].jp.x[ij]＝xx；
                        dx[id].score＝delx；
                   }
                   else{
                        col1[yy]＝dely[yy]；
                        ij＝dx[id].ijmp；
      if(dx[id].jp.n[0]&&(！dna‖(ndely[yy]＞＝MAXJMP
                        &&xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis＞dx[id].score+DINS0)){
                            dx[id].ijmp++；
                            if(++ij＞＝MAXJMP){
                                  writejmps(id)；
                                  ij＝dx[id].ijmp＝0；
                                  dx[id].offset＝offset；
                                  offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)；
                            }
                        }
                        dx[id].jp.n[ij]＝-ndely[yy]；
                        dx[id].jp.x[ij]＝xx；
                        dx[id].score＝dely[yy]；
                  }
                  if(xx＝＝len0&&yy＜len1){
                        /*last col
                         */
                       if(endgaps)
                              col1[yy]-＝ins0+ins1*(len1-yy)；
                       if(col1[yy]＞smax){
                           smax＝col1[yy]；
                           dmax＝id；
                       }
                  }
            }
            if(endgaps&&xx＜len0)
                   col1[yy-1]-＝ins0+ins1*(len0-xx)；
            if(col1[yy-1]＞smax){
                 smax＝col1[yy-1]；
                 dmax＝id；
            }
            tmp＝col0；col0＝col1；col1＝tmp；
      }
      (void)free((char*)ndely)；
      (void)free((char*)dely)；
      (void)free((char*)col0)；
      (void)free((char*)col1)；}
/*
 *
 *print()--only routine visible outside this module
 *
 *static:
 *getmat()--trace back best path，count matches:print()
 *pr_align()--print alignment of described in array p[]:print()
 *dumpblock()--dump a block of lines with numbers，stars:pr_align()
 *nums()--put out a ntumbe line:dumpblock()
 *putline()--put out aline(name，[num]，seq，[num]):dumpblock()
 *stars()--put a line of stars:dumpblock()
 *stripname()--strip any path and prefix from a seqname
 */
#include″nw.h″
#define SPC 3
#define P_LINE   256    /*maximum output line*/
#define P_SPC    3      /*space between name or num and seq*/
extern     _day[26][26]；
int        olen；       /*set output line length*/
FILE       *fx；        /*output file*/
print()                                                          print
{
        int 1x，1y，firstgap，lastgap；   /*overlap*/
        if((fx＝fopen(ofile，″w″))＝＝0){
              fprintf(stderr，″％s:can′t write％s\n″，prog，ofile)；
              cleanup(1)；
        }
        fprintf(fx，″＜first sequence:％s(length＝％d)\n″，namex[0]，len0)；
        fprintf(fx，″＜second sequence:％s(length＝％d)\n″，namex[1]，len1)；
        olen＝60；
        1x＝len0；
        1y＝len1；
        firstgap＝lastgap＝0；
        if(dmax＜len1-1){/*leading gap in x*/
              pp[0].spc＝firstgap＝len1-dmax-1；
              1y-＝pp[0].spc；
        }
        else if(dmax＞len1-1){/*leadinggap in y*/
               pp[1].spc＝firstgap＝dmax-(len1-1)；
               1x-＝pp[1].spc；
        }
        if(dmax0＜len0-1){/*trailing gap in x*/
              lastgap＝len0-dmax0-1；
              1x-＝lastgap；
        }
        else if(dmax0＞len0-1){/*trailing gap in y*/
              lastgap＝dmax0-(len0-1)；
              1y-＝lastgap；
        }
        getmat(1x，1y，firstgap，lastgap)；
        pr_align()；
}
/*
 *trace back the best path，count matches
 */
static
getmat(1x，1y，firstgap，lastgap)                                getmat
      int    1x，1y；                   /*″core″(minus endgaps)*/
      int    firstgap，lastgap；        /*leading trailing overlap*/
{
      int                   nm，i0，i1，siz0，siz1；
      char                  outx[32]；
      double                pct；
      register              n0，n1；
register char    *p0，*p1；
/*get total matches，score
 */
i0＝i1＝siz0＝siz1＝0；
p0＝seqx[0]+pp[1].spc；
p1＝seqx[1]+pp[0].spc；
n0＝pp[1].spc+1；
n1＝pp[0].spc+1；
nm＝0；
while(*p0&&*p1){
     if(siz0){
            p1++；
            n1++；
            siz0--；
     }
     else if(siz1){
            p0++；
            n0++；
            siz1--；
     }
     else{
            if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′])
                  nm++；
            if(n0++＝＝pp[0].x[i0])
                  siz0＝pp[0].n[i0++]；
            if(n1++＝＝pp[1]x[i1])
                  siz1＝pp[1].n[i1++]；
            p0++；
            p1++；
     }
}
/*pct homology:
 *if penalizing endgaps，base is the shorter seq
 *else，knock off overhangs and take shorter core
 */
if(endgaps)
      1x＝(len0＜len1)？len0:len1；
else
      1x＝(1x＜1y)？1x:1y；
pct＝100.*(double)nm/(double)1x；
fprintf(fx，″\n″)；
fprintf(fx，″＜％d match％s in an overlap of％d:％.2f percent similarity\n″，
        nm，(nm＝＝1)？″″:″es″，1x，pct)；
  fprintf(fx，″＜gaps in first sequence:％d″，gapx)；…getmat
if(gapx){
      (void)sprintf(outx，″(％d％s％s)″，
            ngapx，(dna)？″base″:″residue″，(ngapx＝＝1)？″″:″s″)；
      fprintf(fx，″％s″，outx)；
fp rintf(fx，″，gaps in second sequence:％d″，gapy)；
if(gapy){
      (void)sprintf(outx，″(％d％s％s)″，
                    ngapy，(dna)？″base″:″residue″，(ngapy＝＝1)？″″:″s″)；
             fprintf(fx，″％s″，outx)；
      }
      if(dna)
             fprintf(fx，
             ″\n＜score:％d(match＝％d，mismatch＝％d，gap penalty＝％d+％d per base)\n″，
             smax，DMAT，DMIS，DINS0，DINS1)；
      else
             fprintf(fx，
             ″\n＜score:％d(Dayhoff PAM 250 matrix，gap penalty＝％d+％d per residue)\n″，
             smax，PINS0，PINS1)；
      if(endgaps)
             fprintf(fx，
             ″＜endgaps penalized.left endgap:％d％s％s，right endgap:％d％s％s\n″，
             firstgap，(dna)？″base″:″residue″，(firstgap＝＝1)？″″:″s″，
             lastgap，(dna)？″base″:″residue″，(lastgap＝＝1)？″″:″s″)；
      else
             fprintf(fx，″＜endgaps not penalized\n″)；
}
 static        nm；              /*matches in core--for checking*/
 static        lmax；            /*lengths of stripped file names*/
 static        ij[2]；           /*jmp index for a path*/
 static        nc[2]；           /*number at start of current line*/
 static        ni[2]；           /*current elem number--for gapping*/
 static        siz[2]；
 static char   *ps[2]；          /*ptrto current element*/
 static char   *po[2]；          /*ptrto next output char slot*/
 static char   out[2][P_LINE]；  /*output line*/
 static char   star[P_LINE]；    /*set by stars()*/
/*
 *print alignment of described in struct path pp[]
 */
static
pr_align()                                                       pr_align
{
      int        nn；/*char count*/
      int        more；
      register        i；
      for(i＝0，1max＝0；i＜2；i++){
           nn＝stripname(namex[i])；
           if(nn＞1max)
                1max＝nn；
      nc[i]＝1；
      ni[i]＝1；
      siz[i]＝ij[i]＝0；
      ps[i]＝seqx[i]；
      po[i]＝out[i]；                }
   for(nn＝nm＝0，more＝1；more；){                              …pr_align
      for(i＝more＝0；i＜2；i++){
            /*
             *do we have more of this sequence？
             */
            if(！*ps[i])
                     continue；
                more++；
                if(pp[i].spc){/*leading space*/
                       *po[i]++＝″；
                       pp[i].spc--；
                }
                else if(siz[i]){/*in agap*/
                     *po[i]++＝′-′；
                     siz[i]--；
                }
                else{       /*we′re putting a seq element
                             */
                      *po[i]＝*ps[i]；
                      if(islower(*ps[i]))
                            *ps[i]＝toupper(*ps[i])；
                      po[i]++；
                      ps[i]++；
                      /*
                       *are we at next gap for this seq？
                       */
                      if(ni[i]＝＝pp[i].x[ij[i]]){
                             /*
                              *we need to merge all gaps
                              *at this location
                              */
                             siz[i]＝PP[i].n[ij[i]++]；
                             while(ni[i]＝＝pp[i].x[ij[i]])
                                  siz[i]+＝pp[i].n[ij[i]++]；
                     }
                     ni[i]++；
               }
          }
          if(++nn＝＝olen‖！more&&nn){
               dumpblock()；
               for(i＝0；i＜2；i++)
                   po[i]＝out[i]；
               nn＝0；
          }
     }
}
/*
 *dump a block of lines，including numbers，stars:pr_align()
 */
static
dumpblock()                                                      dumpblock
{
     register  i；
     for(i＝0；i＜2；i++)
           *po[i]--＝′\0′；
                                                                 …dumpblock
     (void)putc(′\n′，fx)；
     for(i＝0；i＜2；i++){
          if(*out[i]&&(*out[i]！＝″‖*(po[i])！＝″)){
                 if(i＝＝0)
                        nums(i)；
                 if(i＝＝0&&*out[1])
                        stars()；
                 putline(i)；
                 if(i＝＝0&&*out[1])
                        fprintf(fx，star)；
                 if(i＝＝1)
                        nums(i)；
          }
     }
}
/*
 *put out a number line:dumpblock()
 */
static
nums(ix)                                                         nums
     int    ix；    /*index in out[]holding seq line*/
{
     char                 nline[P_LINE]；
     register             i，j；
     register char        *pn，*px，*py；
     for(pn＝nline，i＝0；i＜1max+P_SPC；i++，pn++)
          *pn＝″；
     for(i＝nc[ix]，py＝out[ix]；*py；py++，pn++){
          if(*py＝＝″‖*py＝＝′-′)
                *pn＝″；
          else{
                if(i％10＝＝0‖(i＝＝1&&nc[ix]！＝1)){
                      j＝(i＜0)？-i:i；
                      for(px＝pn；j；j/＝10，px--)
                           *px＝j％10+′0′；
                      if(i＜0)
                            *px＝′-′；
                }
                else
                      *pn＝″；
                i++；
          }
     }
     *pn＝′\0′；
     nc[ix]＝i；
     for(pn＝nline；*pn；pn++)
          (void)putc(*pn，fx)；
     (void)putc(′\n′，fx)；
}
/*
 *put out a line(name，[num]，seq，[num]):dumpblock()
 */
static
putline(ix)                                                      putline
       int    ix；             {
      int         i；
      register char    *px；
      for(px＝namex[ix]，i＝0；*px&&*px！＝′:′；px++，i++)
             (void)putc(*px，fx)；
      for(；i＜lmax+P_SPC；i++)
             (void)putc(″，fx)；
      /*these count from 1:
       *ni[]is current element(from 1)
       *nc[]is number at start of current line
       */
      for(px＝out[ix]；*px；px++)
            (void)putc(*px&0x7F，fx)；
      (void)putc(′\n′，fx)；
}
/*
 *put a line of stars(seqs always in out[0]，out[1]):dumpblock()
 */
static
stars()                                                          stars
{
         int              i；
         register char    *p0，*p1，cx，*px；
         if(！*out[0]‖(*out[0]＝＝″&&*(po[0])＝＝″)‖
            ！*out[1]‖(*out[1]＝＝″&&*(po[1])＝＝″))
                 return；
         px＝star；
         for(i＝1max+P_SPC；i；i--)
              *px++＝″；
         for(p0＝out[0]，p1＝out[1]；*p0&&*p1；p0++，p1++){
              if(isalpha(*p0)&&isalpha(*p1)){
                     if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′]){
                           cx＝′*′；
                           nm++；
                     }
                     else if(！dna&&_day[*p0-′A′][*p1-′A′]＞0)
                           cx＝′.′；
                     else
                           cx＝″；
              }
              else
                     cx＝″；
              *px++＝cx；
         }
         *px++＝′\n′；
         *px＝′\0′；
}
/*
 *strip path or prefix from pn，return len:pr_align()
 */
static
stripname(pn)                                                    stripname
      char  *pn；  /*file name(may be path)*/
{
      register char    *px，*py；
      py＝0；
      for(px＝pn；*px；px++)
           if(*px＝＝′/′)
                py＝px+1；
      if(py)
           (void)strcpy(pn，py)；
      return(strlen(pn))；
}
/*
 *cleanup()--cleanup any tmp file
 *getseq()--read in seq，set dna，len，maxlen
 *g_calloc()--calloc()with error checkin
 *readjmps()--get the good jmps，from tmp file if necessary
 *writejmps()--write a filled array of jmps to a tmp file:nw()
 */
#include″nw.h″
#include＜sys/file.h＞
char  *jname＝″/tmp/homgXXXXXX″；    /*tmp file for jmps*/
FILE  *fj；
int   cleanup()；                /*cleanup tmp file*/
long  lseek()；
/*
 *remove any tmp file ifwe blow
 */
cleanup(i)                                                       cleanup
      int    i；
{
      if(fj)
             (void)un link(jname)；
      exit(i)；
}
/*
 *read，return ptr to seq，set dna，len，maxlen
 *skip lines starting with′；′，′＜′，or′＞′
 *seq in upper or lower case
 */
char *
getseq(file，len)                                                getseq
      char   *file； /*file name*/
      int    *len；  /*seq len*/
{
      char           line[1024]，*pseq；
      register char         *px，*py；
      int         natgc，tlen；
      FILE        *fp；
      if((fp＝fopen(file，″r″))＝＝0){
            fprintf(stderr，″％s:can′t read％s\n″，prog，file)；
            exit(1)；
      }
      tlen＝natgc＝0；
      while(fhets(line，1024，fp)){
           if(*line＝＝′；′‖*line＝＝′＜′‖*line＝＝′＞′)
                 continue；
           for(px＝line；*px！＝′\n′；px++)
                 if(isupper(*px)‖islower(*px))
                       tlen++；
      }
      if((pseq＝malloc((unsigned)(tlen+6)))＝＝0){
            fprintf(stderr，″％s:malloc()failed to get％d bytes for％s\n″，prog，tlen+6，file)；
            exit(1)；
      }
      pseq[0]＝pseq[1]＝pseq[2]＝pseq[3]＝′\0′；
                                                                 …getseq
      py＝pseq+4；
      *len＝tlen；
      rewind(fp)；
      while(fgets(line，1024，fp)){
           if(*line＝＝′；′‖*line＝＝′＜′‖*line＝＝′＞′)
                continue；
           for(px＝line；*px！＝′\n′；px++){
                if(isupper(*px))
                      *py++＝*px；
                else if(islower(*px))
                      *py++＝toupper(*px)；
                if(index(″ATGCU″，*(py-1)))
                      natgc++；
           }
      }
      *py++＝′\0′；
      *py＝′\0′；
      (void)fclose(fp)；
      dna＝natgc＞(tlen/3)；
      return(pseq+4)；
}
char  *
g_calloc(msg，nx，sz)                                            g_calloc
      char  *msg；       /*program，calling routine*/
      int   nx，sz；     /*number and size of elements*/
{
      char          *px，*calloc()；
      if((px＝calloc((unsigned)nx，(unsigned)sz))＝＝0){
            if(*msg){
                  fprintf(stderr，″％s:g_calloc()failed％s(n＝％d，sz＝％d)\n″，prog，msg，nx，sz)；
                  exit(1)；
            }
      }
      return(px)；
}
/*
 *get final jmps from dx[]or tmp file，set pp[]，reset dmax:main()
 */
readjmps()                                                       readjmps
{
      int         fd＝-1；
      int         siz，i0，i1；
      register    i，j，xx；
      if(fj){
            (void)fclose(fj)；
            if((fd＝open(jname，O_RDONLY，0))＜0){
                  fprintf(stderr，″％s:can′t open()％s\n″，prog，jname)；
                  cleanup(1)；
            }
      }
      for(i＝i0＝i1＝0，dmax0＝dmax，xx＝len0；；i++){
            while(1){
                 for(j＝dx[dmax].ijmp；j＞＝0&&dx[dmax].jp.x[j]＞＝xx；j--)
                      ；
                                                                 …readjmps
                 if(j＜0&&dx[dmax].offset&&fj){
                       (void)lseek(fd，dx[dmax].offset，0)；
                       (void)read(fd，(char*)&dx[dmax].jp，sizeof(struct jmp))；
                       (void)read(fd，(char*)&dx[dmax].offset，sizeof(dx[dmax].offset))；
                       dx[dmax].ijmp＝MAXJMP-1；
                 }
                 else
                       break；
            }
            if(i＞＝JMPS){
                   fprintf(stderr，″％s:too many gaps in alignment\n″，prog)；
                   cleanup(1)；
            }
            if(j＞＝0){
                   siz＝dx[dmax].jp.n[j]；
                   xx＝dx[dmax].jp.x[j]；
                   dmax+＝siz；
                   if(siz＜0){    /*gapin second seq*/
                         pp[1].n[i1]＝-siz；
                         xx+＝siz；
                         /*id＝xx-yy+len1-1
                          */
                         pp[1].x[i1]＝xx-dmax+len1-1；
                         gapy++；
                         ngapy-＝siz；
/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/
                     siz＝(-siz＜MAXGAP‖endgaps)？-siz:MAXGAP；
                     i1++；
                }
                else if(siz＞0){/*gap in first seq*/
                       pp[0].n[i0]＝siz；
                       pp[0].x[i0]＝xx；
                       gapx++；
                     ngapx+＝siz；
/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/
                     siz＝(siz＜MAXGAP‖endgaps)？siz:MAXGAP；
                     i0++；
                }
          }
          else
                break；
      }
      /*reverse the order of jmps
       */
      for(j＝0，i0--；j＜i0；j++，i0--){
            i＝pp[0].n[j]；pp[0].n[j]＝pp[0].n[i0]；pp[0].n[i0]＝i；
            i＝pp[0].x[j]；pp[0].x[j]＝pp[0].x[i0]；pp[0].x[i0]＝i；
      }
      for(j＝0，i1--；j＜i1；j++，i1--){
            i＝pp[1].n[j]；pp[1].n[j]＝pp[1].n[i1]；pp[1].n[i1]＝i；
            i＝pp[1].x[j]；pp[1].x[j]＝pp[1].x[i1]；pp[1].x[i1]＝i；
      }
      if(fd＞＝0)
             (void)close(fd)；
      if(fj){
             (void)unlink(jname)；
             fj＝0；
             offset＝0；
       }                            }
/*
 *write a filled jmp struct offset of the prev one(if any):nw()
 */
writejmps(ix)                                                    writejmps
      int    ix；
{
      char   *mktemp()；
      if(！fj){
              if(mktemp(jname)＜0){
                    fprintf(stderr，″％s:can′t mktemp()％s\n″，prog，jname)；
                    cleanup(1)；
              }
              if((fj＝fopen(jname，″w″))＝＝0){
                    fprintf(stderr，″％s:can′t write％s\n″，prog，jname)；
                    exit(1)；
              }
     }
     (void)fwrite((char*)&dx[ix].jp，sizeof(struct jmp)，1，fj)；
     (void)fwrite((char*)&dx[ix].offset，sizeof(dx[ix].offset)，1，fj)；
}
表2
TAT           XXXXXXXXXXXXXXX    (长度＝15个氨基酸)
比较蛋白质    XXXXXYYYYYYY       (长度＝12个氨基酸)
％氨基酸序列同一性＝(ALIGN-2测定为两种多肽序列之间相同匹配的氨基酸残基数)÷(TAT多肽的氨基酸残基总数)＝
5÷15＝33.3％
表3
TAT          XXXXXXXXXX         (长度＝10个氨基酸)
比较蛋白质   XXXXXYYYYYYZZYZ    (长度＝15个氨基酸)
％氨基酸序列同一性＝
(ALIGN-2测定为两种多肽序列之间相同匹配的氨基酸残基数)÷(TAT多肽的氨基酸残基总数)＝
5÷10＝50％
表4
TAT-DNA    NNNNNNNNNNNNNN      (长度＝14个核苷酸)
比较DNA    NNNNNNLLLLLLLLLL    (长度＝16个核苷酸)
％核酸序列同一性＝
(ALIGN-2测定为两种核酸序列之间相同匹配的核苷酸数)÷(TAT-DNA核酸序列的核苷酸总数)＝
6÷14＝42.9％
表5
TAT-DNA    NNNNNNNNNNNN    (长度＝12个核苷酸)
比较DNA    NNNNLLLVV       (长度＝9个核苷酸)
％核酸序列同一性＝
(ALIGN-2测定为两种核酸序列之间相同匹配的核苷酸数)÷(TAT-DNA核酸序列的核苷酸总数)＝
