CN101348524A - 蛋白质稳定制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在各种冻干制剂和组合物中稳定骨形态发生蛋白(BMP′s)。本发明包括主要含有作为赋形剂的海藻糖并且任选含有其它赋形剂的制剂，海藻糖用于冻干组合物以及其随后的储存和重构，其它赋形剂例如缓冲剂和表面活性剂。

Description

蛋白质稳定制剂
技术领域
本发明涉及用于稳定骨形态发生蛋白(BMP′s)的制剂和方法，和涉及处理、存储和重构期间的密切相关的生长和分化因子(GDF′s)。更特别的，本发明涉及由海藻糖和在冻干、储存和重构期间保护rhGDF-5的其它赋形剂组成的制剂，包括用作赋形剂以递送rhGDF-5的各种底物。此外，本发明包括制备和使用这些制剂以治疗各种肌骨骼缺陷和疾病的方法。
背景技术
生物分子具有三维结构或构型，并且其生物学活性和性质依赖于这种结构。这些生物分子的实例包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质。这些生物分子对生命必不可少，并且代表了各种医学疾病和病症的治疗中的治疗剂和靶体。蛋白质代表了较宽种类的生物分子。不同种类的蛋白质例如酶、生长因子、受体、抗体和信号分子的生物学活性取决于其构型结构。其它种类的蛋白主要为结构性的，例如胶原和软骨，其本身不具有生物学活性。
使生物分子暴露于各种环境中，例如pH、温度、溶剂、渗透度等的变化可能不可逆改变或变性生物分子的构型状态，使其生物学无活性。这些生物分子失活中涉及的某些机制包括聚集、氧化、各种类型的键裂解包括水解和脱酰胺，以及各种类型的键形成，包括交联和其它共价键合，例如二硫键的重排。
骨形态发生蛋白和密切相关的生长分化因子(单体和二聚形式)属于TGF-β超家族蛋白质。这类蛋白质包括骨形态发生蛋白系中的成员，通过其诱导异位软骨内骨形成的能力而初始确认(参见Cheng等人，“Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenicproteins”J.Bone Joint Surg.Am.85A：1544-52(2003))。部分这些蛋白质具有其它命名(参见Lories等人，Cytokine Growth Factor Rev 16：287-98(2005))。这类中的所有成员具有共同的结构特征，包括羧基末端的活性区域，以及成熟长度为约97-106个氨基酸。所有成员具有半胱氨酸残基的高保守模式，其产生3个分子内二硫键和一个分子间二硫键。活性形式可为单个家族成员的二硫键连的同二聚体，或为两种不同家族成员的杂二聚体。(参见Massague Annu.Rev.Cell Biol.6：957(1990)；Sampath等人。J.Biol.Chem.265：13198(1990)；Ozkaynak等人。EMBO J.9：2085-93(1990)；Wharton等人，PNAS 88：9214-18(1991)；Celeste等人，PNAS 87：9843-47(1990)；Lyons等人，PNAS 86：4554-58(1989)，美国专利US 5,011,691和美国专利US 5,266,683)。
已经证实多种糖能够在溶液中稳定生物分子并且对分离细胞和生物分子产生保护。这些化合物在多种物种中作为冷冻保护剂和渗透压调节剂沿用已久。(参见Yancey J.Exper.Biol.208：2819-30(2005))。在冻干药物蛋白质的发展过程中，糖(糖类和多元醇)通常加入到制剂中以改善蛋白质的稳定性并延长存储期限。关于糖稳定作用的机理，存在两种主要理论：1)糖赋形剂用于稀释固态的蛋白，由此降低蛋白质相互作用并防止分子降解，例如聚合，和2)糖赋形剂提供玻璃状基质，由此使得蛋白质流动性和反应性最小化。在这两个机理中，关键的是糖保持在无定形、与蛋白质接触的状态。各种环境因素例如增加的温度和湿度可能诱导糖的结晶。因此，重要的是使得使用的条件和材料最优化以适于考虑使用的具体生物分子和体系。
冻干为通常用于保存生物分子的方法。通常认为冻干比冷冻-融化或温度所致变性作用对生物分子的生物学活性更具有破坏作用。损伤程度很大程度上取决于不同的生物分子和不同的条件，并且各方面研究人员已经研究了不同的体系。水溶液的冷冻导致溶液浓度初始增加，并且对不稳定的化合物来说比冷冻本身更具破坏力。可以加入例如糖、蛋白质、聚合物、缓冲剂和表面活性剂的赋形剂以稳定生物分子的活性，然而取决于体系，具有有限和不同程度的成功。Crowe等人描述了通过糖稳定干燥磷脂双层和蛋白质(Biochem.J.242：1-10(1987))，并且在“Thetrehalose myth revisited：Introduction to a symposium on stabilization ofcells in the dry state”，Cryobiology 43，89-105(2001)中公开了海藻糖稳定细胞机制的最新理解。为了维持有活力和有用的冻干的蛋白质，目前认为存在两种单独和不同的需要：1)蛋白质在冷冻过程中必须保护，和2)蛋白质必须在随后的干燥和重构期间保护。这些是不同的需要，没有必要通过任何一种赋形剂或条件的设定来满足。
不同研究人员已经报道了使用各种赋形剂来保护各种生物分子，例如Gloger等人(Intl.J.Pharm.260：59-68(2003))公开了使用低分子量右旋糖苷稳定蛋白质对aviscumine的冻干保护，并且表明缓冲体系和聚山梨醇酯80单独适于在冷冻期间保护蛋白质，然而在干燥期间需要右旋糖来保护蛋白质；Goodnough等人(Appl.Env.Biol.58(10：3426-28(1992))研究了使用血清蛋白作为稳定剂和各种其它赋形剂在冻干期间A型肉毒毒素的稳定性，并且报道没有赋形剂具有任何有益的作用，然而通过从冻干混合物中除去NaCl并且控制pH，活性毒素的复原显著提高；Costantino等人(J.Pharm.Sci.87(11)：1412-20(1998))描述了各种糖对冻干的重组人生长激素稳定性和结构的影响，并且表明全部测试的赋形剂显著改善了蛋白质的稳定性；Ramos等人(Appl.Envir Microbiol.63(10)：4020-25(1997))表明2-O-β-甘露糖基甘油酸酯在保护多种从各种来源分离的脱氢酶中有效，并且对于全部研究的酶，2-O-β-甘露糖基甘油酸酯赋予的保护与海藻糖相似或者优于海藻糖，然而在保护由P.furiosis分离的谷氨酸脱氢酶时并不有效；Brus等人(J.Control.Rel.95：119-31(2004))研究了寡聚核苷酸-聚乙烯亚胺(PEI)络合物进行冻干的稳定性，并且报道了这些络合物没有受益于例如蔗糖或海藻糖的糖类的加入，但质体-PEI络合物则的确受益于这些糖类的加入。根据不同方法在各种生物分子上的测定，这些研究人员报道了不同程度的成功。没有研究人员曾经报道对BMP的保护。
因此，对于什么是赋形剂的最佳组合以对生物分子的冻干提供保护存在不一致的证据。没有任何一种赋形剂的组合对全部生物分子都是最佳的，相反需要进行有效程度的实验以得到所研究的生物分子的希望的结果。仍然需要药学上可接受的赋形剂的组合以在冻干、储存和使用期间保护BMP。
附图说明
图1表示实施例6所述的rhGDF-5的海藻糖制剂的DSC曲线。所述制剂为冻干海藻糖+GDF-5，其中实施例6-rhGDF-5浓度：0.5毫克/瓶，赋形剂浓度：50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。其中冻干制剂使用水重构。最终浓度为0.33毫克/毫升蛋白质+3.3％海藻糖。
图2表示实施例7所述的rhGDF-5的甘露醇制剂的DSC曲线。所述制剂为冻干甘露醇糖+rhGDF-5，其中实施例7-rhGDF-5浓度：0.5毫克/瓶，甘露醇浓度：50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。其中冻干制剂使用水重构。最终浓度为0.33毫克/毫升蛋白质+3.3％甘露醇。
图3表示rhGDF-5天然蛋白质的DSC曲线。其中0.01％TFA中GDF-5浓度：1.04毫克/毫升，没有赋形剂，相对于0.01％TFA渗析。其中10mM盐酸中3.8毫克/毫升原料GDF-5相对于0.01％TFA渗析。最终蛋白质浓度为1.04毫克/毫升。
图4表示实施例6所述的rhGDF-5的海藻糖制剂的偏振光显微图，其表明海藻糖的所需无定形状态。其为冻干制剂：实施例6，rhGDF-5浓度：0.5毫克/瓶，海藻糖：50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。
图5表示实施例7所述的rhGDF-5的甘露醇制剂的偏振光显微图，其表明甘露醇的非所需结晶状态。其为冻干制剂：实施例7，rhGDF-5浓度：0.5毫克/瓶，甘露醇：50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。
图6表示如实施例12所述在40℃/75％RH下6个月后rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸制剂的rpHPLC曲线。
图7表示如实施例12所述在40℃/75％RH下6个月后rhGDF-5/海藻糖/HCl制剂的rpHPLC曲线。
图8、9和10表示如实施例12所述在5℃、25℃和40℃在不同时间点储存时各种测试缓冲液的蛋白质回收百分率。其中图8表示使用pH为3的不同缓冲液体系冻干的rhGDF-5在5℃的稳定性；图9表示使用pH为3的不同缓冲液体系冻干的rhGDF-5在25℃储存后的稳定性；图10表示使用pH为3的不同缓冲液体系冻干的rhGDF-5在40℃储存后的稳定性。
图11表示如实施例14所述在pH 3的甘氨酸缓冲液中使用5％或10％海藻糖在选定温度冻干的不同浓度rhGDF-5的稳定性。
发明内容
本发明一般涉及在各种制剂和组合物中稳定BMP，由此保持生物活性的至少60％并且改善储藏条件要求，例如温度和湿度。本发明包括主要含有海藻糖作为赋形剂的、用于含有BMP的冻干组合物的制剂以及其随后的储存和重构，并且另外含有包括缓冲剂和表面活性剂的其它赋形剂。
