CN101297034A

CN101297034A - Ply-gbs突变溶素

Info

Publication number: CN101297034A
Application number: CNA2006800394859A
Authority: CN
Inventors: V·A·菲谢蒂; Q·程
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 2005-08-24
Filing date: 2006-08-17
Publication date: 2008-10-29
Also published as: WO2007024628A3; ATE491026T1; EP1917355A2; ES2357626T3; DE602006018746D1; WO2007024628A2; EP1917355A4; EP2360248A1; EP1917355B1; US8105585B2; CA2620903A1; US20080221035A1; JP2009506033A

Abstract

本发明提供用于治疗多种B群链球菌(GBS)的方法，组合物和制造品。提供多种细菌溶素，包括某些PlyGBS突变溶素。尤其，提供具有针对B群链球菌(GBS)的裂解杀伤活性的PlyGBS突变溶素，包括具有比非突变PlyGBS细菌溶素更大的杀B群链球菌(GBS)活性的PlyGBS突变溶素。

Description

PLY-GBS突变溶素

技术领域

本发明涉及鉴定和使用噬菌体相关裂解酶(lytic enzyme)以迅速并特异性地检测或杀伤某些细菌，如B群链球菌(Group B streptococci，GBS)。

背景技术

B群链球菌(GBS)或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)在美国是新生儿细菌性感染的一种主要病因(Baker，C.J.和M.S.Edwards，″B群链球菌性感染，″第1091-1156页，在J.Remmington和J.O.Klein(编辑)，胎儿和新生婴儿的传染病，第五版The W.B.Saunders Co.Philadelphia，PA(2001))。GBS通常定居在人生殖道和下部胃肠道中并且可以在正常阴道式分娩期间从母亲垂直传播至婴儿。GBS病在新生儿中的常见表现包括脓毒症、脑膜炎、肺炎和关节感染。约21％的孕妇阴道内定居着GBS而显著高百分比的婴儿发生与GBS感染有关的症状。例如，脓毒症在定居有GBS的女性中每1,000例活产存在16例，而在无GBS定居的女性中每1,000例活产仅出现0.4例(Regan，J.A.，M.A.Klebanoff，R.P.Nugen和其它7位作者。1996.B群链球菌在孕妇中的定居及不利后果.Am.J.Obstet.Gynecol.174：1354-1360)。

分娩期内抗生素预防法(IAP)是疾病预防控制中心(CDC)建议的主要预防法，因为它可以有效减少新生儿的GBS定居及早期感染发作(疾病预防控制中心，″预防围产期B群链球菌性疾病：公共卫生展望，″Morbid.Mortal.Weekly Rep.45：1-24(1996)；和疾病预防控制中心，″预防围产期B群链球菌性疾病：来自CDC的修订指南，″Morbid.Mortal.Weekly Rep.51：1-22(2002))。IAP通常在分娩前4小时给予定居有GBS的孕妇以防止垂直传播。然而，在世界上存在众多地区没有对孕妇例行实施GBS培养筛查并且广泛施用抗生素可能对新生儿造成潜在威胁。抗生素耐药性是另一个主要忧虑，因为已经发现一些GBS临床分离株抵抗红霉素和克林霉素(Fernandez，M.，M.Hickman和C.J.Baker，″在1992年和1996年间从菌血症或脑膜炎患者中分离的B群链球菌的抗微生物剂敏感性，″Antimicrob.Agents Chemother.42：1517-1519(1998)；疾病预防控制中心，″预防围产期B群链球菌性疾病：来自CDC的修订指南″，Morbid.Mortal.Weekly Rep.51：1-22(2002))。因此，需要直接而有效的IAP的替代法。

一种有前途的检测及治疗病原性细菌的方法是利用噬菌体裂解酶作为溶菌剂。负责细菌宿主溶解的噬菌体裂解酶也称作溶素。多种溶素可以迅速分解细菌细胞壁以释放子代噬菌体(Young，R.1992.噬菌体溶解：机制和调节.Microbiol.Rev.56：430-481)。在结构上，溶素通常作为如此的模块式蛋白质存在，其具有赋予对肽聚糖键的酶活性的氨基端结构域和赋予对细菌细胞壁中糖类表位的结合特异性的羧基端结构域(Loessner，M.，K.Kramer，F.Ebel和S.Scherer，″单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogene)噬菌体胞壁质水解酶的羧基末端结构域决定对细菌细胞壁糖类的特异性识别和高亲和力结合，″(Mol.Microbiol.44：335-349(2002)；Lopez，R.，E.Garcia，P.Garcia和J.L.Garcia，″肺炎球菌细胞壁降解酶：产生新溶素的模块化设计？″MicroB.Drug Resist.3：199-211(1997)；Lopez，R.，M.P.Gonzalez，E.Garcia，J.L.Garcia和P.Garcia，″代表模式化改组实例的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的两种新胞壁质水解酶的生物学作用，″Res.Microbiol.151：437-443(2002)；Sheehan，M.M.，J.L.Garcia，R.Lopez和P.Garcia，″肺炎球菌噬菌体Dp-1的裂解酶：一种具有属间起源的嵌合酶，″Mol.Microbiol.25：717-725(1997))。据信溶素提供至少一种针对肽聚糖底物的下列酶活性：溶菌酶、氨基葡糖苷酶、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶和内肽酶(Young，R.，″噬菌体溶解：机制和调节″Microbiol.Rev.56：430-481(1992))。来自噬菌体的纯化溶素可以外源性地施加以引起细菌溶解(Loeffler，J.M.，D.Nelson和V.A.Fischetti，″用噬菌体细胞壁水解酶迅速杀死肺炎链球菌，″Science.294：2170-2172(2001)；Loessner，M.，G.Wendlinger和S.Scherer，″单核细胞增多性李斯特菌噬菌体中的异源内溶素：一种新类型的酶和长尾病毒裂解盒中保守穴蛋白基因的证据，″Mol.Microbiol.16：1231-1241(1995)；Loessner，M.，S.K.Maier，H.Daubek-Puza，G.Wendlinger和S.Scherer，″三种蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)噬菌体内溶素是不相关的，但显示与来自不同芽胞杆菌的细胞壁水解酶的高度同源性，″J.Bacteriol.179：2845-2851(1997)；Nelson，D.，L.Loomis和V.A.Fischetti，″通过使用噬菌体裂解酶预防和消除A群链球菌对小鼠上呼吸道的定居，″Prot.Natl.Acad.Sci.USA.98：4107-4112(2001))。

溶素通常对衍生该溶素的噬菌体所分离自的细菌物种具有极其的特异性(Fischetti，V.A.2003.控制人粘膜上病原性细菌的新方法.Ann.N.Y.Acad.Sci.987：207-214；Fischetti，V.A.2001.噬菌体抗菌药的复兴.NatureBiotechnol.19：734-735)。虽然溶素所靶向的细菌范围较之相应的噬菌体而言局限性较小，但是溶素仍维持一定程度的特异性，对其它细菌(包括共栖生物)影响极小。尽管噬菌体的宿主范围是极为有限的，仅识别其细菌宿主上的一种特异性抗原，但噬菌体溶素的局限性较小，识别特定物种的宿主细菌共有的特定糖类分子。

据信与噬菌体吸附相比，细菌对噬菌体溶素的抗性因至少两种原因而较不可能发生：首先，细菌溶解在暴露于溶素时几乎立即发生，未给细菌很多突变的机会，并且其次，溶素与选择压力下不发生突变的细菌细胞壁中高度保守的分子结合。相反，经常轻易地鉴定到针对众多抗生素的细菌抗性。此外，使用噬菌体溶素可以削减或消除伴随溶原性转换的问题，并且使用溶素可以有效地进行动物试验和治疗。

存在对有效诊断及控制细菌污染、定居和感染的疗法以及药剂的持续需求。此外，具有杀细菌作用的化合物可以用于在无生命表面和物体上去除细菌污染。所提供的噬菌体裂解酶可用于提供用于检测或杀死B群链球菌(GBS)的药剂。

发明概述

本发明涉及包含具有细菌杀伤活性的PlyGBS肽变体的细菌溶素。例如，PlyGBS肽变体可以是B群链球菌细菌具有裂解性杀伤活性的PlyGBS突变溶素，其中所述活性大于PlyGBS肽针对相同细菌的杀伤活性。

本发明公开了与PlyGBS酶(SEQ ID NO：1)的裂解活性相比，针对GBS细胞具有改良裂解活性的溶素。如由体外(in vitro)和体内(in vivo)试验所证实的，与PlyGBS蛋白质单独相比，高活性PlyGBS突变溶素可以提供针对GBS细胞的更大杀伤活性。所述溶素可以是通过在plyGBS基因上实施DNA诱变方法而从PlyGBS蛋白质裂解突变酶衍生的突变裂解酶。也可以鉴定和表征显示增加的针对GBS蛋白质的裂解活性的PolypeoPlyGBS突变酶。

PlyGBS溶素(如PlyGBS突变溶素)的杀伤活性可以通过开展以下实施例3中描述的体外细菌杀伤试验，或通过开展以下实施例4中描述的体内细菌杀伤试验予以定量。高活性PlyGBS突变体可以提供比PlyGBS(SEQID NO：1)大至少1.5倍至约40倍的对GBS细胞的裂解活性，大至少约14倍至约40倍的裂解活性或大至少约25倍至约40倍的裂解活性。高活性PlyGBS突变溶素包括选自：PlyGBS86-6(SEQ ID NO：2)、PlyGBS80(SEQID NO：3)、PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)、PlyGBS94(SEQ ID NO：8)和PlyGBS95(SEQ ID NO：9)中的那些高活性PlyGBS突变溶素。PlyGBS(SEQ ID NO：1)含有氨基端内肽酶结构域[氨基酸(aa)1-107]、中央溶菌酶结构域(aa150-394)和羧基端区域(aa 395-443)。突变体PlyGBS86-6(SEQ ID NO：2)具有一个从天冬氨酸至谷氨酸(D374E)的氨基酸改变。突变体PlyGBS80(SEQ ID NO：3)(aa 1-164)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)(aa 1-138)是因无义突变产生的终止密码子所致的截短突变体。PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)由异读框缺失作用而衍生，其缺失了plyGBS基因中的bp 424-1255并且因此编码PlyGBS的头141个氨基酸和由plyGBS基因羧基端区域(bp1256-1332)的移码所致的额外13个氨基酸(DGHALTIQSRRNG)。高活性PlyGBS突变体PlyGBS94(SEQ IDNO：8)含有氨基端内肽酶结构域(头146个氨基酸)并且与突变体PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)(头138个氨基酸)(SEQ ID NO：4)相似。在这两种突变体中观察到相似水平的裂解活性。PlyGBS95(SEQ ID NO：9)具有符合读码框的中央溶菌酶结构域缺失(aa 147至348缺失)。

还公开了某些PlyGBS突变溶素的结构。几种高活性PlyGBS突变体包括这样的截短突变体，其仅含有来自PlyGBS氨基端区域的内肽酶结构域并且为约三分之一的野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)长度。与PlyGBS相比，这些突变体可以在比活性方面具有25-40倍的增加，并且也可以具有针对几种链球菌物种的相似活性谱。PlyGBS具有两个推测的催化结构域和一个羧基端未命名的结构域。对PlyGBS突变体PlyGBS95(SEQ ID NO：9)与PlyGBS94(SEQ ID NO：8)的比较表明羧基端缺失对其特异性或对裂解活性没有显著影响。高活性PlyGBS突变体PlyGBS94(SEQ ID NO：8)、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)可以在中央区域和羧基端区域中具有截短，并且似乎与溶菌酶相似，因为它们仅具有催化结构域而无细胞壁结合性结构域。在这些突变体中存在的内肽酶结构域与近来在来自GBS噬菌体B30的另一种裂解酶PlyGBS(SEQ IDNO：1)(Pritchard，D.G.，S.Dong，J.R.Baker和J.A.Engler，″无乳链球菌噬菌体B30的双功能肽聚糖溶素，″Microbiology 150：2079-2087(2004))中所鉴定到的CHAP结构域近乎相同。然而，在这些截短突变体中该CHAP结构域本身不仅对GBS有活性，还在活性方面有超过野生型PlyGBS(SEQID NO：1)的显著增加(从25倍至40倍)。虽然CHAP结构域广泛存在于众多噬菌体溶素中，然而这些CHAP结构域中没有一个被报道过在不连接细胞壁结合性结构域时具备裂解活性。

高活性PlyGBS突变体的生物化学特征如贮藏稳定性和最适pH已经与PlyGBS(SEQ ID NO：1)的进行比较。突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)在盐浓度是50-100mM时具有最佳活性，而野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)的最适NaCl浓度是200mM左右。值得注意的是，突变体PlyGBS90-1(SEQID NO：5)维持了对所有的PlyGBS(SEQ ID NO：1)敏感链球菌物种的裂解活性，即便PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)突变体仅含有三分之一的野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)。

高活性PlyGBS突变体比PlyGBS具有更大的裂解活性并且可以以比野生型PlyGBS更快的速率杀死GBS，从而为要求时效的未来分娩期内疗法提供优势。高活性PlyGBS突变体可以作体内施用，导致GBS定居减少。例如高活性PlyGBS突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)被用于小鼠阴道模型中以测试减少体内GBS定居的效力。单剂量的PlyGBS90-1(SEQ IDNO：5)使GBS定居从处理前的5.54个log(平均每只小鼠约3.5×10⁵cfu)减少至治疗后4小时的1.68个log(每只小鼠少于50cfu)。高活性PlyGBS突变体的体内施用可以用来例如减少分娩期间的新生儿GBS感染，从而提供一种备选方法以替代分娩期内抗生素预防法。

当研究下列附图及详细描述后，本发明的其它系统、方法、特点及优点对本领域技术人员而言将是，或将变得是显而易见的。全部此类其它系统、方法、特点及优点均旨在包括在本说明书内。

附图简述

本发明可以参考以下附图和描述加以更好地理解。图中的组分不一定是按一定比例绘制的，其提供对本发明某些方面的举例说明。

图1是列出PlyGBS序列(SEQ ID NO：1)及所述多种PlyGBS突变体的序列(SEQ ID NOS：2-9)的表格。

图2是PlyGBS(SEQ ID NO：1)和具有增加的GBS细胞裂解活性的数种PlyGBS突变体的示意图。

图3是纯化的PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)(泳道1)、PlyGBS90-1(SEQID NO：5)(泳道2)及野生型PlyGBS(泳道3)的考马斯兰染色的SDS-PAGE凝胶(4-20％梯度)，蛋白质梯的分子量以千道尔顿(KDa)为单位给出。

图4是PlyGBS和数种截短突变体的示意图。

图5A是显示PlyGBS、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQID NO：4)在4℃的相对活性的图；图5B是显示在-80℃贮藏于25％甘油中的PlyGBS、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)在4℃的稳定性的图。

图6A是在不同量(2、10、50和100μg)的PlyGBS与PlyGBS90-1(SEQID NO：5)上比较PlyGBS及PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的杀伤作用的曲线图。图6B是使用相同量(约3000μg)的PlyGBS与PlyGBS90-1(SEQ IDNO：5)，比较PlyGBS及PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的杀伤作用(按体外生存力计)的曲线图。

图7是盐浓度对酶裂解活性的影响的曲线图。

图8是显示PlyGBS(SEQ ID NO：1)与PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)在体外试验中的溶素特异性的图。

图9是显示用PlyGBS(SEQ ID NO：1)或PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)控制小鼠阴道中GBS定居的图。

发明详述

所用某些术语的定义及它们在本公开中的适用性提供如下。

术语“高活性PlyGBS突变体”指在基本上相同的检验条件下与PlyGBS酶相比，针对GBS具有增强的活性的PlyGBS突变溶素。

术语“分离的”意指从起始物质中至少部分地纯化出来。

术语“纯化的”意指生物材料已经通过任何纯化方法在浓度上以可度量方式得以增加(所述纯化方法包括而不限于柱层析、HPLC、沉淀、电泳等)，因而部分地、基本上或彻底地除去杂质如在制备该材料中所涉及的前体或其它化学品。因此，均一或基本上均一(例如在分离方法如电泳或层析中产生单一的蛋白质信号)的材料包括在分离的及纯化的含义范围中。技术人员将理解所需的纯化度将取决于材料的用途。例如，意图施用至人的组合物根据管理标准一般必须是高度纯化的。

术语“由噬菌体遗传编码的裂解酶”指针对宿主细菌具有至少一些裂解活性的多肽。

“多肽”指由与天然存在的多核苷酸序列所编码的多肽对应的氨基酸组成的分子。多肽可以包括保守性置换，其中天然存在的氨基酸由具有相似特性的氨基酸替换，而此类保守性置换不改变多肽的功能(见例如Lewin″Genes V″Oxford UniversityPress第1章，第9-13页，1994)。

“天然序列的噬菌体相关裂解酶”指与源于自然界的酶具有相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列的酶可以从自然界中分离或可以通过重组或合成方法产生。术语“天然序列的酶”尤其包括酶的天然存在的形式(例如可变剪接的或修饰的形式)及天然存在的变体。在一个实例中，天然序列的酶是成熟或全长的多肽，其中所述多肽由来自对B群链球菌(GBS)特异的噬菌体的基因遗传编码。

提及一个量时所用的术语“约”包括与所述量等效的所述量的变体，例如对于预期目的或功能而言与所述量无实质性差异的量。

术语“有效量”指足以实现期望效果而不引起不想要的副作用的活性成分的量。在一些情况中，可能必需在得到期望效果和限制不想要的副作用的严重性之间达成平衡。所用活性成分的量将根据活性成分的类型和本发明组合物的预期用途而变化。

“具有变体多肽序列的噬菌体相关裂解酶”意指由对B群链球菌(GBS)或无乳链球菌特异的噬菌体遗传编码的、有功能性活性的裂解酶，与所公开的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或甚至至少99.5％的氨基酸序列同一性。

相对于本文所鉴定的裂解酶多肽序列而言的“多肽序列同一性百分数(％)”定义为：在比对序列及根据需要导入空位以实现最大序列同一性百分数，并且不将任何保守性置换视为序列同一性的部分后，候选序列中与该特定裂解酶多肽序列内的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。用于确定氨基酸序列同一性百分数的比对方法描述如下。

PlyGBS溶素

提供了具有B群链球菌(GBS)杀伤活性的噬菌体溶素。优选的噬菌体溶素是PlyGBS溶素的高活性PlyGBS突变酶及其变体，其与PlyGBS活性相比具有增强的GBS杀伤活性。具有针对GBS的杀伤活性的几种高活性PlyGBS突变体酶在下述实施例中加以鉴定并表征。其它实施例提供对其它革兰氏阳性细菌具有特异性活性的溶素，其包括所述溶素的变体及片段。

噬菌体胞壁质水解酶PlyGBS可以用来在体外和体内裂解GBS细胞，例如在Cheng，Q.等，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)中所述。PlyGBS属于可以通过消化细菌细胞壁使细胞易于发生渗透性裂解而杀死细菌的一组噬菌体溶素。例如，在小鼠模型中，单剂量的PlyGBS可以明显减少阴道和口咽中的GBS定居。施用噬菌体胞壁质水解酶如PlyGBS是分娩期内抗生素预防法的一种有前途的替代法，旨在于分娩前在孕妇中减少阴道GBS定居或旨在使新生儿的多个身体部位去污染，由此减少GBS相关的新生儿感染的发病率。

溶素通常以模块结构存在。氨基末端模块由据信能够分解某些细菌的细胞壁的催化结构域组成。往往与该催化结构域关联的酶活性是酰胺酶、内肽酶、氨基葡糖苷酶和溶菌酶。羧基末端模块由据信对靶细菌细胞壁上的糖类表位具有亲和力的结合性结构域组成。据信结合性结构域决定了溶素的特异性。

提供有效抗GBS细菌的噬菌体裂解剂，以及其相应的多肽和多核苷酸序列。包含所提供的裂解酶的组合物可以用于与所述几种类型的革兰氏阳性细菌(包括GBS细菌)有关的诊断、治疗和去污染应用。还公开了使用包含所述裂解酶、多肽或多核苷酸序列的组合物进行治疗及去污染的方法。

描述了对GBS细菌菌株显示裂解作用的高活性PlyGBS突变酶，并且尤其描述了具有针对一种或多种GBS细菌物种的杀伤活性的溶素。所述溶素包括包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同源性的多肽序列的高活性PlyGBS突变溶素。

与裂解酶作为抗细菌剂的治疗性应用有关的下列参考文献在本文中完整引用作为参考：Cheng，Q.，D.Nelson，S.W.Zhu和V.A.Fischetti，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)；Loeffler，J.M.，D.Nelson和V.A.Fischetti.2001.用噬菌体细胞壁水解酶迅速杀死肺炎链球菌.Science 294：2170-2172；Nelson，D.，L.Loomis和V.A.Fischetti.2001.通过使用噬菌体裂解酶预防和消除A群链球菌对小鼠上呼吸道的定居.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：4107-4112；和Schuch，R.，D.Nelson和V.A.Fischetti.2002.检测并杀死炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的溶菌剂.Nature 418：884-889.

