CN101443823A - 黄尿酸衍生物药物组合物及其相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利尿剂物组合物和方法并且特别涉及式I的某些衍生物或其前体药物或药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

Description

黄尿酸衍生物药物组合物及其相关方法
相关申请
本申请为2004年12月29日提交的美国申请US11/027,131的部分继续申请，将该申请的全部内容引入本文作为参考。
发明背景
利尿剂为用于治疗各种医学疾病的一组药物，所述的疾病包括充血性心力衰竭、高血压、某些类型的肝和肾病和眼内压上升。利尿剂通过肾的肾单位对转运钠(Na+)起作用，以便增加Na+(和相关离子)和体外水的肾排泄，且由此减少胞外流体(ECF)体积。一般而言，Na+通过膳食进入ECF，并且在尿中以与摄取相同的量排泄。在正常成年人中，进入两肾肾单位的超过99％的钠(通过肾小球过滤)通过罐流体外部的能量依赖性被转运并且返回到ECF中。当这种摄取与排泄之间的平衡紊乱(排泄低于摄取)时，盐贮留发生。治疗这种异常情况的主要机理包括给予一种或多种减少Na+和水被肾重吸收的活性剂且由此增加其在尿中的排泄。这些活性剂共同称作利尿剂。最佳的情况是，强力利尿剂应为促尿钠排泄药(抑制钠离子再吸收)，而并非尿钾排泄药(抑制钾离子再吸收)，因为钾离子缺失是不需要的副作用。包括在＂利尿剂＂类型中的主要药物通过抑制经对肾单位具体部位上的管形上皮细胞内的特异性＂载体＂起作用将Na+(和水)转运至肾小管液外而起作用。后者随使用的利尿剂的不同而改变。
存在几种主要类型的利尿剂，包括髓袢利尿剂、噻嗪类利尿剂和保钾利尿剂。髓袢利尿剂，也称作强效利尿剂对肾脏内稠密向上的细尿管袢起作用。实例包括呋塞米、布美他尼和托拉塞米。髓袢利尿剂具有远大于其它类利尿剂的峰值利尿作用。该类起抑制电解质重吸收的作用，从而不仅导致钠排泄，而且导致钾、钙和镁排泄。认为髓袢利尿剂为＂耗钾的＂。例如，呋塞米常用于治疗心力衰竭、肺水肿、高血压和中毒。令人遗憾的是，如果膳食钾不足，那么可能产生低钾血并且这可以可能诱发心律失常(arrythmias)(Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Basis for Therapeutics，10th Ed.；Hardman，Limbird & Gilman，Eds.MacGraw-Hill，p.772，2001)。
噻嗪类利尿剂在肾脏的远端小管和连接段中起作用。实例包括氯噻嗪、氯噻酮、氢氯噻嗪、吲达帕胺和美托拉宗。尽管噻嗪类导致细胞外液的电解质组成失调低于其他类利尿剂，但是这些药物产生的利尿强度也较低。该类包含许多磺胺类化学本体且由此可以产生那些磺胺过敏反应中的过敏反应。尽管噻嗪类不会导致钙排泄，但是钾排泄随紧急给药而增加。噻嗪类还可以诱发高血糖并且加重预先存在的糖尿病。噻嗪类利尿剂还可能导致血清胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯浓度增加。噻嗪类也称作＂耗钾＂利尿剂。
保钾利尿剂可以通过几种机理起作用。某些为类固醇结构并且在肾脏中的皮质集合小管内的醛甾酮敏感性细胞中起作用。这类药物中的成员为内源性盐皮质激素类固醇的竞争性拮抗剂，诸如醛甾酮，它起促进钠吸收和钾排泄的作用。醛甾酮受体为在几种组织，包括唾液腺、结肠和肾脏的肾单位段中发现的可溶性胞质蛋白。这类药物中有代表性的成员螺内酯结合醛甾酮受体并且防止该受体接受活性成分构造。螺内酯还增加钙排泄。通常的副作用包括恶心、胃痉挛和腹泻。其它副作用包括内分泌失调、男子女性型乳房(男性一侧或两侧乳房异常扩大)、性欲改变、阳痿或多毛症(体毛过度)。氨苯喋啶和阿米洛利为抑制肾单位后段中钠的电进入的非类固醇保钾利尿剂。氨苯喋啶和阿米洛利导致钠和氯化物排泄增加，但对钾排泄几乎没有影响。氨苯喋啶的副作用包括血钾过多(血清钾浓度增加)、恶心、呕吐、腿痛性痉挛和头晕。阿米洛利副作用还包括血钾过多、恶心、呕吐、腹泻和头痛。
其它类利尿剂包括渗透压性利尿剂和碳酸酐酶抑制剂。渗透压性利尿剂，诸如甘露糖醇难以被肾小管重吸收。这类药物难以进行纯钠盐重吸收。此外，甘露糖醇难以被胃肠道吸收且由此必须通过静脉内给药。其它渗透压性利尿剂包括甘油、脲和异山梨醇。
碳酸酐酶抑制剂，诸如乙酰唑胺导致中度的钠重吸收减少并且因其作用机制而还可以导致钾缺失和代谢性酸中毒。
利尿剂单独或与其它药物联合用于治疗高血压(高血压)。高血压可以加重心脏和动脉工作负荷。如果病情持续延长时间期限，那么心脏和动脉功能可能受损。这可以损害脑、心脏或肾脏的血管，从而导致中风、心力衰竭或肾衰竭。高血压还可以增加心脏病发作的风险。如果血压得以适度控制，那么这些风险可以降低。The National Heart，Lung，and Blood Institute′s(NHLBI)high blood pressureguidelines(JAMA，May21，2003；www.nhlbi.nih.gov)强调了研发新的无上述药典中的利尿剂的副作用的利尿药的需求。
发明概述
药物组合物，包含：
治疗有效量的式I的化合物或其前体药物或药学上可接受的盐：
Figure A200580048085D00091
其中R1、R2、R3、R5、R6和R7独立为X3R，其中R选自H、卤素；任选取代的糖、脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；-P(O)(ORa)(ORb)和-NRaRb，其中Ra和Rb独立为H、任选取代的脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；
X1、X2和X3独立为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-OS(O)y-、-S(O)y-、-O-、-NHC(O)-、-NHC(O)O-、-S(O)2NH-、键或不存在；其中y为0-3的整数；且
R4和R8独立为H、(＝O)；羟基；或任选取代的糖、脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；或-P(O)(ORa)(ORb)或-NRaRb，其中Ra和Rb独立为H或任选取代的脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；
和药学上可接受的载体。
本发明还提供了使用包含式I化合物的药物组合物治疗、控制和预防高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼内压上升或肾病综合征和其它相关疾病和病症的方法。
附图简述
附图1表示对正常Sprague Dawley大鼠静脉内(i.v.)给予(2ug剂量)合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷的反应的Na+尿排泄。
附图2表示对正常Sprague Dawley大鼠i.v.给予(2ug剂量)合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷的反应的Na+和K+尿排泄。
附图3表示对正常Sprague Dawley大鼠i.v.给予(2ug剂量)合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷后尿中的Na+和K+浓度。
附图4表示对正常Sprague Dawley大鼠i.v.给予(2ug剂量)合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷后的尿体积。
附图5表示对正常Sprague Dawley大鼠i.v.给予(10ug剂量)合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷的反应的Na+排泄。
附图6表示对正常Sprague Dawley大鼠i.v.给予(10ug剂量)合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷的反应的Na+和K+尿排泄。
附图7表示对正常Sprague Dawley大鼠i.v.给予(10ug剂量)合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷后尿中的Na+和K+浓度。
附图8表示对正常Sprague Dawley大鼠i.v.给予(10ug剂量)合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷后的尿体积。
附图9表示对正常Sprague Dawley大鼠口服(p.o.)给予合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷(10ug)，随后口服给予呋塞米(100ug)的反应的Na+尿排泄。
附图10表示对正常Sprague Dawley大鼠口服(p.o.)给予合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷(10ug)，随后口服给予呋塞米(100ug)的反应的Na+和K+尿排泄。
附图11表示对正常Sprague Dawley大鼠口服(p.o.)给予合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷(10ug)，随后口服给予呋塞米(100ug)的反应的尿中Na+和K+尿浓度。
附图12表示对正常Sprague Dawley大鼠口服(p.o.)给予合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷(10ug)，随后口服给予呋塞米(100ug)后的尿体积。
附图13表示对尿毒症Sprague Dawley大鼠i.v.给予分离的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(3ug)，随后口服给予呋塞米(20ug)的反应的Na+尿排泄。
附图14表示对尿毒症Sprague Dawley大鼠i.v.给予分离的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(3ug)，随后口服给予呋塞米(20ug)的反应的Na+和K+尿排泄。
附图15表示对尿毒症Sprague Dawley大鼠i.v.给予分离的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(3ug)，随后口服给予呋塞米(20ug)的反应的Na+和K+尿浓度。
附图16表示对尿毒症Sprague Dawley大鼠i.v.给予分离的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(3ug)，随后口服给予呋塞米(20ug)的反应的尿体积。
附图17表示对尿毒症Sprague Dawley大鼠i.v.给予分离的黄尿酸8-O-硫酸盐(2ug)的反应的Na+尿排泄。
附图18表示对尿毒症Sprague Dawley大鼠i.v.给予分离的黄尿酸8-O-硫酸盐(2ug)的反应的Na+和K+尿排泄。
附图19表示对尿毒症Sprague Dawley大鼠i.v.给予分离的黄尿酸8-O-硫酸盐(2ug)的反应的尿中Na+和K+尿浓度。
附图20表示对尿毒症Sprague Dawley大鼠i.v.给予分离的黄尿酸8-O-硫酸盐(2ug)的反应的尿体积。