本发明人已经令人吃惊地发现，海藻糖在冻干期间和冻干之后足以保存BMP的生物学活性并且优于其它赋形剂。在多种其它生物分子的稳定中，若非BMP存在较大差异，对于得到保护的量，在各种糖之间存在很少的差异。这种发现提供了在患者中治疗各种肌骨骼缺陷的组合物，而没有加入赋形剂的不良反应。本发明人还令人吃惊地发现，例如抗坏血酸和谷胱甘肽的抗氧化剂的加入并没有提高使用海藻糖冻干的BMP的稳定性，而是降低了通过海藻糖得到的稳定性。
本发明的一个目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖，由此BMP在再水化作用时保持至少60％的生物学活性，所述再水化的液体产物易于被外科医生处理。
本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖、至少一种BMP和其它赋形剂，所述其它赋形剂选自缓冲剂、表面活性剂以及其混合物，由此BMP在再水化作用时保持至少60％的生物学活性，所述再水化的液体产物易于被外科医生处理。
本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖、至少一种BMP和粉碎的(morselized)胶原纤维以提供组合物，以及制备含有BMP的冻干的生物相容的可流动材料的方法，该材料稳定并且在再水化作用时保持至少60％的生物学活性，由此所述再水化的产品易于被外科医生处理。
本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖、至少一种BMP和生物相容的基质以提供组合物，以及制备含有BMP的冻干的生物相容的基质的方法，该基质稳定并且在再水化作用时保持至少60％的生物学活性，由此所述再水化的产品易于被外科医生处理。示例性的生物相容的基质包括胶原、矿物化胶原、磷酸钙的盐、含有钙的陶瓷、各种来源的骨骼包括自生、外源和异体的骨骼，以及聚合物，包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、PLA-PGA共聚物、聚碳酸酯、聚己酸内酯以及其混合物。
本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的海藻糖、至少一种BMP、生物相容的基质和其它赋形剂，所述其它赋形剂选自缓冲剂、表面活性剂以及其混合物，以提供组合物和制备含有BMP的冻干的生物相容的基质的方法，该基质稳定并且在再水化作用时保持至少60％的生物学活性，由此所述再水化的产品易于被外科医生处理。
本发明另一目的是使用足以稳定冻干的BMP的量的一种或多种冻干保护剂和至少一种BMP以提供组合物和制备冻干的BMP的方法，其中冻干保护剂选自海藻糖、低分子量右旋糖、环糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，由此BMP在再水化作用时保持至少60％的生物学活性，所述再水化的产品易于被外科医生处理。
本发明另一目的是使用一种或多种冻干保护剂、至少一种BMP和胶原以提供组合物和制备含有BMP的冻干的生物相容的胶原基质的方法，其中冻干保护剂选自海藻糖、低分子量右旋糖、环糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，该基质稳定并且在再水化作用时保持至少60％的生物学活性，由此所述再水化有展延性的产品易于被外科医生处理。
本发明另一目的是使用一种或多种冻干保护剂、至少一种BMP和粉碎化胶原纤维以提供组合物和制备含有BMP的冻干的生物相容的可流动材料的方法，其中冻干保护剂选自海藻糖、低分子量右旋糖、环糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，该材料稳定并且在再水化作用时保持至少60％的生物学活性，由此所述再水化的产品易于被外科医生处理。
本发明的还一目的在于使用由至少一种冻干保护剂和至少一种BMP的冻干混合物组成的组合物治疗患者的方法。通过直接将重构的BMP溶液施加到患者的解剖学区域，例如施加到骨折、骨缝、骨空隙、椎间盘、软骨缺陷、腱、韧带等区域，或者将重构的BMP溶液施加到要植入患者的装置，例如人造连接骨(bone-contacting)植入物，如人造髋、膝、肩、椎间盘等等，腱锚(tendon anchor)、韧带锚(ligament anchor)、缝合线、卡钉(staple)等等，骨置换罩(bone replacement cage)、自体骨碎片、同种异体骨碎片、异种骨碎片、去矿质骨碎片等等，这些组合物用于治疗各种肌骨骼缺陷，以促进愈合过程。
水溶液或干燥固体形式的BMP不稳定，需要冷藏到-20℃以下以保持蛋白质的生物活性。由于BMP易于聚集、二硫键重排、脱酰胺和氧化，需要一种制剂来保存和保护冻干的BMP的生物学活性。
冻干的BMP产品需要具有改善的稳定性和储存。
仍然需要用于使用水溶液重构的冻干的BMP产品，用于注射到例如椎间盘、非关节和关节软骨的软组织中以促进这些组织的再生。
仍然需要冻干的BMP产品，其以医师使用的合适的BMP浓度提供在可植入生物相容的支架上，由此最小化或消除多种与处置有关的危险，包括污染、不合适的剂量以及泄漏，包括废料，以及引入到不希望的手术位置。
需要冻干的BMP产品，其可以在易于施加到手术位置的生物相容的可流动材料中重构。
由于BMP的发现，一直在进行大量的研究活动以发现用于治疗各种肌骨骼缺陷和病症的治疗应用中合适的组合物。当前存在含有BMP的以冻干的固体出售的产品，其必须重构为液体并且在使用时由医师施加到要被植入的支架或者外科治疗位置。当前rhBMP-2制剂使用蔗糖NF、甘氨酸USP、L-谷氨酸FCC、氯化钠USP和聚山梨醇酯80NF作为赋形剂，并且可在室温下(15-25℃)储存。当前OP-1制剂单独使用牛胶原，并且必须在2-8℃储存。关于重构BMP稳定性的赋形剂的效力，还没有公开的报道。
他人已经试图通过使用甘露醇、蔗糖以及其混合物，通过将BMP包埋在例如PLGA的聚合母体中，通过加入例如蛋氨酸的抗氧化剂，通过加入例如组氨酸、精氨酸、环糊精和牛血清白蛋白的其它赋形剂，和加入例如吐温80的表面活性剂，或者其组合，在冻干期间增强BMP的稳定性。这些努力已经实现了不同程度的有限度的成功。
美国专利US 5,318,898和5,516,654公开了使用硫酸葡聚糖在培养基中制备BMP的改进方法，然而没有阐述产生益处的机制并且没有公开稳定蛋白质的任何其它有用的赋形剂。Yim等人在美国专利US5,385,887中公开了冻干组合物和用于递送BMP的制剂，所述组合物包括BMP、糖、甘氨酸和谷氨酸。虽然Yim等人公开了通过W-20碱性磷酸酶测试证明的冻干制剂保持了生物学活性，然而其没有公开任一制剂与其它制剂相比显示任何定量益处的对比数据。这些发明人没有讨论或确认海藻糖在BMP的冻干中相对于蔗糖的优越性。
本发明提供了组合物以及制备和使用BMP稳定制剂的方法，其可用于冻干、储存和用水溶液重构以由其治疗患者。本发明根据以下说明性实施方案描述如下，并且使用rhGDF-5作为示范性BMP。本领域熟练技术人员将能够理解，本发明可以在多种不同应用和实施方案中实现，并且没有将其应用特别限制于此处所述的特定实施方案中。
本发明一方面提供了一种组合物，和制备随后用于骨和软骨缺陷的外科治疗中稳定的冻干的BMP的方法。正如此处所预想的那样，这种组合物包括至少一种BMP和足以稳定BMP量的海藻糖。通过将重构的BMP溶液直接施加到患者的解剖区域，例如施加到骨折、骨缝、骨空隙、椎间盘、外科用于融合的椎间盘间隙、软骨缺陷、腱、韧带等区域，或者施加到要植入到患者与骨或软骨接触的材料中，例如人造髋、人造膝、人造肩、人造椎间盘、腱锚、韧带锚、缝合线、卡钉(staple)、骨罩、自体骨碎片、同种异体骨碎片、异种骨碎片、去矿质骨碎片等等，这些组合物用于治疗各种肌骨骼缺陷。
此处使用的术语“形态发生”、“骨骼形态发生”、“骨骼形态发生蛋白质”、“BMP”、“成骨蛋白质”、“成骨因子”、“生长&分化因子”和“GDF”包括rhGDF-5代表的一类蛋白。然而本领域熟练技术人员将能够理解，rhGDF-5仅仅作为能够用作BMP的实际组织形态发生素的典型TGF-β系亚组，并且并不意图限制说明。术语“冷冻保护剂”用来表示能够在冷冻期间稳定生物分子的分子，并且在当前上下文中等同于术语“冻干保护剂”，其指的是能够在冻干期间稳定生物分子的分子。此处使用的术语“粉碎化(morselized)”指的是通过切割、砍碎、切断、研磨、粉碎或者其它降低例如胶原的生物相容基质的量的尺寸、由此单个颗粒或纤维的总尺寸降低的方法得到产品，并且“粉碎化(morselization)”指的是上述方法。此处使用的术语“赋形剂”指的是添加到至少一种BMP中的至少一种其它化合物，其中所述其它化合物选自氨基酸、蛋白质、缓冲剂、表面活性剂以及其混合物。
已知rhGDF-5在pH 4.5至pH 10.5范围的中性pH内具有较差的溶解度。因此难以在此pH范围内配制和制备rhGDF-5产品。因此本发明人设计一种研究以评价rhGDF-5在pH 3和pH 4缓冲液中的溶解度，选择形成蛋白质制剂的合适的pH范围是关键的。研究结果如实施例11所述。rhGDF-5的溶解度不仅取决于缓冲液的pH，还取决于缓冲溶液的离子强度。在pH为4时，约10毫克/毫升的rhGDF-5溶液在5和10mM硫酸钠缓冲液中混浊，然而在50和100mM硫酸钠缓冲液中rhGDF-5形成更大的颗粒并且最终沉淀出来。在另一研究中(数据没有显示)，当rhGDF-5以3.5毫克/毫升的浓度在pH为3.5和pH为4的5mM硫酸盐缓冲液中配制时，溶液仍然混浊。
蛋白质的溶解度通常在过度饱和/沉淀的溶液离心后测量蛋白质浓度确定。然而某些混浊的蛋白质溶液难以离心或过滤。即便是在混浊溶液进行离心或过滤(0.22微米)以除去不溶性颗粒后，由于颗粒如此细小滤液仍然看起来混浊，这通常不成功，并且有时蛋白质常常粘在过滤器表面，因而滤液损失了大部分蛋白质。因此当rhGDF-5以3.5毫克/毫升或10毫克/毫升浓度在pH为3.5或pH为4的缓冲液中配制时难以得到透明溶液。