4÷12＝33.3％
II.本发明的组合物和方法
A.抗TAT抗体
在一个实施方案中，本发明提供了可在本文中用作治疗剂和/或诊断剂的抗TAT抗体。例示性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的、和异源偶联的抗体。
1.多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。将相关抗原(尤其在使用合成肽时)与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。例如，可使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基的偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烃基，将抗原与匙孔
Figure A20058003786000951
血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中肽或偶联物初始量的1/5-1/10对动物进行强化。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
2.单克隆抗体
单克隆抗体可以通过最初由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称作融合配偶)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
优选的融合配偶骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系，诸如可从SalkInstitute Cell Distribution Center(San Diege，California，USA)购得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系，以及可从American Type Culture Collection(Manassas，Virginia，USA)购得的SP-2及衍生物，例如X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.，Anal.Biochem.107：220(1980)中记载的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并使用标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies.：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，例如通过将细胞i.p.注射到小鼠中。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。由此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定区(CH和CL)序列替代同源鼠源序列(美国专利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过融合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
3.人抗体和人源化抗体
本发明的抗TAT抗体还可包括人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠源)抗体的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体或输入CDR或框架序列中没有发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且整个或基本上整个FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最好还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))。
用于将非人抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中本质上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
当抗体意图在于人类治疗性用途时，用于制备人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链，对于降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。鉴定与啮齿类最接近的人V结构域序列，并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚型的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
设想了人源化抗TAT抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，任选偶联有一种或多种细胞毒剂以生成免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，诸如完整的IgG1抗体。
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。将大量人种系免疫球蛋白基因转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits etal.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利5,545,806，5,569,825，5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807；及WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，综述参见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Markset al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。
如上所述，还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。
4.抗体片段
在某些情况中，使用抗体片段而非完整抗体是有利的。片段的体积较小，容许快速清除，可导致对实体瘤的进入提高。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，由此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学方法偶联形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段描述于美国专利5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点且缺乏恒定区的唯一种类；因此，它们适合于在体内使用过程中降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应物蛋白质位于sFv氨基末端或羧基末端的融合。参见《Antibody Engineering》，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利5,641,870中描述的抗体。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
5.双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合本文所述TAT蛋白的两种不同表位。其它此类抗体可将TAT结合位点与针对另一种蛋白质的结合位点联合起来。或者，可以将抗TAT臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂联合起来，从而将细胞防御机制聚焦和定位于表达TAT的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达TAT的细胞。这些抗体拥有TAT结合臂及结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
WO 96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，美国专利5,837,234公开了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。双特异性抗ErbB2/Fcα抗体显示于WO 98/02463。美国专利5,821,337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
根据一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选的是，融合使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供期望双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率对期望链组合的产量没有显著影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体。
在本方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性复合物(compound)与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210(1986)。
根据美国专利5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段变得更加容易，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子。每个Fab′片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶的溶解活性。
还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的VH和VL，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。
6.异源偶联抗体
异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；EP03089)。设想了可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利4,676,980中所公开的。
7.多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易的通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的，具有三个或更多抗原结合位点的多价抗体(不同于IgM类)(例如四价抗体)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或交联区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选还包含至少两条(且优选四条)轻链可变区多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变区多肽。本文设想的轻链可变区多肽包含轻链可变区，且任选还包含CL结构域。
8.效应物功能工程改造
可能希望在效应物功能方面修饰本发明的抗体，例如为了增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。
9.免疫偶联物
本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。
本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065，及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。
美登素和美登木素生物碱类
在一个优选的实施方案中，本发明的抗TAT抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，明确将其公开内容收入本文作为参考。
美登木素生物碱-抗体偶联物
在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途：美国专利5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP0425235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3×105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
抗TAT多肽抗体-美登木素生物碱偶联物(免疫偶联物)
抗TAT抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗TAT抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1及Chari et al.，CancerResearch 52：127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包括偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗TAT抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。
其它细胞毒剂
可与本发明的抗TAT抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗TAT抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32、pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于诊断时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Frakeret al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗TAT抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。
10.免疫脂质体
本文中所公开的抗TAT抗体还可配制成免疫脂质体。“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；及WO 97/38731，公开于1997年10月23日中所述。循环时间延长的脂质体披露于美国专利5,013,556。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有期望直径的脂质体。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon et al.，J.NationalCancer Inst.81(19)：1484(1989)。
B.TAT结合寡肽
本发明的TAT结合寡肽指结合，优选特异性结合本文所述TAT多肽的寡肽。TAT结合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法学化学合成，或者可使用重组技术制备和纯化。TAT结合寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类寡肽能够结合，优选特异性结合本文所述TAT多肽。TAT结合寡肽无需过多试验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域公知的(参见例如美国专利5,556,762，5,750,373，4,708,871，4,833,092，5,223,409，5,403,484，5,571,689，5,663,143；PCT公开号WO 84/03506和WO 84/03564；Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3998-4002(1984)；Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：178-182(1985)；Geysen et al.，in Synthetic Peptides as Antigens，130-149(1986)；Geysen et al.，J.Immunol.Meth.102：259-274(1987)；Schoofset al.，J.Immunol.140：611-616(1988)；Cwirla，S.E.et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378；Lowman，H.B.et al.，(1991)Biochemistry 30：10832；Clackson，T.et al.，(1991)Nature 352：624；Marks，J.D.et al.，(1991)，J.Mol.Biol.222：581；Kang，A.S.et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8363；Smith，G.P.，(1991)Current Opin.Biotechnol.2：668)。
在这点上，噬菌体展示是一种可以筛选大型寡肽文库来鉴定那些文库中能够特异性结合多肽靶物的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott，J.K.andSmith，G.P.(1990)Science 249：386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体(或随机克隆cDNA)的大型文库迅速且有效的分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展示肽(Cwirla，S.E.et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378)或蛋白质(Lowman，H.B.et al.，(1991)Biochemistry 30：10832；Clackson，T.et al.，(1991)Nature 352：624；Marks，J.D.et al.，(1991)J.MoI.Biol.222：581；Kang，A.S.et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8363)文库已经用于对数百万多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的那些(Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.2：668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和繁殖大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集的结果的手段。参见美国专利5,223,409，5,403,484，5,571,689和5,663,143。
尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，λ类(lambdoid)噬菌体展示系统(WO 95/34683；US 5,627,024)、T4噬菌体展示系统(Ren，Z-J.et al.，(1998)Gene 215：439；Zhu，Z.(1997)CAN 33：534；Jiang，J.et al.，(1997)can128：44380；Ren，Z-J.et al.，(1997)CAN 127：215644；Ren，Z-J.(1996)ProteinSci.5：1833；Efimov，V.P.et al.，(1995)Virus Genes 10：173)和T7噬菌体展示系统(Smith，G.P.and Scott，J.K.(1993)Methods in Enzymology 217：228-257；US 5,766,905)也是已知的。
现在已经对基础噬菌体展示概念开发了很多其它改进和变异。这些改进增强了展示系统对肽文库筛选与选定靶分子的结合及展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有对这些蛋白质筛选期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO 98/14277)，而且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(WO 98/20169；WO 98/20159)和受约束螺旋肽的特性(WO 98/20036)。WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库接触第一种溶液和第二种溶液以选择性分离结合的配体，在第一种溶液中配体将结合靶分子，而在第二种溶液中亲和配体将不会结合靶分子。WO 97/46251描述了这样一种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，随后使用微量板的孔进行淘选过程以分离高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A作为亲和标签的使用(Li et al.，(1998)Mol.Biotech.9：187)。WO 97/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用可以是噬菌体展示库的组合文库。WO 97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。美国专利5,498,538，5,432,018和WO 98/15833中描述了选择特异性结合的蛋白质的其它方法。
产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利5,723,286，5,432,018，5,580,717，5,427,908，5,498,530，5,770,434，5,734,018，5,698,426，5,763,192，和5,723,323。
C.TAT结合有机分子
TAT结合有机分子指本文所定义的寡肽或抗体以外，结合、优选特异性结合本文所述TAT多肽的有机分子。TAT结合有机分子可以使用已知方法学来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585)。TAT结合有机分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者其大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类能够结合、优选特异性结合本文所述TAT多肽的有机分子无需过多实验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对有机分子文库筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是本领域公知的(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585)。TAT结合有机分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲(semicarbazone)、卡巴肼(carbazide)、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯(carbamate)、碳酸酯(carbonate)、缩酮、硫缩酮(thioketal)、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯(aryl sulfonate)、烃基卤、烃基磺酸酯(alkyl sulfonate)、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺(sulfonamide)、环氧化物、吖丙啶(aziridine)、异氰酸酯(isocyanate)、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯(acid chloride)等。
D.筛选具有期望特性的抗TAT抗体、TAT结合寡肽和TAT结合有机分 子
上文已经描述了用于产生结合TAT多肽的抗体、寡肽和有机分子的技术。根据需要，可进一步选择具有某些生物学性质的抗体、寡肽或其它有机分子。
可通过本领域公知的方法，例如使用内源性或在用TAT基因转染后表达TAT多肽的细胞，来评估本发明抗TAT抗体、寡肽或其它有机分子的生长抑制效果。例如，可将适宜的肿瘤细胞系和TAT转染细胞用不同浓度的本发明抗TAT单克隆抗体、寡肽或其它有机分子处理几天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比色测定法来分析。测量增殖的另一种方法是通过比较在存在或缺乏本发明的抗TAT抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子时所处理细胞的3H-胸苷摄取。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中对掺入DNA的放射性的量定量。适宜的阳性对照包括用已知抑制所选细胞系生长的生长抑制性抗体处理该细胞系。可以本领域知道的多种方法来测定体内肿瘤细胞的生长抑制。优选的是，肿瘤细胞是过表达TAT多肽的细胞。优选的是，与未处理的肿瘤细胞相比，抗TAT抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子将在体外或在体内抑制表达TAT的肿瘤细胞的细胞增殖达约25-100％，更优选约30-100％，甚更优选约50-100％或70-100％，在一个实施方案中，抗体浓度为约0.5-30μg/ml。可在细胞培养物中在抗体浓度为约0.5-30μg/ml或约0.5nM至200nM时测量生长抑制，其中在使肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测量生长抑制。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗TAT抗体导致在自首次施用抗体起约5天至3个月内、优选约5至30天内肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖降低，那么该抗体是体内生长抑制性的。
为了选择诱导细胞死亡的抗TAT抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子，可相对于对照评估膜完整性的丧失，这由例如碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取来指示。PI摄取测定法可在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将表达TAT多肽的肿瘤细胞与单独的培养基或含有适宜的抗TAT抗体(例如约10μg/ml)、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子的培养基一起温育。将细胞温育3天的时间段。每次处理后，清洗细胞并整分(aliquot)到35mm带滤盖的(strainer-capped)的12×75试管中(每支试管1ml，每个处理组3支试管)用于去除细胞团块。然后向试管加入PI(10μg/ml)。使用
Figure A20058003786001131
流式细胞仪和
Figure A20058003786001132
CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可选择那些通过PI摄取确定为诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗TAT抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子作为诱导细胞死亡的抗TAT抗体、TAT结合寡肽或TAT结合有机分子。
为了筛选结合TAT多肽上目的抗体所结合的表位的抗体、寡肽或其它有机分子，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所描述的。此测定法可用于确定测试抗体、寡肽或其它有机分子是否与已知的抗TAT抗体结合相同的位点或表位。或者/另外，可通过本领域已知的方法进行表位作图(mapping)。例如，可通过诸如丙氨酸扫描来诱变抗体序列以鉴定接触残基。首先对突变体抗体测试与多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在一种不同的方法中，可在竞争测定法中使用对应于TAT多肽不同区的肽，其中使用几种测试抗体或者一种测试抗体和一种具有已表征或已知表位的抗体。
E.依赖抗体的酶介导的前体药物疗法(ADEPT)
通过将抗体与前体药物活化酶偶联，本发明的抗体还可用于ADEPT，所述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO 88/07378和美国专利4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将用β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗TAT抗体共价结合，诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984))。
F.全长TAT多肽
本发明还提供了新鉴定并分离的核苷酸序列，其编码本申请中称为TAT多肽的多肽。具体的说，已经鉴定并分离了编码多种TAT多肽的cDNA(部分或全长)，正如下文实施例进一步详细公开的。
正如下文实施例所公开的，多个cDNA克隆已经保藏于ATCC。那些克隆的实际核苷酸序列可以由熟练技术人员使用本领域常规方法通过对所保藏克隆测序来容易的测定。预测的氨基酸序列可使用常规技术从核苷酸序列确定。对于本文所述TAT多肽及编码核酸，在有些情况中，申请人已经鉴定了认为是根据那时可获得的序列信息最好的可鉴定读码框。
G.抗TAT抗体和TAT多肽变体
除了本文所述抗TAT抗体和全长天然序列TAT多肽，设想了可制备抗TAT抗体和TAT多肽变体。抗TAT抗体和TAT多肽变体可通过将适宜的核苷酸改变引入编码DNA和/或通过合成期望抗体或多肽来制备。本领域技术人员将领会，氨基酸改变可改变抗TAT抗体或TAT多肽的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。
可在本文所述抗TAT抗体和TAT多肽中进行变异，例如使用例如美国专利5,364,934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码抗体或多肽的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致氨基酸序列相对于天然序列抗体或多肽的改变。任选的是，变异是通过抗TAT抗体或TAT多肽的一个或多个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。通过比较抗TAT抗体或TAT多肽的序列与同源已知蛋白质分子的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列改变的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残基可插入、替代或删除而不会对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。插入或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通过在序列中系统进行氨基酸插入、替代或删除，并对所得变体测试由全长或成熟天然序列展示的活性来确定可容许的变异。
本文提供了抗TAT抗体和TAT多肽的片段。例如，在与全长天然抗体或蛋白质比较时，此类片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺少对于抗TAT抗体或TAT多肽的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。
抗TAT抗体和TAT多肽片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化学合成。一种备选方法牵涉通过酶促消化产生抗体或多肽片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA，并分离期望片段。还有一种合适的技术牵涉分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望抗体或多肽片段的DNA片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5′和3′引物。优选的是，抗TAT抗体和TAT多肽片段与本文所公开的天然抗TAT抗体或TAT多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。
在具体实施方案中，感兴趣的保守替代见表6标题“优选替代”下所示。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可引入表6中称为“例示替代”的更实质性改变，或者如下文关于氨基酸类别进一步所述的，并筛选产物。
表6
  原始残基  例示替代   优选替代
  Ala(A)  val；leu；ile   val
  Arg(R)  lys；gln；asn   lys
  Asn(N)  gln；his；lys；arg   gln
  Asp(D)  glu   glu
  Cys(C)  ser   ser
  Gln(Q)  asn   asn
  Glu(E)  asp   asp
  Gly(G)  pro；ala   ala
  His(H)  asn；gln；lys；arg   arg
  Ile(I)  leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸   leu
  Leu(L)  正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe   ile
  Lys(K)  arg；gln；asn   arg
  Met(M)  leu；phe；ile   leu
  Phe(F)  leu；val；ile；ala；tyr   leu
  Pro(P)  ala   ala
  Ser(S)  thr   thr
  Thr(T)  ser   ser
  Trp(W)  tyr；phe   tyr
  Tyr(Y)  trp；phe；thr；ser   phe
  Val(V)  ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸   leu
对抗TAT抗体或TAT多肽的功能或免疫学身份的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)影响侧链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是，引入剩余的(非保守)位点。
变异可使用本领域知道的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter et al.，Nucl.Acids Res.13：4331(1986)；Zoller et al.，Nucl.Acids Res.10：6487(1987))、盒式诱变(Wells et al.，Gene 34：315(1985))、限制性选择诱变(restriction selection mutagenesis)(Wells et al.，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA 317：415(1986))或其它已知技术以产生抗TAT抗体或TAT多肽变体DNA。
还可采用扫描氨基酸分析来鉴定沿着邻近序列的一个或多个氨基酸。在优选的扫描用氨基酸中有相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这组中的优选扫描用氨基酸，因为它消除了β-碳上的侧链，而且不大可能改变变体的主链构象(Cunninghamand Wells，Science 244：1081-1085(1989))。丙氨酸通常也是优选的，因为它是最常见的氨基酸。另外，常常在隐蔽位置和暴露位置都能发现它(Creighton，The Proteins，W.H.Freeman&Co.，N.Y.；Chothia，J.Mol.Biol.150：1(1976))。如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可使用等排(isoteric)氨基酸。
任何不涉及保持抗TAT抗体或TAT多肽正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗TAT抗体或TAT多肽中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体的一个或多个高变区残基(例如人源化或人源抗体)。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和人TAT多肽之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码抗TAT抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体形式的抗TAT抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
H.对抗TAT抗体和TAT多肽的修饰
对抗TAT抗体和TAT多肽的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使抗TAT抗体或TAT多肽的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与抗TAT抗体或TAT多肽的选定侧链或者N-或C-末端残基起反应。用双功能试剂进行的衍生化可用于例如使抗TAT抗体或TAT多肽与不溶于水的支持基质或表面交联，以用于抗TAT抗体的纯化方法，反之亦然。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮-乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和诸如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺酯等试剂。
其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。
本发明范围内所包括的对抗TAT抗体或TAT多肽的另一类共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化样式。“改变天然糖基化样式”在本文中意图指删除一个或多个在天然序列抗TAT抗体或TAT多肽中发现的碳水化合物模块(moiety)(或是通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学和/或酶促手段删除糖基化)，和/或添加一个或多个在天然序列抗TAT抗体或TAT多肽中不存在的糖基化位点。另外，此短语包括天然蛋白质糖基化中的定性改变，牵涉所存在的多种碳水化合物模块的本质和比例的改变。
抗体和其它多肽的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗TAT抗体或TAT多肽中添加糖基化位点通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变还可通过向原始抗TAT抗体或TAT多肽的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。可任选通过DNA水平的变化来改变抗TAT抗体或TAT多肽的氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码抗TAT抗体或TAT多肽的DNA，从而产生将翻译成期望氨基酸的密码子。
增加抗TAT抗体或TAT多肽上糖模块的数目的另一种方法是通过使糖苷与多肽化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公开的WO 87/05330，和Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。
去除抗TAT抗体或TAT多肽上存在的糖模块可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代。化学脱糖基化技术是本领域已知的，而且描述于例如Hakimuddin et al.，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge et al.，Anal.Biochem.118：131(1981)。酶促切割多肽上的糖模块可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura et al.，Meth.Enzvmol.138：350(1987)所述。
对抗TAT抗体或TAT多肽的另一类共价修饰包括，以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述方式，将抗体或多肽与多种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亚烷基(polyoxyalkylene)。抗体或多肽还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980。
