CN101522706A - 端粒酶逆转录酶融合蛋白、编码它的核苷酸以及其用途 - Google Patents

端粒酶逆转录酶融合蛋白、编码它的核苷酸以及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101522706A
CN101522706A CNA2007800378827A CN200780037882A CN101522706A CN 101522706 A CN101522706 A CN 101522706A CN A2007800378827 A CNA2007800378827 A CN A2007800378827A CN 200780037882 A CN200780037882 A CN 200780037882A CN 101522706 A CN101522706 A CN 101522706A
Authority
CN
China
Prior art keywords
carrier
tert
sequence
ltb
htert
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2007800378827A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101522706B (zh
Inventor
G·奇利伯托
N·拉莫妮卡
C·门努尼
E·斯卡塞利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Original Assignee
Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA filed Critical Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Publication of CN101522706A publication Critical patent/CN101522706A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101522706B publication Critical patent/CN101522706B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Abstract

提供了编码端粒酶逆转录酶(TERT)融合蛋白的多核苷酸，所述TERT融合蛋白包含与热不稳定肠毒素的B亚基(LTB)的实质部分融合的TERT蛋白或其功能性变体。在本发明的TERT－LTB融合蛋白中有用的TERT变体包含用作消除端粒酶催化活性的突变。本发明的多核苷酸可以在哺乳动物中引发免疫反应，在优选的实施方式中，其比由野生型TERT引发的免疫反应更强。TERT表达通常与人类癌的发展相关。本发明提供组合物和方法，来通过TERT肿瘤相关抗原引发或增强对表达的蛋白质产物的免疫性，其中异常的TERT表达与癌或它的发展相关。本发明具体地提供了携带编码TERT融合蛋白和TERT变体的多核苷酸的腺病毒载体和质粒构建体，公开了它们在用于预防和治疗癌症的疫苗和药物组合物中的用途。

