CN101512009B - 用于微生物快速检测的阵列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测微生物或微生物类别的方法。更具体地，该方法应用阵列，该阵列含有以预定模式相互间隔位于固体载体上的多个离散区域(称为“地址”)。地址经选择从而使阵列能够针对特定微生物或微生物类别提供独特的光谱响应(如颜色图案)或“指纹图谱”。例如，当存在一种微生物或一类微生物(如革兰氏阴性菌)时，该阵列可以产生特定的光谱响应，而当存在其他的微生物或其他类别的微生物(如革兰氏阳性菌)时则产生完全不同的光谱响应。检测由该阵列产生的不同光谱响应从而可用于区分微生物。

Description

用于微生物快速检测的阵列
发明背景 
快速检测微生物的能力已经成为许多行业，包括医药和食品行业中日益增长的问题。例如，在医药领域，快速检测微生物对正确诊断和治疗疾病尤为重要。令人遗憾的是，某些疾病可能是由复合病原体引起的，因此很难快速检测其病因。由于各种原因，选择性鉴别微生物类型的需求很重要。例如，发现存在何种类型的微生物可以使人们鉴别特定的污染源，从而选择恰当的治疗方法。目前大多诊断方法均包括培养微生物用于鉴别的步骤，该过程通常需要几天，并常给出阴性结果。不仅培养微生物需要很长的过程，而且某些病原体(如分枝杆菌)在宿主外极难生长。虽然已有“无培养”技术，但该技术仅适用于特定的病原体。因此，需要通过许多昂贵且费时的化验来获得诊断结果。 
由此可见，目前需要一种技术能够快速且方便的检测微生物的存在，并鉴别检测微生物的特定类型。 
发明概述 
按照本发明的一个实施方式公开了一种用于检测样品中微生物的方法。该方法包括将样品与阵列接触，该阵列含有以预定模式相互间隔的位于固体载体上的多个单独阵列地址。每个地址含有着色剂，从而使该阵列产生可目视观察到的光谱响应。检测(如目视)光谱响应，将其与一种或多种微生物的存在相关联。 
按照本发明的另一个实施方式公开了一种用于检测样品中微生物的阵列。该阵列含有以预定模式相互间隔的位于固体载体上的多个单独阵列地址。每个地址含有着色剂，从而使该阵列产生可目视观察到的对于一种或多种微生物来说是独特的光谱响应。 
以下进一步详细论述本发明的其他特征和方面。 
附图概述 
对本领域普通技术人员而言，本发明充分公开的内容，包括其最 佳实施方式将在说明书其他部分更加具体的阐述，作为参考的附图中： 
图1是本发明示例性阵列接触测试样品前(图1A)，接触被大肠杆菌(E.coli)感染的测试样品后(图1B)以及接触被金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的测试样品后(图1C)的透视图。 
本发明说明书和附图中重复使用的参照符号用于表示本发明相同或类似的特征或要素。 
代表性实施方式详述 
现在将对本发明各种实施方式作出详细的参考，本发明一个或多个实施例如下所述。各个实施例用于对本发明进行说明，而不用作对本发明的限制。事实上，本领域技术人员可以显而易见的在不背离本发明范围或实质的前提下对本发明进行各种更改和变化。例如，一个实施方式中所列举或描述的特征可用于另一实施方式从而进一步产生其他实施方式。因此，本发明涵盖了在所附权利要求及其等同内容范围内的更改和变化。 
一般而言，本发明涉及检测微生物或微生物类别的方法。更具体而言，该方法应用阵列，该阵列含有以预定模式相互间隔的位于固体载体上的多个离散区域(称为“地址”)。地址经选择从而使阵列能够针对特定的微生物或微生物类别提供独特的光谱响应(如颜色图案)或“指纹图谱”。例如，当存在一种微生物或一类微生物(如革兰氏阴性菌)时，该阵列可以产生特定的光谱响应，而当存在其他的微生物或其他类别的微生物(如革兰氏阳性菌)时，则产生完全不同的光谱响应。检测由该阵列产生的不同光谱响应从而可用于区分微生物。 
阵列地址含有能在一种或多种微生物存在下表现出颜色变化的着色剂。也就是说，该着色剂可以由一种颜色变为另一种颜色，由无色变为有色，或由有色变为无色。本发明的阵列可以使用不同着色剂(如染料、颜料等)。在一个实施方式中，例如，使用能够区分一些种类微生物的pH敏感性着色剂。也就是说，pH敏感性着色剂可以检测微生物培养基中pH的变化。例如，细菌使培养基新陈代谢，产生酸性物质(如CO2)或碱性物质(如氨)，从而使pH发生改变。同样地，某些微生物(如细菌)在其细胞壁上含有高度有机化酸性基团。因为对于不同微生物酸性/碱性变化有所不同，本发明可选择使用pH敏感性着 色剂以配合预期的pH转变。以这种方式，阵列地址可含有pH敏感性着色剂，使其只有在存在表现出特定酸性/碱性变化的微生物时发生可检测的颜色变化。 
酞着色剂是一类可用于本发明阵列的合适的pH敏感性着色剂。例如当pH由6.6转变为8.0时，酚红(即酚磺酞)会由黄色变为红色。在pH高于约8.1时，酚红转变为亮粉(fuschia)色。酚红的衍生物也可适用于本发明，例如被氯、溴、甲基、羧酸钠、羧酸、羟基和胺官能团取代的衍生物。示例性的取代酚红化合物包括例如氯酚红、甲酚红紫(间甲酚磺酞)、甲酚红(邻甲酚磺酞)、邻苯二酚紫(焦甲酚磺酞)、氯酚红(3’，3”-二氯酚磺酞)、二甲苯酚蓝(对二甲苯酚磺酞的钠盐)、二甲酚橙、酸性媒介蓝3(Mordant Blue 3)(C.I.43820)、3，4，5，6-四溴酚磺酞、溴二甲苯酚蓝、溴酚蓝(3’，3”，5’，5”-四溴酚磺酞)、溴氯酚蓝(二溴-5’，5”-二氯酚磺酞的钠盐)、溴甲酚紫(5’，5”-二溴-邻-甲酚磺酞)、溴氯酚绿(3’，3”，5’，5”-四溴-邻-甲酚磺酞)等等。其他合适的酞着色剂是本技术领域众所周知的，可包括溴麝香草酚蓝、百里酚蓝、溴甲酚紫、百里酚酞和酚酞(通用指示剂的常用成分)。例如，当pH由4.8转变为6.4时，氯酚红会由黄色变为红色；当pH由6.0转变为7.6时，溴麝香草酚蓝会由黄色变为蓝色；当pH由9.4转变为10.6时，百里酚酞会由无色变为蓝色；当pH由8.2转变为10.0时，酚酞会由无色变为粉红色；当pH由1.2转变为2.8时，百里酚蓝会由红色变为黄色，当pH由8.0转变为9.6时，百里酚蓝会再由黄色变为pH；当pH由3.0转变为4.6时，溴酚蓝会由黄色变为紫色；当pH由3.8转变为5.4时，溴甲酚绿会由黄色变为蓝色；当pH由5.2转变为6.8时，溴甲酚紫会由黄色变为紫色。 
羟基蒽醌类是另一类可用于本发明的合适的pH敏感性着色剂。羟基蒽醌类具有以下通式： 
通式中编号1-8表示稠环结构上可以被官能团取代的位置。对羟基蒽醌类而言，至少官能团之一为羟基或含有羟基(-OH)的基团。可以在稠合环结构上被取代的官能团的其它例子包括卤素(如氯或溴)、磺酰基(如磺酸盐)、烷基、苄基、氨基(如伯胺、仲胺、叔胺或季铵)、羧基、氰基、含磷基团等。本发明可适用的羟基蒽醌类包括酸性媒介红11(Mordant Red 11)(茜素)、酸性媒介红3(Mordant Red 3)(茜素红S)、茜素黄R(Alizarin Yellow R)、茜素络合酮(Alizarin Complexone)、酸性媒介黑13(Mordant Black 13)(茜素蓝黑B)、酸性媒介紫5(Mordant Violet 5)(紫色茜素3R)、茜素黄GG(Alizarin Yellow GG)、天然红4(Natural Red 4)(胭脂红酸)、氨基-4-羟基蒽醌、大黄素(Emodin)、核固红(Nuclear Fast Red)、天然红16(Natural Red 16)(紫色素)、醌茜素等。例如，当pH由3.0转变为5.5时，胭脂红酸会由橙色变为红色，当pH由5.5转变为7.0时，胭脂红酸会再由红色变为紫色。另外，当pH由10.1转变为12.0时，茜素黄R会由黄色变为橙红色。 
芳族偶氮化合物类化合物是另一类可用于本发明阵列的合适的pH敏感性着色剂，具有以下通式： 
X-R1-N＝N-R2-Y 
其中 
R1是芳基； 
R2选自由脂族基和芳基组成的组； 
并且 
X和Y独立选自由氢、卤素、-NO2、-NH2、芳基、烷基、烷氧基、磺酸基、-SO3H、-OH、-COH、-COOH、卤素等基团组成的组。偶氮类衍生物同样适用，如氧化偶氮类化合物(X-R1-N＝NO-R2-Y)或肼撑类化合物(X-R1-NH-NH-R2-Y)。偶氮类化合物(或其衍生物)的具体例子包括甲基紫、甲基黄、甲基橙、甲基红和甲基绿。例如当pH由0转变为1.6时，甲基紫会由黄色变为蓝紫色；当pH由2.9转变为4.0时，甲基黄会由红色变为黄色；当pH由3.1转变为4.4时，甲基橙会由红色变为黄色；当pH由4.2转变为6.3时，甲基红会由红色变为黄色。 