还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的抗TAT抗体或TAT多肽，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的抗TAT抗体或TAT多肽。
在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的抗TAT抗体或TAT多肽的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于抗TAT抗体或TAT多肽的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的抗TAT抗体或TAT多肽的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使抗TAT抗体或TAT多肽易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field et al.，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988))；c-myc标签及其抗体8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10抗体(Evan et al.，Molecular and Cellular Biology 5：3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.，ProteinEngineering 3(6)：547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp et al.，BioTechnology 6：1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin et al.，Science 255：192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner et al.，J.Biol.Chem.266：15163-15166(1991))；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6393-6397(1990))。
在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括抗TAT抗体或TAT多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘附素”)，此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合物优选包含用可溶形式(跨膜结构域删除或失活)的抗TAT抗体或TAT多肽置换Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的铰链区、CH2区和CH3区，或者铰链区、CH1区、CH2区和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的制备还可参见1995年6月27日授权的美国专利5,428,130。
I.抗TAT抗体和TAT多肽的制备
下面的描述主要涉及通过培养用包含编码抗TAT抗体和TAT多肽的核酸的载体转化或转染的细胞来制备抗TAT抗体和TAT多肽。当然设想了可采用本领域公知的备选方法来制备抗TAT抗体和TAT多肽。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成适宜的氨基酸序列或其部分(参见例如Stewart et al.，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA，1969；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动化合成可例如使用AppliedBiosystems Peptide Synthesizer(Foster City，CA)依照制造商的说明书来完成。抗TAT抗体或TAT多肽的多个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成期望的抗TAT抗体和TAT多肽。
1.编码抗TAT抗体或TAT多肽的DNA的分离
编码抗TAT抗体或TAT多肽的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为具有所述抗TAT抗体或TAT多肽mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人的抗TAT抗体或TAT多肽DNA可以方便的从以人组织制备的cDNA文库获得。抗TAT抗体或TAT多肽编码基因也可从基因组文库或通过已知的合成流程(例如自动化核酸合成)获得。
可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准流程进行，诸如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，New York，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989所述。分离编码抗TAT抗体或TAT多肽的基因的一种备选方法是使用PCR方法学(Sambrooket al.，见上文；Dieffenbach et al.，PCR Primer：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1995)。
用于筛选cDNA文库的技术是本领域公知的。选作探针的寡核苷酸序列应该足够长且足够明确(unambiguous)，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本领域公知的，包括使用放射标记物，像32p-标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见Sambrook et al，见上文。
在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如GenBank或其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。分子限定区域内的或跨越全长序列的序列同一性(或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上)可使用本领域知道的和本文描述的方法来测定。
具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断氨基酸序列筛选选定cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrook et al.，见上文所述常规引物延伸流程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间产物。
2.宿主细胞的选择和转化
将宿主细胞用本文所述用于抗TAT抗体或TAT多肽生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，可以由本领域技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见Mammalian CellBiotechnology：a Practical Approach，M.Butler，ed.，IRL Press，1991和Sambrook et al.，见上文。
真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员所知道的，例如CaCl2、CaPO4、脂质体介导的和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook et al.，见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。用根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw et al.，Gene 23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham and van der Eb，Virology 52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利4,399,216。进入酵母的转化通常依照Van Solingen et al.，J.Bact.130：946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的多种技术见Keown et al.，Methods inEnzvmology 185：527-537(1990)和Mansour et al.，Nature 336：348-352(1988)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC53,635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonAptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 UvG kanr；大肠杆菌W3110菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6；及具有1990年8月7日授权的美国专利4,946,783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。
全长抗体、抗体片段及抗体融合物蛋白质可在细菌中制备，特别是在不需要糖基化和Fc效应物功能时，诸如当治疗用抗体与细胞毒剂(例如毒素)偶联且免疫偶联物自身显示出肿瘤细胞破坏的效力时。全长抗体在循环中具有较长半衰期。大肠杆菌中的生成更快且更加省钱。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5,648,237(Carter等人)，US 5,789,199(JoIy等人)，和US 5,840,523(Simmons等人)，它们描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，在此收入这些专利作为参考。表达后，从大肠杆菌细胞糊在可溶性级分中分离抗体，并且可例如根据同种型通过蛋白A或G柱来纯化。最终的纯化可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法类似的进行。
除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是编码抗TAT抗体或TAT多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse，Nature 290：140(1981)；EP139,383，1985年5月2日公开)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4,943,529；Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-975(1991))诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt et al.，J. Bacteriol.154(2)：737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg et al.，Bio/Technology 8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.28：265-278(1988))；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：5259-5263(1979))；许旺酵母属(Schwanniomyces)诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(EP 394,538，1990年10月31日公开)；和丝状真菌诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO 91/00357，1991年1月10日公开)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)(Balance et al.，Biochem.. Biophys.Res.Commun.112：284-289(1983)；Tilbum et al.，Gene 26：205-221(1983)；Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.4：475-479(1985))。甲基营养型酵母(Methylotropic yeast)适于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的、选自以下属的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属(Rhodotorula)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可参见C.Anthony，The Biochemistry ofMethylotrophs，269(1982)。
适用于表达糖基化抗TAT抗体或TAT多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9，以及植物细胞诸如棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、烟草的细胞培养物。。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊蚊Aedes albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)、和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
然而，对脊椎动物细胞最感兴趣，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.，1977，J.Gen Virol.36：59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23：243-251)；猴肾细胞(CV1，ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
用上述用于抗TAT抗体或TAT多肽生成的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。
3.复制型载体的选择和使用
可以将编码抗TAT抗体或TAT多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体用于克隆(DNA扩增)或表达。多种载体是公众可得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适宜的限制性内切酶位点。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。
TAT不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的编码抗TAT抗体或TAT多肽的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp、或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母和克鲁维酵母的α-因子前导序列，后者见美国专利5,010,182)、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公开的EP 362,179)、或1990年11月15日公开的WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。众所周知多种细菌、酵母、和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达和克隆载体通常将包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的选择标志的一个例子是能够鉴定有能力摄取编码抗TAT抗体或TAT多肽的核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和繁殖如Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980)所述。适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb etal.，1979，Nature 282：39；Kingsman et al.，1979，Gene7：141；Tschemper et al.，1980，Gene 10：157)。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志(Jones，1977，Genetics 85：12)。
表达和克隆载体通常包含与编码抗TAT抗体或TAT多肽的核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang et al.，Nature275：615(1978)；Goeddel et al.，Nature 281：544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，Nucleic acids Res.8：4057(1980)；EP 36,776)、和杂合启动子诸如tac启动子(deBoer et al.，Proc.Nal. Acad.Sci.USA 80：21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗TAT抗体或TAT多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzemanet al.，J.Biol.Chem.255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess et al.，J.Adv. Enzyme Reg.7：149(1968)；Holland，Biochemistry17：4900(1978))的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶。
作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 73,657。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗TAT抗体或TAT多肽受到例如由病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)基因组、由异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
可通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码抗TAT抗体或TAT多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp，作用于启动子以增加转录。已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中，位于抗TAT抗体或TAT多肽编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗TAT抗体或TAT多肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
适合在改动后在重组脊椎动物细胞培养物中合成抗TAT抗体或TAT多肽的其它方法、载体和宿主细胞见Gething et al.，Nature 293：620-625(1981)；Mantei et al.，Nature 281：40-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058。
4.培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生成本发明抗TAT抗体或TAT多肽的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，1979，Meth.Enz.58：44；Barnes et al.，1980，Anal.Biochem.102：255；美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适当浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显然的。
5.检测基因扩增/表达
基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列，使用适宜的标记探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链体结合到表面上，从而在双链体在表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。
或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，诸如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可用于免疫组化染色和/或样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列TAT多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与TAT DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列来制备抗体。
6.纯化抗TAT抗体和TAT多肽
可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的抗TAT抗体和TAT多肽。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶促裂解使其从膜释放。抗TAT抗体和TAT多肽表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。
可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化抗TAT抗体和TAT多肽。下面的流程是合适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白ASepharose柱以除去污染物诸如IgG；及结合抗TAT抗体和TAT多肽的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principes and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。纯化步骤的选择将取决于例如所用生成过程的性质和所产生的具体抗TAT抗体或TAT多肽。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167，1992描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，1983，J.Immunol.Meth.62：1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，1986，EMBO J.5：1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何初步的纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可以使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行低pH疏水相互作用层析。
J.药用配制剂
可如下制备依照本发明使用的抗TAT抗体、TAT结合寡肽、TAT siRNA、TAT结合有机分子和/或TAT多肽的治疗用配制剂，即以冻干剂型或水溶液的形式，将具有期望纯度的抗体、多肽、寡肽、siRNA或有机分子与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；张力调节剂(tonicifier)，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，诸如聚山梨醇酯；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。抗体优选包含浓度为5-200mg/ml，优选10-100mg/ml的抗体。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。例如，除了抗TAT抗体、TAT结合寡肽、TAT siRNA或TAT结合有机分子之外，可能还期望在一种配制剂中含有另一种抗体，例如结合TAT多肽上不同表位的第二抗TAT抗体，或针对一些其它靶物诸如影响特定癌生长的生长因子的抗体。或者/另外，组合物还可包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
K.使用抗TAT抗体、TAT结合寡肽、TAT siRNA和TAT结合有机分子 的诊断和治疗
为了测定癌中的TAT表达，可利用多种诊断测定法。在一个实施方案中，可通过免疫组化(IHC)来分析TAT多肽过表达。可对来自肿瘤活组织检查的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法，并给予如下TAT蛋白质染色强度标准：得分0：未观察到染色或者在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。得分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜上有染色。
得分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
那些TAT多肽表达得分0或1+的肿瘤可鉴定为未过表达TAT，而那些得分2+或3+的肿瘤可鉴定为过表达TAT。
或者/另外，可对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法诸如
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(由Ventana，Arizona销售)或
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(Vysis，Illinois)以测定肿瘤中TAT过表达的程度(如果有的话)。
还可使用体内诊断测定法来评估TAT过表达或扩增，例如通过施用结合待检测分子且标记有可检测标记物(例如放射性同位素或荧光标记物)的分子(诸如抗体、寡肽或有机分子)，然后对患者进行外部扫描以定位所述标记物。
如上文所述，本发明的抗TAT抗体、寡肽和有机分子具有多种非治疗性应用。本发明的抗TAT抗体、寡肽和有机分子可用于表达TAT多肽的癌症的诊断和分级(例如在放射成像中)。抗体、寡肽和有机分子还可用于从细胞中纯化或免疫沉淀TAT多肽，用于TAT多肽的体外检测和定量例如在ELISA或Western印迹中，作为纯化其它细胞的一个步骤从混合细胞群中杀死和消除表达TAT的细胞。
现在，根据癌症的分级，癌症的治疗牵涉下列疗法中的一种或组合：手术去除癌性组织，放疗和化疗。抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子疗法对于不能很好承受化疗的毒性和副作用的老年患者和放疗具有有限效用的转移性疾病可能是尤其想要的。本发明的靶向肿瘤的抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子可用于在疾病的最初诊断时或在复发期间减轻表达TAT的癌症。对于治疗性应用，可单独使用抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子，或者用于与例如激素、抗血管发生剂(antiangiogen)或放射标记的化合物，或者与手术、冷冻疗法和/或放疗的联合疗法。抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子的治疗可与其它形式的常规疗法联合施用，与常规疗法连续、在之前或之后。化疗药物诸如
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多西他塞(doxetaxel)、
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紫杉醇(paclitaxel)、雌莫司汀(estramustine)和米托蒽醌(mitoxantrone)用于治疗癌症，特别是无风险(good risk)的患者。在本发明治疗或减轻癌症的方法中，可给癌症患者施用抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子并联合一种或多种前述化疗剂的治疗。具体而言，设想了与紫杉醇及改良衍生物的联合疗法(参见例如EP 0 600 517)。将抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子与治疗有效剂量的化疗剂一起施用。在另一个实施方案中，联合化疗施用抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子以提高化疗剂例如紫杉醇的活性和功效。Physicians′Desk Reference(PDR)公开了已经在多种癌症的治疗中使用的这些药剂的剂量。这些前述化疗药物在治疗上有效的剂量给药方案和剂量将取决于所治疗的具体癌症、疾病的程度、及有本领域技术的内科医师所熟悉的其它因素、且可以由内科医师确定。
在一个具体的实施方案中，将包含与细胞毒剂偶联的抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子的偶联物施用于患者。优选的是，与TAT蛋白质结合的免疫偶联物由细胞内在化，导致免疫偶联物在杀死其所结合的癌细胞方面的治疗功效提高。在一个优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子上文已有描述，包括美登木素生物碱类、加利车霉素、核糖核酸酶及DNA内切核酸酶。
将抗TAT抗体、寡肽、有机分子或其毒素偶联物依照已知方法施用给人类患者，诸如静脉内施用，例如作为推注或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。优选静脉内或皮下施用抗体、寡肽或有机分子。
抗TAT抗体、寡肽或有机分子的施用可联合其它治疗方案。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用，及任意顺序的连续施用，其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。优选的是，此类联合疗法导致协同治疗效果。
可能还期望将一种或多种抗TAT抗体、寡肽或有机分子的施用与针对与特定癌症有关的另一种肿瘤抗原的抗体的施用联合。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性处理方法牵涉(一种或多种)抗TAT抗体、寡肽或有机分子与一种或多种化疗剂或生长抑制剂的联合施用，包括不同化疗剂的混合物(cocktail)的共施用。化疗剂包括磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)、泼尼莫司汀(prednimustine)、顺铂、5-氟尿嘧啶、美法仑(melphalan)、环磷酰胺、羟基脲和羟基脲紫杉烷(hydroxyureataxane)(诸如紫杉醇和多西他塞(doxetaxel))和/或蒽环类(anthracycline)抗生素。此类化疗剂的制剂和剂量给药方案可依照制造商的说明书使用或由熟练从业人员根据经验确定。此类化疗的制备和剂量给药方案还可参阅ChemotherapyService Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
抗体、寡肽或有机分子可与抗激素化合物以此类分子的已知剂量联合，例如抗雌激素化合物，诸如他莫昔芬(tamoxifen)；抗孕酮化合物，诸如奥那司酮(onapristone)(见EP 616,812)；或抗雄激素化合物，诸如氟他米特(flutamide)。当待治疗癌症是雄激素非依赖性癌症时，患者可能先前已经接受过抗雄激素疗法，并在癌症变成雄激素非依赖性时，可以给患者施用抗TAT抗体、寡肽或有机分子(及任选的本文所述其它药剂)。
有时，还给患者共施用心脏保护剂(以预防或降低与疗法有关的心肌功能障碍)或一种或多种细胞因子可能也是有益的。除了上述治疗方案，在抗体、寡肽或有机分子疗法之前、同时、或之后，可给患者进行手术去除癌细胞和/或放疗。任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可由于该药剂与抗TAT抗体、寡肽或有机分子的联合作用(协同作用)而降低。
为了预防或治疗疾病，施用的剂量和模式可以由内科医师依照已知标准来选择。抗体、寡肽或有机分子的适宜剂量将取决于如上定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、是为了预防还是治疗目的施用抗体、寡肽或有机分子、先前的疗法、患者的临床史及对抗体、寡肽或有机分子的响应、及主治医师的判断。恰当的将抗体、寡肽或有机分子一次性或在一系列治疗中施用给患者。优选的是，将抗体、寡肽或有机分子通过静脉内输注或通过皮下注射来施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至约50mg/kg体重(例如约0.1-15mg/kg/剂)的抗体可作为初始侯选剂量施用给患者，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。剂量给药方案可包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，后续约2mg/kg抗TAT抗体的每周维持剂量。然而，其它剂量方案也可使用。根据上述因素，典型的每日剂量可在约1μg/kg到100mg/kg或更多的范围内。对于持续几天或更长时间的重复施用，根据状况，维持治疗直到发生对疾病症状的期望遏制。这种疗法的进展可容易的通过常规方法和测定法，并基于内科医师或其它本领域技术人员知道的标准来监测。
除了将抗体蛋白质施用给患者，本申请设想通过基因疗法来施用抗体。编码抗体的核酸的此类施用涵盖在表述“施用治疗有效量的抗体”中。关于使用基因疗法来产生胞内抗体的用途参见例如1996年3月14日公开的WO96/07321。
有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至预期宿主的体外培养细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson et al.，Science 256：808-813(1992)。还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。
本发明的抗TAT抗体可以是本文中“抗体”定义所涵盖的不同形式。因此，抗体包括全长或完整抗体，抗体片段，天然序列抗体或氨基酸变体，人源化的、嵌合的或融合抗体，免疫偶联物，及其功能性片段。在融合抗体中，抗体序列与异源多肽序列融合。可在Fc区中修饰抗体以提供期望的效应物功能。如本文的部分更为详细讨论的，凭借适宜的Fc区，结合在细胞表面上的裸抗体可诱导细胞毒性，例如经由抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)，或通过在补体依赖性细胞毒性中募集补体，或一些其它机制。或者，在期望消除或降低效应物功能从而使副作用或治疗并发症降至最低时，可使用某些其它Fc区。
在一个实施方案中，抗体与本发明抗体竞争对相同表位的结合或基本上结合相同表位。还设想了具有本发明抗TAT抗体的生物学特征的抗体，明确包括体内肿瘤靶向和任何细胞增殖抑制或细胞毒性特征。
本文详细描述了生成上述抗体的方法。
本发明抗TAT抗体、寡肽、siRNA和有机分子可用于治疗哺乳动物中表达TAT的癌症或减轻所述癌症的一种或多种症状。此类癌症包括前列腺癌、泌尿道癌、肺癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌和卵巢癌，更具体的有前列腺腺癌、肾细胞癌、结肠直肠腺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌和胸膜间皮瘤。癌症涵盖任何前述的转移癌。抗体、寡肽、siRNA或有机分子能够结合哺乳动物中表达TAT多肽的癌细胞的至少一部分。在一个优选的实施方案中，抗体、寡肽、siRNA或有机分子在体外或在体内在结合细胞上的TAT多肽时有效破坏或杀死表达TAT的肿瘤细胞或抑制此类肿瘤细胞的生长。此类抗体包括裸露的抗TAT抗体(未与任何药剂偶联)。具有细胞毒性或细胞生长抑制特性的裸抗体可以进一步与细胞毒剂合作(harness)，使得它们在破坏肿瘤细胞上更有效。可以通过例如将抗体与细胞毒剂偶联形成本文所述免疫偶联物，而赋予抗TAT抗体以细胞毒性特性。细胞毒剂或生长抑制剂优选是小分子。优选毒素诸如加利车霉素或美登木素生物碱类及其类似物或衍生物。
本发明提供了包含本发明抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子及载体的组合物。为了治疗癌症的目的，可以将组合物施用于需要此类治疗的患者，其中组合物可包含一种或多种呈现为免疫偶联物或裸抗体的抗TAT抗体。在另一个实施方案中，组合物可包含这些抗体、寡肽、siRNA或有机分子并联合其它治疗剂诸如细胞毒剂或生长抑制剂，包括化疗剂。本发明还提供了包含本发明抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子及载体的配制剂。在一个实施方案中，配制剂是包含药学可接受载体的治疗用配制剂。
本发明的另一个方面是编码抗TAT抗体的分离核酸。设想了编码重链和轻链二者，尤其是高变区残基的核酸，编码天然序列抗体以及所述抗体的变体、修饰和人源化型式的链。
本发明还提供了可用于治疗哺乳动物中表达TAT多肽的癌症或减轻所述癌症的一种或多种症状的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子。抗体、寡肽或有机分子治疗用组合物可由内科医师指导，短期或长期或间断施用。还提供了抑制表达TAT多肽的细胞生长和杀死它的方法。
本发明还提供了包含至少一种抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子的试剂盒和制品。包含抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子的试剂盒可用于例如表达TAT的细胞的杀伤测定法，从细胞中纯化或免疫沉淀TAT多肽。例如，为了分离和纯化TAT，试剂盒可包含与珠子(例如sepharose珠子)偶联的抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子。可以提供包含抗体、寡肽、siRNA或有机分子的试剂盒，用于TAT的体外检测和定量，例如在ELISA或Western印迹中。可用于检测的此类抗体、寡肽、siRNA或有机分子可以与标记物诸如荧光或放射标记物一起提供。
L.制品和试剂盒
本发明的另一个方面是包含可用于治疗表达TAT的癌症的物质的制品。制品包括容器和所述容器上或与其相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有有效治疗癌症状况的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗癌症。标签或包装插页进一步包含给癌症患者施用抗体、寡肽、siRNA或有机分子组合物的说明书。另外，制品还可包括第二容器，其中装有药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
还提供了可用于多种目的的试剂盒，例如用于表达TAT的细胞的杀伤测定法，用于从细胞中纯化或免疫沉淀TAT多肽。为了分离和纯化TAT，试剂盒可包含与珠子(例如sepharose珠子)偶联的抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子。可以提供包含抗体、寡肽、siRNA或有机分子的试剂盒，用于TAT多肽的体外检测和定量，例如在ELISA或Western印迹中。与制品相同，试剂盒包括容器和所述容器上或与其相关的标签或包装插页。容器中装有包含至少一种本发明抗TAT抗体、寡肽、siRNA或有机分子的组合物。可包括另外的容器，其中装有例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体。标签或包装插页可提供对组合物的描述以及用于预期体外或诊断用途的说明书。
M.TAT多肽和编码TAT多肽的核酸的用途
编码TAT多肽的核苷酸序列(或其互补序列)在分子生物学领域具有多种应用，包括用作杂交探针，用于染色体和基因作图，及用于生成反义RNA、siRNA和DNA探针。编码TAT的核酸还可用于通过本文所述重组技术来制备TAT多肽，其中那些TAT多肽可用于例如制备本文所述抗TAT抗体。