PlyGBS溶素(如PlyGBS突变溶素)的杀伤活性可以通过开展以下实施例3中描述的体外细菌杀伤试验，或通过开展以下实施例4中描述的体内细菌杀伤试验予以定量。

诱变的PlyGBS突变体

参考图1中的表格，高活性PlyGBS突变溶素包括选自PlyGBS86-6(SEQ ID NO：2)、PlyGBS80(SEQ ID NO：3)、PlyGBS90-8(SEQID NO：4)、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)、PlyGBS94(SEQ ID NO：8)和PlyGBS95(SEQ ID NO：9)中的溶素。图2是PlyGBS和通过随机诱变所产生的数种突变体的示意图。PlyGBS(SEQ ID NO：1)含有氨基端内肽酶结构域[氨基酸(aa)1-107]、中央溶菌酶结构域(aa150-394)和羧基端区域(aa395-443)。突变体PlyGBS86-6(SEQ ID NO：2)具有一个从天冬氨酸至谷氨酸(D374E)的氨基酸改变。突变体PlyGBS80(SEQ ID NO：3)(aa 1-164)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)(aa 1-138)是因无义突变产生的终止密码子所致的截短突变体。PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)来自于异读框缺失，其缺失了plyGBS基因中bp 424-1255并且因此编码PlyGBS的头141个氨基酸和因plyGBS基因羧基端区域(bp 1256-1332)的移码所致的额外13个氨基酸(DGHALTIQSRRNG)。

两种高活性PlyGBS突变溶素从增变菌株大肠杆菌(E.coli)XL-1Red中得到。第一个突变体PlyGBS86-6(SEQ ID NO：2)具有导致从天冬氨酸至谷氨酸(D374E)的氨基酸改变的单点突变。PlyGBS86-6(SEQ ID NO：2)突变体具有比野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)高14倍的比活性。第二个突变体PlyGBS80(SEQ ID NO：3)在plyGBS基因中央具有导致截短分子的终止密码子(Q164终止)。PlyGBS80(SEQ ID NO：3)突变体仅含有野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)的头163个氨基酸，但是具有比PlyGBS(SEQ IDNO：1)高1.5倍的比活性。

从PCR随机诱变中鉴定出两种高活性突变体。突变体PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)与PlyGBS80(SEQ ID NO：3)相似，因为两者均是因终止密码子的引入所致的截短突变体。PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)突变体具有PlyGBS(SEQ ID NO：1)的头138个氨基酸。明显地，PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)突变体具有比野生型PlyGBS高约25倍的比活性。另一个突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)不包括plyGBS基因中的区域bp 424-1255。因此，它仅编码PlyGBS(SEQ ID NO：1)的头141个氨基酸以及因plyGBS基因羧基端区域(bp 1256-1332)的移码所致的额外13个氨基酸。该突变体具有比野生型高约40-倍的比活性。

两种高活性突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQID NO：4)使用Q-Sepharose阴离子交换层析进行纯化，并且将活性级分合并并在梯度SDS-PAGE凝胶上进行分析。如图3中所示，PlyGBS90-1(SEQID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)突变体迁移至靠近表1中所列的计算分子量(17.0、15.3KDa)的区域。图3显示纯化的PlyGBS90-8(SEQ IDNO：4)(泳道1)、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)(泳道2)及野生型PlyGBS(泳道3)的考马斯兰染色的SDS-PAGE凝胶(4-20％梯度)，蛋白质梯的分子量以千道尔顿(KDa)为单位给出

表1wt PlyGBS和两种高活性PlyGBS突变溶素的特征

PlyGBS缺失突变体

PlyGBS(SEQ ID NO：1)具有两个催化结构域，即内肽酶和溶菌酶，以及一个羧基端未命名的结构域。(Cheng，Q.，D.Nelson，S.W.Zhu和V.A.Fischetti，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005))。几个鉴定为高活性PlyGBS突变体的PlyGBS突变体是仅含有一个催化结构域但仍具有比野生型PlyGBS更高活性的截短突变体。缺失突变体基于PlyGBS的结构域组织形式进行设计。羧基端的缺失提供保留PlyGBS(SEQ ID NO：1)裂解酶的特异性和裂解活性的PlyGBS突变体。羧基端的缺失对其特异性或对裂解活性不产生实质性影响，如通过比较高活性缺失突变体PlyGBS95(SEQID NO：9)和PlyGBS94(SEQ ID NO：8)所举例说明的那样。高活性突变体(PlyGBS94(SEQ ID NO：8)，PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4))具有在中央区域和羧基端区域中的截短，并且表现出与溶菌酶相似，因为它们仅具有催化结构域而无细胞壁结合性结构域。然而，对卵清溶菌酶(Sigma，St.Louis，MO)未观察到针对GBS以及由这些截短PlyGBS突变体所靶向的其它众多细菌物种的明显裂解活性。这些突变体中存在的内肽酶结构域与近来在来自GBS噬菌体B30的PlyGBS裂解酶(SEQ ID NO：1)(Pritchard，等，″无乳链球菌噬菌体B30的双功能肽聚糖溶素，″Microbiology 150：2079-2087(2004))中鉴定的CHAP结构域相似。然而，在高活性PlyGBS截短突变体中CHAP结构域本身不仅对GBS有活性，还在活性方面有超过野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)的显著增加(从约1.5至约40倍)。虽然CHAP结构域广泛存在于众多噬菌体溶素中，然而CHAP结构域在不连接细胞壁结合性结构域时一般没有裂解活性。

图4为PlyGBS和数种截短突变体的示意图。突变体PlyGBS92(SEQ IDNO：6)仅含有中央溶菌酶结构域(aa 150-394)，而PlyGBS93(SEQ ID NO：7)具有溶菌酶结构域及羧基末端结构域(aa 150-443)。突变体PlyGBS94(SEQID NO：8)含有氨基端内肽酶结构域(aa 1-146)。为了比较，构建具有符合读码框的中央溶菌酶结构域缺失(aa 147至348的缺失)的PlyGBS95(SEQ IDNO：9)。如图4中所示，高活性PlyGBS突变体PlyGBS94(SEQ ID NO：8)含有氨基端内肽酶结构域(头146个氨基酸)并且与上文所得的突变体PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)(头138个氨基酸)相似。在这两种突变体中观察到相似水平的裂解活性。突变体PlyGBS92(SEQ ID NO：6)含有位于PlyGBS中央的推测性溶菌酶结构域，而PlyGBS93(SEQ ID NO：7)突变体含有溶菌酶结构域以及羧基端区域。与突变体PlyGBS94(SEQ ID NO：8)中存在的活性内肽酶结构域相比，这些缺失突变体均无针对GBS的任何裂解活性。还分析了含有符合读码框的中央溶菌酶结构域缺失的突变体(PlyGBS95(SEQ ID NO：9))(图4)的裂解活性。该突变体具有与突变体PlyGBS94(SEQ ID NO：8)相似的裂解活性。

PlyGBS高活性突变体的蛋白质稳定性

图5A是显示PlyGBS、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)在4℃的相对活性的图；图5B是显示PlyGBS(SEQ ID NO：1)、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQID NO：4)在-80℃于25％甘油中的稳定性的图。为得到用于图5A和图5B中的图的数据，将PlyGBS(SEQ ID NO：1)和高活性突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)以等分形式在4℃(图5A)于缓冲液中以及在-80℃(图5B)于25％甘油中贮藏。在不同时间点上，这些样品的裂解活性由体外针对GBS的裂解活性加以度量并且确定V_max值以计算相对活性。如图5A中所示，在4℃，野生型PlyGBS稳定超过40日，而对于相同时间段而言突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)仅分别保留25％和31.2％的活性，并且在60日几乎丧失活性。然而，当这些蛋白质贮藏在-80℃于25％甘油中(图5B)时，则全部3种蛋白质至不超过40日具有较好的稳定性谱，且在60日活性丧失较少。

PlyGBS与高活性PlyGBS突变溶素的裂解活性比较

图6A和图6B的曲线图显示，使用不同量的PlyGBS(SEQ ID NO：1)与突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)(2、10、50和100μg)在体外试验中通过确定V_max而测量裂解活性从而比较PlyGBS及PlyGBS90-1(SEQ IDNO：5)的杀伤作用。为得到图6A中所示的试验结果，在体外试验中使用不同量(2、10、50和100μg)的PlyGBS(SEQ ID NO：1)和PlyGBS90-1(SEQ IDNO：5)并且通过分光光度计监测OD₆₀₀的减少。将裂解活性表示为吸光度随时间而减少的初始速率(-mOD₆₀₀/分钟)。如图6A中所示，V_max在使用100μg野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)时仅是-22.8mOD₆₀₀/分钟，而对于10μg及100μg的突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)，V_max值分别是-60.5和-266.5mOD₆₀₀/分钟。V_max度量OD₆₀₀下降的初始速率，即细胞裂解的速率，并且有可能在使用100μg高活性突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)时被低估，因为细胞裂解发生得太迅速以至于在这种条件下无法准确地被测量。

突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的效力在体外细胞生存力试验中得到测试。为得到图6B中所示的试验结果，在体外生存力试验中使用相同量的PlyGBS(SEQ ID NO：1)和PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)(约3,000μg)。如图6B中所示，细胞生存力在与突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)温育60分钟后减少约6个log，而对于野生型PlyGBS，经过相同时间仅降低2个log。在10分钟温育时，对于突变体而言细胞生存力减少3个log而对于野生型而言细胞生存力减少小于1个log。这些结果表明突变酶具有显著增加的针对GBS的裂解活性。

PlyGBS溶素的溶素活性可以受到盐浓度影响。为得到图7曲线图中所示的结果，PlyGBS(SEQ ID NO：1)和突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的裂解活性在0至500mM的多种NaCl盐浓度上进行测量。图7是显示盐浓度对PlyGBS(SEQ ID NO：1)和PLYGBS90-1(SEQ ID NO：5)突变体的裂解活性的影响的曲线图。为得到图7中所示的数据，将纯化的PlyGBS(SEQ ID NO：1)和PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)对2mMTris-HCl(pH7.4)透析过夜并且添加不同量的5M NaCl以提供用于体外活性试验的所需盐浓度。将在PlyGBS(SEQ ID NO：1)或PlyGBS90-1(SEQ IDNO：5)的最适盐浓度下的最高裂解活性视为100％作为标准用于计算相对活性。如图7中所示，野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)的最适NaCl浓度是约200mM，而突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的最适NaCl浓度迁移至约50-100mM。在图7中显示的结果表明，尽管野生型PlyGBS(SEQ IDNO：1)酶与PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)突变体相比在更宽泛的盐浓度范围上保持活性，然而突变体对这些改变是更敏感的。当突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的pH活性曲线与野生型PlyGBS(SEQ IDNO：1)的pH活性曲线相比较时，两种曲线均在pH 5.0上具有峰值。

使用相同量的溶素，将突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)溶素的活性谱与野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)溶素的活性谱比较。PlyGBS(SEQ IDNO：1)具有针对众多链球菌群和物种，如化脓性链球菌(S.pyogenes)(GAS)，马链球菌(S.equi)(GCS)和唾液链球菌(S.salivarius)的相对广泛的活性谱(Cheng，Q.，D.Nelson，S.W.Zhu和V.A.Fischetti，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)，在本文中完整引用作为参考)。图8是比较PlyGBS(SEQ IDNO：1)和PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的溶素特异性的图。为得到图8中所示的数据，在体外试验中使用相同剂量的PlyGBS或PlyGBS90-1(SEQ IDNO：5)(40U)，并且裂解活性表示为-mOD₆₀₀/分钟。令人吃惊的是，两种酶针对GBS及唾液链球菌(图8)以及一些其它链球菌物种具有相似水平的裂解活性(V_max)。还测试了其中野生型PlyGBS(SEQ ID NO：1)酶几乎无活性至完全无活性的其它细菌物种(即，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡状芽孢杆菌)，并且PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)突变酶，除了与蜡状芽孢杆菌一起发现小量活性外，展示出相似的特异性模式(图8)。使用我们其它的截短突变体中的一些，如PlyGBS80(SEQ ID NO：3)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)，观察到相似结果，这些突变体针对蜡状芽孢杆菌显示出一些杀伤作用。

纯化的突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)制品如在下文实施例及在Cheng，Q.，D.Nelson，S.W.Zhu和V.A.Fischetti，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)中所述，检验其在小鼠阴道模型中的针对GBS的裂解活性。图9的体内试验结果说明，用PlyGBS(SEQ ID NO：1)或PlyGBS90-1(SEQID NO：5)可以控制小鼠阴道中GBS的定居。为得到图9中所示的数据，小鼠在用β-雌二醇戊酸酯同步化后用GBS做阴道定居。在接种GBS后1日，将3组小鼠用缓冲液(n＝10)或1,500μgPlyGBS(SEQ ID NO：1)(n＝10)或1,500μgPlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)(n＝10)处理。每只小鼠在处理前取阴道拭子(0-小时样品)及在处理后以2-至4-小时间隔(2-和4-小时样品)取阴道拭子。将阴道拭子的菌落计数对相同组内的每个时间间隔进行平均并作图。误差棒代表平均值的标准误差。如9图中所示，与缓冲液对照相比，用突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)处理的小鼠显示统计学显著的GBS下降(从处理前的5.54个log至处理后4小时以后的平均值1.68个log)(p＜0.0001)。野生型PlyGBS导致GBS从5.38个log下降至处理后4小时以后的平均值2.28个log。统计学分析表明突变体PlyGBS90-1在处理后4小时比PlyGBS显示出更有效地减少GBS定居(p＝0.0037)。因此，突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)显示可以更有效地减少GBS的定居。

变体多肽

除了由SEQ ID NO：1的多肽序列编码的溶素外，本公开还提供某些变体多肽，包括其片段及具有某些置换的多肽。变体多肽可以是高活性PlyGBS突变溶素。例如，变体多肽是选自：PlyGBS86-6(SEQ ID NO：2)、PlyGBS80(SEQ ID NO：3)、PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)、PlyGBS90-1(SEQID NO：5)、PlyGBS94(SEQ ID NO：8)和PlyGBS95(SEQ ID NO：9)中的高活性PlyGBS突变溶素。所公开的蛋白质或肽的修饰或改变的形式及肽片段包括化学合成的或通过重组DNA技术制备的或通过这两种方法而产生的蛋白质或肽和肽片段。这些技术包括例如嵌合和改组。当蛋白质或肽通过化学合成产生时，优选它基本上不含化学前体或其它化学品，即它与参与合成该蛋白质的化学前体或其它化学品相分离。因此，此类蛋白质制品具有少于约30％、20％、10％、5％(干重)的非目的多肽的化学前体或化合物。

″具有变体多肽序列的噬菌体相关裂解酶″可以是与所公开的全长天然序列裂解酶的多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的活性裂解酶多肽。此类裂解酶多肽变体包括例如这样的裂解酶多肽，其中在全长天然氨基酸序列的氨基端或羧基端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。裂解酶多肽变体将与如下序列具有至少约80％氨基酸序列同一性，并且可以具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸序列同一性，其中所述序列是天然序列的裂解酶的全长多肽序列、缺少信号肽的裂解酶多肽序列、裂解酶多肽的胞外结构域(有或没有信号肽)或如所公开的全长裂解酶多肽序列中的任何其它具体限定的片段。裂解酶变体多肽可以是至少约10个氨基酸长度、经常是至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或300个氨基酸长度或更长。

此类噬菌体相关裂解酶变体包括例如这样的裂解酶多肽，其中在SEQID Nos.1-9的序列的氨基或羧基末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。在一个实例中，在所述序列或序列部分中的任何位置上发生一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加。

相对于鉴定的噬菌体相关裂解酶序列而言的“氨基酸序列同一性百分数”定义为：在于相同读码框中比对序列及根据需要导入空位以实现最大序列同一性百分数并且不将任何保守性置换视为序列同一性的部分后，候选序列中与噬菌体相关裂解酶序列内的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。旨在确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以用本领域技术人员已知的多种方法实现，例如使用公众可获得的计算机软件，如blast软件。

旨在确定氨基酸序列同一性百分数的多肽比对可以用本领域技术人员已知的多种方法实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定适宜的参数用于测量比对、包括需要用于在所比较的序列的全长上实现最大比对的任何算法。

氨基酸序列同一性百分数值也可以如下所述通过使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul等，Methods in Enzymology 266：460-480(1996))得到。大部分的WU-BLAST-2检索参数设置成默认值。将未设置成默认值的检索参数设置成下列值：重叠范围(overlap span)＝1，重叠分数(overlapfraction)＝0.125，字阈值(T)＝11和记分矩阵＝BLOSUM62。当使用WU-BLAST-2时，如此确定氨基酸序列同一性百分数值，即用由WU-BLAST-2在目的裂解酶多肽(具有源于天然裂解酶多肽的序列)的氨基酸序列与目的比较氨基酸序列(即与目的裂解酶多肽正在比较的，可能是裂解酶变体多肽的序列)间确定的匹配的相同氨基酸残基数(a)除以目的裂解酶多肽的氨基酸残基总数(b)。例如在陈述“包含与氨基酸序列B具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”中，氨基酸序列A是目的比较氨基酸序列而氨基酸序列B是目的裂解酶多肽的氨基酸序列。