附图21表示通过口服给药对正常Sprague Dawley大鼠给予合成的黄尿酸8-O-硫酸盐(20.0ug)的反应的Na+尿排泄。
附图22表示通过口服给药对正常Sprague Dawley大鼠给予合成的黄尿酸8-O-硫酸盐(20.0ug)的反应的Na+和K+尿排泄。
附图23表示通过口服给药对正常Sprague Dawley大鼠给予合成的黄尿酸8-O-硫酸盐(20.0ug)的反应的尿中Na+和K+浓度。
附图24表示通过口服给药对正常Sprague Dawley大鼠给予合成的黄尿酸8-O-硫酸盐(20.0ug)的反应的尿体积。
附图25表示正常Sprague Dawley大鼠对呋塞米(0.5mg，i.v.)的反应的Na+和K+尿排泄。
附图26表示正常Sprague Dawley大鼠对呋塞米(0.5mg，i.v.)的反应的尿排泄率。
发明详述
除非另作陈述，否则应使用本文所用的下列定义
术语＂任选取代的＂可以与术语＂取代或未被取代的＂互换使用，除非另作陈述，否则任选取代的基团可以在基团的每一可取代的位置上具有取代基并且取代彼此各自独立。此外，允许取代基的组合或变化形式，只要这类组合产生稳定的化合物。此外，除非另作陈述，否则独立地选择官能基。如果＂任选取代的＂改变了通过逗号分隔开的一系列基团(例如＂任选取代的A，B或C＂；或＂A，B或C任选被...取代＂)，那么意指基团各自(例如A，B和C)任选被取代。
本文所用的术语＂脂族化合物＂或＂脂族基团＂意指完全饱和或包含一个或多个不饱和单元的直链或支链C1-12烃链或完全饱和或包含一个或多个不饱和单元，但并非芳族的单环C3-8烃或双环C8-12烃(本文也称作＂碳环＂或＂环烷基＂)，它具有与分子的剩余部分的单一连接点，其中所述双环环系中的任意各环具有3-7个成员。例如，合适的烷基包括，但不限于直链或支链或烷基、链烯基、炔基及其杂化物，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)链烯基。
术语＂烷氧基＂，＂羟基烷基＂，＂烷氧基烷基＂和＂烷氧羰基＂在单独或作为加大部分的组成部分使用时包括包含1-12个碳原子的直链和支链。术语＂链烯基＂和＂炔基＂在单独或作为加大部分的组成部分使用时包括包含2-12个碳原子的直链和支链。
在术语＂卤代烷基＂，＂卤代链烯基＂和＂卤代烷氧基＂的情况中意指可以被一个或多个卤原子取代的烷基、链烯基或烷氧基。本文所用的术语＂卤素(halogen)＂或＂卤素(halo)＂意指F、Cl、Br或I。
术语＂杂原子＂意指氮、氧或硫并且包括氮和硫的任意氧化形式和任意碱性氮的季胺化形式。术语＂芳基＂在单独或与其它术语联用时意指带有总计5-14个环成员的单环、双环或三环碳环系，其中在该系统中至少一个环为芳族的并且其中该系统中的各环包含3-8个环成员。术语＂芳基＂可以与术语＂芳基环＂互换使用。术语＂芳烷基＂意指被芳基取代的烷基。本文所用的术语＂芳烷氧基＂意指被芳基取代的烷氧基。
本文所用的术语＂杂环烷基＂，＂杂环＂，＂杂环基＂或＂杂环化合物＂意指带有5-14个环成员的单环、双环或三环环系，其中一个或多个环成员为杂原子，其中该系统中的各环包含3-7个环成员并且为非芳族的。
术语＂杂芳基＂在单独或与其它术语联用时意指带有总计5-14个环成员的单环、双环和三环环系，并且其中：1)在该系统中至少一个环为芳族的；2)在该系统中至少一个环包含一个或多个杂原子；和3)在该系统中各环包含3-7个环成员。术语＂杂芳基＂可以与术语＂杂芳基环＂或术语＂杂芳族化合物＂互换使用。杂芳基环的实例包括2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噁二唑基、5-噁二唑基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、3-哒嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、5-四唑基、2-三唑基、5-三唑基、2-噻吩基、3-噻吩基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、吲唑基、异吲哚基、吖啶基和苯并异噁唑基。术语＂杂芳烷基＂意指被杂芳基取代的烷基。术语＂杂芳基烷氧基＂意指被杂芳基取代的烷氧基。
芳基(包括芳烷基、芳烷氧基、芳氧基烷基等)或杂芳基(包括杂芳烷基、杂芳基烷氧基等)可以包含一个或多个取代基。芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基的不饱和碳原子上的合适的取代基选自：卤素；卤代烷基；-CF3；-R9；-OR9；-SR9；1，2-亚甲二氧基；1，2-亚乙二氧基；被保护的OH(诸如酰氧基)；苯基(Ph)；被R9取代的Ph；-O(Ph)；被R9取代的-O-(Ph)；-CH2(Ph)；被R9取代的-CH2(Ph)；-CH2CH2(Ph)；被R9取代的-CH2CH2(Ph)；-NO2；-CN；-NR9R10；-NR9C(O)R10；-NR9C(O)NR10R11；-NR9CO2R10；-NR9NR10C(O)R11；-NR9-NR10C(O)NR11R12；-NR9NR10CO2R11；-C(O)C(O)R9；-C(O)CH2C(O)R9；-CO2R9；-C(O)R9；-C(O)NR9R10；-OC(O)NR9R10；-S(O)2R9；-SO2NR9R10；-S(O)R9；-NR9SO2NR10R11；-NR9SO2R10；-C(＝S)NR9R10；-C(＝NH)-NR9R10；-(CH2)yNHC(O)R9；-(CH2)yR9；-(CH2)yNHC(O)NHR9；-(CH2)yNHC(O)OR9；-(CH2)yNHS(O)R9；-(CH2)yNHSO2R9或-(CH2)yNHC(O)CH((V)z-R9)(R10)，其中R9，R10，R11和R12独立地选自氢、任选取代的C1-6脂族化合物、未被取代的5-6元杂芳基或杂环、苯基(Ph)、-O(Ph)或-CH2(Ph)-CH2(Ph)，其中y为0-6；z为0-1；且V为连接基。当R9，R10，R11或R12为C1-6脂族化合物时，它可以被一个或多个取代基取代，所述的取代基选自-NH2、-NH(C1-4脂族化合物)、-N(C1-4脂族化合物)2、-S(O)(C1-4脂族化合物)、-SO2(C1-4脂族化合物)、卤素、(C1-4脂族化合物)，-OH、-O-(C1-4脂族化合物)、-NO2、-CN、-CO2H、-CO2(C1-4脂族化合物)、-O(卤素C1-4脂族化合物)或-卤代(C1-4脂族化合物)；其中C1-4脂族化合物各自未被取代。
脂族基团或非芳族杂环可以包含一个或多个取代基。从上述对芳基或杂芳基的不饱和碳所述和下述中选择烷基或非芳族杂环的饱和碳上的合适的取代基：＝O、＝S、＝NNHR13、＝NNR13R14、-N-、＝NNHC(O)R13、＝NNHCO2(烷基)、＝NNHSO2(烷基)或＝NR13，其中R13和R14独立地选自氢和任选取代的C1-6脂族化合物。当R13或R14为C1-6脂族化合物时，它可以被一个或多个选自-NH2、-NH(C1-4脂族化合物)、-N(C1-4脂族化合物)2、卤素、-OH、-O-(C1-4脂族化合物)、-NO2、-CN、-CO2H、-CO2(C1-4脂族化合物)、-O(卤代C1-4脂族化合物)或-卤代(C1-4脂族化合物)的取代基取代；其中C1-4脂族化合物各自未被取代。
非芳族杂环的氮上的取代基选自-R15、-NR15R16、-C(O)R15、-CO2R15、-C(O)C(O)R15、-C(O)CH2C(O)R15、-SO2R15、-SO2NR15R16、-C(＝S)NR15R16、-C(＝NH)NR15R16或-NR15SO2R16；其中R15和R16独立为选自氢、任选取代的C1-6脂族化合物、任选取代的苯基(Ph)、任选取代的-O(Ph)、任选取代的-CH2(Ph)、任选取代的-CH2CH2(Ph)或未被取代的5-6元杂芳基或杂环。当R15或R16为C1-6脂族基团或苯基环，它可以被一个或多个取代基取代，所述的取代基选自-NH2、-NH(C1-4脂族化合物)、-N(C1-4脂族化合物)2、卤素、-(C1-4脂族化合物)、-OH、-O-(C1-4脂族化合物)、-NO2、-CN、-CO2H、-CO2(C1-4脂族化合物)、-O(卤代C1-4脂族化合物)或-卤代(C1-4脂族化合物)；其中C1-4脂族化合物各自未被取代。
术语＂糖＂定义了由具有一般实验通式(CH2O)n的一个或多个单元构成的碳水化合物或糖。根据单元或氨基糖的数量的不同，将糖进一步定义为单糖、二糖或多糖，只要一个或多个氧原子被氮原子取代。还可以将糖分类为脱氧糖，只要一个或多个羟基被氢原子取代。
例如，糖取代基可以进一步在任意伯或仲羟基上被烷基、烷氧基烷基、芳基、杂芳基、醚、酯、缩醛、碳酸酯或氨基甲酸酯取代。
术语＂单糖＂定义了单一碳水化合物或糖单位。单糖类的两个家族为醛糖类或酮糖类。醛糖类在碳链的末端上羰基作为醛，此时将单糖书写为线性开链通式。如果羰基位于碳链的任意其它位置上，那么单糖为酮并且称作酮醣。三碳单糖类为丙糖类：甘油醛类，醛糖和二羟基丙酮，酮醣。除二羟基丙酮外，单糖类具有一个或多个不对称中心。前缀D-或L-意指最远离羰基碳的手性碳的碳原子的构型。在主链上带有4，5，6和7个碳原子的单糖类分别称作丁糖类、戊糖类、戊糖类和庚糖类。它们各自以两个系列存在：丁醛糖类和酮丁糖类、戊醛糖类和戊酮糖类、己醛糖类和己酮糖类、庚醛糖类和庚酮糖类。丁糖类包括赤鲜糖和苏糖。戊糖类包括核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖。己糖类包括阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖。在主链上带有5个或5个以上碳的单糖类通常作为环状或环结构出现，其中羰基沿链与羟基之一形成共价键。6元环化合物称作吡喃糖类，5元环化合物为呋喃糖类。6元环的形成是因醛类和醇类形成包含不对称碳原子的半-缩醛类的反应所致。将围绕C-1碳的一种构型描述为α-型并且将另一种构型描述为β-型。
术语＂二糖＂意指包含彼此共价结合的两个单糖的分子部分。二糖类包括麦芽糖[葡萄糖-葡萄糖]、乳糖[半乳糖-葡萄糖]和蔗糖[果糖-葡萄糖]。
术语＂多糖＂包括彼此共价结合的多个单糖单元。多糖类包括淀粉、透明质酸、直链淀粉、支链淀粉、葡聚糖、环糊精和糖原。
术语＂氨基糖＂意指碳水化合物分子，其中一个或多个羟基被氨基取代。它包括单糖葡糖胺和胞壁酸和多糖壳多糖。氨基可以被乙酰化以便包括N-乙酰基-D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-胞壁酸。
术语＂脱氧糖＂意指碳水化合物分子，其中一个或多个羟基被氢取代。它们包括：例如L-鼠李糖(6-脱氧-L-甘露糖)、L-岩藻糖(6-脱氧-L-半乳糖)和D-岩藻糖(万年青糖)。
术语＂治疗＂意指治疗哺乳动物，特别是人的病理性疾病并且包括：(i)预防易感疾病，但尚未诊断为该病的受试者发生病理性疾病，且由此治疗构成了对疾病的预防性治疗；(ii)抑制病理性疾病，即阻止其发展；(iii)缓解病理性疾病，即导致病理性疾病退化；或(iv)缓解由病理性疾病介导的情况。
术语＂治疗有效量＂意指如上所述在对有这类治疗需要的哺乳动物给药时足以进行治疗的本发明化合物的用量。治疗有效量根据受试者和所治疗疾病情况、受试者体重和年龄、疾病的严重程度、给药方式等的不同而改变，它们易于由本领域普通技术人员确定。
