CN101466360A - 用于细胞移植的多膜免疫隔离系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种免疫隔离封装系统，其保护细胞移植物并因此在不需要免疫抑制的情况下使细胞发挥机能和存活。该免疫隔离系统是多组分、多膜胶囊，对于在大型动物模型中的可重复的机能其可以使多个设计参数独立地优化。

Description

用于细胞移植的多膜免疫隔离系统
技术领域
本发明涉及用于细胞移植的多膜免疫隔离系统，其可以用于大型动物和人类而没有免疫抑制作用。
联邦基金说明
本发明部分是根据NASA合同NAG 5-12429而使用来自联邦政府的资金而制成的。因此，联邦政府对于本发明具有一定的权利。
背景技术
世界卫生组织估测，截止到2000年，在世界范围内超过1.76亿人患有糖尿病。预测该数字到2030年会增加超过一倍。在胰岛素依赖型或者1型糖尿病的患者中，自身免疫反应破坏胰岛的胰岛素分泌β细胞。注射人胰岛素，尽管有一定的效果，但是不能精确地恢复正常的葡萄糖平衡，这会导致严重的并发症，如糖尿病肾病、视网膜病、神经病和心血管疾病。
近来，细胞移植已经致力于治疗多种特征为激素或者蛋白质缺失的人类疾病，如糖尿病、帕金森病、亨廷顿病以及其它疾病。但是，多种技术和运筹(logistical)难题已经阻止了细胞移植有效地发挥作用。尤其是，移植的细胞必须被保护起来以免受移植接受者的免疫攻击。这通常需要具有相当大毒性的有效免疫抑制剂，这种免疫抑制剂会使患者遭受多种严重的副作用。
一种可替代的方法是将移植的细胞封入半透膜中。理论上，半透膜被设计用于保护细胞免受免疫攻击，同时允许对细胞机能/生存非常重要的分子流入以及所需细胞产物的流出。这种免疫隔离方法具有两个主要的潜能：i)不需要免疫抑制药物和与之伴随的副作用的细胞移植，以及ii)使用来自各种来源的细胞，如自体移植物(源自主体(或宿主，接受移植的动物)干细胞)、同种异体移植物(源自原代细胞或者干细胞)、异种移植物(猪的细胞或者其他)，或者基因工程化的细胞。虽然这种技术在治疗小型哺乳动物(如啮齿动物)中是有效的，但是发现当用于治疗较大型的哺乳动物时该技术没有效果。
在大型动物模型中已经测试了一些免疫隔离系统，但是其中很多实验是在自发性糖尿病对象中实施或者使用了免疫抑制剂。参见Sun等，“Normalization of diabetes in spontaneously diabetic cynomolgus monkeysby xenografts of microencapsulated porcine islets withoutimmunosuppressant，”J.Clin.Invest.98：1417-22(1996)；Lanza等，“Transplantation of islets using microencapsulation：studies in diabetic rodentsand dogs，”J.Mol.Med.77(1)：206-10(1999)；Calafiore R.，“Transplantationof minimal volume microcapsules in diabetic high mammalians，”Ann NY Acad.Sci.875：219-32(1999)；Hering等，“Long term(>100 days)diabetes reversalin immunosuppressed nonhuman primate recipients of porcine isletxenographs，”American J.Transplantation，4：160-61(2004)；和Soon-Shiong等.，“Insulin independence in a Type 1 diabetic patient after encapsulated islettransplantation，”Lancet 343：950-951(1994)。另外，其中许多实验不能以合适的科学标准进行重复。这些实验缺乏实验对照和一致性使得科学解释复杂化并且限制了它们的实用性。
显然，还没有实现活细胞(living cell)的免疫保护从而治疗激素缺失疾病的承诺。因此，本领域所需要的是可重复的并且有效的细胞治疗方法，其可用于大型哺乳动物而无需使用免疫抑制药物。本发明满足了这种需求。
发明内容
本发明涉及一种用于封装生物材料的多膜组合物，其包括(a)内膜，其与生物材料生物相容并具有足够的机械强度以保持膜中的生物材料并且提供免疫保护来抵抗主体(或宿主)免疫系统中的抗体；(b)中膜，具有足够的化学稳定性以增强内膜来抵抗主体(或宿主)中的化学物质；(c)外膜，其与主体(或宿主)生物相容并且具有足够的机械强度以保护内膜和中膜抵抗主体(或宿主)免疫系统的非特异性免疫反应系统。中膜还将内膜和外膜结合起来。
本发明还涉及一种能够封装生物材料的多膜组合物，其包括(a)包含海藻酸钠、硫酸纤维素、聚(亚甲基-共-胍)(聚(亚甲基二胍)，poly(methylene-co-guanidine))和氯化钙的膜；(b)包含聚阳离子的膜；和(c)包含具有羧酸根基团或者硫酸根基团的碳水化合物聚合物的膜。聚阳离子为聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚乙烯亚胺(polyethylenimine)、聚烯丙胺(polyallyamine)、聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L，D-鸟氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀酰化聚-L-赖氨酸(succinylated poly-L-lysine)、琥珀酰化聚-D-赖氨酸、琥珀酰化聚-L，D-赖氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)或者它们的组合。
本发明还涉及一种治疗患有糖尿病或者相关病症对象的方法，包括将足够量的含有产生胰岛素的胰岛细胞的组合物给予对象，其中该组合物是多膜胶囊，其包括(a)内膜，其与生物材料生物相容并具有足够的机械强度以保持膜中的生物材料并且提供免疫保护来抵抗主体免疫系统中的抗体；(b)中膜，具有足够的化学稳定性以增强内膜来抵抗主体中的化学物质；(c)外膜，其与主体生物相容并且具有足够的机械强度以保护内膜和中膜抵抗主体免疫系统的非特异性免疫应答系统。
本发明还涉及一种治疗患有糖尿病或者相关病症对象的方法，其包括将足够量的含有分泌胰岛素的胰岛细胞的组合物给予对象，其中该组合物是多膜胶囊，其包括(a)包含海藻酸钠、硫酸纤维素、聚(亚甲基-共-胍)和氯化钙的膜；(b)包含聚阳离子的膜；和(c)包含具有羧酸根或者硫酸基基团的碳水化合物聚合物的膜。聚阳离子为聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L，D-鸟氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀酰化聚-L-赖氨酸、琥珀酰化聚-D-赖氨酸、琥珀酰化聚-L，D-赖氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)或者它们的组合。
本发明还涉及一种以不伴随免疫抑制反应的细胞疗法来治疗患有糖尿病或者相关病症的大型哺乳动物对象的方法。该方法包括将含有提供胰岛素持续释放至少30天的产生胰岛素的胰岛细胞的组合物的细胞疗法给予对象。该组合物在持续释放期间不会表现出显著的降解。
本发明还涉及一种含有生物材料的胶囊，当其被引入到具有机能化(functioning)免疫系统的大型哺乳动物时，分泌生物活性剂至少30天而不会产生由于免疫系统的免疫攻击造成的显著降解。
