CN101578297A - 治疗肿瘤疾病的抗体组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在哺乳动物对象中治疗肿瘤疾病的抗体组合物和方法。还提供了在哺乳动物对象中诊断癌症的方法。

Description

治疗肿瘤疾病的抗体组合物和方法
与相关申请的交叉参考
本申请要求2006年4月7日提交的美国临时申请No.60/790,512的优先权，该临时专利申请的内容以其全文引为参考。
发明领域
本发明总的来说涉及在哺乳动物对象中治疗肿瘤疾病的抗体组合物和方法。分离的人类单克隆抗体结合胰岛素样生长因子I或结合胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II二者。本发明还涉及在哺乳动物对象中诊断癌症的方法。
发明背景
癌症治疗是建立在分裂和增殖速度加快的细胞倾向于发展成癌症的理论基础上的。最近，许多流行病学研究已经一致地显示，在高循环水平的强效的有丝分裂原，胰岛素样生长因子(IGF)-I，与几种常见癌症的风险增加有关，这些癌症包括乳腺、前列腺、肺和结肠直肠的癌症。在大多数情况下抑制IGF-I的促有丝分裂作用的血清中的主要IGF-I结合蛋白--IGF结合蛋白(IGFBP)-3的水平，与这些癌症的风险成反相关。
从功能上说，IGF-I不仅刺激细胞的增殖，而且抑制凋亡。这些促有丝分裂和抗凋亡效应的组合可能对肿瘤的生长有影响。除了对与癌症相关的细胞活动的直接影响之外，IGF家族的成员还与参与癌症发生和发展的多种不同的分子相互作用，这些分子包括性类固醇激素、肿瘤抑制基因的产物以及其它生长因子。此外，参与调节人类生长和发育的肽类激素IGF-I的表达和生产，受营养和身体活动的影响。为了解IGF家族成员的分子结构和生理功能而进行的实验，对促有丝分裂生长因子在致癌中的作用提供了了解。Yu和Rohan，J.Natl.Cancer Inst.92：1472-1489，2000。
IGF刺激培养的人类乳腺癌细胞的增殖。这种刺激是通过受体胰岛素样生长因子受体1(IGFR-1)介导的，该受体是受体酪氨酸激酶家族的成员。当被其配体(IGF-I或IGF-II)激活时，IGFR1将两个主要底物IRS-I和Shc上的酪氨酸残基磷酸化，随后通过Ras/Raf和磷脂酰肌醇3’-激酶/AKT途径进行信号发送。IGFR1在转化中发挥了关键的作用。来自敲除了IGFR1的小鼠的细胞对抗多种不同的病毒和细胞癌基因、包括SV40大T抗原和活化的ras的转化，但是来自野生型小鼠的成纤维细胞容易被这些癌基因转化。
有越来越多的流行病学证据将血浆IGF-I水平升高与前列腺、乳腺和结肠癌风险关联起来。来自患者的乳腺癌组织显示出比邻近的正常组织更高的IGFR1表达，表明在IGFR1和乳腺上皮细胞转化之间有关联。据报道，当使用受体的反义方略、中和抗体(抗IR3或抗IGF-I)或显性失活平截抑制IGFR1时，肿瘤细胞的转化能力减弱了。Hailey，J.等，Molecular Cancer Therapeutics 1：1349-1353，2002；Maloney E.K.等，Cancer Res.63：5073-5083，2003；Burtrum D.等，Cancer Res.，63：8912-8921，2003；Lu等，J.Biol.Chem.279：2856-2865，2004；Miyamoto等，Clin.Cancer Res.11：3494-3502，2005；Goya等，Cancer Research 64：6252-6258，2004。在本技术领域中，存在着对治疗肿瘤疾病和转移癌的改进的多靶点疗法的需求。
发明概述
总的来说，本发明涉及在哺乳动物对象中治疗肿瘤疾病的抗体组合物和方法。本发明还涉及在哺乳动物对象中诊断肿瘤疾病的方法。抗体组合物是结合胰岛素样生长因子I的分离的单克隆抗体。另一组抗体组合物是结合胰岛素样生长因子I并与胰岛素样生长因子II交叉反应并结合的单克隆抗体。分离的单克隆抗体是例如人类、非人类灵长动物、兔、大鼠或小鼠的抗体。与胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体组合物是例如m705和m706。与胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II都能结合的分离的人类单克隆抗体组合物是m708和m708.2。单克隆抗体m705、m706、m708和m708.2不结合人类胰岛素。m705具有包含SEQ ID NO：1的VH链氨基酸序列和包含SEQ IDNO：2的VL链氨基酸序列。m706具有包含SEQ ID NO：3的VH链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：4的VL链氨基酸序列。m708具有包含SEQID NO：5的VH链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：6的VL链氨基酸序列。m708.2具有包含SEQ ID NO：7的VH链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：8的VL链氨基酸序列。
提供了与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的单克隆抗体，在其重链可变区中含有SEQ ID NO：7中显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7具有至少90％同源性的氨基酸序列。
提供了与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的单克隆抗体，在其轻链可变区中含有SEQ ID NO：8中显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8具有至少90％同源性的氨基酸序列。
提供了与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的单克隆抗体，在其重链可变区或轻链可变区中分别含有SEQ ID NO：7和8中显示的氨基酸序列或分别与它们具有至少90％同源性的氨基酸序列。提供了含有一种或多种本发明的抗体和可药用载体的药物组合物。
