CN101326281A

CN101326281A - 用源自胎盘的干细胞制备少突胶质细胞

Info

Publication number: CN101326281A
Application number: CNA2006800461336A
Authority: CN
Inventors: 穆罕默德·黑德兰
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2005-10-13
Filing date: 2006-10-13
Publication date: 2008-12-17
Also published as: KR20080056302A; AU2006304274B2; NZ567334A; US8071376B2; IL190731A; US20070134210A1; JP2009511058A; EP1934334A1; WO2007047465A1; US20120121550A1; AU2006304274A1; ZA200803929B; IL190731A0; CA2624916A1; JP5203212B2; EP2368973A1

Abstract

本发明提供了用胎盘干细胞制备神经胶质细胞和少突胶质细胞的方法和组合物。本发明还提供了这些神经胶质和少突胶质细胞在治疗和介入治疗中的用途，例如创伤、局部缺血、中枢神经系统(CNS)的退行性疾病，特别是脱髓鞘病，如多发性硬化的治疗。

Description

用源自胎盘的干细胞制备少突胶质细胞

1.发明领域

本发明提供了用源自胎盘的干细胞(下文称作PDSC)制备神经胶质细胞和少突胶质细胞的方法和组合物。本发明还提供了这些神经胶质和少突胶质细胞在治疗和干预例如创伤、局部缺血、中枢神经系统(CNS)退行性疾病中的用途。

2.发明背景

能够产生中枢神经系统(CNS)神经胶质的胚胎干细胞可以促进脊髓创伤后的功能恢复，具有修复髓鞘脱失和髓鞘形成障碍类疾病，例如多发性硬化的潜能。但是，在临床治疗中使用胚胎干细胞会带来不易解决的伦理方面的问题。

成体干细胞也被提议用于治疗用途。例如，在细胞补给治疗动物模型中使用。只有在伦理上可接受的、自体同源的干细胞资源可获得，且使干细胞程序性地成熟转化为特定细胞类型的自体更新和命运决定可以被控制的情况下，嫁接的干细胞的治疗潜能才能用于临床用途。

神经退行性疾病的重大发病率和死亡率日益增加。髓磷脂破坏成为年轻成年人中最普遍的神经系统疾病，即多发性硬化的基础，而且髓磷脂影响创伤性脊髓损害后的修复，不但阻止损坏的神经元轴突的再生，还影响最接近的未损坏轴突中的电传导。因此，少突胶质细胞的替换是一个重要的临床目标。虽然少突胶质细胞可以由神经干细胞获得，但是这种干细胞难以得到。

3.发明概述

本发明提供了用源自胎盘的干细胞制备少突胶质细胞的方法和组合物，以及使用这种少突胶质细胞来治疗疾病、病症或状况，例如那些包括创伤、局部缺血或中枢神经系统的系统性病症的方法。例如，在一个方面，本发明涉及用源自胎盘的干细胞制备的少突胶质细胞在治疗与异常髓鞘形成有关的疾病、病症或状况中的用途。在一个实施方案中，本发明提供了制备少突胶质细胞的方法，该方法包括在一定条件下培养源自胎盘的干细胞一段时间，该时间足以使所述干细胞显示出少突胶质细胞特征。在一个具体实施方案中，所述特征是髓磷脂少突胶质细胞特异性蛋白的产生，或编码髓磷脂少突胶质细胞特异性蛋白的基因的表达。在另一个具体实施方案中，所述培养包含用异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)接触所述干细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了通过源自胎盘的干细胞的分化来制备的少突胶质细胞。本发明还提供了治疗患有与异常髓鞘形成有关的疾病、病症或状况的个体的方法，该方法包括将这种少突胶质细胞导入到所述个体。在一个更加具体的实施方案中，该疾病、病症或状况是多发性硬化。

4.附图简要描述

图1：少突胶质细胞前体细胞的成熟(McMorris&McKinnon，BrainPathology 6：313-329(1996))。抗原的短暂出现表明迁移的“早期”(O2A)前体到不迁移的“后期”(O4，前-OL原始细胞)和有丝分裂期后OL的进程。成熟可以用所示的因子可逆地抑制(ζ)或反转(7)。单克隆抗体和靶抗原在表1中列出。

图2：人胎盘干细胞。左图：原始培养中形成的胎盘干细胞克隆。右图：用异丁基甲基黄嘌呤(IBMX，一种非特异性的磷酸二酯酶抑制剂，也具有腺苷激动剂活性)处理的胎盘干细胞；免疫着色显示存在神经谱系标记包括神经干细胞标记(波形蛋白、GFAP、巢蛋白)，和神经元(神经丝蛋白、神经元特异性烯醇酶)与神经胶质(髓磷脂少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP))谱系进程的标记。

5.发明的详细描述

5.1少突胶质细胞的制备

本发明提供了用源自胎盘的细胞，尤其是胎盘干细胞，也称作胎盘源干细胞(PDSC)，来制备少突胶质细胞的方法和组合物。干细胞可以通过灌注从哺乳动物的胎盘中获得(参见，例如Hariri的美国申请公开号No.：2002/0123141和2003/0032179，其在此全文引入本文)。干细胞也可以通过破坏(例如浸渍)胎盘或其一部分(参见，例如6.2部分)从胎盘中获得。表现有少突胶质细胞特征的细胞可以从源自胎盘的干细胞中获得。所述细胞在治疗与例如髓鞘脱失或髓鞘形成障碍有关的疾病、病症或状况，如多发性硬化中是很有用的。

在一个实施方案中，可分化的细胞，例如干细胞，可能按照以下方法从胎盘获得。从胎盘，例如人胎盘灌注液中分离单核细胞(MNC)的原代培养物。该胎盘在捐赠人的知情同意下在足月婴儿出生后获得。简要地，脐血管被插入套管，然后连接到流动受到控制的回路中，且在例如如下条件下灌注胎盘：速度1mL/分钟(室温下，达到24小时)，使用Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM，Gibco公司/BRL公司)，其中含有高浓度葡萄糖、1％肝素和青霉素/链霉素。然后将胎盘灌注液(750毫升)集中、离心，并将细胞沉淀在包含1％胎牛血清(FBS)的PBS 中重悬，然后用Lymphoprep^TM(Gibco公司/BRL公司)通过差速梯度密度离心法分离。含有单核细胞的淡黄色层界面包含附着的PDSC，将该界面被回收，在DMEM/10％FBS中重悬，接种到涂纤维粘连蛋白包被的(Sigma公司)Falcon板中，并在37℃下，5％潮湿的CO₂中培养。在培养24小时后，未贴壁的细胞被抛弃，而贴壁的细胞在新鲜的培养基中维持和扩增。单个细胞克隆在10-18天形成，将其扩增为PDSC系。

人胎盘源干细胞(PDSC)在培养中显示出类似纤维原细胞的形态(图2a)，并且是HLA家族I阳性的。使用FACS分析可知，这些细胞不表达造血标记CD34或CD45。然而，它们表达多潜能表面标记：CD10(CALLA)、CD29(整联蛋白β₁)、CD54(ICAM-1)、CD90(Thy-1)以及SH2和SH3。在标准生长条件下，PDSC的数量倍增时间是18到36小时，并且细胞在体外在多于40次群落倍增中维持这一表现型。

许多研究描述了干细胞在体外和体内的神经分化，包括胚胎细胞、造血细胞和骨髓基质细胞(Glaser等，FASEB J.2005 19(1)：112-4(2005)；Rogister等，Cellular Neuroscience 14：287-300(1999)；Rao和MayerProschel，Dev.Biol.188：48-63(1997)；Anderson，Neuron 30：19-35(2001)；Rao，StemCells and Development 13：452-455(2004)；Hermanson等，Nature 419：934-939(2002)；Johe等，Genes Dev.10：3129-3140(1996))。

可以利用能提升细胞内cAMP的试剂来促进体外神经分化。为了确定源自人胎盘的细胞是否能够产生神经系，将它们在相似条件下进行体外检测。采集单层PDSC(0.25％胰蛋白酶，1mM EDTA)，然后重新接种(5×10³个/毫升)到含0.5mM IBMX(Sigma公司)的培养基中，24到72小时后，通过相差显微镜、荧光免疫检验法和流式细胞术监测形态改变。培养3天后，大约50％的细胞具有带长突起和显著的球形细胞体的神经细胞样形态，而对照培养物仍然未分化。IBMX处理的培养物也对许多神经上皮细胞系的标记显示免疫反应活性，包括神经前体细胞标记(巢蛋白、波形蛋白、GFAP)、神经元标记(烯醇酶、神经丝蛋白)和显示神经胶质标记(MOSP)的细胞(图2)。为了确定神经抗原表达的情况，对处理过的和未处理过的PDSC进行流式细胞术。用IBMX处理一天后，所有检测的标记均出现抗原表达的显著变化，未处理的细胞中没有变化。因此，在这些诱导条件下观察到的改变反映了抗原标记的快速获得，这与神经分化一致，而不是与选择性富集或存活一致。

通过在包含IBMX、神经干细胞成熟因子(例如，EGF、FGF)和/或少突胶质细胞前体细胞有丝分裂原(例如，FGF、PDGF)的培养基中培养，源自胎盘的干细胞可分化成少突胶质细胞。少突胶质细胞可以如上所述用源自胎盘的干细胞制备，并如6.1部分所述维持或培养。可以使用如6.3部分所述的免疫组织化学和PCR及如6.5部分所述的流式细胞术来评价少突胶质细胞的分化。少突胶质细胞的增殖、迁移和存活可以如6.4部分所述来评价。

5.2胎盘干细胞和胎盘干细胞群落

本发明的免疫抑制方法使用胎盘干细胞，即从胎盘或其部分中获得的干细胞，它们(1)附着在组织培养基基质上；(2)有能力分化成非胎盘细胞类型；(3)数量足够时，具有可检测的抑制免疫作用的能力，例如抑制混合淋巴细胞反应测试中的CD4⁺和/或CD8⁺干细胞的增殖。胎盘干细胞并不源自于血液，例如胎盘血或脐带血。在本发明的方法和组合物中所使用的胎盘干细胞有能力抑制个体的免疫系统，并且根据该能力进行筛选。

胎盘干细胞可以来源于胎儿或母体(即可以拥有母体或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群落或包含胎盘干细胞的细胞群落可以包含单独来源于胎儿或母体的胎盘干细胞，或者可以包含来源于胎儿和母体双方的胎盘干细胞的混合群。胎盘干细胞和包含胎盘干细胞的细胞群落可以通过形态、标记和以下讨论的培养特征来鉴别和筛选。

5.2.1物理和形态特征

本发明所使用的胎盘干细胞，当在原始培养基或细胞培养基中培养时，附着在组织培养基基质上，例如组织培养容器(例如，用于组织培养的塑料制品)的表面。在培养中，胎盘干细胞一般呈现成纤维样、星状外观，有一定数量的细胞质的突起从中央细胞体中伸出来。然而，该胎盘干细胞在形态学上与在同样条件下培养的纤维原细胞不同，因为胎盘干细胞展示的这种突起在数量上多于纤维原细胞。在形态学上，胎盘干细胞也与造血干细胞不同，造血干细胞一般在培养中呈现更加圆的或鹅卵石状的形态。

5.2.2细胞表面、分子的和遗传的标记

在本发明的方法和组合物中，适用的胎盘干细胞和胎盘干细胞群落表达多种可以用来鉴别和/或分离所述干细胞或包含所述干细胞的细胞群落的标记。本发明的所述胎盘干细胞和干细胞群落(即两种或更多种胎盘干细胞)包括从胎盘或其任何部分(例如羊膜、绒毛膜和胎盘绒毛叶等等)中直接获得的干细胞和含干细胞的细胞群落。胎盘干细胞群落也包括培养的胎盘干细胞群落(即两种或多种)、或容器(例如袋子)中的群落。但是，胎盘干细胞不是滋养层细胞。

胎盘干细胞一般表达标记CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4标记，且不表达CD34、CD38或CD45。胎盘干细胞也表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。这些标记可以被用来鉴别胎盘干细胞，并将胎盘干细胞与其它干细胞类型区别开来。因为胎盘干细胞可以表达CD73和CD105，因此它们可以有间充质干细胞的类似特征。但是，因为胎盘干细胞可以表达CD200和HLA-G，一种胚胎特异性标记，因此它们可以与既不表达CD200也不表达HLA-G的间充质干细胞(例如，源自骨髓的间充质干细胞)区别开来。同样地，不表达CD34、CD38和/或CD45可以将胎盘干细胞作为非造血干细胞鉴别出来。

