CN101511307A - 来自视网膜干细胞的人工角膜 - Google Patents

Abstract

公开了产生人工角膜的方法，所述人工角膜从源自孤雌激活的人卵母细胞的视网膜干细胞(rSC)分化而来，所述方法包括在没有3－D支架的情况下产生这样的人工角膜。还描述了由公开的方法产生的分离的人工角膜。

Description

来自视网膜干细胞的人工角膜

技术领域

【0001】一般而言，本发明涉及胚胎干细胞(ES)，更具体而言，本发明涉及获得人工角膜的方法。

背景技术

【0002】人胚胎干细胞(hES)是能够分化成一系列细胞类型的多能细胞。当注射到免疫缺陷小鼠时，胚胎干细胞形成分化肿瘤(畸胎瘤)。然而，在体外被诱导形成胚状体(embryoid bodies(EBs))的胚胎干细胞提供了胚胎干细胞系的来源，所述胚胎干细胞系在特定的生长条件下容易分化为具有数种组织特征的多种细胞类型。例如，hES已经被分化为内胚层、外胚层和中胚层衍生物。

【0003】人ES细胞和它们的分化后代是用于治疗性移植与用于药物检测和开发的人细胞的重要来源。这两种目标所需要的是供给足够的细胞，所述细胞可分化为适合患者需要或用于适当的药理学检测的组织类型。与此有关的是需要从胚胎干细胞产生分化细胞的有效且可靠的方法。

【0004】hES和hEG细胞提供了显著的科学和治疗可能性，这包括产生更特化的细胞或组织的潜能。然而，关于hES和hEG细胞来源的伦理问题，以及对于应用研究用核移植(nuclear transfer(NT))可导致使用NT产生人这一忧虑，已经促进了大量的公共讨论和辩论。

【0005】哺乳动物卵母细胞的孤雌激活(Parthenogenic activation)可以被用作通过精子/NT的受精的可替代方案，来制备用于胚胎干细胞产生的卵母细胞。孤雌激活是在没有来自雄配子的任何贡献下从雌配子产生胚胎细胞，其最终发育为成体或没有发育为成体。

【0006】目前，干细胞研究的焦点是开发人造器官、康复设备或假肢以替代天然的身体组织。这种开发一般设想将生物相容材料用于工程干细胞以控制增殖(扩张，expansion)/分化；即，应用3-D支架(例如，PLG支架、壳聚糖支架、PCL/PEG支架)，通过为增殖提供机械支持来产生模拟组织类似功能的设备。

【0007】可选地，培养的干细胞或分化的干细胞的移植被预想为治疗方法。这些方法一般称为体内组织工程或原位发生(in situ generation)。虽然本领域的许多工作声称直接移植培养细胞，但是作为一个实际问题，这样的方法通常需要在多孔支架生物材料内接种分化的干细胞(例如，源自干细胞的心肌细胞和凝胶或多孔藻酸盐)。

发明概述

【0008】本发明涉及从源自孤雌激活的人卵母细胞的干细胞产生三维感觉系统器官的方法的开创性发现。本发明的方法不需要使用外部支架。如在一个实施方式中公开的，所述感觉器官是人工角膜。

【0010】在一个实施方式中，公开了分离的视网膜干细胞源的人工角膜。在相关的方面，视网膜干细胞得自孤雌激活的人卵母细胞。在另一相关的方面，角膜是终末分化的。在另一方面，角膜与卵母细胞供体组织相容，包括角膜包含同质的线粒体DNA，并且在人中是可移植的。

【0011】在另一实施方式中，公开了产生人工角膜的方法，包括孤雌激活人卵母细胞，其中活化包括：使卵母细胞与离子载体在高O₂压下接触，并且使卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂在低O₂压下接触，在低O₂压下培养活化的卵母细胞直到胚泡形成，将胚泡转移至一层饲养细胞上，并且在高O₂压下培养转移的胚泡，从胚泡的滋养外胚层机械分离内细胞团(inner cellmass(ICM))并且在高O₂压下在一层饲养细胞上培养ICM的细胞，其中可以通过人胚胎干细胞标记(hES)和神经元特异性标记鉴定培养物中的视网膜干细胞，并且其中任选地分离鉴定的视网膜干细胞，在培养基中培养分离的干细胞，所述培养基包含血清代替品(M/SR)、细胞质基因组产物(plasmonate)和至少一种促细胞分裂原，所述促细胞分裂原在用DNA合成抑制剂处理的成纤维细胞饲养层中上激活gp130/STAT途径和/或MAP激酶途径，在不添加促细胞分裂原的情况下，在包含细胞质基因组产物的M/SR(M/SRP)中培养促细胞分裂原处理的细胞到接近汇合，其中定期用M/SR替换大约1/2体积的M/SRP直到接近汇合的细胞发展为色素形成和圆顶外观，以及将M/SR中的有颜色的细胞转移到明胶包被的基底上，其中定期用M/SR替换大约1/2体积的M/SR直到人工角膜形成。任选地，视网膜细胞可以作为富集的而不是分离的细胞群培养。

【0012】在一方面，促细胞分裂原选自白血病抑制因子(LIF)、bFGF和它们的组合。在另一方面，DNA合成抑制剂是烷化剂，包括但不限于，丝裂霉素C。在相关的方面，所述饲养细胞是人细胞。

【0013】在一个实施方式中，公开了治疗需要人工角膜的对象的方法，包括用人工角膜替换对象的角膜。在一方面，所述对象患有疾病，其影响了角膜，所述疾病如角膜炎、角膜溃疡、角膜磨损(corneal abrasion)、雪盲、电光性眼炎(arc eye)、锡格森浅层点状角膜病变(Thygeson’s superficial puncate keratopathy)、角膜上皮营养不良(Fuchs’dystrophy)、圆锥形角膜(keratoconus)、干性角膜结膜炎(keratpconjunctivitis sicca)、角膜感染或角膜营养不良。在另一方面，所述对象具有损伤的角膜。

【0014】在另一实施方式中，公开了鉴定影响眼角膜的剂的方法，包括使视网膜干细胞源的人工角膜与所述剂接触并且观察在该剂存在或不存在的情况下角膜的变化，其中角膜变化表示该剂影响角膜。

【0015】在一方面，所述剂对角膜具有疗效。在另一方面，所述剂对角膜具有不良作用。在相关的方面，角膜的变化包括基因表达的调节、蛋白质表达的调节、混浊度的改变、可塑性的改变、硬度的改变、光相速度的变化以及形状的变化。

【0016】在一个实施方式中，公开了用人工角膜替换眼角膜的方法，包括：从眼手术切除角膜，将人工角膜插入到除去角膜的区域，并且使所述人工角膜与切除下面的组织连接，以将人工角膜固定到眼。

【0017】在相关的方面，所述方法进一步包括：分离角膜的部分外表面，从而形成角膜瓣(corneal flap)和角膜床(corneal bed)，所述角膜瓣具有前表面和后表面，所述角膜床具有成型的前表面，在将人工角膜植入角膜床上，所述角膜具有前表面和后表面，和替换分离的角膜部分。

【0018】在另一实施方式中，公开了将有效量的剂输送到对象的眼睛的方法，包括：用核酸载体转化至少一部分包含人工角膜的细胞，其中所述载体编码所述剂，鉴定包含所述人工角膜的细胞群，所述细胞群表达所述核酸编码的剂，并且用人工角膜的转化细胞替换所述对象的角膜细胞，其中该替换的细胞输送所述剂到对象的眼睛。

【0019】在相关的方面，所述替换步骤包括用人工角膜替换对象的角膜。

【0020】下面更详细描述了根据本发明的示例性的方法和组合物。

附图简述

【0021】图1A示出孤雌生殖源的hES细胞的碱性磷酸酶的表面标记表达的显微照片。

【0022】图1B示出表面标记Oct4表达的显微照片。

【0023】图1C示出表面标记SSEA-1表达的显微照片。

【0024】图1D示出表面标记SSEA-3表达的显微照片。

【0025】图1E示出表面标记SSEA-4的表达的显微照片。

【0026】图1F示出表面标记TRA-1-60表达的显微照片。

【0027】图1G示出表面标记TRA-1-81表达的显微照片。

【0028】图2A示出孤雌生殖源的hES细胞的端粒末端转移酶活性分析。500、1000和10000(单位)的提取物被用于进行分析。ΔH-热处理的测试提取物(阴性对照)；阳性对照-端粒末端转移酶阳性细胞；CHAPS-裂解缓冲液；TSR8-对照模板。

【0029】图2B示出孤雌生殖源的hES细胞的胚状体形成的显微照片，9天培养物。

【0030】图2C示出孤雌生殖源的hES细胞的胚状体形成的显微照片，10天培养物。

【0031】图2D说明了孤雌生殖源的hES细胞的核型。

【0032】图2E示出孤雌生殖源的hES细胞的DNA指纹分析的结果。1-来自卵母细胞供体血液的DNA；2-来自源于相同供体的孤雌生殖的hES细胞的DNA；3-来自人饲养成纤维细胞的DNA。

【0033】图3示出表征与基因组印记相关的基因表达的RNA印迹。DNA探针：SNRPN、Peg1_2、Peg1_A、H19、和GAPDH(作为内部对照)。NSF，新生皮肤成纤维细胞；hES，源自受精卵母细胞的人胚胎干细胞系；1，hESC-1；2，phESC-3；3，phESC-4；4，phESC-5；5，phESC-6；6phESC-7。NSF RT-、hES RT-、1RT-是阴性对照。

【0034】图4示出phESC分化为所有三个胚层的衍生物。通过对神经元特异性标记68(A)、NCAM(B)、βIII-微管蛋白(C)和神经胶质细胞标记GFAP(D，M)的阳性免疫细胞化学染色来显示外胚层分化。分化的细胞对下列中胚层标记显示阳性：肌肉特异性的α辐肌动蛋白(G)和结蛋白(J)，内皮标记PECAM-1(E)和VE-钙黏着蛋白。通过对甲胎蛋白(H，L)的阳性染色来显示内胚层分化。phESC产生着色的上皮样细胞(I，K)。放大倍率(I)×100；(A-H，J-M)，×400。

【0035】图5示出phESC系对特异性标记的表征。在人饲养层细胞上的未分化的phESC集落(A-F)，对SSEA-1的阴性染色(G-L)，细胞表面标记SSEA-3(M-R)、SSEA-4(S-X)的表达。放大倍率(A)到(E)×100；(F)×200；(G)到(X)×400。在饲养细胞上的phESC集落(A-F)的碱性磷酸酶阳性染色、OCT-4(G-L)的碱性磷酸酶阳性染色、TRA-1-60(K-R)的碱性磷酸酶阳性染色和TRA-1-81(S-X)的碱性磷酸酶阳性染色。放大倍率(A、B、O、R)×100；(C-F、M、S、X)×200；(G-L、N、P、Q、T-W)×400。

【0036】图6显示与阳性对照细胞相比，phESC细胞具有高水平的端粒末端转移酶活性：“+”——来自500个细胞的提取物；“-”——热处理的细胞提取物，具有灭活的端粒末端转移酶；“对照+”——端粒末端转移酶阳性细胞提取物(与TRAPEZE试剂盒一起应用)；“B”——CHAPS裂解缓冲液，引物-二聚体/PCR污染对照；TSR8-端粒末端转移酶定量控制模板(0.1和0.2amole/μl)；“M”——标记，DNA梯状条带(ladder)。

【0037】图7示出phESC系的G-带状核型。phESC-1(A)、phESC-3(B)、phESC-4(C)、phESC-5(D)和phESC-6(E)系具有正常的46，XX核型。phESC-7系具有47，XXX核型(F)。

【0038】图8示出从源自孤雌激活的人卵母细胞的干细胞获得的人工角膜。

发明详述

【0039】在描述本组合物、方法和培养方法之前，应理解本发明不限于所描述的具体的组合物、方法和实验条件，因为这种组合物、方法和条件可以改变。也应理解本文使用的术语仅仅是用于描述具体实施方式的目的，而不意欲为限制性的，因为本发明的范围将只被所附的权利要求所限制。

【0040】如在本说明书和所附的权利要求中使用的，除非上下文另外明确指出，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”包括复数指代。因此，例如，提及“该方法”包括一种或多种方法，和/或本文描述的类型的步骤，这将在本领域技术人员阅读本公开内容等时变得显而易见。

【0041】除非另外定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员一般理解的含义相同的意义。与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用在本发明的实践或检测中，因为将会理解，修饰和改变包括在本公开的精神和范围之内。本文提到的所有出版物于此通过引用以其全部并入。

【0042】“分化”指变化，所述变化发生在细胞内，引起那些细胞呈现某些特化的功能，并且失去变成某些其它特化的功能单位的能力。能够分化的细胞可以是全潜能的、多潜能的或多能细胞。分化对于成熟成体细胞而言可以是部分的或全部的。

【0043】单雌生殖指产生包含可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎，其在活化细胞如卵母细胞，或其它胚细胞类型时产生，其包括全雌性起源，优选地人雌性起源的哺乳动物DNA，例如人或非-人类灵长类卵母细胞DNA。这种雌性哺乳动物DNA可以被遗传修饰，例如，通过插入、缺失或置换至少一个DNA序列，或可以不修饰。例如，可以通过插入或缺失期望的编码序列，或插入或缺失促进或抑制胚胎发生的序列来修饰所述DNA。典型地，这样的胚胎将通过在体外活化含有全雌性起源DNA的卵母细胞来获得。单雌生殖包括下面定义的孤雌生殖。也包括活化方法，其中精子的DNA没有对活化的卵母细胞中的DNA起作用。

【0044】在相关的方面，卵母细胞从准备IVF的超排卵对象获得。设计用于IVF的“超排卵”技术——例如用激素处理雌性对象——以刺激卵巢产生数个卵(卵母细胞)，而不是如通常在自然周期中的单个卵。

【0045】增加卵产生所需要的药物可以包括，但不限于下列：醋酸亮丙瑞林(Lupron)(促性腺激素释放激素激动剂)、Orgalutran、拮抗剂(Antagon)或西曲肽(Cetrotide)(促性腺激素释放激素拮抗剂)、Follistim、Bravelle或Gonal-F(FSH，促卵泡激素)、Repronex(FSH和LH的组合，黄体生成素)、和泼热尼乐(Pregnyl)或Novarel(hCG，人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotropin))。

【0046】在相关的方面，在经阴道超声(transvaginal ultrasound)引导下进行卵的收集。为了完成该收集，使用超声定位每一卵泡，插入一个针(例如，在IV镇静下)，通过阴道壁进入到卵巢中。将滤泡液吸取到测试管中，以获得卵。