全长天然序列TAT基因或其部分可作为杂交探针用于cDNA文库以分离全长TAT cDNA或分离与本文所公开的天然TAT序列具有期望序列同一性的其它cDNA(例如那些编码TAT的天然存在变体或来自其它物种的TAT的cDNA)。任选的是，探针的长度为约20个到约50个碱基。杂交探针可衍生自全长天然核苷酸序列的至少部分新的区域，其中那些区域不需要过多试验就可以确定，或者来自包含天然序列TAT的启动子、增强子元件和内含子的基因组序列。举例来说，筛选方法将包括使用已知DNA序列分离TAT基因的编码区以合成约40个碱基的选定探针。杂交探针可用多种标记物标记，包括放射性核苷酸，诸如32p或35S，或酶标记物，诸如通过亲合素/生物素偶联系统与探针偶联的碱性磷酸酶。具有与本发明TAT基因的序列互补的序列的标记探针可用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA文库以确定探针与此类文库的哪些成员杂交。下面的实施例更详细的描述了杂交技术。使用本文所公开的方法，本申请中公开的任何EST序列可类似的用作探针。
编码TAT的核酸的其它有用片段包括反义或有义寡核苷酸，包括能够结合靶TAT mRNA(有义)或TAT DNA(反义)序列的单链核酸序列(或是RNA或是DNA)。依照本发明，反义或有义寡核苷酸包含TAT DNA编码区的片段。此类片段通常包含至少约14个核苷酸，优选约14至30个核苷酸。根据编码给定蛋白质的cDNA序列来衍生反义或有义寡核苷酸的能力描述于例如Stein and Cohen，Cancer Res.48：2659，1988和van der Krol et al.，BioTechniques 6：958，1988。
反义或有义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，其通过多种手段之一阻断靶序列的转录或翻译，所述手段包括双链体的降解增强、转录或翻译的过早终止、或其它手段。此类方法涵盖在本发明中。反义寡核苷酸因此可用于阻断TAT蛋白质的表达，其中那些TAT蛋白质可能在哺乳动物中起诱导癌症的作用。反义或有义寡核苷酸还包括具有经过修饰的糖-磷酸二酯骨架(或其它糖键(linkage)，诸如WO 91/06629中所述)的寡核苷酸，且其中此类糖键对内源核酸酶有抗性。具有抗性糖键的此类寡核苷酸在体内是稳定的(即能够抵抗酶促降解)，但保留了能够结合靶核苷酸序列的序列特异性。
用于反义结合的优选基因内位点包括掺入基因可读框(ORF)的翻译起始密码子(5′-AUG/5′-ATG)或终止密码子(5′-UAA、5′-UAG和5-UGA/5′-TAA、5′-TAG和5′-TGA)的区域。这些区域指mRNA或基因中涵盖从翻译起始或终止密码子起任一方向(即5′或3′)的约25个至约50个毗连核苷酸的部分。用于反义结合的其它优选区域包括：内含子；外显子；内含子-外显子连接处；可读框(ORF)或“编码区”，即翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域；mRNA的5′帽，其包含经由5′-5′三磷酸键与mRNA的最5′端残基连接的N7-甲基化鸟苷残基，包括5′帽结构自身以及与帽相邻的前50个核苷酸；5′非翻译区(5′UTR)，即mRNA中从翻译起始密码子起5′方向的部分，因此包括mRNA中5′帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上的相应核苷酸；和3′非翻译区(3′UTR)，即mRNA中从翻译终止密码子起3′方向的部分，因此包括mRNA中翻译终止密码子和的3′末端之间的核苷酸或基因上的相应核苷酸。
可用于抑制TAT蛋白质表达的优选反义化合物的具体例子包括包含经修饰骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有经修饰骨架的寡核苷酸包括那些在骨架中保留磷原子的以及那些在骨架中没有磷原子的寡核苷酸。为了本说明书的目的，而且有时候在本领域内参考，在其核苷间骨架中没有磷原子的经修饰寡核苷酸也可认为是寡核苷酸。优选的经修饰寡核苷酸骨架包括例如具有正常3′-5′键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯(aminoalkylphosphotriester)、甲基和其它烃基膦酸酯包括3′-亚烃基膦酸酯(3′-alkylene phosphonate)、5′-亚烃基膦酸酯(5′-alkylenephosphonate)和手性膦酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯(3′-amino phosphoramidate)和氨烃基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烃基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)、硫羰烃基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriester)、硒代磷酸酯(selenophosphate)和溴代磷酸酯(borano-phosphate)，它们的2′-5′连接类似物，及那些具有反向极性的类似物，其中一个或多个核苷酸间键是3′到3′、5′到5′、或2′到2′键。具有反向极性的优选寡核苷酸在最3′端核苷酸间键包含单一3′到3′键，即可以是无碱基(核碱基缺失或以羟基取代)的单一反向核苷残基。多种盐、混合盐和游离酸的形式也包括在内。教导含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697；和5,625,050，在此收入每一项作为参考。
其中不含磷原子的优选经修饰寡核苷酸骨架具有由短链烃基或环烃基核苷间键、混合杂原子和烃基或环烃基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括那些具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；核糖乙酰基骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯(sulfamate)骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基(methylenehydrazino)骨架；磺酸酯和磺酰胺(sulfonamide)骨架；酰胺骨架；及其它具有混合N、O、S和CH2组成部分的骨架。教导此类寡核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269；和5,677,439，在此收入每一项作为参考。
在其它优选的反义寡核苷酸中，核苷酸单元的糖和核苷间键，即骨架，用新基团取代。保持碱基单元以与适宜的核酸靶化合物杂交。已显示出具有卓越杂交特性的这样一种寡聚化合物，即寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架以含酰胺骨架取代，特别是氨乙基甘氨酸骨架。核碱基得到保留并直接或间接结合骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,539,082；5,714,331；和5,719,262，在此收入每一项作为参考。PNA化合物的更多教导可参见Nielsen et al.，1991，Science 254：1497-1500。
优选的反义寡核苷酸掺入了硫代磷酸酯骨架和/或杂原子骨架，特别是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、上述美国专利5,489,677中描述的-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯骨架表示为-O-P-O-CH2-)、及上述美国专利5,602,240的酰胺骨架。上述美国专利5,034,506的具有吗啉代骨架结构的反义寡核苷酸也是优选的。
经修饰的寡核苷酸还可以包含一种或多种取代糖模块。优选的寡核苷酸在2′位置包含如下之一：OH；F；O-烷基，S-烷基，或N-烷基；O-烯基，S-烯基，或N-烯基；O-炔基，S-炔基，或N-炔基；或O-烃基-O-烃基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1到C10烷基或C2到C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1到约10。其它优选的反义寡核苷酸在2′位置包含如下之一：C1到C10低级烃基，取代的低级烃基，烯基，炔基，烃芳基，芳烃基，O-烃芳基或O-芳烃基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，杂环烃基，杂环烃芳基，氨烃基氨基(aminoalkylamino)，聚烃基氨基(polyalkylamino)，取代的甲硅烷基，RNA切割基团(cleaving group)，报道基团(reporter group)，嵌入剂，用于提高寡核苷酸的药动学性质的基团，或用于提高核苷酸的药效学性质的基团，及具有相似性质的其它取代基。优选的修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称作′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin et al.，1995，HeIv.Chim.Acta 78：486-504)即烃氧基烃氧基(alkoxyalkoxy)。进一步优选的修饰包括2′-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称作2′-DMAOE，如下文实施例所述，和2′-二甲氨基乙氧基乙氧基(本领域也称作2′-O-二甲氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即′-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N(CH3)2。
进一步优选的修饰包括锁定核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)，其中2′-羟基与糖环的3′或4′碳原子相连，由此形成双环糖模块。键优选是在桥接2′氧原子和4′碳原子的亚甲基(methelyne)(-CH2-)n基团，其中n是1或2。LNA及其制备参见WO 98/39352和WO 99/14226。
其它优选的修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)，2′-氨丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)，2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)，2′-O-烯丙基(2′-O-CH2-CH＝CH2)和2′-氟(2′-F)。2′-修饰可以在阿拉伯糖(arabino)(上)位或核糖(ribo)(下)位。优选的2′-阿拉伯糖修饰是2′-F。也可在寡核苷酸上的其它位置进行类似的修饰，特别是3′末端核苷酸的糖的3′位置或在2′-5′连接的寡核苷酸中和5′末端核苷酸的5′位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物，诸如用环丁基模块取代呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖。教导此类经过修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，在此完整收入每一项作为参考。
寡核苷酸还可包括核碱基(本领域内通常简称为“碱基”)修饰或替代。在用于本文时，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经过修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烃基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烃基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH3或-CH2-C≡CH)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮(azo)尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基(thiol)、8-硫烃基(thioalkyl)、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯丙噁嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯丙噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹环诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨乙氧基)-H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯丙噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶[4，5-b]吲哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶[3′，2′：4，5]吡咯[2，3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的核碱基还可包括那些其中嘌呤或嘧啶碱基用其它杂环，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮取代的核碱基。更多核碱基包括美国专利3,687,808中公开的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz，J.L，ed.John Wiley&Sons，1990中公开的那些；和Englisch et al.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613中公开的那些。这些核碱基中的某些特别可用于提高本发明寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示出将核酸双链体的稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi et al.，AntisenseResearch and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)而且是优选的碱基取代，甚至在与2′-O-甲氧基乙基糖修饰结合时更加优选。教导经修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3,687,808，以及美国专利4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,681,941；和5,750,692，在此收入每一项作为参考。
与寡核苷酸化学连接的反义寡核苷酸的另一种修饰是提高寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一种或多种模块或共轭物(conjugate)。本发明的化合物可包含与功能基团诸如伯羟基或仲羟基共价连接的共轭基团(conjugate group)。本发明的共轭基团包括嵌入剂、报道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚体药效学性质的基团、和提高寡聚体药动学性质的基团。典型的共轭基团包括胆固醇、脂质、阳离子脂质、磷脂、阳离子磷脂、生物素、吩嗪、叶酸(folate)、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、和染料。在本发明的内容中，提高药效学性质的基团包括提高寡聚体摄取、提高寡聚体对降解的抗性、和/或增强与RNA的序列特异性杂交的基团。在本发明的内容中，提高药动学性质的基团包括提高寡聚体摄取、分布、代谢或排泄的基团。共轭物模块包括但不限于脂质模块，诸如胆固醇模块(Letsinger et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556)，胆酸(Manoharan et al.，1994，Bioorg.Med.Chem.Let.4：1053-1060)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(tritylthiol)(Manoharan et al.，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：306-309；Manoharan et al.，1993，Bioorg.Med.Chem.Let.3：2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser et al.，1992，Nucl.Acids Res.20：533-538)，脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，1991，EMBO J.10：1111-1118；Kabanov et al.，1990，FEBS Lett.259：327-330；Svinarchuk et al.，1993，Biochimie 75：49-54)，磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan et al.，1995，Tetrahedron Lett.36：3651-3654；Shea et al.，1990，Nucl.Acids Res.18：3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，1995，Nucleosides&Nucleotides 14：969-973)，或醋酸金刚烷(Manoharan et al.，1995，TetrahedronLett.36：3651-3654)，棕榈基模块(Mishra et al.，1995，Biochim.Biophys.Acta1264：229-237)，或十八烷胺或己氨基-羰基-羟胆固醇模块。本发明的寡核苷酸还可与活性药物物质偶联，例如阿司匹林(aspirin)、华法林(warfarin)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬(pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹磺酰肌氨酸(dansylsarcosine)、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸(flufenamic aci d)、亚叶酸(folinic acid)、苯并噻二嗪(benzothiadiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、二氮草杂
Figure A20058003786001431
(diazepine)、吲哚美辛(indomethacin)、巴比妥酸盐(barbiturate)、头孢菌素(cephalosporin)、磺胺药(sulfa drug)、抗糖尿病药(antidiabetic)、抗菌药(antibacterial)或抗生素。寡核苷酸-药物偶联物及其制备参见美国系列申请09/334,130(1999年6月15日提交)和美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；和5,688,941，在此收入每一项作为参考。
不必对给定化合物中的所有位置作均一的修饰，事实上可以在单一化合物中甚至在寡核苷酸内的单一核苷处掺入超过一种上述修饰。本发明还包括作为嵌合化合物的反义化合物。在本发明的内容中，“嵌合的”反义化合物或“嵌合物”指包含两个或多个在化学上不同的区的反义化合物，特别是寡核苷酸，每个区由至少一个单体单元构成，在寡核苷酸化合物的情况中即为核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个区，其中寡核苷酸经过修饰而赋予该寡核苷酸以提高的对核酸酶降解的抗性、提高的细胞摄取、和/或提高的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的额外区可充当能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合物的酶的底物。举例而言，RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的活化导致对RNA靶物的切割，由此大大提高寡核苷酸抑制基因表达的效率。因此，在使用嵌合寡核苷酸时，与杂交于相同靶区的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，用较短的寡核苷酸通常获得可比的结果。本发明的嵌合反义化合物可形成为如上所述的两种或多种寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。优选的嵌合反义寡核苷酸在3′-末端掺入至少一个2′修饰的糖(优选2′-O-(CH2)2-O-CH3)以赋予核酸酶抗性，及具有至少4个相连2′-H糖的区域以赋予RNA酶H活性。此类化合物在本领域也称为杂合物(hybrid)或接合物(gapmer)。优选的接合物(gapmer)在由具有至少4个相连2′-H糖的至少一个区分隔的3′-末端和5′末端具有2′修饰的糖(优选2′-O-(CH2)2-O-CH3)的区，且优选掺入硫代磷酸酯骨架键。教导此类杂合物结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，在此完整收入每一项作为参考。
依照本发明使用的反义化合物可方便且常规的通过众所周知的固相合成技术来制备。有多家销售商销售用于此类合成的设备，包括例如AppliedBiosystems(Foster City，Calif.)。另外/或者，可采用本领域已知的用于此类合成的任何其它手段。众所周知使用类似技术来制备寡核苷酸，诸如硫代磷酸酯和烃基化衍生物。本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物的混合物混合、胶囊化、偶联或以其它方式关联成例如脂质体，受体靶向分子，口服的、直肠的、局部的或其它剂型以帮助摄取、分布和/或吸收。教导此类摄取、分布和/或吸收辅助剂型的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，在此收入每一项作为参考。
有义或反义寡核苷酸的其它例子包括那些与有机模块，诸如WO90/10048中描述的那些，及提高寡核苷酸对靶核酸序列的亲和力的其它模块，诸如聚-(L-赖氨酸)共价连接的寡核苷酸。而且，嵌入剂，诸如玫瑰树碱(ellipticine)和烷化剂或金属络合物可附着于有义或反义寡核苷酸以调整反义或有义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
可通过任何基因转移方法将反义或有义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞，包括例如CaPO4介导的DNA转染、电穿孔、或通过使用基因转移载体诸如埃巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)。在一种优选的流程中，将反义或有义寡核苷酸插入合适的逆转录病毒载体。使包含靶核酸序列的细胞在体内或回体接触重组逆转录病毒载体。合适的逆转录病毒载体包括但不限于那些衍生自鼠逆转录病毒M-MuLV的那些，N2(衍生自M-MuLV的逆转录病毒)，或命名为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(见WO 90/13641)。
还可通过与配体结合分子形成偶联物将有义或反义寡核苷酸导入包含靶核苷酸序列的细胞，如WO 91/04753中所述。合适的配体结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子、或结合细胞表面受体的其它配体。优选的是，与配体结合分子的偶联基本不干扰所述配体结合分子结合其相应分子或受体的能力或者阻断有义或反义寡核苷酸或其偶联物型式进入细胞。
或者，可通过形成寡核苷酸-脂质复合物将有义或反义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞，如WO 90/10448中所述。有义或反义寡核苷酸-脂质复合物优选在细胞内由内源脂肪酶解离。
反义或有义RNA或DNA分子的长度通常是至少约5个核苷酸，或者长度为至少约6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670，680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860，870，880，890，900，910，920，930，940，950，960，970，980，990，或1000个核苷酸，其中在此内容中术语“约”指所述核苷酸序列长度加或减该长度的10％。
或者，可生成双链RNA。长度低于30个核苷酸的双链RNA在导入细胞时会抑制特定基因的表达。此机制称为RNA介导的干扰(RNAi)，用作试剂的小(少于30个核苷酸)RNA称作siRNA。TAT干扰RNA可使用已知方法来鉴定和合成(Shi Y.，Trends in Genetics 19(1)：9-12(2003)；WO2003/056012；和WO 2003/064621)。在靶基因的表达降低会减轻状况或紊乱的情况中，siRNA可用于降低基因表达量。
还可将探针用于PCR技术以产生用于鉴定密切相关的TAT编码序列的序列池。
编码TAT的核苷酸序列还可用于构建杂交探针，用于给编码该TAT的基因作图和用于给患遗传性紊乱的个体作遗传分析。可使用已知技术将本文提供的核苷酸序列定位于染色体和染色体特定区域，诸如原位杂交、针对已知染色体标志的连锁分析、和筛选文库的杂交。
当TAT的编码序列编码结合另一种蛋白质的蛋白质时(例如当TAT是受体时)，可以在测定法中使用TAT以鉴定参与结合相互作用的其它蛋白质或分子。通过此类方法，可鉴定受体/配体结合相互作用的抑制物。参与此类结合相互作用的蛋白质还可用于筛选结合相互作用的肽或小分子抑制物或激动剂。同样，受体TAT还可用于分离相关配体。可设计筛选测定法以发现模拟天然TAT或TAT受体的生物学活性的领先化合物。此类筛选测定法将包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。所设想的小分子包括合成的有机或无机化合物。可以多种形式进行测定法，包括本领域已经很好表征的蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。
编码TAT的核酸或其修饰形式还可用于生成转基因动物或“敲除”动物，它们继而可用于开发和筛选治疗上有用的试剂。转基因动物(例如小鼠或大鼠)指具有包含转基因的细胞的动物，其中将转基因导入动物或产前的动物祖先(ancestor)，例如胚胎阶段。转基因指整合到发育成转基因动物的细胞的基因组中的DNA。在一个实施方案中，可依照已建立的技术用编码TAT的cDNA克隆编码TAT的基因组DNA，并将该基因组序列用于生成转基因动物，所述转基因动物包含表达编码TAT的DNA的细胞。用于生成转基因动物，特别是诸如小鼠或大鼠等动物的方法在本领域已经是常规的，参见例如美国专利4,736,866和4,870,009。通常，用组织特异性增强子使TAT转基因的掺入靶向特定细胞。包含一个拷贝在胚胎阶段导入动物种系的编码TAT的转基因的转基因动物可用于检验编码TAT的DNA表达提高的效果。此类动物可作为测试动物用于测试认为针对例如与其过表达有关的病理状况赋予保护的试剂。依照本发明的的这个方面，用试剂治疗动物，与携带转基因的未处理动物相比病理状况的发病率下降将表明对该病理状况的潜在治疗性干预。
或者，TAT的非人同源物可用于构建TAT“敲除”动物，它由于编码TAT的内源基因和导入该动物胚胎干细胞的改变的编码TAT的基因组DNA之间同源重组而具有缺陷的或改变的编码TAT的基因。例如，编码TAT的cDNA可依照已建立的技术用于克隆编码TAT的基因组DNA。可以将编码TAT的基因组DNA的一部分删除或用另一基因替代，诸如可用于监测整合的、编码选择标志的基因。通常，载体中包含数千碱基未改变的侧翼DNA(5′和3′末端都有)(关于同源重组载体的描述参见例如Thomas and Capecchi，1987，Cell 51：503)。将载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并选择其中所导入DNA与内源DNA发生同源重组的细胞(参见例如Li et al.，1992，Cell 69：915)。然后将所选细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如Bradley，in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：APractical Approach，E.J.Robertson，ed.IRL，Oxford，1987，pp.113-152)。然后可将嵌合胚植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎足月产生“敲除”动物。在其生殖细胞中包含同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中动物的所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除动物可以在例如由于缺乏TAT多肽而具有抵御某些病理状况的能力和形成病理状况方面表征。
编码TAT多肽的核酸还可用于基因疗法。在基因疗法应用中，将基因导入细胞以实现治疗上有效的遗传产物的体内合成，例如用于替代缺陷基因。“基因疗法”包括常规基因疗法和施用基因治疗剂两种，前者通过一次处理获得持续的效果，后者涉及一次或反复施用治疗上有效的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于在体内阻断某些基因的表达。已经显示可以将短反义寡核苷酸输入它们在其中起抑制剂作用的细胞，尽管由于细胞膜对它们的摄取有限，因而它们的胞内浓度低(Zamecnik et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4143-4146)。可以修饰寡核苷酸以提高它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。
有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移到体外的培养细胞中，还是体内的预期宿主的细胞中而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。目前优选的体内基因转移技术包括使用病毒(通常是逆转录病毒)载体的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau et al.，1993，Trends in Biotechnology 11：205-210)。在有些情况中，期望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸来源，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，结合与胞吞有关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位并增强胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞的技术参见例如Wu et al.，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432；和Wagner et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414。关于基因标记和基因疗法方案的综述见Anderson et al.，1992，Science 256：808-813。
本文所述编码TAT多肽的核酸分子或其片段可用于染色体鉴定。在这点上，鉴定新染色体标志的需求在增加，因为根据实际的序列数据，现在只有相对较少的染色体标记试剂可用。本发明的每种TAT核酸分子都可用作染色体标志。
本发明的TAT多肽和核酸分子还可在诊断上用于组织分型，其中本发明的TAT多肽可能在一种组织中与另一种组织相比，优选在患病组织中与相同组织类型的正常组织相比差异表达。TAT核酸分子可用于生成探针，用于PCR、Northern分析、Southern分析、和Western分析。
本发明涵盖筛选化合物以鉴定那些模拟TAT多肽(激动剂)或阻止TAT多肽产生效果((拮抗剂)的化合物的方法。用于拮抗剂药物候选物的筛选测定法设计成鉴定与本文鉴定的基因所编码的TAT多肽结合或复合，或者以其它方式干扰所编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物，包括例如抑制细胞表达TAT多肽。此类筛选测定法包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使得它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。
可以多种形式进行测定法，包括本领域已经很好表征的蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。
用于拮抗剂的所有测定法的共同之处在于它们需要使药物候选物接触本文鉴定的核酸所编码的TAT多肽，其条件和时间足以使这两种组分相互作用。
在结合测定法中，相互作用指结合，所形成的复合物可在反应混合物中分离或检测。在一个具体的实施方案中，将本文鉴定的基因所编码的TAT多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定在固相上，例如微量滴定板。非共价附着通常通过用TAT多肽溶液包被固相表面并干燥来实现。或者，对待固定的TAT多肽特异的固定化抗体例如单克隆抗体可用于将它锚定到固相表面上。测定法如下进行，将可以用可检测标记物标记的非固定化组分加到固定化组分例如包含锚定组分的包被表面上。在反应完成时，例如通过清洗除去未反应的组分，并检测锚定到固相表面上的复合物。若最初的非固定化组分携带可检测标记物，检测出固定到表面上的标记物表明发生了复合作用。若最初的非固定化组分不携带标记物，可例如通过使用特异性结合已固定复合物的标记抗体来检测复合作用。
如果候选化合物与本文鉴定的基因所编码的特定TAT多肽相互作用但不结合，那么它与该多肽的相互作用可通过用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的公知方法来测定。此类测定法包括传统方法，诸如例如交联、免疫共沉淀、和通过梯度或层析柱的共纯化。另外，可以如Chevray and Nathans，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5789-5793所公开的，使用Fields及其同事(Fields and Song，1989，Nature(London)340：245-246；Chien et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582)描述的基于酵母的遗传系统来监测蛋白质-蛋白质相互作用。许多转录激活物，诸如酵母GAL4，由两个空间上离散的模块结构域组成，一个起DNA结合结构域的作用，另一个起转录激活结构域的功能。上述出版物中描述的酵母表达系统(通称为“双杂交系统”)利用了此特性，采用两种杂合蛋白质，在一个中将靶蛋白质与GAL4的DNA结合结构域融合，而在另一个中将候选激活蛋白质与激活结构域融合。GAL1-lacZ报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于GAL4活性经由蛋白质-蛋白质相互作用的重建。用β-半乳糖苷酶的显色底物检测包含相互作用多肽的菌落。使用双杂交技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)可从Clontech购买。此系统还可延伸到对参与特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域的作图以及指出对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
干扰本文鉴定的基因所编码的TAT多肽与其它胞内或胞外组分相互作用的化合物可如下测试：通常在足以使两种产物相互作用和结合的条件和时间下制备包含基因产物及胞内或胞外组分的反应混合物。为了测试候选化合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化合物时进行反应。另外，可以向第三份反应混合物中加入安慰剂，作为阳性对照。如上所述监测混合物中存在的TAT多肽和胞内或胞外组分之间的结合(复合物形成)。对照反应物中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成复合物表明，测试化合物干扰TAT多肽与其反应配偶体的相互作用。
为了测定拮抗剂，可将TAT多肽与要筛选特定活性的化合物一起加到细胞中，在存在TAT多肽时该化合物抑制目的活性的能力表明，该化合物是TAT多肽的拮抗剂。或者，可如下检测拮抗剂，将TAT多肽和潜在的拮抗剂与膜结合的TAT多肽受体或重组受体在适于竞争性抑制测定法的条件下组合。TAT多肽可进行标记，诸如通过放射性，使得与受体结合的TAT多肽分子的数目可用于测定潜在拮抗剂的效力。编码受体的基因可通过本领域技术人员知道的多种方法来鉴定，例如配体淘选和FACS分选。Coligan et al.，1991，Current Protocols in Immun.1(2)：Chapter 5。优选的是，采用表达克隆，其中从对TAT多肽有响应的细胞制备多腺苷酸化RNA，将从此RNA构建的cDNA文库分成几个集合，并用于转染COS细胞或对TAT多肽没有响应的其它细胞。使在载玻片上培养的转染细胞暴露于经过标记的TAT多肽。可通过多种手段来标记TAT多肽，包括碘化或包含位点特异性蛋白质激酶的识别位点。固定和温育后，将载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性集合，制备子集，并用相互作用的子集进行再次转染和再次筛选过程，最后产生编码推定受体的单个克隆。
作为受体鉴定的备选方法，可使经标记的TAT多肽与表达受体分子的细胞膜或提取制备物光亲和性相连。通过PAGE解析交联物质并对X-射线胶片曝光。可切下包含受体的标记复合物，解离成肽片段，并进行蛋白质微量测序。从微量测序获得的氨基酸序列可用于设计一组简并寡核苷酸探针，用于筛选cDNA文库以鉴定编码推定受体的基因。
在用于拮抗剂的另一种测定法中，在存在候选化合物时将表达受体的哺乳动物细胞或膜制备物与经过标记的TAT多肽一起温育。然后测量所述化合物增强或阻断此相互作用的能力。
潜在拮抗剂的更具体的例子包括结合免疫球蛋白与TAT多肽的融合物的多肽，特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段，单链抗体，抗独特型抗体，和嵌合的或人源化型式的此类抗体或片段，以及人抗体和抗体片段。或者，潜在的拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如识别受体但不起作用，由此竞争性抑制TAT多肽的作用的突变形式的TAT多肽。
另一种潜在的TAT多肽拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建物，其中例如反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交并防止蛋白质翻译来起直接阻断mRNA翻译的作用。反义技术可用于通过三股螺旋形成或反义DNA或RNA来控制基因表达，二者都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，将编码本文成熟TAT多肽的多核苷酸序列的5′编码部分用于设计长度为约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。将DNA寡核苷酸设计成与基因中参与转录的区互补(三股螺旋-参见Lee et al.，1979，Nucl.Acids Res.6：3073；Cooney et al.，1988，Science 241：456；Dervan et al.，1991，Science 251：1360)，由此防止转录和产生TAT多肽。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并阻断mRNA分子翻译成为TAT多肽(反义-Okano，1991，Neurochem.56：560；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press：Boca Raton，FL，1988)。上述寡核苷酸还可投递至细胞，使得反义RNA或DNA可在体内表达以抑制TAT多肽的生成。在使用反义DNA时，优选衍生自靶基因核苷酸序列的翻译起始位点(例如约-10到+10位置之间)的寡脱氧核糖核苷酸。
潜在的拮抗剂包括结合TAT多肽的活性位点、受体结合位点、或生长因子或其它相关结合位点，由此阻断TAT多肽的正常生物学活性的小分子。小分子的例子包括但不限于小肽或肽样分子，优选可溶性肽，和合成的非肽基有机或无机化合物。
核酶是能够催化对RNA的特异性切割的酶性RNA分子。核酶通过与互补靶RNA发生序列特异性杂交，随后进行内切核酸水解(endonucleolytic)切割来起作用。可通过已知技术来鉴定潜在RNA靶物内的特定核酶切割位点。更多细节参见例如Rossi，1994，Current Biology 4：469-471和PCT公开号WO97/33551(1997年9月18日公开)。
用于抑制转录的三股螺旋结构中的核酸分子应当是单链的且由脱氧核苷酸组成。设计这些寡核苷酸的碱基组成，使得它通过Hoogsteen碱基配对原则促进三股螺旋形成，这通常需要在双链体的一条链上有大段嘌呤或嘧啶。更多细节参见例如PCT公开号WO 97/33551，见上文。
这些小分子可通过上文讨论的一种或多种筛选测定法和/或通过本领域技术人员公知的任何其它筛选技术来鉴定。
分离的编码TAT多肽的核酸在本文中可用于使用本领域公知的技术且且如本文所述来重组生成TAT多肽。继而，所生成的TAT多肽可用于使用本领域公知的技术且如本文所述来生成抗TAT抗体。