氨基酸序列同一性百分数也可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可以从http://www.ncbi.nlm.nih.gov.下载。NCBI-BLAST2使用几个检索参数，其中这些检索参数全部设置成默认值，包括例如，不遮蔽(unmask)＝是，链＝全长，预期发生率(expectedoccurrences)＝10，最小低复杂性长度(minimumlow complexitylength)＝15/5，多途径e值(multi-pass e-value)＝0.01，多途径常数(constantfor multi-pass)＝25，针对最终空位比对的减少(dropoff for final gappedalignment)＝25和记分矩阵＝BLOSUM62。

在NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、基于或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸同一性百分数(其可以备选地被表述为与、基于或相对于对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性百分数的给定氨基酸序列A)按如下进行计算：

100乘以分数X/Y，

其中X是由序列比对程序NCBI-BLAST2在该程序比对A与B中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中的氨基酸残基总数。将理解的是当氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B而言的氨基酸序列同一性百分数将不等于B相对于A而言的氨基酸序列同一性百分数。

溶素片段

在一些实例中，提供所述溶素，包括多肽序列如SEQ ID NO：1或其所述变体，的生物活性片段。变体多肽包括高活性PlyGBS突变溶素。变体多肽可以是选自：PlyGBS86-6(SEQ ID NO：2)、PlyGBS80(SEQ IDNO：3)、PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)、PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)、PlyGBS94(SEQ ID NO：8)和PlyGBS95(SEQ ID NO：9)中的高活性PlyGBS突变溶素。“片段”可以包括具有如下氨基酸序列的变体多肽，其中所述的氨基酸序列与前述多肽的氨基酸序列的部分而非全部是完全相同的。片段可以是“独立存在”的(free-standing)或包含在更大的多肽中形成其中的一个部分或区域，最优选地作为单个连续区域包含在单个更大的多肽中。

如所述，示例的蛋白质或肽片段的生物活性部分包括包含与本公开的噬菌体蛋白质的氨基酸序列足够相同或从其中衍生的氨基酸序列的多肽，该多肽包括比噬菌体蛋白质的全长蛋白质少的氨基酸并显示相应全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本公开中的蛋白质或蛋白质片段的生物活性部分可以是例如10、25、50、100个左右氨基酸长度的多肽。此外，在其中缺失或添加了蛋白质的其它区域的其它生物活性部分可以通过重组技术予以制备并基于多肽的天然形式的一种或多种功能性活性进行评价。

片段可以包括例如这样的截短多肽，其具有与天然结合区或变体中至少50个氨基酸长度的区域相对应(例如50％序列同一性、至少60％、至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少95％序列同一性、至少97％序列同一性或至少或甚至98％序列同一性)的氨基酸序列部分，如包括氨基端的一系列连续残基或包括羧基端的一系列连续残基。也提供多肽在宿主细胞中的降解形式。还提供由结构性或功能性属性所表征的片段，如包含α-螺旋和α-螺旋形成区、β-折叠和β-折叠形成区、转角和转角形成区、无规卷曲和无规卷曲形成区、亲水区、疏水区、α两亲性区、β两亲性区、柔性区、表面形成区、底物结合区和高抗原系数区的片段。

还提供对GBS细菌具有至少10⁶、10⁷、10⁸或10⁹的结合活性的片段，包括具有相似活性或改良活性或具有减少的不想要活性的片段。还有利的是结合位点与可检测标签或杀细菌标签的缀合物，其中所述的可检测标签或杀细菌标签赋予想要的临床功能，所述结合区与细菌细胞壁特异性结合。

作为本公开多肽的片段的变体可以用于通过肽合成方式产生对应的全长多肽；因此，这些变体可以作为用于产生本公开的示例全长多肽的中间体加以使用。

裂解酶肽片段可以通过众多常规技术中的任何技术制备。所需的肽片段可以化学地合成。备选方法包括通过酶消化产生裂解酶片段，例如用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或用合适的限制酶消化DNA并分离所需要的片段。再一种适用技术涉及分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码所需多肽片段的DNA片段。界定DNA片段的所需末端的寡核苷酸用作PCR中的5′引物和3′引物。优选地，裂解酶多肽片段与公开的天然裂解酶多肽共有至少一种生物活性和/或免疫学活性。

本公开多肽的编码序列的片段文库可以用来生成多样化的一群多肽以筛选并随后选择变体。例如，可以如此产生编码序列片段的文库，即通过用核酸酶在每分子仅发生大约一次切割的条件下处理目的编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性以形成可能包括来自不同的带切割产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理而从再形成的双链体中除去单链部分，并且将得到的片段文库连接到表达载体中。通过这种方法，可以产生编码目的蛋白质的各种大小的氨基末端片段和中间片段的表达文库。数种技术在本领域中已知可以用于筛选由点突变或截短作用产生的组合文库的基因产物，及用于筛选cDNA文库以寻找具有所选择的特性的基因产物。易于实施高通量分析操作的、最广泛用来筛选庞大基因文库的技术一般包括将基因文库克隆到复制型表达载体中，用得到的载体文库转化适宜的细胞并在检测期望的活性有利于分离载体的条件下表达组合性基因，其中所述的载体编码其产物得以检测的基因。递归集合诱变(Recursive ensemble mutagensis)(REM)(一种提高文库中功能性突变体出现频率的技术)可以与筛选试验组合使用以鉴定本公开蛋白质的变体(Arkin和Yourvan，1992，PNAS 89：7811-7815；Delgrave等，1993，proteinEngineering 6(3)：327-331)

蛋白质或肽片段的免疫活性部分可以包括能与识别所述噬菌体酶的抗体相结合的区域。在本上下文中，蛋白质(或编码该蛋白质的核酸)的最小部分可以是可识别的特异于产生溶素蛋白质的噬菌体的表位。因此，可以预期结合抗体并且有用的最小多肽(和编码该多肽的相关核酸)可以是8、9、10、11、12、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、85或100个氨基酸长度。虽然短至8、9、10、11、12或15个氨基酸长度那样的小序列可靠地包含足够充当表位的结构，不过5、6或7个氨基酸长度的更短序列在一些情况下可以显示表位结构并且具有价值。因此，SEQID No.1所述的蛋白质的最小部分可以包括长度短至5、6、7、8、9或10个氨基酸的多肽。

如技术人员将理解的，可以制备与此类小蛋白质和/或核酸(或较大分子中的蛋白质和/或核酸区域)具有相同功能的同源性蛋白质和核酸。可能同源的此类小分子及较大分子中的短区域特别旨在作为实例，而不构成限制。与SEQ ID No.1相比，此类有价值的区域的同源性可以是至少50％、65％、75％、85％、至少90％、95％、97％、98％或至少99％。这些同源性百分数值不包括因保守性氨基酸置换所致的改变。

所述的表位可以用来产生抗体并且也可以用来检测与识别溶素蛋白质的分子的结合。另一个实例是可以通过利用表位如通过常规免疫作用或噬菌体展示法(其中表位可以用来筛选潜在结合物文库)而产生的分子，如抗体或其它特异性结合物。此类分子识别溶素蛋白质或编码溶素蛋白质的核酸中的一个或多个表位。识别表位的抗体可以是单克隆抗体、人源化抗体或抗体蛋白的部分。期望地，识别表位的分子对此表位具有特异性结合，结合强度为该分子对血清白蛋白的结合强度的至少10倍。可以用亲和力(Km)度量特异性结合作用。该特异性结合可以比在相同条件下对血清白蛋白的结合高至少10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或甚至更高。

在一个实例中，抗体或抗体片段以可以用来检测溶素蛋白质存在的形式存在。如技术人员所理解的，抗体或抗体片段的多种形式和其合成方法是已知的。抗体可以与报道分子或原子如荧光剂、产生光学信号的酶、化学发光团、微粒或放射性原子缀合(共价性复合)。抗体或抗体片段例如，可以在免疫动物后得以在体内合成。抗体或抗体片段可以在遗传重组后由细胞培养物合成。抗体或抗体片段可以通过细胞合成和化学修饰的组合加以制备。

变体多肽

置换性变体是其中氨基酸序列内的至少一个残基已经被除去并在其位置中插入不同残基的那些变体。当期望细微调节蛋白质特征时，此类置换可以根据下表2产生。表2显示可以用于替换蛋白质中的原始氨基酸并被认为是保守性置换的氨基酸。

表2

在功能或免疫学身份上的实质性改变通过选择比表2中的置换具有更低保守性的置换而产生，即选择这样的残基，其在维持(a)置换区中多肽主链的结构例如折叠或螺旋构象；(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链体积上的作用更显著地不同。通常预期可以在蛋白质特性上产生最大改变的置换是这样的置换，其中(a)亲水残基例如丝氨酰基或苏氨酰基被置换成(或为)疏水残基例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸被置换成(或为)任何其它残基；(c)具有电正性侧链的残基例如、赖氨酰、精氨酰或组氨酰被置换成(或为)电负性残基例如、谷氨酰基或天冬氨酰基；或(d)具有大体积侧链的残基例如苯丙氨酸被置换成(或为)没有侧链的残基如甘氨酸。

对于裂解蛋白质的衍生物，这些氨基酸置换或缺失或添加的作用可以通过分析衍生性蛋白质弥补噬菌体在感染的细菌宿主中所显示出的对DNA交联剂敏感的能力而进行评估。这些试验可以通过将编码衍生性蛋白质的DNA分子转染至如上所述的细菌中而进行。

在裂解酶多肽的功能或免疫学身份方面的实质性修饰通过选择如下置换得以实现，其中所述的置换在维持(a)置换区域中多肽主链的结构例如折叠或螺旋构象；(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链体积上的作用有明显不同。天然存在的残基基于共同的侧链特性分成下列组：

(1)疏水：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水：cys、ser、thr；

(3)酸性：asp、glu；

(4)碱性：asn、gin、his、lys、arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；和

(6)芳香族：trp、tyr、phe。

非保守性置换可能需要将这些组中一个组的成员与另一个组的成员交换。此类置换的残基也可以导入保守性置换位点，或导入剩余(非保守)位点。

多肽变体可以使用本领域已知的方法如寡核苷酸介导的(位点定向)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变产生。位点定向诱变[Carter等，Nucl.AcidsRes.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]、盒式诱变[Wells等，Gene，34：315(1985)]、限制选择诱变(restriction selectionmutagenesis)[Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986)]或其它已知技术可以在克隆的DNA上开展以产生裂解酶变体DNA。

扫描氨基酸分析也可以用来沿连续序列鉴定一个或多个氨基酸。例如，扫描氨基酸可以是相对小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸一般是这个组中优选的扫描氨基酸，因为它消除超出β-碳的侧链并且较不可能改变变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science.244：1081-1085(1989)]。一般优选丙氨酸还因为它是最常见的氨基酸。此外，常常在隐蔽和暴露的位置内均发现存在丙氨酸[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.150：1(1976)]。若丙氨酸置换未产生足够数量的变体，则可以使用等构(isoteric)氨基酸。

嵌合性融合蛋白

在一些实例中，溶素也可以受到修饰以形成嵌合分子，即，该分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的裂解酶。“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与异源多肽有效连接(operably linked)的本公开多肽的全部或(例如生物活性)部分。嵌合蛋白或肽例如通过组合具有两个或多个活性中心的两种或多种蛋白质而产生。嵌合蛋白和肽可以独立地对相同或不同分子产生作用，并且因此具有同时治疗两种或多种不同细菌性感染的潜力。嵌合蛋白和肽也可以用来通过在一个以上位置切割细胞壁而治疗细菌性感染。

在一个实例中，此类嵌合分子包含裂解酶与提供表位的标签多肽的融合，其中抗标签抗体可以与所述表位选择性结合。表位标签通常置于裂解酶的氨基末端或羧基末端。此类带表位标签形式的裂解酶的存在可以使用针对标签多肽的抗体检测。另外，表位标签的提供能够使裂解酶可以通过使用抗标签抗体或另一种可与表位标签结合的亲和基质经亲和纯化方式而方便地纯化。多种标签多肽和它们对应的抗体是本领域众所周知的。实例包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988)]；c-myc标签和针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan等，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985)]和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等，Protein Engineering：(6)：547-553(1990)]。其它标签多肽包括Flag-肽[Hopp等，BioTechnology，6：1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science 255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991))和T7基因10蛋白质肽标签(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990)]。

在备选实例中，嵌合分子可以包含裂解酶与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合。对于双价形式的嵌合分子(也称作“免疫黏附素”)，此类融合可以是与IgG分子的Fc区域的融合。Ig融合可以包括可溶性(跨膜结构域缺失或失活)形式的裂解酶多肽代替Ig分子内至少一个可变区的置换。免疫球蛋白融合物可以包括IgG1分子的铰链、CH2及CH3，或铰链、CH1、CH2及CH3区。对于免疫球蛋白融合物的产生，还见1995年7月27日授予的美国专利号5,428,130。

在另一个实例中，嵌合蛋白或肽含有在其氨基末端的异源信号序列。例如，本公开的多肽的天然信号序列可以被移去并用来自另一种蛋白质的信号序列替换。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可以用作异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology，编者Ausubel等，JohnWiley & Sons，1992，本文中引用作为参考)。真核异源信号序列的其它实例包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。在又一个实例中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等，同上)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jersey)。

有用的融合蛋白的另一个实例是其中本公开的多肽与GST序列的羧基端融合的GST融合蛋白。此种嵌合蛋白可以促进本公开的重组多肽的纯化。

另一个实例显示这样的免疫球蛋白融合蛋白，其中本公开多肽的全部或部分与从免疫球蛋白的蛋白质家族成员中衍生的序列融合。免疫球蛋白融合蛋白可以掺入药物组合物并施用至受试者以抑制(可溶性或膜结合的)配体与细胞表面上的蛋白质(受体)之间的相互作用，以便由此抑制体内信号传导。免疫球蛋白融合蛋白可以改变本公开多肽的关连配体的生物利用率。抑制配体/受体相互作用可能治疗性地用于治疗细菌相关性疾病以及紊乱，以及用于调节(即促进或抑制)细胞存活。此外，本公开的免疫球蛋白融合蛋白可以作为免疫原用于在受试者中产生针对本公开多肽的抗体、用于纯化配体以及用于筛选试验中以便鉴定抑制受体与配体相互作用的分子。本公开的嵌合及融合蛋白和肽可以通过标准重组DNA技术产生。

在另一个实例中，融合基因可以由常用技术(包括自动化DNA合成仪)合成。备选地，可以使用锚定引物实施基因片段的PCR扩增，其中所述的锚定引物在两个连续基因片段间造成互补性突出端，这两个片段随后可以退火并再扩增以产生嵌合基因序列(见Ausubel等，同上)。此外，已经编码融合部分(如GST多肽)的众多表达载体是可商业获得的。编码本公开多肽的核酸可以克隆至此种表达载体中，以至于融合部分与本公开的多肽以符合读码框方式连接。

与信号序列的组合

多肽的信号序列可以利于本公开的蛋白质和肽及肽片段进入和离开黏膜的跨膜移动，以及利于分泌性蛋白质或其它目的蛋白质的分泌和分离。信号序列一般以疏水氨基酸核心为特征，其通常在分泌期间在一个或多个切割事件中从成熟蛋白质上切除。此类信号肽含有在成熟蛋白质通过分泌途经时允许从成熟蛋白质上切除信号序列的加工位点。所述的多肽可以还包括信号序列，以及涉及信号序列本身和无所述信号序列的多肽(即切割产物)。在一个实例中，编码本公开信号序列的核酸序列可以在表达载体中与目的蛋白质(如通常不分泌或否则难以分离的蛋白质)有效连接。信号序列指导蛋白质的分泌，如从其中转化了表达载体的真核宿主中分泌，并且信号序列随后或同时地得到切除。蛋白质可以随后从胞外介质中通过本领域已知的方法方便地进行纯化。备选地，信号序列可以与目的蛋白质通过使用促进纯化的序列，如用GST结构域而连接。

在另一个实例中，信号序列可以用来鉴定调节序列，即启动子、增强子、阻遏物。因为信号序列是肽的氨基最末端序列，预期在信号序列的氨基端侧翼存在的核酸将是影响转录的调节序列。因此，编码信号序列的全部或部分的核苷酸序列可以用作探针以鉴定和分离信号序列及其侧翼区，并且可以研究该侧翼区以鉴定其中的调节元件。本公开的多肽的变体可以具有改变的氨基酸序列并且可以作为激动剂(模拟物)或作为拮抗剂发挥作用。变体可以通过诱变即不连续点突变或截短而产生。激动剂可以保留与天然形式的蛋白质基本上相同的活性或保留其中的部分活性。蛋白质的拮抗剂可以通过例如与包括目的蛋白质在内的细胞信号级联的下游成员或上游成员竞争性结合，而抑制天然存在形式的蛋白质的一种或多种活性。因此，可以通过用具有有限功能的变体处理而引发特定的生物学效应。用具有天然形式的蛋白质的部分生物活性的变体治疗受试者可以相对于用天然形式的蛋白质的治疗在受试者中产生较少副作用。作为激动剂(模拟物)或作为拮抗剂发挥作用的本公开蛋白质的变体可以通过在突变体(即本公开的蛋白质的截短突变体)的组合文库中筛选激动剂或拮抗剂活性而鉴定。在一个实例中，多样化的变体文库通过在核酸水平上的组合诱变而产生并由该多样化基因文库编码。多样化变体文库可以通过例如将合成性寡核苷酸混合物用酶连接成基因序列而产生，由此一组简并的潜在蛋白质序列可以以独立多肽的形式或备选地以一组更大的融合蛋白(例如对于噬菌体展示)的形式表达。存在多种方法可以用来从简并性寡核苷酸序列中产生本公开多肽的潜在变体文库。用于合成简并性寡核苷酸的方法是本领域已知的(即见Narang，1983，Tetrahedron 39：3；ltakura等，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；ltakura等，1984，Science 198：1056；Ike等，1983，Nucleic Acid Res.11：477，全部文献均在此引用作为参考)

改组的酶

某些实例提供改组的蛋白质或肽，其包含一种或多种公开的裂解酶肽或变体、一种以上的相关噬菌体蛋白质的基因产物或肽、或蛋白质肽片段被随机地切割并重新组装成更有活性或特异性的蛋白质。选择或筛选改组的寡核苷酸、肽或肽片段分子以便鉴定具有所需的功能性特点的分子。这种方法例如在Stemmer美国专利号6,132,970(改组多核苷酸的方法)；Kauffman美国专利号5,976,862(经基于密码子的合成的进化)和Huse美国专利号5,808,022(直接的密码子合成)中描述。这些专利的内容在此引用作为参考。使用改组可以产生活性比模板蛋白质高10-100倍的蛋白质。模板蛋白质在各种不同的溶素或穴蛋白质当中选择。改组的蛋白质或肽例如由一个或多个结合性结构域和一个或多个催化结构域构成。每个结合性结构域或催化结构域从相同或不同的噬菌体或噬菌体蛋白质中衍生。改组的结构域是基于寡核苷酸的分子，如基因或基因产物，其可单独地或与其它基因或基因产物组合地被翻译成肽片段，或它们是基于肽的分子。基因片段包括DNA、RNA、DNA RNA杂交体、反义RNA、核酶、EST、SNIP和其它基于寡核苷酸的分子中的任何分子，其单独地或与其它分子组合地产生能够或不能够被翻译成肽的核苷酸分子。