当rhGDF-5以10毫克/毫升浓度在5mM、10mM和25mM磷酸钠溶液中在pH为3.0配制时，蛋白质溶液透明；然而当rhGDF-5以10毫克/毫升在更高离子强度的溶液例如50mM和100mM磷酸钠中配制时，rhGDF-5溶液混浊。因此在一个优选实施方案中，rhGDF-5应当在低离子强度缓冲液中在约3.0的pH配制。
在根据本发明的一个实施方案中，组合物可通过冻干至少一种BMP和足以稳定BMP量的海藻糖的混合物制备，对于含有产品的生物相容的基质，海藻糖与BMP的干重比例为每1毫克BMP约1毫克至约500毫克海藻糖，更优选每1毫克BMP约5毫克至约200毫克海藻糖。海藻糖的加入为冻干制剂中的蛋白质提供改善的溶解度和稳定性。冻干根据本领域通常已知的方法进行。
在另一实施方案中，根据本发明的组合物可通过冻干至少一种BMP、足以稳定BMP量的海藻糖和缓冲液的含水混合物制备。缓冲剂的加入为冻干制剂中的蛋白质提供改善的溶解度和稳定性。本领域已知的生物相容的缓冲剂包括甘氨酸；乙酸钠、钾或钙盐；柠檬酸钠、钾或钙盐；乳酸钠、钾或钙盐；磷酸钠或钾盐，包括磷酸二氢盐、磷酸氢盐、磷酸盐以及其混合物。缓冲剂另外可以具有加入到组合物中起填充剂作用的甘氨酸。甘氨酸将以每1毫克BMP约0.04毫克至约200毫克甘氨酸的比例加入，更优选以每0.04毫克BMP约1毫克至约80毫克甘氨酸的比例加入。与单独具有海藻糖的组合物相比，缓冲剂和填充剂的加入为蛋白质提供稍微更优越的稳定性，pH控制在约2.0至约5.0pH单位，更优选约2.5至约4.5pH单位。
在可供选择的实施方案中，根据本发明的组合物和方法可通过冻干至少一种BMP、足以稳定BMP量的海藻糖、缓冲剂和选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20以及其混合物的表面活性剂的含水混合物制备。表面活性剂将以每1毫克BMP约0.001毫克至约0.2毫克的浓度加入。通过改变溶解度和冻干特性，表面活性剂的加入为蛋白质另外提供稳定性。冻干根据本领域通常已知的方法进行。
在本发明另一实施方案中，稳定的冻干BMP的组合物和方法包括至少一种BMP、足以稳定至少一种BMP的量的冻干的海藻糖，以及至少一种其它赋形剂，所述其它赋形剂选自缓冲剂和表面活性剂。与具有海藻糖作为单独的赋形剂的组合物相比，这种缓冲剂和表面活性剂的加入为冻干的BMP提供增加的改善的稳定性。
在另一实施方案中，根据本发明的组合物和方法可通过在冻干BMP/胶原混合物之前将至少一种BMP和至少一种赋形剂的溶液沉积在冻干胶原上制备。胶原可任选被交联或矿物化，或者既交联又矿物化，例如通过已知为
Figure A20071019987400121
的材料提供并且公开在美国专利US5,972,385、5,866,165、5,776,193、5,455,231和5,231,169中。该实施方案中提供的组合物特别可用于治疗整形外科领域的医学病症，并且提供柔性可延伸的材料，医师可容易地将其置于手术位置以生成骨、软骨或腱。BMP/胶原混合物可使用水溶液重构，包括无菌水、盐水和骨髓吸出物，并且直接施加在患者的缺陷部位，例如骨折、骨缝隙、骨空隙和通过手术为脊柱融合术准备的椎间盘间隙。此外，BMP/胶原混合物可用于填充骨碎片之间的空隙以及在脊柱融合术期间放入椎间盘间隙中的植入物中，放入具有损伤或失去的软骨的区域中，例如断裂或损伤的腱、断裂或损伤的韧带、关节软骨中的软骨缺陷，以及关节软骨中的亚软骨缺陷。
在另一实施方案中，根据本发明的组合物和方法可如下应用：通过制备至少一种BMP和至少一种赋形剂的冻干混合物、使用水、盐水或骨髓吸出物重构该冻干BMP混合物，并且在手术移植BMP/胶原混合物之前将该重构的BMP溶液置于冻干胶原之上。胶原可任选被交联或矿物化，或者既交联又矿物化，例如通过已知为
Figure A20071019987400131
的材料提供。该实施方案中提供的组合物和方法特别可用于治疗整形外科领域的医学病症，并且提供柔性可延伸的材料，医师可容易地将其置于手术位置以生成骨、软骨或腱。BMP/胶原混合物可直接施加到患者的缺陷部位，例如骨折、骨缝隙、骨空隙和通过手术为脊柱融合术准备的椎间盘间隙、填充骨碎片之间的空隙以及在脊柱融合术期间放入椎间盘间隙中的植入物中，放入具有损伤或失去的软骨的区域中，例如断裂或损伤的腱、断裂或损伤的韧带、关节软骨中的软骨缺陷，以及关节软骨中的亚软骨缺陷。由于具有BMP作为分离组分和来自胶原材料的容器，该实施方案中提供的组合物和方法由于易于储存和制备也特别有用。
在另一实施方案中，根据本发明的组合物和方法可通过在冻干BMP/粉碎化胶原混合物之前将至少一种BMP和至少一种赋形剂的溶液沉积在冻干的粉碎化胶原上制备。粉碎化胶原可任选被交联或矿物化，或者既交联又矿物化。这种粉碎化提供直径约25微米长约110微米的较小胶原纤维，其得到适于注射到手术位置的可流动组合物。这种组合物的重构可使用例如无菌水、盐水或骨髓吸出物的水溶液和胶原凝胶的混合物进行，胶原凝胶控制重构产品的粘度。胶原凝胶含有约0.1％至约30％重量/重量的胶原，更优选约0.3％至约3.0％重量/重量的胶原，胶原凝胶的粘度优选为约10厘泊(cp)至约400厘泊，并且更优选约70厘泊至约100厘泊。胶原凝胶的pH优选约4.0pH单位至约8.0pH单位。这种组合物用于治疗各种肌骨骼疾病，包括但不限于骨折、骨缝隙、骨空隙和通过手术为脊柱融合术准备的椎间盘间隙、填充骨碎片之间的空隙以及在脊柱融合术期间放入椎间盘间隙中的植入物中，具有损伤或失去的软骨的区域，例如断裂或损伤的腱、断裂或损伤的韧带、关节软骨中的软骨缺陷，以及关节软骨中的亚软骨缺陷。
在另一实施方案中，根据本发明的组合物和方法可如下使用，通过制备至少一种BMP和至少一种赋形剂的冻干混合物、使用水或盐水重构该冻干BMP混合物，并将该重构的BMP溶液注入到椎间盘。该实施方案中提供的组合物和方法特别用于治疗椎间盘。
具体实施方式
实施例
在以下实施例中，使用以下实验方法：
为了进行RP-HPLC纯度研究，使用10mM盐酸将重构rhGDF-5试样稀释到0.1毫克/毫升的浓度，并且在50℃和0.3毫升/分钟的流速在Vydac 218TP52柱上进行反相HPLC。rhGDF-5使用0.15％三氟乙酸中的乙腈的梯度洗脱，使用UV在214纳米检测。
对于圆二色光谱(CD)研究，圆二色光谱在AVIV Model 60DS圆二色光谱旋光分光计上进行。使用相应赋形剂的基线空白对照剂的扫描从样品扫描中减去。该扫描使用平均残基分子量(值为15)归一化并将其插入到方程式中：
[θ]＝[0.1×M残基]/[浓度(毫克/毫升)×光程]
[θ]的值在每个波长计算以得到平均残基椭圆率。最终，次级结构的估算使用程序PROSEC v.2.1确定(1987年AVIV Associates取得版权)。
差示扫描量热(DSC)在MicroCal VP-DSC仪上进行。扫描速率为60℃/小时。温度范围为5-100℃。仪器基线扫描(空白对照组数据)从试样热扫描中减去。蛋白质浓度为0.33毫克/毫升。
偏振光显微术(PLM)用于结晶度评价。痕量固体试样从处于相对湿度为1％的干空气包中的小瓶中取出。将固体试样分布在玻璃载片上并将一滴二氧化硅油滴加在固体试样上。然后载片使用装有索尼CCD-IRIS/RGB彩色摄像机和偏振光附件的蔡司(zeiss)光学显微镜研究。FlashBus FBG软件用于捕捉图像。
原料rhGDF-5在-80℃以10mM盐酸中3.8毫克/毫升的浓度从Biopharm得到。在用于制剂之前，冷冻的原料蛋白质在2-8℃解冻整夜。
实施例1：具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/条)和海藻糖50毫克/毫升的
Figure A20071019987400151
条(非无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克海藻糖。
海藻糖溶液的制备
25.48克二水合海藻糖仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入350毫升纯净水并缓慢搅拌直到得到透明溶液。向该透明溶液中逐滴加入0.1N盐酸以将pH调节为3.9，然后使用纯净水调节体积以得到400毫升最终体积。测量pH并且发现pH为4.2。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接使用以稀释蛋白质溶液。
使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液
将22.39毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖溶液以将体积调节至150毫升；测量pH并且发现pH为2.5。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在170毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为2.7；UV读数指示0.499毫克/毫升的蛋白质含量。
rhGDF-5/海藻糖溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接施加到条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。这些条插入在2厘米×2厘米小PETG托盘中，并且将小托盘插入到大PETG托盘中并冻干。每个大托盘容纳24个条。
表1a：每个条具有海藻糖(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的
Figure A20071019987400153
在25℃的稳定性(实施例1)
  测试   参数   0个月   0个月   3个月   6个月   9个月   12个月
  RP-HPLC   ％主峰   89.54   82.26   81.49   77.98   76.57   72.19
  RP-HPLC   ％聚集物   0.00   3.01   5.08   4.53   5.40   6.60