在一个实施方案中，本发明提供了分离的细胞群落，该群落包含大量是CD200⁺和HLA-G⁺的免疫抑制的胎盘干细胞，其中所述的大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在该分离群落的一个具体实施方案中，所述干细胞也是CD73⁺和CD105⁺的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞也是CD34^-、CD38^-或CD45^-的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞也是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺的。在另一个实施方案中，所述分离群落在允许胚状体形成的条件下培养时，生成一个或多个胚状体。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的细胞群落，该群落包含大量是CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺的免疫抑制的胎盘干细胞，其中所述的大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在所述群落的一个具体实施方案中，所述干细胞是HLA-G⁺的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞是CD34^-、CD38^-或CD45^-的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞是CD34^-、CD38^-和CD45^-的。在一个更加具体实施方案中，所述干细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺的。在另一个具体实施方案中，所述细胞群落在允许胚状体形成的条件下培养时，生成一个或多个胚状体。

本发明提供了分离的细胞群落，该群落包含大量是CD200⁺和OCT-4⁺的免疫抑制的胎盘干细胞，其中所述的大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体实施方案中，所述干细胞是CD73⁺和CD105⁺的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞是HLA-G⁺的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞是CD34^-、CD38^-和CD45^-的。在一个更加具体实施方案中，所述干细胞是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的。在另一个具体实施方案中，群落在允许胚状体形成的条件下培养时，生成一个或多个胚状体。

本发明提供了分离的细胞群落，该群落包含大量是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的免疫抑制的胎盘干细胞，其中所述的大量细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在上述多种细胞的一个具体实施方案中，所述干细胞也是CD34^-、CD38^-或CD45^-的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞也是CD34^-、CD38^-和CD45^-的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞也是OCT-4⁺的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞也是CD200⁺的。在一个更加具体实施方案中，所述干细胞也是CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺的。

本发明也提供了分离的细胞群落，该群落包含大量是CD73⁺和CD105⁺的免疫抑制的胎盘干细胞，其中所述的大量细胞在允许胚状体形成的条件下形成一个或多个胚状体，且其中所述的多种细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体实施方案中，所述干细胞也是CD34^-、CD38^-或CD45^-的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞也是CD34^-、CD38^-和CD45^-的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞也是OCT-4⁺的。在一个更加具体实施方案中，所述干细胞也是OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的。

本发明还提供了分离的细胞群落，该群落包含大量是OCT-4⁺的免疫抑制的胎盘干细胞，其中所述的群落在允许胚状体形成的条件下培养时形成一个或多个胚状体，且其中所述的多种细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在各种实施方案中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺的干细胞。在以上群落的一个具体实施方案中，所述干细胞是CD73⁺和CD105⁺的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞是CD34^-、CD38^-或CD45^-的。在另一个具体实施方案中，所述干细胞是CD200⁺的。在一个更加具体实施方案中，所述干细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的。在另一个具体实施方案中，所述群落已被扩增，例如传代至少一次、至少三次、至少五次、至少十次、至少十五次、或至少二十次。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的细胞群落，该群落包含大量是CD29⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-和CD133^-的免疫抑制的胎盘干细胞。

在上述胎盘干细胞的一个具体实施方案中，该胎盘干细胞组成性分泌IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)。

以上引用的多种胎盘干细胞各自可以包含：直接从哺乳动物的胎盘中获得和分离的胎盘干细胞，或被培养和传代了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多代的胎盘干细胞，或它们的组合。

以上描述的免疫抑制的多种胎盘干细胞可以包含大约、至少、或不多于1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的胎盘干细胞。

5.2.3筛选和制备胎盘干细胞群落

在另一个实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中筛选大量免疫抑制的胎盘干细胞的方法，该方法包含筛选大量胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD200⁺、HLA-G⁺的胎盘干细胞，并且其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在具体实施方案中，所述筛选包含筛选是CD73⁺和CD105⁺的干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-或CD45^-的干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选也包含筛选那些在允许胚状体形成的条件下培养时会形成一个或多个胚状体的大量胎盘干细胞。

在另一个实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中筛选大量免疫抑制的胎盘干细胞的方法，该方法包含筛选大量胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺的胎盘干细胞，并且其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是HLA-G⁺的干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-或CD45^-的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-、CD45^-和HLA-G⁺的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选额外地包含筛选那些当群落在允许胚状体形成的条件下培养时会形成一个或多个胚状体的胎盘细胞群落。

在另一个实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中筛选大量免疫抑制的胎盘干细胞的方法，该方法包含筛选大量胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD200⁺、OCT-4⁺的胎盘干细胞，并且其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是HLA-G⁺的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的胎盘干细胞。

在另一个实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中筛选大量免疫抑制的胎盘干细胞的方法，该方法包含筛选多种胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺的胎盘干细胞，并且其中所述的胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测试中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-或CD45^-的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD200⁺的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺和CD200⁺的胎盘干细胞。

在另一个实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中筛选大量免疫抑制的胎盘干细胞的方法，该方法包含筛选大量胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73⁺、CD105⁺的胎盘干细胞，并且其中所述的大量细胞在允许胚状体形成的条件下形成一个或多个胚状体。在具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-或CD45^-的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是OCT-4⁺的胎盘干细胞。在一个更加具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。

在另一个实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中筛选大量免疫抑制的胎盘干细胞的方法，该方法包含筛选大量胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述分离的胎盘细胞是OCT-4⁺的干细胞，并且其中所述的大量细胞在允许胚状体形成的条件下形成一个或多个胚状体。在具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD73⁺和CD105⁺的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD34^-、CD38^-或CD45^-的胎盘干细胞。在另一个具体实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD200⁺的胎盘干细胞。在更加具体的实施方案中，所述筛选包含筛选还是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘干细胞。

本发明还提供了制备免疫抑制的胎盘干细胞群落或大量胎盘干细胞的方法。例如，本发明提供了制备群落的方法，该方法包括筛选任意以上描述的大量胎盘干细胞，并将所述大量胎盘干细胞与其它细胞(例如其它胎盘细胞)分离。在具体实施方案中，本发明提供了制备细胞群落的方法，该方法包含筛选胎盘细胞，其中所述的胎盘细胞(a)附着在基质上，(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，且在包含所述干细胞的胎盘细胞群落中且当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时允许形成一个或多个胚状体；或表达OCT-4，在包含干细胞的胎盘细胞群落中且当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时允许形成一个或多个胚状体；和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘细胞从其它细胞中分离以形成细胞群落。

在更加具体实施方案中，本发明提供了制备细胞群落的方法，该方法包括筛选胎盘干细胞，其(a)附着在基质上，(b)表达CD200和HLA-G，和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘细胞从其它细胞中分离以形成细胞群落。在另一个具体实施方案中，本发明提供了制备细胞群落的方法，该方法包括筛选胎盘干细胞，其(a)附着在基质上，(b)表达CD73、CD105和CD200，和(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘细胞从其它细胞中分离以形成细胞群落。在另一个具体实施方案中，本发明提供了制备细胞群落的方法，该方法包含筛选胎盘干细胞，其(a)附着在基质上，(b)表达CD200和OCT-4，和(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘细胞从其它细胞中分离以形成细胞群落。在另一个具体实施方案中，本发明提供了制备细胞群落的方法，该方法包括筛选胎盘干细胞，其(a)附着在基质上，(b)表达CD73和CD105，(c)在允许胚状体形成的条件下培养时形成胚状体，和(d)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘细胞从其它细胞中分离以形成细胞群落。在另一个具体实施方案中，本发明提供了制备细胞群落的方法，该方法包含筛选胎盘干细胞，其(a)附着在基质上，(b)表达CD73、CD105和HLA-G，和(c)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘细胞从其它细胞中分离以形成细胞群落。制备细胞群落的方法包含筛选胎盘干细胞，其(a)附着在基质上，(b)表达OCT-4，(c)在允许胚状体形成的条件下培养时形成胚状体，和(d)在MLR中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖；和将所述胎盘细胞从其它细胞中分离以形成细胞群落。

在制备免疫抑制的胎盘干细胞群落的方法的一个具体实施方案中，所述T细胞和所述胎盘细胞在所述MLR中存在的比率是大约5∶1。该方法中使用的胎盘细胞可以来源于完整的胎盘，或主要来源于羊膜，或羊膜和绒毛膜。在另一个具体实施方案中，相对于在所述MLR中不存在所述胎盘细胞时T细胞增殖的数量，所述胎盘细胞在MLR中抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖的至少50％、至少75％、至少90％、或至少95％。所述方法可以额外地包括筛选、和/或制备有免疫调节能力的胎盘干细胞群落，例如抑制其它免疫细胞的活性，如自然杀伤(NK)细胞的活性。

5.2.4培养生长

在此所述的胎盘干细胞的生长，如同任何哺乳动物细胞一样，部分依赖于为生长所挑选的具体培养基。在最佳条件下，胎盘干细胞一般在3到5天内数量倍增。在培养期间，本发明的胎盘干细胞附着在培养基的基质上，例如用于组织培养的容器(例如塑料组织培养皿，涂纤维粘连蛋白层的塑料制品等等)的表面，并且形成单层。

包含本发明所述的胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群落在适当条件下培养时会形成胚状体，即生长在贴壁干细胞层顶上的三维细胞簇。胚状体内部的细胞表达与非常早期干细胞相关联标记，例如OCT-4、Nanog、SSEA3和SSEA4。胚状体内部的细胞通常不像在此所述的胎盘干细胞那样附着在培养基基质上，而是在培养期间保持附着于所述贴壁细胞。胚状体的细胞依存在贴壁胎盘干细胞之上存活，因为当贴壁干细胞缺乏时胚状体不会形成。因而，在包含贴壁胎盘干细胞的胎盘细胞群落中，贴壁胎盘干细胞促进一个或多个胚状体的生长。不受任何理论的制约，认为胚状体的细胞在贴壁胎盘干细胞上生长，几乎如胚胎干细胞生长在饲养层细胞上一样。间充质干细胞(例如，源自骨髓的间充质干细胞)在培养中并不出现胚状体。

5.2.5分化

在本发明的方法中有用的胎盘干细胞分化成不同的定向细胞系。例如，胎盘干细胞可以分化成脂肪细胞系、软骨细胞系、神经细胞系或成骨细胞系。这些分化可以按照本领域的任何已知的分化方法来完成，例如源自骨髓的间充质干细胞分化成类似细胞系的方法。

5.3获得胎盘干细胞的方法

5.3.1干细胞收集组合物

本发明还提供了收集和分离胎盘干细胞的方法。一般地，使用生理学上可接受的溶液，例如干细胞收集组合物从哺乳动物的胎盘中获得干细胞。在2005年12月29日提交的题为“收集和保存胎盘干细胞的改良组合物和使用该组合物的方法(Improved Composition for Collecting and PreservingPlacental Stem Cells and Methods of Using the Composition)”的相关美国临时申请号60/754,969中详细描述了干细胞收集组合物。

干细胞收集组合物中可以包含任何生理学上可接受的适合收集和/或培养干细胞的溶液，例如，盐溶液(例如，磷酸盐缓冲液、Kreb’s溶液、改良的Kreb’s溶液、Eagle’s溶液、0.9％NaCl等)、培养基(例如，DMEM、H.DMEM等)等等。

干细胞收集组合物可以包含一种或多种倾向于保护胎盘干细胞的成分，即从收集时间到培养时间里防止胎盘干细胞死亡，或延迟胎盘干细胞的死亡，减少细胞群落中死亡的胎盘干细胞数量等。这些成分可以是，例如凋亡抑制剂(例如半胱氨酸蛋白酶抑制剂、或者JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如硫酸镁、抗高血压药物、心房利钠尿肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、硫酸吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如2-(1氢-吲哚-3-基)-3-戊基胺-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或载氧过氟化碳(例如溴代全氟辛烷、溴代全氟癸烷等)。

干细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶、或脱氧核糖核酸酶等。这些酶包括但不限于：胶原酶(例如胶原酶I、II、III或IV，来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原酶等)；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、释放酶、透明质酸酶等。

干细胞收集组合物可以包含杀菌或细菌抑制有效量的抗生素。在某些非限制性实施方案中，该抗生素是大环内酯类抗生素(例如托普霉素)、头孢菌素(例如头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如盘尼西林V)或喹诺酮类(例如氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在具体实施方案中，该抗生素是抗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌活性的，例如，绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等等。

干细胞收集组合物还可以包含一种或更多种下列化合物：腺苷(约1mM到约50mM)；D-葡萄糖(约20mM到约100mM)；镁离子(约1mM到约50mM)；分子量高于20000道尔顿的大分子，在一个实施方案中，存在的量足以维持内皮完整性和细胞生存(例如合成的或天然发生的胶体、多聚糖如葡萄聚糖或聚乙二醇，约25g/l到约100g/l，或约40g/l到约60g/l)；抗氧化剂(例如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，约25μM到约100μM)；还原剂(例如N-乙酰半胱氨酸，约0.1mM到约5mM)；防止钙进入细胞的物质(例如维拉帕米，约2μM到约25μM)；硝化甘油(例如约0.05g/l到约0.2g/l)；抗凝血剂，在一个实施方案中，存在的量足以帮助阻止残留血液凝块(例如肝素或水蛭素，约1000单位/l到约100,000单位/l)；或包含氨氯吡咪(amiloride)基团的化合物(例如氨氯吡咪、乙基异丙基氨氯吡咪、环己基氨氯吡咪、二甲基氨氯吡咪、或异丁基氨氯吡咪，约1.0μM到约5μM)。