芳基甲烷类(如二芳基甲烷类和三芳基甲烷类)是另一类可用于本发明的合适的pH敏感性着色剂。例如三芳基甲烷无色共价化合物具有以下通式： 
其中R、R’和R”独立选自取代或未取代的芳基，如苯基、萘基、蒽基等。芳基可以被官能团取代，如氨基、羟基、羰基、羧基、磺基、烷基和/或其它已知官能团。三芳基甲烷无色共价化合物的例子包括隐性孔雀石绿(Leucomalachite Green)、碱性副品红(Pararosaniline Base)、结晶紫内酯(Crystal Violet Lactone)、隐性结晶紫(Crystal Violet Leuco)、结晶紫(Crystal Violet)、氯碱性紫1(Cl Basic Violet 1)、氯碱性紫2(ClBasic Violet 2)、氯碱性蓝(Cl Basic Blue)、氯维多利亚蓝(Cl VictoriaBlue)、N-苯甲酰基白美(N-benzoyl leuco-methylene)等。合适的二芳基甲烷无色共价化合物的例子可包括4，4’-双(二甲氨基)二苯甲醇(也被称为“Michler’s hydrol”)，Michler’s hydrol leucobenzotriazole，Michler’s hydrol leucomorpholine，Michler’s hydrolleucobenzenesulfonamide等。在一个具体实施方式中，着色剂是隐形孔雀石绿原醇(Leucomalachite Green Carbinol)(Solvent Green 1)或其类似物，其通常为无色并具有以下结构： 
在酸性条件下，(Leucomalachite Green Carbinol)结构中的一个或多个游离氨基将质子化，形成孔雀石绿(Malachite Green)(也被称作苯胺绿(Aniline Green)、碱性绿4(Basic Green 4)、钻石绿B(Diamond Green B)或维多利亚绿B(Victoria Green B))，其具有以下结构： 
当pH由0.2转变为1.8时，孔雀石绿会典型的由黄色变为蓝绿色。PH高于1.8时，孔雀石绿会转变为深绿色。 
阵列中其它合适的pH-敏感性着色剂包括刚果红、石蕊(石蕊精)、亚甲基蓝、中性红、酸性品红、靛蓝胭脂红、亮绿、苦味酸、间胺黄、间甲酚紫、喹哪啶红、金莲橙OO、2，6-二硝基苯酚、焰红染料B、2，4-二硝基苯酚、4-二甲基氨基偶氮苯、2，5-二硝基苯酚、1-萘红、氯酚红、苏木紫、4-硝基酚、硝嗪黄、3-硝基酚、碱性蓝(Alkali Blue)、依波西隆蓝(Epsilon Blue)、尼罗蓝A(Nile Blue A)、常用指示剂等等。例如当pH由3.0转变为5.2时，刚果红由蓝色变为红色；当pH由4.5转变为8.3时，石蕊由红色变为蓝色；当pH由11.4转变为13.0时，中性红由红色变为黄色。 
除了pH，其他机制也可以是导致着色剂颜色变化的全部或部分因素。例如，许多微生物(如细菌和真菌)在培养基中产生低分子量的铁络合物，被称为“含铁细胞”。本发明某些实施方式中可使用金属络合性着色剂，当存在含铁细胞时即发生颜色变化。金属络合性着色剂的具体合适类型是芳香偶氮化合物，如铬黑T、铬蓝SE、铬蓝黑B、铬菁R、二甲酚橙、铬天青S、胭脂红酸等。其他合适的金属络合着色剂可包括茜素络合酮、茜素S、偶氮胂III、金精三羧酸、2，2’-联吡啶、溴邻苯三酚红、钙试剂(铬蓝黑R)、钙羧酸指示剂、变色酸、二钠盐、Cuprizone、5-(4-二甲氨基-苯亚甲基)绕丹宁、丁二酮肟、1，5-二苯碳酰二肼，双硫腙、荧光素络合酮(Alizarin Complexone)、苏木紫、8-羟基喹啉、2-巯基苯并三唑、甲基百里酚蓝、紫脲酸铵、1-亚硝基-2-萘酚、2-亚硝基-1-萘酚、亚硝基-R-盐、1，10-邻菲咯啉、苯基荧光酮、酞紫、1-(2-吡啶偶氮)萘酚、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚、邻苯三酚红、偶氮砜III、5-磺基水杨酸、4-(2-噻唑偶氮)间苯二酚、钍试剂、 Thymolthalexon、钛试剂(Tiron)、Tolurnr-3，4-二硫醇、Zincon等。应当指出的是前述一种或多种pH敏感性着色剂也可以归类为金属络合性着色剂。 
当然，只要阵列所提供的整体光谱响应是独特的，着色剂没有必要能够独立区分特定微生物。在这方面，着色剂也可用于在广谱微生物存在下产生可检测的颜色变化。例如，溶剂化显色着色剂在广谱微生物存在下能够产生可检测的颜色变化。更具体的，溶剂化显色着色剂在基于溶剂极性和/或氢键作用的特定分子环境中可产生颜色变化。例如，溶剂化显色着色剂在极性条件下(如水)呈蓝色，而在非极性条件下(如富脂溶液中)呈黄色或红色。溶剂化显色着色剂产生的颜色取决于着色剂在基态和激发态不同的分子极性。 
部花青(Merocyanine)着色剂(如单-、双-、和三-部花青类)是可用于本发明的一种溶剂化显色着色剂。部花青着色剂，如部花青540属于Griffiths在“Colour and Constitution of Organic Molecules”Academic Press，London(1976)中所述的供体-单受体着色剂类型。更具体的，部花青着色剂含有由共轭链分开的碱性核和酸性核，该共轭链具有偶数个次甲基碳。该着色剂具有羰基作为受电子基团。该电子受体与电子供体基团如羟基或氨基共轭结合。部花青着色剂可以是环状或非环状的(如环部花青着色剂的乙烯基间隔(vinylalogous)酰胺)。例如，环部花青着色剂通常具有以下结构： 
其中，n是任意整数，包括0。如通式1和1’中，部花青着色剂通常具有分离电荷(即“两性离子”)共振形式。两性离子着色剂具有正电荷和负电荷，整体为净中性，但是具有多电荷。不受理论的限制，一般认为两性离子形式是主要的着色剂基态。这种着色剂颜色的产生取决于该着色剂在基态和激发态不同的分子极性。如结构式2所示，部花青着色剂的具体例子之一基态比激发态具有更大的极性。 
左侧电荷分离的典型2是基态的主要形式，而右侧的典型2’则是第一激发态的主要形式。其他合适部花青着色剂的例子如结构式3-13所示。 
其中“R”是基团，如甲基、烷基、芳基、苯基等。 
靛青是本发明可使用的另一类合适的溶剂化显色着色剂。靛青基态的极性显著低于激发态。例如，靛青通常具有以下结构14： 
左侧典型形式14是着色剂基态的主要形式，而右侧的典型14’是激发态的主要形式。 
本发明可使用的其他合适的溶剂化显色着色剂包括具有永久两性离子形式的着色剂。也就是说，这些着色剂具有处于连续兀电子体系中的形式正电荷和负电荷。与上述部花青着色剂不同，该永久两性着色剂的中性共振结构不会被破坏。这类着色剂的例子包括N-酚盐甜菜碱着色剂，其具有如下通式： 
其中R广R5独立地选自氢，硝基(如氮)，卤素，饱和或不饱和、未取代或在相同或不同碳原子上任意被一个、两个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、苯基、芳基、吡啶基或烷氨基取代的直链、支链或环状的C广C20基团(如烷基、苯基、芳基、吡啶基等)组成的组。例如，N-酚盐甜菜碱着色剂可以是4-(2，4，6-三苯基吡啶-1-基)-2,6-二苯基苯氧内盐(Reichardt’s染料)，其具有如下结构15： 
Reichardt’s染料具有强负电子溶剂显色效应，当存在细菌时会发生明显的由蓝色变为无色的颜色变化。更确切地说，当溶剂洗脱强度(极性)增加，Reichardt’s染料的吸光率转变为更短的波长，因而产生可见的颜色变化。其他合适的负电子溶剂化显色吡啶N-酚盐甜菜碱着色剂如结构式16-23所示： 
其中R是氢、-C(CH3)3、-CF3或C6F13。 
其他具有永久两性离子形式的着色剂的例子包括具有通式24的着色剂： 
其中，n为0或大于0，X为氧、碳、氮、硫等。具有结构24的永久两性离子着色剂的具体例子包括以下结构25-33。 
其他合适的溶剂化显色着色剂可包括但不限于4-二氰基亚甲基-2-甲基-6-(对-二甲氨基苯乙烯基)-4H-吡喃(DCM)；6-丙酰基-2-(二甲氨基)萘(普罗丹)；9-(二乙氨基)-5H-苯并[a]酚噁嗪-5-酮(尼罗红)；4-(二氰基乙烯基)久洛尼定(DCVJ)；苯酚蓝；芪着色剂；香豆素着色剂；氧代花青着色剂；N，N-二甲基-4-硝基苯胺(NDMNA)和N-甲基-2-硝基苯胺(NM2NA)；尼罗蓝；1-苯氨基萘-8-磺酸(1，8-ANS)，dapoxyl丁基磺酰胺和其他dapoxyl类似物。除了上述着色剂，其他适用于本发明的着色剂包括但不限于4-[2-N-取代-1，4-氢吡啶-4-亚基]亚乙基]环己-2，5-二烯-1-酮、红吡唑啉酮着色剂、偶氮甲碱着色剂、靛苯胺着色剂和其混合物。 