表1b：每个条具有海藻糖(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的
Figure A20071019987400154
在2-8℃的稳定性(实施例1)
  测试   参数   0个月   0个月   3个月   6个月   9个月   12个月
  RP-HPLC   ％主峰   89.54   88.22   90.84   85.45   88.70   87.61
  RP-HPLC   ％聚集物   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00
实施例2：具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/条)和甘露醇50毫克/毫升的
Figure A20071019987400161
条(非无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克甘露醇。
甘露醇溶液的制备
23.03克甘露醇仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入350毫升纯净水并缓慢搅拌直到得到透明溶液。测量pH并且发现pH为7.2；逐滴加入0.1N盐酸以将pH调解为3.8；然后使用纯净水调节体积以得到400毫升最终体积。测量pH并且发现pH为3.9。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接使用以稀释蛋白质溶液。
使用甘露醇溶液稀释rhGDF-5溶液
将22.37毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入甘露醇溶液以将体积调节至150毫升。测量pH并且发现pH为2.7。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多甘露醇溶液以在170毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为2.8；UV读数指示0.493毫克/毫升的蛋白质含量。
rhGDF-5/甘露醇溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接施加到
Figure A20071019987400162
条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/甘露醇溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/甘露醇溶液。这些条插入在2厘米×5厘米小PETG托盘中，并且将小托盘插入到大PETG托盘中并冻干。每个大托盘容纳24个条。
表2a：每个条具有甘露醇(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的
Figure A20071019987400163
在25℃的稳定性(实施例2)
Figure A20071019987400164
表2b：每个条具有甘露醇(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的在2-8℃的稳定性(实施例2)
  测试   参数   0个月   1个月   3个月   6个月   9个月   12个月
  RP-HPLC   ％主峰   89.71   89.12   86.26   81.02   82.97   79.78
  RP-HPLC   ％聚集物   0.00   0.00   2.70   3.21   4.01   4.12
实施例3：具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/条)和海藻糖100毫克/毫升的
Figure A20071019987400172
条(无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5和500毫克海藻糖。
海藻糖溶液的制备
25.49克二水合海藻糖仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入190毫升纯净水并缓慢搅拌直到得到透明溶液。测量透明海藻糖溶液的pH并发现pH为6.2。没有向溶液中加入盐酸以调节pH。使用纯净水调节体积以得到200毫升最终体积。测量pH并且发现pH为6.3。将溶液直接用于稀释蛋白质溶液。
使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液
将23.03毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖溶液以将体积调节至170毫升；测量pH并且发现pH为3.0。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在175毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.0；UV读数指示0.518毫克/毫升的蛋白质含量。
rhGDF-5/海藻糖溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接施加到无菌
Figure A20071019987400173
条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。这些条置于钢托盘中，并且将其小心包装在无菌双重袋中，并在无菌条件下进行冻干。
表3a：每个条具有海藻糖(500毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)的
Figure A20071019987400174
在2-8℃的稳定性(实施例3)
  测试   参数   0个月   1个月   3个月   6个月
  RP-HPLC   ％主峰   88.5   83.9   90.0   78.9
  RP-HPLC   ％聚集物   0.0   0.0   0.0   0.0
实施例4：具有低剂量rhGDF-5(5毫升/条，0.5毫克/毫升)、海藻糖40毫克/毫升和甘氨酸10毫克/毫升的条(无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5、220毫克海藻糖和50毫克甘氨酸。
海藻糖/甘氨酸溶液的制备
17.84克二水合海藻糖和4.03克甘氨酸仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入300毫升纯净水并缓慢搅拌直到得到透明溶液。测量pH并发现pH为5.5。没有加入盐酸，使用纯净水将体积调节至350毫升。测量pH并且发现pH为5.5。
使用海藻糖/甘氨酸溶液稀释rhGDF-5溶液
将39.47毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖/甘氨酸溶液以将体积调节至295毫升；测量pH并且发现pH为4.1。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在300毫升溶液得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为4.1；UV读数指示0.507毫克/毫升的蛋白质含量。
溶液通过0.22微米过滤器过滤，并且溶液直接用于施加到无菌
Figure A20071019987400182
条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。这些条置于钢托盘中，并且将其小心包装在无菌双重袋中，并在无菌条件下进行冻干。
表4a：每个条具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)的
Figure A20071019987400183
在2-8℃的稳定性(实施例4)
  测试   参数   0个月   1个月   3个月   6个月
  RP-HPLC   ％主峰   87.9   83.5   86.0   80.1
  RP-HPLC   ％聚集物   0.0   0.0   0.0   0.0
表4b：每个条具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)的在25℃的稳定性(实施例4)
  测试   参数   0个月   1个月   3个月   6个月
  RP-HPLC   ％主峰   87.9   78.7   78.1   67.7
  RP-HPLC   ％聚集物   0.00   0.00   0.00   0.00
实施例5：具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，2.5毫克/条)、海藻糖40毫克/毫升、甘氨酸10毫克/毫升和聚山梨醇酯0.1毫克/毫升的
Figure A20071019987400191
条(无菌)。每个条具有2.5毫克rhGDF-5、220毫克海藻糖、50毫克甘氨酸和0.5毫克聚山梨醇酯80。
聚山梨醇酯80溶液的制备
23.03毫克聚山梨醇酯80称重到50毫升无菌一次性试管中，向其中加入25毫升纯净水并旋转2分钟以得到均匀溶液。
海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液的制备
10.19克二水合海藻糖和2.303克甘氨酸仔细称重并转移到无菌聚丙烯瓶中，向其中加入25毫升上面得到的聚山梨醇酯80溶液。将聚山梨醇酯试管用25毫升纯净水清洗2次，并将清洗液转入到海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液。向海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液中另外加入纯净水达到190毫升的总体积。将溶液搅拌2分钟以得到透明溶液。测量溶液的pH并且发现pH为5.6；使用纯净水将体积调节至200毫升。测量pH并且发现pH为5.5。