术语＂药学上可接受的盐＂包括，但不限于本领域技术人员众所周知的盐，例如本发明化合物的一-盐(例如碱金属和铵盐)和多盐(例如二-或三-盐)。例如，式I化合物的药学上可接受的盐，其中可交换的基团，诸如-OH或-NH-上的氢被药学上可接受的阳离子(例如钠、钾或铵离子)取代并且可以便利地由相应的式I的化合物通过例如与合适的碱反应制备。在化合物为足以形成稳定的无毒性酸或碱式盐的情况中，化合物作为盐给药是合适的。药学上可接受的盐的实例为与形成生理可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成的盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-磷酸甘油。还可以形成合适的无机酸盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。可以使用本领域众所周知的标准操作步骤获得药学上可接受的盐，例如，通过使诸如胺这类足够碱性的化合物与合适的酸反应而生成生理可接受的阴离子。还可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
本文所用的术语＂疾病＂、＂病症＂或＂疾病情况＂意指已知利尿药或药物组合物的治疗性给药在其治疗中起作用的任意疾病或其它有害情况或疾病。这类疾病或疾病情况包括，但不限于高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼压或肾病综合征和因那些疾病导致或加剧的并发症。
本文所用的术语＂利尿剂＂意指用于促进尿形成和排泄的药物或其它物质。
本文所用的术语＂高血压＂意指特征在于血压升高的病症。
＂抗体＂意指称作免疫球蛋白的糖基化蛋白家族中的成员，它们可以特异性与抗原结合。
＂抗原＂意指引起抗体形成的化合物。
＂抗原决定簇＂或＂抗原决定部位＂意指抗原的抗体确切识别部位。该术语可以与＂表位＂互换使用。
＂载体＂意指高分子量(大分子)聚合物，通常为蛋白质，抗原或半抗原可以与之结合或缀合以便有利于抗体形成。如果需要，载体可以在其结构中掺入标记。
＂缀合物＂意指抗原或半抗原与载体通过化学方式结合；共轭物也可以包含其它基团。
＂ELISA＂意指酶联免疫吸附测定，其使用与固相结合的抗体或抗原和酶-抗原或酶-抗体缀合物以便检测和定量存在于样品中的抗原或抗体的量。有关ELISA技术的描述可以在D.P.Sites等的Chapter 22of the 4th Edition of Basic and Clinical Immunology中找到，该文献由Lange Medical Publications of Los Altos，Calif在1982年出版，将该文献引入本文作为参考。
＂EMIT＂意指酶-放大免疫测定技术，其使用：(1)酶-标记的半抗原；(2)针对半抗原的特异性抗体；(3)预处理试剂；(4)缓冲的-酶底物；和(5)检测样品中未知的用量的标准品。有关EMIT技术的描述可以在E.T.Maggio的Enzyme Immunoassay中找到，特别是在pp.141-150，234-5，和242-3上，该文献由CRC Press，Inc.，Boca Raton，FIa.在1980年出版。将这些材料引入作为参考。
＂表位＂意指由抗体特异性识别的分子部分。它也称作决定簇。
＂荧光免疫测定＂意指基于抗体的测定，其中所测定的种类结合，取代用抗体-配体复合物中荧光种类标记的物质或与之竞争性结合。在该测定的某些实施方案中，分离所述的复合物并且荧光种类的存在或不存在得到了所测定种类的量的测量值。在其它实施方案中，所述的复合物具有不同于未复合的荧光种类的荧光特性，使得可以在不分离该复合物的情况下检测其形成。有关荧光免疫测定技术的描述可以在＂A Review of Fluoroimmunoassay and Immunofluorometric Assay＂，D.S.Smith等(1981)Ann.Clin.Biochem.(1981)18：253-274中找到，将该文献引入本文作为参考。
＂半抗原＂意指通常为低分子量的化合物，它在结合较大分子时可以引起抗体形成。
＂标记＂意指分子中可检测的基团。在常用的标记中有用于放射性免疫测定的放射性种类、用于荧光免疫测定的荧光种类和用于ELISA和EMIT方法的酶促种类等。
＂配体＂意指具有抗体合并部位并且可以结合受体的任意分子。
＂标准品＂意指以用于定量不同样品未知浓度的相同特异性分子的已知浓度存在的特异性分子样品。
对本领域技术人员显而易见的是，本发明的某些化合物可以以互变体形式存在，所有这类化合物的互变体形式均属于本发明的范围。
除非另作陈述，否则本文所述的结构还指包括该结构的所有立体化学形式；即每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体和对映体和非对映体混合物均在本发明范围内。除非另作陈述，否则本文所述的结构还指包括仅在存在的一个或多个同位素富含的原子上不同的化合物。例如，具有除由氘或氚取代氢或由13C-或14C-富含的碳取代碳外的存在结构的化合物均属于本发明的范围。
本发明的一个方面涉及包含式I的化合物的药物组合物。在一个优选的实施方案中，该组合物包含式I的化合物，中R1、R3、R5、R6和R7独立为H、卤素或低级烷基。在另一个实施方案中，X1不存在且R4为(＝O)；或X1为键且R4为羟基。在另一个实施方案中，X1R4为-OC(O)CH3。在另一个实施方案中，R2为-C(O)OR，其中R优选为H或任选取代的烷基，其中烷基可以为甲基、乙基、丁基、辛基或十一基。在另一个实施方案中，R2为-C(O)NHR，其中R优选为H或任选取代的烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。
在本发明的一个实施方案中，X2为-O-且R8为任选取代的糖，优选单糖选自己醛吡喃糖、戊醛吡喃糖、戊醛呋喃糖或酮糖。在其它实施方案中，R8为D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-岩藻糖或L-鼠李糖。在一个优选的实施方案中，R8为D-葡萄糖。在一个具体的实施方案中，式I的化合物为黄尿酸8-O-β-D-糖苷。
在另一个实施方案中，X2为-O-且R8为-CH2CO2R或-CH2C(O)NHR，其中R优选为H或任选取代的烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。
按照本发明的另一个实施方案，所述的药物组合物包含式I的化合物，其中X2R8为酰基、磷酸酯、膦酸、膦酸烷基酯或硫酸盐基。在一个具体的实施方案中，所述的化合物为黄尿酸8-O-硫酸盐。
本发明进一步提供了药物组合物，包含：治疗有效量的式I表示的化合物与一种或多种额外的利尿化合物或心血管药；和药学上可接受的载体。
本文所述的药物组合物用于治疗或预防高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼内压或肾病综合征和因那些疾病导致或因其加剧的并发症。
根据所治疗或预防的具体疾病的不同，可以将通常为治疗或预防该病给予的额外治疗剂与本发明的化合物一起给药。例如，在治疗高血压的过程中，可以将一种或多种额外的利尿化合物或心血管药与本发明的化合物联用以便治疗高血压。额外的利尿剂选自髓袢利尿剂、噻嗪类利尿剂、保钾利尿剂、碳酸酐酶抑制剂和渗透压性利尿剂。心血管药选自血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β-肾上腺素能阻滞剂、钙通道阻滞剂、胆固醇改变药物、降甘油三酯剂、降c-反应蛋白质剂、降高半胱氨酸剂、阿司匹林及其衍生物、离子移变剂、抗心律失常药和血液稀释剂(抗凝血剂)。这些活性剂包括，但不限于呋塞米、布美他尼、托塞米、依地尼酸、氯噻嗪、氢氯噻嗪、螺内酯、阿米洛利、氨苯喋啶、乙酰唑胺、醋甲唑胺、二氯磺胺、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、吲达帕胺、美托拉宗、泊利噻嗪、氯噻酮、多佐胺、布林唑胺、甘油、甘露糖、脲、赖诺普利、莫昔普利、依那普利、厄贝沙坦、缬沙坦、氯沙坦、纳多洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔和比索洛尔。
可以将式I的化合物配制成药物组合物并且以各种适合于选择的给药途径的形式对哺乳动物宿主，诸如人体患者给药，例如通过口服、非肠道、静脉内、肌内、局部或皮下途径。因此，可以将本发明的化合物与药学上可接受的媒介物，诸如惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起通过全身，例如通过口服给药。可以将它们包封在硬或软壳胶囊中，可以将它们压制成片剂或将其直接掺入患者膳食的食物。为了进行口服治疗给药，可以将活性化合物与一种或多种赋形剂互补并且以可摄取的片剂、含片、药片、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。这类组合物和制剂应包含至少0.1％的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可以改变并且便利地占指定单位剂型重量的约2-约60％。活性化合物在这类治疗上有用的组合物中的量能够获得有效剂量水平。
片剂、含片、丸剂、胶囊等还可以包含下列成分：粘合剂，诸如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；和增甜剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或可以加入矫味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃香料。当单位剂型为胶囊时，它除包含上述类型的物质外，还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。可以存在各种其它物质作为包衣材料，否则就用于改变固体单位剂型的物理形式。例如，可以用明胶、蜡、虫胶或糖等给片剂、丸剂或胶囊包衣。糖浆剂或酏剂可以包含活性化合物、作为增甜剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和诸如樱桃或橙香料这类矫味剂。当然，用于制备任意单位剂型的任意材料均应为药学上可接受的并且在使用量上基本上为无毒性的。此外，可以将活性化合物掺入缓释制剂和装置。
还可以通过静脉内或腹膜内，经输注或注射给予活性化合物。可以制备在水中的任选与无毒性表面活性剂混合的活性化合物或其盐的溶液。还可以制备在甘油、液体聚乙二醇类、三醋精及其混合物和油中的分散体。在一般储存和使用条件下，这些制剂包含防止微生物生长的防腐剂。适合于注射或输注的药物剂型可以包括无菌水溶液或分散液或包含适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液的任选包囊在脂质体中的无菌粉末。在所有情况中，最终的剂型在制备和储存条件下应为无菌的、流体的和稳定的。液体载体或媒介物可以为溶剂或液体分散介质，其包含：例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇类等)、植物油、无毒性的甘油酯类及其合适的混合物。例如，可以通过维持分散液的所需颗粒大小或通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可以用各种抗菌剂和抗真菌剂预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如糖类、缓冲剂或氯化钠。可以通过在组合物中使用延缓吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶延长可注射组合物的吸收。