多肽的共价修饰

其它实例提供对裂解酶或其片段或变体的共价修饰。一种类型的共价修饰包括使裂解酶多肽的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应(其中所述的有机衍生化试剂能够与选定的侧链反应)，或裂解酶的氨基末端或羧基末端残基用双功能试剂衍生化，这可以用于例如将裂解酶交联于水不溶性支持基质或表面以便在用于纯化抗裂解酶抗体的方法中使用，或反之亦然。常见使用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮基水杨酸的酯、同双功能亚胺酸酯类，包括双琥珀酰亚胺基酯如3，3′-二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷和试剂如3-[(对-叠氮基苯基)二硫基]丙亚氨酸甲酯。

其它修饰包括谷氨酰氨酰基及天冬酰氨酰基残基的脱酰胺化分别至对应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基、脯氨酸和赖氨酸的羟化、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基基团的甲基化[T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86页(1983)]、氨基端胺的乙酰化和任何羧基端羧基基团的酰胺化。

提供的另一种对裂解酶多肽的共价修饰包括改变多肽的天然糖基化模式。为本文的目的，改变天然糖基化模式意指(通过除去糖基化所基于的糖基化位点或通过化学方法和/或酶方法消除糖基化)消除裂解酶天然序列中存在的一个或多个糖部分，和/或添加裂解酶天然序列中不存在的一个或多个糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白质的糖基化的性质改变，包括改变存在的多种糖部分的性质和比例。

向裂解酶多肽添加糖基化位点可以通过改变氨基酸序列而进行。这种改变可以通过例如在裂解酶天然序列中添加或置换一个或多个丝氨酸残基或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)而产生。裂解酶的氨基酸序列可以任选地通过在DNA水平上的改变而变更，尤其是在预先选择的碱基处使编码裂解酶多肽的DNA突变以产生将翻译成所需的氨基酸的密码子。

另一种增加裂解酶多肽上的糖部分数目的方法是将糖苷以化学方式偶联或以酶方式偶联至多肽上。此类方法在本领域中有描述，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.第259-306页(1981)。

裂解酶多肽上存在的糖部分的除去可以用化学方式或酶方式进行或通过突变性置换编码充当糖基化靶的氨基酸残基的密码子而进行。化学去糖基化技术是本领域已知的并且例如由Hakimuddin，等Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)及由Edge等，Anal.Biochem.，118：131(1981)描述。多肽上糖部分的酶法切除可以通过利用多种内切糖苷酶及外切糖苷酶实现，如Thotakura等，Meth.Enzymol.，138：350(1987)所述。

另一种对裂解酶的共价修饰包含将裂解酶多肽与多种非蛋白聚合物中的一种(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式连接。

穴蛋白质

细菌溶素可以任选地包含穴蛋白质或与之组合进行施用。穴蛋白质可以例如与一种或多种裂解酶肽或变体或其片段组合进行施用。穴蛋白质在细胞膜中产生孔洞，也可以加以利用。穴蛋白质或“穴蛋白”可以形成致死性膜损伤。如同裂解蛋白质，穴蛋白质由噬菌体编码并携带。大部分穴蛋白质的序列短并且在性质上是整体疏水的，带高度亲水性的羧基端结构域。在许多情况下，推测的穴蛋白质按不同的读码框编码在噬菌体的酶活性结构域中。在其它情况中，穴蛋白质在与编码细胞壁裂解蛋白质的DNA毗邻或接近的DNA上编码。穴蛋白质常常在噬菌体感染晚期合成并存在于细胞质膜内，在这里它们造成膜损伤。

穴蛋白可以基于一级结构分析而分成两个一般类型：I类穴蛋白通常有95个残基或更长并且可以具有三个潜在跨膜结构域。II类穴蛋白通常较小，大约65-95个残基，带电荷残基和疏水残基的分布显示出两个TM结构域(Young，等Trends in Microbiology v.8，No.4，March 2000)。然而至少对于革兰氏阳性宿主的噬菌体而言，双成分裂解系统可能没有普遍性。虽然已经有几种噬菌体被证实或提示存在穴蛋白，但是没有在全部噬菌体上发现编码推测性穴蛋白的基因。已经证实穴蛋白存在于几种细菌噬菌体中，包括例如乳球菌(lactococcal)噬菌体Tuc2009、乳球菌NLC3、肺炎球菌噬菌体EJ1、格氏乳酸杆菌(LactoBacillus gasseri)噬菌体Nadh、金黄色葡萄球菌噬菌体Twort、单核细胞增多性李斯特菌噬菌体、肺炎球菌噬菌体Cp1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)噬菌体M29、德氏乳酸杆菌(LactoBacillus delbrueckki)噬菌体LLH溶素和金黄色葡萄球菌噬菌体N11(Loessner，等、Journal of Bacteriology、1999年8月、第4452-4460)。

多核苷酸

溶素可以通过众多不同的方法产生。裂解酶可以通过用对所述GBS细菌特异的噬菌体所送递的遗传密码感染该GBS细菌而产生。在另一个实例中，裂解酶通过重组生产法从包含如下DNA的核酸产生，其中所述的DNA具有编码一个或多个SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸序列的碱基序列，或具有与编码SEQ ID NO：1的多肽序列的多核苷酸序列的互补碱基在合适杂交条件下杂交的序列。裂解酶可以通过如此方式产生，即从噬菌体基因组中取出编码裂解酶的基因，将该基因导入转移载体并将该转移载体克隆至表达系统内，其中转移载体是质粒。表达系统可以是选自任何以上所列细菌或选自大肠杆菌的细菌。在另一个表达系统中，酶由无细胞表达系统产生。

除了编码所述裂解酶多肽的全长天然多核苷酸序列之外，预期可以制备裂解酶变体。遗传密码的简并性进一步拓宽这些实例的范围，原因在于简并性能够在DNA分子的核苷酸序列中产生较大变异，而同时维持所编码蛋白质的氨基酸序列。例如，以丙氨酸作为示例性氨基酸残基。该残基可以在cDNA中由核苷酸密码子三联体GCT编码。因为遗传密码子的简并性，三种其它核苷酸密码子三联体-GCT、GCC和GCA也编码丙氨酸。因此，基因的核苷酸序列可以在这个位置上被改变成这三种密码子中的任何一种而不影响所编码蛋白质的氨基酸组成或该蛋白质的特征。特定氨基酸的遗传密码和核苷酸密码子的变异是技术人员众所周知的。基于遗传密码的简并性，变体DNA分子可以使用如上所述的标准DNA诱变技术从公开的cDNA分子中衍生或通过合成DNA序列而产生。因基于遗传密码简并性的序列变异而在严格性条件下与公开的cDNA序列不杂交的DNA序列在此包括于本公开中。

裂解酶变体可以例如通过向裂解酶DNA导入适宜的核苷酸改变和/或通过合成所需的裂解酶多肽进行制备。本领域技术人员将理解氨基酸的改变可以导致裂解酶的翻译后加工发生变化，如改变糖基化位点的数目或位置或变更膜锚定特征。

本领域技术人员将认识到本文所述的DNA诱变技术可以产生种类广泛的如下DNA分子，该DNA分子编码对GBS细菌特异的并保持裂解蛋白质的基本特征的噬菌体溶素。也可以对新衍生的蛋白质进行选择以便获得在裂解蛋白质的特征方面的变异，这将在下文更充分地描述。此类衍生物包括在氨基酸序列中具有变异(包括小的缺失、添加和置换)的那些衍生物。尽管用于导入氨基酸序列变异的位置可以是预定的，然而突变本身无需预定。例如为了优化在给定位点内的突变的性能，可以在靶密码子或靶区域中进行随机诱变并且对表达的蛋白质变体筛选所需活性的最优组合。可以用于在具有如上所述的已知序列的DNA内于预定位点产生置换突变的技术是众所周知的。氨基酸置换一般是单残基置换；插入通常为约1-10个氨基酸残基并且缺失将是约1-30个残基。缺失或插入可以是单数形式，但是优选地以相邻成对的方式产生，即缺失2个残基或插入2个残基。可以对置换、缺失、插入或其任何组合进行组合以实现最终构建体。

相对于噬菌体相关裂解酶序列而言的“核酸序列同一性百分数”意指在比对序列及根据需要导入空位以实现最大序列同一性百分数后，候选序列中与噬菌体相关裂解酶序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分数。旨在确定核酸序列同一性百分数的比对可以用处于本领域技术人员能力范围内的多种方法实现，包括但不限于使用公众可获得的计算机软件。

除了对GBS特异的噬菌体所遗传编码的裂解酶和这些酶的片段的编码核苷酸序列之外，相应地提供该cDNA分子的互补DNA链和在严格性条件下与裂解酶cDNA分子或其互补链杂交的DNA分子。此类杂交分子包括仅因细微序列改变(包括核苷酸置换、缺失和添加)而不同的DNA分子。本公开也考虑包含该cDNA分子或其互补链的至少一个节段的分离寡核苷酸，如可以作为有效的DNA杂交探针或作为聚合酶链式反应中的有用引物使用的寡核苷酸。可以方便地通过标准分子生物学技术在该裂解酶cDNA上产生杂交DNA分子和变体。

大量各种各样的编码噬菌体相关裂解酶的分离cDNA序列和与此类基因序列杂交的部分序列可以用于裂解酶的重组生产。在本上下文中代表性核酸序列是编码SEQ ID NOS：1-9的多肽的多核苷酸序列、在严格性条件下与编码这些多肽序列的DNA的互补性序列杂交的序列。这些序列的进一步变体和与附图中所示那些核酸序列杂交的核酸序列也可以考虑用于产生本公开的裂解酶，包括可以获得的天然变体。

对特定DNA突变的检测可以通过如下方法进行，如使用特定寡核苷酸的杂交(Wallace等(1986)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：257-261)、直接DNA测序(Church和Gilbert(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1991-1995)、使用限制酶(Flavell等(1978)细胞15：25)、基于在含有变性剂的凝胶中的电泳迁移率进行区分(Myers和Maniatis(1986)ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51：275-284)、RNase保护(Myers等(1985)Science 230：1242)、化学切割(Cotton等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4397-4401)(本文中引用作为参考)和连接酶介导的检测方法(Landegren等，1988)。

所考虑的许多变体DNA分子包括通过标准DNA诱变技术(如M13引物诱变)所产生的那些DNA分子。这些技术的详细内容由Sambrook等(1989)在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.(本文中引用作为参考)中提供。通过利用这些技术，可以产生在细微方面与公开的那些分子相异的变体。本公开考虑这样的DNA分子和核苷酸序列，其是具体公开的那些DNA分子和核苷酸序列的衍生物，并且与公开的那些DNA分子和核苷酸序列因核苷酸的缺失、添加或置换而相异，但仍编码拥有BSMR蛋白质的功能性特征的蛋白质。还包括这样的小DNA分子或其变体，其中所述的小DNA分子从编码公开的肽序列的全部或部分的DNA分子中衍生。此类小DNA分子包括适于用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物的寡核苷酸。因此，这些小DNA分子将包含由对GBS细菌特异的噬菌体遗传性编码的裂解酶的至少一个部分，并且为了用于PCR，将包含该基因的至少10-15个核苷酸序列并且更优选15-30个核苷酸序列。从如上所述公开的DNA分子中衍生的DNA分子及核苷酸序列可以定义为在严格性条件下与公开的DNA序列或其片段杂交的DNA序列。

对正常序列或突变序列特异的寡核苷酸可以使用可商业获得的机器以化学方式合成，用同位素(如³²P)进行放射性标记或用标签如生物素(Ward和Langer等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6633-66571981)(本文中引用作为参考)进行非放射性标记，并与各个DNA样品杂交，其中所述的DNA样品通过点印迹或电泳后从凝胶上转移而固定在膜或其它固体支持物上。这些特异性序列的存在或不存在可以通过方法如放射自显影术或荧光测定反应或比色测定反应进行可视化(Gebeyehu等Nucleic Acids Res.15：4513-45341987)(本文中引用作为参考)。

基因的正常形式和突变形式间的序列差异也可以通过Church和Gilbert(1988)的直接DNA测序法(本文中引用作为参考)揭示。克隆的DNA节段可以用作检测特定DNA节段的探针。这种方法的灵敏度当与PCR组合时得以极大地增强(Stoflet等Science 239：491-494，1988)(本文中引用作为参考)。在该方法中，位于扩增的序列中的测序引物与双链PCR产物或由改良PCR产生的单链模板一起使用。序列测定通过用放射标记的核苷酸以常规方法进行或通过用荧光标签以自动测序方法进行。此类序列可以用于产生根据所述实施例的裂解酶。

与特定严格性程度相对应的杂交条件根据所选杂交方法的性质和所用杂交DNA的组成及长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其钠离子浓度)将决定杂交的严格性。对达到特定严格性程度所需要的杂交条件的计算由Sambrook等(1989)于Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9章和第11章(本文中引用作为参考)讨论。

此类计算的一个实例如下：杂交实验可以通过DNA分子(例如由对GBS细菌特异的噬菌体遗传编码的裂解酶的天然变体)与靶DNA分子的杂交而进行。靶DNA可以是例如已在琼脂糖凝胶中电泳并通过Southern印迹法(Southern(1975)J.Mol.Biol.98：503)(一种本领域众所周知的并在Sambrook等(1989)In Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，N.Y.(本文中引用作为参考)中描述的技术)转移到硝酸纤维素膜上的相应cDNA。与用同位素P(32)标记的dCTP标记的靶探针的杂交在高离子强度溶液如6倍SSC中在低于解链温度Tm(在下文中描述)20-25摄氏度的温度下实施。对于其中在southern印迹上靶DNA分子含有10ngDNA或更多DNA的Southern杂交实验，杂交使用1-2ng/ml放射标记的探针(比活性等于10⁹CPM/mug或更大)实施6-8小时。杂交后，洗涤硝酸纤维素滤膜以除去背景杂交。洗涤条件尽可能地严格以除去背景杂交而保留特异性杂交信号。术语“Tm″代表这样的温度，高于该温度时，放射标记的探针分子在主要的离子条件下将不与其靶DNA分子杂交。

杂交分子的Tm可以从如下公式估计：Tm＝81.5℃-16.6log₁₀(钠离子浓度)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/l)，其中l＝杂交体的碱基对长度。该公式对0.01M-0.4M钠离子浓度是有效的并且它对计算在具有更高钠离子浓度的溶液中的Tm是较不准确的(Bolton和McCarthy(1962)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：1390)(本文中引用作为参考)。该公式也对具有30％-75％范围内的G+C含量的DNA是有效的并且也适用于长度超过100个核苷酸的杂交体。寡核苷酸探针的行为在Sambrook等(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.的第11章(本文中引用作为参考)中详细描述。

因此以150个碱基对的DNA探针为例，其中所述的DNA探针从具有％GC＝45％的cDNA的开放读码框的头150个碱基对产生，对产生特定严格性所需要的杂交条件的计算可以如下进行：

假设滤膜在杂交后将在0.3×SSC溶液中洗涤，则钠离子＝0.045M；％GC＝45％；甲酰胺浓度＝0；l＝150个碱基对(见Sambrook等中的公式)，因此Tm＝74.4℃。同源性每减少1％，双链DNA的Tm降低1-1.5℃(Bonner等(1973)。J.Mol.Biol.81：123)。因此，对于此给定实例，在0.3倍SSC中在59.4-64.4℃洗涤滤膜将产生等同于90％的杂交严格性；相对于靶BSMR cDNA具有大于10％序列变异的DNA分子将不发生杂交。备选地，在0.3倍SSC中在65.4-68.4℃洗涤杂交后的滤膜将产生94％的杂交严格性；相对于靶BSMR cDNA分子具有大于6％序列变异的DNA分子将不发生杂交。上述实例完全以理论性说明方式给出。本领域技术人员将理解可以使用其它杂交技术并且实验条件的变动将使得需要替代的严格性计算法。

在一些实例中，严格性条件可以定义为这样的条件，在所述条件下具有大于25％序列变异(也称为“错配”)的DNA分子将不发生杂交。在一个实例中，严格性条件是这样的条件，在所述条件下具有大于15％、10％或优选6％错配的DNA分子将不发生杂交。

杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员方便地确定，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，越长的探针需要越高温度以获得合适的退火，而越短的探针需要越低温度。当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，杂交通常依赖于变性DNA的重退火能力。在探针与可杂交序列间的期望同源性程度越高，则可以使用的相对温度越高。因此，可以得出结论：越高的相对温度将趋向于使反应条件越严格，而越低的温度则使反应的严格性越低。对于杂交反应的其它细节及其严格性的解释，见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley lnterscience Publishers，(1995)。

“严格性条件”或“高严格性条件”，如本文中定义，可以通过下列确定：(1)使用低离子强度和高温度用于洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠在50℃洗涤；(2)杂交期间在42℃使用变性剂如甲酰胺例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0-1％焦磷酸钠，5×Denhardt′溶液，超声破碎鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，并且于42℃利用0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺在55℃洗涤，随后是由含有EDTA的0.1×SSC在55℃组成的高严格性洗涤。

“中等严格性条件”可以如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989所述确定，并且包括利用严格性低于如上所述的洗涤溶液和杂交条件(例如温度，离子强度和％SDS)。中等严格性条件的一个实例是在37℃于包含：20％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑精DNA的溶液中过夜温育，随后在大约37-50℃于1倍SSC中洗涤滤膜。技术人员将明了如何根据需要调整温度，离子强度等以适应诸如探针长度等因素。

表达编码溶素的多核苷酸的载体/宿主细胞

还提供包含编码所述溶素多肽序列之一或其变体或片段的一个或多个多核苷酸的载体，包括从仅仅结合区、或从多至完整的溶素蛋白质、或从结合区与其它蛋白质的连接/缀合物形成的载体。其它实例涉及以本公开的载体进行遗传改造的宿主细胞和通过重组技术产生本公开的多肽。使用从本公开的DNA构建体中衍生的RNA，也可以用无细胞翻译系统来产生此类蛋白质。

为重组生产，可以遗传改造宿主细胞以引入表达系统或其部分或本公开的多核苷酸。多核苷酸向宿主细胞的导入可以通过在众多标准实验室手册如Davis等，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，(1986)和Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中描述的方法实现，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖介导的转染法、转介(transvection)、微量注射法、阳离子脂质介导的转染法、电穿孔法、转导法、scrape loading、生物射弹导入法和感染法。

适宜宿主的代表性实例包括细菌细胞，如链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、肠球菌属(Enterococci)、大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞和曲霉属(Aspergillus)细胞；昆虫细胞如果蝇(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293及Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。