5.3.2胎盘的收集和处理

通常，人类胎盘在产后排出不久回收。在优选实施方案中，在患者知情同意后，且患者完整的病史被记录下来并和胎盘相关联后，胎盘从患者那里回收。优选地，所述病史延续到分娩以后。这样的病史可以被用来协调胎盘或从其中收获的干细胞的后续应用。例如，人类胎盘干细胞可以作为个体化药物，依据病史，用于与胎盘相关联的婴儿，或父母、兄弟姐妹、或婴儿的其他亲属。

在回收胎盘干细胞之前，脐带血和胎盘血被移除。在某些实施方案中，分娩以后，胎盘中的脐血被回收。对胎盘进行常规的脐带血回收程序。代表性地，使用针或套管在地心引力的帮助下给胎盘放血(参见，例如Anderson的美国专利号5,372,581；Hessel等的美国专利号5,415,665)。针或套管通常被放置在脐静脉中，并且轻柔地按压胎盘以帮助脐血排出胎盘。这样的脐血回收可以商业化运行，例如LifeBank公司、Cedar Knolls N.J.，ViaCord，Cord Blood Registry and Cryocell。优选地，胎盘通过地心引力排血，不需要进一步处理，以减小脐血回收过程中的组织破坏。

典型地，将胎盘从分娩或出生室运输到另一场所，例如实验室以回收脐带血并通过例如灌注和组织分离来收集干细胞。胎盘优选在无菌的、隔热的运输设备中运输(维持胎盘温度在20-28℃之间)，例如，将夹紧了近端脐带的胎盘放置在无菌的带拉链锁的塑料袋中，然后将该塑料袋放置在隔热容器里。在另一实施方案中，用脐带血收集试剂盒来运输胎盘，该试剂盒如2005年9月19日申请的未决的美国专利申请号11/230,760所述。优选地，在分娩4到24小时后，将胎盘送达实验室。在某些实施方案中，在脐带血回收前将近端脐带夹紧，优选地，夹紧插入到胎盘面的4到5cm(厘米)处。在其它实施方案中，在脐带血回收后、胎盘的进一步处理前，夹紧近端脐带。

在干细胞收集之前，胎盘可以在室温下或5到25℃(摄氏度)的无菌条件下贮存。胎盘可以被贮存长于48小时，优选在灌注胎盘以移除任何残留脐带血之前贮存4到24小时。胎盘优选在温度5到25℃(摄氏度)下，在抗凝血剂溶液中贮存。适合的抗凝血剂溶液在本领域是公知的。例如，可以使用肝素或华法林钠溶液。在优选实施方案中，该抗凝血剂溶液包括肝素溶液(例如在1∶1000溶液中1％w/w)。放过血的胎盘在胎盘干细胞被收集前优选贮存不超过36小时。

哺乳动物的胎盘或其部分在通常如上所述收集和制备后，可以用本领域中任何已知的方式处理，例如，可以被灌注或分裂，例如用一种或多种组织破坏酶消化，以获得干细胞。

5.3.3胎盘组织的物理破坏和酶消化

在一个实施方案中，从哺乳动物的胎盘中通过对所述器官的物理破坏，例如酶消化来收集干细胞。例如，胎盘或其部分在和本发明的干细胞收集组合物相接触时可以被，例如碾碎、剪切、切碎、切成方块、剁碎、浸渍等，随后用一种或多种酶消化所述组织。胎盘或其中部分也可以被物理破坏和用一种或多种酶消化，然后将获得的材料浸入或混入本发明的干细胞收集组合物中。任何物理破坏方法都可以使用，只要该破坏方法使得大量，优选多数，优选至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的所述器官中的细胞存活下来，这可通过例如台盼蓝排除法检测。

在物理破坏和/或酶消化和干细胞回收之前，胎盘可以被分成组分。例如，胎盘干细胞可以从羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶、或它们的任何组合中获得。优选地，从包含羊膜和绒毛膜的胎盘组织中获得胎盘干细胞。典型地，胎盘干细胞可以通过破坏小块胎盘组织来获得，例如，体积为大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或大约1000立方毫米的胎盘组织块。

优选的干细胞收集组合物包含一种或多种组织破坏酶。优选使用酶的组合来进行酶消化，例如，基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，例如胶原酶和分散酶的组合。在一个实施方案中，胎盘组织的酶消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和消化透明质酸的黏液溶解酶的组合，例如胶原酶、分散酶和透明质酸酶的组合，或者释放酶(Boehringer Mannheim公司，Indianapolis，Ind.)和透明质酸酶的组合。其它可以被用来破坏胎盘组织的酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可被血清中的α2微球蛋白抑制，因此消化使用的介质通常不含血清。EDTA和脱氧核糖核酸酶在酶消化过程中通常被使用以增加细胞复苏的效率。所述消化物优选被稀释，以避免使干细胞限制于粘性消化物中。

任何组织消化酶的组合都可以使用。组织消化酶的典型浓度包括，例如胶原酶I和胶原酶IV：50-200U/mL，分散酶：1-10U/mL，弹性蛋白酶：10-100U/mL。蛋白酶可以组合使用，即两种或多种蛋白酶在同一个消化反应中使用，或者连续使用，以释放胎盘干细胞。例如，在一个实施方案中，胎盘或其部分首先用适量的2mg/ml胶原酶I消化30分钟，接下来用0.25％胰蛋白酶在37℃消化10分钟。丝氨酸蛋白酶优选在使用其它酶后使用。

在另一个实施方案中，也可以通过在用干细胞收集组合物来分离干细胞之前向包含干细胞的干细胞收集组合物中或分裂和/或消化所述组织的溶液中添加螯合剂，例如乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N，N，N′N′-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

可以理解，当完整胎盘或该胎盘的部分中包含胎儿和母体双方的细胞时(例如，当胎盘的部分包含绒毛膜或胎盘绒毛叶时)，收集到的胎盘干细胞将包含源自胎儿和母体双方来源的胎盘干细胞的混合。在胎盘的部分不包含或包含可以忽略数量的母体细胞时(例如羊膜)，收集到的胎盘干细胞将包含几乎全部属于胎儿的胎盘干细胞。

5.3.4胎盘灌注

胎盘干细胞也可以通过灌注哺乳动物的胎盘来获得。灌注哺乳动物的胎盘来获得干细胞的方法已有公开，例如Hariri的美国申请公开号2002/0123141，和2005年12月29日申请的题为“收集和保存胎盘干细胞的改良组合物和使用该组合物的方法(Improved Composition for Collecting andPreserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)”的相关美国临时申请号60/754,969。

胎盘干细胞可以通过灌注来收集，例如，经由胎盘的脉管系统，如使用干细胞收集组合物作为灌注溶液灌注。在一个实施方案中，使灌注溶液流经脐带动脉或脐带静脉或两者来灌注哺乳动物的胎盘。可能利用例如地心引力而使灌注溶液流流入胎盘从而通过胎盘。优选地，利用泵，例如蠕动泵来迫使灌注溶液通过胎盘。脐带静脉可以，例如用套管(例如聚四氟乙烯或塑料套管)插入，该套管与消过毒的连接装置，如无菌管连接。该消过毒的连接装置连接到灌注歧管上。

在灌注的准备中，胎盘优选以使脐带动脉和脐带静脉都处于胎盘的最高点上的方式定向(如悬浮)。胎盘可以通过灌注液，例如本发明的干细胞收集组合物经由胎盘的脉管系统或胎盘脉管系统和周围的组织来灌注。在一个实施方案中，脐带动脉和脐带静脉同时地被连接到吸液管上，该吸液管经由可变形的连接器连接到装有灌注溶液的蓄水池上。灌注溶液流进脐带静脉和动脉。灌注溶液渗出和/或经过血管壁，进入到胎盘的周围组织，并从胎盘的表面被收集到适当开口的容器中，该胎盘的表面是胎盘在怀孕期间附着在母亲子宫的那部分表面。灌注溶液也可能通过脐带开口导入，并且允许从胎盘壁上的开口流出或滤出，该胎盘壁是与母体子宫壁交界的那部分胎盘壁。在另一个实施方案中，灌注溶液流经脐带静脉，且从脐带动脉收集，或者流经脐带动脉，且从脐带静脉收集。

在一个实施方案中，近端脐带在灌注过程中被夹紧，优选地，近端脐带插入到胎盘面的4到5cm(厘米)被夹紧。

在放血过程中，第一次从哺乳动物胎盘收集的灌注液通常被脐血和/或胎盘血中残留的红色血细胞染色。随着灌注的进行，灌注液逐渐变成无色，而且残留的脐血细胞被洗出胎盘。开始给胎盘放血的时候，一般30到100ml(毫升)灌注液是足够的，但是根据观察结果可以使用更多或更少的灌注液。

收集胎盘干细胞所使用的灌注液的体积可以根据要收集的干细胞数量、胎盘大小、从单个胎盘中可作的收集次数等等变化。在各种实施方案中，灌注液的体积可能是50mL到5000mL、50mL到4000mL、50mL到3000mL、100mL到2000mL、250mL到2000mL、500mL到2000mL、或750mL到2000mL。典型地，在放血以后，用700到800mL灌注液灌注胎盘。

胎盘可以在几小时或几天过程中被灌注多次。当胎盘要灌注多次时，它可以在无菌条件下在容器或其它适合的器皿中保持或培养，并且使用干细胞收集组合物，或标准灌注溶液(例如，生理盐溶液，如磷酸盐缓冲液(“PBS”))，含或不含抗凝血剂(例如肝素、华法林钠、香豆素、双羟香豆素)，含或不含抗微生物剂(例如，β-巯基乙醇(0.1mM)；抗生素如链霉素(例如，浓度40-100μg/ml)、青霉素(例如，浓度40U/mL)、两性霉素B(例如，浓度0.5μg/ml)灌注。在一个实施方案中，分离的胎盘被维持或培养一段时期，而不收集灌注液，从而使胎盘在灌注和收集灌注液前被维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或2天或3天或更多天。灌注过的胎盘可以被维持一段时间或更多额外时间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多小时，且可以使用例如700-800mL灌注液再次灌注。胎盘可以被灌注1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选实施方案中，胎盘的灌注和灌注溶液例如干细胞收集组合物的收集重复进行，直到回收的有核细胞数量降到100个细胞/毫升以下。不同时间点的灌注液可以被进一步地个别处理，以回收时间依赖性细胞群落，例如干细胞。也可以将不同时间点的灌注液集中起来。

不希望受任何理论的约束，在放血和灌注胎盘足够的时间后，胎盘干细胞被认为迁移到胎盘放血的和灌注的微血管循环中，在该处，依照本发明的方法将它们收集，优选通过灌注冲洗到收集容器内来收集。灌注分离的胎盘不但移除了残留的脐带血，还为胎盘提供了适当的营养，包括氧。胎盘可以培养，且可以用用来移除残留的脐带血细胞的类似溶液来灌注，优选地，该溶液不添加抗凝血剂物质。

依照本发明的方法灌注收集得到的胎盘干细胞明显多于不用所述溶液灌注，也不用获得干细胞的其它处理(例如，通过组织破坏，例如酶消化)而从哺乳动物胎盘获得的数量。在该上下文里，“明显多于”意味着至少多10％。依照本发明的方法灌注制备的胎盘干细胞数量明显多于，例如培养胎盘或其部分而从培养物中获得的胎盘干细胞的数量。

可以用包含一种或多种蛋白酶或其它组织破坏酶的溶液通过灌注从胎盘中分离干细胞。在具体实施方案中，胎盘或其部分(例如羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或绒毛叶、或前述任何的组合)放置到25-37℃，并与一种或多种组织破坏酶在200毫升培养基中共同培养30分钟。收集灌注液中的细胞，放置到4℃，用冷的抑制剂混合物洗涤，该抑制剂混合物包含5mMEDTA、2mM二硫苏糖醇和2mM β-巯基乙醇。数分钟后，用冷的(例如4℃)本发明的干细胞收集组合物洗涤干细胞。

可以理解，根据本发明使用盆方法(pan method)灌注得到胎儿和母体细胞的混合，因为灌洗液在其从胎盘的母体方流出后收集。因此，用这个方法收集到的细胞包含来源于胎儿和母体双方的胎盘干细胞的混合群。相反，单独通过胎盘脉管系统的灌注收集到的胎盘干细胞群几乎全部来源于胎儿，因为灌注液流通过一条或两条胎盘脉管且仅通过剩余的脉管收集。