虽然前述着色剂是根据其颜色变化机理分类的(如pH敏感、金属络合物或溶剂化显色)，应理解的是本发明并不局限于颜色变化的任何具体机理。例如，当使用pH敏感性着色剂时，其他机理也可以是导致着色剂颜色变化的全部或部分因素。例如，着色剂和微生物间的氧化还原反应也可能导致颜色变化。 
如前所述，只要阵列产生独特的光谱响应，对本发明特定着色剂的选择并不重要。各个阵列地址可通过不同的方式使其达到这个目的。在一个具体的实施方式中，各个阵列地址可含有在微生物存在条件下分别能够产生光谱响应的着色剂。例如，一个阵列地址可含有在酸性pH下发生颜色变化的pH敏感性着色剂，而另一个阵列可含有在中性 或碱性条件下发生颜色变化的pH敏感性着色剂。可选择的，阵列地址可仅仅含有不同化学类型的着色剂，无论它们具有何种颜色变化机制。例如第一个阵列地址可含有酞类着色剂，第二个阵列地址可含有芳香偶氮类着色剂，第三个阵列地址可含有蒽醌类着色剂，而第四个阵列地址可含有芳基甲烷类着色剂。当然，各个阵列地址之间光谱的差别并不一定需要由使用不同的着色剂来产生。例如，各个阵列地址可使用相同的着色剂，但是通过不同的浓度来产生不同的光谱响应。特定地址也可含有相同浓度的相同着色剂，只要整个阵列能够产生独特的光谱响应。 
除了各个阵列地址的组合物，也可通过选择性控制阵列的其他方面来增强其产生独特光谱响应的能力。影响阵列产生独特光谱响应的因素之一是使用的阵列地址的数量。也就是说，单个阵列地址的数量越多就能增强不同微生物光谱响应的差异程度。然而，过多的地址也会增加直观区分光谱响应的难度。因此，在本发明的大部分实施方式中，阵列含有2至50个阵列地址，在某些实施方式中含有3至约40个阵列地址，在某些实施方式中含有4至20个阵列地址。阵列中使用的地址数量基本上或至少部分取决于所选用的着色剂的性质。也就是说，如果选择的着色剂在微生物存在条件下具有相似的颜色变化，则需要大量的地址来产生需要的光谱响应。 
影响阵列产生独特光谱响应能力的另一因素是各个阵列地址的结构(如大小、间距、排列等等)。各个阵列地址应具有能直观观察的大小，而不会过度增加固相载体的大小。例如，地址的宽度(或直径)范围为0.01至约100毫米，在某些实施方式中为约0.1至约50毫米，在某些实施方式中为约1至约20毫米。地址的形状也可加强对光谱响应的直观观察。例如，地址可以是条纹、带、点或任何其他的几何形状。地址也可相互间隔一定距离以产生更加直观的光谱响应。例如，两个或多个独立阵列地址之间的距离范围为约0.01至约100毫米，在某些实施方式中为约0.1至约50毫米，在某些实施方式中为约1至约20毫米。阵列的总体结构实质上可具有任何需要的形状。 
本发明阵列的一个具体实施方式如图1所示。例如，图1A中，阵列81含有十六(16)个以四(4)行和四(4)列相互间隔的点的形式存在的单个阵列地址83。在这个实施方式中各个地址83含有着色剂。 例如，第一组地址83a可含有在大肠杆菌存在下会发生颜色变化的着色剂，第二组地址83b可含有在金黄色葡萄球菌存在下会发生颜色变化的着色剂。当被大肠杆菌感染的样品接触阵列时，第一组地址83a会发生颜色变化，而第二组地址83b仍然会保持相同的颜色或仅仅产生微小的颜色变化(图1B)。当被金黄色葡萄球菌感染的皮肤样品接触阵列时，第二组地址83b会发生颜色变化，而第一组地址83a仍然会保持相同的颜色或仅仅产生微小的颜色变化(图1C)。 
本发明的阵列位于固相载体上，然后将其于实验样品接触。固相载体可以由不同材料制成，如薄膜、纸张、非织造布网、针织面料、梭织面料、泡沫、玻璃等。例如用于形成固相载体的材料可包括但不限于天然、合成或经综合改良的天然存在的材料，如多糖(例如纤维素材料，如纸和纤维素衍生物，如醋酸纤维素和硝化纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙聚偏氟乙烯；(PVDF)；涤纶；聚丙烯；二氧化硅；无机材料，如去活氧化铝、硅藻土、硫酸镁，或其它均匀分散在多孔聚合基体中的无机微细材料，聚合物如氯乙烯、氯乙烯、丙共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯共聚物；布，包括天然的(如棉花)和合成的(如尼龙或人造丝)；多孔凝胶，如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；高分子薄膜，如聚丙烯酰胺；等等。 
虽然没有要求，着色剂可以含有流动载体的组合物形式涂布于固相载体上。载体可以是液体、气体、凝胶等，可以经选择从而能够产生着色剂需要的性能(颜色变化的时间，不同区域的差异和灵敏度)。在某些实施方式中，例如载体可以是水溶剂，如水，也可以是非水溶剂，如二醇类(如丙二醇、丁二醇、三乙二醇、己二醇、聚乙二醇、乙氧基二甘醇和一缩二丙二醇)；醇类，(如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇)；甘油三酯；乙酸乙酯；丙酮；甘油酯；乙腈；四氢呋喃；二甲苯；甲醛(如二甲基甲酰胺，“DMF”)等。 
阵列地址中还可加入其他附加剂，该附加剂可以与着色剂组合物单独或联合使用。在一个实施方式中，例如环糊精被用于增加着色剂的灵敏度和各个阵列地址间的差异。不受理论的限制，发明人认为这些附加剂有可能抑制着色剂的结晶化，从而产生更加鲜明的颜色，增强检测的灵敏度。也就是说，单个的着色剂分子对微生物具有更大的灵敏度，因为各个着色剂分子可以不受限制的与细胞膜相互作用。相 反，着色剂的细小结晶需要先溶解再穿越细胞膜。合适的环糊精的例子包括但不限于羟丙基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、γ-环糊精、羟丙基-γ-环糊精和羟乙基-γ-环糊精，可以由Cerestar International ofHammond，Indiana市售获得。 
表面活性剂也可用于增强着色剂的灵敏度和不同地址间的差别。特别理想的表面活性剂是非离子表面活性剂，如烷基酚聚氧乙烯基醚、乙氧基化或丙氧基化脂肪醇、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、脂肪(C8-C18)酸乙氧基酯、环氧乙烷与长链胺或酰胺的缩合物、环氧乙烷与醇的缩合物、炔二醇或其混合物。合适表面活性剂的多种特定例子包括但不限于甲基葡糖醇聚醚-10、PEG-20甲基葡糖二硬脂酸酯、PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯、C11-15链烷醇聚醚-20、鲸蜡醇聚醚-8、鲸蜡醇聚醚-12、十二烷基苯酚聚醚-12、月桂醇聚醚-15、PEG-20蓖麻油、聚山梨醇酯20、硬脂醇聚醚-20、聚氧乙烯-10十六烷基醚、聚氧乙烯-10硬脂醚、聚氧乙烯-20十六烷基醚、聚氧乙烯-10油基醚、聚氧乙烯-20油基醚、壬酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基酚聚氧乙烯醚、或含有3-20个乙氧基的脂肪醇(C6-C22)聚氧乙烯基醚、聚氧乙烯-20异十六烷基醚、聚氧乙烯-23甘油月桂酸，聚氧乙烯-20甘油硬脂酸，PPG-10甲基葡萄糖醚，PPG-20甲基葡萄糖醚，聚氧乙烯-20失水山梨醇单酯、聚氧乙烯-80蓖麻油、聚氧乙烯-15三十三烷基醚、聚氧乙烯-6三十三烷基醚、月桂醇聚醚-2、月桂醇聚醚-3、月桂醇聚醚-4、PEG-3蓖麻油、聚乙二醇600二油酸酯、聚乙二醇400二油酸酯和其混合物。市售的非离子表面活性剂包括AirProducts and Chemicals of Allentown出售的SURFYNOL 系列炔二醇表面活性剂，和Fischer Scientific of Pittsburgh，Pennsylvania出售的TWEEN 系列聚氧乙烯类表面活性剂。 
可使用粘合剂促进着色剂固定在固相载体上。例如，水溶性有机聚合物可作为粘合剂，如多聚糖或其衍生物。多聚糖是具有重复糖单元的多聚物，可以是阳离子、阴离子、非离子物质和/或两性物质。在一个具体实施方式中，多聚糖是非离子、阳离子、阴离子和/或两性纤维素醚。合适的非离子纤维素醚包括但不限于烷基纤维素醚，如甲基纤维素和乙基纤维素；羟烷基纤维素醚，如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基羟丁基纤维素、羟乙基羟丙基纤维素、羟乙基羟丁基纤 维素和羟乙基羟丙基羟丁基纤维；烷基羟烷基纤维素醚，包括甲基羟乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基羟丙基纤维素、甲基乙基羟乙基纤维素和甲基乙基羟丙基纤维素等等。 