多种不同的表达系统可以用来产生本公开的多肽。此类载体包括例如，染色体载体、附加型载体和病毒衍生的载体，例如从细菌质粒、从噬菌体、从转座子、从酵母附加体、从插入元件、从酵母染色体元件、从病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒，禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒衍生的载体，以及从其组合衍生的载体，如从质粒和噬菌体遗传元件衍生的那些载体如粘粒和噬菌粒。表达系统构建体可以含有调节并引起表达的控制区。通常，适于维持、增殖或表达多核苷酸和/或适于在宿主中表达多肽的任何系统或载体均可以用于在此方面的表达。适宜的DNA序列可以通过多种众所周知且常规的技术(例如在Sambrook等，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，(同上)中所述那些技术)中的任意技术插入表达系统。

为使翻译的蛋白质分泌至内质网的腔中、至周质间隙或至胞外环境，可以将适宜的分泌信号并入表达的多肽中。这些信号可以对多肽是内源性的或它们可以是异源信号。

本公开多肽可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、亲和层析法、羟基磷灰石层析法和凝集素层析法。高效液相色谱也可以用于纯化。当多肽在分离和/或纯化期间变性时，可以使用众所周知的蛋白质再折叠技术以再生活性构象。

一个核酸在与另一个核酸序列处于功能性联系时是“有效连接的”。例如，若前序列或分泌性前导区的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌性前导区的DNA与多肽的DNA是有效连接的；若启动子或增强子影响编码序列的翻译，则该启动子或增强子与该编码序列是有效连接的；或，若核糖体结合位点被安置在利于翻译的位置上，该核糖体结合位点与编码序列是有效连接的。通常，“有效连接的”意味着发生连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导区的例子中，是连续且同相阅读的。然而，增强子没有必要是连续的。连接可以通过在便利的限制性位点处的连接而实现。如果此类位点不存在，则根据常规操作使用合成性寡核苷酸衔接子或接头。

诊断试验

检测试验有利地利用多相模式，其中在缀合的结合剂与分析物间发生结合反应，随后使用洗涤步骤以除去未结合的缀合的结合剂。例如，可以制备带有包含结合区的蛋白质的胶体金颗粒，其中该结合性蛋白质固定在颗粒表面上。当结合在蛋白质与细菌间发生时，颗粒汇聚在一起并形成有色的产物。类似地，结合性蛋白可以与酶如β-半乳糖苷酶、过氧化物酶或辣根过氧化物酶例如共价地复合。在洗涤后，留下的发生结合的酶可以通过添加底物如荧光底物或化学发光底物进行检测。结合性蛋白可以与能产生信号的任何其它试剂复合，如与稀土荧光剂复合并通过时间分辨荧光进行检测，与放射性材料复合并通过放射性测量方法进行检测，或者与常规荧光标签复合并通过荧光进行检测。

结合区与可检测标签的缀合可以通过合成化学或生物方法实施。例如，编码结合区或完整的溶素蛋白质的DNA序列可以与编码可检测标记如绿色荧光蛋白(GFP)或酶如碱性磷酸酶的遗传信息连接。这可以通过如下方式实现：分离编码结合性结构域的DNA，去除氨基端催化结构域，并以符合读码框方式将之替换为指示分子如绿色荧光蛋白(GFP)，纯化所表达的融合分子用于GBS细菌鉴定。因为该结合性结构域具有相似于免疫球蛋白G分子的结合亲和力，故该标记的结合性结构域将有效地鉴定GBS细菌而几乎无假阳性活性。也可以根据需要将GFP分子或酶在完整的溶素酶的5′末端处融合，由此酶的结构域将至少部分被失活，但仍允许结合性结构域发挥与其在细胞壁中的底物相结合的功能。

可以表达、纯化与催化结构域分开的分离的结合性结构域并使用众多荧光分子如异硫氰酸荧光素，异硫氰酸罗丹明和技术人员已知的其它荧光分子加以标记。结合性结构域可以用生物素进行修饰以允许在结合区黏附至GBS细菌后形成生物素-抗生物素蛋白复合物用于鉴定。

其它催化结构域可以添加至结合区上。如Diaz等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8125(1990)对另一种系统示例的，该催化结构域可以被来自其它噬菌体裂解酶的催化结构域替换，以便切割GBS细菌肽聚糖细胞壁中的其它键。例如，γ溶素基因5′端编码氨基端催化结构域(酰胺酶)的部分可以被去除并替换为来自其它GBS噬菌体的噬菌体裂解酶中的催化结构域，以及甚至来自其它革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌的噬菌体中的催化结构域。这些催化结构域可以是其它酰胺酶(其可以具有更高的活性或特殊的特点)、溶菌酶、氨基葡糖苷酶或内肽酶，当它们遗传性地与γ溶素的结合性结构域融合时均将切割GBS细菌肽聚糖中的相应键。在一个相关的实例中，具有不同特异性的两个或三个(或更多个)串联性催化结构域(如，溶菌酶-氨基葡糖苷酶-酰胺酶)可以融合至单个γ溶素结合性结构域上，以切割GBS细菌细胞壁肽聚糖中的这些键，从而产生高活性的切割酶。Navarre(D-丙氨酰基甘氨酸内肽酶活性的鉴定.J Biol Chem.1999年5月28日；274：15847-56.)已经证实三联酶结构域可以在噬菌体裂解酶中存在。

可以使用多种常用接头，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、碳二亚胺、双-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等，如选择性顺序接头(selective sequential linker)如在美国专利号4,680,338中公开的酐-异硫氰酸酯接头。

治疗组合物

裂解酶也可以用来预防性治疗与暴露于GBS细菌有关的病症或治疗性治疗已经因感染而生病的那些患者。所公开的噬菌体相关裂解酶对GBS细菌具有特异性并且优选地有效力地且有效率地分解GBS细菌的细胞壁。

所公开的裂解酶多肽也可以作为治疗剂使用。本发明的裂解酶多肽可以根据制备药用组合物的已知方法进行配制，其中本文中的裂解酶产物与可药用载体以混合方式组合。可以用于预防及治疗GBS细菌感染的组合物还包括改组酶和/或嵌合酶以及施用至口腔和鼻腔的黏膜衬里的手段(如载体系统或口腔送递模式)，由此将酶放入载体系统或口腔送递模式以抵达黏膜衬里。

如本文中所用的“载体”包括在所用剂量及浓度上对与之接触的细胞或哺乳动物无毒的可药用载体、赋形剂或稳定剂。生理可接受的载体经常是含水的pH缓冲溶液。生理可接受的载体的实例包括缓冲液如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

在改良裂解酶放入载体系统或口腔送递模式之前或之时，该酶可以处在起稳定作用的缓冲环境中以维持合适的pH范围，如约5.0至约8.0，包括pH约5.0、6.0、7.0、8.0或介于它们之间间隔0.05或0.05的倍数的任何pH，包括pH值5.2、6.5、7.4、7.5和8.5。

治疗性制剂通过混合具有所需纯度的活性成分与任选的生理可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，编者Osol，A.(1980))而制备，以冻干制剂或水溶液形式用于贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量及浓度上对受者无毒，并且包括缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或PEG。

用于裂解酶的任何载体均可以通过常规方法制备。然而，若醇在载体中使用，则酶应当处于微团、脂质体或“逆向”脂质体(“reverse”liposome)中，以防止酶的变性。类似地，若将裂解酶置于载体中，而载体是热的或已加热，则这种放置应当在载体已发生某种程度的冷却后才进行，以避免酶的热变性。载体优选地是无菌的。一种或多种裂解酶可以以液体形式或在冻干状态下添加到这些物质中，随之在它遇到液体时其将被溶解。

稳定缓冲剂

稳定缓冲剂应当允许溶素酶的最佳活性。缓冲剂可以含有还原性试剂如二硫苏糖醇。稳定缓冲剂也可以是或包括金属螯合试剂，如乙二胺四乙酸二钠盐，或它也可以含有磷酸盐或柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂或任何其它缓冲剂。可以对这些噬菌体和其它噬菌体编码的DNA加以改变，以允许重组酶在多于两个的位置处攻击一个细胞壁、以允许重组酶切割多于一种细菌物种的细胞壁、以允许重组酶攻击其它细菌，或以上的任意组合。可以对重组噬菌体产生的酶所做的变更的类型和数目是不可胜数的。可以将任意数目的嵌合裂解酶和改组裂解酶，单独地或与穴蛋白质一起，组织起来以治疗对GBS细菌的暴露。

黏膜黏附物(Mucoadhesives)

在一些实例中，当治疗组合物定向于黏膜衬里以杀死定居的致病细菌时，该组合物包含黏膜黏附物和裂解酶或嵌合和/或改组的裂解酶或它们的肽片段。如所公开和描述的，黏膜衬里包括例如上呼吸道和下呼吸道、眼、口腔、鼻、直肠、阴道、牙周袋、小肠和结肠。因黏膜组织的天然清理或清洁机制，常规剂型在这些施用部位不会停留任何显著长的时间。

因这些原因及其它原因，有利的是将对黏膜组织显示黏附性的物质与一种或多种噬菌体酶和其它补充性药剂一起施用一段时间。具有控释能力的材料尤其是想要的，并且缓释黏膜黏附物的应用已经受到明显关注。

J.R.Robinson(美国专利号4,615,697，本文中引用作为参考)提供有关在黏膜药物送递中使用的多种控释聚合性组合物的综述。该专利描述了包括生物黏附物和有效量的治疗剂的控释治疗组合物。该生物黏附物是水溶胀性的但水不溶性的、纤维状交联的羧基官能性聚合物，含有(a)多个重复单元，其中至少约80％的重复单元含有至少一个羧基官能度，和(b)约0.05至约1.5％的交联剂，基本上无聚链烯基聚醚。尽管Robinson的聚合物是水溶胀性但水不溶性的，但它们是交联的，没有热塑性，并且不象本申请的共聚物系统那样容易与活性物质一起配制，以及配制成各种剂型。微囊和多层微囊也可以用来控制酶的释放。

涉及亲水材料及疏水材料组合的黏膜黏附物的其它方法是已知的。来自E.R.Squibb & Co的Orahesive

是果胶、明胶和羧甲基纤维素钠在粘性烃聚合物中组合而成的黏附物，用于黏附口腔黏膜。然而，亲水成分和疏水成分的这种物理混合物最终将崩解。相反，本公开中的亲水结构域和疏水结构域产生不溶性共聚物。

美国专利号4,948,580(也引用作为参考)描述生物黏附性口腔药物送递系统。该组合物包括冻干的聚合物混合物，其由分散在软膏基质(如含有分散的聚乙烯的矿物油)中的共聚物聚(甲基乙烯基醚/马来酐)和明胶形成。美国专利号5,413,792(本文中引用作为参考)公开这样的糊样制品，其包含(A)糊样基质，其中所述糊样基质包含可以以3∶6至6∶3重量比存在的聚硅氧烷及水溶性聚合材料，和(B)活性成分。美国专利号5,554,380要求保护一种固体或半固体的生物黏附性口腔可摄取的含有油包水系统的药物送递系统，其中所述的油包水系统具有至少两种相。一种相包含约25％至约75％体积的内部亲水相并且另一种相包含约23％至约75％体积的外部疏水相，其中外部疏水相由三种成分组成：(a)乳化剂、(b)甘油酯和(c)蜡材料。美国专利号5,942,243描述用于施用抗细菌剂的一些代表性释放材料，该专利公开引入作为参考。

治疗组合物可以含有基本上由接枝共聚物组成的聚合性黏膜黏附物用于生物活性物质的受控释放，其中所述的接枝共聚物包含亲水主链和疏水接枝链。接枝共聚物是(1)具有烯键式不饱和官能团的聚苯乙烯大单体与(2)具有烯链式不饱和官能团的至少一种亲水酸性单体的反应产物。接枝链基本上由聚苯乙烯组成，而聚合物主链由亲水单体组成部分组成，其中一些亲水单体组成部分具有酸性官能度。聚苯乙烯大单体在接枝共聚物中的重量百分数是约1％至约20％之间并且总亲水单体在接枝共聚物中的重量百分数是80％至99％之间，而其中所述总亲水单体中至少10％是酸性的，所述的接枝共聚物在完全水化时具有至少90％的平衡水含量。

含有该共聚物的组合物在施用部位通过吸收组织液而逐步水化，产生非常柔软的对黏膜表面显示黏附性的冻样物质。在组合物黏附于黏膜表面的时间期间，该组合物提供药理学活性物质的缓释，该活性物质由黏膜组织吸收。

这些示例组合物的黏膜黏附性很大程度上由聚苯乙烯接枝共聚物中链的亲水酸性单体产生。该酸性单体包括，但不限于丙烯酸和甲基丙烯酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酸2-磺基乙酯和乙烯基膦酸。其它可共聚合的单体包括，但不限于N，N-二甲基丙烯酰胺、甘油甲基丙烯酸酯、聚乙二醇单甲基丙烯酸酯等。

本公开的组合物可以任选地含有量不对组合物的黏膜黏附性造成不利影响的其它聚合性材料，如聚(丙烯酸)、聚(乙烯吡咯烷酮)及羧甲基纤维素钠增塑剂以及其它可药用赋形剂。本公开组合物的剂型可以通过常规方法制备。

药物制品

本公开也提供包含一种或多种药剂及一种或多种溶素的组合物。还提供分开地或组合地联合施用一种或多种药剂和一种或多种溶素的治疗方法。

可以使用的药剂包括抗微生物药、抗炎药、抗病毒药、局部麻醉药、皮质类固醇、破坏性治疗药(destructive therapy agents)、抗真菌药和抗雄激素药。可以用在局部用制剂中的活性药剂包括抗微生物药、尤其具有抗炎特性的那些抗微生物药如氨苯砜、红霉素、二甲胺四环素、四环素、克林霉素和其它抗微生物药。抗微生物药的重量百分数是约0.5％至约10％。

局部麻醉药包括丁卡因、盐酸丁卡因、利多卡因、盐酸利多卡因、达克罗宁、盐酸达克罗宁、盐酸异喹卡因、待布卡因、盐酸待布卡因、苦味酸对氨苯酸丁酯和盐酸丙吗卡因。局部麻醉药的示例性浓度是总组合物重量的约0.025％-约5％。麻醉药如苯佐卡因(benzo caine)也可以在约2％-约25％重量份的优选浓度上使用。

可以使用的皮质类固醇包括倍他米松二丙酸盐、氟轻松actinide、戊酸倍他米松、去炎松actinide、丙酸倍氯他索、去羟米松、双醋二氟松、安西奈德(amcinonide)、氟氢缩松、戊酸氢化可的松、氢化可的松丁酸酯和丙缩羟强龙，推荐浓度是约0.01％-1.0％重量份。皮质类固醇如氢化可的松或醋酸甲基泼尼松龙的浓度可以是约0.2％-约5.0％重量份。

破坏性治疗药如水杨酸或乳酸也可以使用。约2％-约40％重量份的浓度可以使用。斑蝥素可以使用，例如浓度是约5％-约30％重量份。可以使用在局部用组合物中的典型抗真菌药及合适的重量浓度的实例包括：硝酸奥西康唑(0.1％-5.0％)、环吡酮胺(0.1％-5.0％)、酮康唑(0.1％-5.0％)、硝酸咪康唑(0.1％-5.0％)和硝酸布康唑(0.1％-5.0％)。如技术人员所理解，可以包括其它局部用药物以对付可能出现的多种局部共感染。

通常，使用药物联合的治疗包括与局部麻醉药联合的抗生素，如硫酸多粘菌素B和硫酸新霉素与丁卡因联合用于局部用抗生素凝胶以预防感染并缓解疼痛。另一个实例是米诺地尔与皮质类固醇如倍他米松二丙酸盐联合用于治疗斑秃的用途。抗炎药如可的松与抗真菌药如酮康唑联合用于治疗藓感染也是一个实例。

组合物可以包含氨苯砜及乙氧基二甘醇，这允许产生微粒药物与溶解的药物的优化比例。这种比例决定了与保留在角质层中或其上以在角质层外(supracomeum)区中发挥作用的药物量相比，所送递的药物的量。氨苯砜和乙氧基二甘醇的此系统可以包括纯化水以及“CARBOPOL

”胶凝聚合物、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、二氧化钛、BHA及中和“CARBOPOL

”的苛性材料。

为加快对感染的治疗，治疗剂可以进一步包括也可以强化裂解酶的杀细菌活性的至少一种补充药。该补充药可以是红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、大环内酯家族的其它成员、青霉素、头孢菌素及其任意组合，其量为可以有效地协同性增强裂解酶的治疗作用的量。实际上，任何其它抗生素均可以与修饰的裂解酶一起使用。类似地，其它裂解酶可以被包括在载体中以治疗其它细菌性感染。穴蛋白质可以被包括在治疗性治疗中。

在一些实例中，可以在治疗组合物中或与之组合使用用量可以有效增强修饰的裂解酶的治疗作用的温和表面活性剂。合适的温和表面活性剂尤其包括聚氧乙烯失水山梨糖醇酐与脂防酸的酯(Tween系列)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X系列)、正辛基-β-D-吡喃葡糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷、正癸基-β-D-吡喃葡糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃葡糖苷和生物学表面活性剂、例如、脂肪酸、甘油酯、甘油单酯、脱氧胆酸和脱氧胆酸的酯。

包含溶素的组合物的施用

包含一种或多种裂解酶如PlyGBS或变体或其片段的治疗组合物可以通过任何合适的方法施用至受试者。施用(修饰或未修饰的)裂解酶的方式包括，但不限于直接方式、间接方式、载体方式和特殊方式或任何组合方式。裂解酶的直接施用可以通过鼻喷雾剂、鼻滴剂、鼻软膏剂、鼻洗剂、鼻注射剂、鼻敷料(packing)、支气管喷雾剂和吸入剂，或间接通过使用喉锭剂、口腔洗剂或漱口剂或通过使用施加至鼻孔的软膏剂，或这些施用方法与相似施用方法的任何组合来进行。裂解酶可以采用的施用形式包括但不限于锭剂、糖锭、糖果剂(candy)、注入物、咀嚼胶、片剂、散剂、喷雾剂、液体剂、软膏剂和气雾剂。对GBS细菌的接触最有可能经由鼻子发生。对于与这种细菌的接触，最好尽快治疗。

当裂解酶通过利用鼻喷雾剂、鼻滴剂、鼻软膏剂、鼻洗剂、鼻注射剂、鼻敷料、支气管喷雾剂、口喷雾剂和吸入剂直接导入时，酶可以处在液体或凝胶环境中，其中液体充当载体。修饰酶的干燥无水形式可以通过吸入剂和支气管喷雾剂予以施用，不过也可以使用液体送递形式。

其中添加酶的锭剂，片剂或胶可以含有糖、玉米糖浆、各种色素、非糖甜味剂、矫味剂、任何粘合剂或其组合。类似地、任何基于胶的产品可以含有阿拉伯胶、巴西棕榈蜡、柠檬酸、玉米淀粉、食用着色剂、矫味剂、非糖甜味剂、明胶、葡萄糖、丙三醇、胶基、紫胶漆、糖精钠、糖、水、白蜡、纤维素、其它粘合剂及其组合。

锭剂可以还含有蔗糖、玉米淀粉、阿拉伯胶、黄蓍胶、茴香醚、亚麻子、含油树脂、矿物油和纤维素、其它粘合剂及其组合。在本公开的另一个实例中，使用糖替代物替代葡萄糖、蔗糖或其它糖。