Description

端粒酶逆转录酶融合蛋白、编码它的核苷酸以及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年10月12日提交的美国临时申请NO.60/851,183的权益，通过引用将其内容完整地合并在此。
发明领域
本发明一般地涉及癌症的治疗。更具体地，本发明涉及编码融合蛋白的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含肿瘤相关多肽端粒酶逆转录酶(TERT)的至少一部分。本发明还提供了包含所述多核苷酸的重组载体和宿主，纯化的融合蛋白和使用在此公开的组合物和分子引发或增强针对TERT基因的蛋白质产物的免疫反应的方法。
发明背景
疫苗接种已经成为预防多种传染性疾病的标准方法。由于分子工程的发展和对肿瘤免疫学的更好的了解，疫苗对其他疾病例如癌症的应用现在是一种有吸引力的可能。
癌症是在世界范围内死亡的主要原因之一。尽管有大量的癌症相关研究，组合了手术、放射和化学治疗的常规的治疗常常不能有效地治疗已建立的癌症。预防的可靠的方法也还是没有。
癌症一般涉及基因的功能失常，所述基因有助于细胞周期或细胞增殖的调节，例如生长因子和它们的受体、癌基因和肿瘤抑制基因。许多这些基因的产物在各种各样的肿瘤细胞的表面表达，因而，被称为肿瘤相关抗原(TAA)。在许多实验模型中，编码TAA的基因直接向受试者中导入已经显示了产生针对TAA的保护性免疫反应，使得这些分子成为疫苗疗法的靶点。然而，由于这些基因产物中的许多也在正常细胞中表达，虽然是低水平的，靶向TAA的许多免疫学治疗已经被证明由于自身耐受性是无效的。
编码几种肿瘤相关抗原(TAA)的基因已经被分离、表征并插入到遗传载体，例如质粒DNA和病毒载体中。已经与癌症的发病原理相关联的一种肿瘤相关抗原是端粒酶(TERT)。
端粒酶是DNA聚合酶，其通常在维持染色体末端处端粒长度方面起作用。在正常细胞生长期间，RNA引物附着在DNA的5′末端并启动复制。在除去RNA引物时，长度上的缺口被导入产生的DNA子代链中。因而，使用常规聚合酶的DNA线性链的复制在复制的每个渐进的轮次中引起端粒长度的缩短。端粒长度的这种缩短导致细胞衰老或正常人类体细胞的老化。
端粒酶是包含RNA组件和催化蛋白组件(端粒酶逆转录酶)的核糖核蛋白。人类端粒酶的催化组件描述于Meyerson等(Cell1197：785-95(1990)和Nakamura等(Science277：955-59(1997))。TERT酶利用它的RNA组件作为端粒DNA合成的模板，因而容许端粒在细胞生长的连续世代中维持它们的长度。在多个增殖循环中这种端粒长度的维持允许细胞逃避正常的衰老并成为永生的，容许肿瘤在长时间上生长和转移。由于端粒酶为细胞赋予了复制永生性，在癌性细胞系和各种肿瘤类型中已经检测到端粒酶活性(Kim et al.Science 266：2011-15(1994))。反之，端粒酶在正常人组织和正常的体细胞培养物中是无活性的或仅以低水平短暂地表达。端粒酶在大多数癌症类型中过量表达以及在正常细胞中低表达或不表达的组合，使得TERT成为与异常的细胞增殖相关的疾病例如癌症的治疗和/或预防的靶点。
由于已经克隆和表征了端粒酶的催化和RNA组件，端粒酶特异性疫苗的开发现在是可能的(参见，例如，美国专利6,166,178)。然而，许多疫苗的开发和商业化已经受到一些难点的阻碍，所述难点与在成功地转化的宿主生物体中获得期望的免疫原的高水平表达相关。有效的基于DNA的疫苗的开发也受到在治疗的个体中不能产生足够量的免疫反应以引起临床条件下的肿瘤退化的阻碍。因此，尽管如上所述的鉴定了编码端粒酶蛋白的野生型核苷酸序列，高度期望的是开发出一种疫苗，当递送给哺乳动物时能够引发相对于野生型全长TERT cDNA的增强的TERT-特异性免疫反应。同样期望的是开发用于治疗和预防TERT相关性癌症的方法，其利用了安全和有效地强化TERT-特异性免疫反应的核酸分子或蛋白。
发明概述
如上所述，肿瘤相关抗原端粒酶逆转录酶(TERT)基因的表达通常与腺癌、包括结肠直肠癌的发展或存在相关。为此，本发明涉及组合物和方法，来引发或增强针对人类TERT(hTERT)基因表达的蛋白产物的免疫性。特别地，本发明提供了编码融合蛋白的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含与大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素的B亚基(LTB)的实质部分融合的hTERT蛋白或其变体。本发明还提供了包含所述多核苷酸的重组载体，包括但不限于，腺病毒和质粒载体，和包含所述重组载体的宿主细胞。在此还提供的是由本发明的多核苷酸编码的纯化的融合蛋白。hTERT-LTB融合蛋白和编码所述融合蛋白的多核苷酸作为用于端粒酶相关癌症的预防和/或治疗的疫苗是有用的。所述疫苗作为单一治疗或作为治疗方案的部分是有用的，所述方案包括施用第二疫苗，例如多核苷酸、基于细胞的、蛋白、或基于肽的疫苗，或包括放射治疗或化学治疗。
在本发明的优选的实施方式中，编码hTERT的核苷酸的序列和/或编码LTB的核苷酸的序列包含已经为在人类宿主细胞中高水平表达而优化的密码子。换句话说，在本发明的某些实施方式中，多核苷酸序列的密码子利用模式相似于高度表达的哺乳动物和/或人类基因的密码子利用模式。
本发明的另一个方面是包含编码hTERT-LTB的核苷酸的表达构建体。在本发明的这个部分的优选的实施方式中，所述构建体包含处在TERT基因的编码序列之前的TPA前导序列以确保TERT-LTB融合蛋白被分泌。
在本发明的另外的优选的实施方式中，端粒酶抗原的端粒酶催化活性被灭活，从而对于疫苗目的，编码的TERT融合蛋白是比野生型TERT更安全的。TERT融合蛋白的酶活性可以通过向TERT编码核苷酸序列添加突变/删除来灭活。在本发明的特定的示范性实施方式中，核苷酸已经被突变，以改变人类TERT蛋白序列中特定的氨基酸D712A和V713I，以及小鼠TERT蛋白序列中的D702A和V703I。
本发明进一步提供了包含编码hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列的腺病毒和质粒载体。本发明还描述了所述腺病毒和质粒载体在用于hTERT相关癌症的预防和/或治疗的免疫原性组合物和疫苗中的用途。
还提供的是腺病毒载体，其包含编码人类TERT蛋白或TERT蛋白变体的核苷酸的序列。在本发明的这个方面中有用的变体包含用作消除端粒酶催化活性的突变。在本发明的这个部分的优选的实施方式中，所述腺病毒载体是Ad6载体。在其他优选的实施方式中，所述腺病毒载体是Ad5载体。
本发明进一步提供了通过施用包含本发明提供的TERT融合物或TERT融合蛋白的疫苗或药物组合物、引发针对TERT蛋白的免疫反应，预防患者中癌症的发展或治疗具有端粒酶相关肿瘤的患者的方法。在本文方法的优选的实施方式中，相对于野生型TERT引发的反应，所述免疫反应被增强了。
在整个说明书中和所附权利要求中使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数的内容，除非上下文中明显地另外指示了。
如在整个说明书和所附权利要求书中使用的，采用以下定义和缩写：
术语“启动子”是指在DNA链上、RNA聚合酶能与之结合的识别位点。启动子与RNA聚合酶形成起始复合物来启动和驱动转录活性。通过称为“增强子”的活化序列，或称为“沉默子”的抑制序列，可以修饰所述复合物。
术语“盒”是指要从载体表达的核苷酸或基因序列，例如，编码hTERT(AI)-LTB融合物的核苷酸或基因序列。一般地，盒包含可被插入到载体中的基因序列，在某些实施方式中其提供了用于表达核苷酸或基因序列的调节序列。在其他实施方式中，核苷酸或基因序列提供了用于其表达的调节序列。在进一步的实施方式中，所述载体提供了某些调节序列，所述核苷酸或基因序列提供了其他调节序列。例如，所述载体可以提供用于转录所述核苷酸或基因序列的启动子，所述核苷酸或基因序列提供转录终止序列。可由载体提供的调节序列包括，但不限于，增强子、转录终止序列、剪接接受体和供体序列、内含子、核糖体结合序列和聚(A)附加序列。
术语“载体”是指一些工具，通过它们能将DNA片段导入到宿主有机体或宿主组织中。存在着各种型式的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌体和粘粒。
所述术语“第一代”对于腺病毒载体使用时，描述了复制缺陷性的腺病毒载体。第一代腺病毒载体一般具有删除的或失活的E1基因区域，优选的具有删除的或失活的E3基因区域。
名称“pV1JnsA/TPA-mTERT(AI)-LTBopt”是指在此公开的质粒构建体，其包含具有内含子A的CMV即时早期(IE)启动子、与密码子优化的LTB基因融合的全长的密码子优化的鼠TERT基因，和源于牛生长激素的聚腺苷酸化以及转录终止序列(参见实施例2)。另外，编码人类组织纤溶酶原激活物(TPA)信号序列的前导序列存在于编码mTERT-LTB的核苷酸序列的5′。名称“AI”表明突变被添加给TERT序列来功能上地消除端粒酶催化活性。名称“pV1JnsA/mTERT(AI)opt”是指基本上如上所述的构建体，只是该构建体包含未融合到LTB或TPA的鼠的优化的TERT核苷酸序列。
名称“pV1JnsA/TPA-hTERT(AI)-LTBopt”是指在此公开的质粒构建体，其包含具有内含子A的CMV即时早期(IE)启动子、与密码子优化的LTB基因融合的全长的密码子优化的人类TERT基因，和源于牛生长激素的聚腺苷酸化以及转录终止序列(参见实施例2)。另外，编码人类组织纤溶酶原激活物(TPA)信号序列的前导序列存在于编码hTERT-LTB的核苷酸序列的5′。这种构建体中的hTERT序列包含突变来功能上地消除端粒酶催化活性。
名称“Ad6/TPAmTERT(AI)-LTBopt”和“Ad6/hTERT(AI)”是指在此公开的两种构建体，其包含E1和E3区域删除的Ad6腺病毒基因组。在“Ad6/TPAmTERT(AI)-LTBopt”构建体中，E1区域被密码子优化的鼠TERT-LTB基因以E1平行方向替代，处在没有内含子A的人类CMV启动子的控制之下，之后是牛生长激素聚腺苷酸化信号。TERT编码序列包含突变来消除端粒酶催化活性。该构建体进一步包含编码人类组织纤溶酶原激活物(TPA)信号序列的序列，其处在TERT(AI)-LTB编码核苷酸序列的5′。“Ad6/hTERT(AI)”构建体是基本上如上所述的，只是Ad6基因组的E1区域被TERT cDNA序列替换，所述序列包含突变来消除酶活性。
缩写“LTB”一般指大肠杆菌热不稳定肠毒素的B亚基，或其实质部分，包括在C-末端或N-末端截短的但维持了佐剂活性的亚基，以及含有内部的氨基酸插入、删除或替换但维持了佐剂活性的亚基(Fingerut等Vaccine23：4685-4696(2005))。
如在此使用的，“融合蛋白”是指具有共价连接的至少两个异源多肽的蛋白，其中一个多肽来自一个蛋白序列或结构域，另一个多肽来自第二蛋白序列或结构域。本发明的融合蛋白包含TERT多肽或其片段或变体，和第二多肽，其包含LTB的实质部分。TERT多肽、其片段或变体可以是人类TERT或来自另一个物种，例如小鼠的TERT同源物。包含融合蛋白的多肽优选的是N-末端到C-末端连接的。所述TERT多肽和所述LTB多肽可以以任何顺序融合。在本发明的某些实施方式中，TERT多肽的C-末端被融合到LTB的N-末端，如附图1和2中例示的。然而，其中LTB亚基被融合到TERT多肽的N-末端的融合蛋白也是期待的。
术语“TERT融合蛋白”或“TERT-LTB融合蛋白”在此作为指代如上所述的融合物的通称可互换地使用，其包含融合到LTB多肽的TERT多肽或其片段或变体。术语“TERT-LTB融合物”是指一种核酸序列，其中TERT基因的至少一部分融合到大肠杆菌热不稳定肠毒素的LTB亚基的实质部分。术语“TERT-LTB融合蛋白”是指由在此描述的TERT-LTB融合物编码的多肽。术语“TERT-LTB融合物”和“TERT-LTB融合蛋白”还理解为是指其片段、其同源物、和其功能等效物(集体地称为“变体”)，例如在其中一个或更多个氨基酸被插入、删除或被其他氨酸替换的那些。本发明的TERT-LTB融合物在向哺乳动物例如人类施用时，可以刺激辅助T细胞或细胞毒性T细胞的免疫反应，至少与“野生型”hTERT序列一样好。在本发明的优选的实施方式中，与野生型hTERT相比，TERT-LTB融合物可以增强免疫反应
术语“治疗”是指治疗性治疗以及预防或防护性手段。需要治疗的对象包括已经发生病症的以及那些倾向于发生病症的或那些需要防止病症的对象。如在此使用的，“治疗”还包括降低获得病症的可能性，以及在已经患病的当中降低病症的严重度。
“病症”是将受益于本发明的分子的治疗的任何状况，所述分子包括在此描述的核酸分子和由所述核酸分子编码的融合蛋白。术语“病症”所包括的是慢性的和急性的病症或疾病，包括那些使得哺乳动物易患所讨论的病症的病理学状况。本发明的分子意图用作对以异常细胞增殖为特征的病症或状况的治疗，所述病症或状况包括但不限于乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌。
术语“有效量”是指导入足够的疫苗组合物来产生充足水平的多肽，从而产生免疫反应。本领域技术人员知道这种水平可以变化。
＂保守性氨基酸替换＂是指一个氨基酸残基被另一个化学上类似的氨基酸残基替换。这种保守性替换的实例包括：用一个疏水残基(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸)替换另一个；或用一个极性残基替换另一个相同电荷的极性残基(例如，精氨酸替换赖氨酸；谷氨酸替换天冬氨酸)。
“hTERT”是指人类端粒酶逆转录酶抗原或编码人类端粒酶逆转录酶抗原的核苷酸。“hTERTopt”是指编码人类端粒酶逆转录酶抗原的密码子优化的核苷酸序列。
＂基本上类似＂意思是给定的核酸或氨基酸序列与参考序列享有至少75％、优选的至少85％、更优选的至少90％，再更优选的至少95％的同一性。在本发明中，所述参考序列可以是野生型人类TERT核苷酸或氨基酸序列的相关部分，如分别在SEQ ID NO：11和12中所列的，或是LTB的核苷酸或氨基酸序列，如在SEQ ID NO：13(opt序列)和14中所列的，如文本的上下文中所指示的。所述参考序列也可以是，例如，野生型恒河猴的或鼠的TERT序列。因而，与野生型人类TERT蛋白或其片段“基本上类似”的TERT蛋白序列，将在片段的长度上与野生型人类TERT的相关片段享有至少75％的同一性，优选的85％的同一性，更优选的90％的同一性，再更优选的95％的同一性。给定的mTERT、hTERT或LTB氨基酸序列或核苷酸序列与参考序列是否是“基本上类似的”，例如可以通过使用序列分析软件如可从University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)获得的GAP计算机程序、版本6.0比较序列信息来确定。GAP程序利用了由Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1981)修正的、Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的比对方法。
基因、其变体、片段或亚基的“实质部分”是指参考序列的至少50％、优选的75％、更优选的90％、再更优选的95％的部分。
“基因”是指一种核酸分子，其核苷酸序列编码多肽分子。基因可以是核苷酸的连续序列，或者它们可以包括插入的片段如内含子、启动子区域、剪接位点和重复序列。基因可以是RNA或DNA。优选的基因是编码本发明的肽的基因。
术语“核酸”或“核酸分子”意指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)、探针、寡核苷酸、其片段或部分、和引物。
“野生型TERT”或“野生型蛋白”或“wt蛋白”是指包含天然存在的氨基酸序列或其变体的蛋白。野生型人类TERT的氨基酸序列在SEQ ID NO：12中列出。早先描述了野生型人类TERT的氨基酸序列(美国专利No.6,166,178；美国专利6,261,836；美国专利No.6,927,285；美国专利申请2003-0096344；Meyerson等，Cell 90：785-95(1997)；Nakamura等，Science 277：955-59(1997))。
“野生型TERT基因”是指包含编码天然存在的TERT蛋白的核苷酸序列的基因，所述蛋白包括人类来源的蛋白或从其他有机体获得的蛋白，其他有机体包括但不限于其他哺乳动物，例如大鼠、小鼠和恒河猴。人类TERT基因的核苷酸序列是本领域可获得的(上述)。
名称“TERT(AI)”是指包含突变来消除或降低端粒酶催化活性的端粒酶逆转录酶序列。
术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人类。
缩写“Ag”是指抗原。
缩写“ORF”是指基因的开放阅读框。
附图的简要说明
附图1显示了示范性的TPA-hTERT(AI)-LTBopt融合物的核苷酸(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
附图2显示了示范性的TPA-mTERT(AI)-LTBopt融合物的核苷酸(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
附图3显示了对用质粒pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt重复注射接种的BALB/c小鼠的IFNγELIspot分析的结果。利用肽库，每组5只小鼠被用于监视针对mTERT或LTB的免疫反应。绘图的数据来自6只独立的小鼠(空心圆形)。标明了几何平均值(实心圆形)。在模拟治疗的小鼠中没有检测到对mTERT的T细胞反应(未显示)。参见实施例7。
附图4显示了对来自接种的BALB/c小鼠的脾细胞IFNγ细胞内染色的结果。针对小鼠TERT的CD4+和CD8+T细胞反应利用覆盖全部蛋白的重叠肽的库来测量。还监视了对LTB的免疫反应。绘图的数据来自6只独立的小鼠(实心三角形)。标明了几何平均值(直线)。在模拟治疗的小鼠中没有检测到对TERT的T细胞反应(未显示)。参见实施例7。