5.3.5胎盘干细胞的分离、分类和表征

来自哺乳动物胎盘的干细胞，不管是通过灌注获得还是酶消化获得，可以首先通过Ficoll梯度离心法而从其它细胞中纯化出来(即分离出来)。这种离心可以遵循任何离心速度的标准方案等。例如，在一个实施方案中，从胎盘中收集到的细胞通过在室温下5000×g离心15分钟而从灌注液中回收，从而将细胞从例如污染的碎片和血小板中分离。在另一个实施方案中，胎盘灌注液被浓缩到大约200毫升，轻柔地在Ficoll上形成分层，22℃大约1100×g离心20分钟，且低密度的中间层细胞被收集作进一步处理。

细胞沉淀可以被重悬在新鲜的干细胞收集组合物中、或适合干细胞维持的培养基中，例如，包含2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL公司，纽约州)。总的单核细胞部分可以例如使用Lymphoprep(Nycomed Pharma公司，奥斯陆，挪威)按照制造者推荐的程序来分离。

在此“分离的”胎盘干细胞指移除至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的在完整的哺乳动物胎盘内通常与干细胞相关联的细胞。当它存在的细胞群落包含少于50％的在完整的器官里通常与干细胞相关联的细胞时，来自该器官中的干细胞是“分离的”。

通过灌注或消化获得的胎盘细胞可以，例如进一步或最初使用例如添加0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州)通过胰蛋白酶消化示差法分离。胰蛋白酶消化示差法是可行的，因为胎盘干细胞通常在大约5分钟之内从塑料表面上分离，而其它附着的群落通常需要多于20-30分钟的培养。分离的胎盘干细胞可以在胰蛋白酶消化和胰蛋白酶中和之后收获，使用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS)(Cambrex公司)。在分离贴壁细胞的实施方案中，将等份的，例如5-10×10⁶个细胞置于几个T-75培养瓶，优选涂纤维粘连蛋白层的T-75培养瓶的每个中。在该实施方案中，细胞可以被培养在商业上可得到的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex公司)中，并放置于组织培养恒温箱中(37℃，5％CO₂)。在10到15天后，未贴壁细胞通过PBS冲洗而从培养瓶中被移除。然后用MSCGM替换PBS。优选每日检查培养瓶是否存在各种附着细胞类型，具体地检查成纤维样细胞簇出现和扩增。

可以监测从哺乳动物胎盘中收集到的细胞的数量和类型，例如，通过使用标准细胞检测技术如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学(例如，组织特异性或细胞标记特异性抗体染色)、荧光激活细胞分类(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)检测形态学改变和细胞表面标记来监测；通过使用光学显微镜或共聚焦显微镜检查细胞的形态来监测；和/或通过使用本领域广为人知的技术，例如PCR和基因表达谱测量基因表达的改变来监测。这些技术也可以用来鉴别对一个或多个特异性标记是阳性的细胞。例如，使用CD34抗体，使用以上技术可以检测到细胞是否包含可检测量的CD34；如果是的话，该细胞是CD34⁺的。同样的，如果细胞产生足够通过RT-PCR可检测到的OCT-4 RNA，或明显多于成体细胞的OCT-4 RNA，则该细胞是OCT-4⁺的。细胞表面标记的抗体(例如CD标记如CD34)和干细胞特异性基因的序列例如OCT-4是本领域公知的。

胎盘细胞，特别是通过Ficoll分离、不同的附着能力或两者的组合分离的细胞，可以使用荧光激活细胞分类(FACS)来分选。荧光激活细胞分类(FACS)是一种公知的分离微粒(包括细胞)的方法，基于其微粒的荧光特性(Kamarch，1987，Methods Enzymol，151：150-165)。单独的微粒中荧光部分的激光激发导致微小电荷，这允许电磁分离混合物中的正的微粒和负的微粒。在一个实施方案中，细胞表面标记特异性抗体或配体用不同的荧光标记标记。细胞通过细胞分选仪处理，这基于它们对使用的抗体的结合能力而将细胞分离。FACS分选的微粒可以直接保存到96孔板或384孔板的独立孔中以便于分离和克隆。

在一个分选方案里，来自胎盘的干细胞基于标记CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达进行分选。这可以与基于其在培养中的附着属性的干细胞筛选程序相结合来完成。例如，附着筛选干细胞可以在基于标记的表达的分选之前或之后进行。在一个实施方案中，例如，细胞首先基于它们对CD34的表达进行分选，CD34^-的细胞被保留，而且那些CD200⁺HLA-G⁺的细胞被从所有其它CD34^-的细胞中分离出来。在另一个实施方案中，来自胎盘的细胞基于它们对标记CD200和/或HLA-G的表达；例如，显示这两个标记中任一个的细胞被分离供进一步使用。表达例如CD200和/或HLA-G的细胞在一个具体实施方案中基于它们对CD73和/或CD105的表达，或基于抗体SH2、SH3或SH4识别的抗原决定部位，或基于CD34、CD38或CD45表达的缺乏可以被进一步分选。例如，在一个实施方案中，胎盘细胞通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或缺乏来分选，并且CD200⁺、HLA-G⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD34^-、CD38^-和CD45^-的胎盘细胞被从其它胎盘细胞中分离，以供进一步使用。

在另一个实施方案中，磁珠可以被用来分离细胞。细胞可以使用磁激活细胞分选(MACS)技术，一种基于它们结合磁珠(直径0.5-100μm)的能力来分离颗粒的方法来分选。可以对磁性微球体进行各种有益的修改，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将所述珠子和细胞混合以进行结合。然后使细胞通过磁场以分离出具有特定细胞表面标记的细胞。在一个实施方案中，这些细胞可以随后被分离，并与结合了额外细胞表面标记的抗体的磁珠重新混合。该细胞再一次通过磁场，以分离出结合了两种抗体的细胞。然后，将这种细胞稀释到分开的培养皿中，例如供克隆分离的微孔培养皿中。

也可以基于细胞形态和生长特征来鉴别和/或分选胎盘干细胞。例如，胎盘干细胞可以表征为具有例如培养中的成纤维样外观和/或基于该外观进行筛选。胎盘干细胞也可以表征为具有形成胚状体的能力和/或基于它们形成胚状体的能力进行筛选。在一个实施方案中，例如，将形状上成纤维样、表达CD73和CD105并且在培养中形成一个或多个胚状体的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。在另一个实施方案中，将在培养中形成一个或多个胚状体的OCT-4⁺的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。

在另一个实施方案中，可以通过克隆形成单位测试法鉴别和表征胎盘干细胞。克隆形成单位测试法在本领域中是公知的，例如Mesen Cult^TM培养基(Stem Cell Technologies公司，温哥华，英属哥伦比亚)。

使用本领域的已知标准技术可以评价胎盘干细胞的生存能力、增殖潜能和寿命，如台盼蓝排除测试、荧光素二醋酸酯吸收测试、碘化丙锭吸收测试(用于评估生存能力)，和胸腺嘧啶脱氧核苷吸收测试、MTT细胞增殖测试(用于评估增殖能力)。寿命可以通过本领域公知的方法来测定，例如通过检测长期培养中群落倍增次数的最大数量来测定。

也可以使用本领域的其它已知技术从其它胎盘细胞中分离胎盘干细胞，例如所需细胞的选择性生长(正选择)，非所需细胞的选择性淘汰(负选择)；混合群落中基于细胞凝集性差别的分离，例如用大豆凝集素；冷冻-解冻程序；过滤；常规离心和区带离心；离心洗提(反流离心)；单元重力分选；逆流分配；电泳等等。

5.4胎盘干细胞的培养

5.4.1培养基

分离的胎盘干细胞或胎盘干细胞群落或生长出胎盘干细胞的细胞或胎盘组织可以用于启始或接种细胞培养基。细胞通常被转移到无菌的用细胞外基质或配体如层粘连蛋白、胶原(例如天然的或变性的)、明胶、纤维粘连蛋白、鸟氨酸、玻璃粘连蛋白和细胞外膜蛋白质(例如MATRIGEL(BDDiscovery Labware公司，贝德福德，马萨诸塞州))涂布或未涂布的组织培养容器中。

胎盘干细胞可以在本领域所公认的干细胞培养可接受的任何条件下和任何培养基中培养。优选地，培养基包含血清。胎盘干细胞可以培养在，例如DMEM-LG(Dulbecco’s改良的必需培养基，低糖)/MCDB 201(鸡纤维原细胞基础培养基)，包含ITS(胰岛素铁硒传递蛋白)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1和青霉素/链霉素；DMEM-HG(高糖)，包含10％胎牛血清(FBS)；DMEM-HG，包含15％FBS；IMDM(Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基)，包含10％FBS、10％马血清和氢化可的松；M199，包含10％FBS、EGF和肝素；α-MEM(最低必需培养基)，包含10％FBS、GlutaMAX^TM和庆大霉素；DMEM，包含10％FBS、GlutaMAX^TM和庆大霉素等等中。优选的培养基是DMEM-LG/MCDB-201，包含2％FBS、ITS、LA+BSA、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF和青霉素/链霉素。

其它可以用来培养胎盘干细胞的培养基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle’s基础培养基、Ham’s F10培养基(F10)、Ham’s F12培养基(F12)、Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz’sL-15培养基、MCDB、DMIEM/F12、RPMI 1640、高级DMEM(Gibco公司)、DMEM/MCDB20 1(Sigma公司)、和CELL-GRO FREE。

可以将一种或多种以下成分补充进培养基，包括例如血清(例如，胎牛血清(FBS)，优选大约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选大约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制剂(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种用于控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌的物质，例如盘尼西林G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，上述成分单独或组合添加。

5.4.2胎盘干细胞的扩增和增殖

一旦分离出了胎盘干细胞或分离出了干细胞群落(例如，干细胞或干细胞群落与至少50％的在体内通常与该干细胞或干细胞群落相关联的胎盘细胞相分离)，则该干细胞或干细胞群落就可以在体外增殖和扩增。例如，胎盘干细胞群落可以在组织培养容器中，例如培养皿、培养瓶、多孔板等中培养充足的时间，以使干细胞增殖到70-90％汇合度，即该干细胞和其后代占据了70-90％的组织培养容器的培养表面区域。

可以以允许细胞生长的密度将胎盘干细胞接种到培养容器中。例如，细胞可以以低密度(例如，大约1000个到大约5000个细胞/cm²)到高密度(例如，大约50,000个或更多个细胞/cm²)接种。在优选实施方案中，细胞被培养在CO₂含量大约0％到大约5％(体积比)的空气中。在一些优选实施方案中，细胞被培养在O₂含量大约2％到大约25％的空气中，优选地，培养在O₂含量大约5％到大约20％的空气中。细胞优选地培养在大约25℃到大约40℃，优选地37℃下。细胞优选在恒温箱中培养。培养基可以是静止的或搅动的，例如，使用生物反应器。胎盘干细胞优选在低的氧化应激条件下生长(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸等等)。

一旦获得70％到90％的汇合度，可以将细胞传代。例如，可以用本领域的公知技术对所述细胞进行酶处理，例如胰蛋白酶处理以将它们从组织培养表面分离开来。在用移液管移走细胞并计数后，将大约20,000到100,000个干细胞，优选地大约50,000个干细胞传代到新的培养容器中的新鲜培养基上。典型地，新培养基和细胞转移前的培养基是同一类型的培养基。本发明包括已传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、或20次或更多次的胎盘干细胞群落。

5.4.3胎盘干细胞群落

本发明提供胎盘干细胞群落。胎盘干细胞群落可以直接从一个或多个胎盘中分离，即胎盘干细胞群落可以是包含胎盘干细胞的胎盘细胞群落，获自或包含在灌注液中；或获自或包含在消化物(即通过酶消化胎盘或其部分而获得的细胞收集)中。本发明的分离的胎盘干细胞也可以培养和扩增以制备胎盘干细胞群落。包含胎盘干细胞的胎盘细胞群落也可以培养和扩增以制备胎盘干细胞群落。

本发明的胎盘干细胞群落包含胎盘干细胞，例如如上所述的胎盘干细胞。在各种实施方案中，在分离的胎盘干细胞群落中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％的细胞是胎盘干细胞。也就是说，胎盘干细胞群落可以包含，例如多达1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的非干细胞。