如上指出，酶也可以置于鼻喷雾剂中，其中喷雾剂是载体。鼻喷雾剂可以是长效或延时释放喷雾剂，并且可以通过本领域众所周知的方法制造。也可以使用吸入剂，以至于酶可以进一步向下进入支气管，包括进入肺中。

用于裂解酶的任何载体均可以通过常规方法制造。然而，优选任何的口腔洗剂或相似类型的产品不含有醇以便防止酶的变性，但是在脂质体中和在其它保护性模式及形式中的酶可以在醇中使用。类似地，如果在制造过程期间将酶放置在止咳片、胶、糖果剂或锭剂中，则这种放置应当在锭剂或糖果剂硬化之前但在止咳片或糖果剂已经发生某种程度冷却后进行，以避免酶的热变性。酶也可以以足够高的有效剂量喷在止咳片、胶、糖果剂或锭剂的表面上。

酶可以以液体形式或在冻干状态下添加到这些物质中，随之在其遇到体液(如唾液)时，其将被溶解。酶也可以存在于微囊或脂质体中。

溶素的剂量

对于治疗感染，酶的有效给药速率或数量将部分取决于酶是预防性还是治疗性使用、受体接触传染性细菌的持续期、个体的体积和重量等。使用含有酶的组合物的持续期也取决于所述使用是否以预防为目的(其中使用可以是每小时、每日或每周一次进行一段短时间)，或所述使用是否将以治疗为目的(其中可能需要更为加强的组合物使用方案，以至于使用可以持续数小时、数日或数周，和/或以每日为基础，或在一天内定时地间隔进行)。所用的任何剂型都应当提供用于最短时间的最小单位数。可以提供酶的有效量或有效剂量的酶活性单位浓度可以为在鼻和口通道的湿润或潮湿环境中以及在局部用方式下约10单位/ml至约500,000单位/ml流体，并且可以是约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100单位/ml至约50,000单位/ml。代表值因此包括约200单位/ml、300单位/ml、500单位/ml、1,000单位/ml、2,500单位/ml、5,000单位/ml、10,000单位/ml、20,000单位/ml、30,000单位/ml和40,000单位/ml。更具体地，对活性酶单位的暴露时间可以影响期望的每mL活性酶单位浓度。应当注意划分为“长时”或“缓慢”释放载体(例如某些鼻喷雾剂或锭剂)的载体能具有或提供较低的每mL活性(酶)单位浓度，但延续较长时间，而“短时”或“快速”释放载体(例如漱口剂)能拥有或提供高的每mL活性(酶)单位浓度，但延续较短时间。每mL活性单位的量和暴露的持续时间取决于感染的性质、治疗是否为预防性或治疗性的以及其它变量。因此，剂量数将取决于具体情况并且可以是每日1-4次或更多次，持续时间从1日至多周。感染可在皮肤中发生并且此类组合物因而也可以使用众所周知的载体(如美国专利6,056,954和6,056,955中描述的那些载体)进行配制以便表面施用。

治疗的方法

使用裂解酶治疗细菌性感染、尤其治疗GBS细菌存在众多优点。溶素具有明显不同的催化结构域和结合性结构域的模块化设计，使得溶素对于结构域交换实验是理想的，在所述实验中细菌特异性和催化活性可以加以改良或适应性调整，以便用于对抗另外的病原体。因为溶素的催化靶和结合靶(分别是肽聚糖和相关的糖类)在很大程度上对生存力是必需的，因此溶素抗性是罕见的。

“治疗”指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中治疗目的是防止或延缓(减轻)所靶向的病理状况或疾病。需要治疗的对象包括已患有该疾病的那些对象，以及易患该疾病的那些对象或有待进行该疾病的预防的那些对象。

为治疗目的，“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和家畜动物，以及动物园动物、体育动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选地，哺乳动物是人。

待体内施用的制剂优选地是无菌的。这可以通过在冻干和复原之前或之后经除菌过滤膜过滤而便利地实现。在此治疗组合物通常置于具有无菌存取口的容器中，例如，具有皮下注射针头可穿透的塞子的静脉溶液袋或小药瓶。

施用途径根据已知方法进行，例如静脉内注射或输注、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内或损伤内途径，局部施用或通过缓释系统施用。当治疗细菌性暴露或感染时，裂解酶可以按照任何合适方式施用，包括胃肠道外方式或通过口腔或鼻腔。

本发明药物组合物的剂量和期望的药物浓度可以根据所预期的具体用途而变化。对适宜施用剂量或途经的确定处于普通内科医生的技术能力范围内。动物实验为确定用于人类治疗的有效剂量提供可靠的指导。有效剂量的物种间换算可以按照由Mordenti，J.和Chappell，W.″The use ofinterspecies scaling in toxicokinetics″在Toxicokinetics and New DrugDevelopment，编者Yacobi等.，Pergamon Press，New York 1989，第42-96页中建立的原则进行。

当采用体内施用裂解酶时，正常的剂量可以是每日约10ng/kg-至不超过100mg/kg哺乳动物体重，或更高，或约1μg/kg/日至10mg/kg/日，这取决于施用途径。下文以及文献中还提供有关具体剂量和送递方法的指导。预期不同制剂将对不同的治疗化合物和不同的病症有效，并且靶向一种器官或组织的施用例如可能需要以与靶向另一种器官或组织的方式相异的方式送递。

当期望缓释施用制剂中的裂解酶时，可以考虑裂解酶的微囊化，其中所述制剂具有对于需要施用该裂解酶的任何疾病或病症而言适于实施治疗的释放特征。使重组蛋白微囊化以便缓释，已经成功地以人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN)、白细胞介素-2和MNrgp120开展。Johnson等，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Then，27：1221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology.8：755-758(1990)；Cleland，″Design andProduction of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems.″在Vaccine Design：The Subunit和Adj uvant Approach中，编者Powell和Newman(Plenum Press：New York，1995)，第439-462页；WO 97/03692、WO 96/40072、WO 96/07399和美国专利号5,654,010。

这些蛋白质的缓释制剂可以使用聚丙交酯共乙交酯(PLGA)聚合物，原因在于该聚合物的生物兼容性和广泛的生物可降解特性。PLGA的降解产物即乳酸和乙醇酸可以在人体内迅速得以清除。此外，这种聚合物的降解性可以根据其分子量和组成做数月至数年的调节。Lewis，″Controlledrelease of bioactive agents from lactide/glycolide polymer，″在：M.Chasin和R.Langer(编者)，Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems(Marcel Dekker：New York，1990)，第1-41页。

皮肤感染

用于治疗局部感染的组合物包含有效量的根据本公开所产生的至少一种溶素和用于送递至少一种裂解酶至感染皮肤的载体。用于裂解酶的施用模式包括多种不同类型的载体和载体组合，包括，但不限于含水液体、醇基液体、水溶性凝胶、洗液、软膏、非水性液体基质、矿物油基质、矿物油与凡士林的混合物、羊毛脂、脂质体、蛋白质载体如血清白蛋白或明胶、粉状纤维素、焦糖及其组合。送递含有治疗剂的载体的模式包括但不限于涂(smear)、喷(spray)、定时释放贴片(time-release patch)、吸收液体的拭子及其组合。裂解酶可以直接地施加至绷带上或在一种其它的载体中施加至绷带上。绷带可以湿售或干售，其中酶在绷带上处于冻干形式。这种应用方法对于治疗感染的皮肤最有效。

局部用组合物的载体可以包含半固体性和凝胶样辅料(vehicle)，其包括聚合物增稠剂、水、防腐剂、有效表面活性剂或乳化剂、抗氧化剂、防晒剂和溶剂或混合的溶剂系统。美国专利号5,863,560(Osborne)讨论了可以帮助皮肤与药物接触的众多不同载体组合。

可以使用的聚合物增稠剂包括本领域技术人员已知的那些增稠剂，如常用于化妆品和制药工业的亲水性胶凝剂及水醇(hydroalcoholic)胶凝剂。亲水性胶凝剂或水醇胶凝剂可以包含，例如“CARBOPOL

”(B.F.Goodrich，Cleveland，Ohio)、“HYPAN

”(Kingston Technologies，Dayton，N.J.)、“NATROSOL

”(Aqualon，Wilmington，Del.)、“KLUCEL

”(Aqualon，Wilmington，Del.)或“STABILEZE

”(ISPTechnologies，Wayne，N.J.)。胶凝剂可以占组合物的约0.2％-约4％重量份。更具体地，组分重量百分数范围的实例对于“CARBOPOL

”可以是约0.5％-约2％，而对“NATROSOL”和“KLUCEL

”的重量百分数范围可以是约0.5％-约4％。组分重量百分数范围对于“HYPAN”和“STABILEZE”均可以是约0.5％-约4％。

“CARBOPOL

”是被给予常用名-卡波姆的多种交联丙烯酸聚合物中的一种。这些聚合物溶解在水中并在用苛性物如氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺或其它胺碱中和后形成清亮或略微浑浊的凝胶。“KLUCEL

”是分散在水中并在完全水化时形成均匀凝胶的纤维素聚合物。其它胶凝聚合物包括羟乙基纤维素、纤维素胶、MVE/MA癸二烯交联聚合物、PVM/MA共聚物或其组合。

防腐剂也可以在本发明中使用并且可以占例如总组合物的约0.05％-0.5％重量份。防腐剂的使用确保当产物受到微生物污染时制剂会阻止或减少微生物生长。可用于本发明中的一些防腐剂包括尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、氯二甲苯酚、苯甲酸钠、DMDM乙内酰脲、3-碘-2-丙基丁基氨基甲酸酯、山梨酸钾、二葡萄糖酸氯己定或其组合。

二氧化钛可以用作防晒剂以起到对光敏的预防作用。备选防晒剂包括肉桂酸甲酯。此外，BHA可以用作抗氧化剂以防止乙氧基二甘醇和/或氨苯砜因氧化而变色。另外的抗氧化剂是BHT.

在一个实例中，本发明包含皮肤病学组合物，其具有约0.5％-10％卡波姆和约0.5％-10％以溶解状态和微粒状态两者存在的药物。溶解的药物具有穿过角质层的能力，而微粒药物无此能力。胺碱、氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液的添加完成该凝胶的形成。更具体的，该药物可以包括氨苯砜、具有抗炎特性的抗微生物药。微粒对溶解的氨苯砜的一个示例性比率是5或更小。

在另一个实例中，本发明包含约1％卡波姆、约80-90％水、约10％乙氧基二甘醇、约0.2％尼泊金甲酯、约0.3％-3.0％氨苯砜(包括微粒氨苯砜和溶解的氨苯砜)以及约2％苛性物。更具体的，卡波姆可以包括″CARBOPOL

980″并且苛性物可以包括氢氧化钠溶液。

在一个实例中，若存在上呼吸道的细菌性感染，则感染可以用如下组合物进行预防性或治疗性治疗，其中所述的组合物包含有效量的由细菌产生的至少一种裂解酶和用于送递该裂解酶至口、喉或鼻道的载体，其中所述的细菌感染了对该细菌特异的噬菌体。该裂解酶可以是可以与穴蛋白质联合使用的裂解酶、嵌合裂解酶和/或改组的裂解酶或其组合。裂解酶可以处于具有允许裂解酶产生活性的pH的环境中。如果个体已经与具有上呼吸道疾病的某个体接触，则裂解酶将停留在黏膜衬里中并阻止感染性细菌的任何定居。

胃肠道外施用

在一些实例中，感染可以经胃肠道外方式治疗。可以使用的酶是如上文的裂解酶、嵌合裂解酶、改组的裂解酶及其组合。酶可以经肌内、静脉内、皮下、皮内方式或其组合加以施用。在一个实例中，感染可以通过向患者注射治疗剂进行治疗，其中所述的治疗剂包含适宜的改组裂解酶和/或嵌合裂解酶以及用于该酶的载体。载体可以由蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合组成。更具体地，输注或注射用溶液剂可以按照常规方式制备，例如添加防腐剂如对羟基苯甲酸酯或稳定剂如乙二胺四乙酸的碱金属盐，并且可以随后转移至输注容器(fusion vessel)、注射小药瓶或安瓿中。备选地，用于注射的化合物可以连同或不连同其它组分进行冻干并且在使用时根据需要于缓冲溶液或蒸馏水中溶解。非水性载体如不挥发性油、脂质体和油酸乙酯也可用于此。其它噬菌体相关裂解酶以及穴蛋白质可以被包括在该组合物中。

在肌内注射是选择的施用模式的情况下，可以使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下，使用等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白.在一些实例中，将血管收缩剂添加至制剂中。提供无菌和无致热原的该药物制品。通常，如上所述，静脉内注射可能是最适宜的。

载体合适地含有小量添加剂如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类物质在所用的剂量和浓度上对受体无毒，并且包括缓冲剂如磷酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸和其它有机酸或其盐；抗氧化剂(例如抗坏血酸)；低分子量(小于约10个残基)多肽例如聚精氨酸或三肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；甘氨酸；氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它糖类包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、海藻糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；反荷离子如钠；非离子型表面活性剂如聚山梨酯、泊洛沙姆或聚乙二醇(PEG)；和/或中性盐例如NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂等。

丙三醇或甘油(1，2，3-丙三醇)是可商业获得用于制药用途的。丙三醇或甘油可以稀释于无菌注射用水或氯化钠注射液或其它可药用的含水注射流体中，并且在0.1％-100％(v/v)、1.0％-50％或约20％的浓度上使用。

DMSO是这样的非质子溶剂，其具有增强多种局部用药物的穿透性的不寻常能力。DMSO可以稀释于无菌注射用水或氯化钠注射液或其它可药用的含水注射流体中，并且在0.1％-100％(v/v)的浓度上使用。载体也可以包括Ringer′s溶液、缓冲溶液和葡萄糖溶液，尤其在制备静脉内溶液剂时。

在酶放入载体系统或口腔送递模式中之前或之时，使酶处在维持pH约5.0-约7.5的稳定缓冲剂环境中可能是受欢迎的。

稳定缓冲剂应当允许酶的最佳活性。该缓冲剂可以是还原性试剂，如二硫苏糖醇.稳定缓冲剂也可以是或包括金属螯合试剂如乙二胺四乙酸二钠盐，或它也可以含有磷酸盐或柠檬酸盐磷酸盐缓冲液。存在于载体中的缓冲剂可以起到为裂解酶稳定环境的作用。

待胃肠道外方式施用的酶的有效给药速率或数量将部分取决于感染的严重性、患者的重量、受体暴露于传染性细菌的持续期、感染的严重性和类型众多的其它变量。组合物可以施加到任何部位，从每日一次至数次，并且可以短时间或长时间施加。使用可以持续多日或多周。所用的任何剂型应当提供用于最短时间的最小单位数。被认为可以提供酶的有效量或有效剂量的酶活性单位浓度可以是约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100单位/ml至约10,000,000单位/ml组合物，约1000单位/ml至约10,000,000单位/ml和约10,000至10,000,000单位/ml。每mL活性单位的量和暴露的持续时间期取决于感染的性质和载体允许裂解酶被接触的量。。记住该酶处在液体环境中时，发挥最佳作用。因此，酶的效力部分地与载体的持水量相关。用于治疗的酶浓度取决于血液中的细菌计数和血液体积。

为了加快对感染的治疗，治疗剂可以进一步包括也可以强化裂解酶的杀菌活性的至少一种补充药。补充药可以是有效抗GBS细菌的任何抗生素。类似地，可以包括其它裂解酶以治疗其它细菌性感染。

此外，众多方法可以用来帮助酶跨细胞膜转运。酶可以在脂质体中进行转运，其中酶通过已知技术“插入”脂质体中。类似地，酶可以位于反微囊中。酶也可以进行PEG化，即把聚乙二醇连接到酶的非活性部分。备选地，疏水分子可以用来跨细胞膜转运酶。最后，酶的糖基化可以用来瞄准细胞膜上的特异性内化受体。

实施例

材料

限制性内切核酸酶从New England Biolabs(Beverly，MA)获得。所用全部试剂均从sigma(st.Louis，Mo)购买，但另外说明的除外。本研究中所用的细菌菌株和质粒列于实施例结尾处的表3中。

实施例1：PlyGBS的克隆和序列比对

在GBS NCTC11237细菌覆层上筛选GBS噬菌体NCTC11261基因组文库的克隆以寻找可能的溶素基因。溶素基因(plyGBS)的全长序列通过对噬菌体NCTC11261基因组DNA测序而获得。相似性搜索表明在核苷酸水平和氨基酸水平上，该基因与来自不同链球菌物种的几种溶素超过90％相同，所述的溶素包括GBS噬菌体B30溶素(SEQ ID NO：1)(GenBank登录号AAN28166)，化脓性链球菌M1噬菌体相关溶素(AAK33905)和马链球菌噬菌体相关蛋白质(AF186180)。

该推测的PlyGBS蛋白质序列与肺炎球菌噬菌体Cp-1溶素(Cpl-1)和葡萄球菌噬菌体187溶素(Ply187)的比对表明，PlyGBS具有三个不同结构域。氨基末端107个氨基酸与Ply187中发挥内肽酶功能的结构域27％相同。对于氨基酸150-394(中央结构域)，PlyGBS与Cpl-1的氨基末端溶菌酶结构域显示46％同一性。两个酸性氨基酸Asp和Glu也存在于PlyGBS中于位置158(Asp)和185(Glu)处。

实施例2：PlyGBS的表征

基于推导的氨基酸序列，PlyGBS具有理论pI值(等电点)4.88。以25mM Tris-HCl(pH 7.4)作为离子交换层析中的洗脱缓冲液，该蛋白质带负电荷并且与带正电荷的Q-Sepharose阴离子交换剂结合。酶通过NaCl梯度洗脱并且将活性级分合并并通过SDS-PAGE进行分析。在约50KDa的主要蛋白质条带与PlyGBS的计算分子量(49.6KDa)相关。通过扫描光密度测定法在考马斯兰染色的SDS-PAGE凝胶上估计纯度＞95％的终末制品用于全部后续实验。

测定纯化的PlyGBS的最适pH是在5.0左右，活性pH范围在4.0之间。PlyGBS的凝胶过滤层析显示蛋白质以单体形式发挥功能。

实施例3：体外PlyGBS活性(光密度体外裂解杀伤试验)

为在多种细菌菌株上检验PlyGBS体外活性，将全部菌株接种过夜、继代培养(1∶100)并培育至OD₆₀₀＝0.3。将细胞离心并重悬于1/10体积的磷酸盐缓冲液(40mM，pH 5.0)。100微升等分试样的细菌溶液(5×10⁸-10⁹cfu/ml)与所示量的PlyGBS在37℃温育60分钟。使用分光光度计监测裂解活性，测量为每分钟下降的毫OD₆₀₀数(-mOD₆₀₀/分钟)。将该反应的初始速率定义为裂解速率。为测定细菌生存力，将来自以上试验的GBS菌株NCTC11237细胞离心、稀释并涂在THY琼脂平板上以便细胞计数。一式三份开展全部实验并且在相同条件下开展添加磷酸盐缓冲液(pH 5.0)的对照实验。