【0047】“孤雌生殖”(“孤雌激活的(parthenogenically activated)”和“孤雌激活的(parthenogentically actived)”可交互使用)是这样的方法，通过该方法卵母细胞活化在没有精子穿入的情况下发生，并且指包含滋养外胚层和内细胞团的早期胚胎的发育，所述早期胚胎通过活化卵母细胞或胚细胞，例如，卵裂球获得，其包括全雌性起源的DNA。在相关的方面，“单性生殖生物(parthenote)”指通过这样的活化所获得的细胞。在另一相关的方面，“胚泡”指受精的或活化的卵母细胞的分裂阶段，其包括由外滋养层细胞和内细胞团(ICM)组成的细胞中空球。在进一步的相关方面，“胚泡形成”是指这样的过程，在卵母细胞受精或活化之后，所述卵母细胞随后在培养基中培养一段时间(例如，5到6天)，以使其能发育成为由外滋养层细胞和ICM组成的细胞中空球。

【0048】“多潜能细胞”指这样的细胞，其来源于活化由包含全雌性或雄性起源的DNA的细胞所产生的胚胎，其可以以未分化的状态在体外保持延长的、理论上无限期的一段时间；其可以产生不同的分化的组织类型，即，外胚层、中胚层和内胚层。细胞的多潜能状态优选地这样保持：通过在适合的条件下培养内细胞团或源自由产雄或产雌方法产生的胚胎的内细胞团的细胞，例如，通过在成纤维细胞饲养层或另外的饲养层或包含白血病抑制因子(LIF)的培养物上培养。这样培养的细胞的多潜能状态可以通过不同的方法来证实，例如，(i)证实具有多潜能细胞特征的标记的表达；(ii)产生嵌合动物，所述动物包含表达多潜能细胞基因型的细胞；(iii)将细胞注入到动物中，例如SCID小鼠，在体内产生不同的分化的细胞类型；和(iv)观察细胞在体外分化(例如，当在没有饲养层或LIF的情况下培养时)成为胚状体和其它分化的细胞类型。

【0049】“二倍体细胞”指这样的细胞，例如具有全雄性或全雌性起源的二倍体DNA内含物的卵母细胞或卵裂球。

【0050】“单倍体细胞”指这样的细胞，例如具有单倍体DNA内含物的卵母细胞或卵裂球，其中所述单倍体DNA为全雄性或全雌性起源。

【0051】“活化(激活)”指这样的过程，其中例如，但不限于，处于减数分裂中期II的受精的或未受精的卵母细胞经历的过程，典型地包括染色单体对的分离，第二极体的伸出，导致卵母细胞具有单倍数目的染色体，每一个具有一套染色单体。活化包括这样的方法，从而包含全雄性或雌性起源DNA的细胞被诱导发育成为具有可辨别的内细胞团和滋养外胚层的胚胎，其被用于产生多潜能细胞但是其本身可能不能发育成为可存活的后代。活化可以在例如下述条件之一下进行：(i)不引起第二极体伸出的条件；(ii)引起极体伸出但是其中所述极体伸出被抑制的条件；或(iii)抑制单倍体卵母细胞的第一次细胞分裂的条件。

【0052】“分裂中期II”指细胞发育的阶段，在该阶段细胞的DNA内含物由单倍体数目的染色体组成，每一染色体由两个染色单体表示。

【0053】在一个实施方式中，通过在不同的氧压气体环境下培养卵母细胞，活化/培养分裂中期II的卵母细胞。在相关的方面，低的氧压气体环境通过包含大约2％、3％、4％或5％的氧浓度的气体混合物产生。在进一步有关的方面，所述气体混合物包括大约5％的CO₂。进一步，所述气体混合物包括大约90％的N₂、91％的N₂或93％的N₂。该气体混合物与5％的CO₂的空气不同，后者为大约5％的CO₂、20％的O₂和75％的N₂。

【0054】“氧压(O₂压)”指流体(即液体或气体)中氧的分压(气体混合物的单一组分施加的压力)。低压是氧分压(pO₂)低，高压是pO₂高。

【0055】“确定成分培养基条件”指用于培养细胞的环境，在其中最佳生长需要的成分的浓度被详述。例如，取决于细胞的用途(例如，治疗应用)，从包含异种蛋白质的条件除去细胞是重要的；即，培养条件是不含动物的条件或不含非—人动物蛋白质。在相关的方面，“体外受精(IVF)培养基”指包含化学成分限定的物质的营养系统，受精的卵母细胞可以在所述营养系统之上或之中生长。

【0056】“细胞外基质(ECM)基底”指支持最佳生长的细胞下的表面。例如，这种ECM基底包括但不限于，基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白、明胶和纤连蛋白基底。在相关的方面，这种基底可以包括胶原IV、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan)，包括各种生长因子(例如，bFGF、表皮生长因子、胰岛素样生长因子—1、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor)、神经生长因子和TGF-β-1)。

【0057】“胚胎”指活化细胞例如，卵母细胞或其它胚细胞产生的胚胎，所述细胞包含全雄性或全雌性起源的DNA，其任选的可以是修饰的，所述胚胎包括可辨别的滋养外胚层和内细胞团，其不能产生可存活的后代，并且其中所述DNA是全雄性或全雌性起源。包含在其中的内细胞团或细胞用于产生如前面所定义的多潜能细胞。

【0058】“内细胞团(ICM)”指产生胎组织的胚胎的内部部分。本文中，这些细胞被用于体外提供多潜能细胞的持续来源。进一步，所述ICM包括由单雄生殖或单雌生殖产生的胚胎的内部部分，即，活化包含全雄性或雌性起源的DNA的细胞产生的胚胎的内部部分。这种DNA，例如，将是人DNA，例如，人卵母细胞或精子的DNA，其可以被遗传修饰或可以没有被遗传修饰。

【0059】“滋养外胚层”是指产生胎盘组织的早期胚胎的另一部分，包括由单雄生殖或单雌生殖产生的胚胎的组织，即，活化包含全雄性或雌性起源的DNA的细胞，例如人卵巢或精子而产生的胚胎的组织。

【0060】“分化的细胞”是指非胚细胞，其具有特定的分化，即，非胚胎的状态。三种最早分化的细胞类型是内胚层、中胚层和外胚层。

【0061】“基本上相同的(基本上同一的)”指对于特定特征的一致性的特性，所述特定特征非常接近以至于在测量差异的能力内基本上相同(例如，通过HLA分型、SNP分析和类似的方法)。

【0062】“组织相容的”指生物耐受外源组织的移植物的程度。

【0063】“基因组印记”指这样的机制，通过该机制，整个基因组的许多基因根据它们的母本起源单等位基因表达。

【0064】“人工的(合成的)”指对象的特性，所述对象是通过所规定的人工操作来产生。

【0065】“同型异源性”包括其语法上的变化，指在细胞或个体内存在相同类型的线粒体DNA(mtDNA)。

【0066】“异质性”包括其语法上的变化，指在细胞或个体内存在一种类型以上的线粒体DNA(mtDNA)的混合物。

【0067】“单亲的”指一个或多个细胞或个体，其中另外一个细胞或个体通过其产生并且对其保持是辅助性的(辅卫性的，subsidiary)。

【0068】“机械分离”指通过物理力量分离细胞团聚体的方法。例如，这样的方法将排除可能包含非人类物质的酶(或其它细胞裂解产物)的使用。

【0069】在一个实施方式中，干细胞可以通过本领域已知的方法产生，例如，但不限于，如由Thomson(参见，例如美国专利第7,029,913号、美国专利第6,200,806号、美国专利第6,887,706号、美国专利第5,843,780号)、Uchida(参见，例如，美国专利第7,083,977号、美国专利第7,049,141号)、Carpenter(参见，例如，美国专利第6,777,233号)、Anderson等人(参见例如，美国专利第5,589,376号)、Hogan(参见，例如，美国专利第5,453,357号)、Naktsuji等人(参见，例如，美国专利第7,083,977号)和Khilian(参见例如，美国专利第5,449,620号)所描述的的方法，其于此通过引用以其全部并入。在一方面，视网膜干细胞通过本领域已知的方法(参见，例如美国专利第6,117,675号)获得。

【0070】在另一实施方式中，干细胞从孤雌激活的人卵母细胞产生。在一方面，从源自孤雌激活的人卵母细胞的干细胞分化的视网膜干细胞获得人工角膜。

【0071】在另一方面，本发明的人工角膜可以用作替换品，用于患有屈光不正(refractive error)的对象，如近视的、远视的或患有散光的那些对象。屈光不正发生在角膜的曲线为不规则形状时(过高或过平)。

【0072】角膜是覆盖虹膜、瞳孔和前房的唯一的、透明的结构，提供了眼睛的光强度的大部分。与晶状体一起，角膜折射光，结果，帮助聚焦。与晶状体相比，角膜对于总的折射起更大的作用，尽管可以调整晶状体的弯曲以“调节”焦点，而角膜的弯曲是固定的。角膜没有血管，其营养是通过来自泪液、房水、和神经营养蛋白的扩散而获得的，所述神经营养蛋白由使之受神经支配的神经纤维供应。因此，例如，这些液体循环的障碍或炎症过程在角膜异常的发病机理中起重大作用。

【0073】角膜主要由致密的结缔组织构成。然而，胶原纤维以平行方式排列，使光波结构性地干涉(constructively interfere)，因而允许光相对不受阻碍的通过。

【0074】与角膜的老化相关的变化包括混浊度增加，前表面弯曲增加以及可能的折射率分布的变化。各种眼屈光手术技术改变角膜的形状，以便减少矫正晶状体的需要或以其它方式提高眼的屈光状态。在许多技术中，通过使用准分子激光的光消融(光切除，photoablation)进行角膜的再成形。

【0075】如果角膜基质发展为视觉上显著的混浊度、不规则或水肿，可以移植尸体供体的角膜。因为角膜中没有血管，其可相对地避开免疫反应，因而，捐赠的角膜的排斥发生相对低(大约20％)。

【0076】也有人工角膜(synthetic)(人工角膜(keratoprotheses))，然而，这些角膜一般是的塑料插入物或可以由生物相容的合成材料组成，其促进组织向内生长到人工角膜中，因而促进了生物结合(biointegration)。可选地，矫正角膜学(orthokeratology)提供了使用专门的硬的或刚硬的气体可透过的隐形眼镜，以使所述角膜瞬时再成形，从而改善了眼睛的屈光状态或减少了对眼镜和隐形眼镜的需要。

【0077】角膜具有对触摸、温度和化学品敏感的无髓鞘的神经末梢；触摸角膜可引起非条件反射而闭合眼睑。因为透明度是最重要的，所以角膜没有血管；其通过从外面的泪液和里面的房水以及还从由使之受神经支配的神经纤维供应的神经营养蛋白的扩散而获得营养。在人类，角膜具有大约11.5毫米的直径，并且具有在中央为0.5毫米-0.6毫米而在外围为0.6毫米-0.8毫米的厚度。在人类，角膜的折光力是大约43屈光度，粗略地为眼睛的总的折光力的四分之三。透明、无血管和免疫豁免(immunologic privilege)使角膜成为特殊的组织。

【0078】角膜组织排列为5个基本层：上皮、鲍曼氏层(Bowman’s layer)、间质、德斯密氏膜(Descemet’s membrane)和内皮，每一层具有不同的功能。上皮是角膜的最外层，占组织厚度的大约10％。上皮主要的功能：(1)阻止外来物质，如灰尘、水和细菌进入到眼睛和角膜的其它层；和(2)提供吸收来自眼泪的氧和细胞营养的平滑表面，然后将这些营养物分送到角膜的其它部分。上皮充满了数以千计的微小神经末梢，所述神经末梢使角膜对在其被摩擦或刮擦时的疼痛非常敏感。充当基底的上皮部分被称为基底膜，在所述基底上，上皮细胞自己固定并组构。

【0079】直接位于上皮的基底膜下的是被称为鲍曼氏层的透明薄片。其由坚固分层的蛋白(胶原)纤维构成。一旦受到损害，鲍曼氏层在其痊愈时可形成疤痕。如果这些疤痕较大并且位于中心，则可能发生一些视觉丧失(vision loss)。

【0080】鲍曼氏层之下是间质，其占角膜厚度的90％。其主要由水(78％)和胶原(16％)组成，并且不含任何血管。胶原给予角膜其强度、弹性和形态。胶原的独特形状、排列和间隔在产生角膜的光导透明度方面是重要的。

【0081】在间质下面的是德斯密氏膜，一个薄的但是坚固的组织片，其充当对抗感染和损伤的保护屏障。德斯密氏膜由胶原纤维(与间质的那些纤维不同)构成并且由位于其下的内皮细胞产生。德斯密氏膜在损伤之后容易再生。

【0082】内皮非常薄，是角膜的最里层。内皮细胞对于保持角膜透明是重要的。通常地，液体从眼睛的内部缓慢的漏出，进入到中间的角膜层(间质)。内皮的主要任务是将这种过多的液体泵出间质。如果没有这种泵作用，间质将由于水而膨胀，变得模糊并且最终不透明。一旦内皮细胞被疾病或损伤破坏，它们将永远失去。如果太多的内皮细胞被破坏，则接着发生角膜水肿和失明，而角膜移植是唯一可用的疗法。

【0083】人角膜蛋白质组已经被表征。当鉴定的免疫球蛋白链和补体C3被包括在内时，大约52％(54个中的28个)的角膜胞外蛋白质是普通的血浆蛋白质。该组角膜蛋白质也包括不同的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III)、α1-微球蛋白、不同的载脂蛋白、凝血因子I、触珠蛋白、血红素结合蛋白、白蛋白、淀粉状P-成分、四连蛋白、运铁蛋白、运甲状腺素蛋白和维生素D结合蛋白。因此，这些蛋白质或是由角膜细胞合成或是从血液起源并且跟随来自位于角膜巩膜缘区域(corneoscleral limbus area)的睫状动脉的总体流动进入角膜。

【0084】当角膜弯曲太大时，远处的物体将显得模糊，这是因为它们在视网膜之前聚焦，即近视(myopia)或近视(nearsightedness)。近视影响了25％的成年人。远视(hyperopia)或远视(farsightedness)，与近视相反。远处的物体是清楚的，而物体接近时变得模糊(即，图像聚焦在视网膜后的点上)。散光是这样的病症，其中角膜的不均匀弯曲使远处和近处的物体都变得模糊并且扭曲。在散光中，角膜形状象调羹的背面，在一个方向比在另一个方向更弯曲。这使光线具有一个以上的焦点，并且在视网膜的两个独立的区域上聚焦，扭曲了视觉图像。患有近视的三分之二的成年人也患有散光。