使用海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液稀释rhGDF-5溶液
将23.03毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，小心向其中加入海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液以将体积调节至170毫升；测量pH并且发现pH为4.1。将溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液以在175毫升溶液得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为4.1；UV读数指示0.510毫克/毫升的蛋白质浓度。
通过0.22微米过滤器过滤的溶液直接使用，在无菌条件下在层流罩中施加到无菌
Figure A20071019987400192
条上。使用无菌移液管将2.5毫升rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液等同施加在条的两点上，每个条上总共有5毫升rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液。这些条置于钢托盘中，并且将其小心包装在无菌双重袋中，并在无菌条件下进行冻干。
表5a：每个条具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)/聚山梨醇酯80(0.5毫克)的
Figure A20071019987400201
在2-8℃的稳定性(实施例5)
  测试   参数   0个月   1个月   3个月   6个月
  RP-HPLC   ％主峰   88.4   84.3   86.8   82.2
  RP-HPLC   ％聚集物   0.0   0.0   0.0   0.0
实施例6：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)的冻干小瓶产品
海藻糖溶液的制备
无菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安装磁力搅拌棒，在室温下向其中加入190毫升纯净水。将溶液在室温下搅拌直到海藻糖彻底溶解。测量pH并且发现pH为6.5。向透明海藻糖溶液中逐滴加入0.1N盐酸以将pH调节至5.8。将溶液体积用纯净水调节至200毫升；测量pH并且发现pH为5.5。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接用于稀释蛋白质溶液。
使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液
将14.47毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，在旋转烧瓶的同时向其中缓慢加入海藻糖溶液至100毫升的最终体积。溶液在室温下偶尔旋转15分钟；测量pH并且发现pH为3.0。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在110毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.1；UV读数指示0.510毫克/毫升的蛋白质浓度。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接加入到小瓶中。
填充小瓶：1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手动加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每个小瓶在进入冻干器前部分用塞子封闭。冻干后将塞子压紧并折边。以白色至灰白色结块(cake)得到产品。
表6a：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在2-8℃的稳定性(实施例6)
  测试   参数   0个月   1个月   3个月   6个月   9个月   12个月
结块外观&完整性 白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整
  重构时间，分钟   ＜2分钟   1.13   0.28   1.32   0.38   0.44   0.34
  重构溶液PH   2.0-3.5   3.0   2.5   2.8   2.8   2.9   2.9
  蛋白质浓度   毫克/毫升   0.49   0.46   0.46   0.48   0.47   0.45
  RP-HPLC   ％主峰   90.74   88.58   92.91   92.96   92.77   93.19
  RP-HPLC   ％聚集物   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00
表6b：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在25℃的稳定性(实施例6)
  测试   参数   0个月   1个月   3个月   6个月   9个月   12个月
结块外观&完整性 白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整   白色至灰白色；完整
  重构时间，分钟   ＜2分钟   1.13   0.26   1.44   0.38   0.52   0.33
  重构溶液PH   2.0-3.5   3.0   2.5   2.8   2.9   2.8   2.9
  蛋白质浓度   毫克/毫升   0.49   0.46   0.46   0.47   0.45   0.45
  RP-HPLC％主峰   ％主峰   90.74   86.24   87.75   85.39   84.19   82.45
  RP-HPLC％聚集物 ％聚集物 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
实施例7：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)的冻干小瓶产品
甘露醇溶液的制备
无菌聚丙烯瓶加入11.52克甘露醇并安装磁力搅拌棒，在室温下向其中加入185毫升纯净水。将混合物在室温下搅拌10分钟直到甘露醇彻底溶解。测量pH并且发现pH为6.6。向透明溶液中逐滴加入0.1N盐酸以将pH调节至5.5。将溶液体积用纯净水调节至200毫升；测量pH并且发现pH为5.7。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接用于稀释蛋白质溶液。
使用甘露醇溶液稀释rhGDF-5溶液
向聚丙烯烧瓶中小心转入14.48毫升rhGDF-5溶液；向其中小心加入甘露醇溶液至100毫升的体积。溶液在室温下旋转15分钟；得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多甘露醇溶液以在110毫升溶液中得到所需蛋白质浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.1；UV读数指示0.498毫克/毫升的蛋白质浓度。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接加入到小瓶中。
填充小瓶：1.1毫升甘露醇/rhGDF-5溶液手动加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每个小瓶在进入冻干器前部分用塞子封闭。冻干后将塞子压紧并折边。以白色至灰白色结块得到产品。
表7a：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)小瓶在2-8℃的稳定性(实施例7)
Figure A20071019987400221
表7b：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)小瓶在25℃的稳定性(实施例7)
实施例8：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)在pH为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中的冻干小瓶产品
海藻糖溶液的制备
无菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安装磁力搅拌棒，在室温下向其中加入200毫升pH为3.0的5mM甘氨酸-盐酸缓冲液。将溶液在室温下搅拌直到海藻糖彻底溶解。海藻糖/甘氨酸溶液的pH为3.1。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接用于稀释蛋白质溶液。
使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液
原料rhGDF-5溶液使用分子量为3000的截断薄膜在2-8℃相对于5mM甘氨酸-盐酸缓冲液渗析。渗析后溶液略微浓缩至3.8毫克/毫升。将14.47毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，在旋转烧瓶的同时向其中缓慢加入海藻糖-甘氨酸溶液至100毫升的最终体积。溶液在室温下偶尔旋转15分钟；测量pH并且发现pH为3.0。根据UV读数，加入更多海藻糖-甘氨酸溶液以在110毫升溶液中得到所需蛋白质浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.0；UV读数指示0.507毫克/毫升的蛋白质浓度。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接加入到小瓶中。