将着色剂组合物以单个阵列地址的形式涂布于固相载体的合适技术包括印刷、浸渍、喷涂、熔融挤压、包衣(例如溶剂包衣、粉末包衣、刷涂等)、喷涂等等。印刷技术可包括例如凹版印刷、柔版印刷、丝网印刷、激光打印、热色带打印，活塞印刷等。在一个具体实施方式中，使用喷墨打印技术来形成载体上的阵列。喷墨打印是一种非接触式印刷技术，包括使油墨通过一个喷嘴(或一系列喷嘴)以形成滴向载体的液滴。通常使用两种技术，即“DOD”(按需喷墨)或“连续式”喷墨印刷。在连续的系统中，墨水在压力下以连续流通过一个口或喷嘴喷出。用增压器扰动该液流，使该液流在距离口固定的位置转化为液滴。各个系统中的增压器可以是压电晶体、声装置、热装置等等。喷墨系统类型的选择根据打印头打印材料的类型而变化。例如，由于液滴的静电偏离，导电材料有时需要用于连续打印系统。因此，当样品通道由绝缘材料形成时，DOD打印技术将更加适用。 
着色剂组合物可用任何已知的组分和/或方法以印刷油墨的形式形成。例如，印刷油墨可含有水作为载体，特别是去离子水。油墨中还可以含有不同的共-载体，如内酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-甲基乙酰胺、N-甲基吗啉-N-氧化物、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基甲酰胺、丙烯乙二醇-单甲醚、四氢噻吩砜、三丙烯乙二醇单甲醚、丙烯乙二醇和三乙醇胺(TEA)。保湿剂也可使用，如乙二醇；二甘醇；甘油；聚乙二醇200、300、400和600；丙烷-1，3-二醇；丙二醇单甲醚，如DowanolPM(Gallade Chemical Inc.，Santa Ana，CA)；多元醇；或其混合物。还可含有其他添加剂以改善油墨性能，例如螯合金属离子的螯合剂可以参与随着时间推移而发生的化学反应，腐蚀抑制剂可以帮助保护打印机或油墨传输系统的金属部件，表面活性剂则可用于调节油墨的表面张力。可用于油墨中的其他组分，如着色剂稳定剂、光引发剂、粘合剂、表面活性剂、电解盐、pH调节剂等可按照美国专利5,681,330中Nohr等所述的和美国专利6,542,379中Nohr等所述的使用，为了所有目的将其全部内容引入作为参考。 
阵列地址中着色剂的确切用量将根据不同的因素而有所变化，包 括着色剂的灵敏度、其他附加剂的存在、检测能力的需要程度(如用肉眼)、微生物预测浓度等。在某些情况下，只需要检测在一定阈值浓度范围内微生物的存在(如病原)。例如，本发明中可以被检测的微生物浓度为大于或等于约每毫升测试样本1×103个菌落形成单位(“CFU”)，在某些实施方式中大于或等于约1×105CFU/ml，在某些实施方式中大于或等于约1×106CFU/ml，在某些实施方式中大于或等于约1×107CFU/ml。因此，着色剂的使用量应当足以使其在存在的微生物浓度为每毫升测试样品至少约1×103CFU时能够产生可检测的颜色变化。例如，着色剂的使用浓度为约0.1至约100毫克每毫升载体，在某些实施方式中为约0.5至约60毫克每毫升载体，以及在某些实施方式中为约1至约40毫克每毫升载体。 
本发明阵列的光谱响应提供了与其接触的样品中是否存在微生物的信息。如果需要，反应阵列的响应可以与对照阵列相比较(直观的或用仪器辅助)，对照阵列与测试阵列对微生物的反应性方面相同或相似。多个对照阵列也可应用于一定浓度下不同类型的微生物。经比较，可以通过选择与反应测试阵列具有相同或大体上相似的光谱响应的对照阵列来鉴别微生物，然后使所选择的对照阵列与一种特定的或一类微生物相关联。另外，阵列本身可含有一种或多种在微生物存在条件下不会产生可检测的颜色变化的着色剂，从而使该着色剂用于比较或对照。 
阵列的光谱响应可目视观察或用仪器检测。在一个实施方式中，用光阅读机来测量颜色强度。光阅读机的实际构造和结构可根据本领域技术人员的常识而变化。通常，光阅读机含有能够发射电磁辐射的照射源，以及能够记录信号(如透射光或反射光)的探测器。照射源可以是本技术领域公知的任何可以产生电磁辐射的设备，如产生可见区或近可见区(例如红外线或紫外线)的光。例如，本发明可以使用的合适的照射源包括但不限于发光二极管(LED)、闪光灯、冷阴极荧光灯、电致发光灯等等。照射源可以是多元的和/或校准的。在某些情况下，照射源可脉冲以减少任何背景干扰。进一步，照射源可以是连续的，也可以是联合了连续波(CW)和脉冲光源的，其中多种照射光束复合使用(如脉冲光束与CW光束复合)从而能够信号识别由CW源产生的信号和由脉冲源产生的信号。例如，在某些实施方式中，可 以使用LEDs(如铝镓砷化物红色二极管、磷化镓绿色二极管、砷化镓磷化绿色二极管或铟镓氮化物紫/蓝/紫外线(UV)二极管)来产生脉冲照射源。适于本发明使用的市售的合适UV LED激发二极管是Model NSHU55OE(Nichia Corporation)，发射正向电流为10毫安(3.5-3.9伏)的750至1000微瓦的光能，产生最大半数全幅为10度、峰值波长为370-375纳米、和光谱半宽为12纳米的光束。 
在某些情况下，照射源可对着色剂提供漫射照明。例如，多点光源(如LED)阵列可单独用于提供相对的漫射照明。另一个能够以相对便宜的方式提供漫射照明的具体需要的照射源是电致发光(EL)器件。EL器件通常为利用位于电极中间发光材料(如荧光粉)的电容器结构，至少一个电极允许光透过。通过电极间的电压在发光材料中产生变化的电场从而使其发光。 
探测器通常是本技术领域已知的可用于输出信号的任何器件。例如，探测器可以是电子成像探测器，使空间分辨成形。电子成像传感器的例子包括高速、线性电荷耦合器件(CCD)、电荷注入器件(CID)、互补金属氧化物半导体(CMOS)器件等。例如，尽管包括单一的探测器像素或光传感器的线性成像探测器(例如，线性CCD探测器)也可以使用，例如用于扫描图像，但是所述图像探测器一般是二维数组的电子光传感器。每个阵列含有一系列已知的、独特的位点，被称做“地址”。图像探测器中的每个地址被覆盖一个区域的传感器占据(如该区域典型形状为盒状或长方形)。例如，探测器象素可以是CCD、CID或CMOS探测器或任何其他探测或检测光的器件或探测器。探测器象素的规格范围可以很广，在某些情况下可以具有低至0.2微米的直径或长度。 
在另外的实施方式中，探测器可以使用缺少空间分辨能力的光探测器。例如所述光探测器的例子包括光电倍增管器件，光电二极管，如雪崩光电二极管或硅光电二极管等等。硅光电二极管有时是有利的，因为它们便宜、敏感、能够高速运行(短期上升/高带宽)，并轻松集成到大多数其他半导体技术和单片电路。另外，硅光电二极管体积小，使他们能够很容易纳入各类检测系统。如果使用硅光电二极管，发射信号的波长范围400至1100纳米均能在其灵敏度范围内。 
光阅读机可通常使用任何已知的探测技术，包括例如发光(如荧 光、磷光等等)、吸光(例如荧光或非荧光)、衍射等等。在本发明一个具体实施方式中，光阅读机以吸光的功能测量颜色强度。在一个实施方式中，使用Dynex Technologies of Chantilly，Virginia(Model # MRX)的酶标仪测量吸光度读数。在另一个实施方式中，使用Pocket Guide toDigital Printing，F.Cost，Delmar Publishers，Albany，NY.ISBN0-8273-7592-1，第144和145页中记载的被称为“CIELAB”的常规实验方法测量吸光度读数。该方法定义三个变量L*、a*和b*，其对应于基于拮抗色学说感知颜色的三个特征。三个变量具有如下定义： 
L*＝光亮度(或发光度)，范围为0至100，0＝暗，100＝亮； 
a*＝红/绿轴，范围约从-100至100；正值为带红色的，负值为带绿色的；和 
b*＝黄/蓝轴，范围约从-100至100；正值为带黄色的，负值为带蓝色的。 
因为CIELAB颜色空间有些视觉统一，可计算单个数值代表被人所感知的两种颜色的差别。该差别为ΔE，根据两种颜色的三个差量(ΔL*、Δa*和Δb*)的平方和的平方根计算。在CIELAB颜色空间中每个ΔE量约等于两种颜色“恰可识别”的差异。因此CIELAB是目标图案-独立色彩指标体系好的测量方法，可用作参考颜色空间以达到颜色管理和颜色改变表达的目的。使用该测试，颜色强度(L*、a*和b*)可用例如Minolta Co.Ltd.of Osaka，Japan(Model#CM2600d)的手持分光光度计测量。该仪器使用D/8几何学以符合CIE No.15，ISO 7724/1，ASTME1164和JIS Z8722-1982(漫射照明/8-度可视系统。由试样表面的夹角8度反射至正常表面的D65光被试样测量光学系统接收。其他合适的光阅读机包括美国专利申请公开号2003/0119202中Kaylor等所述的反射比分光光度计，为了所有目的，将其全部内容引入作为参考。同样的，发射模式检测体系也可用于本发明。 