本发明还涉及一种使得患者的葡萄糖水平稳定至少30天的方法，其包括将含有胰岛素分泌胰岛细胞的组合物的细胞疗法给予患有糖尿病或者相关病症的患者。该细胞疗法不与涉及免疫抑制的其他治疗方法一起给予。
附图说明
图1：单膜胶囊的生物相容性。两个以相同的配方和生产步骤制备的单膜胶囊在被移植到正常小鼠(左)和正常杂种狗(右)的腹膜内30天后进行拍照。
图2：在大型动物中多膜胶囊的生物相容性。示出了在用松散地附着于网膜的胶囊治疗超过6个月后的正常狗的网膜。
图3：胶囊膜的渗透性。该图说明了作为胶囊膜的孔径分布函数的归一化保留时间。
图4：胶囊机械稳定性。该图通过断裂负载(rupture load)随胶囊膜厚度和尺寸变化的绘图说明两种不同聚合物浓度的胶囊的机械强度。
图5：胶囊稳定性。该图说明了具有不同化学成分和膜厚度的两种胶囊作为时间函数的机械强度。
图6：封装的胰岛的周流(或表面灌流，perifusion)。在细胞周流系统(cell perifusion system)中评价释放胰岛素的胰岛的分泌水平。独立地评价游离的胰岛(未封装的)、封装在单膜系统的胰岛(封装的胰岛)，和封装在多膜系统的胰岛(分层封装)。
图7：由回收的封装胰岛的胰岛素分泌。在细胞周流系统中检测在狗中移植100天后回收的封装在多层膜胶囊中的胰岛。
图8：犬的同种异体移植的血糖分析。该图形是进行了全胰切除术的犬模型的实施例。顶部图像(panel)示出了进食后12-18小时收集的静脉血糖浓度。下面的图像示出了皮下给予猪胰岛素的每日剂量。
图9：犬的同种异体移植的体重分析。顶部和底部的图像引自图8。中间的图像示出了在试验过程中监测到的动物体重。
图10：犬的同种异体移植的果糖胺分析。顶部和底部的图像引自图8。中间的图像示出了果糖胺的测量值，糖尿病对象的2-3周的平均血糖水平的指标。
图11：封装的胰岛在犬中的再移植。该图说明了封装在多膜系统中的胰岛在犬中的最初同种异体移植和再移植。
图12：静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)。该图评价了(evaluate)之前接受了封装在多膜系统中的胰岛移植的犬中的静脉内葡萄糖(300mg/kg)给药。
具体实施方式
开发出了可使得生物材料在细胞疗法中有效并持续封装的免疫隔离系统。最好是通过细胞产物(激素、蛋白质、神经递质等)治疗的任何疾病都是免疫隔离细胞移植的候选对象。用于免疫隔离的潜在细胞类型包括胰岛、肝细胞、神经细胞、甲状旁腺细胞和分泌凝固因子的细胞。当在细胞治疗系统中使用封装的胰岛时，该系统对患有糖尿病的患者提供替代的生物人工胰脏和机能性治疗。
本发明涉及一种封装生物材料的多膜组合物，包括(a)内膜，其与生物材料生物相容并具有足够的机械强度以保持膜中的生物材料并且提供免疫保护来抵抗主体(或宿主)免疫系统中的抗体；(b)中膜，具有足够的化学稳定性以增强内膜来抵抗主体中的化学物质；(c)外膜，其与主体(或宿主)生物相容并且具有足够的机械强度以保护内膜和中膜抵抗主体(或宿主)免疫系统的非特异性免疫反应系统。中膜还将内膜和外膜结合起来。
多膜组合物是一种含有至少三个膜的组合物。该组合物优选是胶囊或者是具有封装生物材料能力的组合物。当然，其它系统也是行得通的。
内膜应该与生物材料是生物相容的。也就是，生物材料不能以与可能会杀死或者别的会损害所述生物材料的生物材料相互作用的方式。内膜还应该具有足够的机械强度以保持膜内的生物材料并且提供免疫保护以抵抗主体免疫系统的抗体。
中膜具有足够的化学稳定性以增强内膜来抵抗主体中的化学物质。由中膜提供的化学稳定性还同时帮助内膜和外膜抵挡主体中化学物质的影响。主体中的常见化学物质包括钠、钙、镁和钾离子，以及血流中的其他化学物质。中膜是耐受这些化学物质的化学稳定的，这使它延迟了膜的退化。这延长了膜的寿命并由此延长了被内膜包裹的生物材料的寿命。中膜还将内膜和外膜结合起来，优选通过亲和结合。以将膜结合起来的方式产生交联作用，其形成了更紧密和更有粘合力的多膜组合物，并且消除或者降低了膜分离的可能性。
外膜应该是与主体生物相容的。因为外膜是多膜组合物中接触主体的部分，它应该是充分生物相容的从而主体不会将组合物当作异物(foreignobject)并且排斥或者试图破坏它。在本文中使用的术语“生物相容的”表示植入的组合物和其内容物(context)的消除主体的各种保护系统，如免疫系统或者异质物体纤维化反应的有害作用并且在有意义的时间段保持功能的能力。另外，“生物相容的”还表示该组合物和其内容物不造成特有的不期望的细胞毒或者全身作用，如干扰所需的免疫隔离功能性。
外膜还应该具有足够的机械强度以保护内膜抵抗主体的非特异性先天性免疫系统。先天性免疫系统，其包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和其它，当被激活时，可通过吞噬来攻击多膜组合物或者胶囊。它还可以刺激抗体的活性从而攻击组合物内部的胰岛。
独立的膜中的这些特性的组合使组合物以单个膜所不能提供的方式联合作用。特别是，每个膜以使得多膜组合物达到大型动物移植的二分法目标(dichotomy goal)的方式实现至少一种机能。每个膜被设计为满足最佳的物质转运同时还保持胰岛的健康和机能性。
例如，为了提高物质转运提高膜的孔径会危害到胶囊的稳定性。同样地，为了提高胶囊的稳定性提高聚合物的浓度会降低物质的转运。这些二分性(dichotomy)会导致在胶囊设计和性能上的折衷。在优选系统中，不需要单个膜去折衷它的设计从而实现多方面(multi-faceted)的二分法目标。每一个膜被设计为只实现一项或者两项特定的任务。总的来说，多膜实现了在大型动物模型中细胞移植体的二分法目标中的大多数或者全部而不需要免疫抑制。
内膜的膜厚度优选在约5微米到约100微米的范围。更加优选地，膜厚度在约10微米到约60微米的范围，并且最优选地，厚度在约20微米到约40微米的范围。一般，膜越厚提供的机械强度越大。但是，当膜变得过厚，物质转运能力开始下降。
中膜通常具有小于约5微米的厚度，优选约1-3微米。外膜通常具有范围在约5微米到约500微米的厚度，优选在约100微米到约300微米的范围；但是，范围在约10微米到约30微米的外膜厚度也是合适的。
多膜组合物具有孔隙度，其足够大足以使得从生物材料中释放出生物活性剂但要足够小足以阻止来自免疫系统的抗体的进入。应该防止已知破坏或细胞的抗体进入(可能的话)多膜组合物。例如，抗体IgM，其具有约300千道尔顿(KDa)的分子量，当暴露于含有胰岛的胶囊时会是特别致死的。考虑到已知的抗体，多膜组合物的孔隙度下限(即，大于下限尺寸的孔的数量显著性地降低)应该小于300千道尔顿。另外，因为膜通常被制成随机网络系统，孔隙度下限优选低于250千道尔顿。这更好地保证了设计的膜具有非常少甚至没有大于300千道尔顿的孔。
在另一个方面，孔隙度下限应该大于约50千道尔顿以确保生物材料具有自由地从多膜组合物中释放的能力。孔隙度下限优选在约50千道尔顿到约250千道尔顿的范围以允许具有分子量低于约50千道尔顿的分子通过同时防止具有分子量高于约250千道尔顿的分子通过。更优选地，孔隙度下限在约80千道尔顿到约150千道尔顿的范围。
在本发明的一个实施方式中，每一个膜具有不同的孔隙度，内膜具有范围在约50千道尔顿到约150千道尔顿的孔隙度下限，中膜具有范围在约100千道尔顿到约200千道尔顿的孔隙度下限；外膜具有范围在约150千道尔顿到约250千道尔顿的孔隙度下限。在其它方面中，具有多样化的孔隙度的膜有助于物质转运和免疫保护。
生物材料可以是任何能够被膜封装的材料。通常，生物材料是当被引入到对象中时能够为对象提供一些治疗效果的细胞或者细胞群(group)。优选地，该生物材料选自由胰岛、肝细胞、脉络丛、神经细胞、甲状旁腺细胞，和分泌凝固因子的细胞组成的组。最优选地，生物材料是胰岛或者其它能够治疗患有糖尿病患者产生胰岛素的岛(islet)。