本发明提供了通过例如筛选胚胎干细胞来制备分离的胎盘干细胞群落的方法，该胎盘干细胞不管是来自酶消化的还是来自灌注的都表达特定标记和/或特定的培养特性或形态特征。在一个实施方案中，例如，本发明提供了制备细胞群落的方法，该方法包括：筛选胎盘细胞，其(a)附着在基质上，和(b)表达CD200和HLA-G；和将所述细胞与其它细胞分离，以形成细胞群落。在另一个实施方案中，制备细胞群落的方法包括：筛选胎盘细胞，其(a)附着在基质上，和(b)表达CD73、CD105和CD200；和将所述细胞与其它细胞分离，以形成细胞群落。在另一个实施方案中，制备细胞群落的方法包括：筛选胎盘细胞，其(a)附着在基质上，和(b)表达CD200和OCT-4；和将所述细胞与其它细胞分离，以形成细胞群落。在另一个实施方案中，制备细胞群落的方法包括：筛选胎盘细胞，其(a)附着在基质上，(b)表达CD73和CD105，和(c)在包含所述干细胞的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时促进一个或多个胚状体的形成；和将所述细胞与其它细胞分离，以形成细胞群落。在另一个实施方案中，制备细胞群落的方法包括：筛选胎盘细胞，其(a)附着在基质上，和(b)表达CD73、CD105和HLA-G；和将所述细胞与其它细胞分离，以形成细胞群落。在另一个实施方案中，制备细胞群落的方法包括：筛选胎盘细胞，其(a)附着在基质上，(b)表达OCT-4，和(c)在包含所述干细胞的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时促进一个或多个胚状体的形成；和将所述细胞与其它细胞分离，以形成细胞群落。在上述任何实施方案中，所述方法可以额外包括筛选表达ABC-p(一种胎盘特异性ABC转运蛋白；参见，例如，Allikmets等，Cancer Res.58(23)：5337-9(1998))的胎盘细胞。所述方法也可以包括筛选表现出例如间充质干细胞所特有的至少一种特征的细胞，例如表达CD29、CD44、CD90或前述任一组合的细胞。

在以上实施方案中，所述基质可以是任何可以在其上完成培养和/或筛选细胞(例如胎盘干细胞)的表面。代表性的基质是塑料制品，例如塑料组织培养皿或塑料多孔板。用于组织培养的塑料制品可以被涂上一层生物分子，例如层粘连蛋白或纤维粘连蛋白。

可以通过细胞筛选领域的任何已知方法筛选细胞，例如胎盘干细胞以用于胎盘干细胞群落。例如，可以使用一个或多个细胞表面标记的抗体，例如在流式细胞术或FACS中筛选细胞。可以用结合抗体的磁珠来进行筛选。某些干细胞相关标记的特异性抗体在本领域里是公知的。例如，OCT-4的抗体(Abcam公司，剑桥，马萨诸塞州)、CD200的抗体(Abcam公司)、HLA-G的抗体(Abcam公司)、CD73的抗体(BD Biosciences Pharmingen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)、CD105的抗体(Abcam公司；BioDesignInternational公司，萨科(Saco)，缅因州)等。其它标记的抗体也可以从商业上得到，例如，CD34、CD38和CD45的抗体可以从例如StemCellTechnologies公司或BioDesign International公司得到。

分离的胎盘干细胞群落可以包含非干细胞的胎盘细胞，或非胎盘细胞的细胞。

分离的胎盘干细胞群落可以与一个或多个非干细胞群落或非胎盘细胞群落相组合。例如，分离的胎盘干细胞群落可以与血(例如胎盘血或脐带血)、源自血液的干细胞(例如，源自胎盘血或脐带血的干细胞)、源自血液的有核细胞群落、源自骨髓的间充质细胞、源自骨头的干细胞群落、天然骨髓、成人(成体)干细胞、包含在组织里的干细胞群落、培养的干细胞、完全分化细胞(例如，软骨细胞、纤维原细胞、羊膜细胞、造骨细胞、肌肉细胞、心肌细胞等等)的群落等等相组合。分离的胎盘干细胞群落中的细胞可以与多种另一类型的细胞相组合，比较各个群落中的有核细胞总数量，组合比率是大约100,000,000∶1、50,000,000∶1、20,000,000∶1、10,000,000∶1、5,000,000∶1、2,000,000∶1、1,000,000∶1、500,000∶1、200,000∶1、100,000∶1、50,000∶1、20,000∶1、10,000∶1、5,000∶1、2,000∶1、1,000∶1、500∶1、200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1,000、1∶2,000、1∶5,000、1∶10,000、1∶20,000、1∶50,000、1∶100,000、1∶500,000、1∶1,000,000、1∶2,000,000、1∶5,000,000、1∶10,000,000、1∶20,000,000、1∶50,000,000或大约1∶100,000,000。同样地，分离的胎盘干细胞群落中的细胞可以与多种细胞类型的大量细胞相组合。

在一实施方案中，分离的胎盘干细胞群落与大量造血干细胞相组合。这些造血干细胞可以是，例如包含在未加工的胎盘、脐带血或外周血中；在胎盘血、脐带血或外周血中所有的有核细胞中；在来自胎盘血、脐带血或外周血中的分离的CD34⁺细胞群落中；在未被加工的骨髓中；在骨髓中的所有的有核细胞中；在来自骨髓中的分离的CD34⁺细胞群落中等等。

5.5胎盘干细胞的保存

胎盘干细胞可以被保存，即放置在允许长期贮存的条件下、或抑制细胞死亡(例如凋亡或坏死)的条件下。

胎盘干细胞可以用，例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或载氧过氟化碳的组合物保存，该组合物如2005年12月25日申请的题为“收集和保存胎盘干细胞的改良组合物和使用该组合物的方法(Improved Compositionfor Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using theComposition)”的相关美国临时申请号60/754,969中所述。在一个实施方案中，本发明提供保存胎盘干细胞群落的方法，该方法包括用包含凋亡抑制剂和载氧过氟化碳的干细胞收集组合物接触所述干细胞群落，其中所述凋亡抑制剂，相对于未接触该凋亡抑制剂的干细胞群落，以足以减少或防止干细胞群落中的凋亡的数量和时间存在。在一个具体实施方案中，所述凋亡抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在另一个具体实施方案中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更加具体实施方案中，所述JNK抑制剂不调节所述干细胞的分化或增殖。在另一个实施方案中，所述干细胞收集组合物包含分开相的所述凋亡抑制剂和所述的载氧过氟化碳。在另一个实施方案中，所述干细胞收集组合物包含乳状液形式的所述凋亡抑制剂和所述载氧过氟化碳。在另一个实施方案中，干细胞收集组合物额外包含乳化剂，例如卵磷脂。在另一个实施方案中，所述凋亡抑制剂和所述过氟化碳在接触干细胞时温度在大约0℃和大约25℃。在另一个更加具体实施方案中，所述凋亡抑制剂和所述过氟化碳在接触干细胞时温度在大约2℃和10℃，或在大约2℃和大约5℃。在另一个更加具体实施方案中，所述接触在所述干细胞群落的运输过程中进行。在另一个更加具体实施方案中，所述接触在所述干细胞群落的冷冻和融化过程中进行。

在另一个实施方案中，本发明提供了保存胎盘干细胞群落的方法，该方法包括用凋亡抑制剂和器官保存化合物接触所述干细胞群落，其中所述凋亡抑制剂，相对于未接触该凋亡抑制剂的干细胞群落，以足以减少或防止干细胞群落中的凋亡的数量和时间存在。在一个具体实施方案中，器官保存化合物是UW溶液(在美国专利号4,798,824中描述；也称作ViaSpan；也可参见Southard等，Transplantation 49(2)：251-257(1990))或Stern等的美国专利号5,552,267中所描述的溶液。在另一个实施方案中，所述器官保存化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉籽糖或它们的组合。在另一个实施方案中，干细胞收集组合物额外地包含载氧过氟化碳，不管是分开成两相的还是乳状液形式的。

在本方法的另一个实施例中，在灌注过程中，胎盘干细胞与干细胞收集组合物相接触，该干细胞收集组合物包含凋亡抑制剂和载氧过氟化碳、器官保存化合物或它们的组合。在另一个实施方案中，所述干细胞在组织破坏，例如酶消化过程中被接触。在另一个实施方案中，胎盘干细胞在通过灌注收集后，或通过组织破坏例如酶消化收集后与所述干细胞收集组合物相接触。

典型地，在胎盘细胞的收集、富集和分离过程中，优选最小化或排除缺氧和机械应力引起的细胞应激。因此，在本方法的另一个实施例中，干细胞或干细胞群落在所述保存过程中在收集、富集或分离时暴露于缺氧条件少于六小时，其中的缺氧条件指氧气浓度低于通常的血氧浓度。在一个更加具体实施方案中，在所述保存过程中所述干细胞群落暴露于所述缺氧条件下少于两小时。在另一个更加具体实施方案中，在收集、富集或分离过程中所述干细胞群落暴露于所述缺氧条件下少于一小时、或少于三十分钟，或未被暴露于缺氧条件下。在另一个具体实施方案中，在收集、富集或分离过程中所述干细胞群落未暴露于剪切应力下。

本发明的胎盘干细胞可以被冷冻保藏，例如在小容器如安瓿中的冷冻保藏培养基中保藏。合适的冷冻保藏培养基包括但不限于培养基，包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如从商业上可得到的细胞冷冻培养基如C2695、C2639或C6039(Sigma公司)。冷冻保藏培养基优选包含DMSO(二甲基亚砜)，浓度为例如大约10％(v/v)。冷冻保藏培养基可以包含其它试剂，例如甲基纤维素和/或甘油。在冷冻保藏过程中，胎盘干细胞优选的冷却速度是大约1℃/分钟。优选的冷冻保藏温度是大约-80℃到大约-180℃，优选地，大约-125℃到大约-140℃。冷冻保藏的细胞在融化使用前转移到液氮中。在一些实施方案中，例如，一旦安瓿达到大约-90℃，将它们转移到液氮贮存区域。冷冻保藏的细胞优选在大约25℃到大约40℃解冻，优选地，在大约37℃解冻。

5.6胎盘干细胞的用途

5.6.1包含胎盘干细胞的组合物

本发明的抑制免疫反应的方法可以使用包含胎盘干细胞、或来自其中的生物分子的组合物。同样地，本发明的大量胎盘干细胞和胎盘干细胞群落可以与任何生理学上可接受的或医学上可接受的化合物、组合物或设备相结合以用于例如研究或治疗中。

5.6.1.1冷冻保藏的胎盘干细胞

本发明的免疫抑制的胎盘干细胞群落可以保存起来，例如冷冻保藏以供以后使用。冷冻保藏细胞例如干细胞的方法是本领域公知的。胎盘干细胞群落可以制备成易于向个体给药的方式。例如，本发明提供了包含在适合医学用途的容器内的胎盘干细胞群落。这些容器可以是，例如无菌塑料袋子、瓶子、罐子或其它容器，从中胎盘干细胞群落可以被容易地分配。例如，容器可以是适于向接受者静脉注射液体的血袋或其它塑料的、医学上可接受的袋子。容器优选是允许组合的干细胞群落冷冻保藏的容器。

冷冻保藏的免疫抑制的胎盘干细胞群落可以包含源自单一捐赠体或多个捐赠体的胎盘干细胞。胎盘干细胞群落可以与预期的接受者完全HLA-匹配，或部分HLA-不匹配，或完全HLA-不匹配。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含装在容器中的免疫抑制的胎盘干细胞群落的组合物。在具体实施方案中，该干细胞群落是冷冻保藏的。在另一个具体实施方案中，该容器是袋子、瓶子或罐子。在更加具体实施方案中，所述袋子是无菌的塑料袋子。在一个更加具体实施方案中，所述袋子适于、允许或便于所述胎盘干细胞群落的静脉给药。袋子可以包含多个互相连接的腔或隔室以允许胎盘干细胞和一种或多种其它溶液，例如药物在给药前或给药过程中混合。在另一个具体实施方案中，该组合物包含一种或多种有利于所述组合的干细胞群落的冷冻保藏的化合物。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞群落包含在生理学上可接受的水溶液内。在一个更加具体实施方案中，所述生理学上可接受的水溶液是0.9％的NaCl溶液。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞群落包含与所述干细胞群落接受者HLA-匹配的胎盘细胞。在另一个具体实施方案中，所述的组合的干细胞群落包含与所述干细胞群落接受者至少部分HLA-不匹配的胎盘细胞。在另一个具体实施方案中，所述胎盘干细胞源自多个捐赠体。

5.6.1.2药物组合物

免疫抑制的胎盘干细胞群落或包含胎盘干细胞的细胞群落可以制成药物组合物以供体内使用。这种药物组合物包含在药学上可接受的载体例如盐溶液或其它生理学上可接受的体内给药用溶液中的胎盘干细胞群落或包含胎盘干细胞的细胞群落。本发明的药物组合物可以包含在此所述的任何胎盘干细胞群落或胎盘干细胞类型。药物组合物可以包含胎儿的、母体的、或胎儿和母体双方的胎盘干细胞。此外，本发明的药物组合物可以包含从单独个体或胎盘中获得的胎盘干细胞或从多个个体或胎盘中获得的胎盘干细胞。

本发明的药物组合物可以包含任何免疫抑制数量的胎盘干细胞。例如，单一单位剂量的胎盘干细胞在各种实施方案中可以包含大约、至少、或不多于1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹个或更多个胎盘干细胞。

本发明的药物组合物包含细胞群落，该细胞群包括50％或更多活细胞(即群落中至少50％的细胞是活的或有功能的)。优选地，群落中至少60％的细胞是活细胞。更优选，药物组合物中的群落中至少70％、80％、90％、95％、或99％的细胞是活的。