附图5显示了用CD8+T细胞特异性肽mTERTaa167(AYQVCGSPL；SEQ ID NO：20)脉冲的4T1靶细胞的效应T细胞的51Cr释放CTL杀伤的结果。效应细胞从双免疫的BALB/c小鼠的脾细胞制备，用特异性肽体外重新刺激。结果表示为在不同的效应物/靶标比例下的特异性杀伤的百分比。参见实施例8。
附图6显示了对小鼠TERT的免疫反应的诱导。C57BL/6小鼠用质粒pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt的5次每周一次的注射来免疫。利用小鼠TERT肽库通过IFNγELIspot分析对小鼠脾细胞评估免疫反应。抗原特异性CD4+和CD8+T细胞反应被显示为从6只免疫的小鼠获得的几何平均值，还标明了标准偏差。参见实施例7。
附图7显示了BALB/c小鼠中mTERT特异性免疫反应的诱导。小鼠用构建体pV1J-mTERT(AI)opt或pV1J-TPAmTERT(AI)-LTBopt的5次每周一次的注射来免疫。利用相应于肽序列mTERTaa167(AYQVCGSPL；SEQ ID NO：20)的CD8+表位通过对PBMC的IFNγ细胞内染色来测定免疫反应。绘图的数据来自8只独立的小鼠(实心三角形)。标明了几何平均值(直线)。
附图8显示了，在注射表达mTERT(AI)-LTBopt的腺病毒载体时TERT特异性免疫反应被增强。10只BALB/c小鼠的组经历pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt(50μg/inj.)的5次每周一次的注射。在质粒DNA的最后注射之后两周，小鼠用质粒DNA(DNA-EP)或用1010vp的Ad6/TPA-mTERT(AI)-LTBopt(Ad)的一次另外的注射来强化。通过对PBMC的IFNγICS来监视对TERT的免疫反应。绘图的数据来自10只独立的小鼠(实心菱形)。还显示了每个组的几何平均值(直线)。参见实施例10。
附图9描绘了用来分析BALB/c小鼠中的DMH诱导的癌发生和疫苗接种的方案。DMH每周一次i.p.施用。在标明的时点进行用pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt的疫苗接种。肠病变的分析在12周进行。参见实施例11。
附图10显示了pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt对DMH诱导的癌发生的抗肿瘤效果。如附图9中标明的，BALB/c小鼠用DMH和DNA-EP处理。结肠中ACF和腺瘤形成的分析在治疗开始12周时进行。接种的小鼠中ACF和腺瘤的数量与未接种的对照中检测的相比较。参见实施例11。
附图11描绘了用来分析BALB/c小鼠中的DMH诱导的癌发生和疫苗接种的方案。DMH每周一次i.p.施用。在标明的时点进行用pV1J/TPA-mTERT-LTB DNA和Ad的疫苗接种。肠病变的分析在30周进行。参见实施例11。
附图12展现了pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt DNA初免/Ad强化对肿瘤病变的数量的抗肿瘤效果。如附图9中标明的，BALB/c小鼠用DMH和DNA-EP处理。结肠中ACF和腺瘤形成的分析在治疗开始30周时进行。接种的小鼠中ACF和腺瘤的数量与未接种的对照中检测的相比较。参见实施例11。
附图13展现了pV1J/TPA-mTERT-LTB(AI)opt DNA初免/Ad强化对肿瘤病变的体积和分化阶段的抗肿瘤效果。如标明的，BALB/c小鼠用DMH和DNA-EP处理。接种的和对照小鼠中存在的结肠腺瘤的体积(栏A)和组织分化阶段(栏B)在治疗开始30周时分析。肿瘤如下分类：G1：分化良好的腺癌；G2：中度分化的腺癌；G3：不良分化的腺癌)。参见实施例11。
附图14显示了对人类TERT的免疫反应的诱导。两次每两周一次的注射质粒pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt的(DNA-DNA)，或通过质粒pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt的一次注射、两周后Ad6hTERT(AI)1010pp(DNA/Ad)的一次注射来免疫HHD转基因小鼠。通过IFNγICS分析对小鼠PBMC评估免疫反应。小鼠PBMC与HLA-A2等位基因hTERT865(SEQ ID NO：22)的CD8免疫显性肽孵育。绘图的数据来自10只独立的小鼠(实心三角形)。标明了几何平均数值(直线)。参见实施例12和13。
附图15显示了对Cr51标记的靶HeLa-HHD细胞的CTL分析的结果。从一只免疫的小鼠获得的CD8+T细胞在针对HeLa-HHD细胞的CTL分析中测试，其在用于肽稀释的DMSO的存在下用hTERT865肽或w/o肽外源地加载。HeLa-HHD细胞还用编码hTERT的Ad载体或编码GFP的Ad感染作为对照。参见实施例14。
附图16显示了在通过DNA-EP免疫的恒河猴中对hTERT的细胞介导的免疫反应的诱导。对来自hTERT免疫的恒河猴(pV1J/TPA-hTERT-LTB；DNA-EP/DNA-EP)的PBMC进行ELIspot分析。一式两份地进行分析，显示了来自复本的平均值。显示了在第二次DNA-EP之后进行的分析(栏A)。还显示了在第五次DNA-EP之后进行的分析(栏B)。参见实施例15。
附图17显示了，在用DNA-EP接种、用表达hTERT的腺病毒强化的恒河猴中，与通过单独的DNA-EP接种的猴子中引发的CMI相比，对hTERT的细胞介导的免疫反应增强了。在免疫过程的结束时对来自hTERT免疫的恒河猴的PBMC进行ELIspot，所述免疫过程包括五次DNA-EP(pV1J/TPA-hTERT-LTB)注射，之后是两次Ad(Ad6-hTERT)注射。一式两份地进行分析，显示了来自复本的平均值。参见实施例15。
发明的详细说明
端粒酶的催化成分，称为端粒酶逆转录酶(TERT)的表达通常在多种范围的肿瘤类型中检测到。端粒酶在大多数癌症类型中过量表达以及在正常细胞中低表达或不表达的组合，使得TERT成为与异常的细胞增殖相关的疾病例如癌症的治疗和/或预防的靶点。为此，本发明涉及组合物和方法，来通过TERT肿瘤相关抗原引发或增强对表达的蛋白质产物的免疫性，其中异常的TERT表达与癌或它的发展相关。异常的TERT表达与癌的相关性不需要TERT蛋白在肿瘤发展的所有时点在肿瘤组织中表达，因为异常的TERT表达可能在肿瘤初始期出现而在肿瘤发展的晚期检测不到，或反之。
从而，本发明提供了用于疫苗和药物组合物的包含TERT序列或其变体的多核苷酸、载体、宿主细胞和编码的蛋白，所述疫苗和药物组合物用于癌症的治疗和/或预防。本发明的多核苷酸包含编码TERT蛋白或其变体的核苷酸序列，其与编码大肠杆菌热不稳定肠毒素的B亚基(LTB)的核苷酸序列融合，能有效地辅佐针对相连的TERT抗原的免疫反应。
在本发明的某些实施方式中，在此公开的核苷酸序列进一步包含处在TERT基因的编码序列之前的TPA前导序列以确保TERT-LTB融合蛋白被分泌。在本发明的这个方面的优选的实施方式中，TPA-hTERT(AI)-LTB融合物编码SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。优选的核苷酸序列在SEQID NO：1中列出。在进一步优选的实施方式中，TPA-mTERT(AI)-LTB融合物编码SEQ ID NO：4中列出的氨基酸序列。优选的核苷酸序列在SEQID NO：3中列出。
本发明的TERT核苷酸序列可以是人类来源的，或可以是来自另一物种例如小鼠的TERT同源物。在SEQ ID NO：12中列出了野生型人类TERT核苷酸序列，早先已经报道了(参见，例如，美国专利No.6,166,178；美国专利6,261,836；美国专利No.6,927,285；美国专利申请2003-0096344；Meyerson等，Cell90：785-95(1997)；Nakamura等，Science277：955-59(1997))。TERT融合物的TERT部分可以是全长的，或是足以在哺乳动物中引发TERT特异性T细胞免疫反应的任何变体。本发明的TERT变体包括，但不限于C-或N-末端截短的序列、具有保守性替换的序列，和具有内部的删除或插入的序列。本发明的优选的TERT变体包含功能上地消除端粒酶催化活性的突变。本发明的编码的TERT融合蛋白当导入有需要的疫苗接受者或患者时能够诱导细胞介导的免疫反应。
如上所述，在本发明的优选的实施方式中，端粒酶抗原的端粒酶催化活性被灭活(在此称为“TERT(AI)”)，从而对于疫苗目的，所述编码的TERT融合蛋白是比野生型TERT更安全的。TERT融合蛋白的酶活性可以通过向TERT编码核苷酸序列添加突变/删除来灭活。因此，本发明包括编码TERT-LTB融合蛋白的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码变体hTERT蛋白，其中所述变体包含相对于SEQ ID NO：12中所列野生型hTERT氨基酸序列的一个或更多个突变，并且其中所述突变用作消除所编码的hTERT蛋白的端粒酶催化活性。在本发明的特定的示范性实施方式中，核苷酸已经被突变，以改变人类TERT蛋白序列中特定的氨基酸D712A和V713I(SEQ ID NO：10中列出)，以及小鼠TERT蛋白序列中的D702V和V703I。编码SEQ ID NO：10中列出的突变的人类TERT序列的核苷酸序列在SEQ ID NO：9中公开。
在本发明的优选的实施方式中，TERT-LTB融合物的TERT部分是人类TERT或其变体，例如hTERT(AI)。在其他优选的实施方式中，所述TERT部分是鼠TERT，或其变体，例如mTERT(AI)。本发明的TERT变体和TERT编码核苷酸序列变体包含消除端粒酶酶活性的突变。
因此，本发明涉及包含编码TERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列的合成多核苷酸，所述融合蛋白包含与LTB蛋白或其变体融合的TERT蛋白或TERT蛋白的生物学无活性的片段或突变形式，所述LTB蛋白或其变体能有效地增强对TERT蛋白的免疫反应。所述TERT蛋白的突变形式包括但不限于：保守性氨基酸替换、氨基末端截短、羧基末端截短、删除或添加。任何这样的TERT变体，片段和/或突变体将编码蛋白或蛋白片段，其至少基本上模拟了SEQ ID NO：12中所列TERT蛋白的免疫学性质。优选的TERT变体是催化上无活性的，例如，SEQ ID NO：10中所列的TERT变体。
本发明的合成多核苷酸编码mRNA分子，所述mRNA分子表达TERT(AI)-LTB融合蛋白，所述融合蛋白能够刺激或增强针对相连的TERT蛋白的免疫反应，从而在治疗或预防性癌症疫苗的开发中是有用的。本发明的TERT-LTB融合物的LTB部分已经显示了强烈地强化共同递送的抗原的免疫原性(参见，例如，Simmons等Scand.J.Immunol.53：218-26(2001))。
还考虑用于本发明的是编码LTB变体或突变体的核苷酸序列，其包括但不必限于：核苷酸替换、删除、添加，氨基末端截短和羧基末端截短。在某些情况下，向编码LTB的核苷酸序列添加特定的点突变来降低或消除编码的蛋白的毒性可能是有益的。在本发明的优选的实施方式中，与TERT序列融合的所述LTB序列被截短了它的信号序列。
本发明的TERT-LTB融合物的LTB部分或其变体可以融合到TERT序列的氨基末端或羧基末端。进一步的，LTB序列和TERT序列可以N-末端到N-末端、C-末端到C-末端、C-末端到N-末端或N-末端到N-末端地融合。在本发明的优选的实施方式中，TERT多肽的C-末端与LTB的N-末端融合。
本发明涉及包含核苷酸序列的合成核酸分子(多核苷酸)，所述核苷酸序列编码表达新的TERT-LTB融合蛋白的mRNA；例如，编码SEQ IDNO：6和8中所列融合蛋白的核苷酸序列。本发明的特别优选的TERT融合物是SEQ ID NO：5中所列的hTERT(AI)-LTB融合物序列。本发明的核酸分子基本上不含其他核酸。
本领域技术人员将认识到，其他核苷酸序列对于疫苗目的是有用的，例如，编码SEQ ID NO：6中所列hTERT(AI)-LTB蛋白序列的核苷酸序列。本发明还包括编码无活性hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白与SEQ ID NO：6基本上相似、但不是确切相同的，特别是由于克隆策略所产生的在TERT(AI)序列和LTB序列的接点处的氨基酸差异。
本发明还涉及重组载体以及原核和真核的重组宿主细胞，它们含有在整个说明书中公开的核酸分子。本发明的合成的DNA分子、相关的载体和宿主对于癌症疫苗的开发是有用的。
本发明的示范性的核酸分子包括选自由如附图1-2所示SEQ ID NO：5和7构成的组的核苷酸序列，其编码本发明的示范性的hTERT-LTB和mTERT-LTB融合蛋白。
本发明还包括SEQ ID NO：5和7的生物学活性片段或突变体，SEQID NO：5和7编码表达示范性的TERT-LTB融合蛋白的mRNA。任何这样的生物学活性片段和/或突变体将编码蛋白或蛋白片段，其至少基本上模拟了hTERT蛋白的免疫学性质，所述hTERT蛋白包括但不限于SEQ IDNO：12中所列的hTERT蛋白。这样的多核苷酸包括但不必限于：核苷酸替换、删除、添加、氨基末端截短和羧基末端截短。本发明的优选的突变核苷酸序列编码mRNA分子，所述mRNA分子在真核细胞中表达酶学失活的TERT-LTB融合蛋白，所述融合蛋白能够在有需要的患者中引发预防性或治疗性免疫反应，从而在癌症疫苗开发中是有用的。
还包括在本发明的范围内的是基本上不改变表达的蛋白的最终物理性质的DNA序列中的突变体。例如，缬氨酸对亮氨酸、精氨酸对赖氨酸、或天冬酰胺对谷氨酰胺的替换可能不会引起多肽所需功能方面的变化，例如，引发免疫反应的能力。
如上所述，本发明进一步涉及重组载体，其包含整个说明书中公开的核酸分子。这些载体可以由DNA或RNA组成。对于大多数克隆目的，DNA载体是优选的。典型的载体包括质粒、修饰的病毒、杆状病毒、噬菌体、粘粒、酵母人工染色体，或可以编码TERT-LTB融合蛋白的其他形式的游离或整合的DNA。对于特定的基因转移或其他用途确定合适的载体是在本领域技术人员能力范围内的。
本发明还提供的是由在整个说明书中公开的核酸编码的纯化的TERT-LTB融合蛋白，特别是TERT(AI)-LTB融合蛋白。在本发明的这个方面的示例性实施方式中，所述TERT-LTB融合蛋白包含选自由SEQ IDNO：6和8构成的组的氨基酸序列。
本发明包括在严格条件下与SEQ ID NO：5和7的互补物杂交的DNA序列。举例来说，但不是限制，使用高严格条件的过程如下。含有DNA的滤膜的预杂交在缓冲液中在约65℃进行约2小时到过夜，所述缓冲液由6×SSC，5×Denhardt′s溶液和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA组成。在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA和5-20×106cpm的32P标记的探针的预杂交混合物中，在65℃使滤膜杂交约12到48小时。滤膜的洗涤在含有2×SSC、0.1％ SDS的溶液中在37℃下进行约1小时。随后在放射自显影之前用0.1×SSC、0.1％ SDS在50℃洗涤45分钟。使用高严格条件的其他过程包括，在5×SSC、5×Denhardt′s溶液、50％甲酰胺在约42℃进行杂交步骤约12到48小时，或在0.2×SSPE、0.2％SDS中在约65℃进行洗涤约30到60分钟。在上述过程中提及的用于进行高严格杂交的试剂是本领域公知的。可以在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual2ndEdition；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，(1989)或Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY(2001)中找到这些试剂的组成的细节。除上述的以外，可以使用的其他高严格条件也是本领域公知的。
含有TERT-LTB融合蛋白编码核酸分子的表达载体可用于在重组宿主细胞中高水平表达TERT-LTB融合蛋白。表达载体可以包括，但不限于，克隆载体、修饰的克隆载体、特别设计的质粒或病毒。并且，如果需要，各种细菌表达载体可以用于在细菌细胞中表达重组TERT-LTB融合物序列。此外，各种真菌细胞表达载体可以用于在真菌细胞中表达重组TERT-LTB融合物序列。进一步的，各种昆虫细胞表达载体可以用于在昆虫细胞中表达重组蛋白。
本发明还涉及用包含本发明的核酸分子的载体转化或转染的宿主细胞。重组宿主细胞可以是原核或真核的，包括但不限于，细菌例如大肠杆菌、真菌细胞例如酵母、哺乳动物细胞，包括但不限于，牛、猪、猴和啮齿动物来源的细胞系；和昆虫细胞，包括但不限于源于果蝇(Drosophila)和蚕的细胞系。这种重组宿主细胞可以在适合的条件下培养以产生TERT-LTB融合蛋白或生物学等同形式。在本发明的优选的实施方式中，宿主细胞是人类的。如在此定义的，术语“宿主细胞”不打算包括在转基因人类的身体、人类胎儿或人类胚胎中的细胞。
如上所述，含有编码TERT-LTB融合蛋白的DNA的表达载体可用于在重组宿主细胞中表达TERT融合蛋白。因而，本发明的另一个方面是在重组宿主细胞中表达TERT-LTB融合蛋白的方法，包括：(a)将包含核酸的载体导入适合的人类宿主细胞中，所述核酸包含编码TERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT-LTB融合蛋白包含与LTB蛋白的实质部分融合的TERT蛋白或其无活性变体，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和(b)在容许所述TERT-LTB融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞。
在如上所述表达TERT-LTB融合蛋白的方法的优选的实施方式中，所述LTB序列删除了它的信号序列。
在宿主细胞中表达TERT-LTB融合物之后，可以回收TERT-LTB融合蛋白来提供纯化的TERT-LT融合蛋白。数种蛋白纯化方法是可用和适用的。可以通过盐分馏、离子交换层析、尺寸排阻层析、羟磷灰石吸附层析和疏水性相互作用层析的各种组合或单独的应用来从细胞溶胞产物和提取物中纯化重组蛋白。此外，通过使用对TERT蛋白或TERT蛋白的多肽片段特异的单克隆或多克隆抗体制成的免疫亲和柱，从其他细胞蛋白中分离重组的TERT-LTB融合蛋白。