通过将活性化合物以所需量掺入后于上述各种其它组分的合适的溶剂，如果需要，随后进行无菌过滤来制备无菌可注射溶液。就制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，它们可以产生存在于上述无菌过滤溶液中的活性组分+任意额外所需组分的粉末。就局部给药而言，可以以纯的形式施用本发明的化合物，即此时它们为液体。然而，一般需要将它们作为与可以为共同或液体的皮肤病学可接受载体的组合物或制剂施用于皮肤。
有用的固体载体包括固体细粉，诸如滑石粉、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载体包括水、醇类或乙二醇类或水-醇/乙二醇掺合物，其中可以借助于无毒性表面活性剂以有效水平溶解或分散本发明的化合物。可以加入诸如香料这类佐剂和额外的抗微生物剂以便优化用于指定应用的特性。可以从吸收垫中施用所得的液体组合物，将其用于浸渍绷带和其它敷料或使用泵型或气溶胶喷雾剂喷在受侵害的区域上。
还可以将增稠剂，诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯类、脂肪醇类、改性纤维素或改性的矿物与液体载体一起使用以便形成可直接施用于使用者皮肤的可分散的糊剂、软膏剂、皂等。
可以用于将本发明化合物递送至皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例披露在Jacquet等(美国专利US4,608,392)、Geria(美国专利US4,992,478)、Smith等(美国专利US4,559,157)和Wortzman(美国专利US4,820,508)中。
还可以制备通过鼻和咽喉或支气管组织纳米吸收的合适的剂型的本发明组合物，并且可以便利地采用粉末或液体喷雾剂或吸入剂、锭剂、涂咽剂等剂型。就眼或耳用药物而言，可以将制剂制成单个胶囊，液体或半固体剂型，或可以作为滴剂等使用。可以配制在疏水性或亲水性基质中的局部施用制剂，诸如软膏剂、霜剂、洗剂、涂布剂、粉末等。
就兽药而言，例如，可以将组合物配制成在长效或速释基质中的乳房内用制剂。
可以通过比较动物模型的体外活性和体内活性来测定本发明化合物的有用的剂量。本领域中已知从小鼠的有效剂量外推至人体的有效剂量的方法；例如，参见美国专利US4,938,949。
一般而言，本发明化合物在液体组合物，诸如洗剂中的浓度在约0.1-25wt-％，优选约0.5-10wt-％。在半固体或固体组合物，诸如凝胶或粉末中的浓度在约0.1-5 wt-％，优选约0.5-2.5 wt-％。
无论是液体，还是固体，每单位剂量的组合物可以包含0.1％-99％的活性物质(化合物I或其盐)，优选的范围在约10-60％。以组合物的总重为基准，组合物一般包含约15mg-约1,500mg重量的活性组分；然而，一般而言，优选使用的剂量在约250mg-1,000mg。在非肠道给药中，单位剂量通常为在适度酸化的无菌水溶液中或指定用于溶液的可溶性粉末形式的纯化合物。可以给予用于注射、输注或摄入的单一剂量，即每天1-3次，以便对成年人产生约0.5-50mg/kg的水平。
抗体的产生
本说明书中进一步包括生产能够同源性识别黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的抗体的方法。这类抗体可以包括，但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体和任意上述的表位结合片段。例如，这类抗体可以用于检测生物样品中的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷，或者用作抑制异常黄尿酸-8-O-β-D-糖苷活性的方法。因此，这类抗体可以作为疾病治疗方法的组成部分使用，和/或可以作为诊断技术的组成部分使用，由此可以测试患者的异常黄尿酸-8-O-β-D-糖苷水平。
为了生产抗体，可以通过使用例如水溶性碳二亚胺，诸如EDC活化黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的羧基形成黄尿酸-8-O-β-D-糖苷生物缀合物免疫原而产生黄尿酸-8-O-β-D-糖苷与例如载体蛋白，诸如KLH或卵清蛋白的缀合物。例如，可以通过在辅助方案中注射黄尿酸-8-O-β-D-糖苷生物缀合物免疫原给各种宿主动物免疫接种。这类宿主动物包括家兔、小鼠、大鼠、山羊和小鸡等。各种佐剂可以用于增加免疫反应，这取决于宿主种类，包括，但不限于弗氏(完全和不完全)；矿物凝胶，诸如氢氧化铝；表面活性物质，诸如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类、聚阴离子、肽类、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人佐剂，诸如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗体为来源于免疫接种抗原，诸如黄尿酸-8-O-β-D-糖苷生物缀合物免疫原的动物血清的抗体分子异源群体。为了生产多克隆抗体，可以通过注射补充了也如上所述的佐剂的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷生物缀合物免疫原给诸如如上所述的那些宿主动物免疫接种。
使用宿主动物生产针对抗原的多克隆抗体的方法一般为本领域公知的。在典型制备中，将黄尿酸-8-O-β-D-糖苷生物缀合物免疫原中的一种或多种导入哺乳动物或鸟类宿主。合适的宿主包括：例如猴、牛、家兔、大鼠、小鼠等。该步骤通常通过皮下注射作为在已经用例如弗氏完全佐剂乳化的盐水中的溶液进行。随后的动物抗体滴度遵循ELISA。在几周后，将加强注射在例如弗氏不完全佐剂中的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷生物缀合物免疫原用于增加抗体滴度。通过在约1个月后对动物采血收集抗体。使全血在25℃下凝块几小时。加入硫酸铵水溶液以便获得40％重量的水溶液和IgG级分沉淀。通过离心收集沉淀并且重新悬浮于盐水和缓冲溶液中至所需浓度。
可以进一步将纯化的抗体级分用于诊断测定系统中。这类修饰以包括连接酶，诸如lipozyme、乳过氧化物酶、碱性磷酸酶和用于ELISA测定的其它酶。可以用荧光部分修饰抗体。最好的情况是在抗体和抗原结合时猝灭或强化荧光。这些用于测定抗体-抗原相互作用程度的技术为本领域中公知的。本说明书中的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷、黄尿酸-8-O-β-D-糖苷缀合物和抗体也用于检测和诊断各种钠失衡病症，特别是提供用于测定技术，诸如ELISA或EMIT的校准液的高度纯的物质。
可以通过经在培养物中的连续细胞系提供生产抗体分子的任意技术获得对特定抗原而言为同型抗体群的单克隆抗体。它们包括，但不限于(K
Figure A200580048085D0025135231QIETU
hler和Milstein，Nature，256：495-7(1975)；和美国专利US4,376,110)的杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today，4：72(1983)；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：2026-30(1983))和EBV-杂交瘤技术(Cole等，在MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy中，Alan R.Liss，Inc.，New York，pp.77-96(1985))。这类抗体可以属于任意免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任意的亚类。可以在体外或体内培养本说明书中产生mAb的杂交瘤。体内高滴度mAbs的产生使得它成为目前优选的生产方法。
此外，可以使用为生产＂嵌合抗体＂研发的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-6855(1984)；Takeda等，Nature，314：452-54(1985))，通过下列步骤进行：剪接来自具有合适的抗原同源性的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适的生物活性的人抗体分子的基因。嵌合抗体为不同部分来源于不同动物种类的分子，诸如那些具有可变区来源于鼠mAb和人免疫球蛋白恒定区的分子。
或者，可以采用对生产单链抗体描述的技术(美国专利US4,946,778；Bird，Science 242：423-26(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-83(1988)；和Ward等，Nature，334：544-46(1989))生产基因-单链抗体。一般通过经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成单链抗体，得到单链多肽。
可以通过公知技术产生识别特异性表位的抗体片段。例如，这类片段包括，但不限于可以通过对抗体分子进行胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段和通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，Science，246：1275-81(1989))以便能够快速和易于鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
根据缀合的便利性、更新率和测定未知物(分析物)的生理溶液的不同，可以广泛改变用于诊断试剂、标准品或试剂盒的酶。选择的有代表性的酶包括在美国专利US3,817,837中发现的水解酶、核酸酶、酰胺酶、酯酶等，将该文献引入本文作为参考。
标记如本文所述用于诊断试剂、标准品或试剂盒的抗体的方法和仪器可以在美国专利US4,366,241中找到，将该文献引入本文作为参考。
诊断
本发明进一步包括对可以用于建立与钠失衡病症的相关性的人体液(全血、尿、csf、血清、血浆、眼泪(ocular)、粪便、汗)中的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷进行定量。这类病症可以包括高血压(低肾素、低血管紧张素)、充血性心力衰竭(水肿)、肾病综合征、肝硬化(cirrosis)、月经前期水肿、周期性水肿和心源性休克。黄尿酸-8-O-β-D-糖苷定量可以证实有用的其它临床情况包括手术后环境和战场环境，其中给予患者过多的流体；和保钾与呋塞米给药。黄尿酸-8-O-β-D-糖苷定量还可以用于＂逃逸综合征＂，其中肿瘤不适当地增长，影响醛甾酮；然后是钠排泄减少，从而导致在心血管系统中增加2升的流体潴留。此时，因导致流体和钠缺失和由此维持2升的超负荷状态而发生＂逃逸＂。提出了超负荷流体状态导致黄尿酸-8-O-β-D-糖苷增加，由此通过刺激钠排泄和伴随的流体丢失而导致＂逃逸＂。
各种方法可以用于诊断与黄尿酸-8-O-β-D-糖苷过量或缺乏相关的疾病情况。
例如，可以通过使用预包装的诊断试剂盒进行本文所述的方法，该试剂盒包含至少一种本文所述的特异性抗体试剂，例如，它可以便利地在临床环境中使用，以便诊断表现出疾病症状或处于发生疾病风险中的患者。