填充小瓶：1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手动加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每个小瓶在进入冻干器前部分用塞子封闭。冻干后将塞子压紧并折边。以白色至灰白色结块得到产品。
表8：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在pH为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中的稳定性(实施例8)
  时间和温度   结块外观   重构后溶液外观   蛋白质主峰％回收HPLC ％聚集物HPLC
时间＝0   固体，白色至灰白色 透明 100 0
1个月，5℃   固体，白色至灰白色 透明 100 0
2个月，5℃   固体，白色至灰白色 透明 99.6 0
3个月，5℃   固体，白色至灰白色 透明 100 0
  1个月，25℃   固体，白色至灰白色 透明 100 0
  2个月，25℃   固体，白色至灰白色 透明 99.0 0
  3个月，25℃   固体，白色至灰白色 透明 99.3 0
  1个月，40℃   固体，白色至灰白色 透明 98.7 0
  2个月，40℃   固体，白色至灰白色   透明   99.1   0
  3个月，40℃   固体，白色至灰白色   透明   98.9   0
实施例9：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)在pH为3.0的磷酸盐缓冲液中的冻干小瓶产品
海藻糖溶液的制备
无菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖并安装磁力搅拌棒，在室温下向其中加入200毫升pH为3.0的5mM磷酸盐缓冲液。将溶液在室温下搅拌直到海藻糖彻底溶解。海藻糖/磷酸盐缓冲液溶液的pH为3.0。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并直接用于稀释蛋白质溶液。
使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液
原料rhGDF-5溶液使用分子量为3000的截断薄膜在2-8℃相对于磷酸盐缓冲液渗析。渗析后溶液略微浓缩至3.8毫克/毫升。将14.47毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，在旋转烧瓶的同时向其中缓慢加入海藻糖/磷酸盐缓冲液至100毫升的最终体积。溶液在室温下偶尔旋转15分钟；测量pH并且发现pH为3.0。根据UV读数，加入更多海藻糖/磷酸盐缓冲液以在110毫升得到所需浓度0.5毫克/毫升；测量pH并且发现pH为3.0；UV读数指示0.50毫克/毫升的蛋白质浓度。将溶液通过0.22微米过滤器过滤并且直接加入到小瓶中。
填充小瓶：1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手动加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，并且每个小瓶在进入冻干器前部分用塞子封闭。冻干后将塞子压紧并折边。以白色至灰白色结块得到产品。
表9：rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在pH为3.0的磷酸盐缓冲液中的稳定性(实施例9)
  时间和温度   结块外观   重构后溶液外观   蛋白质主峰％回收HPLC ％聚集物HPLC
时间＝0   固体，白色至灰白色 透明 100 0
1个月，5℃   固体，白色至灰白色 透明 100 0
2个月，5℃   固体，白色至灰白色 透明 99.8 0
3个月，5℃   固体，白色至灰白色 透明 100 0
  1个月，25℃   固体，白色至灰白色 透明 100 0
  2个月，25℃   固体，白色至灰白色   透明   98.7   0
  3个月，25℃   固体，白色至灰白色   透明   99.7   0
  1个月，40℃   固体，白色至灰白色   透明   98.7   0
  2个月，40℃   固体，白色至灰白色   透明   97.4   0
  3个月，40℃   固体，白色至灰白色   透明   97.4   0
实施例10：具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克海藻糖的粉碎化胶原圆柱体
海藻糖溶液的制备
9.56克二水合海藻糖仔细称重并加入到无菌聚丙烯瓶中，在室温下向其中加入145毫升纯净水并缓慢搅拌直到得到透明溶液。测量该透明溶液的pH并且发现其为5.3。使用纯净水调节体积以得到150毫升的最终体积。测量溶液的pH并且发现其为5.3。该溶液直接用于稀释蛋白质溶液。
使用海藻糖溶液稀释rhGDF-5溶液
将16.45毫升rhGDF-5溶液小心转入到聚丙烯烧瓶中，向其中小心加入海藻糖溶液以将体积调节至120毫升；测量pH并且发现pH为2.9。溶液在室温下搅拌15分钟。得到UV消光系数以精确计算蛋白质浓度。根据UV读数，加入更多海藻糖溶液以在125毫升溶液中得到0.5毫克/毫升的所需蛋白质浓度；测量pH并且发现pH为2.9；UV读数指示0.498毫克/毫升的蛋白质浓度。
使用rhGDF-5/海藻糖溶液配制粉碎化胶原圆柱体
溶液通过0.22微米过滤器过滤，并直接使用所得溶液分布在预先形成的压紧在Teflon模具中的粉碎化胶原圆柱体上。在冻干之前每个圆柱体配有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。
表10：每个圆柱体中具有rhGDF-5(2.5毫克)和海藻糖(250毫克)的粉碎化胶原圆柱体在2-8℃的稳定性(实施例10)
Figure A20071019987400271
正如2-8℃样品，而非-20℃样品的RP-HPLC测试的后期洗脱峰的形状所证明，以下表11中的数据表明没有任何赋形剂并且沉积在
Figure A20071019987400272
并且冷冻干燥的rhGDF-5在-20℃稳定，然而在2-8℃不稳定。
表11：具有5毫升rhGDF-5(0.5毫克/毫升)而没有赋形剂的
Figure A20071019987400273
条在2-8℃和在-20℃的稳定性
测试   参数：后期洗脱％ 0个月 1个月 2个月 6个月 9个月 12个月 18个月
  RP-HPLC   2-8℃  0   9.0   12.8   36.5   45.9   49.0   42.1
  RP-HPLC   -20℃  0   2.6   0   1.6   2.2   2.7   3.8
已经研发了制备具有赋形剂和可溶胶原凝胶的可流动粉碎化胶原/rhGDF-5的不同实例，并且对每个实例评价了其性能、稳定性和是否易于制备。
粉碎化胶原实施例1
-冻干为干燥形式的粉碎化胶原圆柱体 & rhGDF-5
-润湿形式的胶原凝胶保持分离
-两者分别在2-8℃保持在分开的注射器中
-两者在注射前混合。
粉碎化胶原实施例2
-以湿润形式混合在一起的粉碎化胶原圆柱体& rhGDF-5 &胶原凝胶(没有冻干)
-全部以湿润形式在2-8℃放在一个注射器中；即可使用
粉碎化胶原实施例3
-冻干为干燥形式的粉碎化胶原圆柱体& rhGDF-5 &胶原凝胶
-全部以干燥形式在2-8℃放在一个注射器中
-在注射之前用水再水化。
粉碎化胶原实施例4
-粉碎化胶原圆柱体&胶原凝胶以糊状物在一起
-rhGDF-5以干燥形式单独放置
-两者在2-8℃分别放在不同注射器中
-两者在注射之前混合。
粉碎化胶原实施例5
-粉碎化胶原圆柱体&胶原凝胶以干燥形式放在一起
-rhGDF-5以干燥形式单独放置
-两者在2-8℃分别放在不同注射器中
-使用无菌水或骨髓吸出物重构rhGDF-5
-在注射之前干燥的粉碎化胶原和胶原与重构的rhGDF-5溶液混合。
在有例如甘露醇、蔗糖和海藻糖的几种赋形剂并且存在或不存在缓冲剂和抗氧化剂的条件下，rhGDF-5的稳定性通过以下方法评价：RP-HPLC、差示扫描量热(DSC)、圆二色光谱(CD)、偏振光显微术(PLM)以及生物测定。几种含有蔗糖的rhGDF-5冻干制剂在储存期间显示出不希望的黄色和玻璃状结块结构，因而是没有希望的。
冻干rhGDF-5制剂的熔融性能使用DSC研究。DSC数据表明海藻糖和甘露醇基制剂显著改善了原料rhGDF-5的热稳定性。
图1、2和3表示rhGDF-5的海藻糖制剂和甘露醇制剂的DSC曲线与原料rhGDF-5的DSC曲线的比较。原料rhGDF-5表现两个主要转变：一个接近40℃并且另一个接近85℃。高温转变可能表示蛋白质的热展开。值得注意的是，第一吸热转变的溶解温度(Tm)在赋形剂的存在下增加7-14℃。单独考虑时，该研究表明海藻糖和甘露醇可同样有效地作为稳定剂。
海藻糖/rhGDF-5制剂的PLM(偏振光显微术)如图4所示。样品没有显示主要的双折射现象。因此该体系为无定形，其对治疗应用来说理想的。图5表示储存一段时间后甘露醇/rhGDF-5制剂的PLM。在样品中观察到许多晶体，表明甘露醇在储存期间已经结晶。结果表明海藻糖为rhGDF-5更好的冻干保护剂。远UV CD光谱表明海藻糖基制剂具有与天然原料蛋白质可比的次级结构分布。
具有各种赋形剂的冻干rhGDF-5通过RP-HPLC的实时稳定性研究清楚地表明，以50毫克/毫升或100毫克/毫升浓度存在海藻糖的rhGDF-5，不管存在还是不存在缓冲剂并且有还是没有聚山梨醇酯，在2-8℃和15-25℃的储存条件下一致产生改善的稳定性，然而甘露醇在类似存储条件下不能提供相同的稳定性水平。