由于本发明，发现了通过使用阵列对一种或一类微生物产生独特的光谱响应来检测微生物污染。依照本发明可检测的微生物包括但不限于细菌、酵母菌、真菌、霉菌、原生动物、病毒等。依照本发明可以检测的几个相关的菌群包括但不限于革兰氏阴性杆菌(如肠杆菌(Entereobacteria))；革兰氏阴性弯曲杆菌(例如，vibious、螺旋杆菌(Heliobacter)、弯曲杆菌(Campylobacter)等)；革兰氏阴性球菌(如淋球 菌(Neisseria))，革兰氏阳性杆菌(如苏云金芽孢杆菌(Bacillus)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)等)；革兰氏阳性球菌(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)，链球菌(Streptococcus)等)；专性细胞内寄生虫(例如立克次氏体(Ricckettsia)和衣原体(Chlamydia))；抗酸杆菌(如分枝杆菌(Myobacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)等)；螺旋菌(如梅毒(Treponema)、疏螺旋体(Borellia)等)；和支原体(即缺乏细胞壁的微小细菌)。特别有关的细菌包括大肠杆菌(E.coli)(革兰氏阴性杆菌)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)(革兰氏阴性杆菌)、链球菌(Streptococcus)(革兰氏阳性球菌)，猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)(革兰阴性杆菌)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)(革兰氏阳性球菌)和绿脓杆菌(P.aeruginosa)(革兰阴性杆菌)。 
除了细菌，其他感兴趣的微生物包括霉菌、酵母菌(如白色念珠菌(Candida albicans))，其属于真菌类。例如接合菌亚门是真菌的一类，包括黑面包霉菌和其他与动植物具有共生关系的霉菌。这些霉菌能够融合并形成顽固的“接合孢子”。子囊菌亚门是另一类真菌，其包括酵母、粉状霉菌、黑和蓝-绿霉菌和一些能够导致如荷兰榆树病，苹果黑星病和麦角症等疾病的种类。真菌的整个生命周期结合了有性和无性繁殖，菌丝再细分为允许细胞核和细胞质通过的多孔壁。半知菌门是另一类真菌，其包括各种类型不能分入前述种类或担子菌门类(其中包括大多数的蘑菇、多孔真菌和尘菌)的真菌。半知菌门不仅包括能够生产干酪和青霉素的种类，而且还包括许多导致疾病的种类，如导致脚气和癣。 
无论如何，本发明阵列的光谱响应是快速的，可以在相对短的时间内检测。例如，光谱响应发生在约等于或小于20分钟，在某些实施方式中约等于或小于10分钟，在某些实施方式中约等于或小于3分钟，在某些实施方式中约10秒钟至约2分钟。在这种方式下，阵列可提供“实时”显示表明存在或不存在一种或一类微生物。 
通过以下实施例的参考将更有利于理解本发明。 
实施例 
实验材料 
除非另有说明，所有试剂和溶剂均由Sigma-Aldrich化学公司，Inc. of St.Louis，Missouri获得，并且未经纯化使用。在研究中使用的微生物是： 
1.革兰氏阴性菌(活菌) 
-大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC#8739)(E.coli) 
-绿脓杆菌(Psuedomonas aeruginosa)(ATCC#9027)(P.aeruginosa) 
-肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC#4352)(K.pneumoniae) 
-奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)(ATCC #7002)(P.mirabilis) 
-流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(ATCC#49247)(H.influenzae) 
-腔隙莫拉菌(Moraxella lacunata)(ATCC #17972)(M.lacunata) 
2.革兰氏阳性菌(活菌) 
-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC #6538)(S.aureus) 
-嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(ATCC#11975)(L.acidophilus) 
-表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(ATCC#12228)(S.epidermidis) 
-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC #19659)(B.subtilis) 
-粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(ATCC #29212)(E.faecalis) 
-酿脓葡萄球菌(Streptococcus pyogenes)(ATCC #10782)(S.pyogenes) 
-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(ATCC #10015)(S.pneumoniae) 
3.酵母(活菌) 
-白色念珠菌(Candida albicans)(ATCC #10231)(C.alhicans) 
4.霉菌(活菌) 
-出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)(ATCC#16622)(A.pullulans) 
-微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)(ATCC#10069)(P.janthinellum) 
研究中所使用的着色剂及其结构列于表1中： 
表1：实施例着色剂及其结构 
实施例1 
测试不同着色剂在金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、白色念珠菌(C.albicans)微生物存在时发生颜色变化的能力。测试的着 色剂是Reichardt’s染料、1-二十二烷基-4-(4-羟基苯乙烯基)吡啶溴化物、3-乙基-2-(2-羟基-1-丙烯基)苯并噻唑氯化物、4-[(1-甲基-4(1H)-亚吡啶基)亚乙基]-2，5-环己二烯-1-酮水合物、N，N-二甲基靛苯胺、醌茜素、部花青540、铬蓝SE(羊毛铬蓝B)、酚红、尼罗蓝A、1-(4-羟基苯基)-2，4，6-三苯基吡啶氢氧化物内盐水合物、偶氮甲碱-H单钠盐水合物、靛胭脂红、亚甲紫、铬蓝黑B、猩红酸性品红溶液、亚甲蓝、尼罗红、锥虫蓝、沙黄O、结晶紫、甲基橙和铬天青S。 
除非另有说明，着色剂均溶于二甲基甲酰胺(DMF)。然后，用移液管将着色剂溶液移至15-cm滤纸(由VWR International-Catalog No.28306-153获得)，使其干燥。将滤纸分割为四分之一圆用于检测四个样品-金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和无菌水。将100微升107CFU/mL金黄色葡萄球菌用移液管移至滤纸的第一个四分之一圆上，将100微升107CFU/mL大肠杆菌用移液管移至滤纸的第二个四分之一圆上，将100微升106CFU/mL色念珠菌用移液管移至滤纸的第三个四分之一圆上，将无菌水用移液管移至滤纸的第四个四分之一圆上。观察和记录各个检测样品引起的着色剂颜色变化。当颜色改变后立刻记录颜色以避免随着样品变干颜色减退(或强度减弱)。表2为本实验的观察结果。 
表2 着色剂颜色变化观察结果(第1组) 
*溶于水 