在下述诊断中可以使用任意的人体生物样品或组织。例如，可以使用血液、尿、唾液、脑脊髓液、血清、血浆、眼泪、粪便或汗。
用于检测生物样品中黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的诊断方法可以包括：例如免疫测定，诸如包括固相酶联免疫吸附测定(ELISA)的异相酶免疫测定；和包括酶放大免疫测定技术(EMIT)的溶液相同相酶免疫测定。可以通过高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)或任选例如通过固相提取对尿样进行预处理的毛细管电泳-质谱(CE-MS)测定黄尿酸-8-O-β-D-糖苷。此外，可以研发表面等离振子共振(SPR)技术，其中基于芯片的光学生物传感器系统用于研究黄尿酸-8-O-β-D-糖苷结合靶膜分子的的功能特性，其中黄尿酸-8-O-β-D-糖苷源来自不纯的混合物，诸如血清、尿和细胞培养基。SPR技术用于发现和表征不同细胞类型中的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的膜受体。
黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的免疫测定一般包括：孵育生物样品，诸如生物流体、组织提取物、新鲜收集的细胞或已经在有能够鉴定黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的可检测标记的抗体存在下的组织培养物中孵育的细胞；并且通过本领域众所周知的许多技术检测结合抗体。
可以使生物样品接触并且固定在固相支持体或载体上，诸如硝化纤维或其它能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的固相支持体。然后用合适的缓冲液洗涤支持体，随后用可检测标记的基因-特异性抗体处理。然后用缓冲液第二次洗涤固相支持体以便除去未结合的抗体。然后可以通过常规方式检测固相支持体上结合的标记的量。
术语＂固相支持体或载体＂用以包括能够结合抗原或抗体的任意支持体。众所周知的支持体或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺类、辉长岩和磁石。就本说明书至的目的而言，载体的性质可以为可溶至一定程度的或不溶性的。支持体材料实际上可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支持体构型可以为珠的球形或在试管的内表面为圆柱形，在外表面为柱形。或者，表面可以为平坦的，为片、试验带等。优选的支持体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员了解许多其它合适的结合抗体或抗原的载体或能够通过使用超过实验确定。
实际上，微量滴定板常用于许多免疫测定。可以通过非共价或共价结合固定锚定的成分。可以便利地通过用黄尿酸-8-O-β-D-糖苷生物缀合物涂敷固体表面并且干燥进行非共价结合。或者，对黄尿酸-8-O-β-D-糖苷具有特异性的固定化抗体，优选单克隆抗体可以用于锚定固体表面。预先制备表面并且储存。为了进行本试验，将未固定的成分加入到包含锚定成分的涂敷的表面上。在反应完成后，在任何形成的复合物保持固定在固体表面上的条件下除去未反应的成分(例如通过洗涤)。可以按照许多方式对锚定在固体表面上的复合物进行检测。如果预先标记了预先未固定的成分，那么检测表面上固定的标记表明形成复合物。如果预先未标记预先未固定的成分，那么，例如，间接标记可以用于使用对预先未固定的成分具有特异性的标记抗体检测表面上锚定的复合物(由此可以使用标记的抗-Ig抗体直接标记或间接标记抗体)。
例如，竞争性抑制测定通常用于测定小分析物，诸如黄尿酸-8-O-β-D-糖苷，因为竞争性抑制测定仅需要结合一种抗体而非如标准ELISA反式中的两种。由于在两种抗体尝试同时结合小分子时出现位阻的可能性，所以夹心式测定方式并不切实可行，因此，优选竞争性抑制测定。在连续竞争性抑制测定中，如几小时测定的步骤加入样品和缀合的分析物，而在传统的竞争性抑制测定中，同时共同孵育这些试剂。
在连续的竞争性抑制测定方式中，将单克隆抗体(MAb)包被在96-孔微量滴定板上。当加入样品时，Mab俘获样品外部游离的分析物。在下一步中，加入用生物素或HRP标记的已知量的分析物。然后还尝试标记的分析物结合吸附在平板上的Mab，然而，因通过存在的来自样品的预先结合的分析物结合Mab而抑制了标记的分析物。这意味着如果单克隆抗体已经结合了另作样品的未标记的分析物，那么标记的分析物无法由平板上的单克隆抗体结合。样品中未标记的分析物的量与标记的分析物产生的信号成反比。信号越弱，则样品中存在的未标记的分析物越多。可以使用连续稀释的未标记的分析物标准品构建标准曲线。然后在夹心式ELISA方式中进行时，读出样品值。
传统的竞争性抑制测定方式需要同时加入标记的(缀合的分析物)和未标记的分析物(来自样品)。标记的和未标记的分析物随后同时竞争平板上单克隆俘获抗体上的结合位点。类似于连续竞争性抑制方式，着色的信号与样品中未标记的靶分析物浓度成正比。
可以过氧化物酶底物，诸如TMB对标记的分析物进行检测，可以使用在微量滴定平板读出器上读取。例如，使用标准曲线(1个空白和7个标准品)和3个对照组，96-孔微量滴定板方式可以一式三份测试21份样品并且一式两份测试37份样品。
作为另一个实例，用于本说明书的抗体或抗体片段可以用于定量或定性检测存在的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷。例如，可以通过应用与光学显微镜、流式细胞计数或荧光检测偶联的荧光标记抗体(参见下文)的免疫荧光技术进行。
另外，如在免疫荧光或免疫电子显微术中，用于本说明书的抗体(或其片段)以组织学方式应用于原位检测黄尿酸-8-O-β-D-糖苷。可以通过从环状中取出组织样本并且将其施用于本说明书中的标记抗体来进行原位检测。优选通过将标记的抗体(或片段)涂布在生物样品上施用抗体(或片段)。通过使用这类操作步骤，不仅能够测定存在的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷，而且能够测定其在检验组织中的分布。使用本说明书披露的内容，本领域技术人员易于理解任意各种方法(诸如染色操作步骤)可以改变以便进行这类原位检测。
本领域技术人员能够通过使用常规实验测定用于每次测定的操作和最佳测定条件。
可检测地标记基因肽-特异性抗体的方式之一通过将其与酶连接并且在酶免疫测定(EIA)中使用它来进行(Voller，Ric Clin Lab，8：289-98(1978)[＂The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)＂，Diagnostic Horizons 2：1-7，1978，Microbiological AssociatesQuarterly Publication，Walkersville，Md.]；Voller等，J.Clin.Pathol.，31：507-20(1978)；Butler，Meth.EnzymoL，73：482-523(1981)；Maggio(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FIa.(1980)；Ishikawa等，(eds.)Enzyme Immunoassay，Igaku-Shoin，Tokyo(1981))。结合抗体的酶与合适的底物，优选显色底物以如可通过分光光度法、荧光法或视觉方式检测的化学部分的方式反应。可以用于检测标记抗体的酶包括，但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油、脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。可以通过使用酶的显色底物的比色法进行检测。还可以通过与类似制备的标准品比较的底物的酶促反应程度的视觉比较进行检测。
还可以使用任意各种其它免疫测定进行检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，能够通过使用放射性免疫测定(RIA)检测黄尿酸-8-O-β-D-糖苷{例如，参见Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on RadioligandAssay Techniques，The Endocrine Society，March，1986}。可以通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影术这类方式检测放射性同位素。
还能够用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体接触适当波长的光时，其存在可以因荧光而夺得检测。在最常用的荧光标记化合物中有异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
还可以使用荧光发射金属，诸如152Eu或镧系的其它元素可检测地标记抗体。可以使用诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺-四乙酸(EDTA)这类金属螯合基团结合这些金属。
还可以通过使抗体与化学发光化合物偶联可检测地标记抗体。然后通过检测化学反应过程中产生的发光的存在测定化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、异氨基苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
同样，生物发光化合物可以用于标记本说明书中的抗体。生物发光为生物系统中发现的化学发光，其中催化蛋白增加了化学发光反应的效率。通过检测存在的发光测定生物发光蛋白的存在。用于标记目的的重要室生物发光化合物为荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
在本申请的上下文中，将各种参考文献、专利和公开的专利申请称作鉴定的引证文献。将本申请中这些参考文献、专利和公开的专利说明书披露的内容引入本说明书作为参考，以便更完整地描述本说明书涉及的本领域的状态。
因黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的尺寸较小而可以使用酶放大免疫测定技术(EMIT)。各种EMIT方法可以用于定性和定量测定，例如通过Dias等所述的方法(参见Dias等，＂The EMIT Cyclosporine Assay：development of application protocols for the BoehringerMannheim Hitachi 911 and 917 analyzers＂Clin.Biochem.1997Mar；30(2)：155-62)。临床环境中EMIT的优点包括：(1)最少或无样品制备；(2)小的样品大小；(3)与其它方法，诸如HPLC和RIA极佳的相关性；(4)因无需分类游离和结合酶标记而快速的时间(少于1分钟)，易于适合于最一般的化学分析仪。