本文鉴定的特异性结合TAT多肽的抗体以及通过上文公开的筛选测定法鉴定的其它分子可以以药用组合物的形式施用，用于治疗多种紊乱，包括癌症。
如果TAT多肽在胞内，而且使用完整抗体作为抑制剂，那么优选使抗体内在化。然而，还可以用脂转染或脂质体将抗体或抗体片段投递到细胞中。在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小抑制性片段。例如，根据抗体的可变区序列，可以设计保留与靶蛋白质序列结合能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术生成。参见例如Marasco et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7889-7893。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。或者/另外，组合物可包含增强其功能的药剂，诸如例如细胞毒剂、细胞因子、化疗剂、或生长抑制剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
提供下列实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。
在此完整收入本说明书中引用的所有专利和文献作为参考。
实施例
实施例1：使用
Figure A20058003786001531
绘制组织表达图谱
分析包含基因表达信息的私有数据库(
Figure A20058003786001532
Gene Logic Inc.，Gaithersburg，MD)，试图鉴定其表达在特定目的肿瘤组织中较之其它肿瘤和/或正常组织显著上调的多肽(及其编码核酸)。具体而言，使用可通过GeneLogic公司(Gaithersburg，MD)获得的、与
Figure A20058003786001533
数据库一起使用的软件或Genentech公司编写和开发的、与数据库一起使用的私有软件进行
Figure A20058003786001535
数据库的分析。分析中阳性命中的评估基于若干标准，包括例如组织特异性、肿瘤特异性、及正常的必要组织和/或正常的增殖组织中的表达水平。下表列出了根据
Figure A20058003786001536
数据库分析确定的组织表达图谱，证实在特定的一种或多种肿瘤中较之其它肿瘤和/或正常组织有高组织表达和显著表达上调且任选在正常的必要组织和/或正常增殖组织中有相对低表达的分子。因此，下文所列分子是用于诊断和治疗哺乳动物中的癌症的卓越多肽靶。
分子                表达上调于      相比较于：
DNA77507(TAT161)    乳房肿瘤        正常乳房组织
DNA77507(TAT161)    结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA77507(TAT161)    肺肿瘤          正常肺组织
DNA77507(TAT161)    肾肿瘤          正常肾组织
DNA77507(TAT161)    肝肿瘤          正常肝组织
DNA77507(TAT161)    卵巢肿瘤        正常卵巢组织
DNA77507(TAT161)    胰腺肿瘤        正常胰腺组织
DNA77507(TAT161)    直肠肿瘤        正常直肠组织
DNA77507(TAT161)    皮肤肿瘤        正常皮肤组织
DNA77507(TAT161)    子宫肿瘤        正常子宫组织
DNA77507(TAT161)    脑肿瘤          正常脑组织
DNA77507(TAT161)    软组织肿瘤      正常软组织
DNA77507(TAT161)    骨肿瘤          正常骨组织
DNA80894(TAT101)    乳房肿瘤        正常乳房组织
DNA82343(TAT157)    结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA82343(TAT157)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA82343(TAT157)    胃肿瘤              正常胃组织
DNA82343(TAT157)    肝肿瘤              正常肝组织
DNA82343(TAT157)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA82343(TAT157)    小肠肿瘤            正常小肠组织
DNA82343(TAT157)    食道肿瘤            正常食道组织
DNA82343(TAT157)    睾丸肿瘤            正常睾丸组织
DNA82343(TAT157)    胸腺肿瘤            正常胸腺组织
DNA87994(TAT160)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA87994(TAT160)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA87994(TAT160)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA87994(TAT160)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA87994(TAT160)    食道肿瘤            正常食道组织
DNA87994(TAT160)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA87994(TAT160)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA87994(TAT160)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA88131(TAT158)    骨肿瘤              正常骨组织
DNA88131(TAT158)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA88131(TAT158)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA88131(TAT158)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA88131(TAT158)    食道肿瘤            正常食道组织
DNA88131(TAT158)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA88131(TAT158)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA88131(TAT158)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA88131(TAT158)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA88131(TAT158)    皮肤肿瘤            正常皮肤组织
DNA88131(TAT158)    软组织肿瘤          正常软组织
DNA88131(TAT158)    胃肿瘤              正常胃组织
分子                表达上调于：        相比较于：
DNA88131(TAT158)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA88131(TAT158)    神经内分泌肿瘤      正常神经内分泌组织
DNA88131(TAT158)    脑肿瘤              正常脑组织
DNA95930(TAT110)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA95930(TAT110)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA95930(TAT110)    子宫内膜肿瘤        正常子宫内膜组织
DNA95930(TAT110)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA95930(TAT110)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA95930(TAT110)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA95930(TAT110)     肺肿瘤          正常肺组织
DNA95930(TAT110)     前列腺肿瘤      正常前列腺组织
DNA95930-1(TAT210)   结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA95930-1(TAT210)   子宫肿瘤        正常子宫组织
DNA95930-1(TAT210)   子宫内膜肿瘤    正常子宫内膜组织
DNA95930-1(TAT210)   直肠肿瘤        正常直肠组织
DNA95930-1(TAT210)   卵巢肿瘤        正常卵巢组织
DNA95930-1(TAT210)   乳房肿瘤        正常乳房组织
DNA95930-1(TAT210)   肺肿瘤          正常肺组织
DNA95930-1(TAT210)   前列腺肿瘤      正常前列腺组织
DNA96917(TAT159)     胰腺肿瘤        正常胰腺组织
DNA96917(TAT159)     肺肿瘤          正常肺组织
DNA96917(TAT159)     肝肿瘤          正常肝组织
DNA96930(TAT112)     乳房肿瘤        正常乳房组织
DNA96930(TAT112)     结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA96930(TAT112)     直肠肿瘤        正常直肠组织
DNA96930(TAT112)     子宫肿瘤        正常子宫组织
DNA96930(TAT112)     肺肿瘤          正常肺组织
DNA96930(TAT112)     卵巢肿瘤        正常卵巢组织
DNA96930(TAT112)     胰腺肿瘤        正常胰腺组织
DNA96930(TAT112)     胃肿瘤          正常胃组织
DNA96936(TAT147)     乳房肿瘤        正常乳房组织
DNA96936(TAT147)     结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA96936(TAT147)     睾丸肿瘤        正常睾丸组织
DNA96936(TAT147)     卵巢肿瘤        正常卵巢组织
DNA98565(TAT145)     脑肿瘤          正常脑组织
DNA98565(TAT145)     神经胶质瘤      正常神经胶质组织
DNA246435(TAT152)    脑肿瘤          正常脑组织
DNA246435(TAT152)    神经胶质瘤      正常神经胶质组织
DNA98591(TAT162)     结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA98591(TAT162)     直肠肿瘤        正常直肠组织
DNA98591(TAT162)     卵巢肿瘤        正常卵巢组织
DNA98591(TAT162)     胰腺肿瘤        正常胰腺组织
DNA98591(TAT162)     胃肿瘤          正常胃组织
DNA108809(TAT114)    结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA108809(TAT114)    肾肿瘤          正常肾组织
DNA119488(TAT119)    结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA119488(TAT119)    肺肿瘤          正常肺组织
DNA119488(TAT119)    直肠肿瘤        正常直肠组织
DNA143493(TAT103)    乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA167234(TAT130)    前列腺肿瘤            正常前列腺组织
DNA235621(TAT166)    前列腺肿瘤            正常前列腺组织
DNA235621(TAT166)    肝肿瘤                正常肝组织
DNA176766(TAT132)    肾肿瘤                正常肾组织
DNA176766(TAT132)    卵巢肿瘤              正常卵巢组织
DNA176766(TAT132)    子宫肿瘤              正常子宫组织
分子                 表达上调于：          相比较于：
DNA236463(TAT150)    肾肿瘤                正常肾组织
DNA236463(TAT150)    卵巢肿瘤              正常卵巢组织
DNA236463(TAT150)    子宫肿瘤              正常子宫组织
DNA181162(TAT129)    前列腺肿瘤            正常前列腺组织
DNA188221(TAT111)    结肠肿瘤              正常结肠组织
DNA188221(TAT111)    子宫内膜肿瘤          正常子宫内膜组织
DNA188221(TAT111)    胃肿瘤                正常胃组织
DNA233876(TAT146)    结肠肿瘤              正常结肠组织
DNA233876(TAT146)    子宫内膜肿瘤          正常子宫内膜组织
DNA233876(TAT146)    胃肿瘤                正常胃组织
DNA193891(TAT148)    结肠肿瘤              正常结肠组织
DNA248170(TAT187)    结肠肿瘤              正常结肠组织
DNA248170(TAT187)    乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA194628(TAT118)    肾肿瘤                正常肾组织
DNA246415(TAT167)    肾肿瘤                正常肾组织
DNA215609(TAT113)    结肠肿瘤              正常结肠组织
DNA215609(TAT113)    直肠肿瘤              正常直肠组织
DNA220432(TAT128)    前列腺肿瘤            正常前列腺组织
DNA226094(TAT164)    乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA226094(TAT164)    脑肿瘤                正常脑组织
DNA226094(TAT164)    肺肿瘤                正常肺组织
DNA226094(TAT164)    皮肤肿瘤              正常皮肤组织
DNA226165(TAT122)    乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA226165(TAT122)    子宫内膜肿瘤          正常子宫内膜组织
DNA226165(TAT122)    肾肿瘤                正常肾组织
DNA226165(TAT122)    肺肿瘤                正常肺组织
DNA226165(TAT122)    卵巢肿瘤              正常卵巢组织
DNA226165(TAT122)    结肠肿瘤              正常结肠组织
DNA226165(TAT122)    直肠肿瘤              正常直肠组织
DNA226165(TAT122)    皮肤肿瘤              正常皮肤组织
DNA226165(TAT122)    软组织肿瘤          正常软组织
DNA226165(TAT122)    膀胱肿瘤            正常膀胱组织
DNA226237(TAT117)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA246450(TAT168)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA226456(TAT144)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA226456(TAT144)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA226456(TAT144)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA226456(TAT144)    子宫内膜肿瘤        正常子宫内膜组织
DNA226456(TAT144)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA226456(TAT144)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA226456(TAT144)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA226456(TAT144)    皮肤肿瘤            正常皮肤组织
DNA237637(TAT188)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA237637(TAT188)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA237637(TAT188)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA237637(TAT188)    子宫内膜肿瘤        正常子宫内膜组织
DNA237637(TAT188)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA237637(TAT188)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA237637(TAT188)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA237637(TAT188)    皮肤肿瘤            正常皮肤组织
DNA237637(TAT188)    肝肿瘤              正常肝组织
DNA237637(TAT188)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA226539(TAT126)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA226539(TAT126)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA226539(TAT126)    直肠肿瘤            正常直肠组织
分子                 表达上调于：        相比较于：
DNA226539(TAT126)    子宫内膜肿瘤        正常子宫内膜组织
DNA226539(TAT126)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA226539(TAT126)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA226539(TAT126)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA236511(TAT151)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA236511(TAT151)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA236511(TAT151)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA236511(TAT151)    子宫内膜肿瘤        正常子宫内膜组织
DNA236511(TAT151)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA236511(TAT151)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA236511(TAT151)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA226771(TAT115)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA226771(TAT115)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA227087(TAT163)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA227087(TAT163)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA227087(TAT163)    直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA227087(TAT163)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA227087(TAT163)    卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA227087(TAT163)    前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA227087(TAT163)    内分泌肿瘤              正常内分泌组织
DNA227087(TAT163)    肾肿瘤                  正常肾组织
DNA227087(TAT163)    肝肿瘤                  正常肝组织
DNA227087(TAT163)    神经系统肿瘤            正常神经系统组织
DNA227087(TAT163)    胰腺肿瘤                正常胰腺组织
DNA227087(TAT163)    子宫肿瘤                正常子宫组织
DNA227087(TAT163)    小肠肿瘤                正常小肠组织
DNA227087(TAT163)    淋巴样肿瘤              正常淋巴样组织
DNA266307(TAT227)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA266307(TAT227)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA266307(TAT227)    直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA266307(TAT227)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA266307(TAT227)    卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA266307(TAT227)    前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA266307(TAT227)    内分泌肿瘤              正常内分泌组织
DNA266307(TAT227)    肾肿瘤                  正常肾组织
DNA266307(TAT227)    肝肿瘤                  正常肝组织
DNA266307(TAT227)    神经系统肿瘤            正常神经系统组织
DNA266307(TAT227)    胰腺肿瘤                正常胰腺组织
DNA266307(TAT227)    子宫肿瘤                正常子宫组织
DNA266307(TAT227)    小肠肿瘤                正常小肠组织
DNA266307(TAT227)    淋巴样肿瘤              正常淋巴样组织
DNA266311(TAT228)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA266311(TAT228)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA266311(TAT228)    直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA266311(TAT228)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA266311(TAT228)    卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA266311(TAT228)    前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA266311(TAT228)    内分泌肿瘤              正常内分泌组织
DNA266311(TAT228)    肾肿瘤                  正常肾组织
DNA266311(TAT228)    肝肿瘤                  正常肝组织
DNA266311(TAT228)    神经系统肿瘤            正常神经系统组织
DNA266311(TAT228)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA266311(TAT228)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA266311(TAT228)    小肠肿瘤            正常小肠组织
DNA266311(TAT228)    淋巴样肿瘤          正常淋巴样组织
分子                 表达上调于：        相比较于：
DNA266312(TAT229)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA266312(TAT229)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA266312(TAT229)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA266312(TAT229)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA266312(TAT229)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA266312(TAT229)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA266312(TAT229)    内分泌肿瘤          正常内分泌组织
DNA266312(TAT229)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA266312(TAT229)    肝肿瘤              正常肝组织
DNA266312(TAT229)    神经系统肿瘤        正常神经系统组织
DNA266312(TAT229)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA266312(TAT229)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA266312(TAT229)    小肠肿瘤            正常小肠组织
DNA266312(TAT229)    淋巴样肿瘤          正常淋巴样组织
DNA266313(TAT230)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA2663)3(TAT230)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA266313(TAT230)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA266313(TAT230)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA266313(TAT230)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA266313(TAT230)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA266313(TAT230)    内分泌肿瘤          正常内分泌组织
DNA266313(TAT230)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA266313(TAT230)    肝肿瘤              正常肝组织
DNA266313(TAT230)    神经系统肿瘤        正常神经系统组织
DNA266313(TAT230)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA266313(TAT230)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA266313(TAT230)    小肠肿瘤            正常小肠组织
DNA266313(TAT230)    淋巴样肿瘤          正常淋巴样组织
DNA227224(TAT121)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA227224(TAT121)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA227224(TAT121)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA227224(TAT121)    子宫内膜肿瘤        正常子宫内膜组织
DNA227224(TAT121)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA227224(TAT121)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA227224(TAT121)    卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA227224(TAT121)    皮肤肿瘤                正常皮肤组织
DNA227224(TAT121)    睾丸肿瘤                正常睾丸组织
DNA227224(TAT121)    膀胱肿瘤                正常膀胱组织
DNA247486(TAT183)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA247486(TAT183)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA247486(TAT183)    直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA247486(TAT183)    子宫内膜肿瘤            正常子宫内膜组织
DNA247486(TAT183)    肾肿瘤                  正常肾组织
DNA247486(TAT183)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA247486(TAT183)    卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA247486(TAT183)    皮肤肿瘤                正常皮肤组织
DNA247486(TAT183)    睾丸肿瘤                正常睾丸组织
DNA247486(TAT183)    膀胱肿瘤                正常膀胱组织
DNA227800(TAT131)    前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA228199(TAT127)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA228199(TAT127)    子宫内膜肿瘤            正常子宫内膜组织
DNA228199(TAT127)    卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA228199(TAT127)    胰腺肿瘤                正常胰腺组织
DNA228199(TAT127)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA228201(TAT116)    结肠肿瘤                正常结肠组织
分子                 表达上调于：            相比较于：
DNA228201(TAT116)    直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA247488(TAT189)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA247488(TAT189)    直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA236538(TAT190)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA236538(TAT190)    直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA247489(TAT191)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA247489(TAT191)    直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA228211(TAT133)    子宫肿瘤                正常子宫组织
DNA233937(TAT186)    子宫肿瘤                正常子宫组织
DNA233937(TAT186)    卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA228994(TAT124)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA228994(TAT124)    卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA228994(TAT124)    皮肤肿瘤                正常皮肤组织
DNA228994(TAT124)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA229410(TAT105)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA229411(TAT107)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA229413(TAT108)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA229700(TAT139)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA231312(TAT143)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA231312(TAT143)        结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA231542(TAT100)        脑肿瘤                  正常脑组织
DNA231542(TAT100)        神经胶质瘤              正常神经胶质组织
DNA231542-1(TAT284)      脑肿瘤                  正常脑组织
DNA231542-1(TAT284)      神经胶质瘤              正常神经胶质组织
DNA231542-2(TAT285)      脑肿瘤                  正常脑组织
DNA231542-2(TAT285)      神经胶质瘤              正常神经胶质组织
DNA297393(TAT285-1)      脑肿瘤                  正常脑组织
DNA297393(TAT285-1)      神经胶质瘤              正常神经胶质组织
DNA234833(TAT149)        结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA268022(TAT231)        结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA268022(TAT231)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA268022(TAT231)        卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA236246(TAT153)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA236343(TAT104)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA236493(TAT141)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA236493(TAT141)        神经胶质瘤              正常神经胶质组织
DNA236534(TAT102)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA236534(TAT102)        结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA236534(TAT102)        直肠肿瘤                正常直肠组织
DNA236534(TAT102)        子宫颈肿瘤              正常子宫颈组织
DNA236534(TAT102)        子宫内膜肿瘤            正常子宫内膜组织
DNA236534(TAT102)        肺肿瘤                  正常肺组织
DNA236534(TAT102)        卵巢肿瘤                正常卵巢组织
DNA236534(TAT102)        胰腺肿瘤                正常胰腺组织
DNA236534(TAT102)        前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA236534(TAT102)        胃肿瘤                  正常胃组织