【0085】屈光不正通常通过眼镜或隐形眼镜来矫正。尽管屈光手术正成为越来越受欢迎的选择。

【0086】影响角膜的另外的病症包括但不限于，变态反应、结膜炎、角膜感染、干眼、角膜上皮营养不良(Fuchs’dystrophy)、带状疹疱、虹膜角膜内皮综合症、圆锥形角膜、角膜网络状营养不良(lattice dystrophy)、角膜地图状-点状-指纹状营养不良症(map-dot-fingerprint dystrophy)、眼部疹疱(ocularherpes)、多型性渗出性红斑粘膜水泡性病变(Stevens-Johnson syndrome)、翼状胬肉、角膜炎、角膜溃疡、角膜磨损、雪盲、电光性眼炎、锡格森浅层点状角膜病变(Thygeson’ssuperficial puncate keratopathy)和干性角膜结膜炎(keratpconjunctivitis sicca)。

【0087】如本文所用的，“角膜移植”、“角膜移植物”或“全层角膜移植术”指用角膜组织替换损伤的或患病的角膜的外科手术方法。在角膜移植手术中，外科医生除去患病的或损伤的角膜的中心部分并且用透明的角膜替换它。新的角膜被放置在开口处并且被缝合到眼睛上(见，例如，Rapuano等人，Anterior Segment，TheRequisites(Requisites in Ophthalmology)，1999，Mosby，Inc.，Philadelphia，PA)。大约20％的角膜移植患者排斥它们的供体角膜。在本发明的一个方面，人工角膜的接受者是角膜从其来源的卵母细胞的供体。同样地，组织排斥的可能性被降到最低。【0088】在一个实施方式中，使用人工角膜置换眼睛的角膜的方法包括：从眼睛手术切除角膜，将人工角膜插入到除去角膜的区域中，并且使人工角膜与所述切除下面的组织连接，以将人工角膜固定到眼睛。

【0089】在相关的方面，所述方法包括：分离角膜的部分外表面，从而形成角膜瓣(corneal flap)和角膜床(corneal bed)，所述角膜瓣具有前表面和后表面，所述角膜床具有成型的前表面，将人工角膜植入角膜床上，所述角膜具有前表面和后表面，和替换分离的角膜部分。

【0090】在另一实施方式中，应用本发明的人工角膜，将有效量的剂输送到对象的眼睛的方法包括：用核酸载体转化一部分包含人工角膜的细胞，其中所述载体编码所述剂，鉴定包含所述人工角膜的细胞群，所述细胞群表达所述核酸编码的剂，并且用人工角膜的转化细胞替换对象的角膜细胞，其中替换细胞输送所述剂到对象的眼睛。

【0091】在相关的方面，替换步骤包括用人工角膜替换对象的角膜。在进一步相关的方面，所述对象可以是驯养家畜，包括猫和狗。进一步，所述对象可以是人。

【0092】在天然环境中，来自卵巢的未成熟的卵母细胞(卵)经历成熟过程，其导致了通过减数分裂向减数分裂的分裂中期II的前进。然后，所述卵母细胞停滞在分裂中期II。在分裂中期II，细胞的DNA内含物由单倍体数目的染色体组成，每一染色体由两个染色单体来表示。

【0093】这种卵母细胞可以通过例如但不限于，用显微注射糖，进行冷藏来无限期维持。

【0094】在一个实施方式中，提供了从冷藏的卵母细胞产生人干细胞的方法，包括将深低温保藏剂显微注射到卵母细胞的细胞质中，将卵母细胞冷冻至低温以引起其进入休眠状态，储存处于休眠状态的卵母细胞，解冻所述卵母细胞，在高的氧压下孤雌激活所述卵母细胞，从活化的卵母细胞分离内细胞团(ICM)，并且在人饲养细胞层上培养ICM细胞，其中培养在低的氧压下进行。

【0095】在一方面，如所述获得的卵母细胞被转移到覆盖有胚胎测试的矿物油(embryo-tested mineral oil)(Sigma)或任何其它的合适培养基的改良的等张IVF。如果需要，所述卵母细胞可以与细胞外糖一起温育，所述细胞外糖的浓度与计划用于显微注射的量相同。例如，为了注射0.1M糖，卵母细胞可以在具有0.1M糖的DMEM/F-12中平衡。在一方面，深低温保藏剂包括比标准DMEM更低的Na⁺浓度(即，低Na⁺培养基)。在相关的方面，深低温保藏剂包括比标准DMEM更高的K⁺浓度(即，高K⁺培养基)。在进一步相关的方面，深低温保藏剂包括比标准DMEM更低的Na⁺浓度和更高的K⁺浓度(低Na⁺/高K⁺培养基)。在一方面，深低温保藏剂包括有机缓冲液，其包括但不限于HEPES。在另一方面，深低温保藏剂包括抑制凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶(capases))的部分。

【0096】可选地，卵母细胞可以任选地用任何其它的基本上非透过性的溶质，如NaCl来平衡，以在显微注射前减小它们的细胞体积。与显微注射之前没有在高渗培养基中温育的卵母细胞相比，这种细胞体积的最初减小可以导致显微注射的卵母细胞的终体积较小。这种较小的终体积可以最小化来自卵母细胞膨胀的任何潜在不良作用。这种制备用于显微注射的细胞的一般方法也可以用于其它细胞类型(例如，活化的卵母细胞、hES细胞和类似的细胞)。

【0097】然后，用深低温保藏剂显微注射卵母细胞。显微注射设备和方法已经在本领域被很好地表征，并且已知用于将小分子注射到细胞中的显微注射设备可以用于本发明。在示例性的显微注射步骤中，可以在10psi的压力下显微注射卵母细胞30毫秒。标准显微注射技术的另一例子是Nakayama和Yanagimachi(NatureBiotech.16：639-642，1998)描述的方法。

【0098】用于本方法的深低温保藏剂包括具有防冻特性并且通常是非透过性的任何化学品。特别是，深低温保藏剂可以包括单独的糖或与其它传统的深低温保藏剂一起混合的糖。糖类如海藻糖、蔗糖、果糖和棉子糖，可以以小于或等于大约1.0M的浓度，并且更优选地，小于或等于大约0.4M的浓度被显微注射。在一方面，浓度在0.05和0.20M之间，包括0.05和0.20M。此外，可以在储存之前加入细胞外糖或传统的深低温保藏剂。如果在显微注射前将细胞在高渗溶液中温育，那么在显微注射后可以使基本上非透过性的溶质保留在培养基中，或可以通过用包含较低浓度的这种溶质或不含这种溶质的培养基洗涤细胞来从培养基中除去。

【0099】平常不能透过细胞膜的某些糖或多糖——因为它们太大而不能穿过膜——对于深低温保藏的目的而言具有优越的生理化学和生物学特性。虽然这些糖平常自己不能透过细胞膜，但是，使用所述方法，这些平常非透过性糖可以被显微注射到细胞内以产生有益的效果。

【0100】在本方法中被特别用作深低温保藏剂、对细胞具有稳定或保存作用的非-透过性糖包括：蔗糖、海藻糖、果糖、右旋糖苷和棉子糖。在这些糖中，已经显示葡萄糖的非还原二糖海藻糖，在低浓度下在稳定细胞结构方面特别有效。添加细胞外糖酯或糖蛋白也可以稳定细胞膜。

【0101】在显微注射深低温保藏剂之后，制备储存细胞。多种冷冻和/或干燥的方法可被用于制备储存细胞。特别是，本文描述三种方法：真空或空气干燥、冷冻干燥和冻融方法。干燥方法具有这样的优点，稳定的生物物质可以被运输并且储存在环境温度下。

【0102】典型地，在投入用于储存的液氮中之前，负载有1至2M DMSO的卵母细胞以非常低的冷却速率(0.3至0.5℃/分钟)冷却到中间温度(-60℃至-80℃)。然后，样品可以在此温度储存。

【0103】然后，悬浮的物质可以被储存在深低温保藏温度，例如，通过将小瓶留在液氮(LN₂)中保持期望的时间来实现。

【0104】用于真空或空气干燥和用于冷冻干燥蛋白质的方案在本领域内被很好地表征(Franks等人，＂Materials Science and the Production of Shelf-Stable Biologicals，＂BioPharm，October 1991，p.39；Shalaev等人，＂Changes in the Physical State of ModelMixtures during Freezing and Drying：Impact on Product Quality，＂Cryobiol.33，14-26(1996))，并且这些方案可以用于制备储存用的细胞悬浮液，如方法所述。除了空气干燥，可以用于从细胞悬浮液中除去水的其它对流干燥方法包括氮气或其它气体的对流流动。

【0105】用于本发明的方法的示例性真空蒸发干燥方案可以包括：将20μl的每一样品放置到12孔板上的孔中并且在环境温度下真空干燥2小时。当然，可以使用其它的干燥方法，包括在小瓶中干燥细胞。以这种方式制备的细胞可以干燥储存，并且通过在DMEM或任何其它合适的培养基中稀释再水合。

【106】本发明的使用冷冻干燥制备储存细胞的方法以冷冻细胞悬浮液开始。虽然可以使用现有技术的冷冻方法，但是用于冻融方法的、此处描述的简单的投入冷冻方法也可以用于冷冻干燥方法中的冷冻步骤。

【107】冷冻之后，可以应用两阶段的干燥过程。在第一阶段，加入升华的能量以使冷结的水蒸发。第二步干燥在样品中的纯结晶冰已经升华之后进行。冷冻干燥的细胞可以被储存并且以如上所述用于真空干燥的同样方式水合。然后活的细胞可以被恢复。

【108】在细胞从冷冻的或干燥的状态恢复之后，可以任选地从培养基中除去任何外来的深低温保藏剂。例如，所述培养基可以通过加入相应的具有较低浓度的深低温保藏剂的培养基来稀释。例如，恢复的细胞可以在包含低于用于细胞储存的糖浓度的培养基中温育大约5分钟。对于这种温育，所述培养基可以包括与用作深低温保藏剂的糖相同的糖；不同的深低温保藏剂，如半乳糖；或任何其它基本上不透过性的溶质。为了最小化由培养基的渗透性(osmolarity)的降低诱导的任何渗压震扰，可以通过多次进行该稀释步骤，缓慢降低细胞外的深低温保藏剂的浓度，其中每次用更低浓度的深低温保藏剂进行。可以重复这些稀释步骤直到没有细胞外深低温保藏剂存在，或直到深低温保藏剂的浓度或所述培养基的渗透性减少到期望的水平。

【0109】孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和自体干细胞可以以这样的方式被储存或“存储(banked)”，所述方式允许细胞当将来需要时复苏。孤雌激活的卵母细胞和自体干细胞的等分试样可以在任何时刻被移出，以生长成许多未分化的细胞培养物并且随后分化为特定的细胞类型或组织类型，然后可以被用于治疗对象的疾病或替换机能障碍组织。由于细胞是从供体孤雌生殖来源的，所以可以储存细胞，以使个体或近亲能够在延长的时间段内使用细胞。

【0110】在一个实施方式中，提供了用于储存孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品的细胞库(cell bank)。在另一实施方式中，提供了管理这种细胞库的方法。美国公布的专利申请第20030215942号，提供了干细胞库系统的例子，其于此通过引用被完整并入。

【0111】应用如上所述的方法，孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品的分离和体外增殖以及它们的深低温保藏法促进了可移植的人干细胞“库”的建立。因为储存更小等分的细胞是可能的，所以该存储方法可占据相对小的空间。因此，可以在短期或长期的基础上以相对较小的花费储存或“存储”许多个体的细胞。

【0112】在一个实施方式中，在处理和储存之前或之后，使一部分样品可用于检测。

【0113】本发明还提供了记录孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品的方法，以在当需要确定样品位置时，可以容易地检索它。任何索引和检索系统可以用于实现该目标。可以使用任何合适类型的存储系统，以使孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品可以被储存。可以设计样品以储存单个的样品，或可以设计样品以储存数以百计、千计甚至百万计的不同细胞样品。

【0114】储存的孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品可以被索引，用于可靠和精确的检索。例如，可以用字母数字编码、条形码、和任何其它方法或它们的组合来标记每一样品。还可以有易获得(易访问)的和可读的信息表，以能够确定每一孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品和其在库中的位置，并且能够鉴定细胞样品的来源和/或类型，其不在库内。这种索引系统可以以在本领域已知的任何方式来管理，例如人工或非人工管理，例如，可以使用计算机和传统的软件。

【0115】在一个实施方式中，使用检索系统组织细胞样品，以使所述样品在供体需要使用时是可用的。在其它实施方式中，细胞样品可以被与原始供体有关系的个体使用。一旦被记载到索引系统中，可以使细胞样品可用于匹配目的，例如，匹配程序将鉴别具有匹配类型信息的个体，而所述个体将具有被提供匹配样品的选择权。

【0116】储存库系统可以包括用于储存与多个个体和多个细胞样品相关的多个记录的系统。每一个记录可以包括与细胞样品或特定个体相关的类型信息、基因型信息或表型信息。在一个实施方式中，所述系统将包括交叉匹配表，所述表将样品的类型与希望得到样品的个体的类型匹配。

【0117】在一个实施方式中，数据库系统储存了库中每一孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品的信息。特定信息与每一样品关联储存。所述信息可以与特定的供体相关，例如，供体身份和供体病史。例如，每一样品可以是HLA分型的，并且HLA分型信息可以与每一样品关联储存。储存的信息也是可用性信息。与每一样品一起储存的信息是可检索的，并且以这样的方式鉴定样品：其可以立即被定位并且提供给委托人。

【0118】因此，本发明的实施方式利用基于计算机的系统，所述系统包括信息如供体、提交日期、提交的细胞类型、存在的细胞表面标记的类型、与供体相关的遗传信息或其它相关信息，和储存细节如维持记录和储存的样品的位置，以及其它有用的信息。

【0119】术语“基于计算机的系统”指硬件、软件和任何用于储存、查找和检索关于储存细胞的信息的数据库。基于计算机的系统优选地包括上面描述的存储介质和用于访问和操作数据的处理器。本实施方式的基于计算机系统的硬件包括中央处理器(CPU)和数据库。技术人员可以容易理解任何一种目前可用的的基于计算机的系统都是合适的。

【0120】在一个实施方式中，计算机系统包括与连接到主存储器(优选地作为RAM实施)的数据传送总线连接的处理器，和多种二级存储设备，如硬盘驱动器和可移动媒体存储设备。所述可移动媒体存储设备可以是，例如，软盘驱动器、DVD驱动器、光盘驱动器(optical disk drive)、光盘驱动器(compact disk drive)、磁带驱动器等。在其中包含控制逻辑和/或记录的数据的可移动存储媒体，如软盘、光盘、磁带等可以被插入到可移动存储设备中。计算机系统包括适合的软件，用于当插入在可移动媒体存储设备中时，读取可移动媒体存储设备的控制逻辑和/或数据。与孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品相关的信息可以以熟知的方式存储在主存储器、任何二级存储设备和/或可移动的存储媒体中。在执行过程中，用于访问和处理这些数据的软件(例如搜索工具、比较工具等)驻留在主存储器中。