生物活性剂是可以从生物材料中释放或者分泌的任何药剂。例如，胰岛具有分泌生物活性剂胰岛素的能力；脉络丛具有分泌脑脊液(cerebralfluids)的能力；神经细胞具有分泌如多巴胺的可以影响神经系统的药剂的能力；甲状旁腺细胞具有分泌可以影响对象的钙和磷代谢的生物活性剂的能力。优选地，生物活性剂是胰岛素。
主体可以包括任何需要或者其他能够接受封装的多膜组合物的对象。虽然主体可以包括小型哺乳动物，如啮齿动物，但多膜组合物特别适合于大型哺乳动物。优选地，该主体是人。
虽然多膜组合物应该含有内膜、中膜和外膜，它可能含有一个或多个附加膜。附加的膜可能是需要的从而为由三膜系统提供的那些特征提供更好的或更多的特征。例如，附加膜可以，独立地或者共同地为多膜组合物提供额外的免疫保护、机械强度、化学稳定性和/或生物相容性。
本发明还涉及能够封装生物材料的多膜组合物，其包括(a)含有海藻酸钠、硫酸纤维素、多组分聚阳离子的膜；(b)含有聚阳离子的膜；和(c)包含具有羧酸根基团或者硫酸根基团的碳水化合物聚合物的膜。
一个膜应该含有海藻酸钠、硫酸纤维素和多组分聚阳离子。该聚阳离子优选含有聚(亚甲基-共-胍)与氯化钙、氯化钠或者它们的组合中的任意一个的组合。该膜可以是美国专利第5,997,900号所披露的封装系统，将其全部内容结合于此作为参考。
第二层膜应该含有聚阳离子。优选地，该聚阳离子选自由聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L，D-鸟氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀酰化聚-L-赖氨酸、琥珀酰化聚-D-赖氨酸、琥珀酰化聚-L，D-赖氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)或者它们的组合组成的组。更优选地，该聚阳离子选自由聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)，和它们的组合组成的组。最优选地，该聚阳离子为聚-L-赖氨酸。
第二层膜还优选含有至少一种选自由海藻酸钠、硫酸纤维素和聚(亚甲基-共-胍)组成的组中的化合物。更优选地，第二层膜含有聚阳离子和所有三种化合物。最优选地，第二层膜含有聚-L-赖氨酸、海藻酸钠、硫酸纤维素和聚(亚甲基-共-胍)。
第三层膜含有具有羧酸根或者硫酸根基团的碳水化合物聚合物。该碳水化合物聚合物优选地选自由羧甲基纤维素钠、低甲氧基果胶、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、黄芪胶、果胶酸钠、κ-角叉菜胶和ι-角叉菜胶组成的组。更优选地，该碳水化合物聚合物选自由海藻酸钠、海藻酸钾和海藻酸钙组成的组。最优选地，该碳水化合物聚合物是海藻酸钠。
第三层膜还优选地含有无机金属盐。合适的金属盐包括氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钙、硝酸钙、氯化铵、氯化钠、氯化钾、氯化胆碱、氯化锶、葡萄糖酸钙、硫酸钙、硫酸钾、氯化钡、氯化镁和它们的组合。优选地，该无机金属盐选自由氯化钙、氯化铵、氯化钠、氯化钾、硫酸钙和它们的组合组成的组。最优选地，该无机金属盐是氯化钙。
在多膜组合物中，第一层膜优选为内膜，第二层膜优选为内膜或者中膜，和第三层膜优选为外膜。多膜组合物还可以含有一个或者多个附加膜。
优选地，多膜组合物是五组分/三层膜的胶囊系统。这五个组分为海藻酸钠(SA)、硫酸纤维素(CS)、聚(亚甲基-共-胍)(PMCG)、氯化钙(CaCl2)和聚-L-赖氨酸(PLL)。内膜是在小型动物模型中成功实验过的相同的PMCG-CS/CaCl2-海藻酸盐膜。该膜被设计为提供一种免疫隔离和物质转运之间的合适的平衡。中膜优选为增强内膜的薄的交织PMCG-CS/PLL-海藻酸盐膜。强离子键，例如存在于PMCG-CS/PLL-藻酸盐系统中的那些，可有助于提供化学稳定性。另外，拥有具有相对大的孔径的薄膜可有助于使该膜不扰乱内膜的免疫隔离和物质转运之间的平衡。中膜还通过逐步提高中膜的PLL浓度以表观上地将内膜和外膜结合起来，从而提供内膜和外膜的阻抗匹配(impedance match)。CaCl2/海藻酸盐外膜保护两个内部膜的PMCG和PLL抵抗主体免疫系统。该膜提高了胶囊的生物相容性并且还给稳定性和免疫保护提供了额外的机械强度。
本发明还涉及一种治疗患有糖尿病或者相关病症的对象的方法，其包括将足够量的含有胰岛素分泌胰岛细胞的组合物给予对象。该组合物是多膜胶囊包括：(a)内膜，其与生物材料生物相容并具有足够的机械强度以保持膜中的生物材料并且提供免疫保护来抵抗对象的免疫系统中的抗体；
(b)中膜，具有足够的化学稳定性以增强内膜来抵抗对象中的化学物质；
(c)外膜，其与主体生物相容并且具有足够的机械强度以保护内膜和中膜抵抗对象的免疫系统的非特异性免疫反应系统。
糖尿病和相关病症包括，但是不限定于，以下的病症：1型糖尿病、2型糖尿病、青年成人型糖尿病(MODY)、成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)、葡萄糖耐量低减(IGT)和空腹血糖受损(IFG)、妊娠期糖尿病和代谢综合症X。优选地，该方法用于治疗1型糖尿病或2型糖尿病。
对象可以是任何患有糖尿病或者相关病症的动物。优选地，对象是大型哺乳动物，如人。
胰岛素分泌胰岛细胞优选为胰岛，但是，其它能够产生胰岛素的细胞也是合适的。优选猪或者人的胰岛，尤其是如果对象是人。
本发明还涉及一种治疗患有糖尿病或者相关病症的对象的方法，其包括将足够量的含有胰岛素分泌胰岛细胞的组合物给予对象，其中该组合物是多膜胶囊，其包括(a)包含海藻酸钠、硫酸纤维素、聚(亚甲基-共-胍)和氯化钙的膜；(b)包含聚阳离子的膜；和(c)包含具有羧酸根或者硫酸基基团的碳水化合物聚合物的膜。聚阳离子为聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L，D-鸟氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀酰化聚-L-赖氨酸、琥珀酰化聚-D-赖氨酸、琥珀酰化聚-L，D-赖氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)或者它们的组合。除了上述三个膜之外，该多膜组合物还可以含有一个或者多个膜。
本发明还涉及一种以不伴随免疫抑制反应的细胞疗法来治疗患有糖尿病或者相关病症的大型哺乳动物对象的方法。该方法包括将含有提供胰岛素持续释放至少30天的胰岛素分泌胰岛细胞的组合物的细胞疗法给予对象。该组合物在持续释放期间不会表现出显著的降解。
在所属的领域中众所周知的，细胞疗法是移植人类或动物的细胞来代替或者修复受损的或者有障碍的组织和/或细胞。给予的细胞的类型在某些方面对应于患者中衰退(failing)的器官或者组织。在患有糖尿病或者相关病症的患者的状况中，细胞疗法包括分泌胰岛素的细胞的移植，分泌胰岛素的细胞可以模仿胰腺细胞的机能并且在达到一定条件时(即对象中的升高的葡萄糖水平)将胰岛素释放到对象中。
细胞疗法通常包括异种(动物)细胞(例如来自羊、牛、猪和鲨鱼)或者来自人体组织的细胞提取物的引入。细胞可以通过植入、移植、注射或者其他本领域中已知的手段引入。细胞可以直接引入到主体中或者通过细胞封装或者通过被设计为欺骗免疫系统识别该新细胞为主体自身的细胞上特定的涂层引入到主体。已经使用的两种常规的细胞封装方法：微胶囊和大胶囊。通常，在微胶囊中，细胞封闭在小的选择性渗透的球形容器中，而在大胶囊中，细胞包埋(entrap)到更大的非球形膜中。在封装方法中已经使用了各种聚合材料来形成胶囊的膜。
细胞疗法优选包括将封装的细胞移植到对象的体腔内。这个可以通过在体腔中产生一个外科手术开口并将封装的细胞通过开口引入到体腔内来实施。这个可以通过似乎简单(plausibly simple)的技术来完成，如将封装的细胞倾入漏斗型的装置中，该装置运送它们穿过开口并且将它们引入体腔内。也可以使用本领域中已知的其它技术，如皮下注射。