为确定针对GBS细胞的PlyGBS体外活性，将GBS细胞(NCTC 11237，血清型IIIR)与40单位PlyGBS在37℃混合60分钟。OD₆₀₀在10分钟内下降至基线，显示迅速的细胞裂解速率，这由在60分钟观察到的生存力减少2log所确证。当在代表血清型Ia、Ib、lc/II、IIR、IIIR以及优势血清型III和V的多种GBS菌株上基于裂解活性检验PlyGBS敏感性时，观察到相似的裂解速度(-mOD₆₀₀/分钟)，具有一定的菌株-到-菌株的变异。

除GBS之外，还分析了代表多个物种的细菌菌株以确定它们对PlyGBS的体外敏感性。在属于不同Lancefield群的受检链球菌菌株中，PlyGBS针对A、C、G和L群链球菌具有明显裂解活性，对D、E和N群几乎无活性或完全无活性。PlyGBS的胞壁质水解活性也针对非Lancefield口腔链球菌物种(包括戈氏链球菌(S.gordonii)、口腔链球菌(S.oralis)、唾液链球菌、远缘链球菌(S.sobrinus)和变形链球菌(S.mutans))进行检验。PlyGBS对唾液链球菌、戈氏链球菌和变形链球菌具有中度至低度活性，但对检验的其它两种共栖物种无活性。用两种非链球菌革兰氏阳性物种蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌或两种阴道共栖细菌嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和卷曲乳杆菌(L.crispatus)没有观察到裂解活性。

使用相差显微镜和电子显微镜观察溶素在GBS细胞上的裂解作用(“裂解活性”的一个实例)。通常，完好的GBS在缓冲液对照中形成短链。在用PlyGBS溶素处理后，细胞裂解，释放细胞质内容物并且在光学显微镜下变得不透明。如用其它溶素通过电子显微镜所见，由PlyGBS导致的细胞壁弱化引起细胞质膜向外突出并破裂，这似乎更多局限于正在分裂的细胞的横隔区中。随后的细胞质内容物丢失使细胞转变成空“细胞形骸”。

实施例4：PlyGBS体内活性(小鼠模型体内杀伤试验)

6周龄BALB/c雌性小鼠从Charles River实验室(Wilmington，MA)购买。因为据信细菌在小鼠阴道腔中的定居于动情期更高效，故全部小鼠的动情周期在第一日通过皮下接种0.1mg β-雌二醇戊酸酯进行同步化。在第3日，将30只小鼠麻醉并使用微量移液器阴道接种约10⁶个抗链霉素的GBS NCTC11237细胞(在40mM磷酸盐缓冲液，pH 5.0中的20μl剂量)。在第4日，小鼠用20μl磷酸盐缓冲液(pH 5.0)进行阴道处理并用尖端包裹藻酸钙纤维的超细拭子(Fischer，Pi ttsburgh，PA)揩拭。含有5％绵羊血液和链霉素(200μg/ml)的THY琼脂平板的表面用湿拭子划线以确定基线定居。随后将小鼠随机化分组以用20μl磷酸盐缓冲液，pH 5.0(n＝15)或10单位PlyGBS溶素(n＝15)处理阴道。在处理后2小时和4小时，全部小鼠再次揩拭以确定滴度。

为检验PlyGBS是否可以用于新生儿的产后治疗，38只小鼠接受约10⁸个StrR GBS NCTC11237细胞的上呼吸道攻毒(20μl口服并且每个鼻孔各20μl)。次日早晨，对小鼠取口咽拭子并且如上所述计数基线定居。将小鼠随机分组并且经口及经鼻施用20μl磷酸盐缓冲液，pH 5.0(n＝18)或10单位PlyGBS溶素(n＝20)。在处理后2小时和24小时，全部小鼠再次取口咽拭子以测定细菌计数。

为统计学分析，使用MIXED模型(来自SAS Mixed Procedure)以比较组间的定居状态。P值＜0.05被认为是显著的。

开展体内杀伤试验以评估PlyGBS的体内裂解活性，其中在小鼠阴道模型中通过施用PlyGBS至定居的GBS进行测试。为进行该试验，两组小鼠用10⁶cfu StrR GBS细胞作阴道攻毒。之后，24小时后，揩拭阴道腔以确定初始定居率(0小时样品，治疗前)。小鼠随后用缓冲液(n＝15)或PlyGBS(n＝15)作阴道处理并在处理后2小时和4小时取拭子。在缓冲液对照处理的动物中观察到可忽略的效果。相反，当与缓冲液对照相比时，用单剂量PlyGBS处理的动物在2小时和4小时间隔上均显示细菌载量的显著减少(大约3个log下降)(p＜0.0001)。

类似地，两组小鼠用经口及经鼻送递的总计10⁸cfu StrR GBS攻毒，以确定PlyGBS是否可以用来减少小鼠上呼吸道中的定居GBS。当与缓冲液对照相比时，用单剂量的溶素通过相同途径处理的小鼠在2小时和24小时揩拭间隔上均显示GBS定居的显著减少(P＜0.0001)。

实施例5：使用大肠杆菌增变菌株通过诱变产生PlyGBS突变溶素

使用大肠杆菌XL-1Red菌株(Stratagene，Inc.，La JoIIa，CA，表3)以在PlyGBS中产生随机突变，其中所述菌株因为三个主要DNA修复途径(muts、mutD和mutT)的缺陷而引起比野生型菌株显著更高的突变率。将含有野生型plyGBS基因的质粒pCQJ67-2转化至大肠杆菌XL-1Red中并在补加卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上37℃过夜增殖。将菌落从琼脂平板上刮下并继代培养(1∶100)以再一次过夜生长，从而允许突变在该质粒DNA中累积。次日早晨，培养物进行继代培养以再生长额外6个小时，并制备质粒DNA。将得到的含有随机突变的质粒转化至蛋白质表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中并且使用如前在Schuch，R.，D.Nelson和V.A.Fischetti，″检测并杀死炭疽芽胞杆菌的溶菌剂，″Nature 418：884-889(2002)中描述的透明区法，从超过5,000个克隆中筛选比野生型PlyGBS更好的溶素活性。为避开任何在启动子区中的潜在突变，从具有比野生型活性更好活性的克隆中制备质粒DNA并用Ncol和XhoI消化。释放的plyGBS基因片段克隆到pET28a中并且得到的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)内，以确证增加的溶素活性。使用DNA序列分析以对突变定位。

实施例6：使用易错PCR方法的基因诱变

所用的另一种诱变方法是“多样化PCR随机诱变试剂盒”(BDBioscience，Palo Alto，CA)。该方法涉及在减少核苷酸掺入忠实性的条件下开展PCR反应，克隆得到的PCR片段并且随后在该文库中筛选具有改良溶素活性的新突变。通过将反应中的镁浓度保持在320μM而选定PCR突变率在每1,000bp约2.7个左右。两个PCR引物在Cheng，Q.等，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.AgentsChemother.49：111-117(2005)中列出。PCR产物用NcoI和XhoI消化并克隆至pET28a中，旨在使用以上提及的方法筛选。开展多轮PCR诱变以改善溶素活性。

实施例7：plyGBS缺失突变体的构建

几种缺失突变体基于野生型plyGBS的结构组织方式进行构建并且示意图在图4中显示。全部区域用PCR扩增并克隆至用于蛋白质表达的pET28a中。从质粒pCQJ92(表3)中表达出的突变体PlyGBS92(SEQ IDNO：6)编码推测的溶菌酶结构域[氨基酸(aa)150-394]。突变体PlyGBS93(SEQ ID NO：7)含有缺失氨基端内肽酶结构域的区域aa150-443。从pCQJ94(表3)中表达出的突变体PlyGBS94(SEQ ID NO：8)含有作为推测的内肽酶结构域的头146个aa。含有中央溶菌酶结构域缺失(aa 147至348缺失)的另一个突变体PlyGBS95(SEQ ID NO：9)从pCQJ95中得以表达，其中所述的pCQJ95通过插入HindIII/XhoI消化的PCR片段(plyGBS基因的羧基端，bp 1045-1332)至pCQJ94中而产生。对用于突变体表达的全部已构建质粒进行测序以证实预期的缺失。

实施例8：溶素活性和稳定性的比较

为比较多种突变体的溶素活性，培养克隆并在Cheng，Q.等，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.AgentsChemother.49：111-117(2005)中所述的相同条件下，于10ml体积中诱导蛋白质的过量表达。蛋白质粗提物用于体外活性试验。为对蛋白质活性定量，制备每种突变体的大批量(1升)培养物。因为突变体具有与野生型酶相似的pI(等电点)(表1)，故纯化通过如在Cheng，Q.等，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌”Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)中所述的阴离子交换层析来实施。将活性级分合并并在4-20％梯度Tris-HCl预制SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上电泳。溶素活性如Cheng，Q等，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌”Antimicrob.Agents Chemother 49：111-117(2005)中所述进行定量。蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测定以计算每种突变体的比活性。

因为从随机诱变中获得的PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)突变体具有比野生型PlyGBS显著更高的比活性，故将这些突变体的稳定性与野生型在贮藏条件下进行比较。新鲜纯化的野生型PlyGBS以及两种突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和PlyGBS90-8(SEQ ID NO：4)直接在4℃或在25％甘油中在-80℃贮藏。体外活性试验在不同时间点(0、20、40和60日)上开展，使用分光光度计监测裂解活性(度量为每分钟下降的毫OD₆₀₀值(-mOD₆₀₀/分钟))。体外活性试验如在Cheng，Q.等，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)中所述开展。该反应的初始速率(V_max)定义为裂解速率并且用来比较在各个时间间隔上的蛋白质稳定性。

实施例9：高活性突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的特征

高活性突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的特征与野生型PlyGBS进行比较。PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的体外裂解活性由两种不同方法测量。首先如在Cheng，Q.等，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)中所述，在体外试验中使用多个量的纯化PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)和野生型PlyGBS(2、10、50和100μg)以测量V_max值。还如在Cheng，Q.等″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)中所述，在体外生存力试验中检验突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)对GBS的杀伤效力。突变体的特异性和最适pH如在Cheng，Q.等，″用噬菌体裂解酶除去定居小鼠阴道和口咽的B群链球菌”Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)中所述进行分析。

为检验盐浓度对裂解活性的影响，将纯化的PlyGBS90-1(SEQ IDNO：5)和PlyGBS对2mM Tris-HCl(pH 7.4)透析过夜。将不同量的5MNaCl添加到已透析的蛋白质样品中，如在Cheng，Q.等，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.AgentsChemother.49：111-117(2005)中所述，使用分光光度计测定在0-500mM盐浓度下的V_max值。

实施例10：突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)的体内活性

在先前研究(Cheng，Q.，D.Nelson，S.W.Zhu和V.A.Fischetti，″用噬菌体裂解酶除去定居在小鼠阴道和口咽的B群链球菌，″Antimicrob.Agents Chemother.49：111-117(2005)，本文中引用作为参考)中研发的小鼠阴道模型中，对突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)进行体内抗GBS测试。简而言之，在第1日，20只6周龄BALB/c雌性小鼠(Charles River Lab，Wilmington，MA)的动情周期通过β-雌二醇戊酸酯进行同步化(McLean，N.W和I.J.Rosenstein，″表征和选择再定居于复发细菌性阴道炎的女性阴道中的乳杆菌物种，″J.Med.Microbiol.49：543-552(2000))。在第3日，小鼠用10⁶个菌落形成单位(cfu)StrR NCTC11237GBS细胞作阴道攻毒。在第4日，从阴道腔取拭子确定处理前的定居状态(0小时样品)。小鼠随后随机分成3个组并用缓冲液(n＝10)或1,500μg PlyGBS(n＝10)或1,500μg突变体PlyGBS90-1(SEQ ID NO：5)(n＝10)作阴道处理。小鼠随后在处理后2小时和4小时取阴道拭子。使用补加5％绵羊血液和链霉素(200μg/ml)的THY琼脂平板(Nelson，D.，L.Loomis和V.A.Fischetti，″通过使用噬菌体裂解酶预防和消除A群链球菌对小鼠上呼吸道的定居，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：4107-4112(2001)，在此引用作为参考)以测定来自湿拭子的菌落计数。MIXED模型(来自SAS Mixed Procedure)用来在统计学分析中比较组间的定居状态并且认为P值＜0.05是显著性的。

表3.细菌菌株和质粒

细菌菌株血清型来源^a

GBS NCTC11237 IIIR 1

NCTC11237衍生株 IIIR，Str^R 2

大肠杆菌 XL-1Red 3

BL21(DE3) 2

唾液链球菌 ATCC9222 4

蜡状芽孢杆菌 ATCC4342 2

金黄色葡萄球菌 RN6390 2

质粒表型编码的蛋白质描述

PCQJ67-2 Kan^R Wt PlyGBS 克隆至pET28a中的Wt plyGBS基因

PCQJ67-2

衍生物

PCQJ86-6 Kan^R PlyGBS86-6 在plyGBS基因中的点突变导致D374E

改变

PCQJ80 Kan^R PlyGBS80 因无义突变导致突变体含有PlyGBS的头

163个氨基酸。

PCQJ90-1 Kan^R PlyGBS90-1 突变体在plyGBS基因中具有异读框缺失

(bp 424-1255)。它表达PlyGBS的头141

个氨基酸以及因移码产生的额外13个氨

基酸。

PCQJ90-8 Kan^R PlyGBS90-8 因无义突变导致突变体含有PlyGBS的头

138个氨基酸。

PLYGBS

缺失突变体

PCQJ92 Kan^R PlyGBS92 通过NcoI/XhoI克隆至pET28a中的738

bp PCR片段。产生的质粒编码PlyGBS

的溶菌酶结构域(第150-394位氨基酸)

PCQJ93 Kan^R PlyGBS93 通过NcoI/XhoI克隆至pET28a中的885

bp PCR片段。产生的质粒编码PlyGBS

的溶菌酶结构域和羧基端区域(第150-443

位氨基酸)。

PCQJ94 Kan^R PlyGBS94 通过NcoI/HindIII克隆至pET28a中的

441bp PCR片段。PCQJ94编码PlyGBS

的氨基端内肽酶结构域(第1-146位氨基

酸)

PCQJ95 Kan^R PlyGBS95 通过HindIII/XhoI克隆至pCQJ94中的

288bp PCR片段(plyGBS基因的羧基端，

bp 1045-1332)。产生的质粒编码具有中央

溶菌酶结构域缺失(第147-348位氨基酸缺

失)的PlyGBS突变体。

尽管已经描述本发明的多种实施方案，对本领域普通技术人员而言显而易见的是本发明范围内可以存在更多实施方案和实施方式。因此除基于后附的权利要求及其等效物之外，本发明将不受到其它限制。

序列表

<110>洛克菲勒大学(The Rockefeller University)

<120>PLY-GBS突变溶素

<130>12157-16

<150>60/710,936

<151>2005-08-24

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>443

<212>PRT

<213>无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)

<400>1

Met Ala Thr Tyr Gln Glu Tyr Lys Ser Arg Ser Asn Gly Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Asp Ile Asp Gly Ser Phe Gly Ala Gln Cys Trp Asp Gly Tyr Ala Asp

20 25 30

Tyr Cys Lys Tyr Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Cys Thr Asn Thr Gly

35 40 45

Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Glu Gln Arg His Glu Asn Gly Ile Leu Asn

50 55 60

Tyr Phe Asp Glu Val Glu Val Met Gln Ala Gly Asp Val Ala Ile Phe

65 70 75 80

Met Val Val Asp Gly Val Thr Pro Tyr Ser His Val Ala Ile Phe Asp

85 90 95

Ser Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Phe Leu Gly Gln Asn Gln Gly

100 105 110

Gly Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Leu Val Lys Ile Pro Tyr Ser Ala Thr

115 120 125

Tyr Pro Thr Ala Phe Arg Pro Lys Ser Phe Lys Asn Ala Val Thr Val

130 135 140

Thr Asp Asn Thr Gly Leu Asn Lys Gly Asp Tyr Phe Ile Asp Val Ser

145 150 155 160

Ala Tyr Gln Gln Ala Asp Leu Thr Thr Thr Cys Gln Gln Ala Gly Thr

165 170 175

Thr Lys Thr Ile Ile Lys Val Ser Glu Ser Ile Ala Trp Leu Ser Asp

180 185 190

Arg His Gln Gln Gln Ala Asn Thr Ser Asp Pro Ile Gly Tyr Tyr His

195 200 205

Phe Gly Arg Phe Gly Gly Asp Ser Ala Leu Ala Gln Arg Glu Ala Asp

210 215 220

Leu Phe Leu Ser Asn Leu Pro Ser Lys Lys Val Ser Tyr Leu Val Ile

225 230 235 240

Asp Tyr Glu Asp Ser Ala Ser Ala Asp Lys Gln Ala Asn Thr Asn Ala

245 250 255

Val Ile Ala Phe Met Asp Lys Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Lys Pro Ile

260 265 270

Tyr Tyr Ser Tyr Lys Pro Phe Thr Leu Asn Asn Ile Asp Tyr Gln Lys

275 280 285

Ile Ile Ala Lys Tyr Pro Asn Ser Ile Trp Ile Ala Gly Tyr Pro Asp

290 295 300

Tyr Glu Val Arg Thr Glu Pro Leu Trp Glu Phe Phe Pro Ser Met Asp

305 310 315 320

Gly Val Arg Trp Trp Gln Phe Thr Ser Val Gly Val Ala Gly Gly Leu

325 330 335

Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu Ala Asp Asp Ser Ser Lys Met Asp Ile

340 345 350

Pro Lys Val Asp Lys Pro Gln Glu Leu Thr Phe Tyr Gln Lys Leu Ala

355 360 365

Thr Asn Thr Lys Leu Asp Asn Ser Asn Val Pro Tyr Tyr Glu Ala Thr

370 375 380

Leu Ser Thr Asp Tyr Tyr Val Glu Ser Lys Pro Asn Ala Ser Ser Ala

385 390 395 400

Asp Lys Glu Phe Ile Lys Ala Gly Thr Arg Val Arg Val Tyr Glu Lys

405 410 415

Val Asn Gly Trp Ser Arg Ile Asn His Pro Glu Ser Ala Gln Trp Val

420 425 430

Glu Asp Asn Tyr Leu Val Asn Ala Thr Asp Met

435 440

<210>2

<211>443

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的无乳链球菌序列

<400>2

Met Ala Thr Tyr Gln Glu Tyr Lys Ser Arg Ser Asn Gly Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Asp Ile Asp Gly Ser Phe Gly Ala Gln Cys Trp Asp Gly Tyr Ala Asp

20 25 30

Tyr Cys Lys Tyr Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Cys Thr Asn Thr Gly

35 40 45

Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Glu Gln Arg His Glu Asn Gly Ile Leu Asn

50 55 60

Tyr Phe Asp Glu Val Glu Val Met Gln Ala Gly Asp Val Ala Ile Phe

65 70 75 80

Met Val Val Asp Gly Val Thr Pro Tyr Ser His Val Ala Ile Phe Asp

85 90 95

Ser Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Phe Leu Gly Gln Asn Gln Gly