【0121】如本文所用的，“数据库”指可以存储任何与孤雌激活的卵母细胞和/或自体干细胞收集和供体相关的有用信息的存储器。

【0122】与孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞相关的数据可以以多种格式在多种数据处理程序中存储和操作。例如，可以以本领域技术人员熟悉的多种数据库程序如DB2、SYBASE或ORACLE，将数据在文字处理文件如Microsoft WORD或WORDPERFECT，ASCII文件，html文件或pdf文件中存储为文本。

【0123】“搜索程序”指在基于计算机的系统上实施以搜索细节或比较数据库内与深低温保藏的样品相关的信息的一个或多个程序。“检索程序”指可以在基于计算机的系统上实施以鉴定数据库中目的参数的一个或多个程序。例如，检索程序可以用于找出符合特定特征(profile)的样品，具有特异性标记或DNA序列的样品，或找出相应于特定个体的样品的位置。

【0124】可以储存在一个细胞库中的细胞样品的数目没有上限。在一个实施方式中，来自不同个体的数以百计的产物将被储存在一个库或存储设备中。在另一实施方式中，可达数以百万计的产物可以被储存在一个存储设备中。可以使用单一存储设备储存孤雌激活的卵母细胞和/或自体干细胞样品，或者可以使用多个存储设备。

【0125】在本发明的一些实施方式中，存储设备可以具有用于组织和索引存储细胞样品的任何方法的手段，如，例如，自动化机器人检索机制和细胞样品操作机制。该设备可以包括用于处理细胞样品的显微操作装置。已知的传统技术可以用于有效的储存和检索细胞样品。示例性的技术包括但不限于，机器视觉(MachineVision)、机器人技术、自动导引车系统(Automated Guided Vehicle System)、自动存储和检索系统(Automated Storage and Retrieval Systems)、计算机集成制造(Computer Integrated Manufacturing)、计算机辅助工艺规划(Computer AidedProcess Planning)、统计过程控制(Statistical Process Control)和类似的技术。

【0126】与需要样品的个体相关的类型信息和其它信息可以被记录到系统中，所述系统可以用于鉴定适合的匹配产物，如，例如，数据库系统、索引系统和类似的系统。一旦被记录在系统中，可以进行个体类型和供体细胞样品之间的匹配。在优选的实施方式中，供体样品来自与需要该样品的个体相同的个体。然而，还可以使用相似但不相同的供体/受体匹配。匹配的样品可用于拥有匹配类型标识符(identifier)的个体。在本发明的一个实施方式中，个体身份信息与细胞样品关联储存。在一些实施方式中，匹配过程大约在收集样品的时间进行，或可以在处理、储存过程中的任何时刻进行，或在需要出现时进行。因此，在本发明的一些实施方式中，匹配过程在个体真正需要细胞样品之前进行。

【0127】当个体需要孤雌激活的卵母细胞、胚泡、ICM和/或自体干细胞样品时，如果需要的话，可以在数分钟内进行检索并且用于研究、移植或其它的目的。样品还可以被进一步处理以使其准备用于移植或其它需要。

【0128】通常，卵母细胞在此阶段排卵并且由精子受精。精子在被称为活化的过程内启动了减数分裂的完成。在活化期间，染色单体对分离，第二极体伸出，并且卵母细胞保留了单倍体数目的染色体，每一染色体具有一个染色单体。精子提供了另一互补单倍体染色体以利用单一染色单体得到完全的二倍体细胞。然后染色体进入第一个细胞周期中的DNA合成。这些细胞然后发育成胚胎。

【0129】相反地，本文描述的胚胎是由细胞，典型地为哺乳动物卵母细胞或卵裂球的人工活化发育而来，所述卵母细胞或卵裂球包含全雄性或雌性起源的DNA。如在本发明的背景中所讨论的，文献中已经报导了许多人工活化未受精的卵母细胞的方法。这些方法包括：物理方法，例如，机械方法如刺(pricking)、操作或培养卵母细胞，热方法如冷却和加热，重复电脉冲，酶处理如胰蛋白酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶，渗透处理，离子处理如使用二价阳离子和钙离子载体，如离子霉素和A23187，应用麻醉剂如醚、乙醇、丁卡因、利多卡因、普鲁卡因、吩噻嗪，安定剂如甲硫哒嗪、三氟啦嗪、氟奋乃静、氯丙嗪，使用蛋白质合成抑制剂如放线菌素酮、嘌呤霉素，使用磷酸化抑制剂例如，蛋白激酶抑制剂如星形孢菌素(staurosporine)、2-氨基嘌呤、鞘胺醇(shingosine)和DMAP，它们的组合以及其它的方法。

【0130】这样的活化方法在本领域中是熟知的并且在美国专利第5,945,577号中讨论，于此通过引用并入。

【0131】在一个实施方式中，处于分裂中期II的人细胞，典型地是包含全雄性或雌性起源的DNA的卵母细胞或卵裂球，被人工活化，用于实现卵母细胞的人工活化。

【0132】在相关的方面，活化的细胞——例如，卵母细胞，其是二倍体——被允许发育成包含滋养外胚层和内细胞团的胚胎。这可以使用已知的促进胚泡发育的方法和培养基实现。

【0133】在雌核发育胚胎(gynogenetic embryo)被培养产生可辨别的滋养外胚层和内细胞团之后，内细胞团的细胞随后被用于产生期望的多潜能细胞系。这可以通过将源自内细胞团的细胞或整个内细胞团转移到抑制分化的培养物上来实现。这可以通过将内细胞团细胞转移到抑制分化的饲养层或产生LIF的其它细胞上来实现，所述饲养层例如，成纤维细胞或上皮细胞，如源自出生后的人组织等的成纤维细胞。可以使用其它的因子/成分，以提供将细胞维持在未分化的状态的适合的培养条件，其包括但不限于，加入条件培养基(Amit等人，Developmental Biol(2000)227：271-278)、bFGF和TGF-β1(含有或没有LIF)(Amit等人，Biol Reprod(2004)70：837-845)、活化gp130/STAT3途径的因子(Hoffman和Carpenter，NatureBiotech(2005)23(6)：699-708)、活化PI3K/Akt、PKB途径的因子(Kim等人，FEBSLett(2005)579：534-540)、骨形态发生蛋白(BMP)超家族的成员的因子(Hoffnan和Carpenter(2005)，上述)、和活化规范/β-联蛋白(canonical/β-catenin)Wnt信号通路的因子(例如，GSK-3-特异性抑制剂，Sato等人，Nat Med(2004)10：55-63)。在相关的方面，这样的因子可以包括含有饲养细胞和/或ECM基底的培养条件(Hoffman和Carpenter(2005)，在上)。

【0134】在一方面，内细胞团细胞被培养在人出生后的包皮或皮肤成纤维细胞或其它产生白血病抑制因子的细胞上，或在白血病抑制因子的存在下培养。在相关的方面，在用ICM接种之前，灭活饲养细胞。例如，可以使用抗生素使所述饲养细胞有丝分裂灭活。在相关的方面，所述抗生素可以是但不限于，丝裂霉素C。

【0135】培养将在这样的条件下实现，所述条件使细胞长时期，理论上无限期地保持在未分化的、多潜能的状态。在一个实施方式中，在高氧压下用钙离子载体孤雌激活卵母细胞，之后在低氧压下使卵母细胞与丝氨酸—苏氨酸激酶抑制剂接触。从孤雌激活的卵母细胞产生的ICM被在高氧压下培养，其中例如，使用包含20％ O₂的气体混合物维持所述细胞。在一方面，可培养的指能够或适合于培养。在相关的方面，在胚泡培养4天之后，机械地进行ICM分离，其中所述培养在饲养细胞上进行。这样的培养，例如，不需要应用源自动物源的物质，如对于免疫外科法(immunosurgery)是这种情况。

【0136】在相关的方面，ICM培养基被补充有非—动物血清，包括但不限于，人脐带血清，其中所述血清存在于成分确定培养基中(例如，IVF，从MediCult A/S，Denmark、Vitrolife，Sweden、或Zander IVF，Inc.，Vero Beach，FL可获得)。在另一方面，所提供的培养基和过程不含动物产品。在相关的方面，动物产品是这些产品，包括血清、干扰素、趋化因子、细胞因子、激素和生长因子，它们来自非-人来源。

【0137】通过本发明产生的细胞的多潜能状态可以通过多种方法来证实。例如，可以测试细胞存在或不存在特征ES细胞标记。在人ES细胞的情况下，这些标记的例子如上鉴定，包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60和TRA-1-81，并且在本领域内是已知的。

【0138】同样，多潜能性可以通过将细胞注射到合适的动物，例如，SCID小鼠中并且观测分化的细胞和组织的产生来确定。确定多潜能性的另一方法是应用目标多潜能细胞产生嵌合动物并且观测被引入的细胞对不同细胞类型的作用。产生嵌合动物的方法在本领域内是熟知的并且被描述在美国专利第6,642,433号中，于此通过引用并入。

【0139】而确定多潜能性的另一方法是当在促进分化的条件(例如，除去成纤维饲养层)下培养时，观察ES细胞分化为胚状体和其它分化的细胞类型。这种方法已经被使用，并且已经确认目标多潜能细胞在组织培养中产生胚状体和不同的分化细胞类型。

【0140】得到的多潜能细胞和细胞系，优选地为人多潜能细胞和细胞系——其源自全雌性起源的DNA，具有许多治疗和诊断应用。这样的多潜能细胞可以在许多疾病病症的治疗中被用于细胞移植疗法或基因疗法(如果被遗传修饰的话)。

【0141】在这方面，已知小鼠胚胎干(ES)细胞能够分化为几乎任何细胞类型，例如，造血干细胞。因此，根据本发明产生的人多潜能(ES)细胞应该具有类似的分化能力。根据已知的方法，诱导本发明的多潜能细胞分化以获得期望的细胞类型。例如，根据本发明产生的人ES细胞可以被诱导分化为造血干细胞、肌肉细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、视网膜细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞等，其是通过在分化培养基中和在提供细胞分化的条件下培养这样的细胞进行的。导致ES细胞分化的培养基和方法在本领域内称为合适的培养条件。

【0142】例如，Palacios等人，Proc.Natl Acad.Sci.，USA，92：7530-7537(1995)教导了通过使干细胞经受诱导方法从胚胎细胞系产生造血干细胞，所述诱导方法包括最初在缺乏视黄酸的悬浮培养基中培养这种细胞的集合体(aggregate)，然后在含有视黄酸的相同培养基中培养，之后将细胞集合体转移到可提供细胞附着的基底上。

【0143】而且，Pedersen，J.Reprod.Fertil.Dev.，6：543-552(1994)是一篇引用了许多文章的综述文章，其公开了胚胎干细胞在体外分化以产生不同的分化细胞类型的方法，所述细胞类型包括造血细胞、肌肉、心肌、神经细胞等等。

【0144】进一步，Bain等人，Dev.Biol.，168：342-357(1995)教导了胚胎干细胞在体外分化以产生具有神经元特性的神经细胞。这些参考文献是所报导的从胚细胞或干细胞获得分化细胞的方法的示例。这些参考文献，特别是其中与胚胎干细胞分化方法相关的公开内容于此通过引用以其全部并入。因此，应用已知的方法和培养基，本领域技术人员可以培养目标ES细胞——包括遗传工程的或转基因的ES细胞——以获得期望的分化细胞类型，例如，神经细胞、肌肉细胞、造血细胞等。通过本文描述的方法产生的多潜能细胞可以用于获得任何期望的分化细胞类型。分化的人细胞的治疗使用是无与伦比的。例如，人造血干细胞可以用于需要骨髓移植的医疗中。这种方法被用于治疗许多疾病，例如，晚期癌如卵巢癌和白血病，以及危害免疫系统的疾病，如AIDS。例如，可以通过将源自雄性或雌性癌症患者或AIDS患者的雄性或雌性DNA与无核的卵母细胞合并，获得如上所述的多潜能细胞，并且在促进分化的条件下培养这种细胞，直到获得造血干细胞。这种造血细胞可以用于治疗包括癌和AIDS在内的疾病。

【0145】可选地，通过在产生神经细胞系的分化条件下培养目标多潜能细胞，多潜能细胞可以用于治疗患有神经障碍的患者。通过移植这种人神经细胞可治疗的具体疾病包括，例如，帕金森氏病(Parkinson′s disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、ALS和脑瘫等等。在帕金森氏病的具体情况下，已经表明移植的胎脑神经细胞与周围的细胞正确连接并且产生多巴胺。这可以导致帕金森氏病症状的长期逆转。

【0146】目标发明的一个目标是提供基本上无限供应的多潜能的人细胞，所述多潜能的人细胞可以用于产生适合卵母细胞供体的自体移植的分化细胞。当用于异源细胞移植治疗中时，人胚胎干细胞和它们的分化后代——源自不孕处理后保留的胚泡，或使用NT产生的——，将可能被受体的免疫系统排斥。孤雌生殖源的干细胞应该产生如此分化的细胞，其能够缓解与目前的移植方法相关的显著问题，即，由于对于卵母细胞供体的宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥，可能发生的移植组织的排斥。按照惯例，通过施用抗排斥药物如环孢霉素来防止或减少排斥。然而，这种药物具有明显的不良副作用，例如，免疫抑制、致癌特性以及非常昂贵。对于卵母细胞供体，由所公开的方法产生的细胞应该消除、或至少大大降低抗排斥药物的需要。

【0147】本发明的另一目标是提供基本上无限供应的多潜能的人细胞，所述多潜能的人细胞可以用于产生适合同种异体移植到卵母细胞供体家族成员的分化细胞。所述细胞将与卵母细胞供体的直系家族成员的细胞在免疫学上和遗传上相似，并且因此较少可能被供体家族成员排斥。

【0148】该方法的另一目标是，当与SCNT相比较时，哺乳动物卵母细胞的孤雌激活是相对简单的步骤，并且在较少细胞操作下导致干细胞的产生。

【0149】已经显示，哺乳动物卵母细胞的孤雌激活在干细胞的产生中比需要操作胚泡的卵母细胞的方法更有效。

【0150】SCNT的一个缺点是：线粒体呼吸链活性(deficient mitochondrialrespiratorychain activity)不足的对象显示了这样的表型，所述表型与一般在SCNT胎儿和后代中遇到的异常有惊人的相似之处(Hiendleder等人，Repro Fertil Dev(2005)17(1-2)：69-83)。细胞通常只含有一种类型的线粒体DNA(mtDNA)，称为同型异源性，然而，同型异质性通常作为突变体和野生型mt DNA分子的组合存在或形成野生型变体的组合(Spikings等人，Hum Repro Update(2006)12(4)：401-415)。由于异质性可以导致线粒体疾病，所以存在各种机制以确保只有母体传递(maternal-only transmission)。然而，随着越来越多地使用绕开维持同型异源性的正常机制的方案(例如，细胞质传递(CT)和SCNT)，受到干扰的线粒体功能对于源自这些来源的干细胞可能是固有的。