为用于疫苗开发，相对于编码TERT的全长野生型cDNA，本发明的包含TERT-LTB融合物的核酸分子和所编码的融合蛋白被设计以增强TERT-特异性免疫反应。为了进一步增强本发明的TERT-LTB融合物序列的免疫原性，在本文描述的某些实施方式中，编码TERT-LTB融合蛋白的多核苷酸包含为在宿主细胞中进一步高水平表达的优化的密码子，如下所述。在这些实施方式中，设计TERT-LTB融合物的密码子的至少一部分以使用计划的宿主细胞偏爱的密码子，在优选的实施方式中所述宿主细胞是人类细胞。优化的TERT-LTB融合物可以用于开发基于重组腺病毒或质粒的DNA疫苗，其通过细胞介导的免疫提供了针对TERT-相关癌症的有效的免疫预防。合成分子可以被用做免疫原性组合物。本发明提供了密码子优化的TERT-LTB融合物多核苷酸，当其被直接体内导入脊椎动物时在所述动物内诱导所编码的蛋白的表达，所述脊椎动物包括哺乳动物，例如灵长类和人类。
如上所述，在本发明的某些实施方式中，合成分子包括核苷酸的序列，其中一些核苷酸已经改变以使用人类细胞偏爱的密码子，因而容许在人类宿主细胞中高水平的融合蛋白表达。所述合成的分子可以用作TERT-LTB融合蛋白的来源，其可以在癌症疫苗中使用来通过细胞介导的免疫提供针对TERT相关癌症的有效的免疫预防。在此公开的核酸分子也可以用做基于DNA的癌症疫苗的基础。
四种可能的核苷酸碱基的“三联体”密码子可以存在超过60种变化形式。由于这些密码子提供了仅20种不同氨基酸(以及转录起始和终止)的信息，某些氨基酸可以由超过一个密码子编码，这是一种称为密码子冗余的现象。由于某些未完全了解的原因，在不同类型细胞的内源DNA中，可选择的密码子不是一致地出现的。实际上，在某些类型的细胞中对于某些密码子似乎存在可变的天然等级或“偏爱”。作为例子，氨基酸亮氨酸由六种DNA密码子的任何一个指定，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG。对微生物的基因组密码子频率的彻底分析揭示了，大肠杆菌的内源DNA最通常地含有CTG亮氨酸指定密码子，而酵母和粘菌类的DNA最通常地包括TTA亮氨酸指定密码子。鉴于这种等级，普遍认为，通过大肠杆菌宿主获得富含亮氨酸多肽的高水平表达的可能性将在一定程度上取决于密码子使用的频率。例如，可能的是，富含TTA密码子的基因将在大肠杆菌中较弱地表达，而富含CTG的基因将可能在这种宿主中高度表达。类似地，对在酵母宿主细胞中表达富含亮氨酸多肽的优选的密码子是TTA。
密码子偏爱现象对重组DNA技术的意义是明显的，该现象可以用来解释先前在成功转化的宿主有机体中实现外源基因高水平表达的许多失败，在插入的基因中较不“偏爱”的密码子可能重复地出现，用于表达的宿主细胞机制可能不能有效地运作。这种现象提示了，已经被设计以包括计划的宿主细胞偏爱的密码子的合成基因，提供了对于重组DNA技术的实践最佳形式的外源遗传物质。因而，本发明的一个方面是为在人类细胞中表达而密码子优化了的TERT-LTB融合基因。在本发明优选的实施方式中，已经发现，使用编码相同蛋白序列的可选择的密码子可以消除对在人类细胞中表达外源TERT-LTB融合蛋白的制约。
根据本发明的某些实施方式，将编码TERT-LTB融合蛋白的核酸分子转换成具有相同的翻译序列但具有可选择的密码子利用的多核苷酸序列，如Lathe，＂Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino AcidSequence Data：Theoretical and Practical Considerations＂J.Molec.Bio.183：1-12(1985)所描述的，通过引用将其合并在此。该方法一般由在野生型序列中鉴定与高度表达的人类基因通常不相关的密码子，和用在人类细胞中高度表达的最佳密码子替换它们组成。然后检查该新的基因序列中由这些密码子替换产生的不期望的序列(例如，“ATTTA”序列，内含子剪接识别位点的无意产生，不需要的限制性内切酶位点，等等)。通过用编码相同氨基酸的不同密码子替换现有的密码子来消除不期望的序列。然后测试合成基因片段的改善的表达。
要理解的是，这种方法将不必产生一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列中所有的密码子是根据高度表达的人类和/或哺乳动物细胞的密码子利用的最佳密码子。然而，优选的是，在期待TERT和/或LTB的密码子优化的多核苷酸变体的本发明的实施方式中，产生的密码子的实质部分类似于高度表达的人类和/或哺乳动物基因的密码子利用。
如上所述的方法用于产生编码TERT-LTB融合蛋白的合成基因序列，产生包含为在人类细胞中高水平表达而优化的密码子的基因。虽然上述的方法提供了设计用于癌症疫苗的密码子优化基因的代表性方法的概述，本领域技术人员要理解的是，基因的类似疫苗效力或提高的表达可以通过方法中的微小改变或通过序列中的微小改变来实现。
本领域技术人员还将认识到，可以构建其他的核酸分子提供在人类细胞中的高水平TERT-LTB融合物表达，其中该DNA分子的密码子的仅一部分是密码子优化的。例如，在本发明的某些实施方式中，包含TERT-LTB融合物的TERT部分的密码子是为在人类细胞中高水平表达而优化的，包含TERT-LTB融合物的LTB部分的密码子基本上类似于野生型LTB。在本发明的其他实施方式中，包含TERT-LTB融合物的LTB部分的密码子是为在人类细胞中高水平表达而优化的，包含TERT-LTB融合物的TERT部分的密码子基本上类似于野生型TERT基因。仍然在本发明的其他的实施方式中，TERT-LTB融合物的TERT和LTB部分都是为在人类细胞中高水平表达而密码子优化的，例如，如SEQ ID NO：5中所列的hTERT-LTBopt序列。在其中仅处在TERT-LTB融合物的TERT和/或LTB部分内的密码子的亚组被优化的TERT-LTB融合物，也是本发明期待的。
本发明的核酸可以装配到表达盒中，所述表达盒包含被设计以提供在人类细胞中的有效蛋白表达的序列。所述盒优选地含有TERT-LTB融合蛋白编码基因，具有与其可操纵连接的相关的转录和翻译控制序列，例如启动子和终止序列。在优选的实施方式中，所述启动子是具有内含子A序列的巨细胞病毒启动子(CMV)，而本领域的技术人员将认识到，可以使用任何许多其他已知的启动子例如强的免疫球蛋白或其他真核基因启动子。优选的转录终止子是牛生长激素终止子，而其他已知的转录终止子也可以使用。CMV-BGH终止子的组合是特别优选的。
根据本发明，TERT-LTB融合物表达盒被插入载体中。载体优选的是腺病毒或质粒载体，然而也可以使用与启动子相连的线性DNA，或其他载体，例如腺病毒相关病毒或修饰的牛痘病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。
在本发明的优选的实施方式中，所述载体是腺病毒载体(在此与“腺载体”可互换地使用)。腺载体可以基于不同的腺病毒血清型，例如在人类或动物中发现的那些。动物腺病毒的实例包括牛的、猪的、黑猩猩的、鼠的、犬的和禽类的(CELO)。优选的腺载体是基于人类血清型的，更优选的是B、C或D组血清型。人类腺病毒B、C、D或E组血清型的实例包括2型(＂Ad2＂)、4型(＂Ad4＂)、5型(＂Ad5＂)、6型(＂Ad6＂)、24型(＂Ad24＂)、26型(＂Ad26＂)、34型(＂Ad34＂)和35型(＂Ad35＂)。在本发明的特别优选的实施方式中，所述表达载体是腺病毒6型(Ad6)载体。
如果选择的载体是腺病毒，优选的是，该载体是所谓的第一代腺病毒载体。这些腺病毒载体的特征是具有无功能的E1基因区域，和优选删除的腺病毒E1基因区域。此外，第一代载体可以具有无功能的或删除的E3基因区域(Danthinne等Gene Therapy 7：1707-1714(2000)；F.L.Graham，Immunology Today 21(9)：426-428(2000))。腺载体不必要完全移除它们的E1和E3区域。而是，足够数量的E1区域被移除以使得缺失反式(intrans)提供的E1蛋白时载体复制无法完成；所述E1删除或所述E1和E3删除的组合是足够大的以容纳基因表达盒。
在某些实施方式，所述表达盒被插入到腺病毒E1基因通常所处的位置。此外，这些载体任选的具有无功能的或删除的E3区域。优选的是，使用的腺病毒基因组删除了E1和E3区域(ΔE1ΔE3)。该腺病毒可以在表达病毒E1基因的已知细胞系中增殖，例如293细胞或PERC.6细胞，或在被瞬时或稳定转化以表达额外的蛋白的、来源于293或PERC.6细胞的细胞系中增殖。例如，当使用具有受控的基因表达的构建体，例如四环素可调节启动子系统时，所述细胞系可以表达该调节系统中涉及的成分。这种细胞系的一个实例是T-Rex-293；其他的是本领域已知的。
为了方便操作腺病毒载体，腺病毒可以是穿梭质粒形式。本发明还涉及穿梭质粒载体，其包含质粒部分和腺病毒部分，所述腺病毒部分包含删除的E1和任选的E3删除，并具有包含TERT-LTB融合蛋白编码核苷酸序列的插入的表达盒的腺病毒基因组。在优选的实施方式中，存在位于质粒的腺病毒部分侧翼的限制性位点，从而可以容易地除去腺病毒载体。穿梭质粒可以在原核细胞或真核细胞中复制。
在本发明的优选的实施方式中，所述表达盒被插入到Ad6(ΔE1ΔE3)腺病毒质粒中(参见Emini等，US20040247615，通过引用合并在此)。这个载体包含删除了E1和E3区域的Ad6腺病毒基因组。在本发明其他优选的实施方式中，表达盒插入到pMRKAd5-HV0腺病毒质粒中(参见Emini等，US20030044421，通过引用将其合并在此)。这个质粒包含删除了E1和E3区域的Ad5腺病毒基因组。通过将5’顺式作用包装区域进一步延伸到E1基因中来引入被认为在优化病毒包装方面重要的元件，引起增强的病毒扩增，改进pMRKAd5-HV0质粒的设计以超过先前的腺病毒载体。有利地，这种增强的腺病毒载体能够在高传代增殖之后维持遗传稳定性。
制备和纯化DNA构建体的分子生物学标准技术允许制备本发明的腺病毒、穿梭质粒和DNA免疫原。
根据本发明已经确定了，用编码TPA-mTERT(AI)-LTBopt的质粒DNA的基因疫苗接种可以破坏BALB/c和B6小鼠中的免疫耐受性(参见实施例7)。在此还显示的是，使用质粒TPA-mTERT(AI)-LTBopt的免疫可以在BALB/c小鼠中引发细胞毒性免疫反应(参见实施例8)。进一步展现的是，这种构建体能够比单独的mTERT(AI)诱导更强的CD8+免疫反应(参见实施例9)，并且能够控制肿瘤生长(实施例11)。因而在此描述的数据证明了，TERT编码序列与LTB cDNA的融合物引起了TERT特异性免疫反应的提高。
根据本发明还显示了的是，hTERT(AI)-LTBopt可以诱导HLA-A2限制性CD8+免疫反应(参见实施例12)，并且这种免疫反应可以通过用Ad6-hTERT(AI)强化来增高。
因而，如上所述的载体可以用于免疫原性组合物和疫苗，所述免疫原性组合物和疫苗用于预防与异常的TERT表达相关的肿瘤的发展，和/或用于治疗现有的癌症。通过消除在成功地转化的宿主有机体中获得外源TERT的高表达水平的难题，和通过提供当施用给哺乳动物例如人类时能引发增强的免疫反应的TERT-LTB融合蛋白，本发明的载体允许了疫苗开发和商业化。
为此，本发明的一个方面是预防或治疗TERT相关癌症的方法，包括给哺乳动物施用包含多核苷酸的疫苗载体，所述多核苷酸包含编码TERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT-LTB融合蛋白包含融合到LTB的实质部分的无活性的TERT蛋白或其变体，其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应。
根据如上所述的方法，可以施用所述疫苗载体用于在任何哺乳动物中治疗或预防癌症，包括但不限于：肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌。在本发明的优选的实施方式中，所述哺乳动物是人类。
进一步的，本领域的技术人员可以选择用于所描述的治疗和预防方法的任何类型的载体。优选的，所述载体是腺病毒载体或质粒载体。在本发明的优选的实施方式中，所述载体是腺病毒载体，其包含具有在腺病毒E1区域中的删除和在腺病毒E1区域中的插入的腺病毒基因组，其中所述插入包含表达盒，所述表达盒包含：(a)编码TERT-LTB融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT-LTB融合蛋白包含与LTB的实质部分融合的无活性的TERT蛋白或其变体，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和(b)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
本发明进一步涉及腺病毒疫苗载体，其包含具有在腺病毒E1区域中的删除和在腺病毒E1区域中的插入的腺病毒基因组，其中所述插入包含表达盒，所述表达盒包含：(a)编码TERT融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT-LTB融合蛋白包含与LTB的实质部分融合的无活性的TERT蛋白或其变体，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和(b)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
在本发明这个方面的优选实施方式中，所述腺病毒载体是Ad6载体。
在本发明的另一个优选的实施方式中，所述腺病毒载体是Ad5载体。
在又一个优选的实施方式中，所述腺病毒载体是Ad24载体。
还考虑用于本发明的是包含腺病毒基因组的腺病毒疫苗载体，其天然地感染除了人类以外的物种，包括但不限于，黑猩猩腺病毒载体。本发明的这个方面的优选的实施方式是黑猩猩Ad3疫苗载体。
在另一个方面，本发明涉及包含质粒部分和表达盒部分的疫苗质粒，所述表达盒部分包含：(a)编码TERT融合蛋白的核苷酸的序列，其中所述TERT融合蛋白包含与LTB的实质部分融合的无活性的TERT蛋白或其变体，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和(b)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。适合的质粒的实例将是如所描述的哺乳动物表达质粒V1Jns(J.Shiver等in DNA Vaccines，M.Liu等eds.，N.Y.Acad.Sci.，N.Y.，772：198-208(1996)，通过引用合并在此)。
在本发明的某些实施方式中，在此公开的基于重组腺病毒和质粒的多核苷酸疫苗被用于各种初免/强化(prime/boost)组合以诱导增强的免疫反应。在这种情况下，以“初免和强化”方式施用两种载体。例如施用第一类型的载体一次或更多次，在预定的时间之后，例如，2周、1个月、2个月、六个月或其他适当的间隔时间，施用第二类型的载体一次或更多次。优选的，所述载体携带编码相同的多核苷酸或多核苷酸组合的表达盒。
在也使用质粒DNA的实施方式中，优选的是，该载体含有被哺乳动物或昆虫细胞识别的一种或更多种启动子。在优选的实施方式中，所述质粒将含有强启动子，例如但不限于，CMV启动子。本领域技术人员将认识到，许多其他的已知启动子的任一种可以被选择用于驱动本发明的TERT-LTB核苷酸序列的表达。启动子的其他实例包括天然存在的启动子，例如EF1alpha启动子、劳氏肉瘤病毒启动子，和SV40早期/晚期启动子和p-肌动蛋白启动子；以及人工启动子，例如合成的肌肉特异性启动子和嵌合的肌肉特异性/CMV启动子(Li等，Nat.Biotechnol.17：241-245(1999)；Hagstrom et al.，Blood 95：2536-2542(2000))。要表达的合成TERT-LTB融合物基因或其他基因将与这样的启动子连接。
如上所述，可以将腺病毒载体疫苗和质粒疫苗施用给脊椎动物作为单一治疗方式的部分来诱导免疫反应。为此，本发明涉及保护哺乳动物免于TERT相关癌症的方法，包括：(a)向所述哺乳动物中导入第一载体，所述第一载体包含：i)编码TERT融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含与LTB的实质部分融合的无活性的TERT蛋白或其变体，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和ii)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子；(b)容许经过预定的时间；和(c)向所述哺乳动物中导入第二载体，所述第二载体包含：i)编码TERT融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含与LTB的实质部分融合的无活性的TERT蛋白或其变体，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和ii)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
在如上所述的保护方法的一个实施方式中，所述第一载体是质粒，第二载体是腺病毒载体。在可选择的实施方式中，第一载体是腺病毒载体，第二载体是质粒。在本发明的某些实施方式中，在施用所述第二载体之前，所述第一载体被施用给患者超过一次。
在如上所述的方法中，施用第一类型的载体超过一次，每次载体施用间隔预定的时间。这种第一类型载体的系列施用在经过预定的时间之后可以跟随着一次或更多次第二类型载体的施用。类似于第一类型载体的治疗，第二类型载体也可以按照着预定的时间间隔给予一次或超过一次。