一旦进入到体腔内，随后封装的细胞可以在体腔内自由移动。通常，封装的细胞会停留在对象的网膜上。网膜是被封装的细胞的优选位点，因为这里几乎没有细胞干扰网膜机能的危险。相反，如果封装的细胞将其自身附着于其它器官的外壁，如肝或者肾，就会存在封装的细胞破坏这些器官的机能，导致其它医疗事件的可能性。
封装细胞疗法不与被设计为抑制机能化免疫系统或者防止对象的免疫系统排斥细胞疗法的免疫抑制剂一起给药。许多细胞疗法需要使用免疫抑制剂以确保将要被移植的生物材料不被主体的免疫系统攻击和排斥。尽管免疫抑制剂提高了主体接受细胞疗法的机会，但是已经充分证明免疫抑制药物会对主体造成有害的作用。特别是，免疫抑制剂降低了对象对感染的抵抗性，使得更难治疗感染，并且增大了不可控的出血的可能性。这种药物对胰岛也是有害。
本文所使用的术语“持续释放”是指在释放应该发生的情况下，生物制剂从生物材料中的连续释放。例如，如果生物材料是胰岛并且生物剂是胰岛素，那么在移植之后，胰岛应该在胰岛认识到主体的葡萄糖水平已经达到某一点的任何时候连续将胰岛素释放到主体。在主体中的葡萄糖水平已经被保持后，胰岛会暂时停止分泌额外的胰岛素。但是，当主体的葡萄糖水平又达到需要胰岛素的一点时，暂时停止活动的胰岛会重新开始分泌胰岛素。这种类型的连续释放是持续释放的一个实例。
持续释放的周期应该持续至少30天。优选地，它持续至少60天；更优选地，至少120天；并且最优选地，至少180天。组合物能够提供的胰岛素的持续释放越长，患者仅以细胞疗法而被机能化而不需要额外的治疗就越长。例如，如果细胞疗法能够持续至少180天，患者则只需要大约每6个月接受一次加强剂量的治疗。这使糖尿病患者显著增加了自由度来从事日常活动而不需要必须连续监控他们的病症，校正高或者低的血糖，注射胰岛素或者平衡碳水化合物的摄入以及通过肝脏将葡萄糖规律的并持续的释放到血液中。这还可通过降低胰岛素休克或者酮酸中毒的发生以及防止或延缓糖尿病相关并发症的发作使得整体的血糖控制更强。
当含有细胞的组合物被主体的免疫系统有效地攻击时，免疫系统可以损害或破坏组合物，造成组合物的显著降解。存在两条主体免疫系统攻击外来物质(foreign material)的主要途径，在这种情况下组合物含有细胞。第一，主体中的白血细胞可以消耗含有细胞的组合物或者附着于表面并使内部的生物材料窒息致死(suffocate)。第二，主体的免疫系统可以产生特异性抗体，其具有穿透组合物的空隙并攻击内部生物材料的能力。这些攻击中的任意一种将会造成组合物的某种形式的降解。但是，如果组合物含有足够的生物相容性、化学稳定性和机械强度，则由免疫系统造成的损害和组合物的降解会是最小的。在另一个方面，如果组合物不是充分生物相容或者化学稳定的，并且不具有足够的机械强度，组合物会易于受到攻击和由于这些攻击造成的相应的破坏。有效的攻击将会损坏或者破坏组合物中的生物材料并且使得组合物处于降解的状态中。
人们发现传统的细胞治疗系统引入到大型哺乳动物如犬模型中时，将会稳定少于一个月。在图1中可以找到在犬模型中经历了显著降解的传统制造的封装细胞的一个实施方式。图1描述了以相同配方和加工步骤制备的两个单膜微囊移植到正常的C57/B16小鼠(左边)和正常的杂种狗的腹膜内。胶囊在30天后回收并且拍照。啮齿动物的胶囊没有表现出降解，而犬的胶囊由于胶囊的破损和由主体的免疫系统所引起的生物材料的破坏而表现出了显著的降解。
本发明还涉及一种含有生物材料的胶囊，其当被引入到具有机能化免疫系统的大型哺乳动物时，分泌生物活性剂至少30天而不会产生由于免疫系统的免疫攻击而造成的显著降解。
术语“胶囊”是指在封装系统中使用的任何类型的封装装置，包括微胶囊和大胶囊。优选地，胶囊是球形胶囊，如那些在微胶囊技术中使用的。使用特定的装置和反应器可以形成胶囊，如那些在美国专利第5,260,002和6,001,312号中所披露的，其全部内容结合于此作为参考。
本发明还涉及一种使得患者的葡萄糖水平稳定至少30天的方法，其包括将含有产生胰岛素的胰岛细胞的组合物的细胞疗法给予患有糖尿病或者相关病症的患者。该细胞疗法不与伴随免疫抑制的其他治疗方法一起给予。
如本领域众所周知的，患有糖尿病或者相关病症的患者体内所具有的葡萄糖水平不通过正常机能的胰腺稳定。可以通过含有产生胰岛素的胰岛细胞的组合物的细胞疗法来实现稳定糖尿病患者或者任何遭受不稳定葡萄糖水平的其它类型的患者的葡萄糖水平。细胞疗法可以稳定葡萄糖水平至少30天；优选地，至少60天；更优选地，至少120天；并且最优选地，至少180天。
存在几个已知的制备用于可被利用的封装的细胞的方法。一种形式包括从细胞将要被用于其中的患者中提取细胞，然后在实验室环境下培养它们直到它们增殖到移植回患者所需要的水平。然而，还没有对所有类型的细胞实现细胞增殖，如胰腺细胞。另外一个步骤使用新鲜分离的动物组织，其已经被处理并且悬浮在盐水溶液中。然后将新鲜细胞的制备物立即注射到患者体内或者在注射前通过冷冻干燥或者在液氮中深度冷冻来保藏。在使用之前可以针对病原体，如细菌、病毒，或者寄生虫检测细胞。
猪的胰岛细胞可以从研究实验室或者当地屠宰场得到的猪或仔猪的胰腺获得。优选地，猪或者小猪是无特定病原体(SPF)动物，其以捐献胰岛的目的养殖和监控。可选地，新生的胰岛，其含有初期的或者没有完全发育的免疫系统、猪胎儿的胰岛，其含有在实验室中成熟的胰岛，或者来源于干细胞研究的胚胎细胞，其含有可以在实验室再生的细胞，也可以用于提供胰岛。由健康患者提供的人胰岛理论上代表了胰岛的良好来源并且趋向于具有更少的免疫问题。但是，目前每年提供的人胰岛是不足的，在实际措施中有力地妨碍了人类胰岛作为胰岛的唯一来源。
以下的实施例用于说明本发明。这些实施方式不能被用于限定本发明的范围，本发明的范围由权利要求来确定。
实施例
胶囊设计：以下的实施例利用了五组分/三层膜胶囊系统。该系统提供了设计的灵活性从而进行系统权衡研究来优化在大型动物中的胶囊的性能。系统的5个组分是海藻酸钠(SA)、硫酸纤维素(CS)、聚(亚甲基-共-胍)(或聚(亚甲基二胍)，PMCG)、氯化钙(CaCl2)和聚-L-赖氨酸(PLL)。内膜是PMCG-CS/CaCl2-海藻酸盐(大约100kDa的孔隙度，20-40微米的厚度)；中膜是薄的交织PMCG-CS/PLL-海藻酸盐膜(大约150kDa的孔隙度，1-3微米的厚度)；外膜是CaCl2/海藻酸盐(大约250kDa的孔隙度，100-300微米的厚度)。
胶囊优化：进行以下试验从而优化胶囊。因为所有的膜应该一起发挥作用，所以在胶囊已经被构造后，很难预测一个膜是怎样影响另外一个的。例如，形成中膜的工艺会改变内膜的性能。同样，形成外膜的工艺会改变中膜和内膜的性能。另外，每个膜独立的提升的特征不能预测多膜胶囊在移植主体内是怎样一起作用的。基于这些原因，胶囊形成物被作为一个具有下表中列出的多个参数的整体系统来对待，每一个膜作为一个组分。列出了每个组分(膜)需要的功能，和在构造后系统(胶囊)的整体性能。
胶囊形成和优化中的试剂/步骤
 
# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
试剂/步骤  PA1 PA2 PC1  RT1  PC2 RT2  PC3  RT3  PA3  PC4  RT4  PA4 
PA＝聚阴离子；RT＝反应时间；PC＝聚阳离子；
胶囊设计参数        膜形成参数(见上面的#1-12)
物质转运(T)         1、2、3、4、5、6、7、8
免疫保护(P)         全部
生物相容性          9、10、11、12
球形/中心           1、2、3、4
稳定性(S)           5、6、7、8
胶囊性能：多膜组合物被设计为生物相容的，完成有效的物质转运、提供免疫保护、为生物材料提供机械强度，并且提供化学稳定性。