【0151】在一方面，由于单性生殖生物(parthenote)是单亲的，所以异质性的可能性被降到最低。

【0152】通过细胞疗法可治疗的其它疾病和病症包括，例如，脊髓损伤，多发性硬化症(multiple sclerosis)，肌营养不良(muscular dystrophy)，糖尿病，肝病包括急性病(病毒性肝炎、药物过量(对乙酰氨基酚)、和其它的疾病)，慢性病(慢性肝炎和其它的疾病(一般导致肝硬化))，可遗传的肝缺陷(heritable liverdefects)(血友病B、因子IX缺乏症、bulirubin代谢缺陷、尿素循环缺陷(尿素循环障碍，urea cycle defects)、溶酶体贮积症、α1抗胰蛋白酶缺乏症和其它病症)，心脏病，软骨替换，灼伤，足部溃疡，胃肠疾病，血管疾病，肾脏疾病，视网膜疾病，角膜疾病，尿道疾病以及老化相关的疾病和病症。

【0153】本方法可以用于置换缺陷的基因，例如，缺陷的免疫系统基因、囊肿性纤维化基因，或用于引入导致治疗益处蛋白质的表达的基因，如生长因子、淋巴因子、细胞因子、酶等。

【0154】例如，编码脑源生长因子的基因可以被引入到根据本发明产生的人多潜能细胞中，所述细胞分化为神经细胞并且所述细胞被移植到帕金森氏病的患者中以阻止神经细胞在该疾病过程中损失。

【0155】同样，目标多潜能人ES细胞可以用作分化的体外模型，特别是用于研究涉及早期发育的调控的基因。同样，应用目标ES细胞产生的分化的细胞组织和器官可以用在药物研究中。

【0156】进一步，从此来源的所述目标ES细胞或分化的细胞可以用作核供体，用于产生其它的ES细胞和细胞集落。

【0157】还进一步，根据本公开内容获得的多潜能细胞可以用于鉴定参与胚胎发生的蛋白质和基因。这可以通过，例如差异表达实现，所述差异表达即通过比较表达在根据本发明提供的多潜能细胞中表达的mRNA和如这些细胞分化为不同的细胞类型所表达的mRNA，所述细胞类型如神经细胞、心肌细胞、其它的肌肉细胞、皮肤细胞等。因而，有可能确定什么基因参与特异性细胞类型的分化。

【0158】进一步，ES细胞和/或它们的分化后代——其具有特定遗传缺陷，如导致杜兴氏肌营养不良(Duchene’s MuscularDystrophy)的遗传缺陷——，可以用作研究与该遗传缺陷相关的特定疾病的模型。

【0159】同样，本公开的另一目标是：将根据所述方法产生的多潜能细胞系暴露于不同浓度的不同生长因子的混合物，并且在不同的细胞培养条件如在不同的细胞基质上培养或在不同的气体分压下培养，从而鉴定诱导产生和增殖期望的分化细胞类型的条件。

【0160】在一个实施方式中，公开了人工角膜，其是在体外、在不存在控制分化和/或增殖的机械支持(即，没有3-D支架)的情况下产生的。在一方面，公开了人工角膜，其包括但不限于，在体外是终末分化的角膜。

【0161】在另一实施方式中，角膜从孤雌激活的人卵母细胞产生，其中源自孤雌激活的卵母细胞的干细胞被人工操作以产生角膜。

【0162】在一方面，产生人工角膜，包括：在培养基中培养从孤雌激活的卵母细胞的分离的干细胞，所述培养基包含血清替换品(M/SR)、细胞质基因组产物、和至少一种促细胞分裂原——其在用DNA抑制剂处理的成纤维饲养层上激活gp130/STAT途径和/或MAP激酶途径；在不添加促细胞分裂原的情况下，在包含细胞质基因组产物的M/SR(M/SRP)中培养促细胞分裂原处理的细胞到接近汇合，其中定期用M/SR替换1/2体积的M/SRP直到接近汇合的细胞发展为色素形成和圆顶外观；以及将M/SR中的有颜色的细胞/圆顶细胞转移到明胶包被的基底上，其中定期用M/SR替换1/2体积的M/SR直到漂浮的细胞团形成，其中漂浮的细胞团是人工角膜。在相关方面，M/SR包含KO Hi葡萄糖DMEM、链霉素、非必需氨基酸、Glutamax-I、β-巯基乙醇和血清替代品。在另一相关的方面，M/SRP包含M/SR的成分和细胞质基因组产物。

【0163】下列实施例拟说明而不是限制本发明。

实施例1

人孤雌胚胎干细胞(embryogenic stem cell)的产生

【0164】材料和方法

【0165】捐赠者(供体)自愿捐赠卵子和血液(用于DNA分析)而不需付款。捐赠者签署全面知情同意文件并且被告知所有捐献的物质将被用于研究而不是用于生殖的目的。在卵巢刺激之前，根据关于人细胞、组织以及细胞和基于组织的产物的捐赠者的FDA资格确定指南(FDA eligibility determination guideline)(Foodand Drug Administration.(食品和药品管理局。)2004年5月的(Draft)Guidance forIndustry：Eligibility Determinationfor Donors of Human Cells，Tissues，and Cellularand Tissue Based Products(HCT/Ps)(关于工业的指南(草案)：人细胞、组织和基于细胞和组织的产物(HCT/Ps)的捐赠者的资格确定))和俄罗斯公共卫生部(Russian Public Health Ministry)的第N 67(02.26.03)号命令，对卵母细胞捐赠者进行医学检查以确定适合性。其包括X—射线、血液和尿分析，以及肝功能检测。捐赠者也进行了梅毒、HIV、HBV和HCV筛查。

【0166】应用标准激素刺激在目标捐赠者体内产生超排卵而获得卵母细胞。每一捐赠者的卵子在她们月经周期的第3天到第13天经受通过FSH的卵巢刺激。总计1500IU的FSH被施用。在捐赠者的月经周期的第10天到第14天，以0.25毫克/天注射促性腺素释放激素拮抗剂Orgalutran(Organon，Holland)。在捐赠者的月经周期的第12天到第14天，每天提供注射75IU FSH+75IU LH(Menopur，FerringGmbH，Germany)。如果超声检查显示卵泡的直径在18到20毫米之间，在捐赠者的月经周期的第14天施用单一的8000IU剂量的hGC(Choragon，Ferring GmbH，Germany)。在大约第16天，在hCG注射后35小时进行经阴道穿刺(punction)。通过超声引导下针吸从麻醉的捐赠者的囊状卵泡(antral follicle)收集滤泡液到无菌管中。

【0167】从滤泡液中挑选卵丘卵母细胞复合体(COCs)，以Flushing培养基(MediCult)洗涤，然后在具有液体石蜡(MediCult)覆盖的通用IVF培养基(UniversalIVF medium)(MediCult，见表1)中，在20％ O₂、5％ CO₂、37℃的湿润气氛下温育2小时。

表1  IVF 培养基

组成

氯化钙

EDTA

葡萄糖

人血清白蛋白

硫酸镁

青霉素G

氯化钾

磷酸二氢钾

碳酸氢钠

氯化钠

乳酸钠

丙酮酸钠

水

【0168】在活化前，用SynVitro Hyadase(MediCult)处理卵丘卵母细胞复合体(COCs)以除去卵丘细胞，之后在具有石蜡覆盖的通用IVF培养基中温育30分钟。

【0169】从这点起，除了离子霉素处理之外，使用O₂减少的气体混合物(90％ N₂+5％ O₂+5％ CO₂)，在37℃，在湿润气氛下进行卵母细胞和胚胎的培养。通过在37℃、20％ O₂，5％ CO₂的气体环境的CO₂培养箱中，在5μM离子霉素中温育5分钟活化卵母细胞，之后在37℃，在90％ N₂、5％ O₂和5％ CO₂的气体环境中，用1mM 6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)在石蜡覆盖的IVF培养基中培养4小时。活化和培养在4-孔板(Nunclon，A/S，Denmark)中，在500μl覆盖有液体石蜡油(MediCult，A/S，Denmark)的培养基中进行。

【0170】在包含5％ O₂、5％ CO₂和90％ N₂的气体环境中，在IVF培养基中培养活化的卵母细胞，并且从活化的卵母细胞产生的胚胎在相同的气体混合物中培养。

【0171】使活化的卵母细胞在上述条件下在IVF中温育，直到观察到包含内细胞团(ICM)的充分扩大的胚泡为1AA或2AA的胚泡得分修饰(Scoring Modification)(Shady Grove Fertility Center，Rockville，MD，和Georgia Reproductive Specialists，Atlanta，GA))。

【0172】通过0.5％链霉蛋白酶(Sigma，St.Louis)处理除去透明带。通过免疫外科(immuno-surgery)分离来自胚泡的ICM，其中所述胚泡与马抗人脾细胞抗血清温育，之后暴露于豚鼠补体。通过轻轻地吹吸所处理的胚泡，从ICM除去滋养外胚层细胞(Trophoectodern cells)。

【0173】为了从整个胚泡衍生phESC，所述胚泡被放置在为培养phESC设计的培养基(即，补充有4ng/ml hrbFGF、5ng/ml hrLIF和10％人脐带血血清的VitroHES(Vitrolife))中的饲养层上。当胚泡附着并且质体细胞(trophoplast cells)伸展时，ICM变得可见。通过3天到4天的额外的培养，通过使用精细玻璃吸管从滋养外胚层生长晕(outgrowth)机械切下而分离ICM。进一步，所述IMC细胞在37℃，在5％ CO₂和20％ O₂下，于96孔板，在补充有10％人脐带血血清、5ng/ml人重组LIF(Chemicon Int’l，Inc.，Temecula，CA)、4ng/ml重组人FGF(Chemicon Int’l，Inc.，Temecula，CA)和青霉素-链霉素(100U/100μg)的VITROHES^TM培养基(例如，DMEM/高糖培养基，VitroLife，Sweden)中，在有丝分裂失活的出生后人皮肤成纤维细胞的饲养细胞层上进行培养。这种气体混合物被用于培养干细胞。应用非动物物质制备人成纤维细胞培养基。应用10μg/ml的丝裂霉素C(Sigma，St.Louis，MO)，对成纤维细胞进行失活3小时。

【0174】在单独的方法中，通过使胚泡与马抗人脾细胞抗血清温育，之后暴露于兔补体来进行免疫手术。通过轻轻地吹吸所处理的胚泡，从ICM除去滋养外胚层细胞。应用包含人脐带血血清的培养基，分离的ICM的进一步培养在新生儿的人皮肤成纤维细胞(HSF)的饲养层上进行，所述成纤维细胞是从遗传上不相关个体来源获得(双亲同意)的。应用丝裂霉素C，所述HSF饲养层被有丝分裂失活。

【0175】用于培养HSF的培养基由90％DMEM(高糖，具有L-谷氨酰胺(Invitrogen))、10％人脐带血血清和青霉素-链霉素(100U/100mg)(Invitrogen)组成。

【0176】为了培养ICM和phESC，使用补充4ng/ml hrbFGF、5ng/ml hrLIF和10％人脐带血血清的VitroHES(Vitrolife)。ICM被机械地平铺在新鲜的饲养层上并且培养3到4天。第一个集落(colony)被机械切下并且在培养5天后重新铺板。所有后来的传代在培养5到6天后进行。对于早期传代，集落被机械地分成团(clump)并且重新铺板。用胶原酶IV处理和机械分离进行phESC的进一步传代。phESC的增殖在37℃、5％ CO₂的湿润的气氛中进行。

【0177】卵母细胞活化

【0178】对于最初的4个供体，活化的卵母细胞在包含5％ O₂、5％ CO₂和90％ N₂的气体环境中，在IVF培养基中培养并且随后培养五(5)天以上。表2示出了活化的卵母细胞的成熟进程。每一卵母细胞分散(separate)在4孔板中。

表2.培养的活化的卵母细胞 ^＊

      第1天          第2天                  第3天           第5天

N1    1个前核(pn)，  2个相等的卵裂球(b1)，  4个相等的b1，   1个桑椹胚，

      1个极体(pb)    裂殖(fr)-0％           fr-2％          fr-15％

N2    0个pn，        4个不相等的b1，        5个不相等的     4个不相等的

                                            b1，            b1，

      1个pb          fr-4％                 fr-20％         fr-40％

N3    1个pn，        2个不相等的b1，        6个相等的b1，   早期胚泡

      1个pb          fr-0％                 fr-0％

N4    1个pn，        4个相等的b1，          4个相等的b1，   充分扩大的胚

      1个pb          fr-10％                fr-20％         泡，具有好的

                                                            ICM 1AA

^*细胞 在第一天在M1培养基(MediCult)中温育并且在第2-5天在M2培养基(MediCult)中温育。每天更换培养基。M1和M2包含人血清白蛋白、葡萄糖和衍生的代谢物、生理盐、必需氨基酸、非必需氨基酸、维生素、核苷酸、碳酸氢钠、链霉素(40mg/l)、青霉素(40.000IU/1)和酚红。

【0179】从N4分离内细胞团并且转移到人成纤维饲养细胞上，如上所概述的。N1和N2在第6天退化。进一步，在第6天，N3产生具有ICM 2AB的充分扩大的胚泡。然后，在第6天，将N3转移到人成纤维饲养细胞上。N4的ICM没有变化。N3被用于分离干细胞。

【0180】在包含5％ CO₂和95％ N₂的气体环境中，在NitroHES培养基中培养ICM细胞并且随后培养四十五(45)天以上。表2a示出了N3 ICM细胞培养的进程。

表2a.N3-ICM培养的进程 ^＊

第3天             ICM被移植到新鲜的饲养细胞上。

第8天             细胞集落被机械分成6块并且将其在96孔板的

                  3个孔中培养——第一次传代

第14天            从第一次传代的五(5)个集落，将细胞机械地分

                  开，并且将第二次传代的的20个集落培养在

                  24孔板的3个孔中。

第20天            将细胞铺在35毫米盘中—第三次传代。

第24天            用细胞接种五(5)个35毫米盘—第四次传代。

                  在室温下用5％链霉蛋白酶(Sigma)将一个盘

                  机械地分开。

第30天            用细胞接种二十五(25)个35毫米盘—第五次^**

                  传代。

第34天            第六次^**细胞传代。

第35天            从第六次传代冷冻11个安瓿。

第37天            第七次^**细胞传代。

第44天            从第七次传代冷冻12个安瓿。

第45天            第八次细胞传代。

^*细胞在M2培养基上(MediaCult)生长。

^**用链霉蛋白酶消化进行这些传代。

【0181】干细胞分离

【0182】从来自5个供体的卵母细胞，使用MediCult培养基，之后在减少的氧气下培养，以在培养的第五或第六天产生23个胚泡。11个胚泡具有可见的ICM(表3)。