本发明进一步涉及治疗患有TERT相关癌症的患者的方法，包括：(a)向所述哺乳动物中导入第一载体，所述第一载体包含：i)编码TERT融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含与LTB的实质部分融合的TERT(AI)蛋白或其变体，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和ii)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子；(b)容许经过预定的时间；和(c)向所述患者中导入第二载体，所述第二载体包含：i)编码TERT融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含与LTB的实质部分融合的TERT(AI)蛋白或其变体，并且其中所述融合蛋白能够在患者中产生免疫反应；和ii)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
在如上所述的治疗方法的一个实施方式中，所述第一载体是质粒，第二载体是腺病毒载体。在可选择的实施方式中，第一载体是腺病毒载体，第二载体是质粒。在如上所述的方法的进一步优选的实施方式中，在向所述患者施用第二载体之前，所述第一载体被施用给所述患者超过一次。
在如上所述的方法的优选的实施方式中，所述载体包含编码TERT(AI)-LTB融合蛋白的核苷酸序列，其中所述TERT融合蛋白包含与LTB的实质部分融合的无活性的TERT蛋白。
待导入疫苗接受者的可表达DNA或可转录RNA的数量部分地取决于使用的启动子的强度和表达的基因产物的免疫原性。一般地，将约1ng到100mg、优选的约10μg到300μg的免疫或预防有效剂量的质粒疫苗载体直接施用到肌肉组织中。重组腺病毒的有效剂量是约106-1012个粒子，优选的约107-1011个粒子。皮下注射、皮内导入、压过皮肤，和其他施用模式，例如腹膜内的、静脉内的、肌肉内的或吸入递送也是考虑的。
在本发明的优选的实施方式中，通过肌肉内注射将疫苗载体导入接受者。
本发明的疫苗载体可以是裸露的，即，未与任何蛋白或影响接受者的免疫系统的其他试剂缔合。在这种情况下，希望的是疫苗载体处在生理学可接受的溶液中，例如但不限于，无菌盐水或无菌缓冲盐水。或者，有益的是，施用帮助DNA的细胞摄取的试剂，例如但不限于钙离子。这些试剂一般称为转染促进试剂和药学上可接受的载体。本领域的技术人员能够确定特定的试剂或药学上可接受的载体以及施用的合适次数和方式。
为了描述和公开可以与本发明相联系使用的方法和材料，在此提及的所有出版物通过引用合并。在此的任何内容都不能解释为承认本发明因为在先发明而无权早于所述公开。
参考附图描述了本发明的优选的实施方式，要理解的是本发明不限于这些明确的实施方式，本领域的技术人员可以实行各种改变和修改而不背离如所附权利要求中所定义的本发明的范围和精神。
以下实施例说明、但不限制本发明。
实施例1
TERT融合蛋白的构建
为了确定端粒酶逆转录酶(TERT)抗原与大肠杆菌热不稳定肠毒素的LTB亚基((Fingerut等Vaccine 23(38)：4685-96(2005)；Rigano等Plant Cell Rep.22(7)：502-8(2004))的融合物是否可以增强单独的TERT的免疫原性，构建了具有数个修饰的、编码全长端粒酶逆转录酶的载体。首先，DNA序列被密码子优化来包括人类宿主细胞偏爱的密码子。另外，为了确保编码的抗原对于疫苗用途是安全的，向TERT核苷酸序列中导入突变来灭活编码的蛋白质的端粒酶催化活性。具体地，突变D712A和V713I被添加到人类TERT序列，突变D702A和V703I被添加到小鼠TERT序列(Arai等Two independent regions of human telomerase reversetranscriptase are important for its oligomerization and telomerase activity.J.Biol.Chem.277(10)：8538-44(2002))。
通过将如上所述的修饰的TERT核苷酸序列的C-末端连接到已经除去信号肽编码序列的、编码修饰的LTB的核苷酸序列(nt64到375)，来工程化TERT融合物。另外，将编码人类组织纤溶酶原激活物(TPA)信号序列的前导序列添加到TERT编码核苷酸序列的5′以确保TERT蛋白的分泌(Haddad等Comparative study of DNA-based immunization vectors：effect of secretion signals on the antibody responses in mice.FEMS Immunol.Med.Microbiol.18(3)：193-202(1997))。利用计算机算法，全部序列被密码子优化来包括人类宿主细胞偏爱的密码子。合成的密码子优化的基因通过合成的寡核苷酸来组装。在最终的构建体中，由于克隆策略，在TERT序列和LTB序列之间添加了两个氨基酸(S和R)。
将编码TERT融合物的核苷酸序列克隆到载体pV1JnsA中处在人类巨细胞病毒(CMV)/内含子A启动子以及牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号的控制下。质粒pV1J/TPA-hTERT-LTBopt带有密码子优化的、失活的人类TERT的cDNA，其在N-末端上融合到TPA信号序列的编码序列，在C-末端上融合到LTB的编码序列。类似地，质粒pV1J/TPA-mTERT-LTBopt带有融合到TPA和LTB的、密码子优化的、失活的、小鼠TERT的cDNA。
实施例2
质粒和腺病毒构建体
pV1JnsA/TPA-mTERT(AI)-LTBopt：含有TPA-mTERT(AI)-LTB序列的质粒041046pucKana获自GENEART(Geneart GmbH，Regensburg，Germany)。该质粒用BglII和SalI消化，产生的片段克隆到质粒pV1JnsA中的BglII/SalI位点中(Montgomery等，DNA Cell Biol.，12(9)：777-83(1993))。
pV1JnsA/mTERT(AI)opt：pV1JnsA/TPA-mTERT(AI)-LTB用XbaI消化来除去LTB编码序列(处在两个XbaI位点之间)，产生的构建体pV1JnsA/TPA-mTERT具有处在最后的mTERT氨基酸之后和终止密码子之前的3个氨基酸(S；R；N)。TPA编码序列的去除通过BamHI和EcoRV消化在pV1JnsA/TPA-mTERT(AI)上进行。TPA编码序列被用有义引物(5’-G A T C T G A T G A T A T C G C C A C C A T G A C C A G A G C CC C C A G A T G-3；SEQ ID NO：15)和反义引物(5’-A G G G G G G A T CC G C A C A C C T G G T A G G C G C A G C T G G G G-3’；SEQ IDNO：16))扩增mTERT序列获得的PCR产物替换，并克隆回BamHI和EcoRV消化的载体。
pV1JnsA/TPA-hTERT(AI)-LTBopt：通过GENEART获得的相应于TPA-hTERT(AI)-LTB的合成片段利用BglII/SalI限制性位点克隆到pV1JnsA中。
Ad6-TPAmTERT(AI)-LTBopt：含有TPA-mTERT(AI)-LTBopt序列的质粒041046pucKana获自GENEART。该质粒用BglII和SalI消化，片段BglII/SalI克隆到质粒pNEBAd6-CMVpA穿梭载体中。用BglI/HindIII消化的质粒pNEBAd6-CMVpA-TPA-mTERT(AI)-LTB重组到ClaI线性化的质粒pMRK Ad6 ΔE1 ΔE3中。用PacI酶切质粒来释放Ad ITRs，并在PerC-6细胞中转染。Ad6载体扩增通过连续传代来进行，通过标准的CsCL梯度纯化来进行纯化。
Ad6-hTERT(AI)：含有hTERT的野生型序列(hTERT野生型序列通过人类肿瘤细胞的mRNA的逆转录来被恢复)的质粒pCRsript BglII/XbaI消化，用Klenow酶填充，克隆到EcoRV和BglII消化的pV1JnsA中。通过利用寡核苷酸(5’-C T G T A C T T T G T C A A G G T G G C T A T C AC G G G C G C G T A C G-3’；SEQ ID NO：17)和Stratagene quikchange多重定点诱变试剂盒(Stratagene，LA Jolla，CA；Cat：200513)诱变pV1JnsA-hTERT来获得pV1JnsA-hTERT(AI)。该质粒用BglII和SalI消化，片段BglII/SalI克隆到质粒pNEBAd6-CMVpA穿梭载体中。用PacI/PmeI消化质粒pNEBAd6-CMVpA-hTERT(AI)，重组到ClaI线性化的质粒pMRK Ad6 ΔE1 ΔE3中。用PacI酶切质粒来释放Ad ITRs，并在Perc-6细胞中转染。Ad6载体扩增通过连续传代来进行，通过标准的CsCL梯度纯化来进行纯化。
实施例3
IFN-γELISPOT分析
利用标准的酶联免疫斑点(ELISPOT)分析(Miyahira等J ImmunolMethods 181(1)：45-54(1995))检测以抗原特异性方式分泌IFN-γ的小鼠脾细胞。九十六孔MAIP平板(Millipore Corp.，Billerica，MA)用100μl/孔的、在无菌PBS中稀释到2.5μg/ml的纯化的大鼠抗小鼠IFN-γ(IgGl，克隆R4-6A2，Pharmingen)包被。用PBS洗涤之后，平板的封闭用200μl/孔的R10培养基在37℃进行2小时。
以无菌方式通过从安乐死的小鼠移除脾脏，然后在金属筛网上搓擦破坏脾脏来获得脾细胞。通过向细胞团添加1ml0.1×PBS并旋涡约15秒，来通过渗透裂解除去红细胞。然后添加1ml2×PBS，用1×PBS将体积调至4ml。通过在RT在1200rpm离心10分钟将细胞团粒化，将团粒重悬浮在1ml R10培养基中。使用Türks染色对活细胞计数。
以5×105和2.5×105细胞/孔一式两份将脾细胞平板接种，用每种肽的1μg/ml悬浮液在37℃孵育20h。对每个小鼠以5μg/ml使用伴刀豆球蛋白A(ConA)作为阳性内部对照。用PBS、0.05％吐温20洗涤之后，平板与分析缓冲液中1∶2500稀释的50μl/孔结合生物素的大鼠抗小鼠IFNγ(RatIgGl，克隆XMG 1.2，PharMingen)在4℃孵育O/N。在彻底洗涤之后，通过添加50μl/孔NBT/B-CIP(Pierce)培育平板直到斑点的显影明显可见。通过用蒸馏水彻底地洗涤平板来停止反应。风干平板，使用自动化ELISPOT读取器对斑点进行计数。
实施例4
细胞内细胞因子染色.
将加入EDTA通过眶后放血获得的一到两百万小鼠脾细胞或PBMC重悬浮在1ml RPMI 10％ FCS中，与肽库(每种肽5-6μg/ml终浓度)和布雷菲尔德菌素A(1μg/ml；BD Pharmingen cat #555028/2300kk)在37℃和5％ CO2孵育12-16小时。然后用FACS缓冲液(PBS 1％ FBS，0.01％NaN3)洗涤细胞，在4℃与纯化的抗小鼠CD16/CD32 Fc片段(BDPharmingen cat # 553142)孵育15分钟。然后洗涤细胞，用表面抗体：CD4-PE结合的抗小鼠(BD Pharmingen，cat.# 553049)、PercP CD8结合的抗小鼠(BD Pharmingen cat# 553036)和APC结合的抗小鼠CD3e(BDPharmingen cat# 553066)在暗处室温下染色30分钟。洗涤之后将细胞固定，在暗处4℃用Cytofix-Cytoperm溶液(BD Pharmingen cat#555028/2300kk)渗透化20分钟。用PermWash溶液(BD Pharmingen cat#555028/2300kk)洗涤之后，细胞与IFNγ-FITC抗体(BD Pharmingen)孵育。然后洗涤细胞，用PBS中的1％甲醛固定，使用CellQuest软件(Becton Dickinson，San Jose，CA)在FACS-Calibur流动血细胞计数器上进行分析。
实施例5
细胞毒T淋巴细胞(CTL)分析
以无菌方式通过从安乐死的小鼠移除脾脏，然后在金属筛网上搓擦破坏脾脏来获得脾细胞。通过向细胞团添加1ml 0.1×PBS并旋涡约15秒，来通过渗透裂解除去红细胞。R10中2×106细胞/ml的脾脏细胞在存在终浓度10μg/ml的免疫原性肽的情况下平板接种到24孔细胞培养物平板(2ml细胞/孔)上。平板在37℃、95％湿度、5％ CO2孵育6天。在培养的第3天，添加终浓度10U/ml的重组人IL-2。
收获生长到指数期的靶细胞，在存在10μg/ml终浓度的免疫原性肽的情况下调节为1×106细胞/ml/试管。细胞用50-100μCi51Cr/试管在37℃标记2小时。通过在250g离心，用10ml培养基洗涤靶细胞三次，室温5分钟，调节为1×105细胞/ml。
通过按100:1、50:1、25:1和12.5:1的E/T比例平板接种效应物/靶细胞，进行CTL分析。在4小时的孵育之后，平板在1200rpm离心5分钟，收获上清液(30μl/孔)。平板干燥过夜，利用Beta-平板计数器来计数。
实施例6
小鼠免疫
雌性C57BL/6小鼠(H-2b)购自Charles River(Lecco，Italy)。HLA-A2.1小鼠(HHD)由F.Lemmonier(Institute Pasteur，Paris，France)惠赠。BALB/c小鼠(H-2d)购自Charles River(Lecco，Italy)。在8周龄的时候免疫小鼠。如早先描述的(Rizzuto等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(11)：6417-22(1999))，将50微克质粒DNA以50μl体积电注射到小鼠四头肌中。电穿孔(EP)如早先描述的进行(Zucchelli等J.Virol.74(24)：11598-607(2000)；Rizzuto等，上文)。简要地，电击由具有1000个方形双极脉冲(90V/cm，75mA，200μs/相)的10个串列组成。以50μl体积在小鼠四头肌中进行Ad注射。在标明的时间分析细胞介导的免疫反应。
实施例7
编码TPA-mTERT(AI)-LTB的质粒DNA的基因疫苗接种破坏免疫耐受性
为了确定TPA-mTERT(AI)-LTB的小鼠疫苗接种是否可以破坏免疫耐受性，20只BALB/c小鼠的组用质粒pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTB的5次每周一次的注射(5 weekly injections)、随后电穿孔来免疫，如实施例6中描述的。在最后的注射之后11天，从单个小鼠获得脾细胞，用于通过IFN-γELISPOT分析和通过细胞内细胞因子染色(ICS)来分析细胞介导的免疫反应。
使用重叠11个氨基酸并包括完整mTERT蛋白的15mer mTERT肽的三个库来测量来自刺激的脾细胞的抗原特异性IFNγ分泌。mTERT-1库由覆盖从氨基酸1到388的mTERT区域的94个单独的肽组成。mTERT-2库由覆盖从氨基酸377到811的mTERT区域的106个单独的肽组成。mTERT-3库由覆盖从氨基酸801到1122的mTERT区域的78个单独的肽组成。作为阴性对照，在用与溶解TERT肽所使用的相同浓度的DMSO刺激脾细胞时，测量了细胞因子产生。通过使用重叠11个氨基酸并覆盖整个LTB序列的24个单独的15-mer肽的库，还检测了针对LTB佐剂诱导的免疫反应。ELIspot结果表明，TPA-mTERT(AI)-LTBopt的小鼠疫苗接种引发了针对TERT-1和TERT-2肽库中所含的、TERT蛋白的N-末端和中央区域的细胞介导的免疫反应(CMI)(附图3)。还通过ELIspot检测了针对LTB的CMI(附图3)。
为了更好地表征质粒pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt引发的T细胞反应和鉴定导致IFN-γ产生的CD8+和CD4+T细胞亚群，对接种的小鼠脾细胞进行IFN-γ细胞内染色并通过FACS分析。ICS获得的数据展现了，TPA-mTERT(AI)-LTBopt接种的BALB/c小鼠的基因疫苗接种引发了针对TERT蛋白的N-末端区域(mTERT-1肽库中所含的，参见附图4)的显著的CD8+T细胞反应。CD4+T细胞反应被定位在TERT的中央区域(mTERT-2肽库)。相比之下，在这些小鼠中没有检测到针对蛋白的C-末端区域(mTERT-3肽库)的CMI。还检测到针对LTB的CD4+T细胞反应(附图4)。
为了进一步定位CD8+T细胞反应，使用了mTERT15mer肽的中型库(midi pool)。每个中型库含有十个15mer，它们各自独立地被包含在独立的中型库中。因而，2个中型库的阳性反应将明确地鉴定出单个15mer是免疫原性的。因为CD8+表位总是9氨基酸长度，任何CD8+肽被包含在两个邻近的11mer肽中。结果表明，CD8+T细胞免疫反应被定位到包括在以下15mer mTERT肽中的TERT区域：mTERT-41(TERTaa161；LVPPSCAYQVCGSPL(SEQ ID NO：18)和mTERT-42(TERTaa165；SCAYQVCGSPLYQIC；SEQ ID NO：19)。通过重叠两个15mer肽(mTERT41和mTERT-42)，合成了三种可能的反应性九聚物，并在ICS中测试。最后，BALB/c小鼠中的免疫显性CD8+表位被鉴定为在以下序列中(mTERTaa167；AYQVCGSPL；SEQ ID NO：20)。这些结果表明，使用pV1J/TPA-mTERT-LTB的BALB/c小鼠疫苗接种可以破坏对mTERT抗原的免疫耐受性。
为了证实BALB/c小鼠中获得的数据，还用质粒pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt的5次每周一次的注射免疫了C57BL/6(B6)小鼠。对接种的小鼠脾细胞进行IFN-γ细胞内染色，通过FACS分析。类似于用BALB/c小鼠获得的结果，在所有B6小鼠中针对mTERT的耐受性被破坏。另外，在用TERT肽刺激时，通过ICS检测到产生IFNγ的CD4+和CD8+T细胞(参见附图6)。