表面等离振子共振(SPR)也可以用于检测作为与固定化黄尿酸-8-O-β-D-糖苷特异性抗体的溶液相相互作用物的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷。McDonnell和Rich等的技术可以用于SPR法的发展(McDonnell，J.M.，＂Surface plasmon resonance：towards an understanding ofthe mechanisms of biological molecular recognition.CurrentOpinion in Chemical Biology，2001.5(5)：p.572-577；Rich，R.L.，等，＂High-resolution and high-throughput protocols formeasuring drug/human serum albumin interactions using BIACORE＂Analytical Biochemistry，2001.296(2)：p.197-207)。可以构建各种流通细胞并且与商购SPR生物传感器，诸如具有商标Biocore的仪器一起的置于线上。可以将特异性抗体固定在形成流动细胞的一侧壁的SPR-活性金包被的载玻片上；并且注射在含水缓冲液中的分析物黄尿酸-8-O-β-D-糖苷以便流过流动的细胞。当光(可见或近红外)通过载玻片照射和以接近所谓的＂表面等离振子共振＂条件的角度和波长照射在金表面时，金的光学反射率极为敏感地随金表面上或金上薄涂层中存在的生物分子而改变。易于通过监测这一反射率改变来观察和定量溶液相相互作用物与固定化抗体之间的结合程度。
高效液相色谱法(HPLC)可以用于检测尿中的黄尿酸-8-O-b-D-糖苷。例如，可以使用C18柱上的尿样固相提取和随后通过阳离子交换树脂柱。可以通过UV、荧光或光散射技术进行样品检测(例如，参见Marsilio等，Clinical Chemistry.1998；44：1685-1691)。还可以将毛细管电泳(CE)或毛细管电泳-质谱(CE-MS)与通过固相提取任选预处理的尿样用于对生物样品柱的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷进行定量(He等，J Chromatogr B Biomed Sci Appl.1999 Apr 30；727(1-2)：43-52；Theodoridis et al，J Chromatogr B Biomed Sci Appl.2000Aug4；745(1)：49-82.)。
现在参照下列非限制性实施例来描述本发明。
实施例
实施例1.黄尿酸8-O-β-D-糖苷的合成
Figure A200580048085D00331
黄尿酸                   黄尿酸8-O-β-D-糖苷
方案1.黄尿酸8-O-β-D-糖苷的合成
步骤1：黄尿酸2，3，4，6-四-O-乙酰基8-O-β-D-糖苷的合成(例如，参见Real等，J.Biol.Chem.，1990，265(13)，7407-7412)
黄尿酸通过商购获自Aldrich，Milwaukee，WI。将在1M NaOH(10mL)中的黄尿酸(930mg，4.53mmol)冷却至前10℃。在10分钟内滴加在丙酮(16mL)中的2，3，4，6-四-O-乙酰基8-α-D-吡喃糖基溴(2.03g，4.94mmol)。在4小时内将该溶液温至室温。在30分钟内在缓慢加入1M NaOH水溶液(3mL)并且将溶液搅拌30分钟。用水和乙醚萃取该混合物。将含水部分酸化至pH3.5并且进一步用1:1四氢呋喃/乙酸乙酯萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤合并的有机层并且用硫酸镁干燥。在过滤后，在真空中浓缩粗的黄尿酸四-O-乙酰基8-β-D-糖苷中间体而得到约1克的粗残余物。将该残余物与4：1二甲亚砜/水(28mL)一起研磨，过滤并且干燥至得到215mg黄尿酸四-O-乙酰基8-β-D-糖苷，为黄白色固体中间体。用高效液相色谱法(HPLC)进一步纯化母液以便再回收60mg中间体(C18，含有0.2％三氟乙酸的水/乙腈；分步稀释)，合并产率11.5％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ 1.97(s，3H)，1.99(s，3H)，2.00(s，3H)，2.06(s，3H)，4.05-4.30(m，3H)，5.07(d，J＝9.6Hz，1H)，5.23(dd，J＝9.6，7.8Hz，1H)，5.44(t，J＝9.60Hz，1H)，5.67(d，J＝7.8Hz，1H)，6.65(s，1H)，7.37(t，J＝8.1Hz，1H)，7.48(dd，J＝7.5，1.2Hz，1H)，7.81(dd，J＝8.1，1.2Hz，1H)，9.44(bs，1H).ESI-MS m/z 536.44(M+H+).
步骤2：黄尿酸8-O-β-D-糖苷
将来自步骤1的黄尿酸2，3，4，6-四-O-乙酰基8-O-β-D-糖苷(190mg，0.35mmol)加入到95％甲醇钠(40mg，0.7mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中。将该混合物搅拌1小时。用1M HCl水溶液将该混合物调整至pH3.5。用20mL乙醚稀释淤浆并且过滤。用1∶1甲醇/乙醚洗涤滤饼并且在真空中干燥而得到118mg黄尿酸8-O-β-D-糖苷，产率为82％。FTIR(净)，
3000-3700(br s)，3365，2934，1626，1602cm-1.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ 3.10-3.70(m，6H and H2O)，4.87(d，J＝7.5Hz，1H)，4.95(m，1H)，5.16(m，1H)，5.33(m，1H)，5.81(m，1H)，6.47(s，1H)，7.21(t，J＝8.0Hz，1H)，8.07(d，J＝7.2Hz，1H)，8.24(dd，J＝8.4，1.0Hz，1H)，8.47(s，<1H，部分交换)，10.47(br s，1H).13C-NMR(75.4MHz，DMSO-d6)δ 60.74，69.62，73.49，76.56，77.66，103.73，107.73，119.65，122.72，126.79，132.00，146.24，147，05，162.85，166.88，178.33.电喷射离子化质谱(ESI-MS)m/z 368.31(M+H+).
实施例2.黄尿酸8-O-硫酸盐的合成
Figure A200580048085D00341
黄尿酸                     黄尿酸8-O-硫酸盐
方案2：黄尿酸8-O-硫酸盐的合成
在室温下向黄尿酸(300mg，1.46mmol)在2.9mL 1 N NaOH和2.1mL dH2O(去离子水)中的溶液中加入sulfertrioxidetrimethylamine(407mg，2.92mmol)和5mL丙酮。在氮气环境中密封反应器(20 x 125mm试管)并且在70℃下搅拌16小时。将该反应体系冷却至室温并且在减压下浓缩至干。用丙酮，乙腈，二氯甲烷，乙酸乙酯且然后用乙醚连续洗涤残余物。在真空中放置收集的固体过夜。将该固体溶于3mL dH2O，上Sephadex SP-C25柱(4 x 11cm，40-125u)并且用dH2O洗脱而得到标题化合物的钠盐(474mg，1.44mmol)，产率为98.8％，为有光泽的棕色粉末，mp>250℃(分解)。
1H NMR(300MHz，D2O)δ6.67(br s，1H)，7.28(br dd，J＝8.1，7.8Hz，1H)，7.56(br d，J＝7.8Hz，1H)，7.79(br d，J＝8.1Hz，1H).13C NMR(75MHz，D2O)δ 108.5，122.1，124.9125.6，126.1，132.6140.7，144.7，166.3，181.0.IR(固体，cm-1)2835，2545，1687，1601，1372，1372，1254.
实施例3.黄尿酸8-O-硫酸盐和黄尿酸8-O-β-D-糖苷的分离
采集24小时期限内来自人尿毒症患者的尿样。典型的采集体积为每位患者2-3升。将各样品冻干并且用100mL去离子水再溶解。使用凝胶过滤SephadexG-25柱色谱法对再溶解的样品(25mL上样体积)进行大小级分分离，用pH6.8的10mM乙酸铵在10℃下洗脱，并且通过UV在285nm和电导下监测。洗脱后(盐峰值后)，筛选具有UV活性和重量克分子渗透浓度<100mOsm的10mL级分以便用于Bricker等的蛙皮测定的生物活性(Kidney International VoI 44(1993)Nov；44(5)：937-47)。通过冻干浓缩和用1mL去离子水再溶解具有活性(各10mL)的级分。
使用高效液相色谱法(HPLC；1mL上样体积)，用十八烷基甲硅烷基(Phenomenex SphereClone ODS2，35℃)半-制备型HPLC柱以4mL/分钟对具有生物活性的再溶解的Sephadex G-25级分进一步分级分离，其中使用0.1M乙酸吡啶鎓：甲醇梯度；0-40％甲醇/11分钟，采集2mL级分。通过荧光(激发332nm，在430nm发射)和UV(338nm)监测洗脱。从多次试验中采集到具有12.4分钟保留时间(RT)的级分并且浓缩约10-倍。将级分重新上上述HPLC系统，其中注射体积1mL，以与92％ 0.1M/8％甲醇以4mL/分钟等度模式运行。使用332nm激发，430nm发射监测荧光。在338nm监测UV。这些最大值用于黄尿酸8-O-β-D-糖苷。在12秒(0.8mL)级分中收集10-13分钟之间的洗脱液。11.2-11.6分钟RT之间洗脱的级分包含黄尿酸8-O-β-D-糖苷；12.0-12.5分钟之间洗脱的级分包含黄尿酸8-O-硫酸盐。分别收集包含黄尿酸8-O-β-D-糖苷或黄尿酸8-O-硫酸盐的级分并且通过介质加热用Savant Speed-Vac Plus(SC210A)浓缩。使用反相C-18HPLC柱：Phenomenex P/NO00G-4375-E0，SYNERGI 4u Hydro-RP 80A 250 x 4.6mm，4微米以分选等级将收集物再进行等度HPLC。在35℃下用等度模式以1mL/分钟与8％甲醇和0.1％ 0.1M乙酸吡啶鎓进行HPLC纯化。通过在338nm处的UV吸收和332nm激发，430nm发射的荧光检测监测洗脱。包含黄尿酸8-O-β-D-糖苷的级分具有的RT＝10.2-10.6分钟。来自单独黄尿酸8-O-硫酸盐试验的级分具有的RT＝11-11.5分钟。收集级分并且用Speed-Vac浓缩，其中临时添加吡啶以便增加pH。将纯化的黄尿酸8-O-β-D-糖苷再上相同的分析柱并且用20％在水中的甲醇洗脱以便消除乙酸吡啶鎓。在通过该技术浓缩时黄尿酸8-O-β-D-糖苷形成结晶。就分离的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(C16H17NO9)而言：ESI-MS(m/z)367.09，368.094(M+H)和229(M-葡萄糖+Na+)；
1H-NMR(500MHz，D2O)δ 3.58(dd，J＝9，9.5Hz，1H)，3.65(dd，J＝9，9.5Hz，1H)，3.67(m，1H)，3.80(dd，1H)，3.81(dd，J＝8，9.5Hz)，3.95(dd，1H)，5.24(d，J＝8Hz，1H)，6.93(s，1H)，7.47(t，J＝8Hz，1H)，7.59(dd，J＝8，2Hz，1H)，7.90(dd，J＝8，2Hz)ppm；13C-NMR(126MHz，D2O/CD3OD)δ 60.8，69.7，72.9，75.7，76.7，101.2，108.1，117.9，118.2，124.5，125.2，130.6，143.9，145.5，165.9，180.3ppm.