DNA236534(TAT102)        膀胱肿瘤                正常膀胱组织
DNA246430(TAT109)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA246430(TAT109)        前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA247480(TAT142)        乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA247480(TAT142)        肺肿瘤                  正常肺组织
DNA264454(TAT106)        乳房肿瘤                正常乳房组织
实施例2：为检测癌性肿瘤中TAT多肽的上调而进行的微阵列分析
常常包含数以千计的基因序列的核酸微阵列可用于鉴定患病组织中较之其正常对应物差异表达的基因。为了使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录并标记以产生cDNA探针。然后将cDNA探针与固定在固相支持物上的核酸阵列杂交。阵列的设置使得阵列各成员的序列和位置是已知的。例如，可将已知在某些疾病状态表达的基因选集排列到固相支持物上。标记探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。若来自测试(疾病组织)样品的探针的杂交信号大于来自对照(正常组织)样品的探针的杂交信号，则在疾病组织中过表达的一种或多种基因得到鉴定。此结果的意义是在患病组织中过表达的蛋白质不仅可用作疾病状况存在的诊断标志物，而且可用作疾病状况治疗的治疗靶。
核酸杂交和微阵列技术的方法学是本领域众所周知的。在一个实施例中，用于杂交的核酸和探针的特定制备物、载玻片和杂交条件都详细描述于2001年3月30日提交的PCT专利申请流水号PCT/US01/10482，在此收入作为参考。
在本实施例中，对衍生自多种人组织的癌性肿瘤研究相对于来自不同组织类型的癌性肿瘤和/或非癌性人组织上调的基因表达，试图鉴定那些在特定癌性肿瘤中过表达的多肽。在某些实验中，获取同一组织类型(常常来自同一患者)的癌性人肿瘤组织和非癌性人肿瘤组织并分析TAT多肽表达。另外，获取来自多种不同人肿瘤中任一种的癌性人肿瘤组织并与通过合并上皮起源(包括肝、肾和肺)的非癌性人组织制备的“普遍的”上皮对照样品进行比较。从合并组织分离的mRNA代表来自这些不同组织的所表达基因产物的混合物。使用合并对照样品的微阵列杂交实验在双色分析中产生线性曲线图。然后用双色分析中产生的线的斜率标准化各次实验中的比率(测试：对照检测)。然后将各次实验的标准化比率进行比较并用于鉴定基因表达的聚簇。因此，合并的“普遍对照”样品不仅容许在简单的两样品比较中进行有效的相对基因表达判定，它还容许进行若干实验之间的多样品比较。
在本实验中，使用来自本文所述TAT多肽编码核酸序列的核酸探针创建微阵列并使用来自多种肿瘤组织的RNA与其杂交。下文显示了这些实验的结果，证明本发明的各种TAT多肽在多种人肿瘤组织中较之其正常对应物组织显著过表达。此外，下文所示所有分子在它们的特定肿瘤组织中较之在“普遍的”上皮对照中显著过表达。如上所述，这些数据证明本发明的TAT多肽不仅可用作一种或多种癌性肿瘤存在的诊断标志物，而且还可用作治疗那些肿瘤的治疗靶。
分子                     表达上调于：      相比较于：
DNA95930(TAT110)         结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA95930(TAT110)         肺肿瘤            正常肺组织
DNA95930(TAT110)         前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA95930(TAT110)         子宫内膜肿瘤      正常子宫内膜组织
DNA95930(TAT110)         卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA95930-1(TAT210)       结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA95930-1(TAT210)       肺肿瘤            正常肺组织
DNA95930-1(TAT210)       前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA95930-1(TAT210)       子宫内膜肿瘤      正常子宫内膜组织
DNA95930-1(TAT210)       卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA96930(TAT112)         结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA96930(TAT112)         乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA96930(TAT112)         肺肿瘤            正常肺组织
DNA96936(TAT147)         乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA96936(TAT147)         结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA96936(TAT147)         卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA96936(TAT147)         前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA108809(TAT114)        结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA119488(TAT119)        结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA119488(TAT119)        肺肿瘤            正常肺组织
DNA143493(TAT103)        乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA181162(TAT129)        前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA188221(TAT111)        结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA188221(TAT111)        肺肿瘤            正常肺组织
DNA188221(TAT111)        卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA233876(TAT146)        结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA233876(TAT146)        肺肿瘤            正常肺组织
DNA233876(TAT146)        卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA210499(TAT123)        卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA210499(TAT123)        肺肿瘤            正常肺组织
DNA219894(TAT211)        卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA219894(TAT211)        肺肿瘤            正常肺组织
DNA215609(TAT113)        结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA220432(TAT128)        前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA226165(TAT122)        乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA226165(TAT122)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA226165(TAT122)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA226165(TAT122)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA226165(TAT122)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA226165(TAT122)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA226456(TAT144)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA226456(TAT144)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA237637(TAT188)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA237637(TAT188)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA226539(TAT126)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA226539(TAT126)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA226539(TAT126)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA226539(TAT126)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA236511(TAT151)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA236511(TAT151)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA236511(TAT151)    肺肿瘤              正常肺组织
分子                 表达上调于：        相比较于：
DNA236511(TAT151)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA226771(TAT115)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA227224(TAT121)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA227224(TAT121)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA227224(TAT121)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA227224(TAT121)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA227224(TAT121)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA227224(TAT121)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA247486(TAT183)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA247486(TAT183)    直肠肿瘤            正常直肠组织
DNA247486(TAT183)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA247486(TAT183)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA247486(TAT183)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA247486(TAT183)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA228199(TAT127)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA228199(TAT127)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA228201(TAT116)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA247488(TAT189)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA236538(TAT190)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA247489(TAT191)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA228994(TAT124)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA228994(TAT124)        乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA228994(TAT124)        卵巢肿瘤              正常卵巢组织
DNA231312(TAT143)        结肠肿瘤              正常结肠组织
DNA231542(TAT100)        脑肿瘤                正常脑组织
DNA231542(TAT100)        神经胶质瘤            正常神经胶质组织
DNA231542-1(TAT284)      脑肿瘤                正常脑组织
DNA231542-1(TAT284)      神经胶质瘤            正常神经胶质组织
DNA231542-2(TAT285)      脑肿瘤                正常脑组织
DNA231542-2(TAT285)      神经胶质瘤            正常神经胶质组织
DNA297393(TAT285-1)      脑肿瘤                正常脑组织
DNA297393(TAT285-1)      神经胶质瘤            正常神经胶质组织
DNA236246(TAT153)        乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA236343(TAT104)        乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA236534(TAT102)        乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA236534(TAT102)        结肠肿瘤              正常结肠组织
DNA246430(TAT109)        前列腺肿瘤            正常前列腺组织
DNA264454(TAT106)        乳房肿瘤              正常乳房组织
DNA98565(TAT145)         神经胶质瘤            正常脑组织
DNA246435(TAT152)        神经胶质瘤            正常脑组织
DNA226094(TAT164)        神经胶质瘤            正常脑组织
实施例3：TAT mRNA表达的定量分析
在此测定法中，使用5′核酸酶测定法(例如
Figure A20058003786001651
)和实时定量PCR(例如ABI Prizm 7700Sequence Detection(Perkin Elmer，AppliedBiosystems Division，Foster City，CA))寻找在一种或多种癌性肿瘤中较之其它癌性肿瘤或正常非癌性组织显著过表达的基因。5′核酸酶测定法反应是基于荧光PCR的技术，它利用Taq DNA聚合酶的5′外切核酸酶活性实时监测基因表达。使用两种寡核苷酸引物(其序列基于目的基因或EST序列)来产生扩增子，通常是PCR反应的。设计第三种寡核苷酸或探针来检测位于两种PCR引物之间的核苷酸序列。所述探针不能由Taq DNA聚合酶延伸，且标记有报道物(reporter)荧光染料和淬灭剂(quencher)荧光染料。当这两种染料如同它们在探针上一样位置靠近在一起时，来自报道物染料的任何激光诱导的发射受到淬灭剂染料的淬灭。在PCR扩增反应过程中，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式切割探针。所得探针片段在溶液中解离，而来自所释放报道物染料的信号不受第二荧光团的淬灭作用。对合成的每个新分子释放一个分子的报道物染料，而未淬灭报道物染料的检测为数据的定量解读提供了基础。
5′核酸酶流程在实时定量PCR装置上进行，诸如ABI Prism 7700TMSequence Detection。该系统由热循环仪、激光、电荷耦合器件(CCD)照相机和计算机组成。该系统在热循环仪上以96孔形式扩增样品。在扩增过程中，通过针对所有96个孔的光导纤维电缆实时收集激光诱导的荧光信号，并在CCD处检测。该系统包括用于运行设备和用于分析数据的软件。
用于筛选的起始材料是从多种不同癌性组织分离的mRNA。对所述mRNA进行精确定量，例如通过荧光。作为阴性对照，从与所测癌性组织具有相同组织类型的多种正常组织分离RNA。
5′核酸酶测定法数据最初表示为Ct或循环阈值。这定义为报道物信号积累高于背景荧光水平的循环数。使用ACt值作为比较癌症mRNA结果和正常人mRNA结果时核酸样品中特定靶序列相对起始拷贝数的定量测量。由于一个Ct单位相当于1轮PCR循环或相对于正常的大约2倍的相对增加，因此两个单位相当于4倍相对增加，3个单位相当于8倍相对增加，依此类推，研究人员可定量检测两种或更多不同组织间mRNA表达的相对倍数增加。利用此技术，下文所列分子鉴定为在一种或多种特定肿瘤中较之其正常非癌性对应物组织(来自相同和不同组织供体)显著过表达，并因此代表了用于诊断和治疗哺乳动物中的癌症的卓越多肽靶。
分子                  表达上调于：    相比较于：
DNA77507(TAT161)      乳房肿瘤        正常乳房组织
DNA82343(TAT157)      结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA88131(TAT158)      乳房肿瘤        正常乳房组织
DNA88131(TAT158)      结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA95930(TAT110)      结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA95930(TAT110)      肺肿瘤          正常肺组织
DNA95930(TAT110)      前列腺肿瘤      正常前列腺组织
DNA95930(TAT110)      子宫内膜肿瘤    正常子宫内膜组织
DNA95930(TAT110)      卵巢肿瘤        正常卵巢组织
DNA95930-1(TAT210)    结肠肿瘤        正常结肠组织
DNA95930-1(TAT210)    肺肿瘤          正常肺组织
DNA95930-1(TAT210)    前列腺肿瘤      正常前列腺组织
DNA95930-1(TAT210)    子宫内膜肿瘤    正常子宫内膜组织
分子                 表达上调于：      相比较于：
DNA95930-1(TAT210)   卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA96930(TAT112)     结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA96936(TAT147)     结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA98591(TAT162)     结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA108809(TAT114)    肾肿瘤            正常肾组织
DNA119488(TAT119)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA188221(TAT111)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA233876(TAT146)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA193891(TAT148)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA248170(TAT187)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA194628(TAT118)    肾肿瘤            正常肾组织
DNA246415(TAT167)    肾肿瘤            正常肾组织
DNA210499(TAT123)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA219894(TAT211)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA215609(TAT113)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA220432(TAT128)    前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA226165(TAT122)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA226237(TAT117)    肾肿瘤            正常肾组织
DNA246450(TAT168)    肾肿瘤            正常肾组织
DNA226456(TAT144)    乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA237637(TAT188)    乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA226539(TAT126)    卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA236511(TAT151)    卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA227224(TAT121)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA247486(TAT183)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA227800(TAT131)    前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA228199(TAT127)    卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA228199(TAT127)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA228201(TAT116)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA247488(TAT189)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA236538(TAT190)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA247489(TAT191)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA228993(TAT120)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA228994(TAT124)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA236343(TAT104)    乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA236534(TAT102)    卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA246430(TAT109)    乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA247480(TAT142)      肺肿瘤        正常肺组织
DNA98565(TAT145)       神经胶质瘤    正常脑组织
DNA246435(TAT152)      神经胶质瘤    正常脑组织
DNA226094(TAT164)      神经胶质瘤    正常脑组织
DNA227578(TAT165)      神经胶质瘤    正常脑组织
DNA231542(TAT100)      神经胶质瘤    正常脑组织
DNA231542-1(TAT284)    神经胶质瘤    正常脑组织
DNA231542-2(TAT285)    神经胶质瘤    正常脑组织
DNA297393(TAT285-1)    神经胶质瘤    正常脑组织
实施例4：原位杂交
原位杂交是用于细胞或组织制备物内核酸序列检测和定位的有力且通用的技术。它可用于例如鉴定基因表达的部位，分析转录的组织分布，鉴定和定位病毒感染，跟踪特定mRNA合成的变化，及帮助染色体作图。
原位杂交遵循Lu and Gillett，Cell Vision 1：169-176(1994)中的优化版本方案进行，使用与待检测靶序列具有同源性的PCR生成的33P标记核糖核酸探针(riboprobe)。简而言之，将甲醛固定、石蜡包埋的人组织切片，脱石蜡，在蛋白酶K(20g/ml)中于37℃除蛋白质15分钟，并如Lu and Gillett，同上所述进一步处理以进行原位杂交。从PCR产物生成[33-P]UTP标记的反义核糖核酸探针，并于55℃杂交过夜。将载玻片浸入Kodak NTB2核迹乳液并曝光4周。
33P-核糖核酸探针合成
将6.0μl(125mCi)33P-UTP(Amersham BF 1002，SA＜2000Ci/mmol)快速真空干燥。向含干燥33P-UTP的每个管中加入以下成分：
2.0μl 5x转录缓冲液
1.0μl DTT(100mM)
2.0μl NTP混合物(2.5mM：10μl每种10mM GTP，CTP&ATP+10μl H2O)
1.0μl UTP(50μM)
1.0μl Rnasin
1.0μl DNA模板(1μg)
1.0μl H2O
1.0μl RNA聚合酶(对于PCR产物，经常是T3＝AS，T7＝S)
将管于37℃温育1小时。加入1.0μl RQ1 DNA酶，然后于37℃温育15分钟。加入90μl TE(10mM Tris pH 7.6/1mM EDTApH 8.0)，将混合液转移到DE81纸上。将剩余溶液加到Microcon-50超滤单元中，用程序10旋转(6分钟)。将过滤单元倒置在第二个管上，并用程序2旋转(3分钟)。在最后的旋转回收后，加入100μl TE。将1μl终产物转移到DE81纸上，并在6ml Biofluor II中计数。
将探针在TBE/尿素凝胶上电泳。将1-3μl探针或5μl RNA Mrk III加到3μl上样缓冲液中。在95℃加热块上加热3分钟后，将探针立即置于冰上。冲洗凝胶孔，加入样品，并在180-250伏特电泳45分钟。将凝胶包裹在saran包装纸中，并在-70℃冷柜中用增光屏对XAR胶片曝光1小时至过夜。
33P-杂交
A.冷冻切片的预处理
从冷柜中取出载玻片，放在铝盘上，并于室温融化5分钟。将盘在55℃温箱中放置5分钟以减少冷凝(condensation)。将载波片在通风橱中在冰上在4％低聚甲醛中固定10分钟，并在0.5x SSC(25ml 20x SSC+975ml SQ H2O)中于室温清洗5分钟。在0.5μg/ml蛋白酶K(12.5μl 10mg/ml储液在250ml预热的无RNA酶的RNA酶缓冲液中稀释)于37℃除蛋白质10分钟后，将切片在0.5x SSC中于室温清洗10分钟。将切片在70％、95％、100％乙醇中脱水，每次2分钟。
B.石蜡包埋切片的预处理
将载玻片脱石蜡，放置在SQ H2O中，并在2x SSC中于室温漂洗两次，每次5分钟。将人胚胎或甲醛组织的切片在20μg/ml蛋白酶K(500μl 10mg/ml在250ml无RNA酶的RNA酶缓冲液中稀释，37℃15分钟)或8x蛋白酶K(100μl在250ml RNA酶缓冲液中稀释，37℃30分钟)中除蛋白质。随后在0.5x SSC中漂洗，并如上所述进行脱水。
C.预杂交
将载玻片放置在衬有Box缓冲液(4x SSC，50％甲酰胺)所饱和的滤纸的塑料盒中。
D.杂交
将每个载玻片的1.0×106cpm探针和1.0μl tRNA(50mg/ml储液)于95℃加热3分钟。将载玻片在冰上冷却，每个载玻片加48μl杂交缓冲液。漩涡振荡后，向载玻片上的50μl预杂交液中加入50μl 33P混合液。将载玻片于55℃温育过夜。
E.清洗
用2x SSC，EDTA(400ml 20x SSC+16ml 0.25M EDTA，Vf＝4L)于室温进行2次10分钟清洗，随后于37℃用RNA酶A(500μl 10mg/ml在250mlRNA酶缓冲液中稀释＝20μg/ml)处理30分钟。将载玻片用2x SSC，EDTA于室温清洗2次10分钟。严格清洗条件如下：55℃，0.1x SSC，EDTA(20ml 20x SSC+16ml EDTA，Vf＝4L)，2小时。
F.寡核苷酸
对本文所公开的多种DNA序列进行原位分析。获取用于这些分析的寡核苷酸使其与附图所示核酸(或其互补序列)互补。
G.结果
对本文所公开的多种DNA序列进行原位分析。这些分析的结果如下。
(1)DNA95930(TAT110)
在一次分析中，在3/3份肺肿瘤、3/3份结肠直肠腺癌、1/1份前列腺癌、3/3份移行细胞癌和3/3份子宫内膜腺癌中观察到显著表达，其中对应正常组织中的表达水平显著较低。
在第二次独立的分析中，在7/7份子宫内膜腺癌和12/15份卵巢腺癌中观察到显著表达，其中对应正常组织中的表达水平显著较低。
在第三次独立的分析中，在24/26份结肠直肠肿瘤样品中观察到显著表达，其中对应正常组织中的表达水平显著较低。
最后，在第四次独立的分析中，在8/26份非恶性前列腺组织样品、55/82份原发性前列腺癌样品和5/23份转移性前列腺癌样品中观察到表达。
(2)DNA95930-1(TAT210)
在一次分析中，在3/3份肺肿瘤、3/3份结肠直肠腺癌、1/1份前列腺癌、3/3份移行细胞癌和3/3份子宫内膜腺癌中观察到显著表达，其中对应正常组织中的表达水平显著较低。
在第二次独立的分析中，在7/7份子宫内膜腺癌和12/15份卵巢腺癌中观察到显著表达，其中对应正常组织中的表达水平显著较低。
在第三次独立的分析中，在24/26份结肠直肠肿瘤样品中观察到显著表达，其中对应正常组织中的表达水平显著较低。
最后，在第四次独立的分析中，在8/26份非恶性前列腺组织样品、55/82份原发性前列腺癌样品和5/23份转移性前列腺癌样品中观察到表达。
(3)DNA96930(TAT112)
在结肠直肠癌中强表达。在恶性上皮中的表达看起来显著强于邻近的良性上皮。另外，在23份所测胰腺腺癌样品中的所有23份中观察到强表达，其中检测不到正常胰腺组织中的表达。
(4)DNA96936(TAT147)
在一次分析中，在6/6份乳房肿瘤中观察到强阳性信号。在另一次独立的分析中，在4/4份非小细胞肺癌中观察到阳性信号，其中肿瘤看起来与正常肺相比表达更强。1/1份子宫内膜腺癌显示出强表达，而3/3份结肠直肠腺癌显示出易变的表达。
(5)DNA108809(TAT114)
在测试的所有肾细胞癌(n＝3)中有阳性信号，而在正常肾组织中未观察到表达。另外，在5/12份胃肿瘤、5/24份结肠直肠肿瘤、3/8份胰腺肿瘤和1/3份肺肿瘤中观察到阳性表达。正常非癌性组织表达局限于胃和小肠。
(6)DNA176766(TAT132)
在测试的所有子宫内膜腺癌(n＝3)中有阳性信号，而在正常子宫内膜组织中未观察到表达。
(7)DNA236463(TAT150)
在测试的所有子宫内膜腺癌(n＝3)中有阳性信号，而在正常子宫内膜组织中未观察到表达。
(8)DNA181162(TAT129)
肿瘤性前列腺上皮一般是阳性的，信号强度在个案之间从弱到强变化。非前列腺组织是阴性的。
(9)DNA188221(TAT111)
在恶性上皮上在结肠多肿瘤阵列中看到强信号。在正常组织中，某种探针在结肠隐窝下2/3段衬里的上皮细胞上给出特异信号，信号强度看起来显著低于结肠癌中的信号强度。在12/18份结肠直肠腺癌、6/8份转移性腺癌和2/9份胃腺癌中观察到阳性表达。
(10)DNA233876(TAT146)
在恶性上皮上在结肠多肿瘤阵列中看到强信号。在正常组织中，某种探针在结肠隐窝下2/3段衬里的上皮细胞上给出特异信号，信号强度看起来显著低于结肠癌中的信号强度。在12/18份结肠直肠腺癌、6/8份转移性腺癌和2/9份胃腺癌中观察到阳性表达。
(11)DNA210499(TAT123)
在一次分析中，12/14份卵巢腺癌是阳性的，8/9份子宫内膜腺癌是阳性的。正常卵巢基质(stroma)与子宫肌膜一样是阴性的。其它正常卵巢和子宫组织是阴性的。
在一次独立的分析中，16/27份非小细胞肺癌是阳性的，其中信号中等或强。
(12)DNA219894(TAT211)
在一次分析中，12/14份卵巢腺癌是阳性的，8/9份子宫内膜腺癌是阳性的。正常卵巢基质(stroma)与子宫肌膜一样是阴性的。其它正常卵巢和子宫组织是阴性的。
在一次独立的分析中，16/27份非小细胞肺癌是阳性的，其中信号中等或强。
(13)DNA215609(TAT113)
在结肠癌中看到强信号，而在正常结肠中只有非常低水平的信号。肺和乳房癌是阴性的。
(14)DNA220432(TAT128)
表达此基因的唯一正常成人组织是前列腺上皮。所述表达强度中等至强且是病灶性的(focal)，它在增生上皮中更普遍。
在有50例原发性前列腺癌可检查的一次分析中，29例(58％)是阳性的，18例(36％)是阴性的，而3例(6％)是不明确的。在有37例原发性前列腺癌可检查的另一次分析中，33例(89％)是阳性的，4例(11％)是阴性的。最后，在有27例转移性前列腺癌可检查的另一次独立的分析中，14例(52％)是阳性的，11例(41％)是阴性的，而2例(7％)是不明确的。
(15)DNA226237(TAT117)
在一次分析中，2/3份肾细胞癌是阳性的，其中正常肾表达是阴性的。(16)DNA246450(TAT168)
在一次分析中，2/3份肾细胞癌是阳性的，其中正常肾表达是阴性的。
(17)DNA227087(TAT163)
针对此分子的一种探针在肺、乳房、结肠、胰腺和子宫内膜癌的所有测试例的肿瘤相关基质细胞亚群中显示阳性信号。标记的强度常常相当强。在一例具有邻近良性结肠的结肠腺癌中，标记局限于肿瘤相关基质，而正常良性组织是阴性的。乳房纤维腺瘤也显示对上皮下基质细胞的标记。
(18)DNA266307(TAT227)
针对此分子的一种探针在肺、乳房、结肠、胰腺和子宫内膜癌的所有测试例的肿瘤相关基质细胞亚群中显示阳性信号。标记的强度常常相当强。在一例具有邻近良性结肠的结肠腺癌中，标记局限于肿瘤相关基质，而正常良性组织是阴性的。乳房纤维腺瘤也显示对上皮下基质细胞的标记。
(19)DNA266311(TAT228)
针对此分子的一种探针在肺、乳房、结肠、胰腺和子宫内膜癌的所有测试例的肿瘤相关基质细胞亚群中显示阳性信号。标记的强度常常相当强。在一例具有邻近良性结肠的结肠腺癌中，标记局限于肿瘤相关基质，而正常良性组织是阴性的。乳房纤维腺瘤也显示对上皮下基质细胞的标记。
(20)DNA266312(TAT229)
针对此分子的一种探针在肺、乳房、结肠、胰腺和子宫内膜癌的所有测试例的肿瘤相关基质细胞亚群中显示阳性信号。标记的强度常常相当强。在一例具有邻近良性结肠的结肠腺癌中，标记局限于肿瘤相关基质，而正常良性组织是阴性的。乳房纤维腺瘤也显示对上皮下基质细胞的标记。
(21)DNA266313(TAT230)
针对此分子的一种探针在肺、乳房、结肠、胰腺和子宫内膜癌的所有测试例的肿瘤相关基质细胞亚群中显示阳性信号。标记的强度常常相当强。在一例具有邻近良性结肠的结肠腺癌中，标记局限于肿瘤相关基质，而正常良性组织是阴性的。乳房纤维腺瘤也显示对上皮下基质细胞的标记。
(22)DNA227224(TAT121)
在2/3份子宫内膜腺癌中观察到表达。
(23)DNA247486(TAT183)
在2/3份子宫内膜腺癌中观察到表达。
(24)DNA227800(TAT131)
在一次分析中，46/64份原发性前列腺癌是阳性的，6/14份转移性前列腺癌是阳性的。在前列腺上皮中观察到弱至中等表达。
(25)DNA228199(TAT127)
在13/15份卵巢肿瘤(腺癌和表面上皮肿瘤)中观察到表达。良性卵巢表面上皮也是阳性的。大多数阳性肿瘤中的表达水平是强或中等的且相当一致。在8/9份子宫腺癌中也观察到表达。7/23份非小细胞肺癌是阳性的。
(26)DNA228201(TAT116)
13/16份结肠直肠腺癌的恶性细胞对TAT116表达是阳性的。另外，9/10份转移性腺癌对表达是阳性的。在正常结肠隐窝的基部也观察到表达。
(27)DNA247488(TAT189)
13/16份结肠直肠腺癌的恶性细胞对TAT189表达是阳性的。另外，9/10份转移性腺癌对表达是阳性的。在正常结肠隐窝的基部也观察到表达。
(28)DNA236538(TAT190)
13/16份结肠直肠腺癌的恶性细胞对TAT190表达是阳性的。另外，9/10份转移性腺癌对表达是阳性的。在正常结肠隐窝的基部也观察到表达。
(29)DNA247489(TAT191)
13/16份结肠直肠腺癌的恶性细胞对TAT191表达是阳性的。另外，9/10份转移性腺癌对表达是阳性的。在正常结肠隐窝的基部也观察到表达。
(30)DNA228994(TAT124)
13/61例非小细胞肺癌对TAT124表达是阳性的。这些阳性肿瘤样品中的表达水平显著高于正常成人组织中的表达水平。
(31)DNA231542(TAT100)
如上所述进行的原位分析证明人神经胶质瘤和成胶质细胞瘤组织中的表达较之正常脑(和其它)组织显著上调。
(32)DNA231542-1(TAT284)
如上所述进行的原位分析证明人神经胶质瘤和成胶质细胞瘤组织中的表达较之正常脑(和其它)组织显著上调。
(33)DNA231542-2(TAT285)
如上所述进行的原位分析证明人神经胶质瘤和成胶质细胞瘤组织中的表达较之正常脑(和其它)组织显著上调。
(34)DNA297393(TAT285-1)
如上所述进行的原位分析证明人神经胶质瘤和成胶质细胞瘤组织中的表达较之正常脑(和其它)组织显著上调。
(35)DNA236534(TAT102)
在14/15份卵巢上皮恶性肿瘤(腺癌、上皮表面肿瘤、子宫内膜样Ca)中观察到TAT102表达。同样，8/9份子宫的子宫内膜腺癌表达TAT102。此外，在24/27份非小细胞肺癌中观察到TAT102表达，阳性案例包括鳞状癌和腺癌。这些肿瘤组织中的表达显著高于它们的正常组织对应物中的表达。
(36)DNA246430(TAT109)
在14/92份乳房肿瘤样品对TAT109表达是阳性的。在所有正常组织中未检测到表达。
(37)DNA264454(TAT106)
在38/88份乳房肿瘤中观察到TAT106表达。在正常乳房组织中的表达是弱的或未检测到。
(38)DNA98565(TAT145)
在大多数神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、一些黑素瘤和正常脑(主要定位于星形胶质细胞)中观察到TAT145的阳性信号。成胶质细胞瘤中的信号强度看起来大于正常星形胶质细胞中的信号强度。虽然测试的大多数神经胶质瘤和成胶质细胞瘤样品对TAT145表达是阳性的，但是测试的大多数正常脑样品对所述表达是阴性的。
(39)DNA246435(TAT152)
在大多数成胶质细胞瘤、一些黑素瘤和正常脑(主要定位于星形胶质细胞)中观察到TAT152的阳性信号。成胶质细胞瘤中的信号强度看起来大于正常星形胶质细胞中的信号强度。虽然测试的大多数神经胶质瘤和成胶质细胞瘤样品对TAT152表达是阳性的，但是测试的大多数正常脑样品对所述表达是阴性的。
(40)DNA167234(TAT130)