C57BL/6小鼠中通过DNA疫苗接种引发的CD8+免疫反应主要偏向TERT蛋白的中央区域(肽库mTERT-2)。还在mTERT肽库-1中检测到较弱的CD8+免疫反应。如上所述利用中型库在B6小鼠中定位了CD8+免疫反应。在B6中鉴定到两个CD8+表位。第一个免疫原性序列被定位到氨基酸序列mTERT198(VGRNFTNL；SEQ ID NO：21)，第二个CD8+表位被定位到序列mTERT486(SLGKYGKL；SEQ ID NO：22)。另外，CD4+免疫反应被定位到TERT的N-末端(肽库mTERT-1)。针对mTERT的C-末端区域没有检测到免疫反应。
类似于如上所述用BALB/c小鼠获得的结果，B6小鼠的随后的免疫反应的免疫和分析证实了，TPA-mTERT(AI)-LTBopt免疫可以破坏对mTERT抗原的免疫耐受性。因而，结合起来，用BALB/c和B6小鼠获得的结果表明，TPA-mTERT(AI)-LTBopt融合物是独立于所使用的小鼠株系的、自身有效的免疫原。
实施例8
TERT特异性CD8+T细胞的细胞溶解活性
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分析被用于检测通过用pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt免疫BALB/c小鼠引发的TERT特异性CD8+T细胞的细胞溶解活性。用质粒pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt的5次每周一次的注射、随后电穿孔来免疫小鼠。从2只单独的小鼠获得的小鼠脾细胞在最后一次免疫之后10天采集。这些脾细胞用免疫原性肽mTERTaa167(AYQVCGSPL；SEQ ID NO：20)刺激一周来获得体外活化的T细胞。BALB/c同系肿瘤细胞系4T1(Aslakson等Cancer Res.52(6)：1399-405(1992))被用作靶标。4T1细胞用免疫反应性肽加载，用Cr51标记作为CTL分析的靶标。以不同的效应物/靶标比例，将活化的T细胞与靶4T1细胞共同孵育。当用免疫原性肽mTERTaa167(AYQVCGSPL；SEQ ID NO：20)加载时，从小鼠#1和小鼠#2获得的活化的T细胞显示了对靶细胞的细胞溶解活性。在50/1的效应物/靶标比例下，两只小鼠显示了从80％(小鼠#1)到25％(小鼠#2)的不同程度的细胞毒性活性。
结果表明，在BALB/c小鼠中在用TPA-mTERT(AI)-LTBopt作为自身抗原DNA免疫时诱导了细胞毒性免疫反应(附图5)。
实施例9
TPA-mTERT(AI)-LTBopt构建体的比较性免疫原性
为了比较由pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt编码的、与LTB融合的分泌的mTERT(AI)蛋白，与没有融合到LTB的mTERT(AI)的非分泌形式的免疫原性，构建了携带mTERT(AI)的质粒pV1J衍生物，如实施例2中描述的。
6只BALB/c小鼠的组用质粒pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt或pV1J/mTERT(AI)opt的5次每周一次的注射来免疫。利用早先对BALB/c小鼠鉴定的mTERTaa167 CD8+免疫显性表位序列(AYQVCGSPL(SEQ IDNO：20)，通过IFNγ细胞内染色来监视免疫反应。
结果表明，与mTERT(AI)相比，对于诱导针对鼠端粒酶的CD8+免疫反应，TPA-mTERT(AI)-LTBopt是更好的构建体(附图7)。在由TPA-mTERT-LTB(AI)opt免疫的组中诱导的CD8+T细胞反应中所观察到的差异，统计学上不同于在DNA免疫的情境中利用mTERT(AI)opt所获得的(p＝0.04studentt检验)。
实施例10
免疫方式的比较
通过用DNA TPA-mTERT(AI)-LTBopt加单独的电刺激免疫BALB/c小鼠引发的抗mTERT细胞介导的免疫反应，与利用DNA TPA-mTERT(AI)-LTBopt加电刺激作为初免、Ad6TPA-mTERT(AI)-LTBopt作为免疫反应的最终强化剂的多样化初免/强化免疫方式所诱导的免疫反应进行了比较。
用质粒pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt的5次每周一次的注射来免疫10只小鼠的组。一周以后，给予强化剂注射，其由50μgDNA的一次额外的注射加电穿孔(EP)组成，或用1010vp的Ad6/TPA-mTERT(AI)-LTBopt。对小鼠PBMC进行IFNγ细胞内染色来评估产生的细胞介导的免疫反应。早先定位到TERT的N-末端区域的、包含CD8+T细胞特异性表位mTERT167(AYQVCGSPL；SEQ ID NO：20)的肽被用作抗原。结果表明，DNA-EP/Ad组合所引发的免疫反应的幅度是在仅接受DNA-EP方式的小鼠中观察到的4.6倍(参见附图8)。
实施例11
TPA-mTERT-LTB的疫苗接种控制肿瘤生长
为了确定mTERT特异性免疫反应是否可以产生抗肿瘤效果，在疫苗接种之前通过腹膜内(i.p.)注射用化学致癌物二甲基肼处理BALB/c小鼠。小鼠用这种致癌物质处理导致结肠中渐进性的肿瘤发展，特征是异常的隐窝形成、腺瘤和最后的癌。这些小鼠的化学处理不使它们成为免疫妥协的，因为用TPA-mTERT(AI)-LTBopt的免疫引发了与早先在未处理小鼠中所发现的相当的免疫反应(数据未显示)。
为了评估基因疫苗接种对DMH诱导的癌发生的早期阶段的影响，根据附图9中描述的进度表，BALB/c小鼠用DMH处理并通过用pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt进行DNA随后电穿孔(DNA-EP)来免疫。
在开始DMH处理之后12周对二十只小鼠安乐死来统计ACF(异常的隐窝病灶)的数目和已经形成的腺瘤的数目。与未接种的小鼠相比，接种的小鼠中观察到存在的ACF的数量和腺瘤的数量的显著降低(附图10)。
还监视了mTERT疫苗接种对肿瘤发展的晚期阶段的效力。为了增强和维持对mTERT的免疫反应，小鼠接受了重复的DNA-EP TPA-mTERT(AI)-LTBopt和Ad6TPA-mTERT(AI)-LTBopt(附图11)。这些小鼠中引发的免疫反应与在用相同的DNA/Ad方式免疫的、未用DMH处理的BALB/c小鼠中所检测的是可比较的。
在开始DMH处理之后30周对二十只小鼠安乐死来统计ACF(异常的隐窝病灶)和已经形成的腺瘤的数目。如同早期肿瘤发展所见的结果，与未接种的小鼠相比，接种的小鼠中观察到ACF和腺瘤的数量的显著降低(附图12)。
最后，与未接种的小鼠中发现的相比，在接种的小鼠中存在的腺瘤体积上更小(附图13A)。此外，组织学分析显示了，与未接种的动物中的肿瘤相比，在接种的小鼠中存在的肿瘤处在发展较低的阶段(附图13B)。
实施例12
pV1JTPA-hTERT(AI)-LTBopt的表征
由于hTERT的小鼠转基因是不可获得的，在非自身环境中评估了pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt的免疫原性潜力。使用具有人HLA-A2的转基因C57BL/6小鼠(HHD转基因小鼠)，从而TERT免疫原性肽将存在于人I型HLA的环境中。通过50μg质粒pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt的2次每两周一次的注射(2biweekly injections)、通过DNA-EP接种HHD转基因小鼠。对小鼠PBMC通过ICS评估了诱导的免疫反应。与hTERT865表位RLVDDFLLV(SEQ ID NO：23)相应的hTERT免疫原性肽用作抗原。如早先描述的，这个表位序列是在T细胞体外初敏实验中HLA-A2的强结合物和CTL活性的强诱导物(Dupont等Cancer Research 65(12)：5417-27(2005))。
从10只小鼠获得的结果显示了，平均起来，当用免疫原性hTERT865肽刺激时，12％的CD8+细胞产生IFN-γ(附图14)。结果表明，pV1JTPA-hTERT(AI)-LTBopt疫苗候选物是免疫原性的，并诱导了HLA-A2限制性CD8免疫反应。
实施例13
在Ad6-hTERT(AI)强化之后接种的小鼠中免疫反应的表征
如实施例2中的描述组装Ad6 hTERT(AI)构建体。这种构建体包含野生型密码子，只是添加了两个突变来消除端粒酶催化活性。还制备了Ad6 hTERT-LTB融合物构建体，但是不能被恢复，所以只能用Ad6hTERT(AI)进行进一步的测试。
在HHD转基因小鼠中测试了Ad6 hTERT(AI)构建体对DNA-EP诱导的免疫反应的强化能力。10只小鼠的组用50μg质粒pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt的一次注射通过DNA-EP免疫，并在第一次DNA注射后两周用第二次DNA注射或用Ad6 hTERT 1010pp来强化。利用早先鉴定的HLA-A2等位基因hTERT865的免疫显性肽测量了诱导的免疫反应。以高频率检出了产生IFN-γ的反应性CD8+T细胞。如附图14中所示，DNA-EP/Ad组合所引发的免疫反应的幅度是仅接受DNA-EP方式的小鼠中所观察到的3倍。
结果表明，通过注射pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt DNA激发的hTERT特异性免疫反应，通过用Ad6-hTERT(AI)强化被增强了。
实施例14
hTERT免疫诱导的CTL活性的表征
通过测试活化的T细胞对肿瘤靶细胞的细胞毒活性(CTL)，进一步表征了在接种的小鼠中引发的针对hTERT的CD8+T细胞反应。来自免疫的小鼠脾细胞在存在hTERT865肽(SEQ ID NO：23，参见实施例12)和IL-2的情况下在培养物中刺激6天。此后，在Cr51释放分析中测试了活化的CD8+T细胞针对靶细胞的溶胞活性。被稳定转染以表达HHD小鼠上存在的嵌合MHC I型分子的HeLa细胞(HeLa-HHD)被用作靶细胞。HeLa-HHD靶细胞用免疫原性肽hTERT865外源加载，或24小时之前用编码hTERT的Ad6载体感染，以外源过量表达TERT抗原。作为对照，用编码GFP的Ad6载体感染靶细胞。结果表明，通过所描述的疫苗接种诱导的CD8+T细胞能够杀死过量表达hTERT抗原的靶细胞(附图15)。
实施例15
恒河猴中人类TERT疫苗的免疫原性的表征
在恒河猴中评估使用hTERT、基于DNA初免、Ad强化的基因疫苗接种平台的免疫原性。由于人类TERT和恒河猴TERT序列的同源性是96％，预计耐受性在确定疫苗接种效力方面起到重要作用。
疫苗接种方案由每两周给予的五次DNA-EP注射(pV1J/TPA-hTERT-LTB，5mg/注射)组成。最后的DNA-EP治疗之后四周，用表达hTERT的Ad载体(Ad6-hTERT，1011vp)以两周的间隔强化猴子2次。每周采集体重和临床征象的数据。没有观察到对动物体重的消极影响或临床征象的出现。
利用类似于在实施例7中描述的hTERT肽库和覆盖LTB序列的肽库，通过PBMC的IFN-γELISPOT分析，监视了诱导的免疫反应。如果获得的信号是背景反应性(DMSO)的至少四倍，免疫反应被计为阳性。诱导的CMI的ELIspot分析表明，在四只接种的猴子中的四只中，在第一轮2次DNA-EP治疗之后存在着可检测的免疫反应(附图16A)。在第五次DNA-EP之后，观察到反应的轻微提高(附图16B)。还在完整的免疫方案的结束时，在两次Ad强化之后测量了免疫反应。结果表明，Ad强化诱导了CMI幅度的一致的增加(附图17)。因而，通过这个实验进一步确认了异源的初免/强化形式的能力。
序列表
<110>Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P.Angeletti S.p.A.
<120>端粒酶逆转录酶融合蛋白、编码它的核苷酸以及其用途
<130>ITR0119Y PCT
<150>60/851,183
<151>2006-10-12
<160>23
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>3783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TPA-hTERT(AI)-LTBopt
<400>1
Figure A200780037882D00401
Figure A200780037882D00411
Figure A200780037882D00421
<210>2
<211>1267
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>-hTERT(AI)-LTBopt
<400>2
Figure A200780037882D00422
Figure A200780037882D00431
Figure A200780037882D00441
Figure A200780037882D00451
<210>3
<211>3753
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TPA-mTERT(AI)-LTBopt
<400>3
Figure A200780037882D00461
<210>4
<211>1251
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TPA-mTERT(AI)-LTBopt
<400>4
Figure A200780037882D00481
Figure A200780037882D00511
<210>5
<211>3711
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hTERT(AI)-LTBopt
<400>5
Figure A200780037882D00512
Figure A200780037882D00521
Figure A200780037882D00531
<210>6
<211>1236
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hTERT(AI)-LTBopt
<400>6
Figure A200780037882D00532
Figure A200780037882D00541
Figure A200780037882D00551
<210>7
<211>3681
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mTERT(AI)-LTBopt
<400>7
<210>8
<211>1232
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mTERT(AI)-LTBopt
<400>8
Figure A200780037882D00582
Figure A200780037882D00591
Figure A200780037882D00601
Figure A200780037882D00611
<210>9
<211>3393
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hTERT(AI)
<400>9
Figure A200780037882D00631
<210>10
<211>1137
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>hTERT(AI)
<400>10
Figure A200780037882D00641
Figure A200780037882D00651
Figure A200780037882D00661
Figure A200780037882D00671
<210>11
<211>3399
<212>DNA
<213>智人
<400>11
Figure A200780037882D00681
<210>12
<211>1132
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Figure A200780037882D00691
Figure A200780037882D00701
Figure A200780037882D00711
Figure A200780037882D00721
<210>13
<211>309
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>13
Figure A200780037882D00722
<210>14
<211>109
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>14
Figure A200780037882D00723
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>15
Figure A200780037882D00731
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>16
Figure A200780037882D00732
<210>17
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>17
<210>18
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>18
Figure A200780037882D00734
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>19
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>20
<210>21
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>21
Figure A200780037882D00743
<210>22
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>22
Figure A200780037882D00751
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>肽
<400>23
Figure A200780037882D00752