就分离的黄尿酸8-O-硫酸盐(C10H7NO7S)而言：ESI-MS(m/z)284.994，285.998(M+H+).
实施例4.在正常Sprague Dawley大鼠中对合成的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(2 ug i.v.)的尿钠排泄反应
使用PE10管放置用乙醚和尾静脉导管轻度麻醉的雌性SpragueDawley大鼠(250g)。另外，使用KY胶胨和2％利多卡因作为润滑剂插入尿道导管。将大鼠限制在改进的树脂玻璃管内，以便可以用1.5-mL微量离心管采集尿。在0时以0.02mL/分钟开始盐水输注，持续试验期限。将相同的i.v.导管用于注射测试化合物。在10分钟期限内在所示的时间注射在1-mL盐水体积中的合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷2ug。以14,000 rpm离心管以便从尿中分离任何RBCs。使用相应的离子选择电极测定尿中的Na+和K+浓度。通过(vol尿/采集时间期限)x(离子尿浓度)计算Na+和K+排泄率。结果如附图1-4中所示。2ugi.v.的合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷导致正常大鼠持续的尿钠排泄反应。更因Na+尿浓度比附图3和4中所示增加的尿体积增加而导致Na+排泄。由于在250-g大鼠中指定了胞外体积为50mL，所以测试化合物的浓度为10-6M，即可能的最小剂量。在一个类似的实验中，2ug i.v.合成的未衍生的黄尿酸不会增加Na+排泄。然而，随后给予合成的黄尿酸8-O-β-D-糖苷会导致尿钠排泄。
实施例5. 在正常Sprague Dawley大鼠中对合成的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(10ugi.v.)的尿钠排泄反应
使用PE10管放置用乙醚和尾静脉导管轻度麻醉的雌性SpragueDawley大鼠(250g)。另外，使用KY胶胨和2％利多卡因作为润滑剂插入尿道导管。将大鼠限制在改进的树脂玻璃管内，以便可以用1.5-mL微量离心管采集尿。在0时以0.02mL/分钟开始盐水输注，持续试验期限。将相同的i.v.导管用于注射测试化合物。在10分钟期限内在所示的时间注射在1-mL盐水体积中的合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷10ug。在所示的时间时，盐水输注增加10倍至0.2mL/分钟，持续10分钟并且返回到0.02mL/分钟，持续本试验的期限。以14,000rpm离心管以便从尿中分离任何RBCs。使用相应的离子选择电极测定尿中的Na+和K+浓度。通过(vol尿/采集时间期限)x(离子尿浓度)计算Na+和K+排泄率。结果如附图5-8中所示。10ug i.v.的合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷导致正常大鼠持续的尿钠排泄反应。K+排泄不会增加对黄尿酸8-O-β-D-糖苷的反应。附图6中的起始尿钠排泄反应(10-20分钟)是因附图8中所示的尿体积增加所致，而不因附图7中所示的尿Na+浓度所致。然而，截止到给药后60-90分钟，如附图7中所示，尿钠增多是因尿Na+浓度增加所致。
在给药后140分钟尿产生减少，导致尿钠排泄下降。然而，当盐水输注增加10倍至0.2mL/分钟，持续10分钟时，Na+排泄率从2uEq/分钟增加至10uEq/分钟，正如附图6中观察到的。这些数据与如下构思一致：黄尿酸8-O-β-D-糖苷抑制远端小管上Na+重吸收，但如果仅是水化作用，那么导致Na+排泄，并且GFR对达到远端小管的足够流体而言是充分的。
实施例6.在正常Sprague Dawley大鼠中对合成的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(10ug)，随后是呋塞米(100ug)(口服给药)的尿钠排泄反应
使乙醚轻度麻醉的雌性Sprague Dawley大鼠(250g)并且使用KY胶胨和2％利多卡因作为润滑剂插入尿道导管。将大鼠限制在改进的树脂玻璃管内，以便可以用1.5-mL微量离心管采集尿。不给予盐水输注。在1分钟期限内在所示的时间用加料针头注射在1-mL体积水中的合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷。6分钟后使用加料针头类似地给予100ug呋塞米。以14,000rpm离心管以便从尿中分离任何RBCs。使用相应的离子选择电极测定尿中的Na+和K+浓度。通过(vol尿/采集时间期限)x(离子尿浓度)计算Na+和K+排泄率。结果如附图9-12中所示。合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷(10ug)因在正常大鼠中产生尿钠排泄反应而具有口服活性。口服给药后6分钟，呋塞米(100ug)导致如附图9-11中观察到的持续Na+排泄。用黄尿酸8-O-β-D-糖苷预治疗，随后用呋塞米治疗能够使Na+排泄增加，但无法增加附图10中的K+排泄。单独口服呋塞米导致Na+和K+均排泄(数据未显示)。用黄尿酸8-O-β-D-糖苷预治疗抑制了呋塞米-诱导的K+排泄。
实施例7.在正常Sprague Dawley大鼠中对分离的黄尿酸8-O-β-D-糖苷(3ug)，随后是呋塞米(20ug)(i.v.)的尿钠排泄反应
通过结扎一个肾和30-50％的第二个肾使225g重的雌性Sprague-Dawley大鼠发生尿毒症。2周后，准备对大鼠测试尿钠排泄活性。使用PE10管放置用乙醚和尾静脉导管轻度麻醉的大鼠。另外，使用KY胶胨和2％利多卡因作为润滑剂插入尿道导管。将大鼠限制在改进的树脂玻璃管内，以便可以用1.5-mL微量离心管采集尿。在0时以0.02mL/分钟开始盐水输注，持续试验期限。将相同的i.v.导管用于在10分钟期限内在所示的时间注射在1-mL盐水体积中的分离的黄尿酸8-O-β-D-糖苷。2小时后，以相同方式注射20ug呋塞米。以14,000 rpm离心管以便从尿中分离任何RBCs。使用相应的离子选择电极测定尿中的Na+和K+浓度。通过(vol尿/采集时间期限)x(离子尿浓度)计算Na+和K+排泄率。
结果如附图13-16中所示。3ug i.v.分离的黄尿酸8-O-β-D-糖苷在尿毒症大鼠中产生持续的尿钠排泄反应。Na+排泄时程在如附图13中所示尿毒症大鼠中在70分钟时达到峰值，这与附图1中所示的合成黄尿酸8-O-β-D-糖苷在正常大鼠中的时程类似。附图14和15中的K+排泄不会增加作为对分离的黄尿酸8-O-β-糖苷的反应。对呋塞米的利尿反应在其时程与Na+排泄方面是典型的。一般而言，呋塞米还使K+排泄达K+补充为呋塞米临床应用中必不可少的程度。在正常大鼠中的类似作用例示在附图25(仅呋塞米)中。在附图14和15中所示的本试验中，用黄尿酸8-O-β-D-糖苷预治疗，随后用呋塞米治疗防止了典型的K+排泄增加。
实施例8.在尿毒症Sprague Dawley大鼠中对分离的黄尿酸8-O-硫酸盐(2.0ug)(i.v.给药)的Na+和K+尿排泄反应
通过结扎一个肾和30-50％的第二个肾使225g重的雌性Sprague-Dawley大鼠发生尿毒症。2周后，准备对大鼠测试尿钠排泄活性。使用PE10管放置用乙醚和尾静脉导管轻度麻醉的大鼠。另外，使用KY胶胨和2％利多卡因作为润滑剂插入尿道导管。将大鼠限制在改进的树脂玻璃管内，以便可以用1.5-mL微量离心管采集尿。在0时以0.02mL/分钟开始盐水输注，持续试验期限。将相同的i.v.导管用于注射测试化合物。在10分钟期限内在所示的时间注射在1-mL盐水体积中的分离的黄尿酸8-O-硫酸盐2ug。然后使盐水是输注返回到0.02mL/分钟，持续本试验期限。以14,000 rpm离心管以便从尿中分离任何RBCs。使用相应的离子选择电极测定Na+和K+排泄率。通过(vol尿/采集时间期限)x(离子尿浓度)计算Na+和K+排泄率。
结果如附图17-20中所示。分离的黄尿酸8-O-硫酸盐(2ug，i.v.)在尿毒症大鼠中产生持续的尿钠排泄反应。尿钠排泄的时程在30分钟内达到峰值且然后在治疗的70分钟内接近控制水平，正如附图17和18中观察到的。K+排泄不会增加对分离的黄尿酸8-O-硫酸盐的反应，正如附图18和19中所示。
实施例9.在正常Sprague Dawley大鼠中对分离的黄尿酸8-O-硫酸盐(20ug)(口服给药)的Na+和K+尿排泄反应
使用乙醚轻度麻醉雌性Sprague Dawley大鼠(250g)并且使用KY胶胨和2％利多卡因作为润滑剂插入尿道导管。将大鼠限制在改进的树脂玻璃管内，以便可以用1.5-mL微量离心管采集尿。不给予盐水输注。在1分钟期限内在所示的时间用加料针头注射在1-mL体积水中的合成黄尿酸8-O-硫酸盐。以14,000 rpm离心管以便从尿中分离任何RBCs。使用相应的离子选择电极测定尿中的Na+和K+浓度。通过(vol尿/采集时间期限)x(离子尿浓度)计算Na+和K+排泄率。结果如附图21-24中所示。黄尿酸8-O-硫酸盐(20ug)在导致正常大鼠尿钠排泄反应方面不具有口服活性。特别地，在附图21中Na+尿浓度保持低于50mM，而在i.v.给予的黄尿酸8-O-硫酸盐中，Na+尿浓度在附图19中从60mM增加至160mM。此外，黄尿酸8-O-β-D-糖苷在正常大鼠中因附图11中的将Na+尿浓度增加至160mM而具有口服活性。
实施例10.对黄尿酸8-O-β-D-糖苷和黄尿酸8-硫酸盐的多克隆抗体产生方案
下列方案描述了在研发用于检测和测定尿和血浆中黄尿酸8-O-β-D-糖苷的ELISA测定法过程中产生对黄尿酸8-O-β-D-糖苷的多克隆抗体。黄尿酸8-O-β-D-糖苷与大蛋白质KLH共价连接而在家兔中引起免疫反应。此外，SBA用作黄尿酸8-O-β-D-糖苷与KLH之间的间隔臂
Figure A200580048085D00411
间隔臂能够在免疫反应中更好地呈递黄尿酸8-O-β-D-糖苷。在抗体反应筛选过程中，黄尿酸8-O-β-D-糖苷类似地与随后包被在ELISA孔上的BSA连接。然后通过孵育具有与黄尿酸8-O-β-D-糖苷缀合的BSA的家兔血清筛选家兔血清的黄尿酸8-O-β-D-糖苷抗体。通过结合与指示器酶辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊-抗-家兔抗体检测这些家兔抗体。将底物四甲基联苯胺(TMB)与HRP一起孵育并且在400nm处测定产物。