有70例原发性前列腺腺癌可检查。在这70例中，56例(80％)对TAT130表达是阳性的。非前列腺组织中的TAT130表达是弱的或未检测到。
(41)DNA235621(TAT166)
有70例原发性前列腺腺癌可检查。在这70例中，56例(80％)对TAT166表达是阳性的。非前列腺组织中的TAT166表达是弱的或未检测到。
(42)DNA236493(TAT141)
在70/148份乳癌、2/63份结肠直肠腺癌、4/42份卵巢肿瘤、9/69份非小细胞肺癌、9/67份前列腺腺癌和5/25份神经胶质瘤中观察到阳性表达。正常非癌性组织中的表达看起来局限于前列腺和乳房上皮。
(43)DNA226094(TAT164)
21/37份成胶质细胞瘤样品和8/8份神经胶质瘤样品对TAT164表达是阳性的，而检验的所有其它肿瘤和正常组织(包括正常脑组织)是阴性的。
(44)DNA227578(TAT165)
15/25份测试的成胶质细胞瘤样品对表达是阳性的，而在测试的正常脑样品中观察到显著较弱的表达。
实施例5：免疫组化分析
制备针对本文所公开的某些TAT多肽的抗体，并如下进行免疫组化分析。首先将组织切片在丙酮/乙醇中固定5分钟(冰冻或石蜡包埋的)。然后在PBS中清洗切片，随后用亲合素和生物素(Vector试剂盒)封闭10分钟，每次封闭后在PBS中清洗一次。然后将切片用10％血清封闭20分钟，随后吸干以去除过量溶液。然后将一抗以10μg/ml的浓度加到切片上达1小时，随后在PBS中清洗切片。然后将生物素化的二抗(抗一抗)加到切片上达30分钟，随后在PBS中清洗切片。然后将切片暴露于Vector试剂盒的试剂达30分钟，随后在PBS中清洗切片。然后将切片暴露于二氨基联苯胺(Diaminobenzidine)(Pierce)达5分钟，随后在PBS中清洗。然后将切片用Mayers苏木精复染(对比染色)，盖上盖玻片并观察。免疫组化分析还可如Sambrook et al.，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，New York：ColdSpring Harbor Press，1989和Ausubel et al.，《Current Protocols of MolecularBiology》，Unit 3.16，John Wiley and Sons 1997中所述进行。这些分析的结果显示如下。
(1)DNA96930(TAT112)
在结肠肿瘤的结肠隐窝顶部表面检测到比正常结肠隐窝顶部表面显著更高的表达。另外，发现TAT112在胰腺腺癌细胞中较之正常胰腺细胞中显著过表达。最后，如上所述进行的IHC分析证明，TAT112在肺癌较之正常肺组织、非小细胞肺癌较之正常肺组织、及胃癌较之正常胃组织中显著过表达。
(2)DNA226539(TAT126)
在2/10份子宫腺癌、9/17份卵巢腺癌和2/20份非小细胞肺癌中观察到阳性表达。利用此流程，在任何正常组织中都未检测到TAT126表达。
(3)DNA236511(TAT151)
在2/10份子宫腺癌、9/17份卵巢腺癌和2/20份非小细胞肺癌中观察到阳性表达。利用此流程，在任何正常组织中都未检测到TAT151表达。
实施例6：差异TAT多肽表达通过GEPIS的验证和分析
对可能已经如上一个或多个实施例中所述鉴定为肿瘤抗原的TAT多肽进行如下验证和分析。通过GEPIS搜索表达序列标签(EST)DNA数据库(Incyte Pharmaceuticals，Palo Alto，CA)并鉴定目的EST序列。计算机基因表达图谱绘制(GEPIS)是Genentech公司研发的生物信息学方法，用于鉴定作为新癌症治疗靶的目的基因。GEPIS利用大量的EST序列和文库信息来确定基因表达图谱。GEPIS能够根据其与EST数据库中的出现次数的比例关系来确定基因的表达图谱，而且它通过以严格且有统计学意义的方式整合EST关系数据库和Genentech私有信息而运行。在此实施例中，GEPIS用于鉴定和交叉验证新的肿瘤抗原，尽管GEPIS可设定成执行非常特殊的分析或广泛的筛选任务。对于最初的筛选，GEPIS用于从
Figure A20058003786001773
数据库中鉴定与一种或多种特定目的组织(常常是目的肿瘤组织)中的表达有关的EST序列。然后对此最初筛选中鉴定的EST序列(或者通过对比最初筛选所获得的多种相关且交叠EST序列获得的共有序列)进行筛选以鉴定所编码蛋白质中是否存在至少一个跨膜结构域。最后，利用GEPIS产生各种目的序列的完整组织表达图谱。利用这种类型的筛选生物信息学，鉴定出多种TAT多肽(及其编码核酸分子)在特定类型的癌症或某些癌症中较之其它癌症和/或正常非癌性组织显著过表达。GEPIS命中的评估基于若干标准，包括例如组织特异性、肿瘤特异性、及正常的必要组织和/或正常的增殖组织中的表达水平。下表列出了根据GEPIS确定的组织表达图谱，证实在特定的一种或多种肿瘤中较之其它肿瘤和/或正常组织有高组织表达和显著表达上调且任选在正常的必要组织和/或正常的增殖组织中有相对低表达的分子。因此，下文所列分子是用于诊断和治疗哺乳动物中的癌症的卓越多肽靶。
分子                表达上调于：    相比较于：
DNA77507(TAT161)    乳房肿瘤        正常乳房组织
DNA77507(TAT161)    结肠肿瘤         正常结肠组织
DNA77507(TAT161)    肺肿瘤           正常肺组织
DNA77507(TAT161)    肾肿瘤           正常肾组织
DNA77507(TAT161)    肝肿瘤           正常肝组织
DNA77507(TAT161)    卵巢肿瘤         正常卵巢组织
DNA77507(TAT161)    胰腺肿瘤         正常胰腺组织
DNA77507(TAT161)    直肠肿瘤         正常直肠组织
DNA77507(TAT161)    皮肤肿瘤         正常皮肤组织
DNA77507(TAT161)    子宫肿瘤         正常子宫组织
DNA77507(TAT161)    脑肿瘤           正常脑组织
DNA77507(TAT161)    软组织肿瘤       正常软组织
DNA77507(TAT161)    骨肿瘤           正常骨组织
DNA82343(TAT157)    结肠肿瘤         正常结肠组织
DNA82343(TAT157)    卵巢肿瘤         正常卵巢组织
DNA82343(TAT157)    胃肿瘤           正常胃组织
DNA82343(TAT157)    胸腺肿瘤         正常胸腺组织
DNA82343(TAT157)    小肠肿瘤         正常小肠组织
DNA87994(TAT160)    乳房肿瘤         正常乳房组织
DNA87994(TAT160)    胰腺肿瘤         正常胰腺组织
DNA87994(TAT160)    结肠肿瘤         正常结肠组织
DNA87994(TAT160)    食道肿瘤         正常食道组织
DNA87994(TAT160)    卵巢肿瘤         正常卵巢组织
DNA87994(TAT160)    前列腺肿瘤       正常前列腺组织
DNA88131(TAT158)    乳房肿瘤         正常乳房组织
DNA88131(TAT158)    结肠肿瘤         正常结肠组织
DNA88131(TAT158)    肺肿瘤           正常肺组织
分子                表达上调于：     相比较于：
DNA88131(TAT158)    胰腺肿瘤         正常胰腺组织
DNA88131(TAT158)    前列腺肿瘤       正常前列腺组织
DNA88131(TAT158)    胃肿瘤           正常胃组织
DNA88131(TAT158)    膀胱肿瘤         正常膀胱组织
DNA88131(TAT158)    脑肿瘤           正常脑组织
DNA95930(TAT110)    结肠肿瘤         正常结肠组织
DNA95930(TAT110)    肺肿瘤           正常肺组织
DNA95930(TAT110)    前列腺肿瘤       正常前列腺组织
DNA95930(TAT110)    子宫内膜肿瘤     正常子宫内膜组织
DNA95930(TAT110)    卵巢肿瘤         正常卵巢组织
DNA95930(TAT110)    乳房肿瘤         正常乳房组织
DNA95930-1(TAT210)   结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA95930-1(TAT210)   肺肿瘤            正常肺组织
DNA95930-1(TAT210)   前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA95930-1(TAT210)   子宫内膜肿瘤      正常子宫内膜组织
DNA95930-1(TAT210)   卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA95930-1(TAT210)   乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA96917(TAT159)     胰腺肿瘤          正常胰腺组织
DNA96917(TAT159)     肺肿瘤            正常肺组织
DNA96917(TAT159)     肝肿瘤            正常肝组织
DNA96917(TAT159)     前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA96930(TAT112)     乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA96930(TAT112)     结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA96930(TAT112)     肺肿瘤            正常肺组织
DNA96930(TAT112)     卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA96930(TAT112)     胰腺肿瘤          正常胰腺组织
DNA96930(TAT112)     胃肿瘤            正常胃组织
DNA96936(TAT147)     乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA96936(TAT147)     结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA96936(TAT147)     前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA96936(TAT147)     子宫肿瘤          正常子宫组织
DNA98565(TAT145)     脑肿瘤            正常脑组织
DNA98565(TAT145)     结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA246435(TAT152)    脑肿瘤            正常脑组织
DNA246435(TAT152)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA98591(TAT162)     结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA98591(TAT162)     小肠肿瘤          正常小肠组织
DNA98591(TAT162)     卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA98591(TAT162)     食道肿瘤          正常食道组织
DNA108809(TAT114)    结肠肿瘤          正常结肠组织
DNA108809(TAT114)    肺肿瘤            正常肺组织
DNA108809(TAT114)    卵巢肿瘤          正常卵巢组织
DNA108809(TAT114)    脑肿瘤            正常脑组织
DNA143493(TAT103)    乳房肿瘤          正常乳房组织
DNA167234(TAT130)    前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA235621(TAT166)    前列腺肿瘤        正常前列腺组织
DNA176766(TAT132)    肾肿瘤            正常肾组织
DNA176766(TAT132)    子宫肿瘤          正常子宫组织
DNA236463(TAT150)    肾肿瘤            正常肾组织
DNA236463(TAT150)    子宫肿瘤          正常子宫组织
DNA181162(TAT129)    前列腺肿瘤           正常前列腺组织
DNA188221(TAT111)    结肠肿瘤             正常结肠组织
DNA188221(TAT111)    肝肿瘤               正常肝组织
DNA188221(TAT111)    肺肿瘤               正常肺组织
DNA233876(TAT146)    结肠肿瘤             正常结肠组织
分子                 表达上调于：         相比较于：
DNA233876(TAT146)    肝肿瘤               正常肝组织
DNA233876(TAT146)    肺肿瘤               正常肺组织
DNA193891(TAT148)    前列腺肿瘤           正常前列腺组织
DNA193891(TAT148)    乳房肿瘤             正常乳房组织
DNA248170(TAT187)    乳房肿瘤             正常乳房组织
DNA248170(TAT187)    前列腺肿瘤           正常前列腺组织
DNA194628(TAT118)    肾肿瘤               正常肾组织
DNA246415(TAT167)    肾肿瘤               正常肾组织
DNA215609(TAT113)    结肠肿瘤             正常结肠组织
DNA220432(TAT128)    前列腺肿瘤           正常前列腺组织
DNA226094(TAT164)    乳房肿瘤             正常乳房组织
DNA226094(TAT164)    脑肿瘤               正常脑组织
DNA226094(TAT164)    卵巢肿瘤             正常卵巢组织
DNA226094(TAT164)    肺肿瘤               正常肺组织
DNA226165(TAT122)    乳房肿瘤             正常乳房组织
DNA226165(TAT122)    子宫内膜肿瘤         正常子宫内膜组织
DNA226165(TAT122)    肺肿瘤               正常肺组织
DNA226165(TAT122)    结肠肿瘤             正常结肠组织
DNA226237(TAT117)    肾肿瘤               正常肾组织
DNA246450(TAT168)    肾肿瘤               正常肾组织
DNA246450(TAT168)    脑肿瘤               正常脑组织
DNA226456(TAT144)    乳房肿瘤             正常乳房组织
DNA226456(TAT144)    脑肿瘤               正常脑组织
DNA226456(TAT144)    子宫内膜肿瘤         正常子宫内膜组织
DNA226456(TAT144)    肾肿瘤               正常肾组织
DNA226456(TAT144)    肺肿瘤               正常肺组织
DNA237637(TAT188)    乳房肿瘤             正常乳房组织
DNA237637(TAT188)    脑肿瘤               正常脑组织
DNA237637(TAT188)    子宫内膜肿瘤         正常子宫内膜组织
DNA237637(TAT188)    肾肿瘤               正常肾组织
DNA237637(TAT188)    肺肿瘤               正常肺组织
DNA226539(TAT126)    结肠肿瘤             正常结肠组织
DNA226539(TAT126)    子宫内膜肿瘤        正常子宫内膜组织
DNA226539(TAT126)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA226539(TAT126)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA236511(TAT151)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA236511(TAT151)    子宫内膜肿瘤        正常子宫内膜组织
DNA236511(TAT151)    卵巢肿瘤            正常卵巢组织
DNA236511(TAT151)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA226771(TAT115)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA227087(TAT163)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA227087(TAT163)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA227087(TAT163)    内分泌肿瘤          正常内分泌组织
DNA227087(TAT163)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA227087(TAT163)    肝肿瘤              正常肝组织
DNA227087(TAT163)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA227087(TAT163)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA227087(TAT163)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA227087(TAT163)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA227087(TAT163)    膀胱肿瘤            正常膀胱组织
DNA266307(TAT227)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA266307(TAT227)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA266307(TAT227)    内分泌肿瘤          正常内分泌组织
DNA266307(TAT227)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA266307(TAT227)    肝肿瘤              正常肝组织
分子                 表达上调于：        相比较于：
DNA266307(TAT227)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA266307(TAT227)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA266307(TAT227)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA266307(TAT227)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA266307(TAT227)    膀胱肿瘤            正常膀胱组织
DNA266311(TAT228)    乳房肿瘤            正常乳房组织
DNA266311(TAT228)    结肠肿瘤            正常结肠组织
DNA266311(TAT228)    内分泌肿瘤          正常内分泌组织
DNA266311(TAT228)    肾肿瘤              正常肾组织
DNA266311(TAT228)    肝肿瘤              正常肝组织
DNA266311(TAT228)    肺肿瘤              正常肺组织
DNA266311(TAT228)    胰腺肿瘤            正常胰腺组织
DNA266311(TAT228)    子宫肿瘤            正常子宫组织
DNA266311(TAT228)    前列腺肿瘤          正常前列腺组织
DNA266311(TAT228)    膀胱肿瘤                正常膀胱组织
DNA266312(TAT229)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA266312(TAT229)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA266312(TAT229)    内分泌肿瘤              正常内分泌组织
DNA266312(TAT229)    肾肿瘤                  正常肾组织
DNA266312(TAT229)    肝肿瘤                  正常肝组织
DNA266312(TAT229)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA266312(TAT229)    胰腺肿瘤                正常胰腺组织
DNA266312(TAT229)    子宫肿瘤                正常子宫组织
DNA266312(TAT229)    前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA266312(TAT229)    膀胱肿瘤                正常膀胱组织
DNA266313(TAT230)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA266313(TAT230)    结肠肿瘤                正常结肠组织
DNA266313(TAT230)    内分泌肿瘤              正常内分泌组织
DNA266313(TAT230)    肾肿瘤                  正常肾组织
DNA266313(TAT230)    肝肿瘤                  正常肝组织
DNA266313(TAT230)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA266313(TAT230)    胰腺肿瘤                正常胰腺组织
DNA266313(TAT230)    子宫肿瘤                正常子宫组织
DNA266313(TAT230)    前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA266313(TAT230)    膀胱肿瘤                正常膀胱组织
DNA227224(TAT121)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA227224(TAT121)    子宫内膜肿瘤            正常子宫内膜组织
DNA227224(TAT121)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA227224(TAT121)    皮肤肿瘤                正常皮肤组织
DNA247486(TAT183)    乳房肿瘤                正常乳房组织
DNA247486(TAT183)    子宫内膜肿瘤            正常子宫内膜组织
DNA247486(TAT183)    肺肿瘤                  正常肺组织
DNA247486(TAT183)    皮肤肿瘤                正常皮肤组织
DNA227578(TAT165)    脑肿瘤                  正常脑组织
DNA227800(TAT131)    前列腺肿瘤              正常前列腺组织
DNA227800(TAT131)    肾肿瘤                  正常肾组织
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分子                 表达上调于：        相比较于：
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实施例7：TAT作为杂交探针的用途
下面的方法描述了编码TAT的核苷酸序列作为杂交探针用于例如诊断哺乳动物中肿瘤存在的用途。
包含本文所公开的全长或成熟TAT的编码序列的DNA也可作为探针用于筛选人组织cDNA文库或人组织基因组文库中的同源DNA(诸如那些编码TAT的天然存在变体的DNA)。
含任一种文库DNA的滤膜的杂交和清洗在如下高严格条件下进行。放射性标记的TAT衍生探针与滤膜的杂交在50％甲酰胺，5x SSC，0.1％SDS，0.1％焦磷酸钠，50mM磷酸钠pH 6.8，2x Denhardt氏溶液和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃进行20小时。滤膜的清洗在0.1x SSC和0.1％SDS的水溶液中于42℃进行。
然后可使用本领域已知的标准技术来鉴定与编码全长天然序列TAT的DNA具有期望序列同一性的DNA。
实施例8：TAT在大肠杆菌中的表达
此实施例通过大肠杆菌中的重组表达例示了非糖基化形式的TAT的制备。
首先使用选定的PCR引物扩增编码TAT的DNA序列。引物应当包含与选定的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点。可采用多种表达载体。合适载体的一个例子是pBR322(衍生自大肠杆菌；参阅Bolivar et al.，Gene，2：95(1977))，它包含氨苄青霉素和四环素抗性的基因。将载体用限制酶消化并去磷酸化。然后将PCR扩增序列连接到载体中。载体优选包含编码抗生素抗性基因、trp启动子、多组氨酸前导(包含头6个STII密码子、多组氨酸序列和肠激酶切割位点)、TAT编码区、λ转录终止子和argU基因的序列。
然后通过Sambrook et al.，同上中描述的方法用连接混合液转化选定的大肠杆菌菌株。通过在LB平板上生长的能力来鉴定转化子，然后挑选抗生素抗性菌落。可分离质粒DNA，并通过限制性分析和DNA测序进行确认。
选定的克隆可在液体培养基中培养过夜，诸如补充有抗生素的LB培养基。随后可用过夜培养物接种大规模培养。然后使细胞生长至期望光密度，在此期间表达启动子开启。
将细胞再培养若干小时后，可通过离心收获细胞。通过离心收获的细胞沉淀物可使用本领域已知的各种试剂溶解，然后可用金属螯合柱在允许蛋白质紧密结合的条件下纯化溶解的TAT蛋白。
使用如下流程，TAT可以多组氨酸标记形式在大肠杆菌中表达。首先用选定的PCR引物扩增编码TAT的DNA。引物包含与选定的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点，以及提供有效和可靠的翻译起始、金属螯合柱上的快速纯化及肠激酶的蛋白水解切除的其它有用序列。然后将PCR扩增的多组氨酸标记的序列连接到表达载体中，用于转化基于菌株52(W3110fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq))的大肠杆菌宿主。首先将转化子在含50mg/ml羧苄青霉素的LB培养基中于30℃振荡培养至O.D.600达到3-5。然后将培养物在CRAP培养基(通过在500mL水中混和3.57g(NH4)2SO4，0.71g柠檬酸钠·2H2O，1.07g KCl，5.36g Difco酵母提取物，5.36gSheffield hycase SF，以及110mM MPOS pH 7.3，0.55％(w/v)葡萄糖和7mMMgSO4来配制)中稀释50-100倍，并于30℃振荡培养大约20-30小时。取出样品通过SDS-PAGE分析来验证表达，并将大量培养物离心以沉淀细胞。冷冻细胞沉淀物直至纯化和重折叠。
将来自0.5至1升发酵液的大肠杆菌细胞浆(6-10g沉淀物)重悬于10倍体积(w/v)的7M胍，20mM Tris pH 8缓冲液。加入固体亚硫酸钠和连四硫酸钠至终浓度分别为0.1M和0.02M，并将溶液于4℃搅动过夜。此步骤产生所有半胱氨酸残基通过亚硫酸酰化(sulfitolization)而封闭的变性蛋白质。将溶液在Beckman超速离心机中以40,000rpm离心30分钟。将上清液用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍，20mM Tris pH 7.4)稀释，并通过0.22微米滤器过滤至澄清。将澄清的提取物加到在金属螯合柱缓冲液中平衡的5ml Qiagen Ni-NTA金属螯合柱上。用含50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)pH 7.4的另外缓冲液清洗柱子。用含250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。合并含有期望蛋白质的级分并贮存于4℃。利用根据蛋白质的氨基酸序列计算的消光系数通过其在280nm的吸光度估计其浓度。
通过将蛋白质在新鲜配制的重折叠缓冲液中稀释使其重折叠，所述重折叠缓冲液含20mM Tris pH 8.6，0.3M NaCl，2.5M尿素，5mM半胱氨酸，20mM甘氨酸和1mM EDTA。选择重折叠体积使得最终的蛋白质浓度在50至100μg/ml之间。将重折叠溶液于4℃温和搅动12-36小时。通过加入TFA至终浓度0.4％(pH大约3)终止重折叠反应。在进一步纯化蛋白质之前，将溶液通过0.22微米滤器过滤，并加入乙腈至终浓度2-10％。将重折叠蛋白质在Poros R1/H反相柱上层析，使用0.1％TFA作为流动缓冲液，并用10至80％的乙腈梯度洗脱。在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析具A280吸光度的级分的等分试样，并合并含均一重折叠蛋白质的级分。通常，大多数蛋白质的正确重折叠形式在最低乙腈浓度得到洗脱，因为那些形式是最紧凑的，使其疏水内部免于与反相树脂的相互作用。聚集形式常常在较高乙腈浓度得到洗脱。除了从期望形式中解除蛋白质的错误折叠形式，反相步骤还从样品中去除内毒素。
合并含期望折叠的TAT多肽的级分，并用对准溶液的温和氮流去除乙腈。通过透析或通过使用在配制缓冲液中平衡的G25 Superfine(Pharmacia)树脂的凝胶过滤将蛋白质配制到含0.14M氯化钠和4％甘露糖的20mMHepes pH 6.8中，并无菌过滤。
本文所公开的某些TAT多肽已经使用此技术成功表达并纯化。
实施例9：TAT在哺乳动物细胞中的表达
此实施例通过哺乳动物细胞中的重组表达例示了潜在糖基化形式的TAT的制备。
采用载体pRK5(参阅1989年3月15日公开的EP 307,247)作为表达载体。任选的是，使用诸如Sambrook et al.，同上中描述的连接方法，将TATDNA连接到经选定的限制酶消化以容许插入TAT DNA的pRK5中。所得载体称为pRK5-TAT。
在一个实施方案中，选定的宿主细胞可以是293细胞。将人293细胞(ATCC CCL 1573)在组织培养皿中在诸如补充有胎牛血清和任选的营养成分和/或抗生素的DMEM等培养基中培养至汇合。将约10μg pRK5-TAT DNA与约1μg编码VA RNA基因的DNA(Thimmappaya et al.，Cell，31：543(1982))混合，并溶于500μl 1mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，0.227M CaCl2。向此混合液中逐滴加入500μl 50mM HEPES(pH 7.35)，280mM NaCl，1.5mM NaPO4，并于25℃沉淀10分钟。将沉淀物悬浮并加到293细胞中，使其于37℃静置4小时。吸去培养基并加入2ml含20％甘油的PBS达30秒。然后用无血清培养基清洗293细胞，加入新鲜培养基，并将细胞温育约5天。
转染后大约24小时，去除培养基，并用培养基(单独)或含200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml 35S-甲硫氨酸的培养基置换。温育12小时后，收集条件培养基，在旋转滤器上浓缩，并加到15％SDS凝胶上。处理后的凝胶可干燥，并对胶片曝光选定的一段时间以显现TAT多肽的存在。含转染细胞的培养物可进行进一步温育(在无血清培养基中)，并在选定的生物测定法中测试培养基。
在一种备选技术中，可使用Somparyrac et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，12：7575(1981)描述的硫酸右旋糖苷法将TAT瞬时导入293细胞。将293细胞在旋转摇瓶中培养至最大密度，加入700μg pRK5-TAT DNA。首先通过离心从旋转摇瓶浓缩细胞并用PBS清洗。将DNA-右旋糖苷沉淀物在细胞沉淀物上温育4小时。将细胞用20％甘油处理90秒，用组织培养基清洗，再次放入装有组织培养基、5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛运铁蛋白的旋转摇瓶。大约4天后，将条件培养基离心并过滤以去除细胞和碎片。然后可通过任何选定的方法诸如透析和/或柱层析来浓缩并纯化含所表达TAT的样品。
在另一个实施方案中，可在CHO细胞中表达TAT。可使用已知试剂诸如CaPO4或DEAE-右旋糖苷将pRK5-TAT转染到CHO细胞。如上所述，可将细胞培养物温育，并用培养基(单独的)或含放射性标记物诸如35S-甲硫氨酸的培养基置换培养基。测定TAT多肽的存在后，可用无血清培养基置换培养基。优选的是，将培养物温育约6天，然后收获条件培养基。然后可通过任何选定的方法来浓缩并纯化含所表达TAT的培养液。
还可在宿主CHO细胞中表达表位标记的TAT。可将TAT亚克隆到pRK5载体外。亚克隆插入片段可进行PCR以融合到杆状病毒表达载体中，与选定的表位标签诸如多组氨酸标签处于同一读码框。然后可将多组氨酸标记的TAT插入片段亚克隆到SV40驱动的载体中，所述载体包含选择标记诸如DHFR以选择稳定的克隆。最后，可用SV40驱动的载体转染CHO细胞(如上所述)。可如上所述进行标记以验证表达。然后可通过任何选定的方法诸如Ni2+-螯合亲和层析来浓缩并纯化含所表达多组氨酸标记的TAT的培养液。
TAT还可通过瞬时表达流程在CHO和/或COS细胞中表达，或者通过其它稳定表达流程在CHO细胞中表达。
CHO细胞中的稳定表达使用如下流程进行。将蛋白质作为IgG构建物(免疫粘附素)表达，其中将相应蛋白质的可溶形式(例如胞外结构域)的编码序列与含铰链、CH2和CH3结构域的IgG1恒定区序列融合，和/或是多组氨酸标记形式。
PCR扩增后，使用如Ausubel et al.，Current Protocols of Molecular Biology，Unit 3.16，John Wiley and Sons(1997)中所描述的标准技术将各DNA亚克隆到CHO表达载体中。将CHO表达载体构建成在目的DNA的5’和3’具有相容限制性位点以容许cDNA方便的穿梭。用于在CHO细胞中表达的载体如Lucas et al.，Nucl.Acids Res.24：9(1774-1779)(1996)中所述，利用SV40早期启动子/增强子来驱动目的cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达容许选择质粒在转染后的稳定维持。
使用商品化转染试剂
Figure A20058003786001881
(Quiagen)、
Figure A20058003786001882
或
Figure A20058003786001883
(Boehringer Mannheim)将12微克期望质粒DNA导入大约1×107个CHO细胞。如Lucas et al.，同上中所述培养细胞。将大约3×107个细胞冻存于安瓿中以供如下所述的进一步培养和生产。
通过置于水浴中融化含质粒DNA的安瓿并震荡混合。将内容物转移到装有10mL培养基的离心管中，并以1000rpm离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬于10mL选择培养基(含5％0.2μm渗滤胎牛血清的0.2μm过滤PS20)。然后将细胞等分到装有90mL选择培养基的100mL转瓶中。1-2天后，将细胞转移到装有150mL选择性生长培养基的250mL旋转瓶中，并于37℃温育。再过2-3天后，以3×105个细胞/mL接种250mL、500mL和2000mL转瓶。通过离心并重悬于生产培养基而用新鲜培养基置换细胞培养基。尽管可采用任何合适的CHO培养基，实际上可使用1992年6月16日授权的美国专利5,122,469中描述的生产培养基。以1.2×106个细胞/mL接种3L生产转瓶。第0天，测定细胞数。第1天，对转瓶采样并开始喷入过滤空气。第2天，对转瓶采样，将温度转变成33℃，并加入30mL 500g/L葡萄糖和0.6mL10％防沫剂(例如35％聚二甲基硅氧烷乳液，Dow Corning 365医用乳液)。在整个生产过程中，根据需要调节pH使其保持在7.2左右。10天后，或者直至存活力降至70％以下，通过离心收获细胞培养物并通过0.22μm滤器过滤。滤出液贮存于4℃或立即加到柱上以进行纯化。
对于多组氨酸标记的构建物，使用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化蛋白质。纯化前，向条件培养基中加入咪唑至浓度5mM。于4℃用泵将条件培养基以4-5ml/分钟的流速加到在含0.3M NaCl和5mM咪唑的20mM Hepes pH 7.4中平衡的6ml Ni-NTA柱上。加样后，用另外的平衡缓冲液清洗柱子，并用含0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白质。随后将高度纯化的蛋白质用25mlG25Superfine(Pharmacia)柱脱盐至含10mM Hepes，0.14M NaCl和4％甘露醇，pH 6.8的贮存缓冲液中，并贮存于-80℃。
免疫粘附素(含Fc)构建物如下从条件培养基中纯化。用泵将条件培养物加到在20mM磷酸钠缓冲液，pH 6.8中平衡的5ml蛋白A柱(Pharmacia)上。加样后，用平衡缓冲液彻底清洗柱子，然后用100mM柠檬酸，pH 3.5进行洗脱。洗脱的蛋白质立即通过将1ml级分收集到装有275μL 1M Tris缓冲液，pH9的管中而中和。随后如上文关于多组氨酸标记的蛋白质所述将高度纯化的蛋白质脱盐至贮存缓冲液中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶和经Edman降解的N-末端氨基酸测序评估均一性。
本文所公开的某些TAT多肽已经使用此技术成功表达并纯化。
实施例10：TAT在酵母中的表达
下面的方法描述了TAT在酵母中的重组表达。
首先，构建酵母表达载体用于由ADH2/GAPDH启动子的TAT的细胞内生成或分泌。将编码TAT和启动子的DNA插入选定质粒的合适限制酶位点以指导TAT的细胞内表达。对于分泌，可将编码TAT的DNA与编码用于TAT表达的ADH2/GAPDH启动子、天然TAT信号肽或其它哺乳动物信号肽或者例如酵母α因子或转化酶分泌信号/前导序列、及接头序列(如果需要)的DNA一起克隆到选定的质粒中。
然后可以用上文所述表达质粒转化酵母细胞诸如酵母菌株AB110，并在选定的发酵培养基中培养。经转化酵母的上清液可通过使用10％三氯乙酸的沉淀及通过SDS-PAGE的分离、随后使用考马斯蓝的凝胶染色进行分析。
随后可通过离心从发酵培养液中去除酵母细胞并使用选定的针筒滤器浓缩培养液来分离重组TAT。含TAT的浓缩液可使用选定的柱层析树脂进一步纯化。
本文所公开的某些TAT多肽已经使用此技术成功表达并纯化。
实施例11：TAT在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达
下面的方法描述了TAT在杆状病毒感染的昆虫细胞中的重组表达。
将编码TAT的序列融合到杆状病毒表达载体内所包含的表位标签的上游。此类表位标签包括多组氨酸标签和免疫球蛋白标签(像IgG的Fc区)。可采用多种质粒，包括衍生自商品化质粒诸如pVL1393(Novagen)的质粒。简而言之，用与5′和3′区互补的引物通过PCR扩增编码TAT的序列或TAT编码序列的期望部分，诸如编码跨膜蛋白质胞外结构域的序列或编码成熟蛋白质的序列，如果所述蛋白质是细胞外的话。5′引物将掺入侧翼(选定的)限制酶位点。然后用那些选定的限制酶消化产物，并亚克隆到表达载体中。