100 105 110

Gly Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Leu Val Lys Ile Pro Tyr Ser Ala Thr

115 120 125

Tyr Pro Thr Ala Phe Arg Pro Lys Ser Phe Lys Asn Ala Val Thr Val

130 135 140

Thr Asp Asn Thr Gly Leu Asn Lys Gly Asp Tyr Phe Ile Asp Val Ser

145 150 155 160

Ala Tyr Gln Gln Ala Asp Leu Thr Thr Thr Cys Gln Gln Ala Gly Thr

165 170 175

Thr Lys Thr Ile Ile Lys Val Ser Glu Ser Ile Ala Trp Leu Ser Asp

180 185 190

Arg His Gln Gln Gln Ala Asn Thr Ser Asp Pro Ile Gly Tyr Tyr His

195 200 205

Phe Gly Arg Phe Gly Gly Asp Ser Ala Leu Ala Gln Arg Glu Ala Asp

210 215 220

Leu Phe Leu Ser Asn Leu Pro Ser Lys Lys Val Ser Tyr Leu Val Ile

225 230 235 240

Asp Tyr Glu Asp Ser Ala Ser Ala Asp Lys Gln Ala Asn Thr Asn Ala

245 250 255

Val Ile Ala Phe Met Asp Lys Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Lys Pro Ile

260 265 270

Tyr Tyr Ser Tyr Lys Pro Phe Thr Leu Asn Asn Ile Asp Tyr Gln Lys

275 280 285

Ile Ile Ala Lys Tyr Pro Asn Ser Ile Trp Ile Ala Gly Tyr Pro Asp

290 295 300

Tyr Glu Val Arg Thr Glu Pro Leu Trp Glu Phe Phe Pro Ser Met Asp

305 310 315 320

Gly Val Arg Trp Trp Gln Phe Thr Ser Val Gly Val Ala Gly Gly Leu

325 330 335

Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu Ala Asp Asp Ser Ser Lys Met Asp Ile

340 345 350

Pro Lys Val Asp Lys Pro Gln Glu Leu Thr Phe Tyr Gln Lys Leu Ala

355 360 365

Thr Asn Thr Lys Leu Glu Asn Ser Asn Val Pro Tyr Tyr Glu Ala Thr

370 375 380

Leu Ser Thr Asp Tyr Tyr ValGlu Ser Lys Pro Asn Ala Ser Ser Ala

385 390 395 400

Asp Lys Glu Phe Ile Lys Ala Gly Thr Arg Val Arg Val Tyr Glu Lys

405 410 415

Val Asn Gly Trp Ser Arg Ile Asn His Pro Glu Ser Ala Gln Trp Val

420 425 430

Glu Asp Asn Tyr Leu Val Asn Ala Thr Asp Met

435 440

<210>3

<211>163

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的无乳链球菌序列

<400>3

Met Ala Thr Tyr Gln Glu Tyr Lys Ser Arg Ser Asn Gly Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Asp Ile Asp Gly Ser Phe Gly Ala Gln Cys Trp Asp Gly Tyr Ala Asp

20 25 30

Tyr Cys Lys Tyr Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Cys Thr Asn Thr Gly

35 40 45

Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Glu Gln Arg His Glu Asn Gly Ile Leu Asn

50 55 60

Tyr Phe Asp Glu Val Glu Val Met Gln Ala Gly Asp Val Ala Ile Phe

65 70 75 80

Met Val Val Asp Gly Val Thr Pro Tyr Ser His Val Ala Ile Phe Asp

85 90 95

Ser Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Phe Leu Gly Gln Asn Gln Gly

100 105 110

Gly Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Leu Val Lys Ile Pro Tyr Ser Ala Thr

115 120 125

Tyr Pro Thr Ala Phe Arg Pro Lys Ser Phe Lys Asn Ala Val Thr Val

130 135 140

Thr Asp Asn Thr Gly Leu Asn Lys Gly Asp Tyr Phe Ile Asp Val Ser

145 150 155 160

Ala Tyr Gln

<210>4

<211>138

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的无乳链球菌序列

<400>4

Met Ala Thr Tyr Gln Glu Tyr Lys Ser Arg Ser Asn Gly Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Asp Ile Asp Gly Ser Phe Gly Ala Gln Cys Trp Asp Gly Tyr Ala Asp

20 25 30

Tyr Cys Lys Tyr Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Cys Thr Asn Thr Gly

35 40 45

Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Glu Gln Arg His Glu Asn Gly Ile Leu Asn

50 55 60

Tyr Phe Asp Glu Val Glu Val Met Gln Ala Gly Asp Val Ala Ile Phe

65 70 75 80

Met Val Val Asp Gly Val Thr Pro Tyr Ser His Val Ala Ile Phe Asp

85 90 95

Ser Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Phe Leu Gly Gln Asn Gln Gly

100 105 110

Gly Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Leu Val Lys Ile Pro Tyr Ser Ala Thr

115 120 125

Tyr Pro Thr Ala Phe Arg Pro Lys Ser Phe

130 135

<210>5

<211>154

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的无乳链球菌序列

<400>5

Met Ala Thr Tyr Gln Glu Tyr Lys Ser Arg Ser Asn Gly Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Asp Ile Asp Gly Ser Phe Gly Ala Gln Cys Trp Asp Gly Tyr Ala Asp

20 25 30

Tyr Cys Lys Tyr Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Cys Thr Asn Thr Gly

35 40 45

Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Glu Gln Arg His Glu Asn Gly Ile Leu Asn

50 55 60

Tyr Phe Asp Glu Val Glu Val Met Gln Ala Gly Asp Val Ala Ile Phe

65 70 75 80

Met Val Val Asp Gly Val Thr Pro Tyr Ser His Val Ala Ile Phe Asp

85 90 95

Ser Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Phe Leu Gly Gln Asn Gln Gly

100 105 110

Gly Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Leu Val Lys Ile Pro Tyr Ser Ala Thr

115 120 125

Tyr Pro Thr Ala Phe Arg Pro Lys Ser Phe Lys Asn Ala Asp Gly His

130 135 140

Ala Leu Thr Ile Gln Ser Arg Arg Asn Gly

145 150

<210>6

<211>245

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的无乳链球菌

<400>6

Leu Asn Lys Gly Asp Tyr Phe Ile Asp Val Ser Ala Tyr Gln Gln Ala

1 5 10 15

Asp Leu Thr Thr Thr Cys Gln Gln Ala Gly Thr Thr Lys Thr Ile Ile

20 25 30

Lys Val Ser Glu Ser Ile Ala Trp Leu Ser Asp Arg His Gln Gln Gln

35 40 45

Ala Asn Thr Ser Asp Pro Ile Gly Tyr Tyr His Phe Gly Arg Phe Gly

50 55 60

Gly Asp Ser Ala Leu Ala Gln Arg Glu Ala Asp Leu Phe Leu Ser Asn

65 70 75 80

Leu Pro Ser Lys Lys Val Ser Tyr Leu Val Ile Asp Tyr Glu Asp Ser

85 90 95

Ala Ser Ala Asp Lys Gln Ala Asn Thr Asn Ala Val Ile Ala Phe Met

100 105 110

Asp Lys Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Lys Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys

115 120 125

Pro Phe Thr Leu Asn Asn Ile Asp Tyr Gln Lys Ile Ile Ala Lys Tyr

130 135 140

Pro Asn Ser Ile Trp Ile Ala Gly Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Arg Thr

145 150 155 160

Glu Pro Leu Trp Glu Phe Phe Pro Ser Met Asp Gly Val Arg Trp Trp

165 170 175

Gln Phe Thr Ser Val Gly Val Ala Gly Gly Leu Asp Lys Asn Ile Val

180 185 190

Leu Leu Ala Asp Asp Ser Ser Lys Met Asp Ile Pro Lys Val Asp Lys

195 200 205

Pro Gln Glu Leu Thr Phe Tyr Gln Lys Leu Ala Thr Asn Thr Lys Leu

210 215 220

Asp Asn Ser Asn Val Pro Tyr Tyr Glu Ala Thr Leu Ser Thr Asp Tyr

225 230 235 240

Tyr Val Glu Ser Lys

245

<210>7

<211>294

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的无乳链球菌序列

<400>7

Leu Asn Lys Gly Asp Tyr Phe Ile Asp Val Ser Ala Tyr Gln Gln Ala

1 5 10 15

Asp Leu Thr Thr Thr Cys Gln Gln Ala Gly Thr Thr Lys Thr Ile Ile

20 25 30

Lys Val Ser Glu Ser Ile Ala Trp Leu Ser Asp Arg His Gln Gln Gln

35 40 45

Ala Asn Thr Ser Asp Pro Ile Gly Tyr Tyr His Phe Gly Arg Phe Gly

50 55 60

Gly Asp Ser Ala Leu Ala Gln Arg Glu Ala Asp Leu Phe Leu Ser Asn

65 70 75 80

Leu Pro Ser Lys Lys Val Ser Tyr Leu Val Ile Asp Tyr Glu Asp Ser

85 90 95

Ala Ser Ala Asp Lys Gln Ala Asn Thr Asn Ala Val Ile Ala Phe Met

100 105 110

Asp Lys Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Lys Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys

115 120 125

Pro Phe Thr Leu Asn Asn Ile Asp Tyr Gln Lys Ile Ile Ala Lys Tyr

130 135 140

Pro Asn Ser Ile Trp Ile Ala Gly Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Arg Thr

145 150 155 160

Glu Pro Leu Trp Glu Phe Phe Pro Ser Met Asp Gly Val Arg Trp Trp

165 170 175

Gln Phe Thr Ser Val Gly Val Ala Gly Gly Leu Asp Lys Asn Ile Val

180 185 190

Leu Leu Ala Asp Asp Ser Ser Lys Met Asp Ile Pro Lys Val Asp Lys

195 200 205

Pro Gln Glu Leu Thr Phe Tyr Gln Lys Leu Ala Thr Asn Thr Lys Leu

210 215 220

Asp Asn Ser Asn Val Pro Tyr Tyr Glu Ala Thr Leu Ser Thr Asp Tyr

225 230 235 240

Tyr Val Glu Ser Lys Pro Asn Ala Ser Ser Ala Asp Lys Glu Phe Ile

245 250 255

Lys Ala Gly Thr Arg Val Arg Val Tyr Glu Lys Val Asn Gly Trp Ser

260 265 270

Arg Ile Asn His Pro Glu Ser Ala Gln Trp Val Glu Asp Asn Tyr Leu

275 280 285

Val Asn Ala Thr Asp Met

290

<210>8

<211>146

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的无乳链球菌序列

<400>8

Met Ala Thr Tyr Gln Glu Tyr Lys Ser Arg Ser Asn Gly Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Asp Ile Asp Gly Ser Phe Gly Ala Gln Cys Trp Asp Gly Tyr Ala Asp

20 25 30

Tyr Cys Lys Tyr Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Cys Thr Asn Thr Gly

35 40 45

Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Glu Gln Arg His Glu Asn Gly Ile Leu Asn

50 55 60

Tyr Phe Asp Glu Val Glu Val Met Gln Ala Gly Asp Val Ala Ile Phe

65 70 75 80

Met Val Val Asp Gly Val Thr Pro Tyr Ser His Val Ala Ile Phe Asp

85 90 95

Ser Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Phe Leu Gly Gln Asn Gln Gly

100 105 110

Gly Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Leu Val Lys Ile Pro Tyr Ser Ala Thr

115 120 125

Tyr Pro Thr Ala Phe Arg Pro Lys Ser Phe Lys Asn Ala Val Thr Val

130 135 140

Thr Asp

145

<210>9

<211>241

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的无乳链球菌序列

<400>9

Met Ala Thr Tyr Gln Glu Tyr Lys Ser Arg Ser Asn Gly Asn Ala Tyr

1 5 10 15

Asp Ile Asp Gly Ser Phe Gly Ala Gln Cys Trp Asp Gly Tyr Ala Asp

20 25 30

Tyr Cys Lys Tyr Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Cys Thr Asn Thr Gly

35 40 45

Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Glu Gln Arg His Glu Asn Gly Ile Leu Asn

50 55 60

Tyr Phe Asp Glu Val Glu Val Met Gln Ala Gly Asp Val Ala Ile Phe

65 70 75 80

Met Val Val Asp Gly Val Thr Pro Tyr Ser His Val Ala Ile Phe Asp

85 90 95

Ser Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Phe Leu Gly Gln Asn Gln Gly

100 105 110

Gly Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Leu Val Lys Ile Pro Tyr Ser Ala Thr

115 120 125

Tyr Pro Thr Ala Phe Arg Pro Lys Ser Phe Lys Asn Ala Val Thr Val

130 135 140

Thr Asp Lys Met Asp Ile Pro Lys Val Asp Lys Pro Gln Glu Leu Thr

145 150 155 160

Phe Tyr Gln Lys Leu Ala Thr Asn Thr Lys Leu Asp Asn Ser Asn Val

165 170 175

Pro Tyr Tyr Glu Ala Thr Leu Ser Thr Asp Tyr Tyr Val Glu Ser Lys

180 185 190

Pro Asn Ala Ser Ser Ala Asp Lys Glu Phe Ile Lys Ala Gly Thr Arg

195 200 205

Val Arg Val Tyr Glu Lys Val Asn Gly Trp Ser Arg Ile Asn His Pro

210 215 220

Glu Ser Ala Gln Trp Val Glu Asp Asn Tyr Leu Val Asn Ala Thr Asp

225 230 235 240

Met

Claims

1.包含细菌溶素的治疗组合物，该细菌溶素包含与选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中的氨基酸序列具有至少70％同源性的分离的氨基酸序列，其中所述细菌溶素对B群链球菌细菌具有杀伤活性。

2.权利要求1所述的治疗组合物，其中杀伤活性是对第一B群链球菌细菌的第一裂解杀伤活性，该活性比PlyGBS对第一B群链球菌细菌的第二裂解杀伤活性高至少约1.5倍，其中第一裂解杀伤活性及第二裂解杀伤活性由光密度体外裂解杀伤活性试验测量；

a.其中光密度体外裂解杀伤活性试验按如下开展，即在形成试验混合物时测量试验混合物的第一OD₆₀₀并在形成试验混合物后60分钟测量试验混合物的第二OD₆₀₀，

b.其中试验混合物通过在约25℃温度混合100μL的B群链球菌细菌悬浮液与100μL的细菌溶素溶液而形成；

c.其中细菌悬浮液包含经继代培养及生长至0.3OD₆₀₀并随后添加到pH约5.0的磷酸盐缓冲盐水(40mM)中的接种细菌；

d.其中细菌溶素溶液包含在pH约5.0的PBS中的40个溶素活性单位/ml的细菌溶素制品；并且

e.其中溶素活性单位是在15分钟内导致细菌OD₆₀₀减少50％的细菌溶素最高稀释度的倒数。

3.权利要求1所述的治疗组合物，其中细菌溶素包含选自：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中的分离的氨基酸序列，其中细菌溶素对B群链球菌细菌具有第一裂解杀伤活性，该活性比PlyGBS对该B群链球菌细菌的第二裂解杀伤活性高至少约25倍。

4.权利要求1所述的治疗组合物，其中细菌溶素包含SEQ ID NO：5的分离的氨基酸序列，其中细菌溶素对B群链球菌细菌具有第一裂解杀伤活性，该活性比PlyGBS对该B群链球菌细菌的第二裂解杀伤活性高大约40倍。

5.权利要求1所述的治疗组合物，其中包含B群链球菌细菌的细菌悬浮液与3,000μg在pH约5.0的PBS中的40个溶素活性单位/ml的细菌溶素制品温育60分钟，导致按每mL菌落形成单位度量，B群链球菌细菌的生存力减少至少约400倍。

6.权利要求1所述的治疗组合物，其中分离的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：2组成。

7.权利要求1所述的治疗组合物，其中分离的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：3组成。

8.权利要求1所述的治疗组合物，其中分离的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：4组成。

9.权利要求1所述的治疗组合物，其中分离的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：5组成。

10.权利要求1所述的治疗组合物，其中分离的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：8组成.

11.权利要求1所述的治疗组合物，其中分离的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：9组成.

12.权利要求1所述的治疗组合物，还包含穴蛋白质。

13.包含细菌溶素的治疗组合物，该细菌溶素包含选自：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9的分离的氨基酸序列。

14.权利要求12所述的治疗组合物，其中细菌溶素对B群链球菌细菌具有比PlyGBS对该B群链球菌细菌的第二裂解杀伤活性高至少约1.5倍的第一裂解杀伤活性，其中第一裂解杀伤活性及第二裂解杀伤活性由光密度体外裂解杀伤活性试验测量；

a.其中光密度体外裂解杀伤活性试验按如下开展，即，在形成试验混合物时测量试验混合物的第一OD₆₀₀并在形成试验混合物后60分钟测量试验混合物的第二OD₆₀₀，

c.其中细菌悬浮液包含经继代培养及生长至0.3OD₆₀₀并且随后添加到pH约5.0的磷酸盐缓冲盐水(40mM)中的接种细菌；

15.权利要求13所述的治疗组合物，其中细菌溶素包含SEQ ID NO：5的分离的氨基酸序列，其中细菌溶素对B群链球菌细菌具有第一裂解杀伤活性，该活性比PlyGBS对该B群链球菌细菌的第二裂解杀伤活性高约40倍。

16.权利要求13所述的治疗组合物，其中细菌溶素包含选自：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中的分离的氨基酸序列，其中细菌溶素对B群链球菌细菌具有第一裂解杀伤活性，该活性比PlyGBS对该B群链球菌细菌的第二裂解杀伤活性高至少约25倍。

17.权利要求13所述的治疗组合物，其中包含B群链球菌细菌的细菌悬浮液与3,000μg在pH约5.0的PBS中的40个溶素活性单位/ml的细菌溶素制品温育60分钟，导致按每mL菌落形成单位度量，B群链球菌细菌的生存力减少至少约400倍。

18.包含细菌溶素的治疗组合物、该细菌溶素包含与SEQ ID NO：5具有至少约85％同源性的分离的氨基酸序列，其中细菌溶素对B群链球菌细菌具有第一裂解杀伤活性，该活性比PlyGBS对该B群链球菌细菌的第二裂解杀伤活性高，其中第一裂解杀伤活性及第二裂解杀伤活性由光密度体外裂解杀伤活性试验测量；

19.权利要求17所述的治疗组合物，其中细菌溶素对B群链球菌细菌具有第一裂解杀伤活性，该活性比PlyGBS对该B群链球菌细菌的第二裂解杀伤活性高约40倍。

20.权利要求17所述的治疗组合物，还包含穴蛋白质。

21.权利要求17所述的治疗组合物，其中裂解酶是嵌合的或改组的裂解酶。

22.包含含有PlyGBS肽变体的细菌溶素的治疗组合物，其中所述的PlyGBS肽变体对B群链球菌细菌具有的杀伤活性大于PlyGBS肽对该B群链球菌细菌的杀伤活性。

23.PlyGBS肽变体在制造用于治疗B群链球菌细菌性感染的组合物中的用途，其中所述的PlyGBS肽变体是对B群链球菌细菌的杀伤活性大于PlyGBS肽对该B群链球菌细菌的杀伤活性的PlyGBS突变体。