除了甲基橙、尼罗红和部花青540，其他着色剂均立即产生可观察到的颜色变化(1至2分钟)。 
实施例2 
测试不同着色剂在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌微生物存在时发生颜色变化的能力。测试的着色剂是隐性结晶紫、隐色孔雀绿、隐性二甲苯蓝FF、4，5-二羟基-1，3-苯二磺酸二钠盐单水合物、5-氰基-2-[3-(5-氰基-1，3-二乙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-亚基)-1-丙烯基]-1-乙基-3-(4-磺基丁基)-1H-苯并咪唑氢氧化物内盐、酸绿25、浴菲绕啉二磺酸二钠盐三水合物、胭脂酸、天青石蓝、苏木紫、溴酚蓝、溴麝香草酚蓝、玫瑰红、通用指示剂(0-5)和通用指示剂(3-10)。除非另有说明，着色剂均溶于二甲基甲酰胺(DMF)。VWR滤纸和着色剂均按照实施例1描述的方法制备。表3为本实验的观察结果。 
表3.着色剂颜色变化观察结果(第2组) 
  着色剂   初始颜色   颜色变化w/   金黄色   葡萄球菌   颜色变化w/   大肠杆菌   颜色变化w/   白色   念珠菌 颜色变化w/ 无菌水
  隐性结晶紫   白色   蓝色   蓝色   蓝色 无变化
  隐色孔雀绿   白色   绿色   绿色   绿色 无变化
  隐性二甲苯蓝FF   白色   无变化   无变化   无变化 无变化
  4，5-二羟基-1，3-苯二磺酸二钠  盐单水合物*    白色    无变化    无变化    无变化  无变化
  5-氰基-2-[3-(5-氰基-1，3-二乙基  -1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-亚  基)-1-丙烯基]-1-乙基-3-(4-磺基  丁基)-1H-苯并咪唑氢氧化物内  盐     亮红粉色     暗粉色     暗紫粉色     暗绿粉色  具有暗粉边缘的较浅粉色(溶散)
  酸绿25     绿色   具有较暗绿色  边缘的较浅绿   色  (溶散)   具有较暗绿  色边缘的较   浅绿色  (溶散)   具有较暗绿  色边缘的较   浅绿色  (溶散) 具有较暗绿色边缘的较浅绿 色(溶散)
[0138] 
  着色剂   初始颜色   颜色变化w/   金黄色   葡萄球菌   颜色变化w/   大肠杆菌   颜色变化w/   白色   念珠菌   颜色变化w/   无菌水
  浴菲绕啉二磺酸二钠盐三水合   物**    白色    无变化    无变化    无变化    无变化
  胭脂酸*    桃红色    青莲色    紫色    暗紫色   具有较暗桃色  边缘的较浅桃  色(溶散)
  天青石蓝   暗淡紫色   蓝色   蓝色   蓝色   蓝色
  苏木紫    乳黄色    无变化    浅紫色    较暗的紫色   具有较暗黄色  边缘的乳黄色  (溶散)
  溴酚蓝    明黄色    深蓝色    深蓝色    深蓝色   具有橙色边缘  的较浅黄色  (溶散)
  溴麝香草酚蓝     黄色    具有暗黄色边   缘的较浅黄色     浅绿色     较暗的绿色   非常浅的黄色/  具有较暗黄色   边缘的发白的  颜色
  玫瑰红    艳粉色    较暗的粉色    紫粉色    红粉色   具有暗粉边缘   的白色(溶散)
  通用指示剂(0-5)    黄绿色    黄蓝色    黄蓝色    黄蓝色   具有暗绿色边  缘的较浅绿色  (溶散)
  通用指示剂(3-10)   桃色   粉桃红   橙黄色   黄色   暗粉色
*溶于水 
**溶于水和DMF 
除了隐性结晶紫、隐色孔雀绿和隐性二甲苯蓝FF，其他着色剂均立即产生可观察到的颜色变化(1至2分钟)。 
实施例3 
测试不同着色剂在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌微生物存在时发生颜色变化的能力。测试的着色剂是茜素络合酮、茜素红s、紫色素、茜素、大黄素、氨基-4-羟基蒽醌、核固红、氯酚红、雷马亮蓝R、普施安蓝HB、酚酞、四苯基卟啉，四-o-磺酸盐和茚三酮。除非另有说明，着色剂均溶于二甲基甲酰胺(DMF)。VWR滤纸和着色剂均按照实施例1描述的方法制备。表4为本实验的观察结果。 
表4.着色剂颜色变化观察结果(第3组) 
  着色剂   初始   颜色   颜色变化w/   金黄色   葡萄球菌  颜色变化w/  大肠杆菌   颜色变化w/   白色念珠菌   颜色变化w/   无菌水
  茜素络合酮   黄色   褐色  红紫色   紫色   无变化
   茜素红s    黄色    橙褐色   粉紫色    紫色   具有较暗黄色边缘   的较浅黄色(溶散)
  紫色素   桃橙色   较暗的桃橙色  红粉色   深红粉色   黄桃红色
  茜素   奶油黄   无变化  浅褐色   紫褐色   呈绿色的 奶油黄
  大黄素   黄色   无变化  微绿橙色   较深的绿橙色   绿黄色
  氨基-4-羟基蒽醌   粉色   较浅的粉色  微浅的粉色   极浅的粉色   较暗的粉色
  核固红   红粉色   深红粉色  黄粉色   黄粉色   深粉色
   氯酚红    橙黄色    褐色   深红紫色    较深的红紫色   具有较暗边缘的较   浅橙黄色(溶散)
    雷马亮蓝R     冰蓝色   具有暗蓝边缘   的较浅蓝色   (溶散)  具有暗蓝边  缘的较浅蓝  色(溶散)   具有暗蓝边缘   的较浅蓝色r   (溶散)    具有暗蓝边缘的较   浅蓝色(溶散)
   普施安蓝HB   凫蓝绿   色    无变化   无变化    略暗的凫蓝色   具有暗边缘的较浅   凫蓝色(溶散)
  酚酞   白色   无变化  无变化   无变化   无变化
   四苯基卟啉，四   -o-磺酸盐     黑色    具有较暗边缘   的灰色(溶散)  具有较暗边  缘的灰色(溶  散)    具有较暗边缘   的灰色(溶散)    具有较暗边缘的灰   色(溶散)
  茚三酮   白色   深紫色  深紫色   略浅的深色   无变化
[0146] 均立即产生可观察的颜色变化(1至2分钟) 
实施例4 
表明使用实施例1-3着色剂快速检测各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的能力。还检测了其他着色剂，包括羊毛铬蓝B、氮蓝四唑、茜素络合酮、地衣红、四甲基-对-苯二胺(TMPD)、尼罗红、铬蓝黑B、酚红、茜素红S、胭脂酸、Fe(III)C3、天青石蓝、Kovac’s试剂、铬天青S、通用指示剂3-10、甲基橙、部花青540和氯化铁III卟啉。测试的革兰氏阳性菌微生物是金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌。测试的革兰氏阴性菌微生物是大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌和奇异变形杆菌。 
着色剂样品按照实施例1类似的方法制备。除非另有说明，着色剂均溶于二甲基甲酰胺(DMF)。每种着色剂溶液均用移液管移至两片分开的VWR滤纸，置干。一片含有干着色剂的滤纸样品分为五等份，用于检测五种革兰氏阳性菌。另外一片滤纸分为四等份，用于检测四种革兰氏阴性菌。分别将100微升107CFU/mL样品用移液管移至其相应的滤纸样品部分。表5为革兰氏阳性菌的观察结果，表6为革兰氏阴性菌的观察结果。 
表5 革兰氏阳性菌的颜色变化观察结果 
  着色剂   初始颜色   颜色变化w/   枯草芽孢   杆菌   颜色变化w/   金黄色   葡萄球菌   颜色变化w/   表皮   葡萄球菌   颜色变化w/   粪肠球菌   颜色变化w/   嗜酸乳杆菌
   羊毛铬蓝B    深粉色    紫粉色    很淡的紫粉色    深粉色    红粉色   较深的红粉   色
  氮蓝四唑   黄白色   无变化   无变化   无变化   无变化   无变化
  茜素络合酮   黄色   褐红色   较浅的褐红色   较浅的褐红色   较浅的褐红色   褐黄色
   地衣红    灰暗紫色    亮紫色   较浅的灰暗紫   色    较暗的灰紫色    较暗的灰紫色   较暗的灰紫   色
  四甲基-对-苯  二胺  (TMPD)*    亮紫色    无色    无色    未试验    未试验    无色