使用脂转染试剂(lipofectin，可从GIBCO-BRL购买)将上述质粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共转染到草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(“Sf9”)细胞(ATCC CRL 1711)中，产生重组杆状病毒。于28℃温育4-5天后，收获释放的病毒并用于进一步扩增。病毒感染和蛋白质表达如O′Reilley et al.，Baculovirus expression vectors：A Laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994)所述进行。
然后可纯化所表达的多组氨酸标记的TAT，例如通过如下的Ni2+-螯合亲和层析。如Rupert et al.，Nature，362：175-179(1993)所述从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简而言之，清洗Sf9细胞，重悬于超声处理缓冲液(25mLHepes pH 7.9，12.5mM MgCl2，0.1mM EDTA，10％甘油，0.1％NP-40，0.4MKCl)，在冰上超声处理2次各20秒。通过离心使超声处理物澄清，将上清液在加样缓冲液(50mM磷酸盐，300mM NaCl，10％甘油，pH 7.8)中稀释50倍并通过0.45μm滤器过滤。制备柱床体积5mL的Ni2+-NTA琼脂糖柱(可从Qiagen购买)，用25mL水清洗并用25mL加样缓冲液平衡。将过滤后的细胞提取物以0.5mL/分钟加到柱上。用加样缓冲液清洗柱子至基线A280，此时开始收集级分。接着，用第二清洗缓冲液(50mM磷酸盐，300mM NaCl，10％甘油，pH 6.0)清洗柱子，洗脱非特异性结合的蛋白质。再次达到A280基线后，用第二清洗缓冲液中的0至500mM咪唑梯度冲洗柱子。收集1mL级分，并通过SDS-PAGE和银染或者通过使用偶联有碱性磷酸酶的Ni2+-NTA(Qiagen)的Western印迹进行分析。合并含所洗脱His10标记的TAT的级分，并针对加样缓冲液进行透析。
或者，IgG标记的(或Fc标记的)TAT的纯化可使用已知的层析技术进行，包括例如蛋白A或蛋白G柱层析。
本文所公开的某些TAT多肽已经使用此技术成功表达并纯化。
实施例12：结合TAT的抗体的制备
此实施例例示了能特异性结合TAT的单克隆抗体的制备。此实施例进一步例示了能特异性结合TAT188(E16)多肽的单克隆抗体的制备。
用于生成单克隆抗体的技术是本领域已知的，且描述于例如Goding，同上。可采用的免疫原包括纯化的TAT、含TAT的融合蛋白、和在细胞表面上表达重组TAT的细胞。熟练技术人员无需过度实验就可做出免疫原的选择。
使用在完全弗氏佐剂中乳化的TAT免疫原通过1-100微克量的皮下或腹膜内注射免疫小鼠诸如Balb/c。或者，将免疫原在MPL-TDM佐剂(RibiImmunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化并注射到动物的后爪垫中。10至12天后用在选定佐剂中乳化的追加免疫原对已免疫小鼠进行加强免疫。此后，持续数周，还可通过追加免疫注射对小鼠进行加强免疫。可通过眼窝后放血定期从小鼠获取血清样品，用于在ELISA测定法中测试以检测抗TAT抗体。
TAT188多肽E16是12次跨膜的蛋白质，其C-和N-末端均定位于细胞内。TAT(E16)是不依赖Na2+的较大中性氨基酸转运蛋白的亚基，与常见的重链4F2hc(CD98hc)异二聚化形成功能单元(见图155的示意图)。为了制备靶向胞外结构域的抗TAT188(抗E16)抗体，使用内源表达E16的PC3细胞作为免疫原。简而言之，将PC3细胞(22×106个细胞/m1)注射到Balb-c小鼠中。针对对照293细胞和293-E16细胞(用E16转染并生成E16的293细胞)测试抗体滴度。制备了6个表达抗E16抗体的杂交瘤。其中，三种抗体通过FACS分析显示出对E16具有较好的特异性(见图156)，其中细胞表面结合与E16表面表达平行。具体而言，E16siRNA转染抑制E16表达(见本文实施例17)，而且还降低与PC3细胞表面结合的抗E16抗体的量。这些抗体在本文中称为3B5.1(或3B5)、12G12.1(或12G12)和12B9.1(或12B9)，并用于本文所公开的进一步实验。
表达本发明抗体的杂交瘤如下制备。在检测到合适的抗体滴度后，对抗体呈“阳性”的动物可进行最后的TAT静脉内注射。3至4天后，处死小鼠并收获脾细胞。然后将脾细胞与选定的鼠骨髓瘤细胞系融合(使用35％聚乙二醇)，诸如P3X63AgU.1，可从ATCC，No.CRL 1597获取。融合产生杂交瘤细胞，然后可分配到96孔组织培养板中，其中装有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培养基以抑制未融合细胞、骨髓瘤杂合体和脾细胞杂合体的增殖。
在ELISA中对杂交瘤细胞筛选针对TAT的反应性。分泌针对TAT的期望单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞的确定在本领域技术范围内。
阳性杂交瘤细胞可腹膜内注射到同基因Balb/c小鼠中以生成含有抗TAT单克隆抗体的腹水。或者，可在组织培养瓶或滚瓶中培养杂交瘤细胞。腹水中生成的单克隆抗体的纯化可使用硫酸胺沉淀后续凝胶排阻层析来完成。或者，可采用基于抗体与蛋白A或蛋白G结合的亲和层析。
针对本文所公开的某些TAT多肽的抗体已经使用此技术成功生成。更具体的说，针对以下本文所公开的TAT蛋白已经成功生成了能够识别并结合TAT蛋白质(根据标准ELISA、FACS分选分析和/或免疫组化分析的测量)的功能性单克隆抗体：TAT110(DNA95930)，TAT210(DNA95930-1)，TAT113(DNA215609)，TAT126(DNA226539)，TAT151(DNA236511)，TAT111(DNA188221)，TAT146(DNA233876)，TAT112(DNA96930)，TAT145(DNA98565)，TAT152(DNA246435)，TAT141(DNA236493)，TAT114(DNA108809)，TAT104(DNA236343)，TAT100(DNA231542)，TAT284(DNA231542-1)，TAT285(DNA231542-2)，TAT285-1(DNA297393)，TAT144(DNA226456)，TAT188(DNA237637)，TAT123(DNA210499)，TAT211(DNA219894)，TAT102(DNA236534)，TAT127(DNA228199)和TAT128(DNA220432)。有趣的是，申请人鉴定得出针对TAT111(DNA188221)和TAT146(DNA233876)制备的单克隆抗体能够阻断由DNA188221和DNA233876分子编码的EphB2R受体所受到的其相关配体多肽的活化作用。因此，抗体及使用那些抗体来阻断EphB2R受体(即TAT111和TAT146多肽)所受到的其相关配体的活化作用的方法涵盖在当前所述发明内。此外，申请人鉴定得出针对TAT110(DNA95930)和TAT210(DNA95930-1)多肽(即IL-20受体α多肽)的单克隆抗体能够抑制IL-19蛋白对IL20受体α的活化作用。因此，抗体及使用那些抗体来抑制IL-19对IL-20受体α(即TAT110和TAT210多肽)的活化作用的方法涵盖在当前所述发明内。
除了成功制备针对本文所述TAT多肽的单克隆抗体之外，那些单克隆抗体中的许多已经成功的与细胞毒素偶联以用于将细胞毒素引导至表达目的TAT多肽的细胞(或组织)(在体外和在体内)。例如，针对以下本文所述TAT多肽已经成功生成毒素(例如DM1)衍生化单克隆抗体：TAT110(DNA95930)，TAT210(DNA95930-1)，TAT112(DNA96930)，TAT113(DNA215609)，TAT111(DNA188221)和TAT146(DNA233876)。如下文所示，其它有用的偶联毒素包括auristatins、MMAE和MMAF。
实施例13：使用特异抗体纯化TAT多肽
可通过蛋白质纯化领域的多种标准技术来纯化天然或重组TAT多肽。例如，使用对目的TAT多肽特异的抗体通过免疫亲和层析纯化原TAT多肽、成熟TAT多肽或前TAT多肽。通常，免疫亲和柱是通过将抗TAT多肽抗体与活化的层析树脂共价偶联而构造的。
多克隆免疫球蛋白是通过用硫酸胺沉淀或通过固定化蛋白A(PharmaciaLKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)纯化从免疫血清中制备的。同样的，单克隆抗体是通过硫酸胺沉淀或固定化蛋白A层析从小鼠腹水液体中制备的。将部分纯化的免疫球蛋白共价附着于层析树脂诸如CnBr活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)。依照制造商的说明书将抗体与树脂偶联，封闭树脂，并清洗衍生的树脂。
此类免疫亲和层析柱通过从细胞制备含可溶形式TAT多肽的级分而用于TAT多肽的纯化。此制备物是通过向全细胞或经差速离心获得的亚细胞级分中加入去污剂的溶解或通过本领域众所周知的其它方法衍生的。或者，含信号序列的可溶性TAT多肽可以有用数量分泌到培养细胞的培养基中。
使含可溶性TAT多肽的制备物流过免疫亲和柱，并在容许TAT多肽优先吸附的条件下清洗柱子(例如存在去污剂时的高离子强度缓冲液)。然后，在破坏抗体/TAT多肽结合的条件下(例如低pH缓冲液，诸如大约pH 2-3，或高浓度离液剂，诸如尿素或硫氰酸根离子)洗脱柱子，并收集TAT多肽。
实施例14：体外肿瘤细胞杀伤测定法
表达目的TAT多肽的哺乳动物细胞可使用标准表达载体和克隆技术获得。或者，表达目的TAT多肽的许多肿瘤细胞系是可公开获得的，例如通过ATCC，而且可使用标准ELISA或FACS分析进行常规鉴定。然后可将抗TAT多肽单克隆抗体(及其毒素偶联衍生物)用于测定法中以测定所述抗体在体外杀伤表达TAT多肽的细胞的能力。
例如，如上所述获取表达目的TAT多肽的细胞并分配到96孔皿中。在一项分析中，在4天的整个细胞温育期间都包括抗体/毒素偶联物(或裸抗体)。在第二项独立的分析中，将细胞与抗体/毒素偶联物(或裸抗体)一起温育1小时，然后清洗并在缺乏抗体/毒素偶联物的条件下温育4天。然后使用Promega (Cat#G7571)的CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法测量细胞存活力。未处理细胞充当阴性对照。
在一项特定的分析中，对针对TAT112(DNA96930)的单克隆抗体分析杀伤表达该多肽的细胞的能力。在一项分析中，制备了称作gD.NCA的表达载体。插入该载体的TAT112多肽编码序列由SV40启动子驱动，且该载体还包含SV40早期聚腺苷酸(poly A)信号。将gD.NCA载体与在PC3细胞中表达Neo抗性的SV40一起共转染到PC3细胞中，并在800μg/ml G418中选择阳性转化子。在96孔板中分离阳性克隆并使用如上所述制备的、称作3E6的抗TAT112单克隆抗体通过流式细胞术进行分析。挑选克隆3进行分析，因为发现它在其表面表达高水平的TAT112多肽。在第二项独立的分析中，从ATCC获取胰腺癌细胞系HpafII并用于测定法中。
在另一项特定的分析中，对针对TAT188(DNA237637)的单克隆抗体分析杀伤表达该多肽的细胞的能力。
首先，证实了裸露的抗TAT188(E16)抗体影响细胞活性的能力。
A.抗TAT188(E16)单克隆抗体刺激TAT188(E16)内在化并降低氨基酸转 运活性。
抗E16抗体与表达E16蛋白质的细胞结合引起与氨基酸转运降低平行的抗体内在化。将PC3细胞与一抗一起在存在蛋白酶体抑制剂(Sigma)时于37℃温育指定的一段时间。然后去除抗体并用PBS清洗细胞数次。用4％PFA固定细胞，然后用PBS/0.1％TritonX-100透化。用10％山羊血清封闭后，将细胞用二抗(偶联有Cy3的山羊抗小鼠IgG(Jackson immunolabs))染色并通过荧光显微镜进行分析。结果显示抗E16单克隆抗体结合在其表面表达TAT188(E16)的PC3细胞并由其内在化(见图157)。抗TAT188抗体内在化的证实强调了抗体-E16相互作用的有用特色，因为所结合抗体的内在化可导致与抗TAT188抗体偶联的毒素的摄取(见此实施例14的B和C部分)。
TAT188(E16)作为氨基酸转运蛋白的功能受到抗TAT188(E16)抗体结合的抑制。亮氨酸转运功能测定法进行如下。在24孔板中培养细胞并用抗E16抗体处理过夜。然后用温热的无Na++的Hepes-Ringer漂洗细胞并于37℃温育10分钟。将缓冲液换成200μl/孔含放射性标记氨基酸的测定缓冲液(L-[2，3-3H]-精氨酸或L-[3，4，5-3H(N)]-亮氨酸5μCi/ml，50μl于无钠的Hepes-Ringer中)。将放射性混合液于37℃温育30秒后，吸去缓冲液并将细胞用冰冷的无钠Hepes-Ringer 1ml/孔清洗4次。弄干平板并向其中加入0.2ml/孔0.2％SDS/0.2N NaOH。将来自每份样品的0.1ml裂解液等分试样用0.1ml 0.2N HCl中和，然后加入液闪混和液。使用闪烁计数器测试裂解液的([3H])放射性。图158中的结果还证实了抗E16抗体结合细胞表面E16蛋白在大约24小时后引起氨基酸转运全面降低。所述降低是由于伴随的E16多肽内在化和可用于转运功能的E16的损失造成的。
B.偶联有毒素的抗TAT188(E16)抗体与表达TAT188(E16)的细胞的结合 导致细胞杀伤
通过抗TAT188和MC-vc-PAB-MMAE的偶联来制备抗 AT188-MC-vc-PAB-MMAE
抗体提供了将细胞毒素投递至细胞的方便且高度特异性的方法，其中所述细胞相对独特的特征，诸如组织特异性(或疾病特异性或二者)表面蛋白，容许将杀伤作用靶向细胞而避免杀伤健康细胞。上文所公开的经MC-vc-PAB接头与抗体偶联的auristatin细胞毒素可用于证明E16介导的抗体-毒素偶联物内在化所导致的细胞杀伤作用。流程进行如下。使用MC-vc-PAB接头将MMAE毒素与抗TAT188抗体上的半胱氨酸残基共价连接。用过量的100mM二硫苏糖醇(DTT)处理溶于500mM硼酸钠和500mM氯化钠pH 8.0的抗TAT188。于37℃温育约30分钟后，通过Sephadex G25树脂上的洗脱更换缓冲液并用含1mM DTPA的PBS洗脱。通过溶液在280nm处的吸光度测定还原抗体浓度，并通过与DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)的反应及412nm处的吸光度测定硫醇浓度，由此检查硫醇/抗体值。使溶于PBS的还原抗体在冰上变冷。
将溶于DMSO的药物接头试剂马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-PAB-单甲基auristatin E(MMAE)，即MC-vc-PAB-MMAE用已知浓度的乙腈和水稀释，并加到变冷的溶于PBS的还原抗TAT188(E16)抗体中。约1小时后，加入过量的马来酰亚胺以淬灭反应并给任何未反应的抗体硫醇基加帽。通过离心超滤浓缩反应混合液，通过PBS中的G25树脂的洗脱对抗TAT188(E16)-MC-vc-PAB-MMAE进行纯化和脱盐，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤，并冻存。
通过抗TAT188和MC-vc-PAB-MMAF的偶联来制备抗 TAT188-MC-vc-PAB-MMAF
依照上文关于MMAE的缀合所公开的流程，通过抗TAT188(E16)和MC-val-cit-PAB-MMAF的偶联来制备抗TAT188-MC-val-cit-PAB-MMAF。MMAF是MMAE在药物的C-末端有一个苯丙氨酸的衍生物。
偶联有毒素的抗TAT188的体外细胞毒性的测定
用于此实验的偶联有毒素的3B5、12B9和12G12抗体分别制备成3B5-MC-vc-PAB-MMAE、12B9-MC-vc-PAB-MMAE和12G12-MC-vc-PAB-MMAE缀合物。抗体-毒素偶联物α-IL8-MC-vc-PAB-MMAE用作阴性对照。使PC3细胞(前列腺癌细胞系，可从ATCC获取，且在其表面内源性表达E16)和Colo205细胞(人结肠癌细胞系，可从ATCC获得，且在其表面内源性表达E16)接触浓度渐增的偶联有毒素的抗体并如上所述通过标准细胞存活力生物发光测定法(CellTiterGloTM试剂盒，Promega)监测细胞杀伤。图159A(PC3细胞)和图159B(Colo205细胞)所示结果证明了三种偶联有毒素的抗E16抗体促进对表达E16的细胞的杀伤作用。
将另一种毒素MMAF与抗体连接并测试细胞毒性。用于此实验的连接有毒素的3B5抗体指派为3B5-MC-vc-PAB-MMAE和3B5-MC-vc-PAB-MMAF。抗体-毒素偶联物α-IL8-vc-MMAE用作阴性对照。附着于每个抗体的毒素分子的平均数目大约是每个抗体4个毒素分子，如图160所示。将人结肠癌细胞系Colo205细胞以4000个细胞/孔接种到96孔板上的50μl培养基中。次日将细胞与在50μl培养基中稀释的分级浓度的3B5-MC-vc-PAB-MMAE、3B5-MC-vc-PAB-MMAF或α-IL8-vc-MMAE抗体一起温育72小时。使用CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法试剂盒(Promega)测量细胞存活力。图160所示结果证实了MC-vc-PAB-MMAE和MC-vc-PAB-MMAF偶联的抗E16抗体具有杀伤表达E16的细胞的能力，而MMAF毒素(EC50大约0.06μg/ml)提供比MMAF(EC50大约0.007μg/ml)大的细胞杀伤作用。
将本发明抗体开发成人体使用的治疗剂需要在猴和/或灵长类中进行早期毒性研究。E16氨基酸序列在物种间有变化，诸如人对猴、大鼠和小鼠E16氨基酸序列分别是96.26％、91.05％和90.66％。为了确定抗人TAT188(E16)抗体是否也能够结合并杀伤猴细胞，进行下面的体外实验。使用在其表面内源性表达猴E16的猴细胞系COS7(可从ATCC获得)。使抗E16抗体3B5、12B9和12G12接触分别内源性表达人、猴和小鼠E16的人、猴和小鼠细胞，并通过标准FACS分析进行分析。FACS显示三种抗人E16抗体3B5、12G12和12B9中的每一种结合表达人E16的猴COS7细胞(见图161A)以及表达人E16的人细胞(见图161B)，但不结合表达小鼠E16的细胞(见图161B)。因此，本发明的抗TAT188(E16)抗体可用于临床活性、功效和毒性研究。
实施例15：体外肿瘤细胞杀伤测定法
抗TAT112活性：
为了测试未偶联的抗TAT112单克隆抗体的功效，将抗TAT112抗体腹膜内注射到裸鼠中，24小时后侧腹皮下接受PC3.gD.NCA克隆3细胞(如上文实施例14所述获得)。对研究的剩余时间，每周两次继续注射抗体。每周两次测量肿瘤体积。
为了测试偶联有DM1的抗TAT112抗体的功效，将PC3.gD.NCA克隆3细胞(如上文实施例14所述获得)接种到裸鼠的侧腹中。当肿瘤达到平均体积大约100mm3时，通过每周一次或两次静脉内注射偶联有DM1的抗TAT112抗体来处理小鼠。
以上分析的结果证明了未偶联的抗TAT112以及偶联有DM1的抗TAT112抗体二者在此体内模型中高度有效的减小肿瘤体积。这些分析证明了抗TAT多肽单克隆抗体有效杀伤表达目的TAT多肽的肿瘤细胞。
抗TAT118(E16)活性：
为了测试未偶联的抗TAT188单克隆抗体，抗TAT188抗体3B5、12B9和12G12在体外杀伤细胞的功效，进行了下面的流程。将内源性表达E16的PC3细胞在背部侧腹注射到无胸腺的裸鼠(nu/nu)中。在接种细胞的当天，每周两次以2mg/kg腹膜内注射抗体。给对照小鼠注射不含抗体的PBS。对每组中的10只小鼠监测4周并每周两次测量肿瘤体积。通过同时注射肿瘤细胞和抗E16抗体，此流程测试了所施加抗体抑制异种移植物小鼠中肿瘤建立的能力。图162中的结果显示了在此实验中，平均肿瘤体积并不显著低于对照抗体。
为了测试MC-vc-PAB-MMAE和MC-vc-PAB-MMAF偶联的抗TAT188(E16)抗体的功效，将Colo205细胞接种到无胸腺裸鼠(nu/nu)的侧腹，大约1周后，当肿瘤达到平均体积大约100-200mm3时，每周一次以3mg/kg给小鼠静脉内注射偶联抗体。在含肿瘤小鼠分组的当天进行下面的抗体处理：(1)模拟对照-0.2ml或更少PBS，每周一次静脉内注射达4周；(2)抗体对照-0.2ml或更少PBS中的抗IL8-MC-vc-PAB-MMAE，每周一次静脉内注射达4周；(3)抗体-0.2ml或更少PBS中的3B5-MC-vc-PAB-MMAE，每周一次静脉内注射达4周；(4)抗体-0.2ml或更少PBS中的3B5-MC-vc-PAB-MMAF，每周一次静脉内注射达4周。测量平均肿瘤体积并对时间作图。图163中的结果显示了偶联有MMAE和MMAF的抗E16抗体在此体内模型中限制缩小肿瘤体积。这些分析证明了抗TAT多肽单克隆抗体，诸如抗188(E16)抗体有效杀伤表达目的TAT多肽诸如TAT188(E16)多肽的肿瘤细胞。
实施例16：Northern印迹分析
Northern印迹分析基本上如Sambrook et al.，同上所述进行。使用衍生自DNA231542、DNA231542-1、DNA231542-2和DNA297393的探针进行的Northern印迹分析证明了人神经胶质瘤组织中的表达较之正常人脑组织显著上调。
还使用衍生自DNA237637(TAT188，E16)的探针进行了Northern印迹分析，结果显示人乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝中的表达表明人癌中的表达较之同一组织类型的正常人组织显著上调。
实施例17：通过siRNA调控TAT表达
siRNA已经证明可用作其中传统拮抗剂诸如小分子或抗体失败的调控基因表达的研究中的工具(Shi Y.，Trends in Genetics 19(1)：9-12(2003))。长度为21到23个核苷酸的体外合成的双链RNA可起干扰RNA(iRNA)的作用，且能特异性抑制基因表达(Fire A.，Trends in Genetics 391：806-810(1999))。这些iRNA通过介导其靶RNA的降解起作用。然而，由于它们的长度低于30个核苷酸，因此它们不会触发细胞抗病毒防御机制。此类机制包括干扰素生成及宿主细胞蛋白质合成的全面停止。实践中，siRNA可人工合成，然后克隆到DNA载体中。此类载体可转染，并使之以高水平表达siRNA。高水平的siRNA表达用于“敲除”或显著降低细胞中产生的蛋白质量，因此它可用于认为蛋白质的过表达与紊乱诸如癌症有关的试验。TAT是细胞表面表达的肿瘤抗原，通过微阵列，TaqmanTM和原位杂交分析显示了TAT过表达。尽管本文中显示了抗体结合TAT诸如TAT188抑制肿瘤抗原的功能且对于偶联有毒素的抗体而言引起细胞杀伤，siRNA是通过限制所述抗原的细胞生成而其作用的有用TAT多肽拮抗剂。
实验方法和结果：TAT188(E16)
下面的实验证明了对TAT188(在本文中也称作E16)特异的siRNA降低RNA表达、蛋白质生成、细胞表面表达和蛋白质功能。可用相同或相似流程证明本发明其它TAT RNA的siRNA下调。可通过任何合适流程进行靶序列的选择(参阅例如Amarzguioui，M.and Prydz，H.，Biochem Biophys ResComm 316：1050-1058(2004))。
A.E16 siRNA的瞬时转染降低E16-GFP在PC3-E16-GFP细胞中的表达。
前列腺癌细胞系PC3由于其内源性过表达TAT188而用于此组实验。用针对TAT188(siTAT188)或核纤层蛋白的双链21聚物RNA构建物转染PC3细胞，或者模拟转染。这些构建物列举如下。
siRNA寡聚物：
TAT188(E16)
TAT188(E16)编码序列内靶区的DNA序列显示如下，随后是双链siRNA的有义和反义链的序列。
AAGGAAGAGGCGCGGGAGAAG(SEQ ID NO：155)，是用于本文中所公开的TAT188 siRNA实施例中所使用的siRNA寡聚物所靶向的TAT188编码区内的核酸序列。可依照siRNA基因沉默领域的标准实践选择其它序列作为靶标。
TAT188(E16)siRNA寡聚物：
有义：r(GGAAGAGGCGCGGGAGAAG)TT  (SEQ ID NO：156)
反义：r(CUUCUCCCGCGCCUCUUCC)TT  (SEQ ID NO：157)
核纤层蛋白siRNA寡聚物：
有义：r(CUGGACUUCCAGAAGAACA)TT  (SEQ ID NO：158)
反义：r(UGUUCUGGAAGUCCAG)TT     (SEQ ID NO：159)
(参阅Elbashir et al.，Nature 411：494-498(2001))
转染后两天，通过荧光显微镜监测EGFP荧光来分析TAT188(E16)多肽较之E16-EGFP表达敲低(knock-down)的相对水平。E16表达的降低与所检测到的EGFP生成和生物发光降低平行。图164中的结果证明了用siTAT188(E16)siRNA瞬时转染降低E16-EGFP融合表达。在图164和165中称作“GFP”的融合蛋白指将通过将E16基因克隆到pEGFP-C1载体(来自BD Clontech)中而生成的E16-EGFP融合物。
B.E16siRNA的瞬时转染降低TAT188(E16)多肽生成。
使用Western印迹分析通过E16蛋白质的减少证明了E16表达的降低。此实例中所使用的siTAT188(siE16)RNA寡聚物SEQ ID NO：156和SEQ IDNO：157及核纤层蛋白siRNA寡聚物SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159与此实施例上文A部分所示相同。转染后3天收获用E16-EGFP瞬时转染的PC3细胞，并对β-微管蛋白条带进行Western印迹以指示蛋白质负载。使用可检测标记的抗GFP抗体显现TAT188(E16)-GFP融合物的Western印迹(见图165，左泳道-模拟转染；右泳道-E16siRNA转染)。结果证明了TAT188(E16)siRNA在表达E16-GFP融合蛋白的细胞中的存在显著降低E16-GFP的表达。
C.E16 siRNA的瞬时转染抑制PC3细胞中的内源性E16氨基酸转运蛋 白活性。
以相同流程进行TAT188(E16)siRNA和核纤层蛋白siRNA(对照)的瞬时转染。使用上文所述亮氨酸转运测定法如下对测试细胞和对照细胞测试E16作为氨基酸转运蛋白的活性。图166中的结果显示了E16siRNA对E16RNA和蛋白质生成的降低作用与细胞中可用于氨基酸转运功能的E16的量的减少一致。
D.E16 siRNA的瞬时转染降低E16的表面表达。
此实施例进行如下。siRNA转染后48小时，通过FACS分析细胞。简而言之，将细胞与一抗一起在冰上保温1小时。然后用偶联有荧光染料(诸如作为非限制性实例的Cy-3或PE)的二抗标记细胞并用FACScaliberTM或FACScanTM收集数据。使用作为非限制性实例的CellquestTM(BD Clontech)或FlowJoTM(Tree Star，Inc.)分析收集的数据。如本文实施例12中所公开的，三种抗E16单克隆抗体3B5、12B9和12G12均显示出在转染TAT188(E16)siRNA后在PC3细胞上的结合减少，与存在所靶向siRNA时E16蛋白质表达减少一致(见图156)。
E.TAT188(E16)siRNA的瞬时转染抑制PC3细胞增殖。
可依照下面的商品化方案(Promega Corp.Technical Bulletin TB288；Mendoza et al.(2002)Cancer Res.62：5485-5488)测定用靶向TAT188的siRNA转染的PC3细胞的增殖。例如，将PC3细胞以3.5×105个细胞/孔分配到6孔板中。次日，使用Lipofectamin2000(Invitrogen)用终浓度100nM的双链RNA(dsRNA，SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156)或核纤层蛋白对照siRNA(使用siRNA寡聚物SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158)转染细胞。转染6小时后，将细胞再分配到96孔板中，并在图167所示时间点使用细胞计数试剂盒-8TM(Dojindo)测量细胞存活力，其中RLU＝相对发光单位。其它细胞若表达TAT188(内源性的或用编码TAT188的核酸转染后的)也可用此方法测定，包括但不限于SKBR-3、BT474、MCF7或MDA-MB-468，证明了乳癌细胞中E16表达的降低导致细胞杀伤作用且乳癌以及前列腺癌、结肠直肠癌和其它类型癌症也是使用E16表达敲低的治疗的理想靶标。
这些数据显示了siRNA可“敲低”或降低TAT蛋白质诸如TAT188(E16)蛋白的表达。所述降低表现为TAT188(E16)的RNA表达降低(在原位杂交测定法中)、蛋白质生成降低(如Western印迹分析中所示)、细胞表面表达降低(如FACS分析和内在化测定法所示)以及功能降低(如通过氨基酸转运降低所示)。siRNA在一段时间内对TAT蛋白质诸如TAT188(E16)的降低作用导致癌细胞系中细胞增殖降低。因此，siRNA可用于降低TAT蛋白质诸如TAT188(E16)。TAT蛋白质诸如TAT188(E16)水平的降低引起癌细胞系增殖的降低。由于癌症是一种细胞增殖性紊乱，因此这些结果显示了TAT多肽诸如TAT188(E16)的拮抗剂可用于降低癌细胞的生长。癌细胞生长的降低对于哺乳动物中癌症的减轻将是有用的。
实施例18：材料保藏
以下杂交瘤细胞系已保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)(ATCC)：
杂交瘤/抗体名称    ATCC编号    保藏日期
3B5.1              PTA-6193    2004年9月8日
12B9.1             PTA-6194    2004年9月8日
12G12.1            PTA-6195    2004年9月8日
此保藏是依据布达佩斯条约关于用于专利程序的微生物保藏的国际认可的规定及其(布达佩斯条约)细则进行的。这保证了从保藏之日起保持存活培养物30年。此细胞系可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech公司和ATCC之间的协议，它保证了(a)在专利申请悬而未决期间依据37CFR§1.14和35USC§122由委员决定的个人有资格获取所述培养物，及(b)在所述专利授予后对公众获取所保藏培养物的所有限制将不可撤回的取消。
本申请的受让人已同意若保藏的培养物在合适条件下培养时死亡、丢失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物的存活样本更换。所保藏细胞系的可用性并不解释为对违反任何政府的机构依据其专利法所授予的权利实践本发明的许可。
认为前述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明并不限于所保藏构建物的范围，因为所保藏实施方案意图作为本发明某些方面的单一例示，而且功能上相当的任何构建物都在本发明的范围内。本文中的材料保藏并非承认本文中所包含的书面说明不足以能够实践本发明的任何方面，包括其最佳模式，也不能解释为将权利要求的范围限制于它所描述的具体例示。实际上，根据上面的描述，除了本文所显示和描述的，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。

Claims (61)

1. 分离的抗体，其结合与下述各项具有至少80％氨基酸序列同一性的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽，缺少其相关信号肽；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，具有其相关信号肽；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域，缺少其相关信号肽；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的多肽；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的多肽。
2. 分离的抗体，其结合具有下述各项的多肽：
(a)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列；
(b)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(c)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，具有其相关信号肽序列；
(d)图79到154(SEQ ID NO：79-154)任一所示多肽的胞外域的氨基酸序列，缺少其相关信号肽序列；
(e)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或
(f)图1到78A-B(SEQ ID NO：1-78)任一所示核苷酸序列的全长编码区所编码的氨基酸序列。
3. 权利要求1的抗体，其是单克隆抗体。
4. 权利要求1的抗体，其是抗体片段。
5. 权利要求1的抗体，其是嵌合或人源化抗体。
6. 权利要求1的抗体，其与生长抑制剂偶联。
7. 权利要求1的抗体，其与细胞毒剂偶联。
8. 权利要求7的抗体，其中所述细胞毒剂选自毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
9. 权利要求7的抗体，其中所述细胞毒剂是毒素。
10. 权利要求9的抗体，其中所述毒素选自auristastin、美登木素生物碱(maytansinoid)和加利车霉素(calicheamicin)。
11. 权利要求9的抗体，其中所述毒素是美登木素生物碱。
12. 权利要求1的抗体，其在细菌中产生。
13. 权利要求1的抗体，其在CHO细胞中产生。
14. 权利要求1的抗体，其诱导其所结合的细胞死亡。
15. 权利要求1的抗体，其被可检测的标记。
16. 权利要求9的抗体，其中所述毒素选自MMAE(单甲基auristatin E)、MMAF和AEVB(auristatin E戊酰基苄腙)，及AFP(Auristatin F苯二胺)。
17. 权利要求9的抗体，其中所述毒素通过接头共价附着于抗体。
18. 权利要求17的抗体，其中所述接头选自马来酰亚胺己酰基(MC)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit，vc)、瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)、PAB(对氨基苄基氨基甲酰基)、ME(N-甲基-缬氨酸瓜氨酸)、MC(PEG)6-OH(马来酰亚胺己酰基-聚乙二醇)、SPP(N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯)、SMCC(N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)、和MC-vc-PAB。
19. 权利要求16的抗体，其中所述毒素是MMAE。
20. 权利要求16的抗体，其中所述毒素是MMAF。
21. 权利要求19或20的抗体，其中所述接头是MC-vc-PAB。
22. 权利要求1-21任一项的抗体，其中所述抗体结合TAT188多肽。
23. 权利要求22的抗体，其中所述抗体抑制表达TAT188的细胞增殖或促进其细胞死亡。
24. 权利要求23的抗体，其中所述细胞是癌细胞。
25. 权利要求24的抗体，其中所述癌细胞选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
26. 分离的抗体，其竞争与TAT188多肽的表位的结合，所述表位受到选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体结合。
27. 分离的抗体，其具有选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的生物学活性，其中所述生物学活性是在表达TAT188的细胞中抑制细胞增殖或促进细胞死亡。
28. 分离的抗体，其在相应的互补决定区(CDR)中包含如下氨基酸序列，该序列与选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的至少1、2、3、4、5或6种CDR具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。
29. 权利要求1-21任一项的抗体，其中所述抗体在相应的互补决定区(CDR)中包含如下氨基酸序列，该序列与选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的至少1、2、3、4、5或6种CDR具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。
30. 权利要求1-21任一项的抗体，其中所述抗体展现选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的生物学活性，其中所述生物学活性是在表达TAT188的细胞中抑制细胞增殖或促进细胞死亡。
31. 权利要求30的抗体，其中所述细胞是癌细胞。
32. 权利要求31的抗体，其中所述癌细胞选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
33. 抑制表达TAT188的细胞生长的方法，该方法包括使所述细胞接触权利要求1-21任一项的抗体。
34. 权利要求33的方法，其中所述细胞是癌细胞。
35. 权利要求34的方法，其中所述癌细胞选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
36. 权利要求35的方法，其中所述癌细胞是哺乳动物细胞。
37. 权利要求36的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
38. 抑制表达TAT188的细胞生长的方法，该方法包括使所述细胞接触权利要求1-21任一项的抗体，其中所述抗体在相应的互补决定区(CDR)中包含如下氨基酸序列，该序列与选自3B5.1(ATCC登录号PTA-6193)、12B9.1(ATCC登录号PTA-6194)和12G12.1(ATCC登录号PTA-6195)的杂交瘤所产生的抗体的至少1、2、3、4、5或6种CDR具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。
39. 检测测试细胞中表达的TAT188多肽相对于对照细胞的水平的方法，该方法包括：
(a)使测试细胞和对照细胞接触权利要求26的分离的抗TAT188抗体；
(b)检测所述抗体的结合；并
(c)测定该抗体与测试细胞和对照细胞的相对结合。
40. 权利要求39的方法，其中将所述测试细胞和对照细胞溶解。
41. 权利要求39的方法，其中所述测试细胞在组织中。
42. 权利要求41的方法，其中所述组织是肿瘤组织。
43. 权利要求42的方法，其中所述肿瘤组织选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
44. 检测测试细胞中TAT188多肽或与图115(SEQ ID NO：115)所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽相对于对照细胞的方法，该方法包括：
(a)使测试细胞和对照细胞接触权利要求1-5、12-15及26-28任一项的分离的抗体；
(b)检测所述抗体的结合；并
(c)测定该抗体与测试细胞和对照细胞的相对结合。
45. 权利要求44的方法，其中所述测试细胞中的TAT188多肽水平高于对照细胞中的水平。
46. 权利要求45的方法，其中所述方法诊断包含着或包含过所述测试细胞的组织中的癌症。
47. TAT结合干扰RNA(siRNA)，其结合与下述各项具有至少80％序列同一性的核酸：
(a)图37(SEQ ID NO：37)所示核苷酸序列；及
(b)(a)的互补序列，其中所述siRNA降低TAT188的表达。
48. 包含权利要求47的siRNA的表达载体。
49. 权利要求48的表达载体，其中所述siRNA与控制序列可操作连接，所
述控制序列受到用该载体转染的宿主细胞的识别。
50. 包含权利要求49的表达载体的宿主细胞。
51. 物质组合物，其包含与载体组合的：
(a)权利要求1的抗体，或
(b)权利要求47的siRNA。
52. 权利要求51的物质组合物，其中所述载体是药学可接受的载体。
53. 制品，其包括：
(a)容器；及
(b)所述容器中容纳的权利要求51的物质组合物。
54. 权利要求53的制品，还包括附于所述容器的标签或所述容器中包括的包装插页，其涉及所述物质组合物用于癌症的治疗性处理或诊断性检测的用途。
55. 抑制癌细胞生长的方法，所述癌细胞表达与图115(SEQ ID NO：115)所示氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的多肽，该方法包括使所述癌细胞接触如下siRNA，所述siRNA结合所述癌细胞中编码所述氨基酸序列的核酸序列，由此抑制所述癌细胞的生长。
56. 权利要求55的方法，其中所述核酸具有图37(SEQ ID NO：37)所示序列。
57. 权利要求44的方法，其中所述多肽的表达水平的检测包括在免疫组化分析中使用抗体。
58. 用于治疗或预防与如下多肽的表达或活性提高有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述多肽与图115(SEQ ID NO：115)所示氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性，该方法包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的TAT188多肽的拮抗剂。
59. 权利要求58的方法，其中所述拮抗剂是权利要求1-21及23-28任一项的分离的抗TAT188多肽抗体。
60. 权利要求59的方法，其中所述细胞增殖性紊乱是癌症。
61. 权利要求60的方法，其中所述癌症选自乳房、结肠、直肠、子宫内膜、肾、肺、卵巢、皮肤和肝。
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