Claims (34)

1.一种核酸分子，包含编码人类端粒酶逆转录酶(hTERT)融合蛋白的核苷酸的序列，其中所述hTERT融合蛋白包含融合到大肠杆菌热不稳定肠毒素的B亚基(LTB)蛋白的实质部分的hTERT蛋白或其变体，并且其中所述融合蛋白能在哺乳动物中产生免疫反应。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述核苷酸的序列编码变体hTERT蛋白，其中所述变体包含相对于SEQ ID NO：12中所列野生型hTERT氨基酸序列的一个或更多个突变，并且其中所述突变用作消除或降低所编码的hTERT蛋白的端粒酶催化活性。
3.权利要求2的核酸分子，其中所述突变由D712A和V713I组成。
4.权利要求3的核酸分子，其中所述编码hTERT的核苷酸的序列为在人类细胞中高水平表达而被密码子优化。
5.权利要求3的核酸分子，其中所编码的LTB蛋白被截短了它的信号序列。
6.权利要求5的核酸分子，其中所述编码LTB的核苷酸的序列为在人类细胞中高水平表达而被密码子优化。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述编码LTB的核苷酸的序列和所述编码hTERT的核苷酸的序列为在人类细胞中高水平表达而被密码子优化。
8.权利要求7的核酸分子，其中所述核苷酸的序列包含SEQ ID NO：5中所列的序列。
9.权利要求3的核酸分子，其中所述核苷酸的序列编码SEQ ID NO：6中所列的hTERT-LTB融合蛋白。
10.一种纯化的融合蛋白，包含与大肠杆菌热不稳定肠毒素的B亚基(LTB)蛋白融合的人类端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白或其变体。
11.权利要求10的纯化的融合蛋白，其中所述hTERT蛋白的C-末端被融合到LTB蛋白的N-末端。
12.权利要求11的纯化的融合蛋白，其中所述hTERT蛋白包含用作消除端粒酶催化活性的突变。
13.权利要求12的纯化的融合蛋白，其中所述蛋白包含SEQ ID NO：6中所列的氨基酸序列。
14.包含权利要求1的核酸分子的载体。
15.包含权利要求9的核酸分子的载体。
16.权利要求15的载体，其中所述载体是质粒载体或腺病毒载体。
17.权利要求16的载体，其中所述载体是质粒pV1J。
18.包含权利要求15的载体的宿主细胞。
19.权利要求7的核酸分子，其中所述核苷酸的序列进一步包含编码人类组织纤溶酶原激活物(TPA)信号序列的前导序列。
20.权利要求19的核酸分子，其中所述核苷酸的序列包含SEQ IDNO：1中所列的序列。
21.包含权利要求20的核酸分子的载体。
22.一种腺病毒疫苗载体，包含编码人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的核苷酸的序列；其中所述核苷酸的序列包含用作消除端粒酶催化活性的突变。
23.权利要求22的腺病毒疫苗载体，其中所述核苷酸的序列编码SEQID NO：10中所列的hTERT蛋白。
24.权利要求23的载体，其中所述载体是Ad5载体或Ad6载体。
25.一种在重组宿主细胞中表达hTERT-LTB融合蛋白的方法，包括：
(a)将包含权利要求1的核酸分子的载体导入适合的宿主细胞中；和，
(b)在容许所述hTERT-LTB融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞。
26.一种预防或治疗癌症的方法，包括给有需要的患者施用包含权利要求2的核酸分子的疫苗载体。
27.根据权利要求26的方法，其中所述载体是腺病毒载体或质粒载体。
28.根据权利要求27的方法，其中所述载体是包含腺病毒基因组的腺病毒载体，所述腺病毒基因组具有在腺病毒E1区域中的删除和在腺病毒E1区域中的插入物，其中所述插入物包含表达盒，所述表达盒包含：
(a)多核苷酸，其包含编码hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸的序列，其中所述hTERT-LTB融合蛋白包含hTERT蛋白变体；所述hTERT蛋白变体包含突变来消除端粒酶催化活性，其与大肠杆菌热不稳定肠毒素亚基B(LTB)的实质部分融合，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和，
(b)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
29.根据权利要求27的方法，其中所述载体是质粒疫苗载体，其包含质粒部分和可表达的盒，所述盒包含
(a)多核苷酸，其包含编码hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸的序列，其中所述hTERT-LTB融合蛋白包含hTERT蛋白变体；所述hTERT蛋白变体包含突变来消除端粒酶催化活性，其与大肠杆菌热不稳定肠毒素亚基B(LTB)的实质部分融合，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和，
(b)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
30.一种包含腺病毒基因组的腺病毒疫苗载体，所述腺病毒基因组具有在E1区域中的删除，和在E1区域中的插入物，其中所述插入物包含表达盒，所述表达盒包含：
(a)多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：10中所列人类端粒酶逆转录酶变体的核苷酸的序列；和
(b)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子。
31.根据权利要求30的腺病毒载体，其是Ad5或Ad6载体。
32.一种治疗患有或易患TERT-相关癌症的患者的方法，包括：
(a)向所述患者中一次或更多次导入第一载体，所述第一载体包含：
(i)多核苷酸，其包含编码hTERT-LTB融合蛋白的核苷酸的序列，其中所述hTERT-LTB融合蛋白包含hTERT蛋白变体；所述hTERT蛋白变体包含突变来消除端粒酶催化活性，其与大肠杆菌热不稳定肠毒素亚基B(LTB)的实质部分融合，并且其中所述融合蛋白能够在哺乳动物中产生免疫反应；和，
(ii)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子；
(b)容许经过预定的时间；和
(c)向所述患者中导入第二载体，所述第二载体包含：
(i)多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：10中所列人类端粒酶逆转录酶变体的核苷酸的序列；和
(ii)与所述多核苷酸可操纵地连接的启动子；
其中所述第一载体和所述第二载体不是相同的。
33.根据权利要求32的方法，其中所述第一载体是质粒，所述第二载体是腺病毒载体。
34.根据权利要求33的方法，其中在所述腺病毒载体被导入之前，所述质粒载体被导入所述患者中超过一次。
CN2007800378827A 2006-10-12 2007-10-09 端粒酶逆转录酶融合蛋白、编码它的核苷酸以及其用途 Expired - Fee Related CN101522706B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85118306P 2006-10-12 2006-10-12
US60/851,183 2006-10-12
PCT/EP2007/060713 WO2008043760A1 (en) 2006-10-12 2007-10-09 Telomerase reverse transcriptase fusion protein, nucleotides encoding it, and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101522706A true CN101522706A (zh) 2009-09-02
CN101522706B CN101522706B (zh) 2013-09-04