本发明的药物组合物可以包含一种或多种例如有利于植入的化合物(例如抗T细胞受体的抗体、免疫抑制剂等)，稳定剂如白蛋白、葡萄聚糖40、明胶、羟乙基淀粉等。

5.6.1.3胎盘干细胞条件培养基

本发明的胎盘干细胞可以用来制备免疫抑制的条件培养基，即培养基中包含干细胞分泌或排泄的一种或多种生物分子，这些生物分子对一种或多种类型的大量的免疫细胞具有可检测的免疫抑制效果。在各种实施方案中，条件培养基包含胎盘干细胞在其中生长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培养基。在其它实施方案中，条件培养基包含胎盘干细胞在其中生长到汇合度至少是30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或达到100％汇合度的培养基。这种条件培养基可以用于支持培养分开的胎盘干细胞群落或其它种类的干细胞。在另一个实施方案中，条件培养基包含胎盘干细胞在其中分化成成体细胞类型的培养基。在另一个实施方案中，本发明的条件培养基包含胎盘干细胞和非胎盘干细胞在其中被培养的培养基。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含来自培养胎盘干细胞的培养物的培养基的组合物，其中所述胎盘干细胞(a)附着在基质上；(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，且在包含该胎盘干细胞的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时促进一个或多个胚状体的形成；或表达OCT-4且在包含该胎盘干细胞的胎盘细胞群落中，当所述群落在允许胚状体形成的条件下培养时促进一个或多个胚状体的形成；和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中可检测地抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖，其中所述胎盘干细胞的培养物在所述培养基中培养24小时或更长时间。在具体实施方案中，该组合物进一步包含大量所述的胎盘干细胞。在另一具体实施方案中，该组合物包含大量非胎盘细胞。在更加具体实施方案中，所述非胎盘细胞包含CD34⁺细胞，例如造血祖细胞，如外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞、或胎盘血造血祖细胞。非胎盘细胞也可以包含其它干细胞，例如间充质干细胞，如源自骨髓的间充质干细胞。非胎盘细胞也可以是一种或多种类型的成体细胞或细胞系。在另一个具体实施方案中，该组合物包含抗增殖物质，例如抗-MIP-1α或抗-MIP-1β抗体。

5.6.1.4包含胎盘干细胞的基质

本发明还包含包含免疫抑制的胎盘干细胞群落的基质、水凝胶、支架等。

本发明的胎盘干细胞可以被接种到天然基质上，例如胎盘生物材料，如羊膜材料上。这些羊膜材料可以是，例如直接从哺乳动物的胎盘中分割出来的羊膜；固定的或热处理过的羊膜、基本干燥(即含水量＜20％)的羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜等等。优选的可以接种胎盘干细胞的胎盘生物材料在Hariri的美国申请公开号2004/0048796中有描述。

本发明的胎盘干细胞可以被悬浮在用于，例如注射的水凝胶溶液中。适合这些组合物的水凝胶包括自组装多肽，例如RAD16。在一个实施方案中，包含细胞的水凝胶溶液可以允许被硬化，例如在模子中硬化以形成细胞分散其中用于植入的基质。这种基质中的胎盘干细胞也可以被培养，从而使得细胞在植入前被有丝分裂扩增。水凝胶是，例如有机聚合物(天然的或合成的)，其通过共价键、离子键或氢键交联形成三维开放栅格结构，该结构包埋水分子从而形成凝胶。形成水凝胶的材料包括离子地交联的多糖例如海藻酸和其盐、多肽、聚膦嗪和聚丙烯酸，或分别通过温度或pH值交联的嵌段共聚物例如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。在一些实施方案中，本发明的水凝胶或基质是可生物降解的。

在本发明的一些实施方案中，所述组合物包含原位可聚合的凝胶(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0022676；Anseth等，J.Control Release，78(1-3)：199-209(2002)；Wang等，Biomaterials，24(22)：3969-80(2003))。

在一些实施方案中，所述聚合物至少部分地可溶于水溶液中，例如水、缓冲盐溶液或水性乙醇溶液，它们具有带电荷的侧基团或其单价离子盐。具有酸性侧基团可以和阳离子反应的聚合物的例子有聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)、和磺化聚合物如磺化聚苯乙烯。具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基团的共聚物也可以使用。酸性基团的例子有羧酸基团、磺酸基团、卤化(优选地氟化)乙醇基团、酚的OH基团和酸的OH基团。

本发明的胎盘干细胞或它们共培养物可以被接种到三维框架或支架上并植入体内。这种框架可以与任何一种或多种刺激组织形成或以其它方式提高或改善本发明实施的生长因子、细胞、药物或其它成分联合植入。

本发明中可以使用的支架的例子包括非织造毡、多孔渗水的泡沫材料或自组装多肽。非织造毡可以使用纤维形成，包括人造的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物(例如，PGA/PLA)(VICRYL，Ethicon公司，萨默维尔，新泽西州)。通过步骤如冷冻干燥、或冻干法形成(参见，例如美国专利号6,355,699)形成的由例如聚(ε-己内酯/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成的泡沫材料也可用作支架。

本发明的胎盘干细胞也可以被接种到生理学上可接受的陶瓷材料上或与之相接触，该生理学上可接受的陶瓷材料包括但不限于：单-磷酸钙、双-磷酸钙、三-磷酸钙、α-三-磷酸钙、β-三-磷酸钙和四-磷酸钙，羟基磷灰石，氟磷灰石，硫酸钙，氟化钙，氧化钙，碳酸钙，磷酸钙镁盐，具有生物活性的玻璃例如

和它们的混合物。目前从商业上可得到的多孔生物相容的陶瓷材料包括

(CanMedica公司，加拿大)、(Merck Biomaterial France公司，法国)、

(Mathys，AG，Bettlach，瑞士)和矿物化胶原基骨移植产品例如HEALOS^TM(DePuy公司，Raynham，马萨诸塞州)和

RHAKOSS^TM、和

(Orthovita公司，马尔文，宾夕法尼亚州)。框架可以是天然的和/或合成的材料的混合物、共混物或合成物。

在另一个实施方案中，胎盘干细胞可以被接种到毡上或与之接触，该毡可以例如由使用生物可吸收的材料如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物，或透明质酸制造的复丝纱线制成。

本发明的胎盘干细胞可以，在另一个实施方案中，被接种到复合结构的泡沫支架上。这些泡沫支架可以被模制成有用的形状，例如需要修复、替换或增大的身体的具体结构的一部分的形状。在一些实施方案中，对框架进行处理，例如用0.1 M醋酸处理，然后在多聚赖氨酸、PBS、和/或胶原蛋白中培养，接着接种本发明的细胞，以增强细胞的附着。基质的外表面可能被改变以改善细胞的附着或生长和组织分化，例如用血浆涂布基质，或添加一种或多种蛋白质(例如胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、粘多糖(例如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等)、细胞基质、和/或其它材料，例如但不局限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖、植物胶等等。

在一些实施方案中，所述支架包含材料或用该材料处理，该材料使该支架是非凝血的。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、移植和细胞外基质沉积。这些材料和处理的例子包括但不限于：天然材料例如基底膜蛋白，如层粘连蛋白和IV型胶原，合成材料例如EPTFE，和嵌段聚氨酯脲硅树脂，如PURSPAN^TM(The Polymer Technology Group公司，伯克利，加利福尼亚州)。支架也可以包含抗血栓形成的试剂，如肝素；支架也可以在接种胎盘干细胞前被处理，来改变表面电荷(用血浆涂布)。

5.6.2永生化胎盘干细胞系

哺乳动物的胎盘细胞可以通过使用任何合适的包含促生长基因的载体来转染而有条件的永生化，该促生长基因是编码如下蛋白的基因：其在适当的条件下促进转染过的细胞的生长，从而使促生长蛋白的制备、和/或活性可通过外界因素来调控。在优选实施方案中，促生长基因是致癌基因，例如但不局限于v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、E1a腺病毒、或人乳头瘤病毒E7蛋白。

促生长蛋白的外部调控可以通过将促生长基因置于外部可调控的启动子，例如其活性可以通过，例如改变转染细胞的温度或者接触细胞的培养基的组分来调控的启动子的控制下。在一个实施方案中，四环素(tet)控制基因表达系统可以被使用(参见，Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551，1992；Hoshimaru等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：1518-1523，1996)。在缺乏tet的条件下，在这个载体中的tet控制转录激活因子(tTA)强烈的激活ph_CMV*-1，一种融合到tet操纵子序列的来自人类巨细胞病毒的最小启动子的转录。tTA是大肠杆菌的转座子-10-源抗tet操纵子的阻遏蛋白(tetR)和单纯疱疹病毒VP16的酸性结构域的融合蛋白。低的、无毒浓度的tet(例如0.01-1.0μg/mL)几乎完全消除tTA的转录激活。

在一个实施方案中，所述载体还包含编码可选择性标记，例如使药物有抗性的蛋白的基因。细菌新霉素抗性基因(neo^R)是这种标记，其可以用于本发明。带neo^R标记的细胞可能通过本领域公知的方法筛选，例如添加例如100-200μg/mL G418到生长培养基中。

转染可以用本领域公知的多种方法中的任一种来进行，包括但不限于逆转录病毒感染。通常，细胞培养物可以通过与从载体的制备细胞系收集的条件培养基和包含N2补充物的DMEM/F12培养基的混合物共同培养来转染。例如，如上所述制备的胎盘细胞培养物可以在，例如通过在一体积的条件培养基和两体积的包含N2补充物的DMEM/F12中培养大约20小时在五天后体外感染。然后，如上所述筛选带有可选择性标记的转染过的细胞。

转染以后，将培养基被传代到允许增殖的表面上，例如，允许在24小时时间内至少30％的细胞倍增。优选地，所述基质是聚鸟氨酸/层粘连蛋白基质，由涂布有聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘连蛋白(10μg/mL)的组织培养塑料制品组成；多聚赖氨酸/层粘连蛋白基质或用纤维粘连蛋白处理过的表面。然后将培养物每三到四天用生长培养基饲养，该培养基中可补充或不补充一种或多种增殖增强因子。增殖增强因子可以在培养物的汇合度少于50％时加入到生长培养基中。

当汇合度达到80-95％时，条件永生化的胎盘干细胞系可以使用标准技术来传代，例如通过胰蛋白酶作用传代。在一些实施方案中，直到大约第二十次传代其保持筛选仍是有利的(通过，例如向包含抗新霉素基因的细胞中添加G418)。细胞也可能被冷冻在液氮中作长期贮存。

克隆细胞系可以从如上所述制备的条件永生化的人类胎盘干细胞系中分离。通常，这种克隆细胞系可以使用标准技术来分离和扩增，例如通过有限稀释法或使用克隆环分离。克隆细胞系通常可以如上所述饲养和传代。

条件永生化的人类胎盘干细胞系，可以但不必须是克隆，通常可以通过在促进分化的培养条件下抑制促生长蛋白的产生和/或活性而被诱导分化。例如，如果编码促生长蛋白的基因是在外部可调控的启动子的控制下，则可以通过改变条件，例如温度或培养基组分来抑制促生长基因的转录。对于以上讨论的四环素控制的基因表达系统，可以通过添加四环素来抑制促生长基因的转录从而进行分化。通常，四到五天的1μg/mL四环素足以启动分化。为了促使进一步分化，生长培养基中可能包括其它试剂。

5.6.3测试

本发明的胚胎干细胞可以用于测试，以检测相对于未接触所述条件的胎盘干细胞，培养条件、环境因素、分子(例如生物分子、小的无机分子等)等等对干细胞的增殖、扩增和/或分化的影响。

在优选实施方案中，测试了本发明的胎盘干细胞在接触一种分子后在增殖、扩增或分化上的改变。在一个实施方案中，例如，本发明提供了鉴别调节大量胎盘干细胞的增殖的化合物的方法，该方法包括将所述大量干细胞在允许增殖的条件下与所述化合物接触，其中如果相对于未接触所述化合物的大量干细胞，所述化合物导致所述大量干细胞增殖的可检测性改变，则所述化合物被鉴定为调节胎盘干细胞增殖的化合物。在具体实施方案中，所述化合物被鉴定为增殖抑制剂。在另一个具体实施方案中，所述化合物被鉴定为增殖促进剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别调节大量胎盘干细胞的扩增的化合物的方法，该方法包含将所述大量干细胞在允许扩增的条件下与所述化合物接触，其中如果相对于未接触所述化合物的大量干细胞，所述化合物导致所述大量干细胞扩增的可检测性改变，则所述化合物被鉴定为调节胎盘干细胞扩增的化合物。在具体实施方案中，所述化合物被鉴定为扩增抑制剂。在另一个具体实施方案中，所述化合物被鉴定为扩增促进剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别调节胎盘干细胞的分化的化合物的方法，该方法包含将所述多种干细胞在允许分化的条件下与所述化合物接触，其中如果相对于未接触所述化合物的多种干细胞，所述化合物导致所述多种干细胞分化的可检测性改变，则所述化合物被鉴定为调节胎盘干细胞分化的化合物。在一个具体实施方案中，所述化合物被鉴定为分化抑制剂。在另一个具体实施方案中，所述化合物被鉴定为分化促进剂。