冻干结块制剂的实时稳定性研究清楚地表明，由在室温和2-8℃储存条件下，主峰显著降低同时聚集物峰值增加可证明，甘露醇没有稳定蛋白质。由于能够产生免疫反应和副作用，聚集物为蛋白质制剂中最不希望的物质。相比之下，如实时稳定性研究中所证实，特别是在2-8℃的储存条件下通过抑制聚集物的形成和保护主峰，海藻糖很好地稳定了蛋白质。因此在稳定制剂中的rhGDF-5时，海藻糖比甘露醇更好。实时稳定性数据还表明，具有磷酸盐或甘氨酸作为缓冲液以控制pH的rhGDF-5/海藻糖制剂比没有缓冲液的rhGDF-5/海藻糖制剂更好。实时稳定性数据表明，rhGDF-5海藻糖/甘氨酸制剂的理想储存是在2-8℃，并且在25℃储存也合适。
除了海藻糖基rhGDF-5制剂有利的生化和生理数据外，这些制剂还在碱性磷酸酶生物测定中显示效力。物理化学分析方法、体外测试方法以及实时稳定性数据显示海藻糖在冻干独立产品中，以及用于治疗各种肌骨骼病症的胶原基组合产品中，在稳定rhGDF-5中作为优越赋形剂的前途。
实施例11：rhGDF-5在不同离子强度溶液和两种pH缓冲液(pH 3和pH 4)中的溶解度
磷酸钠缓冲剂的不同离子强度的溶液用于该研究。原料蛋白质溶液浓缩至约10毫克/毫升并且使用5、10、25、50和100mM磷酸盐缓冲液在pH 3或pH 4渗析。渗析后，检查样品透明度并在UV-Vis分光光度计上分析蛋白质浓度。详细步骤如下所述。
缓冲液制备
pH为3的100mM磷酸盐缓冲液
13.5毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。
pH为3的50mM磷酸盐缓冲液
6.76毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。
pH为3的25mM磷酸盐缓冲液
3.39毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。
pH为3的10mM磷酸盐缓冲液
1.35毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。
pH为3的5mM磷酸盐缓冲液
0.676毫升浓磷酸(14.8M)溶液转入到2000毫升烧杯，向其中加入去离子水以达到1900毫升刻度。将溶液使用氢氧化钠溶液滴定至pH为3并转入2000毫升量筒。加入水补充到2000毫升。然后倒回烧杯并充分混合。
样品制备
原料蛋白质rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8℃解冻。原料蛋白质溶液(24毫升，3.8毫克/毫升)使用离心过滤装置(Pall Life Science，Cat#OD010C37，10K MWCO)浓缩至约6毫升的体积。约0.9毫升浓缩的rhGDF-5溶液转入到各个渗析过滤片(cassette)中(Pierce，Cat#66380)并相对于磷酸盐缓冲液在室温下渗析整夜。浓缩的rhGDF-5溶液小心从渗析过滤片中移出并放入小玻璃管中以检查溶液透明度。如分析方法部分所述，蛋白质浓度在UV-Vis分光光度计上确定。
在pH为4的溶解度
通过向pH为3的缓冲液中加入更多的氢氧化钠溶液由pH为3的缓冲液制备pH为4.0的缓冲液。蛋白质溶液相对于pH为4的缓冲液在室温下渗析整夜。分析样品的溶液透明度和蛋白质浓度。
分析方法
对小玻璃管中的溶液样品检查透明度和颗粒。样品小瓶使用垂直光线对着黑色背景检查。试样的透明度与作为对照的纯净水样品比较。每个溶液样品的pH直接使用校准pH计测量。
结果
10毫克/毫升rhGDF-5溶液溶解度研究的结果表明，在5、10和25mM较低离子强度的磷酸钠缓冲液中得到透明溶液，显示良好的溶解度，然而在50和100mM较高离子强度的磷酸钠缓冲液中得到混浊溶液，显示较差的溶解度。在pH为4时，5和10mM磷酸钠缓冲液得到混浊溶液，显示较差的溶解度。25、50和100mM的磷酸钠缓冲液在离心后得到透明溶液，然而具有接近零的蛋白质回收率，表明蛋白质已经沉淀。因此，接近pH为3的低离子强度缓冲液将优于在较高pH的高离子强度缓冲液。
实施例12：rhGDF-5在具有5％海藻糖的各种缓冲液中在不同温度下的稳定性
在此研究中，测试了各种缓冲液在保护5％海藻糖溶液中0.7毫克/毫升rhGDF-5在冷冻干燥期间和在5℃储存时的影响。测试的缓冲液为pH为3的5mM甘氨酸-盐酸、pH为3的5mM磷酸钠、pH为3的5mM柠檬酸钠、pH为3的10mM乳酸钠、水中的0.01％TFA、1mM盐酸，以及不存在海藻糖的rhGDF-5在1mM盐酸中的对照溶液。缓冲液如下制备：
pH为3的5mM甘氨酸缓冲液
2000毫升烧杯中加入0.75克甘氨酸(分子量75.05克)和1900毫升去离子水；在搅拌下将该溶液使用盐酸溶液滴定至pH为3。加入水补充至2000毫升并充分混合。
pH为3的5mM柠檬酸缓冲液
2000毫升烧杯中加入2.11克一水合柠檬酸(分子量210.14克)和1900毫升去离子水；将该溶液用氢氧化钠溶液滴定至pH为3。加入水补充至2000毫升并将溶液充分混合。
pH为3的5mM磷酸盐缓冲液
将0.676毫升磷酸溶液(14.8M)转入到含有1900毫升去离子水的2000毫升烧杯中；将该溶液用氢氧化钠溶液滴定至pH为3。加入水补充至2000毫升并将溶液充分混合。
pH为3的10mM乳酸盐缓冲液
2000毫升烧杯中加入1.81克乳酸(分子量90.08)和1900毫升去离子水；将所得溶液用氢氧化钠溶液滴定至pH为3。加入水补充至2000毫升并将溶液充分混合。
1mM盐酸溶液
1毫升2N盐酸溶液转入到含有1900毫升去离子水的2000毫升烧杯中。通过加入更多去离子水将溶液的最终体积调节至2000毫升。
0.01％TFA溶液
0.2毫升TFA溶液转入到含有1900毫升去离子水的2000毫升烧杯中。通过加入更多去离子水将溶液的最终体积调节至2000毫升并将溶液充分混合。
制剂制备
原料蛋白质rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8℃解冻。原料蛋白质溶液(55毫升，3.8毫克/毫升)使用离心过滤装置(Pall Life Science，Cat#OD010C37，10K MWCO)浓缩至约10毫升的体积。约1.4毫升浓缩的rhGDF-5溶液转入到各个渗析过滤片(cassette)中(Pierce，Cat#66380)过滤片相对于测试缓冲液在2-8℃渗析整夜。
rhGDF-5溶液小心从渗析过滤片中除去并转入到小玻璃瓶中。溶液的蛋白质浓度使用UV-Vis分光光度计测量。蛋白质以约0.7毫克/毫升和5％(重量/体积)的海藻糖配制在测试缓冲液中，并通过0.22微米过滤器过滤。溶液在冻干之前在2-8℃储存。
装填和冻干
每个配制溶液以1毫升/瓶装填进3毫升玻璃瓶中(WestPharmaceutical Services，Cat#68000316)。玻璃瓶用塞子(WestPharmaceutical Services，Cat#99150630)部分封闭并转入冻干器(FTSSystem，LyoStar II)中。热电偶置于空白对照剂瓶中以监测冻干过程。作为对照，还测试了没有海藻糖的另一制剂。将200微升1mM盐酸溶液中浓度为4.5毫克/毫升的rhGDF-5转入到每个玻璃瓶并冻干。
分析方法
·冻干结块的完整性
检查冻干样品中冻干结块裂缝、收缩和崩解的每个时间点。
·重构时间
1毫升去离子水加入到每个冻干样品中并轻轻混合。记录重构时间。
·溶液透明度-视觉外观
对小玻璃瓶中的溶液样品检查透明度和颗粒。样品瓶使用垂直光线对着黑暗背景检查。将测试样品的透明度与作为对照的纯水样品比较。
·pH方法
每个溶液样品的pH直接使用校准pH计测量。
·UV光谱
蛋白质浓度使用UV-Vis分光光度计确定。rhGDF-5的浓度使用在280纳米的1.16毫升/毫克*厘米的消光系数计算。
·HPLC方法
非还原(non-reduced)rpHPLC法(TM 0051D)用于监测蛋白质的改进类型。测试样品使用50mM乙酸稀释到约0.1毫克rhGDF-5/毫升溶液。稀释样品(每个50毫升)注入到HPLC柱(Vydac 218TP52，C18柱)。样品使用水中0.15％(体积/体积)的TFA和乙腈中0.15％(体积/体积)的TFA作为流动相以0.3毫升/分钟洗脱。在214纳米检测到洗脱峰。计算每个峰面积的百分比以监测主峰和较小峰(降解峰)的改变。
·体积排阻色谱(SEC)
蛋白质聚集物使用SEC法监测。通常30微升每种测试样品直接注入到SEC柱(TOSOH Bioscience，Cat#08540)并且使用水中0.1％(体积/体积)TFA和45％(体积/体积)乙腈以0.5毫升/分钟的速率洗脱。在280纳米监测到蛋白质峰，并且计算聚集物的百分比。
·凝胶电泳
蛋白质聚集物和降解的小块还使用凝胶电泳法监测。通常，约10微克蛋白质被干燥并使用70微升具有或没有10％β-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液(Invitrogen，Cat#LC2676)重构。样品在95℃培养5分钟。约18微升每个样品加载到凝胶(Invitrogen，Cat#NP0341Box)上。凝胶使用流动缓冲液(Invitrogen，Cat#NP0002)在200伏电压流动约35分钟。然后凝胶使用Simplyblue solution(Invitrogen，Cat#LC6060)着色并使用去离子水脱色。扫描凝胶并收集图像。
·生物活性测试
仅仅分析6个月稳定的样品(甘氨酸制剂和盐酸制剂)的生物学活性。基于细胞的测试(TM 0046)用于测量碱性磷酸酶活性以确定样品的稳定性。
·含水量
含水量测试使用卡尔·费歇尔滴定法(Karl Fischer Titration method)通过PDD进行。
·结果
·冻干结块的完整性
从时间零点到9-月时间点所有储存条件下的测试样品结块都显示为固体和白色至灰白色。当例如海藻糖或蔗糖的糖类用作填充剂时，通常观察到结块的轻微收缩，或者结块从玻璃瓶的玻璃壁略微分离。所有测试样品没有观察到结块的崩解。结块崩解通常可以改变重构时间并引起蛋白质不稳定。在没有海藻糖的制剂中得到白色、松软和轻质的结块。
·重构时间
在测试时，向每个样品瓶中加入1毫升水。将样品轻轻混合并记录重构时间。结块完全溶解需要约30-40秒。
·溶液透明度
重构的溶液样品在垂直光线下对着黑色背景检查，发现全部试样溶液透明并且无色。