Family

ID=38858912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800378827A Expired - Fee Related CN101522706B (zh) 2006-10-12 2007-10-09 端粒酶逆转录酶融合蛋白、编码它的核苷酸以及其用途

Country Status (16)

Country Link
US (1) US8017387B2 (zh)
EP (1) EP2076531B1 (zh)
JP (1) JP2010505433A (zh)
KR (1) KR20090079938A (zh)
CN (1) CN101522706B (zh)
AT (1) ATE534661T1 (zh)
AU (1) AU2007306368B2 (zh)
BR (1) BRPI0719865A2 (zh)
CA (1) CA2664168A1 (zh)
ES (1) ES2376010T3 (zh)
IL (1) IL198012A0 (zh)
MX (1) MX2009003873A (zh)
NO (1) NO20091840L (zh)
NZ (1) NZ576134A (zh)
RU (1) RU2473691C2 (zh)
WO (1) WO2008043760A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102942618A (zh) * 2012-11-14 2013-02-27 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 具有肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用
CN104470947A (zh) * 2012-07-20 2015-03-25 凯尔杰姆维克斯有限公司 抗炎性肽及包含其的组合物
CN106061509A (zh) * 2013-10-28 2016-10-26 英韦克泰斯公司 编码端粒酶的dna疫苗
CN108883312A (zh) * 2016-02-05 2018-11-23 艾诺奥医药品有限公司 癌症疫苗和使用其的治疗方法
CN111065408A (zh) * 2017-07-11 2020-04-24 辉瑞公司 免疫原性组合物

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101710981B1 (ko) * 2006-07-28 2017-02-28 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 개선된 백신 및 이의 사용 방법
EP2324057B1 (en) * 2008-08-12 2018-03-21 MSD Italia S.r.l. Minigene comprising htpa signal peptide, t-cell epitopes, e. coli ltb and furin sensitive linkers
EP2639299A1 (en) 2012-03-16 2013-09-18 Invectys Universal cancer peptides derived from telomerase
KR20150130284A (ko) * 2013-03-15 2015-11-23 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암 백신 및 이를 이용한 치료 방법
WO2014154904A1 (en) 2013-03-28 2014-10-02 Invectys A cancer vaccine for cats
WO2014154905A1 (en) 2013-03-28 2014-10-02 Invectys A cancer vaccine for dogs
EP3020724A4 (en) * 2013-07-12 2017-01-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same
JP6601915B2 (ja) 2013-10-28 2019-11-06 アンヴェクティ 皮膚細胞への電気的遺伝子導入
ES2818921T3 (es) * 2013-11-22 2021-04-14 Gemvax & Kael Co Ltd Péptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis y composición que contiene el mismo
WO2016011144A1 (en) * 2014-07-17 2016-01-21 Blueprint Medicines Corporation Tert fusions
EP3364985A4 (en) * 2015-10-19 2019-03-27 University Of Maryland, Baltimore METHOD FOR GENERATING MANIPULATED DENDRITIC CELL LINES FROM HUMAN PRIMARY BLOOD
DK3405212T3 (da) * 2016-01-19 2020-08-24 Pfizer Cancervacciner
CA3038889A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Jian Yan Tert immunogenic compositions and methods of treatment using the same
EP3622078A1 (en) 2017-05-09 2020-03-18 Invectys Recombinant measles vaccine expressing htert
WO2022236301A1 (en) * 2021-05-05 2022-11-10 Inovio Pharmaceuticals Inc. Vaccines against coronavirus and methods of use

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340372C (en) 1984-07-09 1999-02-02 John D. Clements Production of e. coli lt-b enterotoxin subunit
CA2004738A1 (en) 1988-12-07 1990-06-07 University Of Leicester Heat-labile toxin b subunit fusion proteins
US6413523B1 (en) * 1989-06-02 2002-07-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Pharmaceutical composition of escherichia coli heat-labile enterotoxin adjuvant and methods of use
US5241053A (en) * 1990-09-05 1993-08-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Fused proteins comprising glycoprotein gD of HSV-1 and LTB
US7585622B1 (en) * 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
KR20000048820A (ko) 1996-10-01 2000-07-25 게론 코포레이션 텔로머라제 역전사 효소
US7390891B1 (en) * 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
WO1998037181A2 (en) 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
US6818222B1 (en) 1997-03-21 2004-11-16 Chiron Corporation Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants
US7622549B2 (en) * 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
WO1998059040A2 (de) 1997-06-20 1998-12-30 Bayer Aktiengesellschaft Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung
EP0919243A1 (en) * 1997-11-25 1999-06-02 Duphar International Research B.V Vaccine containing B subunits of heat-labile enterotoxin (LTB) of Escherichia coli as an adjuvant
US6733993B2 (en) 2000-09-15 2004-05-11 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications
CA2461380C (en) 2001-10-11 2011-03-22 Merck & Co., Inc. Hepatitis c virus vaccine
US20040106128A1 (en) * 2002-06-27 2004-06-03 Majumdar Anish Sen Cancer vaccines containing xenogeneic epitopes of telomerase reverse transcriptase
EP1716173B8 (en) * 2004-02-11 2012-06-27 Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.R.L. Carcinoembryonic antigen fusion protein and uses thereof
DE102004035227A1 (de) * 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
US20090304733A1 (en) 2004-07-28 2009-12-10 Jacob Pitcovski Vaccine comprising recombinant ct or lt toxin
AU2006248725A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine composition comprising B-subunit of E. coli heat toxin and an atigen and an adjuvant
CN1757736A (zh) * 2005-07-26 2006-04-12 浙江大学 一种融合基因载体的构建表达及应用

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104470947A (zh) * 2012-07-20 2015-03-25 凯尔杰姆维克斯有限公司 抗炎性肽及包含其的组合物
CN104470947B (zh) * 2012-07-20 2019-03-08 珍白斯凯尔有限公司 抗炎性肽及包含其的组合物
CN102942618A (zh) * 2012-11-14 2013-02-27 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 具有肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用
CN106061509A (zh) * 2013-10-28 2016-10-26 英韦克泰斯公司 编码端粒酶的dna疫苗
CN106061509B (zh) * 2013-10-28 2022-04-08 英韦克泰斯公司 编码端粒酶的dna疫苗
CN108883312A (zh) * 2016-02-05 2018-11-23 艾诺奥医药品有限公司 癌症疫苗和使用其的治疗方法
US11801288B2 (en) 2016-02-05 2023-10-31 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Cancer vaccines and methods of treatment using the same
CN108883312B (zh) * 2016-02-05 2024-04-09 因诺维奥制药公司 癌症疫苗和使用其的治疗方法
CN111065408A (zh) * 2017-07-11 2020-04-24 辉瑞公司 免疫原性组合物

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0719865A2 (pt) 2016-03-15
CN101522706B (zh) 2013-09-04
US8017387B2 (en) 2011-09-13
IL198012A0 (en) 2011-08-01
RU2473691C2 (ru) 2013-01-27
CA2664168A1 (en) 2008-04-17
NZ576134A (en) 2011-09-30
AU2007306368B2 (en) 2012-05-03
MX2009003873A (es) 2009-04-22
RU2009117325A (ru) 2010-11-20
JP2010505433A (ja) 2010-02-25
EP2076531B1 (en) 2011-11-23
KR20090079938A (ko) 2009-07-22
WO2008043760A1 (en) 2008-04-17
NO20091840L (no) 2009-07-10
US20080090778A1 (en) 2008-04-17
EP2076531A1 (en) 2009-07-08
AU2007306368A1 (en) 2008-04-17
ATE534661T1 (de) 2011-12-15
ES2376010T3 (es) 2012-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101522706A (zh) 端粒酶逆转录酶融合蛋白、编码它的核苷酸以及其用途
DK172013B1 (da) DNA, vektor indeholdende dette DNA, vært transformeret med vektoren,polypeptid indeholdt i DNA&#39;et og salt deraf, aggregat indeholdende polypeptidet samt pharmaceutisk sammensætning indeholdende polypeptidet eller aggregatet.
KR102022662B1 (ko) 식물 세포에서의 목적 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
WO2020218829A1 (ko) 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
US8188244B2 (en) Carcinoembryonic antigen fusions and uses thereof
Zhu et al. An insecticidal N-acetylglucosamine-specific lectin gene from Griffonia simplicifolia (Leguminosae)
WO2017034330A1 (en) Cell-permeable bone morphogenetic protein (cp-bmp) recombinant protein and use thereof
WO2017026779A1 (en) Improved cell-permeable cre (icp-cre) recombinant protein and use thereof
WO2017099474A1 (ko) ＧＭ－ＣＳＦ 유전자; FLT3L-TRAIL 융합 유전자; ＴＧＦ－β 발현을 억제하는 ｓｈＲＮＡ; 및 HSP 발현을 억제하는 ｓｈＲＮＡ를 포함하는 항종양 조성물
WO2011043584A2 (ko) 형질전환 식물 유래의 고병원성 조류독감 바이러스 단백질 백신 및 그 제조방법
CN1328288C (zh) 一个水稻dreb类转录因子及其编码基因与应用
KR20060003903A (ko) 사람 암배아 항원을 암호화하는 합성 유전자 및 이의 용도
AU2003294023B2 (en) Rhesus HER2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
WO2022035200A1 (ko) Il-12 및 항-cd20 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
CN101001869B (zh) 癌胚抗原融合物和其用途
KR101459532B1 (ko) 무름병 저항성을 가지는 형질전환 식물체 및 이의 제조방법
WO2015152609A1 (ko) ＧＭ－ＣＳＦ 유전자; 데코린 유전자; ＴＧＦ－β２ 발현을 억제하는 ｓｈＲＮＡ; 및 ＦｏｘＰ３ 발현을 억제하는 ｓｈＲＮＡ를 포함하는 항종양 조성물
WO2019022463A2 (ko) 면역원성시스템 및 이를 포함한 동물 백신
WO2023048518A1 (ko) Pd-1 및 il-15를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이의 용도
WO2021101351A2 (ko) 비푸코실화된 담배를 이용하여 생산한 항체 및 이의 용도
WO2019190291A1 (ko) 뇌 표적 지속형 치료학적 효소 결합체
CN1273485C (zh) 新型人树突状细胞来源的免疫球蛋白样受体，其编码序列及用途
CN1304568C (zh) 新型人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物,其编码序列及用途
CN1718729A (zh) 新型人免疫细胞抑制性受体klrl1的功能及用途
WO2013020958A1 (en) Use of macrocypins as pesticidal agents

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130904

Termination date: 20141009

EXPY Termination of patent right or utility model