在另一方面，抗体提供了至少一个CDR序列，包括但不限于，VL：QSISS(SEQ ID NO：9)，VL：AAS(SEQ ID NO：10)，VL：QQSYSTPSTF(SEQ ID NO：11)，VH：GGTFSSYA(SEQ ID NO：12)，VH：GIIPILGIA(SEQ ID NO：13)，或VH：ARGPRGYSYNFDY(SEQ ID NO：14)。在另一方面，抗体包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD或IgE抗体。抗体可以是IgG1κ或IgG1λ同种型。抗体是IgG4κ或IgG4λ同种型。抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD或IgE抗体。抗体可以是IgG1κ或IgG1λ同种型。抗体可以是IgG4κ或IgG4λ同种型。在具体方面，抗体是人类、非人类灵长动物、兔、啮齿动物、大鼠或小鼠的抗体或其组合。
在另一方面，本发明的分离的单克隆抗体具有下列一种或多种特征：(i)在抗体浓度为大约4nM以上时，在体外MCF-7乳腺癌细胞分析中抑制IGF-I受体的磷酸化；(ii)抑制与IGF-I受体的IGF-I结合或IGF-II结合；或(iii)在细胞迁移分析中抑制细胞的迁移。
在另一方面，使用重组人类胰岛素样生长因子I或人类胰岛素样生长因子II作为分析物和抗体作为配体，通过表面等离子体共振(SPR)进行测定时，本发明的分离的单克隆抗体的解离平衡常数(KD)为大约10-8M以下。
在另一方面，提供了能够以大约108M-1以上的结合亲和力与人类胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II结合的分离的单克隆抗体。在另一方面，提供了能够以大约109M-1以上的结合亲和力与人类胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II结合的分离的单克隆抗体。在具体的方面，分离的单克隆抗体是完整的抗体，完整的IgG1抗体，完整的IgG2抗体，完整的IgG3抗体，完整的IgG4抗体，完整的IgM抗体，完整的IgA1抗体，完整的IgA2抗体，完整的分泌性IgA抗体，完整的IgD抗体或完整的IgE抗体，其中该抗体在真核细胞中被糖基化。在另一方面，分离的单克隆抗体是抗体片段或单链抗体。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是F(ab′)2、Fab，Fv或Fd片段。抗体可以是抗原特异性的。
在另一方面，本发明的分离的单克隆抗体是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)SEQ ID NO：7中显示的可变重链氨基酸序列或与SEQ ID NO：7具有至少90％同源性的可变重链序列，通过接头肽与SEQ ID NO：8中显示的可变的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO：8具有至少90％同源性的可变的轻链序列融合，所述可变重链氨基酸序列与免疫球蛋白铰链区多肽融合(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。抗体可以以平衡结合常数(Ka)与预定的抗原结合，例如至少108M-1、至少109M-1或至少1010M-1。
提供了与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的人类单克隆抗体。在一个方面，抗体含有至少一个下列的CDR序列：VL：QSISS(SEQ ID NO：9)，VL：AAS(SEQ ID NO：10)，VL：QQSYSTPSTF(SEQ ID NO：11)，VH：GGTFSSYA(SEQ ID NO：12)，VH：GIIPILGIA(SEQ ID NO：13)，或VH：ARGPRGYSYNFDY(SEQ ID NO：14)。
提供了与人类胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类重链可变区中含有SEQ ID NO：1中显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的氨基酸序列。提供了与人类胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类轻链可变区中含有SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性的氨基酸序列。提供了与人类胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类重链可变区中含有SEQ ID NO：3中显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3具有至少90％同源性的氨基酸序列。提供了与人类胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类轻链可变区中含有SEQ ID NO：4中显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少90％同源性的氨基酸序列。提供了与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类重链可变区中含有SEQ ID NO：5中显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：5具有至少90％同源性的氨基酸序列。提供了与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类轻链可变区中含有SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：6具有至少90％同源性的氨基酸序列。提供了含有一种或多种本发明的抗体和可药用载体的药物组合物。
提供了编码本发明的蛋白/抗体的重链免疫球蛋白可变结构域序列或轻链免疫球蛋白可变结构域序列的分离的核酸。提供了含有核酸和可药用载体的药物组合物。提供了含有本发明的抗体的免疫球蛋白可变结构域序列的一种或多种编码核酸的重组细胞。提供了宿主细胞，其包含编码含有抗体的HC可变结构域的多肽的第一种核酸序列和编码含有抗体的LC可变结构域的多肽的第二种核酸序列，其中所述抗体是本发明的蛋白。提供了能够与胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II结合的抗体的制备方法，该方法包括在提供核酸表达的条件下在宿主细胞中表达本发明的核酸，然后回收抗体。