生物相容性：胶囊的生物相容性取决于将胶囊的免疫源组分保护起来抵抗移植主体。当移植到健康的狗中达6个半月的封装的胰岛的检测没有显示并发症时，证明了胶囊膜的长期生物相容性。参见图2。
图2描绘了在治疗超过6个月之后示出的正常狗的网膜(狗在2/14/01接受了封装的胰岛，并且在8/14/01处死)。在处死前，在动物中未观察到并发症，在处死后，在器官中或者器官上未观察到异常。该图示出了网膜的最小的炎症反应和轻微的新生血管形成。观察到少量的胶囊(少于1％)含有不足量的血纤维蛋白和附着于表面的稀少的单核细胞。从狗中回收的大多数胶囊的表面是干净的和透明的，以肉眼几乎看不见但在显微镜下是易于观察到的。组织反应性的证据是最小的。在内脏床(splanchnic bed)中没有观察到任何其他器官系统的介入。胶囊松散地附着于网膜并且易于被清洗下来，显示胶囊锚定在但是不是嵌入到网膜内。胶囊的完整性非常好，仅观察到了最小的胶囊“破坏”。在6个半月之后移出的回收的封装胰岛仍然是活着的。
物质转运：使用交织管模型，物质转运与R4/D成比例，其中R是平均孔径，D是膜厚度。参见Wang T.，“New Technologies for BioartificalOrgans，”Artif.Organs，22，1：p.68-74(1998)，其全部内容结合于此作为参考。膜的孔径可以使用排阻色谱法来进行测量。参见Brissova等.，“Controland measurement of permeability for design of microcapsule cell deliverysystem，”J.Biomed.Mat.Res.，39：61-70(1998)，其全部内容结合于此作为参考。
图3显示了具有80KDa(直径大约为12纳米)下限的胶囊膜的孔径分布。该孔径足够大足以使葡萄糖和胰岛素出入，并足够小足以阻止免疫系统以各种方法渗透进入胰岛所在的胶囊的核心。该图显示了作为胶囊的膜的孔径分布函数的归一化保留时间。胶囊的膜的孔径通过排阻色谱(SEC)来确定，排阻色谱测量右旋糖苷(dextran)溶质自填满有微胶囊的柱的排出量。测量到的溶质排阻系数值(KSEC)和溶质分子的已知大小可以估测膜的孔径的分布和胶囊的渗透性。
免疫保护：使用随机游走模型，免疫保护与D2/R2成比例，其中D是膜厚度，R是平均孔径。参见Wang T.，“New Technologies for BioartificalOrgans，”Artif.Organs，22，1：p.68-74(1998)。一般而言，免疫保护的目地是与物质运输的目地成反比的。但是，它们对膜厚度和孔径的依赖的能力是完全不同的，这样调整参数从而同时满足两个目地是可能的。
机械强度：通过在胶囊上施加升高的单轴载荷直到胶囊破裂来测量胶囊的机械强度。胶囊的机械强度(膜厚度的函数)，可以在几分之一克到几十克的负荷之间的任何位置进行调整从而满足移植目地而不改变胶囊的渗透性。
图4：胶囊机械稳定性。该图通过断裂负载(rupture load)随胶囊膜厚度和尺寸变化的绘图说明了两种不同聚合物浓度的胶囊的机械强度。曲线的斜率代表了破裂应力由此间接地代表了胶囊膜的固有强度。该图通过在胶囊上施加单轴负荷来测量胶囊的机械破裂强度。实心圆代表0.6-0.6海藻酸盐-CS胶囊，空心圆表示0.9-0.9海藻酸盐-CS胶囊，实心方形代表PLL-海藻酸盐系统。如图表中所示，虽然某些聚合物比其它的坚固，但是通常发现越厚的膜倾向于成为越坚固的膜。
稳定性：胶囊的稳定性主要取决于化学键的稳定性和膜厚度。大型动物，如狗的腹腔液(intra peritonea)可以与胶囊膜发生化学反应从而削弱了机械强度。
图5说明了具有不同化学成分和膜厚度的两种胶囊的机械强度。通过测量由于在40℃下在狗血浆中培育的l/e因子引起的胶囊丧失其机械强度的时间长度来实验测定稳定性。人们相信一个设计适当的胶囊系统可以在大型动物的腹膜的不利环境中维持多年。在图5中，当胶囊在40℃下在狗血浆中培育时，测量作为时间函数的机械强度。实心菱形代表0.6-0.6海藻酸盐-CS胶囊，实心方形代表0.9-0.9海藻酸盐-CS胶囊，空心方形代表0.6-0.6海藻酸盐-CS胶囊。稳定性通过随着时间的最小波动量来示出。在图中，0.6-0.6海藻酸盐-CS胶囊显示了最小的波动量并且因此可以被认为是所试验的三种中最稳定的胶囊。
已经在切除了胰腺的犬模型中研究了多膜封装的胰岛的生物相容性和功能能力。动物的尺寸和相应的血量可以进行血糖和胰岛素的每日估测、葡萄糖耐受的临床评价(assessment)以及生物相容性和安全性的估测。另外，犬模型是广泛使用的人葡萄糖自我平衡和糖尿病的模型。犬中全胰切除术导致内生胰岛素的完全缺失，因此胰岛素浓度的评价可以直接估测封装的胰岛的机能和反应力。
犬的准备：研究了平均重量7.6kg的任意性别的杂种犬。该动物住在符合美国协会对于动物管理条例(animal care guideline)认证的设备中。所有的动物管理程序都通过了Vanderbilt′s设立的动物管理及使用委员会的评审和核准。在封装的胰岛腹膜内给药前的17到24天，如以下所描述地进行全胰切除术。在手术后阶段，基于干重给动物喂饲罐装饲料的标准饮食(34％蛋白质、14.5％脂肪、46％碳水化合物，和5.5％纤维素)。外分泌的胰腺酶、脂肪酶(70000U)、淀粉酶(210000U)和蛋白酶(210000U)与它们的进食一起给药，从而辅助食物消化并且补偿胰腺外分泌功能的缺失。动物每日接受调节剂量的胰岛素注射物以在喂饲后12个小时保持血糖正常，在24小时内没有糖尿。胰岛素的需要量通常在0.6-0.9U/kg常规猪(regular pork)和1.0-1.3U/kg NPH猪的范围，q24小时(每24小时一次)。
封装的胰岛的给药：在胰切除术之后，每日的胰岛素需要量可以是稳定的。动物禁食12小时，并使用丙泊酚(Propofol)(4.4mg.kg，IV)和异氟烷(具有2％的O2，吸入)进行全身麻醉。实施1.5cm的中线剖腹手术，并将7.0mm I.D.套管插入到腹膜间隙。一个漏斗连接到套管的自由端。悬浮在含有犬清蛋白的改良Hanks溶液中的封装的胰岛在室温下给药到腹部间隙。总的胶囊给药注入量是150-200ml。立即移出腹膜内的套管并封闭剖腹手术切口。使动物苏醒，立即喂饲她/他每日食物配给量(ration)。该食物配给量从封装的胰岛给药时起的两个小时内消化的。喂饲食物后的6到8个小时，收集血液用于测量血糖状况，在此后的3天每天都实施收集。
每日临床测量：在紧接着的给药后阶段之后，动物喂饲标准的每日配给量，以2-3天的间隔进行血液的收集用于测定葡萄糖和胰岛素。在收集血液时，称重动物并且测量一般身体状况。在封装的胰岛给药后的2-4周实施口服葡萄糖耐量试验。在18个小时的禁食之后，将18规格的静脉留置针放置在左颈静脉或右颈静脉中用来收集血液。在收集了基线(baseline)血液样品以后口服给药右旋糖(0.7gm/kg)。在开始的20分钟以2.5分钟间隔收集血液样品，之后在试验的3个小时阶段中以5和10分钟间隔收集血液样品。使用Beckman葡萄糖II分析仪(Beckman Instruments Palo AltoCA.)通过葡萄糖氧化酶法测定血浆葡萄糖水平。使用双抗体系统通过放射性免疫测定确定血浆中的胰岛素。
在封装的胰岛给药的那天，停止外源胰岛素并且监控血液葡萄糖水平。没有将免疫抑制药物给予动物。
胰岛的分离和评价：为了胰岛的分离，杂种犬(体重20-28kg)在禁食18小时之后进行全身麻醉。实施中线剖腹手术。分离(分辨出，isolate)胃与十二指肠、脾脏和胰十二指肠的静脉和动脉，在每个血管周围放置结扎线(ligature)。在接近十二指肠入口的地方确定并且分离主胰管。围绕该管放置结扎线。将18规格的静脉留置针插入管中，其尖端向前2-3mm这样它就保留在正好在胰腺的管分支前的主体管结构中。将导管缝合到该管上从而稳固其位置。要回收之前，立即将先前放置的血管结扎线拉紧，动物安乐死。从所有腹膜和血管的连接处横切胰腺并且从十二指肠切开。一旦切离，立即通过事先放置的管的导管将冰冷的Wisconsin大学(UW-D)灌注液灌注到胰腺。