表3.单性生殖生物和孤雌胚胎干细胞系的增殖

供体编    收获的    捐献的    正常活    产生的单    衍生的胚泡        产生的

号        卵母细    卵母细    化的卵    性生殖生    具   有  没 有 看 系

          胞        胞        母细胞    物          ICM      得见的

                                                             ICM

1         8         4         4         4           2        -        phESC-1

                                                                      免疫手

                                                                      术

2         15        8         8         8           3        3        phESC-3

                                                                      phESC-4

                                                                      phESC-5

                                                                      都来自

                                                                      整个胚

                                                                      泡

3         27        14        12¹       11²         3        2        phESC-6

                                                                      来自整

                                                                      个胚泡

4         22        11        10³       10          2        3        phESC-7

                                                                      来自整

                                                                      个胚泡

5         20        9⁴        7         7           1        4        没有细

                                                                      胞系产

                                                                      生

¹-两个卵母细胞没有被活化；²-一个卵母细胞在活化后退化；³-一个卵母细胞没有被活化；⁴-两个卵母细胞处于分裂中期阶段I并且被丢弃。

【0183】这些结果显示从孤雌激活的卵母细胞形成胚泡具有大约57.5％的成功率。

【0184】免疫组织化学染色

【0185】为了免疫染色，将饲养层上的hES细胞集落和phESC细胞接种到微盖玻片上，用PBS洗涤两次并且在-20℃用100％甲醇固定5分钟。用PBS+0.05％吐温-20洗涤细胞两次，并且在室温用PBS+0.1％ Triton X-100透化处理10分钟。在细胞洗涤之后，通过在室温(RT)下与封闭溶液(PBS+0.05％吐温-20+4％山羊血清+3％人脐带血血清)温育30分钟封闭非特异性结合。在封闭溶液中稀释单克隆抗体并且在室温下使用1小时：所述单克隆抗体为来自Chemicon的SSEA-1(MAB4301)(1:30)、SSEA-3(MAB4303)(1:10)、SSEA-4(MAB4304)(1:50)、OCT-4(MAB4305)(1:30)、TRA-1-60(MAB4360)(1:50)、和TRA-1-81(MAB4381)(1:50)。洗涤细胞之后，在PBS+0.05％吐温-20中以1：1000稀释第二抗体Alexa Fluor 546(橙色-荧光的)和488(绿色-荧光的)(Molecular Probes，Invitrogen)，并且在室温应用1小时。洗涤细胞并且在室温用PBS+0.05％吐温-20中的0.1μg/ml的DAPI(Sigma)对核染色10分钟。洗涤细胞并且用Mowiol(Calbiochem)安置在载玻片上。用荧光显微镜显现荧光图像。

【0186】为了在三周大的胚状体或在有收缩性的胚状体(contractile embryoidbodies)中检测中胚层标记，使用单克隆的小鼠抗结蛋白抗体，抗人α辐肌动蛋白抗体(Chemicon)作为肌肉特异性标记，和抗人CD31/PECAM-1抗体(R&DSystems)，抗人VE钙黏着蛋白(DC144)抗体(R&D Systems)作为内皮标记。

【0187】为了检测胚状体中的内皮标记，使用单克隆的小鼠抗人甲胎蛋白抗体(R&D Systems)。

【0188】碱性磷酸酶和端粒末端转移酶活性

【0189】使用AP试剂盒和TRAPEZE试剂盒(Chemicon)，根据制造商的说明书进行碱性磷酸酶和端粒末端转移酶的活性检测。

【0190】核型分析

【0191】为了分析核型，用10μg/ml脱羰秋水仙碱(Sigma)处理hES细胞两小时，用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)收获细胞并且以700转/每分钟(rpm)离心3分钟。将沉淀重悬在5毫升的0.56％ KCl中，并且在室温温育15分钟。在重复离心后，除去上清液，重悬细胞并且在4℃下，用5毫升甲醇/醋酸(3:1)的冰冷混合物固定5分钟。重复两次细胞固定，之后所述细胞悬浮液被放置在显微镜载玻片上，并且用改良的吉姆萨染液(Giemsa Modified Stain)(Sigma)对所述制备物进行染色。通过标准G-显带方法分析以这种方式制备的细胞的分裂中期。显示5/1000的量的分裂中期伸展，并且63个分裂中期被分析。

【0192】胚状体形成

【0193】hES和phESC细胞集落被机械分成团并且放置在预先包被有1.5％琼脂糖(Sigma)的24孔板的孔中的培养基中，所述培养基包含85％的敲除(Knockout)DMEM、15％人脐带血血清、1×MEM NEAA、1mM Glutamax、0.055mM β-巯基乙醇、青霉素-链霉素(50U/50mg)、4ng/ml hrbFGF(除血清外，全部来自Invitrogen)。人EB在悬浮培养物中培养14天并且放置在培养皿上，以产生生长晕，或在悬浮液中培养额外的一周。

【0194】通过在分化培养基中将附着到培养皿表面的两周大的胚状体培养一周的时期来诱导神经分化，所述分化培养基：DMEM/F12、B27、2mM Glutamax、青霉素-链霉素(100U/100μg)和20ng/ml hrbFGF(全部来自Invitrogen)。一些胚状体产生具有神经形态的分化细胞，其它的被分开(dissect)并且另外培养以产生神经球(neurosphere)。

【0195】在平铺在粘附表面上之后在如用于胚状体增殖的相同培养基中培养5天之后，自发地出现有节律地跳动胚状体(Rhythmically beating embryoid bodies)。

【0196】角膜形成

【0197】hES在具有促细胞分裂原、LIF和bFGF的生长培养基中(在>40％汇合的丝裂霉素C处理的人成纤维细胞饲养层上)生长。接近汇合(即，当ES失去了清楚的集落边缘时)的生长培养基用没有添加促细胞分裂原的生长培养基替换。其后，每2-3天，用EB培养基替换50％的所述培养基，持续最少三个星期。在此时刻，有颜色的细胞在培养物中发育为小球或大的圆顶物和圆柱。

【0198】然后从培养物中除去培养基并且用EB培养基剧烈洗涤细胞以取出期望的细胞。然后将EB培养基洗液和收获的细胞转移到单独的、用0.1％明胶包被的培养瓶中。两天后，用EB培养基替换转移的培养物中的50％的培养基。随后，每3-4天，用EB培养基替换转移的培养物中的50％的培养基，持续最少三个星期，直到小的类似油滴的漂浮细胞团变得可见。在这时，注意：在替换培养基时，不要弄乱漂浮细胞团或晶状体(lens)。每3-4天，除去50％的培养基，并且用足以确保生长的角膜完全浸入在培养基中的体积的EB培养基替换。

【0199】生长培养基：

KO Hi葡萄糖DMEM

500U/ml链霉素

1％非必需氨基酸

2mM Glutamax-I

0.1mM β-巯基乙醇

8％血清替代品

8％细胞质基因组产物(Beyer，Res Triangle Park)

促细胞分裂原：

10ng/ml LIF

5ng/ml bFGF

【0201】EB培养基：

KO Hi葡萄糖DMEM

500U/ml链霉素

1％非必需氨基酸

2mM Glutamax-I

0.1mM β-巯基乙醇

13％血清替代品

【0201】组织学检查

【0202】在中性缓冲福尔马林(NBF)中固定之后，将样本(10毫米透明/白色半透明的组织球)放置在70％乙醇中。所述球被分成两份，检查一部分用于大体描述(gross description)，而另一部分通过显微镜检查。

【0203】用一组组织染料对样本进行染色，包括黏蛋白染色(例如，过碘酸-希夫染色(periodic acid-Schiff[PAS]))、生物胺染色、黑色素染色、脂色素染色、铁和钙染色、尿酸盐染色、脂肪染色、结缔组织染色、吉姆萨染色、微生物染色(例如，抗酸细菌、gomori六亚甲四胺-银染色和类似的染色)。染色后，在光学显微镜下检查样品。

【0204】HLA分型

【0205】用来自Dynal(Invitrogen)的Dynabeads DNA Direct Blood从供体血液、hES、phESC细胞和人新生儿皮肤成纤维细胞(NSFs)中提取基因组DNA。用等位基因特异性的测序引物(PCR-SSP，Protrans)，根据使用说明书，通过PCR进行HLA分型。以限定A^*01-A^*80、B^*07-B^*83、Cw^*01-Cw^*18区域的PROTRANS HLA A^*、B^*、Cw^*分型HLAI类基因(HLAA^*、B^*、Cw^*)。用限定DRB1^*01-DRB1^*16(DR1-DR18)、DRB3^*、DRB4^*、DRB5^*区域的PROTRANS HLA DRB1^*和限定DQB1^*02-DQB1^*06(DQ2-DQ9、DQA1^*0101-DQA1^*0601的区域的PROTRANSHLA DQB1^*DQA1^*来分析HLA类型II基因(HLA DRB1^*、DRB3^*、DRB4^*、DRB5^*、DQA1^*、DQB1^*)。如下完成PCR扩增：94℃ 2分钟；94℃ 10秒，65℃ 1分钟，10个循环；94℃ 10秒，61℃ 50秒，72℃ 30秒，20个循环。在2％琼脂糖凝胶上检测扩增产物。

【0206】Affimetrix SNP微阵列分析

【0207】通过酚/氯仿提取方法，从血液、卵丘细胞、phESC和NSF分离基因组DNA。用Affimetrix Mapping 50K Hind 240 Array(Affimetrix GeneChip Mapping100K试剂盒的一部分)对从四个高加索人对象获得的这些DNA样品进行基因型分型。首先，所述数据包含57,244个二进制的SNP标记。因为标记的数量多于鉴定基因组样品的等值(equivalency)和研究杂合性所需的量，所以选择22种常染色体中的15种(染色体1-15)。除去最短的7种染色体，以减少在随机取样的过程中选择到对给定染色体没有标记或单一标记的机会。通过Relcheck(版本0.67，Copyright2000KarlW.Broman，Johns Hopkins University，Licensed under GNUGeneral Public License version 2(June1991))分析1,459种标记。

【0208】基因组印记分析

【209】如Li等人(J Biol Chem(2002)277(16)：13518-13527)所述制备总核酸。应用Tri-reagent(Sigma)或通过应用来自Qiagen(Valencia，CA)的RNA制备试剂盒从细胞提取RNA和DNA。

【210】将包含来自不同样品的RNA的RNA印迹(见图3)通过标准方法(见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989，2nd ed，ColdSpring Harbor Press)印迹到滤膜上。该Northern滤膜与单链寡核苷酸探针杂交，所述单链寡核苷酸探针可特异性地与mRNA杂交。用[γ³²P]ATP(AmershamBiosciences)对寡核苷酸探针进行末端标记。随后，在60℃，用包含0.1％SDS的0.2×SSC(1×SSC＝0.15MNaCl和0.015M柠檬酸钠)洗涤所述膜三次，每次10分钟，并且应用PhosphorImager(Molecular Dynamics)进行分析。从基于下列登录号的序列获得寡核苷酸探针的序列：NP002393(Peg1_2和Peg1_A)；对于这些基因，从两种可选的启动子转录人PEG1，这导致两种同工型转录，它们中仅一种进行(同工型1_2)印记。父本表达同工型1与父本等位基因的外显子1中未甲基化的CpG岛结合发生，而母本基因(同工型1_A)中相应的CpG岛完全甲基化。参见，例如Li等(2002)，如上)；CAG29346(SNRPN)；AF087017(H19)；NR_001564(失活X特异性转录物-XIST)；和P04406(GAPDH)。

【211】DNA指纹分析

【212】通过酚/氯仿提取，从血液、hES细胞和NSF分离基因组DNA，用HinfI限制性酶(Fermentas)消化并且加载到0.8％的琼脂糖凝胶中。电泳之后，通过DNA印迹将变性的DNA转移到尼龙膜(Hybond N，Amersham)上，并且与³²P-标记的(CAC)5寡核苷酸探针杂交。在应用Cronex增感屏将膜曝光在X射线片(Kodak XAR)上之后分析mData。

【213】单基因座(monolocus)PCR基因型分型

【214】3’脱脂载脂蛋白B超变小卫星基因座(hypervariable minisatellite locus)(3’ApoB VNTR)

【215】染色体定位：2p23-p23

【216】GenBank基因座和基因座定义：APOB，脱脂载脂蛋白B(包括Ag(x)抗原)非翻译区

【217】重复序列5’-3’：(TATAATTAAATATT TTATAATTAAAATATT)n(SEQ IDNO：1)

【218】等位基因梯状条带(ladder)大小范围(碱基)：450+10+2引物+连接体

【219】VNTR梯状条带大小范围(重复的编号(#)，根据Ludwig等人，1989)：30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52

【220】其它已知的等位基因(重复的编号)：25、27、28、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、54、55

【221】Promega K562

等位基因大小(重复的编号)：36/36

【222】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：                      95℃，2’

30个循环：

  变性                          94℃，1’

  延长和引物连接                60℃，2’

延伸步骤：                      72℃，5’

保持步骤：                      4℃，无限时间

可以如Verbenko等人，Apolipoprotien B 3’-VNTR polymorphism in EasternEuropeanpopulations.Eur J Hum Gen(2003)11(1)：444-451所述进行分析。参见表4。

【223】D1S80(pMCT118)超变小卫星基因座(D1S80 VNTR)

【224】染色体定位：1p35-36

【225】GenBank基因座和基因座定义：人D1S80和MCT118基因

【226】重复序列5’-3’：(GAAGACAGACCACAG)n(SEQ ID NO：2)

【227】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：387-762

【228】VNTR梯状条带大小范围(重复的编号)：16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、34、35、36、37、40、41

【229】其它已知的等位基因(重复的编号)：13、14、15、38、39、>41

【230】Promega K562 

等位基因大小(重复的编号)：18/29

【231】PCR方案：

热循环仪：DNATechnology Ltd.，Russia

初始温育：                  95℃，2’

30个循环：

  变性                      94℃，45”

  引物连接                  60℃，30”

  延长                      72℃，45”

延伸步骤：                  72℃，5’

保持步骤：4℃，无限时间

【232】可以如Verbenko等人，Allelefrequencies for D1S80(pMCT118)locus in someEastern European populations.J Forensic Sci(2003)48(1)：207-208中所述进行分析。参见表5。

表5.俄罗斯人口的等位基因频率

【233】D6S366

【234】染色体定位：6q21-qter

【235】GenBank基因座和基因座定义：NA

【236】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：150-162

【237】STR梯状条带大小范围(重复的编号)：12、13、15

【238】其它已知的等位基因(重复的编号)：10、11、14、16、17

【239】Promega K562 

等位基因大小(重复的编号)：13/14

【240】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：                  95℃，2’