提供了分离的重组抗IGF-I和抗IGF-II抗体或其抗原结合片段，该抗体含有人类恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)竞争性抑制m708.2抗体(ATCC登录号No.____)与人类IGF-I和人类IGF-II的结合，以及(ii)在体内以至少1×108升/摩尔的亲和力或至少1×109升/摩尔的亲和力与人类IGF-I和人类IGF-II的中和性表位结合，亲和力是作为结合常数(Ka)通过表面等离子体共振测定的。抗体或抗原结合片段可以包含人类恒定区和人类可变区。抗体或抗原结合片段可以包含至少一条人类轻链和至少一条人类重链。在另一方面，轻链含有m708.2(ATCC登录号No.____)的轻链的所有抗原结合区。重链可以含有m708.2(ATCC登录号No.____)的重链的所有抗原结合区。轻链可以含有m708.2(ATCC登录号No.____)的轻链的所有抗原结合区，和其中重链含有m708.2(ATCC登录号No.____)的重链的所有抗原结合区。
提供了分离的重组抗IGF-I和抗IGF-II抗体或其抗原结合片段，该抗体含有人类恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)含有m708.2抗体(ATCC登录号No.____)的抗原结合区，并且(ii)在体内以至少1×108升/摩尔的亲和力或至少1×109升/摩尔的亲和力与人类IGF-I和人类IGF-II的中和性表位结合，亲和力是作为结合常数(Ka)通过表面等离子体共振测定的。提供了分离的重组抗IGF-I和抗IGF-II抗体或其抗原结合片段，该抗体含有人类IgG1恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)竞争性抑制m708.2抗体(ATCC登录号No.____)与人类IGF-I和人类IGF-II的结合，并且(ii)在体内以至少1×108升/摩尔的亲和力或至少1×109升/摩尔的亲和力与人类IGF-I和人类IGF-II的中和性表位结合，亲和力是作为结合常数(Ka)通过表面等离子体共振测定的。提供了分离的重组抗IGF-I和抗IGF-II抗体或其抗原结合片段，该抗体含有人类IgG1恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)含有m708.2抗体(ATCC登录号No.____)的抗原结合区，并且(ii)在体内以至少1×108升/摩尔的亲和力或至少1×109升/摩尔的亲和力与人类IGF-I和人类IGF-II的中和性表位结合，亲和力是作为结合常数(Ka)通过表面等离子体共振测定的。
提供了在样品中检测人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的方法，包括：(a)提供样品；(b)在允许多肽配体与人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II结合的条件下，将(a)的样品与特异性结合含有人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的多肽的人类单克隆抗体m708或m708.2进行接触；以及(c)检测抗体m708或m708.2与样品中人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的结合，其中检测到结合表明在样品中存在人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II；从而检测出样品中的人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II。
提供了在样品中检测人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的方法，包括：(a)提供样品；(b)在允许多肽配体与人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II结合的条件下，将(a)的样品与特异性结合含有人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的多肽的人类单克隆抗体m708或m708.2进行接触；以及(c)检测抗体m708或m708.2与样品中人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的结合，其中检测到结合表明在样品中存在人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II；从而检测出样品中的人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II。
提供了在样品中检测人类胰岛素生长因子I的方法，包括：(a)提供样品；(b)在允许多肽配体与人类胰岛素生长因子I结合的条件下，将(a)的样品与特异性结合含有人类胰岛素生长因子I的多肽的人类单克隆抗体m705或m706进行接触；以及(c)检测抗体m705或m706与样品中人类胰岛素生长因子I的结合，其中检测到结合表明在样品中存在人类胰岛素生长因子I；从而检测出样品中的人类胰岛素生长因子I。
提供了能够结合胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的抗体的制备方法，该方法包括在提供核酸表达的条件下，在宿主细胞中表达本发明的核酸，然后回收抗体。
提供了鉴定特异性针对人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的多肽配体的方法，包括：(a)提供包含表达候选的人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子I结合多肽的噬菌体的噬菌体文库；(b)将噬菌体文库与人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II蛋白进行接触，以及(c)检测人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II蛋白与噬菌体的结合；从而鉴定了特异性针对人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的多肽配体。
提供了在哺乳动物对象中治疗肿瘤疾病的方法，包括给哺乳动物对象施用含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的抗体的药物组合物，该抗体以有效减轻或消除哺乳动物对象中的肿瘤疾病的量与胰岛素样生长因子I特异性结合。在一个方面，抗体与胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II特异性结合。在另一个方面，抗体含有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。抗体可以与细胞毒性剂连接。细胞毒性剂可以是细胞毒性药物或放射性同位素。在具体的方面，肿瘤疾病是实体肿瘤、血液恶性肿瘤、白血病、结肠直肠癌、良性或恶性乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合症、子宫内膜息肉、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫腺肌病、腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或星形母细胞瘤。在其他的具体方面，肿瘤疾病是哺乳动物对象中肿瘤细胞的转移。肿瘤疾病可以是哺乳动物对象中的乳腺癌转移。