5.6.4胎盘干细胞库

来自产后胎盘的干细胞可以用许多不同的方式培养以制备一系列胎盘干细胞组，例如，一系列个体给药用剂量。这些组可以，例如获自来源于胎盘灌注液或酶消化的胎盘组织的干细胞。获自大量胎盘的胎盘干细胞组系列可以被安排在胎盘干细胞库中以供例如长期贮存。一般地，贴壁干细胞可以获自胎盘材料的初始培养物，以形成种子培养物，该种子培养物在受控条件下倍增大约相当的次数从而形成细胞群落。组优选来源于单独的胎盘的组织，但是可以来源于多个胎盘的组织。

在一个实施方案中，干细胞组按照以下方法获得。首先破碎胎盘组织，例如通过切碎，用适当的酶，例如胶原酶(参见上文第5.2.3部分)消化来破碎。胎盘组织优选包含，例如来自单一胎盘的完整的羊膜、完整的绒毛膜或两者，也可包含羊膜或绒毛膜的一部分。对消化的组织进行培养，例如培养大约一到三星期，优选大约两星期。在移除未附着的细胞后，形成的高密度克隆被收集，例如通过胰蛋白酶作用收集。将这些细胞收集并重悬在合适体积的培养基中，并定义为第0代细胞。

然后，将第0代细胞用来接种扩增培养基。扩增培养可以是任何分开的细胞培养设备的组合，例如，NUNC^TM的细胞工厂。第0代培养物中的细胞可以以任何程度细分以，例如用1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、或10×10⁴个干细胞接种扩增培养基。优选地，每个扩增培养基用大约2×10⁴个到大约3×10⁴个第0代细胞来接种。扩增培养的数量可以取决于第0代细胞的数量，数量上可能多一些或少一些，取决于获取干细胞的具体胎盘。

扩增培养物生长直到培养基中的细胞密度达到某一值，例如大约1×10⁵个细胞/平方厘米。这时将细胞收集起来并冷冻保藏，或者如上所述传代到新的扩增培养基中。在使用之前，细胞可以传代例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。优选在扩增培养过程中保持纪录群落倍增次数的累积数。来自第0代培养物的细胞可以扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次，或达到60次倍增次数。然而，优选地，在将细胞群落分成单个剂量之前，群落倍增次数的数量在大约15次到大约30次之间，优选地倍增次数为大约20次。在扩增过程中，细胞可以连续培养，或者可以在扩增期间的一个或多个点上被冷冻。

用于单个剂量的细胞可以被冷冻起来，例如冷冻保藏以供以后使用。单个剂量可以包含，例如大约一百万个到大约一亿个细胞每毫升，而且可以包含总数在大约10⁶个到大约10⁹个之间的细胞。

在本方法的具体实施方案中，第0代细胞被培养到大约4次倍增，然后冷冻在第一细胞库中。第一细胞库中的细胞被冷冻并用来接种第二细胞库，该第二细胞库中的细胞被扩增大约另一个8次倍增。收集这个阶段的细胞并冷冻，并用来接种允许进行大约8次额外倍增的培养基中，从而使细胞倍增次数的累积数达到大约20次。在传代的中间点的细胞可以以每毫升大约100,000个到大约一千万个细胞，优选每毫升大约一百万个细胞为单位冷冻，以供以后的扩增培养使用。倍增次数是大约20次的细胞可以以每毫升大约一百万个到大约一亿个细胞的单个剂量冷冻，以供以包含干细胞的组合物的形式给药或使用。

在优选实施方案中，对获取胎盘的捐赠体(例如母体)测试至少一种病原体。如果该母体对测试的病原体是阳性的，则将来自该胎盘的全部组抛弃。这样的测试可以在胎盘干细胞组制备期间的任何时候进行，包括在第0代细胞建立之前或之后，或在扩增培养期间。其存在被测试的病原体可以包括但不限于：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人类免疫缺陷病毒(I型和II型)、巨细胞病毒、疱疹病毒等等。

5.6.5多发性硬化的治疗

在另一个方面，本发明提供了治疗患有多发性硬化或多发性硬化相关症状的个体的方法，该方法包括向该个体以足以可检测地调节，例如抑制该个体的免疫反应的数量和时间给予大量胚胎干细胞。

多发性硬化(MS)是一种慢性的、复发性的中枢神经系统疾病。该疾病导致包围CNS和PNS轴突的髓鞘、少突胶质细胞和神经细胞自身的损伤。该疾病由自动反应的T细胞，特别是CD4⁺T细胞介导，该细胞增殖、穿越血脑屏障，并在细胞粘附分子和促炎症细胞因子的影响下进入CNS。多发性硬化的症状包括肢体中的知觉障碍、视神经功能障碍、锥体束功能障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、共济失调和复视。

已经鉴别出了MS的四种不同类型或临床过程。首先，复发/缓解型多发性硬化(RRMS)的特点是神经功能障碍的自体限制性发作，其剧烈发作，持续数日到数星期，随后恢复一段时期，有些时候不完全，持续数月。第二种类型，继发渐进型多发性硬化(SPMS)，其开始与RRMS一样，但是会发生改变从而使临床过程的特点变为稳定的功能退化，不涉及剧烈发作。第三种，原发渐进型多发性硬化(PPMS)，其特点是从发作开始功能稳定衰退，没有剧烈发作。第四种类型，渐进/复发型多发性硬化(PRMS)，其也开始于渐进性过程，功能逐渐衰退的同时偶而发作。

患有MS的人一般用运动功能评价法，任选地与MRI一起来评估。例如，一种运动功能评价法，即扩展的残疾状况量表对受疾病影响的个体的能力进行评分分级如下：

0.0神经检查正常

1.0没有残疾，在一个FS中有最小信号

1.5没有残疾，在多个FS中有最小信号

2.0在一个FS中有最小残疾

2.5在一个FS中有轻度残疾或在两个FS中有最小程度的残疾

3.0在一个FS中有中度残疾，或在三或四个FS中有轻度残疾。完全可走动

3.5完全可走动，但是在一个FS中有中度残疾和数个其它系统中有超过最小程度的残疾

4.0完全可走动，不需辅助，生活自理，尽管有相当严重的残疾，但每天起床走动大约12小时；不需辅助或休息能够行走大约500米

4.5完全可走动，不需辅助，每天起床走动大多时间，能够整日工作，完全活动可能有一些限制或需要最小限度的帮助；特点是相当严重的残疾；不需辅助或休息能够行走大约300米

5.0不需辅助或休息行走大约200米；残疾严重到足以伤害整日的日常活动(不需特殊设备的整日工作)

5.5不需辅助或休息行走大约100米；残疾严重到足以阻止整日的日常活动

6.0间歇辅助或一侧持续辅助(竹杖、拐杖、支架)下行走大约100米，需要或不需休息

6.5持续的双侧辅助(竹杖、拐杖、支架)下行走大约20米，不需休息

7.0即使在辅助下也不能行走超出大约5米，基本限制在轮椅上；自行移动到标准轮椅中并单独挪动；每天在轮椅上起床走动大约12小时

7.5行走不多于几步；限制在轮椅上；挪动时可能需要辅助；自行移动轮椅，但不能整天呆在标准轮椅上；可能需要自动轮椅

8.0基本限制在床或椅子上或在轮椅上走动，但每天可以离开床大多数时间；保留有自理功能；一般有手臂的有效使用

8.5每天的大多数时间基本限制在床上；有一些手臂的有效使用，保留部分自理功能

9.0被限制在床上；仍然可以交流和进食

9.5完全无助的卧床病人；不能有效地交流或进食/吞咽

10.0 MS引起的死亡

在以上的评分系统中，“FS”指测量的八个功能系统，包括锥体、小脑、脑干、感官、肠和膀胱、视觉、大脑和其它系统。

另外的，类似的评分系统是公知的，包括Scripps神经学等级量表、行走能力索引和多发性硬化功能综合评分(MSFC)。

MS的进展也通过发作等级的测定来评估。

MS的进展也通过核磁共振成像来评估，其可以检测MS相关的神经系统的损伤(例如新的损伤、增强的损伤、或组合的独特活性损伤)。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有MS的个体，例如被诊断为患有MS的个体的方法，该方法包括给给予该个体大量胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞能分化成少突胶质细胞，例如在该个体体内分化成少突胶质细胞。在一个具体实施方案中，所述给予可检测地改善该个体MS的一种或多种症状。在更加具体实施方案中，所述症状是，例如肢体的一个或多个知觉障碍、视神经功能障碍、锥体束功能障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、共济失调或复视。在另一个具体实施方案中，所述给予导致EDSS量表中至少半分的改善。在另一个具体实施方案中，所述给予导致EDSS量表中至少一分的改善。在另一个具体实施方案中，所述给予导致EDSS量表中至少两分的改善。在其它具体实施方案中，所述给予导致多发性硬化评估量表中或MRI中可检测到的改善。

MS已用其它治疗试剂来治疗，例如免疫调节剂或免疫抑制剂，例如干扰素β(IFNβ)，包括IFNβ-1a和IFN-1b；醋酸格拉替雷(Copaxone公司)；环磷酰胺；甲氨蝶呤；咪唑硫嘌呤(Imuran公司)；克拉屈滨(Leustatin公司)；环孢霉素；米托蒽醌；等等。MS也用抗炎症治疗剂来治疗，例如肾上腺糖皮质激素，包括促肾上腺皮质激素(ATCH)、甲基强的松龙、地塞米松等。MS还用其它类型治疗剂来治疗，例如静脉注射用免疫球蛋白、血浆置换、或柳氮磺胺吡啶。

因此，本发明还提供了治疗患有MS的个体，例如，已被诊断患有MS的个体的方法，该方法包括给予该个体大量胎盘干细胞和一种或多种治疗剂，其中所述给予可检测地改善了该个体MS的一种或多种症状，且其中的胎盘干细胞能分化成少突胶质细胞，例如在该个体内分化成少突胶质细胞。在一个实施方案中，所述治疗剂是肾上腺糖皮质激素。在具体实施方案中，肾上腺糖皮质激素是促肾上腺皮质激素(ATCH)、甲基强的松龙、或地塞米松。在另一个实施方案中，治疗剂是免疫调节剂或免疫抑制剂。在各种具体实施方案中，免疫调节剂或免疫抑制剂是IFNβ-1a、IFN-1b、醋酸格拉替雷、环磷酰胺、甲氨蝶呤、咪唑硫嘌呤、克拉屈滨、环孢霉素或米托蒽醌。在其它实施方案中，该治疗剂是静脉注射用免疫球蛋白、血浆置换、或柳氮磺胺吡啶。在另一个实施方案中，给予该个体前述治疗剂的任何组合。

患有MS的个体，例如被诊断患有MS的个体在疾病进程期间的任何时间里可以用大量胎盘干细胞，和任选的一种或多种治疗剂来治疗。例如，该个体可以在诊断后立即被治疗，或者在诊断的1、2、3、4、5、6天内，或者在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或更多星期内，或者在诊断后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多年内被治疗。在疾病的临床过程期间该个体可以被治疗一次或者多次。该个体可以在剧烈发作期间、缓解期间，或者慢性退化阶段期间被适当治疗。在另一个实施方案中，将所述胎盘干细胞给予患有MS的临产前女性，以维持在怀孕期间所经历的缓解或减少复发的状态。在一个实施方案中，该个体被给予大约三亿个胎盘干细胞的剂量。然而，剂量可以变化，取决于所述个体的身体特征，例如体重，且每剂量可以为一百万个到一百亿个胎盘干细胞，优选地一千万个到十亿个胎盘干细胞，或一亿个胎盘干细胞到五千万个胎盘干细胞。所述给予优选静脉给予，但是可以通过任何本领域接受的给予活细胞的途径给予。在一个实施方案中，该胎盘干细胞来自细胞库。