[0152] 
  着色剂   初始颜色   颜色变化w/   枯草芽孢   杆菌   颜色变化w/   金黄色   葡萄球菌   颜色变化w/   表皮   葡萄球菌   颜色变化w/   粪肠球菌   颜色变化w/   嗜酸乳杆菌
  尼罗红   亮淡紫色   浅粉色   浅粉色   浅粉色   浅粉色   浅粉色
   铬蓝黑B    暗灰紫色    蓝紫色   较浅的灰暗紫   色    较暗的灰紫色    较暗的灰紫色   较暗的灰紫   色
   酚红    黄色   具有黄色中心   的橙色   具有橙色边缘   的黄色   具有橙色边缘   的黄色   具有橙色边缘   的黄色   具有橙色边   缘的绿黄色
  茜素红S   黄色   褐粉色   浅褐色   浅褐色   浅褐色   浅绿褐色
  胭脂酸*   桃红色   青莲色   青莲色   青莲色   紫桃色   黄桃色
  Fe(III)C3   白色   无变化   无变化   未试验   未试验   无变化
  天青石蓝   暗淡紫色   蓝色   蓝色   蓝色   蓝色   蓝色
   Kovac’s试剂    乳黄色   具有黄色边缘  和绿色中心的  白色   具有黄色边缘  和绿色中心的  白色   具有黄色边缘  和绿色中心的  白色   具有黄色边缘  和绿色中心的  白色   具有褐色边  缘和绿色中  心的白色
   铬天青S    粉色   具有红色边缘   的乳黄色   具有暗橙色边   缘的浅橙色   具有暗橙色边   缘的浅黄橙色   具有暗橙色边   缘的浅橙色   具有暗红边   缘的浅红色
  通用指示剂   3-10    桃色   具有黄色中心   的较浅桃色   具有黄色中心   的较浅桃色   具有黄色中心   的较浅桃色    较浅的桃色    红色
  甲基橙   亮橙色   黄色   黄色   黄色   黄色   黄色
  部花青540   艳粉色   浅紫色   浅紫色   浅紫色   浅紫色   浅紫色
  氯化铁III卟   啉*    浅芥末黄   较暗的浅芥末   黄   较暗的浅芥末   黄   较暗的浅芥末   黄   较暗的浅芥末   黄   较暗的浅芥   末黄
*溶于水 
表6.革兰氏阴性菌的颜色变化观察结果 
  着色剂   初始颜色   颜色变化w/   大肠杆菌   颜色变化w/   绿脓杆菌   颜色变化w/肺   炎克雷伯氏菌   颜色变化w/   奇异变形杆菌
  羊毛铬蓝B   深粉色   亮紫色   深蓝色   深红粉色   深红粉色
  氮蓝四唑   黄白色   无变化   无变化   无变化   无变化
  茜素络合酮   黄色   紫色   较深的紫色   褐紫色   紫色
  地衣红   灰暗紫色   浅紫色   较紫色   褐紫色   较暗的褐紫色
  四甲基-对-苯   二胺(TMPD)*    亮淡紫色    无色    暗紫色    无色    无色
  尼罗红   亮紫色   浅粉色   浅粉色   浅粉色   浅粉色
  铬蓝黑B   暗灰紫色   蓝紫色   暗蓝色   较暗的紫色   较暗的紫色
   酚红    黄色    橙色    暗红/橙色   具有橙色边缘的   黄色    橙色
  茜素红s   黄色   褐紫色   深红紫色   浅褐紫色   深红紫色
  胭脂酸*   桃红色   蓝紫色   暗紫色   灰蓝紫色   紫色
  Fe(III)C3   白色   无变化   无变化   未试验   无变化
  天青石蓝   暗淡紫色   蓝色   蓝色   蓝色   蓝色
    Kovac’s试剂     乳黄色   具有绿色中心   和黄色边缘的   白色   具有绿色中心   和黄色边缘的   白色    具有绿色中心和   黄色边缘的白色   具有绿色中心   和黄色边缘的   白色
   铬天青S    粉色   具有暗粉边缘   的绿黄色   具有暗粉边缘   的亮黄色   具有暗粉边缘的   绿黄色   具有暗粉边缘   的绿黄色
  通用指示剂   3-10    桃色   具有黄色中心   的较浅桃色    浅绿色   具有黄色中心的   较暗桃色   具有黄色中心   的较浅桃色
   甲基橙    亮橙色    黄色    黄色    黄色   橙色/   黄色
  部花青540   艳粉色   黄粉色   黄粉色   黄粉色   黄粉色
  氯化铁III卟   啉*    芥末黄    较暗的芥末黄    较暗的芥末黄    较暗的芥末黄    较暗的芥末黄
*溶于水 
除了甲基橙、尼罗红、四甲基-对-苯二胺(TMPD)和部花青540，其他着色剂均立即观察到颜色变化(1至2分钟)。 
实施例5 
表明使用一组着色剂快速检测上呼吸道病原体的能力。检测的着色剂是茜素红s、通用指示剂3-10、尼罗红、羊毛铬蓝B、铁III卟啉、铬蓝黑B、铬天青S、地衣红、茜素络合酮、酚红、胭脂酸、甲基橙和TMPD。检测的上呼吸道感染病原体是流感嗜血杆菌、腔隙莫拉菌、酿脓葡萄球菌、肺炎链球菌、出芽短梗霉菌和微紫青霉菌。着色剂样品按照实施例1类似的方法制备。除非另有说明，着色剂均溶于二甲基甲酰胺(DMF)。观察并记录每种检测样品着色剂的颜色变化。表7为上呼吸道感染病原体的观察结果。 
表7.上呼吸道感染病原体的颜色变化 
  着色剂   初始   颜色   颜色变化   w/流感   嗜血杆菌   颜色变化   w/腔隙   莫拉菌   颜色变化   w/酿脓   葡萄球菌   颜色变化   w/肺炎   链球菌   颜色变化   w/出芽   短梗霉菌   颜色变化   w/微紫   青霉菌
   茜素红s   暗芥   末黄    红色    褐红色    浅褐色    浅褐色    亮褐黄色    亮褐黄色
  通用指示剂   3-10   暗桃   色    绿黄色    绿黄色    褐黄色    褐黄色   较暗的桃   色    较暗的桃色
   尼罗红   亮紫   色    粉色    粉色    粉色    粉色    暗粉色    暗粉色
   羊毛铬蓝B   亮粉   色    蓝紫色   较暗的蓝   紫色    暗粉色    暗粉色   较浅的亮   粉色   较浅的亮粉   色
  铁III卟啉  *   芥末  黄   较暗的芥  末黄   较暗的芥  末黄   较暗的芥  末黄   较暗的芥末  黄   较暗的芥  末黄   较暗的芥末  黄
   铬蓝黑B   葡萄   色    暗蓝    暗蓝   暗葡萄粉   色    暗葡萄粉色    暗葡萄色    暗葡萄色
    铬天青S    浅橙   色   具有暗红   边缘的浅   绿色   具有暗红   边缘的浅   绿色   具有暗红   边缘的褐   红色    具有暗红边   缘的褐红色   具有暗红   边缘的浅   粉色    具有暗红边   缘的浅粉色
   地衣红   灰暗   紫色    亮紫色    亮紫色   蓝灰暗紫   色   较暗的灰紫   色   较浅的灰   暗紫色   较浅的灰暗   紫色
  茜素络合酮   黄色   红紫色   紫色   褐色   褐色   黄色   黄色
   酚红   橙黄   色    橙红色    亮红色    绿黄色    绿黄色    亮黄色    亮黄色
   胭脂酸*   亮桃   色    紫色    暗紫色   褐桃色/   紫桃色   褐桃色/   紫桃色   较亮的桃   色    较亮的桃色
   甲基橙   暗橙   色    黄色    黄色    黄色    黄色    褐黄色    褐黄色
   TMPD*   微黄   色    白色    紫色    未试验    粉色    未试验    未试验
*溶于水 
除了甲基橙、尼罗红和四甲基-对-苯二胺(TMPD)，其他着色剂均立即观察到颜色变化(1至2分钟)。 
实施例6 
用铬天青、茜素络合酮、羊毛铬蓝B和酚红溶液(均溶于DMF中)处理滤纸(由VWR International获得)。样品挂干使溶剂挥发。白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌溶液用胰化酪蛋白大豆肉羹(TSB)介质稀释十倍，在某些情况下用无菌水。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的浓度范围为108CFU/mL(原液)至101CFU/mL，白色念珠菌的浓度范围为107CFU/mL(原液)至101CFU/mL。以TSB和无菌水作为对照溶液。将每种溶液的100μL应用于样品。表8-12为颜色变化总结。 