提供了在怀疑患有肿瘤疾病或怀疑处于肿瘤疾病的风险下的哺乳动物对象中诊断癌症的方法，包括从对象的血液或组织获得测试样品，测试样品含有细胞群体，提供含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的抗体检测在细胞群体内的细胞上是否存在IGF-I标志，对通过IGF-I标志检测到的细胞群体进行分析以鉴定细胞和表征细胞，在细胞中或细胞上存在IGF-I标志指示了在哺乳动物对象中的肿瘤疾病或肿瘤疾病的风险。
诊断癌症的方法还包括提供包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的抗体，以检测在细胞群体内的细胞上或细胞中是否存在IGF-II标志和IGF-I标志，并对通过IGF-I标志和IGF-II标志检测到的细胞群体进行分析以鉴定和表征细胞，在细胞中或细胞上存在IGF-I标志和IGF-II标志指示了在哺乳动物对象中的肿瘤疾病或肿瘤疾病的风险。
在该诊断方法中，在样本中的细胞上或细胞中存在IGF-I标志或IGF-II标志指示了哺乳动物对象中存在转移性癌症。在该诊断方法中，在样本中的细胞上或细胞中存在IGF-I标志或IGF-II标志指示了哺乳动物对象中存在早期癌症。在该诊断方法中，在样本中的细胞上或细胞中不存在IGF-I标志和IGF-II标志指示了哺乳动物对象中存在无疾病状态或不能检测到的疾病状态。在该诊断方法的另一个方面，在样本中的细胞上或细胞中IGF-I标志或IGF-II标志的存在或不存在，在癌症治疗或癌症恢复过程中对治疗处理进行了监测。在另一方面，该方法包含与抗体结合的成像部分。成像部分可以通过磁共振波谱、X-射线波谱或正电子发射断层成像(PET)。结合可以是共价键或非共价键。肿瘤疾病包括但不限于实体肿瘤、血液恶性肿瘤、白血病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合症、子宫内膜息肉、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫腺肌病、腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或星形母细胞瘤。
在哺乳动物对象中治疗癌症的药物候选化合物的筛选方法，包括给怀疑患有癌症的对象施用治疗有效量的药物候选化合物，在用药物候选化合物治疗之前和之后从对象的血液或组织获得测试样品，测试样品含有怀疑含有肿瘤细胞的细胞群体，提供含有SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的抗体检测在测试样品中的细胞上是否存在IGF-I标志，对通过IGF-I标志检测到的细胞群体进行分析，以鉴定药物候选化合物治疗之前测试样品中的肿瘤细胞，与药物候选化合物治疗之后相比较，其中在治疗后样本中存在的肿瘤细胞数量与治疗前样本中肿瘤细胞数量相比降低，表明了药物候选化合物在治疗哺乳动物对象的癌症中的有效性。
在另一方面，在哺乳动物对象中治疗癌症的药物候选化合物的筛选方法包括提供含有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的抗体，以检测在测试样品中的细胞上是否存在IGF-II标志和IGF-I标志，并对通过IGF-I标志和IGF-II标志检测到的细胞群体进行分析，以鉴定药物候选化合物治疗之前测试样品中的肿瘤细胞，与药物候选化合物治疗之后相比较，其中在治疗后样本中存在的肿瘤细胞数量与治疗前样本中肿瘤细胞数量相比降低，表明了药物候选化合物在治疗哺乳动物对象的癌症中的有效性。癌症可以是转移性癌症或早期癌症。
附图简述
图1显示了针对IGF-I筛选的人类单克隆抗体，其结合IGF-I或IGF-I和IGF-II。
图2显示了IgG 708.2与IGF-I和IGF-II结合的ELISA结合分析。
图3显示了IgG 708.2抑制了MCF-7细胞中IGF-IR的磷酸化。
图4显示了针对IGF-I筛选的人类单克隆抗体抑制IGF-I与可溶性IGF-IR的结合。
图5显示了抗IGF-II人类IgG1 m708.2剂量依赖性抑制MCF7细胞中IGF-II和IGF-I诱导的IGF-IR磷酸化。
图6显示了IgG1 708.2抑制细胞的运动性。
图7显示了通过ELISA分析检测的单克隆抗体m705、m706和m708与IGF-I和IGF-II的结合特异性。
图8显示了单克隆抗体m705、m706和m708在IGF-I和IGF-I受体之间结合的结合竞争性。
图9显示了单克隆抗体m708.2IgG与IGF-II的结合。
具体说明
总的来说，本发明涉及在哺乳动物对象中治疗肿瘤疾病的抗体组合物和方法。本发明还涉及在哺乳动物对象中诊断肿瘤疾病的方法。抗体组合物是结合胰岛素样生长因子I的分离的单克隆抗体。另一组抗体组合物是结合胰岛素样生长因子I并与胰岛素样生长因子II交叉反应并结合的单克隆抗体。分离的单克隆抗体是例如人类、非人类灵长动物、兔、大鼠或小鼠的抗体。与胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体组合物是例如m705和m706。与胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II都结合的分离的人类单克隆抗体组合物是m708和m708.2。单克隆抗体m705、m706、m708和m708.2不结合人类胰岛素。
胰岛素样生长因子(IGF)是有丝分裂原，在调控细胞增殖、分化和凋亡中发挥作用。IGF的效应通过胰岛素样生长因子受体IGF-IR介导。胰岛素样生长因子I(IGF-I)和胰岛素样生长因子II(IGF-II)通过与I型胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)结合介导了效应。IGF-IR被许多肿瘤过量表达，并介导增殖、运动性以及对免于凋亡的保护。它的由肿瘤过量表达的主要配体是IGF-I。对IGF-IR介导的信号发送的抑制可以在细胞外和细胞内靶上进行。在细胞外IGF与IGF-IR结合，激活的酪氨酸激酶导致了包括PI3激酶/Akt和MAPK途径在内的信号途径所介导的增殖和细胞存活增强。对IGF-IR的抑制可以在细胞外和细胞内的多种水平上进行。LeRoith D，Helman L，Cancer Cell 5：201-202，2004。