30个循环：

  变性                      94℃，1’

  延长和引物连接            60℃，2’

延伸步骤：                  72℃，5’

保持步骤：                  4℃，无限时间

【241】可以如Efremov等人，An expertevaluation of molecular geneticindividualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandemrepeats.Sud Med Ekspert(1998)41(2)：33-36中所述进行分析。参见表6。

表6.俄罗斯人口的等位基因频率

【242】D16S539

【243】染色体定位：16q24-qter

【244】GenBank基因座和基因座定义：NA

【245】重复序列5’-3’：(AGAT)n

【246】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：264-304

【247】STR梯状条带大小范围(重复的编号)：5、8、9、10、11、12、13、14、15

【248】Promega K562

等位基因大小(重复的编号)：11/12

【249】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：                       95℃，2’

30个循环：

  变性                           94℃，45”

  引物连接                       64℃，30”

  延长                           72℃，30”

延伸步骤：                       72℃，5’

保持步骤：                       4℃，无限时间

【250】如在

 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行分析。参见表7。

表7.高加索美国人的等位基因频率

【251】D7S820

【252】染色体定位：7q11.21-22

【253】GenBank基因座和基因座定义：NA

【254】重复序列5’-3’：(AGAT)n

【255】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：215-247

【256】VNTR梯状条带大小范围(重复的编号)：6、7、8、9、10、11、12、13、14

【257】Promega K562 等位基因大小(重复的编号)：9/11

【258】PCR方案：

热循环仪：DNATechnology Ltd.，Russia

初始温育：                   95℃，2’

30个循环：

  变性                       94℃，45”

  引物连接                   64℃，30”

  延长                       72℃，30”

延伸步骤：                   72℃，5’

保持步骤：                   4℃，无限时间

如在

 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行分析。参见表8。

表8.不同人群中D7S820的等位基因频率

【259】人血管性血友病因子(von Willebrand factor)基因超变小卫星基因座II(vWFII)

【260】染色体定位：12p13.3-12p13.2

【261】GenBank基因座和基因座定义：HUMvWFII，人血管性血友病因子基因

【262】重复序列5’-3’：(ATCT)n/(AGAT)n

【263】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：154-178

【264】STR梯状条带大小范围(重复的编号)：9、11、12、13

【265】其它已知的等位基因(重复的编号)：8、10、14、15

【266】Promega K562 

等位基因大小(重复的编号)：13/13

【267】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：              95℃，2’

30个循环：

  变性                  94℃，1’

  延长和引物连接             60℃，2’

延伸步骤：                   72℃，5’

保持步骤：                   4℃，无限时间

【268】如在Efremov等人，An expert evaluation of molecular genetic individualizingsystems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats.SudMed Ekspert(1998)41(2)：33-36中所述进行分析。参见表9。

表9.俄罗斯人口的等位基因频率

【269】D13S317

【270】染色体定位：13q22-q31

【271】GenBank基因座和基因座定义：未知(NA)

【272】重复序列5’-3’：(AGAT)n

【273】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：165-197

【274】STR梯状条带大小范围(重复的编号)：8、9、10、11、12、13、14、15

【275】其它已知的等位基因(重复的编号)：7

【276】Promega K562 等位基因大小(重复的编号)：8/8

【277】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：                 95℃，2’

30个循环：

  变性                     94℃，45”

  引物连接                 64℃，30”

  延长                     72℃，30”

延伸步骤：                 72℃，5’

保持步骤：                 4℃，无限时间

【278】如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA中所述进行分析。参见表10。

表10.不同人群中D13S317的等位基因频率

【279】人血管性血友病因子基因超变小卫星基因座(vWA)

【280】染色体定位：12p12pter

【281】GenBank基因座和基因座定义：HUMVWFA31，人血管性血友病因子基因

【282】重复序列5’-3’：(AGAT)n

【283】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：139-167

【284】STR梯状条带大小范围(重复的编号)：14、16、17、18

【285】其它已知的等位基因(重复的编号)：11、12、13、15、19、20、21

【286】Promega K562 

等位基因大小(重复的编号)：16/16

【287】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：                   95℃，2’

30个循环：

  变性                       94℃，1’

  延长和引物连接             60℃，2’

延伸步骤：                   72℃，5’

保持步骤：                   4℃，无限时间

【288】如在 

 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行分析。参见表11。

表11.不同人群中的HUMVWFA31等位基因频率

【289】CSF-1受体基因的人c-fms原癌基因(Human c-fms proto-oncogene)微卫星基因座(minisatellite locus)(CSF1PO)

【290】染色体定位：5q33.3-34

【291】GenBank基因座和基因座定义：HUMCSF1PO，人c-fms原癌基因

【292】重复序列5’-3’：(AGAT)n

【293】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：295-327

【294】STR梯状条带大小范围(重复的编号)：7、8、9、10、11、12、13、14、15

【295】其它已知的等位基因(重复的编号)：6

【296】Promega K562 

 等位基因大小(重复的编号)：9/10

【297】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：                        95℃，2’

30个循环：

  变性                            94℃，45”

  引物连接                        64℃，30”

  延长                            72℃，30”

延伸步骤：                        72℃，5’

保持步骤：                        4℃，无限时间

【298】如在

 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行分析。参见表12。

表12.高加索美国人的等位基因频率

【299】人甲状腺过氧化物酶基因(Human thyroid peroxidase gene)微卫星基因座(TPOX)

【300】染色体定位：2p25.1-pter

【301】GenBank基因座和基因座定义：HUMTPOX，人甲状腺过氧化物酶基因

【302】重复序列5’-3’：(AATG)n

【303】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：224-252

【304】STR梯状条带大小范围(重复的编号)：6、7、8、9、10、11、12、13

【305】其它已知的等位基因(重复的编号)：无

【306】Promega K562 等位基因大小(重复的编号)：8/9

【307】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：                     95℃，2’

30个循环：

  变性                         94℃，45”

  引物连接                     64℃，30”

  延长                        72℃，30”

延伸步骤：                    72℃，5’

保持步骤：                    4℃，无限时间

【308】如在

 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行分析。参见表13。

表13.高加索美国人的等位基因频率

【309】人酪氨酸羟化酶(Human tyrosine hydroxylase)基因微卫星基因座(TH01)

【310】染色体定位：5q33.3-34

【311】GenBank基因座和基因座定义：HUMTHO1，人酪氨酸羟化酶基因

【312】重复序列5’-3’：(AATG)n

【313】等位基因梯状条带大小范围(碱基)：179-203

【314】STR梯状条带大小范围(重复的编号)：5、6、7、8、9、10、11

【315】其它已知的等位基因(重复的编号)：9.3

【316】Promega K562 

等位基因大小(重复的编号)：9.3/9.3

【317】PCR方案：

热循环仪：DNA Technology Ltd.，Russia

初始温育：                   95℃，2’

30个循环：

  变性                       94℃，45”

  引物连接                   64℃，30”

  延伸                       72℃，30”

延伸步骤：                   72℃，5’

保持步骤：                   4℃，无限时间

如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行分析。参见表14。

表14.高加索美国人的等位基因频率

【318】结果

【319】来自此方法的hES细胞显示了许多胚胎干细胞的典型特征：胞质脂肪体(cytoplasmic lipid bodies)、小的细胞质/核比例和清楚可辨的核仁。hES细胞集落显示与以前报导的源于体外受精后的人胚胎干细胞的细胞集落形态相似。所述细胞对于碱性磷酸酶(图1A)、八核苷酸结合转录因子4mRNA(Oct-4)(图1B)、阶段特异胚抗原1(SSEA-1)(图1C)、阶段特异胚抗原3(SSEA-3)(图1D)、阶段特异胚抗原4(SSEA-4)(图1E)、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)(图1F)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)(图1G)为免疫反应阳性，而对于阶段特异胚抗原1(SSEA-1)(图1C)(对于小鼠胚胎干细胞而非人胚胎干细胞是阳性)为阴性。端粒末端转移酶活性通常与复制不灭(replicative immortality)有关并且典型地在生殖细胞、癌细胞和多种干细胞中表达，包括干细胞，但是在大多数体细胞类型中不表达。由本方法制备的细胞在体外增殖3个月后保持了未分化的形态并且显示了高水平的端粒末端转移酶活性(图2A)。通过胚状体形成在体外研究了细胞的多潜能性(图2B、2C)，G-带状核型分析说明了细胞具有正常的人46XX核型(图2D)。

【320】通过与³²P-标记的(CAC)寡核苷酸探针的DNA印迹和杂交以及对于不同基因座的单基因座(monolocus)聚合酶链反应(PCR)，在卵母细胞供体的血液、ES细胞和HNSF饲养细胞上进行DNA指纹分析(图2E)。

【321】对于单基因座PCR，基因型分型显示了对于所有基因座(除了一个，D7S820)在血液(供体)DNA和OL1DNA之间同样的等位基因。参见表15。

表15.单基因座PCR基因型分型

 

NN	基因座定义	染色体定位	hES	NSF	血液
						1.	3’ApoB	2p24-p23	36/48	36/36	36/48
2.	D1S80	1p35-36	18/24	22/31	18/24
						3.	D6S366	6q21-qter	13/15	17/17	13/15
4.	D16S359	16q24-qter	8/13	12/13	8/13
						5.	D7S820	7q11.21-22	11/11	9/10	10/11
6.	vWFII	12p13.3-12p13.2	11/13	9/11	11/13
						7.	D13S317	13q22-q31	9/12	11/12	9/12
8.	vWA	12p12pter	14/18	17/18	14/18
						9.	CSF1PO	5q33.3-34	12/12	12/13	12/12
10.	TPOX	2p25.1-pter	8/11	8/11	8/11
						11.	TH01	5q33.3-34	6/6	6/9，3	6/6

【322】所有杂合供体基因座(除了一个，D7S820)的杂合性(杂合)在hES基因座中没有变化。hES DNA中的D7S820基因座的纯合性(纯合)是由于DNA复制和DNA修复过程中滑链(slipped-strand)错配而突变的结果(在微卫星重复中插入一个AGAT单体)。

【323】这些结果与用多座位DNA指纹技术(multilocus DNA fingerprinting)获得的结果一致(同时发现供体DNA和hES DNA的指纹模式基本上相同)。

【324】图2E证明了hES细胞的杂合性和它们与卵母细胞供体血液的同一性，并且在hES细胞和饲养细胞之间没有相似性。应用MHC I类和II类内的多态性基因，通过基于PCR的单元型分析，确定hES细胞系的DNA分布。来自卵母细胞供体血细胞、hES细胞和饲养HNSF的总基因组(total genomic)DNA进行基因型分型和比较。数据显示hES细胞与来自供体血液的细胞彼此不能区分，因此应该被认为是自体的，而上述两者都与饲养细胞的DNA可区分(表16)。

表16.HLA分型

                   MHCI                             MHCII

         HLA-A     HLA-B       HLA-C     DRB1      DQB1        DQA1

pHES-1   A^*01      B^*15(63)    Cw^*04     DRB1^*12   DQB1^*06      DQA1^*01

         A^*02      B^*35        Cw^*0708   DRB1^*13   DQB1^*03      DQA1^*0505

供体     A^*01      B^*15(63)    Cw^*04     DRB1^*12   DQB1^*06      DQA1^*01

         A^*02      B^*35        Cw^*0708   DRB1^*13   DQB1^*03      DQA1^*0505

HNSF     A^*25      B^*15(62)    Cw^*12     DRB1^*04   DQB1^*06      DQA1^*01

         A^*32      B^*18        Cw^*12     DRB1^*15   DQB1^*03      DQA1^*03

【325】DNA指纹分型和HLA分型分析证实了hES细胞是杂合的并且包括全部的供体遗传物质。这些结果与孤雌生殖的猴干细胞系的数据一致(Vrana等人，ProcNatl Acad Sci USA(2003)100(Suppl1)：11911-11916)，而与孤雌生殖的小鼠干细胞系的数据不一致(Lin等人，Stem Cells(2003)21：153-161)，所述孤雌生殖的小鼠干细胞系包含一半的供体遗传物质。

【326】phESC细胞系显示了在hES细胞中预期的形态，形成具有紧凑细胞的集落、明显的核仁和小的细胞质与核的比例(图4)。这些细胞表达传统的hES标记SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT-4，不表达SSEA-1——未分化的小鼠胚胎干细胞的阳性标记(图4)。源自所有系的细胞显示了高水平的碱性磷酸酶和端粒末端转移酶活性(图5和图6)。G-带状基因型分型显示phESC系具有正常的人46，XX核型，phESC-7系除外(图7)。phESC-7系的大约91％的细胞具有47，XXX核型，并且9％的细胞具有48，XXX，+6核型。在所述系中观测到不同程度的X染色体异态性；大约12％的phESC-1和phESC-6系；对phESC-5系为42％；以及对细胞系phESC7、phESC-3和phESC-4分别为70％、80％和86％(图7)。

【327】对所有的phESC系、供体体细胞和饲养细胞进行DNA分布的比较。这些研究应用Affimetrix SNP微阵列(Mapping50K Hind 240 Arrays)研究染色体变化并且确定phESC与供体体细胞的遗传相似性。phESC系和它们相关的供体体细胞之间的所有成对的基因型亲缘(relationship)被确定为“全同胞(full sibling)”，而对的所有其它的组合被确定为“不相关的”。内部对照将源自同一phESC系的分开的培养物(split culture)之间的成对基因型亲缘确定为“单卵双生”(表17，数据库S1)。

表17.数据库S1.