表8：TSB介质中白色念珠菌稀释液的响应 
  染料   初始颜  色   106  CFU/ml   105  CFU/ml   104  CFU/ml   103  CFU/ml   102  CFU/ml   101  CFU/ml   TSB  对照
  酚红   亮黄色   橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   暗橙  色
  羊毛铬  蓝B   亮粉色   紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   暗紫  蓝色
  茜素络  合酮   亮黄色   褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   暗褐  紫色
  铬天青   玫瑰色   绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   黄绿  色
[0168] 表9：TSB介质中金黄色葡萄球菌稀释液的响应 
  染料   初始  颜色   108  CFU/ml  (未稀释)   107  CFU/ml   106  CFU/ml   105  CFU/ml   104  CFU/ml   103  CFU/ml   102  CFU/ml   TSB  对照
  酚红   亮黄色   亮黄色   橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   暗橙色
  羊毛铬  蓝B   亮粉色   亮紫粉色   紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   暗紫蓝  色
  茜素络  合酮   亮黄色   浅褐色   褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   暗褐紫  色
  铬天青   玫瑰色   褐黄色   绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   黄绿色
表10：金黄色葡萄球菌水稀释液的响应 
  染料   初始颜色   107CFU/ml  (水中)   水对照
  酚红   亮黄色   N/A   浅黄色
  羊毛铬蓝B   亮粉色   亮粉色   浅粉色
  茜素络合酮   亮黄色   乳黄色   乳黄色
  铬天青   玫瑰色   绿红-粉色   亮红-粉色
[0172] 表11：TSB介质中大肠杆菌稀释液的响应 
  染料   初始  颜色   108  CFU/ml  (未稀释)   107  CFU/ml   106  CFU/ml   105  CFU/ml   104  CFU/ml   103  CFU/ml   102  CFU/ml   TSB  对照
  酚红   亮黄色   浅橙色   橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   略微更暗  的橙色   暗橙  色
  羊毛铬  蓝B   亮粉色   粉紫色   紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   略微更暗  的紫蓝色   暗紫  蓝色
  茜素络  合酮   亮黄色   紫褐色   褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   略微更暗  的褐紫色   暗褐  紫色
  铬天青   玫瑰色   浅绿色   绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   略微更暗  的绿黄色   黄绿  色
表12：大肠杆菌水稀释液的响应 
  染料   初始颜色   107CFU/ml  (水中)   水对照
  酚红   亮黄色   橙黄色   浅黄色
  羊毛铬蓝B   亮绿色   亮粉色   浅粉色
  茜素络合酮   亮黄色   褐黄色   乳黄色
  铬天青   玫瑰色   深绿色   浅红-粉色
因此，尽管稀释溶液的区别十分微小，微生物颜色变化的观察比单独的介质困难。不受理论的限制，稀释溶液十分微小的区别部分是由于缺少用微生物调节介质的时间(试验在稀释后立刻进行)。相反的，含有微生物的原液在介质中达到24小时。 
虽然本发明已经对其具体实施方式进行了详细的表述，应当理解的是，本领域技术人员在理解前述内容的基础上可以容易的设想这些实施方式的变更、变化和等同的内容。因此，本发明的范围可以超过所附权利要求及其任何等同内容。 

Claims (24)

1.一种检测样品中微生物的方法，其用于非诊断目的，该方法包括：
将样品与阵列接触，该阵列含有以预定模式相互间隔的位于固相载体上的多个单独阵列地址，其中每个地址含有N-苯酚甜菜碱溶剂化显色着色剂，所述N-苯酚甜菜碱溶剂化显色着色剂在广谱微生物的存在下经历可检测到的颜色的变化，其中所述广谱微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌或它们的组合，并且其中至少一部分地址含有区分着色剂，从而使该阵列产生可目视观察到的对于一种或多种微生物来说是独特的光谱响应，其中所述区分着色剂为pH敏感性着色剂或金属络合性着色剂；
检测光谱响应；和
将检测到的光谱响应与一种或多种微生物的存在相关联。
2.权利要求1所述的方法，其中一个或多个地址含有pH敏感性着色剂。
3.权利要求2所述的方法，其中所述pH敏感性着色剂是酞、羟基蒽醌、芳基甲烷、芳族偶氮化合物。
4.权利要求1所述的方法，其中一个或多个地址含有金属络合性着色剂。
5.前述任一项权利要求所述的方法，其中阵列含有2至50个单独阵列地址。
6.前述任一项权利要求所述的方法，其中阵列含有3至40个单独阵列地址。
7.前述任一项权利要求所述的方法，其中至少两个地址的间隔间距为0.01至100毫米。
8.前述任一项权利要求所述的方法，其中至少两个地址的间隔间距为0.1至50毫米。
9.前述任一项权利要求所述的方法，其中光谱响应与一种或多种微生物的存在相关联，所述微生物的浓度为1×103或更多个菌落形成单位每毫升样品。
10.前述任一项权利要求所述的方法，其中光谱响应与一种或多种微生物的存在相关联，所述微生物的浓度为1×106或更多个菌落形成单位每毫升样品。
11.前述任一项权利要求所述的方法，其中着色剂以含有载体的组合物形式应用于固相载体。
12.权利要求11所述的方法，其中每毫升载体含有着色剂0.1至100毫克。
13.权利要求11所述的方法，其中每毫升载体含有着色剂0.5至60毫克。
14.前述任一项权利要求所述的方法，其中阵列印于载体上。
15.前述任一项权利要求所述的方法，其中检测光谱响应并将其与对照阵列比较。
16.前述任一项权利要求所述的方法，其中光谱响应是目视检测的。
17.前述任一项权利要求所述的方法，其中光谱响应在阵列与样品接触后等于或小于30分钟时产生。
18.前述任一项权利要求所述的方法，其中光谱响应在阵列与样品接触后等于或小于5分钟时产生。
19.一种用于检测样品中微生物的阵列，该阵列含有以预定模式相互间隔的位于固相载体上的多个单独阵列地址，其中至少一个地址含有N-苯酚甜菜碱溶剂化显色着色剂，所述N-苯酚甜菜碱溶剂化显色着色剂在广谱微生物的存在下经历可检测到的颜色的变化，其中所述广谱微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌或它们的组合，并且其中至少一部分地址含有区分着色剂，从而使该阵列产生可目视观察到的对于一种或多种微生物来说是独特的光谱响应，其中所述区分着色剂为pH敏感性着色剂或金属络合性着色剂。
20.权利要求19所述的阵列，其中所述区分着色剂为pH敏感性着色剂。
21.权利要求19所述的阵列，其中pH敏感性着色剂是酞、羟基蒽醌、芳基甲烷、芳族偶氮化合物。
22.权利要求19至21中任一项所述的阵列，其中所述区分着色剂为金属络合性着色剂。
23.权利要求19至21中任一项所述的阵列，其中阵列含有2至50个单独阵列地址。
24.权利要求19至21中任一项所述的阵列，其中阵列含有3至40个单独阵列地址。
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