实施可视化检查以保证整个胰腺都被灌注。得到的腺体放在冰上转送到实验室，在实验室用胶原酶的UW-D(Crescent化学品)溶液替代UW-D溶液。然后将腺体放置于振荡水域中，并且在40℃消化大约35分钟。离解(dissociate)的组织经过400-μm网筛过滤，用冰冷的介质(培养基，meida)清洗几次从而去除并失活胶原酶。根据胰岛和外分泌组织之间的密度差异，使用不连续Ficoll梯度来分离胰岛和外分泌组织。在密度离心之后，收集、清洗胰岛，转移到补加了10％FBS(胎牛血清)和抗生素的组织培养M199培养基中。在48-72小时的培养过程中，分离的胰岛保持它们完整的外观并且胶囊表面保持光滑。
在56个犬胰腺上实施胰岛分离。在下面示出了每个胰腺的平均分离结果(未量化的小于50μm的胰岛片段)的分布(profile)。除了分离的胰岛的数量，通过测定胰岛的直径、纯度、胰岛的生存能力和胰岛的功能来估测分离物的质量。因为平均胰岛直径会变化，所以通过计算平均胰岛体积与直径为150μm的“标准”胰岛的体积的比值来将分离产率归一化。得到的数值表示为胰岛当量值(Equivalent Islet Number，EIN)并且可以使得不同的分离物进行产率比较。用胰岛特异性染料双硫腙染色的样品来测定胰岛的纯度。染料将胰岛染成红色但是不染色外分泌组织。大部分外分泌组织在培养开始的24小时中死亡，导致在培养过程中纯度升高到大约95％。
通过用钙黄绿素AM(将活细胞染成荧光绿)和溴化乙锭(将死细胞的核染成荧光红)的组合染色的样品来确定胰岛的生存能力。生存能力以1(所有细胞死亡)至4(所有细胞生活)的等级进行记分。5种典型的分离物的平均值列表如下。
每个胰腺的胰岛           435±38K
胰岛直径                 106±3.8μm
胰岛当量值               0.48±0.04
纯度                     87.3±1.2％
生活力                   3.5±0.1
胶囊的形成和描述：可以用液滴形成器和化学反应室制造胶囊，如在美国专利第5,260,002或者6,001,312号中所披露的，这二者的全部内容都结合于此作为参考。
另外一种液滴形成器系统是双注射器系统，其中两个或者多个注射器平行连接并且没入恒温槽中从而保持活细胞健康。含有注射器的恒温槽可以为具有约4℃温度的冰水槽，其有助于将细胞保持在休眠的状态。已经发现，当胰岛处于休眠状态时，在移植的过程中会产生较少的损害。通过在一个注射器上进行实验时可以使另外一个注射器重新补充，这种双注射系统提供了连续的操作。该注射器也可以含有位于注射器内部的低转速(slow-turning)的推进器，其有助于保持胰岛密度的一致，即胰岛在注射器内更加平均地分布。
化学反应装置包括充满溶液的，如阳离子溶的液多回路室反应器。该阳离子溶液槽通过阳离子流供给，其连续地补充溶液并且带走被引入室的阴离子液滴。具有封入的胰岛的连续的SA/CS液滴会从滴形成器流出，以设计好的高度和角度进入阳离子流；从而降低或者将胰岛偏离中心、液滴变形和与冲击(碰撞)相关的气泡掺入问题最小化。然后通过聚阳离子流将液滴带入到多回路反应器中。该反应器有助于控制复合物(complex)形成的时间以及消除某些重力沉降作用。胶囊被带入到用于连续操作的具有相同或者不同聚阳离子溶液的第二回路反应器。这促进了更严格地控制胶囊的直径、球形以及膜的厚度和均一性。
胶囊可以被制成直径范围在约0.5mm到约3.0mm并且膜厚度范围在约0.006mm到约0.125mm。
可以通过在胶囊上施加增大的单轴负荷直到胶囊破裂或者完全被压缩成一个平的盘状物来测量胶囊的机械强度，正如在图4中描述和先前讨论的。胶囊的机械强度(作为膜组分和厚度的函数)，可以调节到几分之一克到几百克的负荷之间的任何位置从而在不显著改变胶囊的渗透性下满足移植的目地。
开发并且表征了一系列具有渗透性范围的胶囊(孔隙度下限在40kDa-230kDa的范围，基于右旋糖苷排出测量法)。胶囊渗透性可以通过使用以右旋糖苷分子量作为标准的排阻色谱法(SEC)来测量。测量渗透性和组分浓度可以更好地控制和操纵胶囊的渗透性。胶囊膜的表观孔径是通过排阻色谱法(SEC)来测定的，其测量从填满微囊的柱中的右旋糖苷溶质的排出。通过使用中性多糖分子量标准，在当溶质的扩散仅由其分子量大小控制的条件下，可以评价膜的性能。基于溶质排阻系数(KSEC)的测量值和溶质分子的已知尺寸，可以估计膜的孔径分布(PSD)。
新型胶囊的体内功能
响应于刺激的封装胰岛的胰岛素分泌：在胰岛分离和直径、纯度和生存能力测试后，培养胰岛48-72小时并且用多膜胶囊封装。在细胞周流系统中测定游离的胰岛和封装的胰岛的胰岛素分泌能力，如下所述。在具有含0.1％的作为周流液的BSA的RPMI 1640的流速为1ml/分钟的细胞周流仪器中估测封装的胰岛的胰岛素分泌。封装的胰岛以2mM葡萄糖周流30分钟，抛弃柱流过物。在30分钟的2mM葡萄糖的周流过程中，30分钟的2mM葡萄糖+0.045mM IBMX(营养物)的周流过程中和60分钟的2mM葡萄糖的周流过程中收集周流液的3个微小(瞬间，minute)的样品。使用具有犬胰岛素标准的Coat-a-Count试剂盒(Diagnostic ProductsCorporation，Los Angeles，CA)重复检测样品的胰岛素。分泌的胰岛素的量被归一化为胰岛的数量。
如通过对胰岛素促分泌素的动态响应的测量，封装的胰岛的胰岛素分泌具有与未封装的游离胰岛相似的分部，在胰岛素分泌上具有轻微的滞后。参见图6。这种在胰岛素分泌上的滞后和在去除刺激后胰岛素分泌的停止反应出(a)促分泌素进入胶囊并达到胰岛的时间和(b)胰岛素离开胶囊的时间。
图6描述了测量分泌胰岛素的胰岛的分泌水平的细胞周流系统。分别测量游离胰岛(未封装的)、封装在单膜系统的胰岛(封装的胰岛)和封装在多膜系统的胰岛(具有多层的封装)。在图中的顶部用黑色棒状物表示胰岛素分泌的刺激。每3分钟从周流相(perifusion fraction)中收集的胰岛素通过放射性免疫测定而被定量。胰岛的数量未被归一化，所以图表的关注点应该放在响应时间而不是图的高度上。3幅图中的响应时间的相似性(只具有微小的延迟)，表示封装在多膜系统的胰岛将会在移植动物中正常发挥作用。
封装的胰岛的功能和安全性：使用全胰切除术的狗模型，在10个糖尿病动物中测量了腹膜内给药的封装的犬胰岛(同种异体移植物)的功能和安全性。糖尿病复发(以葡萄糖水平连续4天高于180mg/dl来确定)在移植后大约100天在狗1中出现。回收封装胰岛，并且在细胞周流系统中使用与在图6所示的前述移植中所用的相同刺激测试该封装胰岛。参见图7。
图7中的图显示出封装的胰岛仍然是存活的，以对高葡萄糖加IBMX的反应作为证据，但是胰岛素分泌能力下降。这些结果提示由于不充足的胰岛素量糖尿病复发，还提示这是由于降低的胰岛量或者功能的降低，其不是同种异体移植物反应的结果。
在图8-10中显示了狗10的空腹血糖浓度、体重和果糖胺测量值作为代表性数据。回收的胶囊是干净和完整的，提示移植物的寿命不再由胶囊的稳定性所限定，而是由胰岛的量的减少而限制。
图8描述了犬的同种异体移植的血糖分析。已经证明封装在多膜系统中的胰岛的移植在消除已经进行了全胰切除术的犬模型(第10号狗)的糖尿病上的功效。顶部图像显示了在进食后12-18小时收集的静脉血糖浓度。较低图像显示了皮下给药的猪胰岛素的每日剂量。较低图像的棒状物的上部显示了NPH胰岛素，棒状物的下部显示了常规的胰岛素。在18和19天，停止治疗从而确认狗患有糖尿病。在顶部图像中可见，当胰岛素治疗停止时，葡萄糖水平显著升高。在20天重新开始胰岛素治疗。在25天的早晨，又停止胰岛素治疗。在25天的下午，将封装在多膜系统中的胰岛移植到犬中，如通过垂直线所示。如在顶部图像中所显示的，经过200天，葡萄糖水平以与胰岛素治疗期间所观察到的葡萄糖水平可比的或者更好的水平保持稳定。底部图像确定了在这个时间阶段中没有给予额外的胰岛素治疗。