阻止IGF-I与其受体的结合可以导致抑制细胞增殖所需的信号转导。通过筛选人类天然噬菌体抗体文库，鉴定到了两种抗体m705和m706，它们特异性针对IGF-I，并且不与IGF-II和胰岛素发生交叉反应。两种抗体m708和m708.2与IGF-I和IGF-II交叉反应。M708显示出与IGF-I的结合亲和力最高，并被转变成IgG1。所有的抗体都显示出与受体(IGF-IR)竞争与IGF-I和IGF-II的结合。IgG1m708在MCF-7乳腺癌细胞系中有力地抑制了IGF-IR介导的信号转导，IC50等于1nM。抑制的机理是通过与IGF-IR竞争与IGF-II的结合产生的。这与它与IGF-I的高nM范围的亲和力相一致。这些抗体可用于癌症的治疗和与癌症治疗有关的诊断分析。
应该理解，本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，这些当然是可以改变的。还应该理解，在本文中使用的术语仅仅是出于描述具体的实施方案的目的，而不是为了限制。用在本说明书和所附的权利要求中，除非内容明确地另有指明，单数形式的“a”、“an”和“the”包括了复数的指代物。因此，例如，称为“a cell”包括两个或多个细胞的组合，等等。
本文使用的术语“大约”在指称可测量的值例如量、时间长度等时，是指包含了与特定的值有±20％或±10％的差异，更优选为±5％、更加优选±1％、尤为优选±0.1％，因为这样的差异对于执行本发明的方法是合适的。
除非另有定义，在本文中使用的技术和科学术语具有的意义与本发明所属的技术领域中普通专业人员所通常理解的相同。尽管与本文描述的方法和材料类似或等价的任何方法和材料也可以用于实施本发明的检测，但是优选的材料和方法是本文所述的。在本发明的描述和权利要求中，使用了下面的术语。
“患者”、“对象”或“哺乳动物”可以互换使用，是指哺乳动物例如人类患者和非人类灵长动物，以及实验动物例如兔、大鼠和小鼠，以及其它的动物。动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。
“治疗”或包括施用本发明的抗体组合物、化合物或药剂阻止或延迟疾病的症状、并发症、或生化指标的发作、缓解症状或者遏制或抑制疾病、病状或病障(例如癌症、转移癌、或转移的乳腺癌)的进一步发展。治疗可以是预防性的(例如阻止或延迟疾病的发作，或阻止其临床或亚临床症状的显现)，或是疾病显现之后对症状的治疗性抑制或缓解。
“癌症”或“恶性肿瘤”被用作同义术语，是指多种疾病中的任何一种，这些疾病的特征为细胞不受控制的异常增殖、受影响的细胞局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位(即转移)的能力以及多种特征性的结构和/或分子特点的任何。“癌性的”或“恶性细胞”被理解为具有特定的结构性质、缺少分化并能够侵染和转移的细胞。癌症的例子是乳腺、肺、脑、骨、肝、肾、结肠和前列腺癌(参见DeVita等主编的《癌症原理和肿瘤学实践》(Cancer Principlesand Practice of Oncology)第六版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，2001；该文献在此出于所有目的以其全文引为参考)。
“癌症相关的”是指核酸及其表达或其缺失、或蛋白及其水平或活性或其缺失与对象细胞中恶性肿瘤发生的关系。例如癌症可以与特定基因的表达相关，该基因在正常的健康细胞中不表达，或以较低的水平表达。反过来，癌症相关的基因可以是在恶性细胞(或经历转化的细胞)中不表达，或在恶性细胞中比在正常的健康细胞中的表达水平低的基因。
在癌症的内容时，术语“转化”是指正常细胞在变为恶性时所经历的变化。在真核生物中，术语“转化”可以用于描述在细胞培养中正常细胞向恶性细胞的转变。
“增殖细胞”是正在活跃地经历细胞分裂和指数生长的细胞。“失去细胞增殖控制”是指细胞已经失去了在正常情况下确保适当限制细胞分裂的细胞周期控制的性质。失去了这样的控制的细胞增殖速度比正常快，不需要刺激信号，并且对抑制信号没有响应。
“晚期癌症”意味着癌症不再局限于初发的肿瘤位点，或者是根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)为III期或IV期的癌症。
“良好耐受”是指健康状况中没有作为治疗的结果而产生并将影响治疗决定的不利变化。
“转移性的”是指肿瘤细胞，例如人类乳腺癌细胞，在注射到免疫缺陷小鼠的乳房脂肪垫和/或循环中后，能够在免疫缺陷小鼠的肺、肝、骨或脑中建立起继发肿瘤病变。
“非转移性的”是指是指肿瘤细胞，例如人类乳腺癌细胞，在注射到乳房脂肪垫和/或循环中后，不能在免疫缺陷小鼠的肺、肝、骨或脑或其它乳腺癌转移的靶器官中建立起继发肿瘤病变。在本文中使用并在本文中阐述为非转移性的人类肿瘤细胞，在注射到免疫缺陷小鼠的乳房脂肪垫中之后，能够建立起原发肿瘤，但是它们不能从那些原发肿瘤播散。
本文中使用的“淋巴细胞”具有本技术领域中的通常意义，是指在血液、淋巴和淋巴样组织中发现的任何单核细胞、非吞噬性白细胞，例如B和T淋巴细胞。
本文中使用的“多肽片段”是指氨基和/或羧基末端缺失的多肽，但是剩余的氨基酸序列与例如从全长的cDNA序列推导的天然存在的序列中的对应位置一致。片段典型为至少5、6、8或10个氨基酸长，优选至少14个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，更优选至少70个氨基酸长。本文中使用的术语“类似物”是指含有与推导的氨基酸序列的一部分基本上一致的至少25个氨基酸片段的多肽，并且它具有至少一种下面的性质：(1)在适当的结合条件下与IGF-I或IGF-II特异性结合，(2)阻断IGF-I或IGF-II与IGF-I受体结合的能力，或(3)在体外或体内抑制表达IGF-I或表达IGF-II的细胞生长的能力。典型情况下，多肽类似物相对于天然存在的序列来说含有保守的氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物典型为至少20个氨基酸长，优选为至少50个氨基酸长或更长，并且通常可以与全长的天然存在的多肽一样长。