6.实施例

6.1实施例1：少突胶质细胞维持培养基

典型的维持少突胶质细胞的培养基如下：优选的培养基是无血清的配方，对于啮齿动物的OL系细胞的维持最优。基础培养基(R1236)包含高糖DMEM(Sigma公司)，补充了1 mM丙酮酸钠、抗生素(青霉素-链霉素)、0.05μg/ml胰岛素(以刺激葡萄糖转运子)、100μg/ml铁传递蛋白(铁摄入)、30nM硒(新陈代谢的协同因子)、10μM弗司扣林(forskolin)(cAMP)、60μg/ml N-乙酰半胱氨酸(Redox，生存)和5μg/ml牛血清白蛋白(运输蛋白)。啮齿动物的少突胶质细胞前体细胞使用R1236来维持，培养基中补充了有丝分裂原以促进增殖和自体更新(10ng/mL PDGF-AA+5ng/mL FGF2或20％v∶vB104条件培养基)。为了促进少突胶质细胞的分化，包含有丝分裂原的培养基用包含10μg/ml牛胰岛素+5μg/ml T3(三碘甲状腺原氨酸)的R1236代替，牛胰岛素和T3两者都是啮齿动物的少突胶质细胞的生存和成熟因子。培养基中包含的所有生长因子都是重组的(人类)多肽(R&D公司)，而且B104-cm从成神经细胞瘤细胞(可以从ATCC公司得到)，培养到50％汇合度，然后接触R1236 48小时来制备。然后过滤这种条件培养基，等分贮存在-30℃直到使用。B104是Salk学院的Dave Schubert建立的许多神经系统细胞系中的一个(Schubert等，Nature 249：224-227(1974))，且分泌支持啮齿动物的少突胶质细胞前体细胞的生存和自体更新的因子。

6.2 实施例2：通过酶消化从胎盘中获得干细胞

通过酶消化从胎盘组织中获得干细胞的例举性方案如下：获得冷冻胎盘组织(长宽高大约各自是1×1×0.5cm)。组织是脐带、胎盘的母体面或羊膜。使用的消化酶包括胰蛋白酶-EDTA(0.25％，GIBCO BRL公司)；胶原酶IA(Sigma公司)、胶原酶I(Worthington公司)、胶原酶IA(Sigma公司)+胰蛋白酶-EDTA、胶原酶I(Worthington公司)+胰蛋白酶-EDTA，或弹性蛋白酶+胶原酶I+胶原酶IV+分散酶(Worthington公司)。胎盘组织如下消化：组织在酶的存在下被切碎(1克在10毫升酶中，在50毫升管中)，试管以45°角放置，37℃下250转/分摇动1小时(C25培养振动器，New BrunswickScientific公司，埃迪逊，新泽西州，美国)。然后抛弃上清夜。沉淀用20毫升Hank’s+5％FCS冲洗(三次)，用12毫升培养基重悬。得到的3ml悬浮液等分到各自包含10毫升培养基的T-75培养瓶中(每个消化有四瓶)。可选择地，加入10毫升胰蛋白酶/EDTA，37℃下250转/分摇动30分钟，重新离心，用10毫升Hank’s+5％FCS额外冲洗一次。细胞被接种和培养，筛选贴壁细胞。

6.3 实施例3：少突胶质细胞前体谱系测试

少突胶质细胞前体细胞的出现、成熟和分化可以通过免疫化学和转录表达来检测。对于免疫化学，生长在玻璃盖玻片上的细胞在包含一定浓度的生长因子的培养基中培养。盖玻片在1-7天后移开，用4％多聚甲醛固定，然后使用谱系特异性抗体(表1)表征。使用与荧光标记连结的第二抗体(Alexa Fluors，Molecular Probes公司)来检测着色并通过荧光显微镜观察。作为阴性对照，单独使用第二抗体。免疫反应性的细胞比例通过每片盖玻片数至多200个细胞来检测。

表1.免疫组织化学的试剂：

阶段：抗体特异性靶位点来源文献

nSC： Nestin Ms IgG 轴丝 DSHB (Johe等，1996)

NRP： e-NCAM Ms IgG 轴丝 DSHB

GRP： A2B5 Ms IgM 神经节苷脂条件培养基 (Eisenbarth等，

(ATCC) 1979)

OPC： Olig2 兔IgG bHLH因子 (H.Yakoo， (Sun等，2001)

JP)

NG2 兔IgG 蛋白多糖 Chemicon (Nishiyama等，

1996)

Pdgfra 山羊IgG PDGF受体 R&D Inc. (Matsui等，1989)

Unc5b 山羊IgG Netrin受体 R&D Inc. (Lu等，2004)

O4 Ms IgM 硫脂 CM (Bansal等，1989)

OL： O1 Ms IgM GalC CM (Raff等，1978)

CNPase Ms IgG 髓鞘 Sigma (Pfeiffer等，1993)

CNPase

MBP 兔IgG 髓鞘碱性 Chemicon (Pfeiffer等，1993)

Inc

神经细胞 NF-H 神经丝蛋白 Virginia Lee

星形胶质 GFAP 兔IgG 神经胶质微 (Pfeiffer等，1993)

细胞丝

CM＝条件培养基

通过在特定的培养条件下分析转录表达来扩展免疫组织化学研究。RNA分析使用Northern印迹法(McKinnon等，1990)和RT-PCR(McKinnon等，1993b)。回收生长在60mm板内的细胞，并用TRIzol试剂(Gibco公司)收获RNA。对于RT-PCR，通过将1μgRNA逆转录成cDNA来进行分析(MoMuLV逆转录酶；cDNA产量1∶1)。然后，使用50-100ng cDNA作为PCR扩增的模板，并使用Taq聚合酶和在文献中(参见，例如，McKinnon等，Glia 7：245-254(1993))描述的引物选择程序选择的合成引物。引物构建成与编码谱系特异性少突胶质细胞和少突胶质细胞前体蛋白转录体杂交。对于新的引物对，使用梯度(±10℃)来建立最佳的扩增参数。PCR片段通过电泳来解析，通过EtBr染色来可视化，并通过自动化DNA序列分析(DNAcore facility公司)确定其身份。

6.4实施例4：增殖、迁移和生存测试

增殖测试：少突胶质细胞前体对特异性配体产生促有丝分裂响应的能力用定量³H-胸腺嘧啶掺入测试来测量。将细胞暴露于生长因子，其剂量引起FGF和PDGF的最大响应，以检测一半最大值响应值。响应范围从背景的500-1000cpm(无生长因子)到10,000cpm(重组的PDGF-AA)，而且测试足够敏感而能精确地探测出部分促有丝分裂响应。所有的细胞增殖测试任选独立地进行至少3次。对于定性测试，在50μM BrdU(Sigma公司)存在下，使细胞暴露于有丝分裂原最后四小时，并通过对BrdU(Osterhout等，J.Neurosci.17：9122-9132(1997))和第二谱系标记的双重荧光免疫检验法来监控DNA合成。

对细胞进行增殖测试，该细胞在暴露于重组生长因子前已经移除了有丝分裂原24小时，以降低DNA合成的背景水平。在此所述的增殖测试通过增加的DNA合成并在依赖于向生长因子的暴露的这个测试的最后4小时期间掺入³H-胸腺嘧啶，从而测量了对有丝分裂原的响应。96孔板中的细胞(2,000个细胞/孔)在缺乏生长因子的R1236培养基中培养24小时，然后在特定浓度的因子的存在下培养24小时，在0.5μCi/ml³H-胸腺嘧啶(Amersham公司)存在下培养最后4小时。使用自动收获仪(Brandel公司)来回收核酸，并通过闪烁计数法测量掺入的放射性。对每个生长因子浓度进行三组(三孔)测试。

迁移测试：少突胶质细胞前体细胞的迁移能力(趋化现象)和它们对生长因子的响应中的指向性响应通过电影照相术测量。定量测试使用改良的Boyden小室测试(Armstrong等，1990)。在这个测试中，PDGF-AA介导的趋化现象(4,000个细胞/平方毫米)可以通过对趋化室的上层和下层孔中均加入诱导剂(阻止趋化现象，但不阻止化学运动性)而与背景迁移(1,000个细胞/平方毫米)和化学运动性(随意运动)区分开来(参见Armstrong等，J.Neurosci.Res.27：400-407(1990))。

细胞在缺乏有丝分裂原的培养基中培养16小时，然后被转移到微趋化室的顶部孔中(20,000个细胞/孔)，培养基为确定成分的培养基，通过聚碳酸酯过滤器将它们与包含加有引诱剂的培养基的下层室分开。每一浓度的生长因子添加三个孔，且细胞在37℃下培养16小时。过滤器的下层每平方毫米迁移的细胞数量通过对GFP标记的细胞计数来确定，和迁移总数在使用Dip-Quik(American Scientific公司)对膜进行着色后测定。

生存测试：单独的少突胶质细胞前体细胞的生存能力使用MTT测试(Mosmann，1983)以及使用染色质片段(核小体梯带)按照描述(Yasuda等，J.Neurosci.Res.40：306-3 17(1995))用改良的TUNEL测试(Gavrieli等，J.Cell.Biol.119：493-501(1992))来测定。细胞在含有bFGF、PDGF-AA的培养基或不含生长因子的培养基中培养24小时，在突变型和野生型OL的培养之间对比掺入MTT的细胞数量或缺口末端标记的水平。使用PI3K抑制剂渥曼青霉素，作为细胞死亡的阳性对照(Ebner等，J.Neurosci.Res.62：336-345(2000))。

对生长在96孔板中的细胞进行MTT测试，标记细胞的比例将按照之前的描述通过对着色细胞计数的方法来检测(Barres等，Cell 70：31-46(1992))。bFGF和PDGF-AA防止DNA片段化的能力分析染色质DNA来检测，该染色质DNA来自在存在或不存在渐增浓度的这些因子的条件下生长的细胞。对于定量分析，将生长在96孔板中的细胞在37℃下在包含4单位末端转移酶(Promega Biotech.公司)、2μCi[a-³²P]-双脱氧ATP(Amersham公司)、和0.3％Triton X-100的PBS溶液中培养60分钟，然后在Whatman GF/C过滤器(Brandel Cell Harvester公司)上收获细胞溶解产物，并且通过液体闪烁计数法来检测DNA 3’-末端的³²P掺入。该测试是酶依赖性的，且产生10,000cpm的背景，和在1μM星形孢菌素(Ebner，2000)存在下培养72小时的细胞中掺入100,000cpm。对于核小体梯带的定性分析，从生长在35mm培养皿中的细胞中分离DNA，用末端转移酶和³²P-ddATP体外标记末端，在琼脂糖凝胶中依大小解析核小体大小的片段，且通过光密度测定法检测掺入的放射性。

6.5实施例5：流式细胞术

为了进行用于流式细胞术的细胞内着色，用0.5毫升的Beckman CoulterIntraPrep试剂对大约5×10⁵个PDSC的细胞膜透化15分钟。用PBS冲洗后，将细胞与第一抗体(1g)在冰上共同培养30分钟，随后冲洗两次。将细胞在1∶100的第二抗体中重悬，并培养30分钟。在着色以后，将细胞冲洗两次，并立即在BeckmanCoulter XL-MCL流式细胞仪上分析。为了评估未处理的细胞和IBMX-诱导的细胞中的蛋白表达，使用FL1(FITC)和FL2(CY3)信号收集1.5×10×10⁴个细胞。通过使用高度前向和直角的光散射窗口或通过碘化丙啶(PI)排除法来排除死细胞和碎片。

鼠、兔和驴的第一抗体和最终稀释度如下：兔抗-巢蛋白，1∶100(BDPharMingen公司)；小鼠抗-神经元特异性烯醇酶，1∶100(Chemicon公司)；小鼠抗-髓磷脂/少突胶质细胞特异性蛋白，1∶100(DAKO公司)；小鼠抗-神经丝蛋白-L，1∶100(DAKO公司)；兔抗-神经胶质纤维酸性蛋白，1∶200(DAKO公司)；小鼠抗-波形蛋白，1∶100(BD PharMingen公司)。以下在流式细胞术实验中使用的抗体可以从Becton Dickinson公司得到，而且使用的稀释度为1∶10：抗-CD45、抗-CD34、抗-CD29、抗-CD10、抗-HLA-1、抗-CD54、抗-CD90、抗-SH2、和抗-SH3。

细胞在包含10％FCS的DMEM中在聚鸟氨酸涂层的玻璃盖玻片(Sigma公司)上培养。细胞在PBS中用4％多聚甲醛固定10分钟，而且用0.2％TritonX-100的PBS溶液在室温下透化10分钟。然后细胞和第一抗体在37℃下共同培养30分钟。随后用PBS冲洗三次，将细胞与荧光素(FITC)-结合的驴抗-小鼠IgG(Jackson实验室)或者Cy3-结合的山羊抗-兔IgG(Jackson实验室)共同培养，两者都在37℃下在黑暗中培养30分钟，稀释度为1∶50。冲洗标记细胞，而且用Vectashield封固剂(Vector实验室)封固。

Claims

1.制备少突胶质细胞的方法，该方法包含培养源自胎盘的干细胞，该培养的条件和时间足以使所述干细胞表现出少突胶质细胞特征。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述特征是产生髓磷脂少突胶质细胞特异性蛋白，或编码髓磷脂少突胶质细胞特异性蛋白的基因表达。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述培养包括将所述干细胞与异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)接触。

4.由权利要求1所述的方法制备的少突胶质细胞。

5.治疗患有异常髓鞘形成相关疾病、病症或状况的个体的方法，该方法包含将如权利要求4所述的少突胶质细胞导入到该个体中。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述的疾病、病症或状况是多发性硬化。