·pH
使用校准pH计测量重构溶液的pH。在整个研究过程中，全部制剂的pH都没有发生显著变化。含有海藻糖/缓冲剂的制剂样品的pH约为3.0±0.2。没有海藻糖的制剂的pH约为4.0。
·UV光谱
蛋白质浓度在UV-VIS分光光度计上测量。在整个研究中，在含有甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液或0.01％TFA的rhGDF-5/海藻糖制剂中，蛋白质浓度没有显著变化。当其在25℃/60％和40℃/60％RH储存时，rhGDF-5/海藻糖/盐酸制剂中在280纳米的吸光度增加。蛋白质的浓度在40℃储存的制剂中似乎增加；由时间零点的0.7毫克/毫升的初始蛋白质浓度增加到6-月时间点的1毫克/毫升。这可以暗示海藻糖可能降解成糠醛化合物，其在280纳米具有类似的吸光度。
·非还原rhHPLC结果
非还原rhHPLC法用来监测rhGDF-5的降解物质，其通过蛋氨酸氧化、脱酰胺反应以及其它反应形成。除盐酸制剂和没有海藻糖的制剂外，对于在2-8℃和25℃储存9个月的全部制剂，主峰的百分比没有显著变化。全部制剂在9-月时间点具有小于90％的主峰。
然而当制剂在例如40℃/75％RH的加速储存条件下储存时，仅仅一种制剂(即，rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸)在6-月时间点时具有大于91％的主峰。其它制剂在加速储存条件下不如rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸制剂稳定。特别地，rhGDF-5/海藻糖/盐酸制剂在6-月时间点仅仅具有66％的主峰。图6和图7表示在40℃/75％RH储存6个月时rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸制剂和rhGDF-5/海藻糖/盐酸制剂的HPLC色谱。图8、9和10表示在5℃、25℃和40℃储存时各种测试缓冲剂的蛋白质回收百分率。
rpHPLC分析结果表明海藻糖和甘氨酸缓冲剂的组合在储存期间为冻干rhGDF-5提供最好的稳定性。此外，由于强酸HCl可能对蛋白质和海藻糖具有一定的去稳定作用，rhGDF-5/海藻糖/盐酸制剂不太稳定。
实施例13：rhGDF-5在具有5％海藻糖的pH为3的甘氨酸缓冲剂中在不同温度下的稳定性
在此研究中，rhGDF-5以约0.01、0.03、0.1、2.5、4.5和9毫克/毫升与5％(重量/体积)海藻糖和pH为3的5mM甘氨酸-盐酸缓冲液一起配制。配制的溶液用来以1毫升/瓶添加到3毫升玻璃瓶中并将玻璃瓶冻干。冻干的样品瓶在2-8℃、25℃/60％RH和40℃/75％RH储存。在每个指定时间点分析样品的产品稳定性。该研究中使用的方法包括结块外观、重构时间、溶液透明度、pH、rpHPLC(反相高效液相色谱)、UV(紫外光谱)、SEC(体积排阻色谱)和凝胶电泳。在三种储存条件下存储6个月后，在具有低至0.1毫克/毫升至高达9毫克/毫升的蛋白质浓度的制剂中没有观察到显著变化。当蛋白质浓度太低时，例如0.01和0.03毫克/毫升，现有方法不足以检测微小变化。
该研究结果表明含有海藻糖和甘氨酸-盐酸并具有不同蛋白质浓度的冻干rhGDF-5制剂在2-8℃、25℃/60％RH至少稳定6个月。在40℃/75％RH的加速储存条件下在6-月时间点在储存的产品中发现轻微的rpHPLC曲线改变。
实施例14：不同浓度的rhGDF-5在具有5％海藻糖的pH为3的甘氨酸缓冲剂中在不同温度下的稳定性
在该研究中，rhGDF-5以0.01、0.03、0.1、2.5、4.5和9毫克/毫升的rhGDF-5浓度与5％(重量/体积)海藻糖和pH为3的5mM甘氨酸缓冲液一起配制。此外作为对比，4.5毫克/毫升rhGDF-5与10％(重量/体积)海藻糖和5mM甘氨酸缓冲液(pH为3)一起配制为制剂。然后配制的溶液以1毫升/瓶添加到3毫升玻璃瓶中并冻干。冻干的样品储存在稳定的容器中。
·PH为3的5mM甘氨酸-盐酸缓冲液
3×0.75克甘氨酸(分子量75.07克)称重到3×2000毫升的烧杯中，并且向每个烧杯中加入约1900毫升去离子水。溶液使用盐酸滴定至pH为3。向每个烧杯中加入额外的水以达到2000毫升的最终体积并充分混合。
·制剂制备
原料蛋白质rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8℃解冻。蛋白质溶液(96毫升，3.8毫克/毫升)使用4离心过滤装置(Pall Life Science，Cat#OD010C37，10K MWCO)浓缩至约24毫升的总合并体积。约3×8毫升浓缩的rhGDF-5溶液转入到3×渗析过滤片(cassette)中(Pierce，Cat#66380)，并且过滤片相对于甘氨酸-盐酸缓冲液在2-8℃渗析整夜。
rhGDF-5溶液从渗析过滤片中转移到小玻璃瓶中。蛋白质浓度使用UV-Vis分光光度计测量。蛋白质使用5％或10％(重量/体积)的海藻糖和如上所述5mM甘氨酸缓冲液以各种浓度配制。配制的溶液通过0.22微米过滤器过滤，并且在冻干之前在2-8℃储存。
·填充和冻干
每个配制的溶液以1毫升/瓶添加到3毫升玻璃瓶(WestPharmaceutical Services，Cat#68000316)中。塞子(West PharmaceuticalServices，Cat#99150630)部分放置在玻璃瓶上。样品瓶转入到冻干器(FTS System，LyoStar II)中。热电偶置于空白对照剂瓶中以监测冻干过程的温度曲线。
使用的分析方法类似于如上所述实施例11和实施例12中的那些。
·结果
·冻干结块的完整性
从时间零点到6-月时间点，所有储存条件下的测试样品结块都显示为固体和白色。在结块周围观察到轻微的收缩，或者结块从玻璃瓶的玻璃壁略微分离。当例如海藻糖或蔗糖的糖类用作填充剂时这相当普遍。所有测试样品没有观察到崩解的结块。
·重构时间
在测试时，向每个样品瓶中加入1毫升水。玻璃瓶轻轻混合并记录重构时间。结块溶解需要约30-40秒。
·溶液透明度
当蛋白质溶液使用垂直光线对着黑色背景检查时，全部重构样品透明并且无色。
·pH
重构溶液用于测量pH。在整个研究过程中，全部制剂的pH都没有发生显著变化。制剂的pH值为3.0-3.3。
·UV光谱
蛋白质浓度使用UV光谱法测量。UV光谱还可提供蛋白质聚集的信息(基线光散射)。对于0.01-0.1毫克/毫升的蛋白质浓度，使用10毫米透明容器。对于2-9毫克/毫升的蛋白质浓度，使用1毫米透明小容器，没有稀释或没有样品破坏。在稳定性研究的整个过程中，在0.1-9毫克/毫升的样品中没有观察到蛋白质浓度的显著变化。对于0.01-0.03毫克/毫升的低浓度样品，由于吸光度太低而没有观察到更多变化。对于未来研究的低浓度样品，应当需要新样品制备方法。
·非还原rhHPLC结果
非还原rhHPLC法用来监测rhGDF-5的降解物质，例如蛋氨酸氧化和脱酰胺。在整个6个月储存期间，在2-8℃、25℃和40℃储存的全部样品中没有观察到主峰百分比的显著变化。在6个月储存的样品的rhGDF-5的主峰仍然回复为≥96％，并且其与从时间零点样品得到的数据是可比的。0.01和0.03毫克/毫升的低浓度样品难以通过HPLC法分析。未来研究应当需要新样品制备。
·SEC
SEC用于监测蛋白质聚集。在整个6个月稳定性测试期间，全部样品都没有观察到聚集的显著变化。没有分析0.01和0.03毫克/毫升的低浓度样品。
·凝胶电泳
蛋白质聚集和分解的物质还使用凝胶电泳监测。在整个6个月稳定性测试期间，全部样品都没有发现显著变化。
存储期间没有在任何样品中形成蛋白质的小片段，因为没有在还原SDS-PAGE上发现。
·含水量
样品的含水量低至0.19至0.32％。在蛋白质浓度和含水量之间没有观察到相关性或趋势。
通过rpHPLC和SEC色谱证明，所得结果表明冻干的rhGDF-5产品在海藻糖和甘氨酸缓冲剂的存在下在2-8℃、25℃/60％RH和40℃/75％RH稳定至少6个月。使用5％(重量/体积)海藻糖/5mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH为3)，蛋白质可以在0.1-9毫克/毫升的不同浓度范围配制(冻干之前)并且冻干。当蛋白质以例如0.01毫克/毫升和0.03毫克/毫升的低浓度配制时，现有方法对测定变化具有某些限制。
本发明已经根据说明性实施方案进行了说明。由于在不脱离本发明范围的情况下可以对上述制剂作出改变，上述说明或附图中所示的全部物质将作为说明性而非限制性解释。例如本领域熟练技术人员将会认识到，本发明说明性实施方案中的制剂不限于使用BMP，并且可以使用任何合适的生物体系中的其它生物分子。
还应当理解的是以下权利要求将覆盖本发明此处所述的全部通用和特定特征，并且本发明范围的全部声明作为语言上的要素将落入其中。

Claims (13)

1.包括至少一种BMP和足以稳定所述BMP的量的海藻糖的组合物。
2.权利要求1的组合物，另外包括pH为从约2.5至约3.5的甘氨酸缓冲液。
3.权利要求1的组合物，其中所述BMP为rhGDF-5。
4.权利要求2的组合物，其中所述BMP为rhGDF-5。
5.稳定BMP的方法，包括
(a)提供含有至少一种BMP和足以稳定所述BMP的量的海藻糖的组合物，
(b)冻干该混合物。
6.权利要求5的方法，另外包括加入pH为从约2.5至约3.5的甘氨酸缓冲液。
7.权利要求5或权利要求6的方法，其中所述BMP为rhGDF-5。
8.植入在哺乳动物中的装置，所述装置包括至少一种冻干BMP，其中BMP已经根据权利要求5的方法冻干。
9.权利要求8的装置，另外包括可生物降解的胶原基质。
10.权利要求8的装置，其中所述BMP为rhGDF-5。
11.植入在哺乳动物中的装置，所述装置包括至少一种冻干BMP，其中BMP已经根据权利要求6的方法冻干。
12.权利要求11的装置，另外包括可生物降解的胶原基质。
13.权利要求11的装置，其中所述BMP为rhGDF-5。
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