肽类似物通常在制药工业中用作具有与模板肽性质相似的非肽药物。这些类型的非肽类化合物被称为“肽模拟物(peptide mimetics)”或“肽拟似物(peptidomimetics)”。Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29，1986；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；以及Evans等，J.Med.Chem.30：1229，1987，在此引为参考。这些化合物通常是在计算机分子模拟的帮助下开发的。与治疗有用的肽结构类似的肽模拟物可以用于产生同等的治疗或预防效果。一般来说，肽模拟物与范本多肽(即具有生化性质或药理活性的多肽)例如人类抗体的结构相似，但是有一个或多个肽键任选通过本技术领域中熟知的方法用选自下面的键代替：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。用同样类型的D-氨基酸有系统取代保守序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)，可以用于产生更稳定的肽。此外，可以通过本技术领域中已知的方法(Rizo和GieraschAnn.Rev.Biochem.61：387，1992，在此引为参考)产生含有保守序列或基本上一致的保守序列变异体的受约束肽；例如，通过加入能够形成分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基使肽环化。
在用于多肽时，术语“基本上一致”意味着两个肽序列，当例如使用缺省的间隙权重通过程序GAP或BESTFIT进行最适比对时，共有至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性，最优选至少99％的序列同一性。优选不一致的残基位置的差别是保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，一类具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，一类具有脂肪羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸，一类具有含有酰胺的侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺，一类具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，一类具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸，一类具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
正如在本文中讨论的那样，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的少量变化被认为包涵在本发明中，只要氨基酸序列的变化维持了至少75％、更优选至少80％、90％、95％、和最优选99％的同源性就行。具体来说，考虑到了保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代不对抗总体同源性，总体同源性可以维持在至少75％、更优选至少80％、90％、95％、最优选99％的同源性。保守取代是侧链相关的氨基酸家族内发生的取代。遗传编码的氨基酸一般被分成下列家族：(1)酸性＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；以及(4)不带电荷的极性＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。更优选的家族是：丝氨酸和苏氨酸是脂肪族羟基氨基酸；天冬酰胺和谷氨酰胺是含有酰胺的家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂肪族家族；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳香族家族。例如，期望用异亮氨酸或缬氨酸孤立取代亮氨酸、用谷氨酸孤立取代天冬氨酸、用丝氨酸孤立取代苏氨酸、或将氨基酸用结构相关的氨基酸类似取代不会对得到的分子的结合或性质有显著的影响，这是合理的，特别是如果取代不涉及框架位点内的氨基酸的话。氨基酸的改变是否会产生有功能的肽，这可以通过分析多肽衍生物的比活来容易地确定。分析方法在本文中详细描述。本技术领域的普通专业人员可以容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选的氨基-和羧基-末端出现在靠近功能性结构域的边界。结构和功能结构域可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共的或专有的序列数据库进行比较来鉴定。优选使用计算机化的比较方法来鉴定在其它具有已知结构和/或功能的蛋白中存在的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等，Science 253：164，1991。因此，上述的例子证实本技术领域的专业人员可以认识到可用于确定本发明的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
优选的氨基酸取代是这样的取代：(1)降低了对蛋白水解的易感性，(2)降低了对氧化的易感性，(3)改变了形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变了结合亲和力，以及(4)赋予或修饰了这样的类似物的其它物理化学或功能性质。类似物可以包含天然存在的肽序列之外的各种不同的突变蛋白序列。例如，可以在天然存在的序列中(优选在多肽形成分子间接触的结构域之外的部分中)进行单个或多个氨基酸取代(优选为保守氨基酸取代)。保守的氨基酸取代将基本上不改变亲本序列的结构特征(例如取代的氨基酸不应该倾向于破坏亲本序列中存在的螺旋、或破坏表征亲本序列特征性的其它类型的二级结构)。本技术领域公认的多肽的二级和三级结构的例子描述在《蛋白，结构和分子原理》(Proteins，Structures and Molecular Principles)(Creighton主编，W.H.Freeman and Company，New York(1984))，《蛋白结构简介》(Introduction to Protein Structure)(C.Branden和J.Tooze主编，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))和Thornton等，Nature 354：105，1991中，每个在此引为参考。