图9描述了犬同种异体移植的体重分析。顶部和底部图像来源于图8。中部图片显示了在试验过程中监测到的动物体重。如图表中所见，在整个试验阶段，犬的体重保持稳定。
图10描述了犬同种异体移植的果糖胺分析。顶部和底部图像来源于图8。中部图像显示了果糖胺的测量值，糖尿病对象2-3周的平均血糖水平的指标。400的果糖胺水平大致相当于8.0的A1C测量值，其是相似的指标。中部图像的阴影区域示出了可接受的果糖胺水平。如这个图中所示，在试验期的果糖胺水平降低到可接受的水平内。测试的果糖胺水平相当于范围在6.0(110-120天)至8.0(195-200天)的A1C水平。
再移植：当动物复发空腹高血糖症时，可以重复移植步骤从而保持血糖量正常。例如，狗7接受了40,000EIN/kg，但是只能在大约90天保持某些类似的葡萄糖控制。然后狗以两个移植物接受了总量达63,000EIN/kg的第二次剂量的封装的胰岛(鉴于胰岛的有效性，以一个月分开给予移植物)。这些结果类似在具有100,000 EIN/kg的狗6的移植中观察到的，并且在提供空腹血糖控制上具有可比的有效性。
图11示出了90-110mg/dl的不补充胰岛素或者免疫抑制的狗7的每日空腹血糖。垂直线示出胰岛移植的天数。顶部图像示出了指示进食后12-18小时收集的静脉血糖浓度的数据点。较低图像显示了皮下给药的猪胰岛素的每日剂量，棒状物的上部显示了NPH胰岛素，棒状物的下部显示了常规胰岛素。该图显示了再移植的有效性，这通过第二次移植后的迅速稳定的葡萄糖水平而被证明。
这些数据提示如果不比首次移植更好，进行再一次移植也无妨。由于对象的适应治疗和将血管化降低到最小的能力，人们相信随后的移植比最初的移植表现更好。再移植提供了提高的葡萄糖控制，并且在生物相容性方面在动物中很好地被接受。已经在一个对象上成功地进行了4次再移植；但是，可以在对象中实施的再移植的数量并没有实际的限制。
静脉葡萄糖耐量实验(IVGTT)：对所用的动物实施静脉葡萄糖耐量实验(IVGTT)以测量封装的胰岛的体内功能。图12显示了狗5的IVGTT结果。给先前接受了封装在多膜系统中的胰岛移植的狗在t＝0给予静脉内葡萄糖(300mg/kg)。从颈静脉收集静脉样品从而测定血糖和胰岛素。
大约在105分钟对象的血糖水平恢复到正常，其比对照狗6表现出的平均50分钟的时间要长，但不是不合理的长。葡萄糖清除率(K值)高，但仍然在正常的范围内。在以75分钟的IVGTT基础上，所有被移植动物的循环胰岛素值比基础的平均升高40％，并且在试验的剩余时间里保持在这个水平上。据有封装的胰岛的狗不表现出第一相胰岛素分泌，其在对照动物中经常发现。缺乏响应于葡萄糖激发的胰岛素波动(可能是由于IP移植位点的稀释效应)可能会促进胰岛逐渐丧失分泌充足的胰岛素以保持正常血糖量的能力。

Claims (58)

1.一种用于封装生物材料的多膜组合物，包括：
a.内膜，其与所述生物材料生物相容并且具有足够的机械强度以保持所述膜中的所述生物材料并且提供免疫保护以抵抗主体的免疫系统中的抗体；
b.中膜，其具有足够的化学稳定性以增强所述内膜来抵抗所述主体的化学物质；以及
c.外膜，其与所述主体生物相容并且具有足够的机械强度以防护所述内膜和所述中膜抵抗所述主体的非特异性先天免疫系统；
其中所述中膜将所述内膜和所述外膜结合起来。
2.根据权利要求1所述的多膜组合物，其中所述多膜组合物具有孔隙度，所述孔隙度足够大足以使得生物活性剂从所述生物材料释放但又足够小足以防止来自免疫系统的抗体的进入。
3.根据权利要求2所述的多膜组合物，其中所述孔隙度下限在约50kDa至约250kDa的范围。
4.根据权利要求1所述的多膜组合物，其中每个膜以一种可以使所述多膜组合物满足大型动物移植物的二分法目标的方式实现至少一种功能。
5.根据权利要求1所述的多膜组合物，其中所述生物材料选自由胰岛、肝细胞、脉络丛、神经细胞、甲状旁腺细胞和分泌凝固因子的细胞组成的组。
6.根据权利要求5所述的多膜组合物，其中所述生物材料是胰岛。
7.根据权利要求2所述的多膜组合物，其中所述的生物活性剂是胰岛素。
8.根据权利要求1所述的多膜组合物，其中所述主体是大型哺乳动物。
9.根据权利要求8所述的多膜组合物，其中所述大型哺乳动物是人。
10.根据权利要求1所述的多膜组合物，进一步包括一个或者多个附加膜。
11.根据权利要求10所述的多膜组合物，其中所述附加膜为所述多膜组合物提供免疫保护、机械强度、化学稳定性、和/或生物相容性。
12.根据权利要求1所述的多膜组合物，其中所述内膜的膜厚度在约5微米至约150微米的范围。
13.根据权利要求12所述的多膜组合物，其中所述膜厚度在约10微米至约60微米的范围。
14.一种能够封装生物材料的多膜组合物，包括：
a.包括海藻酸钠、硫酸纤维素、聚(亚甲基-共-胍)和氯化钙的膜；
b.包括选自由聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L，D-鸟氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀酰化聚-L-赖氨酸、琥珀酰化聚-D-赖氨酸、琥珀酰化聚-L，D-赖氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)以及它们的组合组成的组中的聚阳离子的膜；和
c.包含具有羧酸根基团或者硫酸根基团的碳水化合物聚合物的膜。
15.根据权利要求14所述的多膜组合物，其中所述聚阳离子选自由聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L，D-鸟氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)以及它们的组合组成的组。
16.根据权利要求15所述的多膜组合物，其中所述聚阳离子是聚-L-赖氨酸。
17.根据权利要求14所述的多膜组合物，其中所述碳水化合物聚合物选自由羧甲基纤维素钠、低甲氧基果胶、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、黄芪胶、果胶酸钠、κ-角叉菜胶和ι-角叉菜胶组成的组。
18.根据权利要求17所述的多膜组合物，其中所述碳水化合物聚合物选自由海藻酸钠、海藻酸钾以及海藻酸钙组成的组。
19.根据权利要求14所述的多膜组合物，其中所述膜(b)进一步包括至少一种选自由海藻酸钠、硫酸纤维素和聚(亚甲基-共-胍)组成的组中的化合物。
20.根据权利要求14所述的多膜组合物，其中所述膜(c)进一步包括选自由氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钙、硝酸钙、氯化铵、氯化钠、氯化钾、氯化胆碱、氯化锶、葡萄糖酸钙、硫酸钙、硫酸钾、氯化钡、氯化镁、以及它们的组合组成的组中的无机金属盐。
21.根据权利要求20所述的多膜组合物，其中所述无机金属盐选自由氯化钙、氯化铵、氯化钠、氯化钾、硫酸钙、以及它们的组合组成的组。
22.根据权利要求14所述的多膜组合物，进一步包括一个或者多个附加膜。
23.一种治疗患有糖尿病或者相关病症的对象的方法，包括将足够量的含有产生胰岛素的胰岛细胞的组合物给予所述对象，其中所述组合物是多膜胶囊，包括：
a.内膜，其与所述生物材料生物相容并且具有足够的机械强度以保持所述膜中的所述生物材料并且提供免疫保护以抵抗所述对象的免疫系统中的抗体；
b.中膜，其具有足够的化学稳定性以增强所述内膜来抵抗所述对象中的化学物质；以及