一旦测定了对黄尿酸8-O-β-D-糖苷的抗-血清滴度，就通过竞争性ELISA，使用特异性多克隆抗体测试尿样中存在的黄尿酸8-O-β-D-糖苷。通过ELISA验证黄尿酸8-O-β-D-糖苷通过最新的HPLC方法与荧光检测来进行。这种HPLC方法起出在分离人尿中黄尿酸8-O-β-D-糖苷中研发。还可以检验尿样中的黄尿酸8-O-β-D-糖苷的UV光谱。通过最新HPLC方法，尿中黄尿酸8-O-β-D-糖苷的检测限2.7uM，其中无固相提取(SPE)。预计SPE将HPLC检测限降至nM。
通过ELISA和SPE/HPLC技术建立黄尿酸8-O-β-D-糖苷和黄尿酸8-硫酸盐的临床血浆和尿水平。

Claims (37)

1.药物组合物，包含：
治疗有效量的式I的化合物或其前体药物或药学上可接受的盐：
Figure A200580048085C00021
其中R1、R2、R3、R5、R6和R7独立为X3R，其中R选自H、卤素；任选取代的糖、脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；-P(O)(ORa)(ORb)和-NRaRb，其中Ra和Rb独立为H、任选取代的脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；
X1、X2和X3独立为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-OS(O)y-、-S(O)y-、-O-、-NHC(O)-、-NHC(O)O-、-S(O)2NH-、键或不存在；其中y为0-3的整数；且
R4和R8独立为H、(＝O)；羟基；或任选取代的糖、脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；或-P(O)(ORa)(ORb)或-NRaRb，其中Ra和Rb独立为H或任选取代的脂族化合物、环烷基或杂环烷基、芳基或杂芳基；
和药学上可接受的载体。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中R1、R3、R5、R6和R7独立为H或卤素。
3.权利要求2所述的药物组合物，其中X1不存在或为键并且R4为羟基或(＝O)。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中R2为-C(O)OR。
5.权利要求4所述的药物组合物，其中R2为-C(O)OH。
6.权利要求1所述的药物组合物，其中R8为任选取代的糖。
7.权利要求6所述的药物组合物，其中X2为-O-并且R8为任选取代的单糖。
8.权利要求7所述的药物组合物，其中R8为己醛吡喃糖、戊醛吡喃糖、戊醛呋喃糖或酮糖。
9.权利要求8所述的药物组合物，其中R8为糖苷。
10.权利要求1所述的药物组合物，其中式I的化合物为黄尿酸8-O-β-D-糖苷。
11.权利要求1所述的药物组合物，其中式X3为-OS(O)y。
12.权利要求1所述的药物组合物，其中式I的化合物为黄尿酸8-O-硫酸盐。
13.药物组合物，包含：
(1)治疗有效量的式I的化合物或其前体药物或药学上可接受的盐：
Figure A200580048085C00031
        (I)
其中R1、R2、R3、R5、R6和R7独立为X3R其中R选自H、卤素；任选取代的糖、脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；-P(O)(ORa)(ORb)和-NRaRb，其中Ra和Rb独立为H、任选取代的脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；
X1、X2和X3独立为-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-OS(O)y-、-S(O)y-、-O-、-NHC(O)-、-NHC(O)O-、-S(O)2NH-、键或不存在；其中y为0-3的整数；且
R4和R8独立为H、(＝O)；羟基；或任选取代的糖、脂族化合物、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；或-P(O)(ORa)(ORb)或-NRaRb，其中Ra和Rb独立为H或任选取代的脂族化合物、环烷基或杂环烷基、芳基或杂芳基；
(2)一种或多种额外的利尿化合物或心血管化合物；和
药学上可接受的载体。
14.权利要求13所述的药物组合物，其中额外的利尿化合物选自髓袢利尿剂、噻嗪类利尿剂、保钾利尿剂、碳酸酐酶抑制剂和渗透压性利尿剂。
15.权利要求14所述的药物组合物，其中额外的利尿化合物选自呋塞米、布美他尼、托塞米、地尼酸、氯噻嗪、氢氯噻嗪、螺内酯、阿米洛利、氨苯喋啶、乙酰唑胺、醋甲唑胺、二氯磺胺、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、吲达帕胺、美托拉宗、泊利噻嗪、氯噻酮、多佐胺、布林唑胺、甘油、甘露糖和脲。
16.权利要求14所述的药物组合物，其中额外的利尿化合物为呋塞米。
17.权利要求13所述的药物组合物，其中额外的心血管药选自血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂和β-肾上腺素能阻滞剂。
18.权利要求17所述的药物组合物，其中额外的心血管药为赖诺普利、莫昔普利、依那普利、厄贝沙坦、缬沙坦、氯沙坦、纳多洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、吗洛尔或比索洛尔。
19.治疗、控制或预防哺乳动物高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼内压上升、肾病综合征或涉及流体/钠平衡失调的其它疾病状态的方法，包含给予药物有效量的权利要求1的药物组合物。
20.治疗、控制或预防哺乳动物高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼内压上升、肾病综合征或涉及流体/钠平衡失调的其它疾病状态的方法，包含给予药物有效量的权利要求13的药物组合物。
21.对需要的患者进行利尿的方法，包含给予药物有效量的权利要求1的药物组合物。
22.权利要求21所述的方法，其中所述的患者具有下列疾病中的一种或多种：高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼内压上升或肾病综合征。
23.对需要的患者进行利尿的方法，包含给予药物有效量的权利要求13的药物组合物。
24.权利要求23所述的方法，其中所述的患者具有下列疾病中的一种或多种：高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼内压上升或肾病综合征。
25.特异性结合黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的分离抗体。
26.权利要求25所述的抗体，为单克隆抗体。
27.权利要求25所述的抗体，为多克隆抗体。
28.用于测定血清样品中黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的诊断试剂盒，包含一种或多种针对黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的单克隆抗体。
29.测定人血清样品中存在的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的方法，包含：
a.获得人血清样品；
b.使人血清样品接触一种或多种特异性识别黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的抗体，所述的一种或多种抗体存以预定量存在，使得一种或多种抗体的部分保持不与存在于样品中的人黄尿酸-8-O-β-D-糖苷复合；和
c.测定未复合的一种或多种抗体的量，以便测定人血清样品中的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷。
30.用于监测或检测与黄尿酸-8-O-β-D-糖苷异常水平相关的疾病的方法，该方法包含：
a.使生物样品接触针对黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的抗体；和
b.用单克隆抗体检测所述生物样品中的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷水平，其中黄尿酸-8-O-β-D-糖苷在所述生物样品中的水平升高与疾病相关。
31.权利要求30所述的方法，其中所述的疾病选自高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼内压上升、肾病综合征或涉及流体/钠平衡失调的其它疾病状态。
32.权利要求30所述的方法，其中所述的生物样品为尿样。
33.权利要求30所述的方法，其中所述的生物样品为血清样品。
34.用于对生物样品中黄尿酸-8-O-β-D-糖苷进行色谱定量的方法，该方法包含：
a.获得生物样品；
b.将已知体积的生物样品注入HPLC单元柱；和
c.测定生物样品中与黄尿酸-8-O-β-D-糖苷标准品相比黄尿酸-8-O-β-D-糖苷的量。
35.治疗与黄尿酸-8-O-β-D-糖苷异常水平相关的疾病的方法，该方法包含：
基于人生物样品中黄尿酸-8-O-β-D-糖苷检测水平给予药物有效量的权利要求1所述的组合物。
36.权利要求35所述的方法，其中所述的疾病选自高血压、水肿、急性肾衰竭、充血性心力衰竭、慢性肾衰竭、腹水、眼内压上升、肾病综合征或涉及流体/钠平衡失调的其它疾病状态。
37.治疗与钠重吸收减少相关的疾病或病症的方法，该方法包含给予治疗有效量的黄尿酸-8-O-β-D-糖苷拮抗剂。
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