“抗体”或“抗体肽”是指完整的抗体或其与完整的抗体竞争特异性结合的结合片段。结合片段通过重组DNA技术产生，或通过完整抗体的酶法或化学水解来产生。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和单链抗体。完整的“抗体”含有至少两条重(H)链和两条轻(L)链，通过二硫键相连。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区含有一个结构域CL。VH和VL区还可以细分成超变区、称为互补性决定区(CDR)，间有更加保守的区域，被称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按下面的次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种不同细胞(例如效应细胞)和经典的补体系统的第一种成分(C1q)。术语抗体包含了完整的抗体的保留了与IGF-I或IGF-II结合的能力的抗原结合部分。结合的例子包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，含有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域构成；(iv)Fv片段，由抗体的单个臂的VL和VH结构域构成；(v)dAb片段(Ward等，Nature 341：544-546，1989)，它由VH结构域构成；以及(vi)分离的互补性决定区(CDR)。
“双特异性”或“双功能”抗体之外的抗体被理解为它的每个结合位点都是相同的。当过量的抗体使与反受体结合的受体量减少了至少大约20％、40％、60％或80％、更通常大于大约85％时(在体外竞争性结合分析中测定)，则抗体显著抑制了受体与反受体的结合。
“Fab抗体”或“Fab片段”是指缺少了全部或一部分免疫球蛋白恒定区、并含有抗体的Fab区的抗体片段。Fab抗体按照本文的描述制备。
“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分离的基因编码，但可以使用重组方法通过合成的接头将它们连接起来，使它们能够被制成单一的蛋白链，其中VL和VH区配对形成了单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，Science 242：423-426，1988；和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883，1988)。在使用术语“抗体”片段时包含了的这种单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶法或化学水解来制备。
“人类序列抗体”包括具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)的抗体。本发明的人类序列抗体可以包含不是人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点专一的诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。这样的抗体可以在非人类的转基因动物中产生，例如描述在PCT公布No.WO01/14424和WO 00/37504中。但是，本文中使用的术语“人类序列抗体”不打算包含其中来自另一种哺乳动物种类例如小鼠的种系的CDR序列嫁接到人类框架序列上的抗体(例如人源化抗体)。
此外，可以生产重组的免疫球蛋白。参见Cabilly的美国专利No.4,816,567，在此出于所有目的以其全文引为参考；以及Queen等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033，1989。
“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组成显示出对特定表位的单一的结合特异性和亲和力。因此，术语“人类单克隆抗体”是指显示出单一的结合特异性的抗体，其具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)。在一个实施方案中，人类单克隆抗体通过杂交瘤产生，杂交瘤含有与永生化的细胞融合的B细胞，该B细胞从转基因的非人类动物例如转基因小鼠获得，其基因组中含有人类重链转基因和轻链转基因。
“多克隆抗体”是指针对细胞表面受体或配体的大于一种(两种或以上)不同抗体的制剂，例如与IGF-I受体结合的IGF-I或IGFII。这样的制剂包括与多种不同的表位结合的抗体。针对IGF-I或IGF-II的抗体可以结合IGF-I或IGF-II上的表位，因此抑制了IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的结合。类似地，针对IGF-I或IGF-II的抗体，可以充当与IGF-I受体结合从而抑制IGF-I或IGF-II与IGF-I受体结合的肽模拟物。这些以及适合用于本发明的其它抗体可以按照本技术领域熟知的方法和/或在本文引用的参考文献中描述的方法来制备。在优选的实施方案中，在本发明中使用的抗IGF-I或抗IGF-II抗体是“人类抗体”-例如从人类分离的抗体-或者它们是“人类序列抗体”(定义如上)。
“免疫细胞应答”是指免疫系统的细胞对外部或内部刺激(例如抗原、细胞表面受体、IGF-I、IGF-II、IGF-I受体、细胞因子、化学因子和其它细胞)的应答，在免疫细胞中产生了生化改变，导致免疫细胞的迁移、靶细胞的杀死、细胞吞噬、抗体和免疫应答的其它可溶性效应物的产生，等等。
“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、粒细胞以及上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的协同行动，导致从人体中选择性损伤、破坏或消除癌性细胞、转移的肿瘤细胞、转移的乳腺癌细胞、侵入的病原体、被病原体感染的细胞或组织、或者在自体免疫或病理性炎症情况下的正常人类细胞或组织。
“T淋巴细胞应答”和“T淋巴细胞活性”这里可以互换使用，是指依赖于T淋巴细胞的免疫应答的成分(例如T淋巴细胞增殖和/或分化成辅助性、细胞毒性杀伤性或抑制性T淋巴细胞，辅助性T淋巴细胞提供信号给B淋巴细胞引起或阻止抗体的生产，由细胞毒性T淋巴细胞杀死特定的靶细胞，以及释放可溶性因子例如细胞因子来调节其它免疫细胞的功能)。
癌症的治疗
通过抗体组合物阻断IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的结合，可以增强针对患者中的癌性细胞的记忆和二次免疫应答。针对IGF-I或IGF-II的抗体可以与免疫原性剂例如癌性细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞、以及用编码免疫刺激性细胞因子和细胞表面抗原的基因转染的细胞相组合，或单独使用，来刺激免疫。