从phESC和相关供体鉴定DNA样品的数据库S1

如下对DNA样品进行编号：1-人新生儿皮肤成纤维细胞；2-phESC-7系供体；3-phESC-7系；4-phESC-1系；5-phESC-1系；6-phESC-3系；7-phESC-4系；8-phESC-5系；9-phESC-6系；10-phESC-6系供体；11-phESC-3到phESC-5系供体；和12-phESC-1系供体。

结果显示只有一对(样品4-5)被确定为单卵(MZ)双生。10个其它对(样品2-3、4-12、5-12、6-7、6-11、7-8、7-11、8-11、9-10)被确定为全同胞，而所有其它的对的组合被确定为不相关。输出中的IBS柱显示了标记的数目，在该标记数目下所述对都是分型的并且状态上共有0、1或2个同样的等位基因(对于在没有基因型分型错误的理想条件下的MZ双生，所有的标记必须在IBS＝2之下安置)。该输出没有直接显示P(观测的标记给定的亲缘(given relationship))，但是其显示了LOD得分—log₁₀{P(观测的标记假定的亲缘/P(观测的标记|亲缘——获得最大可能性并且因此产生信号)}，作为相似性的量度。LOD得分越小，两个样品之间的假定的亲缘的可能性越小。

【328】1,459个SNP标记的比较分析显示了phESC的杂合性，并且说明：与相关的供体体细胞基因型相比，phESC细胞基因型中发生了变化。以前为杂合的体细胞基因组的一些片段在相关的phESC系基因组中变成纯合。该杂合到纯合的模式出现在11-15％的phESC-1、PhESC-3、phESC-4、phESC-5和phESC-6系中，并且对于phESC7系为19％(数据库S2)。而且，在源自同一卵母细胞供体的phESC和phESC-5系之间观测到遗传差异(表18，数据库S2)。

表18

结果示出了得到的phESC系的杂合性，并且通过与相关的供体基因型相比，显示了基因型的变化。部分的供体基因组的杂合片段在phESC中变成纯合。染色体-染色体数目；dbSNP数据库中的RS ID-RS数目；如由Affimetrix GeneChip记录的碱基对-碱基对距离；高加索人中的Freq A—在高加索人群中的A等位基因的频率。

【329】在以前的研究中，小鼠卵母细胞的孤雌激活导致纯合的胚胎干细胞系(Lin等人，Stem Cells(2003)21：152)。在人卵母细胞中，在卵母细胞孤雌激活和二倍体胚胎产生后第二次减数分裂的抑制不导致全纯合的hES细胞的衍生。

【330】基于HLA-分型的结果，从所有phESC系来源的分化细胞应该与卵母细胞供体完全组织相容，使这成为产生治疗用途的细胞的方法(表19)。

表19.DhESC细胞系的HLA-分型

                     MHCI                            MHCII

             HLA-A   HLA-B       HLA-C    DRB1       DQB1       DQA1

phESC-1      A^*01    B^*15(63)    Cw^*04    DRB1^*12    DQB1^*06    DQA1^*01

             A^*02    B^*35        Cw^*0708  DRB1^*13    DQB1^*03    DQA1^*0505

phESC-1供    A^*01    B^*15(63)    Cw^*04    DRB1^*12    DQB1^*06    DQA1^*01

体           A^*02    B^*35        Cw^*0708  DRB1^*13    DQB1^*03    DQA1^*0505

phESC-3、4、 A^*02    B^*52        Cw^*03    DRB1^*01    DQB1^*05    DQA1^*0101

5            A^*03    B^*22        Cw^*04    DRB1^*03    DQB1^*02    DQA1^*05

phESC-3、4、 A^*02    B^*52        Cw^*03    DRB1^*01    DQB1^*05    DQA1^*0101

5供体        A^*03    B^*22        Cw^*04    DRB1^*03    DQB1^*02    DQA1^*05

phESC-6      A^*02    B^*07        Cw^*04    DRB1^*04    DQB1^*06    DQA1^*01

             A^*03    B^*27        Cw^*07    DRB1^*15    DQB1^*03    DQA1^*03

phESC-6供    A^*02    B^*07        Cw^*04    DRB1^*04    DQB1^*06    DQA1^*01

体           A^*03    B^*27        Cw^*07    DRB1^*15    DQB1^*03    DQA1^*03

phESC-7      A^*01    B^*38        Cw^*06    DRB1^*13    DQB1^*06    DQA1^*0106

             A^*02    B^*57        Cw^*12    DRB1^*14    DQB1^*06    DQA1^*0103

phESC-7供     A^*01     B^*38     Cw^*06     DRB1^*13    DQB1^*06     DQA1^*0106

体            A^*02     B^*57     Cw^*12     DRB1^*14    DQB1^*06     DQA1^*0103

NSF           A^*25     B^*15(62) Cw^*12     DRB1^*04    DQB1^*06     DQA1^*01

              A^*32     B^*18     Cw^*12     DRB1^*15    DQB1^*03     DQA1^*03

【331】源自用作饲养细胞的人成纤维细胞的遗传物质的DNA分布显示：phESC细胞系没有来自人成纤维细胞的物质的污染(表19)。

【332】phESC-1系在10个月的培养过程中，跨越35次传代而保持未分化。另外的细胞系被成功培养至少21代以上。在体外分化后，所有phESC系的细胞在悬浮培养中形成了囊性胚状体并且产生了全部三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层的衍生物(图4)。在铺板5天后，大约5％的来自phESC-1系的胚状体产生跳动的细胞。phESC-6系产生有色的上皮样细胞(图4I、K)。外胚层分化通过对神经元特异性标记神经丝(neurofiliment)68(图4A)、NCAM(图4B)、βIII-微管蛋白(图4C)和神经胶质细胞标记GFAP(图4D、M)的阳性免疫细胞化学染色来显示。分化的细胞对中胚层标记显示阳性，所述标记包括肌肉特异的α辐肌动蛋白(图4G)和结蛋白(图4J)——其是肌肉特异性标记，和内皮标记PECAM-1(图4E)和VE-钙黏着蛋白(图4F)。通过对甲胎蛋白的分化衍生物阳性染色来显示内胚层分化。这些数据表明phESC可以分化为能产生人体所有细胞类型的三个胚层。

【333】phESC-7的改变的核型可能是将其排除在临床应用之外的一个原因。人胚胎中基因组印记的改变可以促进与母本或父本表达基因相关的病症的发展(Gabriel等人，Proc Natl Acad Sci USA(1998)95：14857)。为了研究phESC系的其它特征，并且确定它们在细胞治疗中应用的适合性，进行了印记分析。

【334】如上所概述的，进行RNA印迹并且用DNA探针SNRPN、Peg1_2、Peg1_A、H19和GAPDH(作为内部对照)进行了筛选。印迹的核酸从NSF、新生儿皮肤成纤维细胞获得；hES、人胚胎干细胞系源自受精的卵母细胞；1，phESC-1；2，phESC-3；3，phESC-4；4，phESC-5；5，phESC-6；6，phESC-7。NSF RT-、hES RT-、1RT-是阴性对照。图3示出了印记印迹(imprinting blot)的结果。

【335】母本印记基因Peg1_A在所有测试的细胞系中显示了强的结合。对于母本印记基因H19，在所有细胞系中观测到较弱(相对于Peg1_A)、但一致(consistent)的结合。SNRPN显示结合主要在NSF、hES、phESC-4和phESC-6中。Peg1_2显示结合主要在NSF、hES、phESC-1(较弱的信号)、phESC-3、phESC-5和phESC-6中。GAPDH结合证实了RNA的加载量在所有条带中相似。

【336】角膜形成和组织学

【337】如所述的，通过将球完全浸入在培养基中来培养生长的人工角膜。球的大体视觉检测显示它们是相对透明的组织球，并且可生长到直径超过1厘米(图8)。

【338】在大体检查时，看起来所述球基本上是空的，其包括大约0.5毫米厚的壁。随后的组织学/显微检查显示该样本由两条主要纤维组织组成，其中偶然(occasional)具有成纤维细胞。染色鉴定PAS和Trichrome阴性的基底膜的存在，这暗示了鲍曼氏层(Bowman’s layer)(即，角膜基质)的存在。在纤维组织层之上的是单细胞层，其包括核仁，暗示了是上皮而不是内皮。基于这种分析，推断所述组织样本与角膜相容。

【339】虽然本发明已经对上述实施例进行了描述，但是应理解修改和变化包括在本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅由下述权利要求所限定。

参考文献

1.J.Cibelli等人，Methods for making and using reprogrammed human somaticcell nuclei and autologous and isogenic human stem cells.US Patent ApplicationNo.20030232430，December 18，2003。

2.H.Lin等人，Multilineage potential of homozygous stem cells derived from分裂中期II oocytes.Stem Cells(2003)21：153-161。

3.K.E.Vrana等人，Nonhuman primate parthenogenetic stem cells.PNAS(2003)100(Suppl 1)：11911-11916。

4.J.P.M.Dumoulin等人，Effect of oxygen concentration on human in vitrofertilization and embryo culture.Human Reproduction.(1999)14(2)：465-469。

5.B.Fischer和B.D.Bavister，Oxygen tension in the oviduct and uterus ofrhesus monkeys，hamsters and rabbits.J Reprod Fertil(1993)99：673-679。

6.D.I.Kaufman和J.A.Mitchell，Intauterine oxygen tension during oestrouscycle in the hamster：patterns of change.Comp Biochem Physiol Comp Physiol(1994)107(4)：673-678。

7.F.D.Houghton等人，Oxygen consumption and energy metabolism of the earlymouse embryo.Mol Reprod Dev(1996)44：476-485。

8.A.Van Soom等人，Prevalence of apoptosis and inner cell allocation in bovineembryos cultured under different oxygen tension with or without cysteineaddition.Theriogenology(2002)57(5)：1453-1465。

Claims (36)

1.分离的视网膜干细胞源的人工角膜。

2.权利要求1所述的分离的角膜，其中所述视网膜干细胞是从孤雌激活的人卵母细胞分化的。

3.权利要求1所述的分离的角膜，其中所述角膜是终末分化的。

4.权利要求1所述的分离的角膜，其中所述角膜包括上皮细胞。

5.权利要求4所述的分离的角膜，其中所述角膜包括基质细胞。

6.权利要求1所述的分离的角膜，其中所述角膜具有改变光相速率的能力。

7.权利要求1所述的分离的角膜，其中所述角膜具有大约5毫米到11.5毫米的横径。

8.权利要求1所述的分离的角膜，其中所述角膜在中央具有大约0.5毫米到0.6毫米的厚度并且在周围具有大约0.6毫米到0.8毫米的厚度。

9.权利要求1所述的分离的角膜，其中所述角膜被保藏，ATTC登录号为：     。

10.权利要求2所述的分离的角膜，其中所述角膜与所述卵母细胞供体是组织相容的。

11.权利要求2所述的分离的角膜，其中所述角膜包括同质的线粒体DNA(mtDNA)。

12.权利要求10所述的角膜，其中所述角膜在人中是可移植的。

13.产生人工角膜的方法，包括：

a)孤雌激活人卵母细胞，其中活化包括：i)使所述卵母细胞与离子载体在高O₂压下接触，和ii)使所述卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂在低O₂压下接触；

b)在低O₂压下培养所述步骤(a)的活化的卵母细胞直到胚泡形成；

c)将所述胚泡转移至一层饲养细胞，并且在高O₂压下培养所述转移的胚泡；

d)从所述步骤(c)的胚泡的滋养外胚层机械分离内细胞团(ICM)；

e)在高O₂压下在一层人饲养细胞上培养所述步骤(d)的ICM的细胞，其中可以通过人胚胎干细胞标记(hES)和神经元特异性标记鉴定培养物中的视网膜干细胞，并且其中随后分离所鉴定的视网膜干细胞；

f)在培养基中培养所述步骤(e)的分离的干细胞，所述培养基包含血清代替品(M/SR)、细胞质基因组产物和至少一种促细胞分裂原，所述促细胞分裂原在用DNA合成抑制剂处理的成纤维细胞饲养层上激活gp130/STAT途径和/或MAP激酶途径；

g)在不添加促细胞分裂原的情况下，在包含细胞质基因组产物的M/SR(M/SRP)中培养所述步骤(f)的促细胞分裂原处理的细胞到接近汇合，其中定期用M/SR替换1/2体积的M/SRP，直到接近汇合的细胞发展为色素形成和圆顶外观；和

h)将M/SR中的所述步骤(g)的有颜色的细胞转移到明胶包被的基底上，其中定期用M/SR替换1/2体积的M/SR直到人工角膜形成。

14.权利要求13所述的方法，其中所述角膜在没有3-D支架的情况下形成。

15.权利要求13所述的方法，其中所述促细胞分裂原选自白血病抑制因子(LIF)、bFGF、和它们的组合。

16.权利要求13所述的方法，其中所述DNA合成抑制剂是烷化剂。

17.权利要求16所述的方法，其中所述DNA合成抑制剂是丝裂霉素C。

18.权利要求13所述的方法，其中所述饲养细胞是人细胞。

19.权利要求13所述的方法，其中所述hES标记选自SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-91、OCT-4和它们的组合。

20.权利要求13所述的方法，其中所述神经元特异性标记选自神经丝68、NCAM、β-III微管蛋白、GFAP和它们的组合。

21.视网膜干细胞源的人工角膜，其通过权利要求13所述的方法获得。

22.治疗需要人工角膜的对象的方法，包括用人工角膜替换所述对象的角膜。

23.权利要求22所述的方法，其中所述对象具有损伤的角膜。

24.权利要求22所述的方法，其中所述对象患有影响所述角膜的疾病。

25.权利要求24所述的方法，其中所述疾病选自角膜炎、角膜溃疡、角膜磨损、雪盲、电光性眼炎、锡格森浅层点状角膜病变、角膜上皮营养不良、圆锥形角膜、干性角膜结膜炎、角膜感染和角膜营养不良。

26.鉴定影响眼角膜的剂的方法，包括：

(a)使视网膜干细胞源的人工角膜与剂接触；和

(b)观察在所述剂存在或不存在的情况下所述角膜的变化，其中所述角膜变化表示影响所述角膜的剂。

27.权利要求26所述的方法，其中所述剂对所述角膜具有疗效。

28.权利要求26所述的方法，其中所述剂对所述角膜具有不良作用。

29.权利要求26所述的方法，其中所述角膜的变化选自基因表达的调节、蛋白质表达的调节、混浊度的改变、可塑性的改变、硬度的改变、光相速度的变化和形状的变化。

30.权利要求28所述的方法，其中所述剂是环境化学品。

31.权利要求27所述的方法，其中所述剂是药物。

32.权利要求31所述的方法，其中所述药物是局部药物。

33.用根据权利要求1所述的人工角膜替换眼角膜的方法，包括：

a)从所述眼手术切除所述角膜；

b)将所述人工角膜插入到除去角膜的区域；和

c)使所述人工角膜与所述切除下面的组织连接，以将所述人工角膜固定到所述眼。

34.权利要求33所述的方法，进一步包括：分离角膜的部分外表面，从而形成角膜瓣和角膜床，所述角膜瓣具有前表面和后表面，所述角膜床具有成型的前表面；将所述人工角膜植入所述角膜床上，所述角膜具有前表面和后表面；和替换该分离的角膜部分。

35.将有效量的剂输送到对象的眼睛的方法，包括：

a)用核酸载体转化至少一部分包括权利要求1所述的人工角膜的细胞，其中所述载体编码所述剂；

b)鉴定包含所述步骤(a)的人工角膜的细胞群，所述细胞群表达所述核酸编码的剂；和

c)用所述步骤(b)的人工角膜的转化细胞替换所述对象的角膜细胞，

其中该替换的细胞输送所述剂到所述对象的眼。

36.权利要求35所述的方法，其中所述替换步骤包括用所述步骤(b)的人工角膜替换所述对象的角膜。

Images