c.外膜，其与所述主体生物相容并且具有足够的机械强度以保护所述内膜和所述中膜抵抗所述对象的非特异性先天免疫系统。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述糖尿病或者相关病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、青年成人型糖尿病(MODY)、成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)、葡萄糖耐量低减(IGT)和空腹血糖受损(IFG)、妊娠期糖尿病和代谢综合症X组成的组。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述对象是大型哺乳动物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述大型哺乳动物是人。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述多膜胶囊具有孔隙度，所述孔隙度足够大足以使胰岛素从所述产生胰岛素的胰岛细胞释放但是足够小足以防止来自免疫系统的抗体的进入。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述孔隙度下限在约50千道尔顿至约250千道尔顿的范围。
29.根据权利要求23所述的方法，其中每个膜以一种使所述多膜组合物满足大型动物移植物的二分法目标的方式实现至少一种功能。
30.一种治疗患有糖尿病或者相关病症的对象的方法，包括将足够量的含有产生胰岛素的胰岛细胞的组合物给予所述对象，其中所述组合物是多膜胶囊，包括：
a.包括海藻酸钠、硫酸纤维素、聚(亚甲基-共-胍)和氯化钙的膜；
b.包括选自由聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L，D-鸟氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L，D-天冬氨酸、聚丙烯酸、聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸、聚-L，D-谷氨酸、琥珀酰化聚-L-赖氨酸、琥珀酰化聚-D-赖氨酸、琥珀酰化聚-L，D-赖氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)、以及它们的组合组成的组中的聚阳离子的膜；和
c.包含具有羧酸根基团或者硫酸根基团的碳水化合物聚合物的膜。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述聚阳离子选自由聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L，D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸、聚-L，D-鸟氨酸、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)、以及它们的组合组成的组。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述聚阳离子是聚-L-赖氨酸。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述碳水化合物聚合物选自由羧甲基纤维素钠、低甲氧基果胶、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、黄芪胶、果胶酸钠、κ-角叉菜胶和ι-角叉菜胶组成的组。
34.根据权利要求33所述的方法，其中碳水化合物聚合物选自由海藻酸钠、海藻酸钾和海藻酸钙组成的组。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述膜(b)进一步包括至少一种选自由海藻酸钠、硫酸纤维素和聚(亚甲基-共-胍)组成的组中的成分。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述膜(c)进一步包括选自由氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钙、硝酸钙、氯化铵、氯化钠、氯化钾、氯化胆碱、氯化锶、葡萄糖酸钙、硫酸钙、硫酸钾、氯化钡、氯化镁、以及它们的组合组成的组中的无机金属盐。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述无机金属盐选自由氯化钙、氯化铵、氯化钠、氯化钾、硫酸钙、以及它们的组合组成的组。
38.根据权利要求30所述的方法，进一步包括一个或者多个附加膜。
39.一种以不涉及免疫抑制的细胞疗法治疗患有糖尿病或者相关病症的大型哺乳动物对象的方法，所述方法包括：
将含有提供至少30天的胰岛素持续释放的产生胰岛素的胰岛细胞的组合物的细胞疗法给予所述对象，其中所述组合物在所述持续释放过程中未表现出显著的降解。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述持续释放阶段持续至少60天。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述持续释放阶段持续至少120天。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述持续释放阶段持续至少180天。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述组合物是多膜组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述多膜组合物包括至少三个膜，所述膜中的每一个包含至少一种选自由海藻酸钠、硫酸纤维素、聚(亚甲基-共-胍)、氯化钙和聚-L-赖氨酸组成的组中的化合物。
45.一种含有生物材料的胶囊，当所述胶囊引入到具有机能化免疫系统的大型哺乳动物中时，分泌生物活性剂至少30天而不产生由所述免疫系统的免疫攻击而造成的显著降解。
46.根据权利要求45所述的胶囊，其中所述生物剂是胰岛素。
47.根据权利要求45所述的胶囊，其中所述大型哺乳动物是人。
48.根据权利要求45所述的胶囊，其中所述胶囊分泌所述生物活性剂至少60天。
49.根据权利要求48所述的胶囊，其中所述胶囊分泌所述生物活性剂至少120天。
50.根据权利要求49所述的胶囊，其中所述胶囊分泌所述生物活性剂至少180天。
51.根据权利要求45所述的胶囊，其中所述胶囊是多膜胶囊。
52.根据权利要求51所述的胶囊，其中所述多膜胶囊包括至少三个膜，所述膜的每一个包括至少一种选自由海藻酸钠、硫酸纤维素、聚(亚甲基-共-胍)、氯化钙和聚-L-赖氨酸组成的组中的化合物。
53.一种稳定患者的葡萄糖水平至少30天的方法，包括将含有产生胰岛素的胰岛细胞的组合物的细胞疗法给予患有糖尿病或者相关病症的患者，其中所述细胞疗法并不是与涉及免疫抑制的附加治疗一起给予的。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述葡萄糖水平稳定至少60天。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述葡萄糖水平稳定至少120天。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述葡萄糖水平稳定至少180天。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述组合物是多膜组合物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述多膜组合物包括至少三个膜，所述膜的每一个包括至少一种选自由海藻酸钠、硫酸纤维素、聚(亚甲基-共-胍)、氯化钙和聚-L-赖氨酸组成的组中的化合物。
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