在接种方案后，针对IGF-I或IGF-II的抗体是有效的。已经设计了许多针对肿瘤的实验性预防接种方略(参见Rosenberg，ASCOEducational Book Spring：60-62，2000(ASCO教学书，2000春季：60-62)；Logothetis，ASCO Educational Book Spring：300-302，2000(ASCO教学书，2000春季：300-302)；Khayat，ASCO Educational Book Spring：414-428，2000(ASCO教学书，2000春季：414-428)；Foon，ASCOEducational Book Spring：730-738，2000(ASCO教学书，2000春季：730-738)；也参见Restifo等，《癌症：肿瘤学原理和实践》(Cancer：Principles and Practice of Oncology)，61：3023-3043，1997。在一种这样的方略中，使用了自体或异源的肿瘤细胞制备疫苗。已经显示出，当转导肿瘤细胞表达GM-CSF时，这些细胞疫苗最为有效。GM-CSF已经显示出对于肿瘤预防接种来说是抗原呈递的有力的激活剂。Dranoff等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，90：3539-43，1993。
针对IGF-I或IGF-II的抗体可以加强GMCSF修饰的肿瘤细胞疫苗，在许多实验性肿瘤模型中增加疫苗的功效，例如乳腺癌(Hurwitz等，1998，同上)、原发性前列腺癌(Hurwitz等，Cancer Research，60：2444-8，2000)和黑素瘤(van Elsas等，J.Exp.Med.，190：355-66，1999)。在这些情况下，非免疫原性的肿瘤例如B 16黑素瘤，已经被赋予了易于被免疫系统破坏。也可以修饰肿瘤细胞疫苗，使其特别表达其它的免疫激活剂例如IL-2，和共刺激分子。
本文中使用的“抗肿瘤剂”是指具有在人类中抑制肿瘤、特别是恶性(癌性)病变例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病的发生或发展的功能性性质的药剂。抑制转移通常也是抗肿瘤剂的性质。
“实体肿瘤”包括但不限于肉瘤、黑素瘤、癌或其它实体肿瘤癌症。
“肉瘤”是指由类似胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，一般由包埋在纤维状或均质的物质中的紧密堆积的细胞构成。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy氏肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色肉瘤、胚胎性肉瘤、Wilms氏肿瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏(Ewing′s)肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏(Hodgkin′s)肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、Jensen氏肉瘤、卡波斯(Kaposi′s)肉瘤、库普弗(Kupffer)细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、骨网状细胞肉瘤、劳氏(Rous)肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和血管扩张性肉瘤。
“黑素瘤”是指从皮肤和其它器官的黑色素细胞系统产生的肿瘤。黑素瘤包括例如肢端着色斑性黑素瘤、非黑色素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、克劳德曼(Cloudman′s)黑素瘤、S91黑素瘤、哈-帕二氏(Harding-Passey)黑素瘤、青少年黑素瘤、恶性小痣黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤和浅表播散性黑素瘤。
“癌”是指由表皮细胞细胞形成的恶性的新生长，倾向于浸润周围的组织并产生转移。示例性的癌包括例如腺泡癌、腺泡状癌、腺样囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基细胞癌、基底细胞癌、基底细胞上皮癌、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、肺癌、脑样癌、胆管细胞型癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、癌疮、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓质癌、表皮样癌、腺样上皮癌、外植体癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌、胶状癌、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒层细胞癌、毛母质癌、多血癌、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、玻璃体癌、肾透明细胞样(hypemephroid)癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克氏(Krompecher′s)癌、库尔奇茨基(Kulchitzky)细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticular)、脂肪瘤状癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullare carcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨化性癌、乳头状癌、门脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、软糊状癌、肾脏的肾细胞癌、贮备细胞癌、肉瘤样癌、schneiderian癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、海绵体癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosm)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和viflosum癌。
“白血病”是指造血器官的进行性的恶性疾病，其特点通常为血液和骨髓中的白细胞及它们的前体的畸变增殖和发育。白血病通常在临床上根据下述基准分类：(1)疾病的时程和特点--急性或慢性；(2)涉及的细胞类型；骨髓样的(骨髓性的)、淋巴样的(淋巴性的)或单核细胞的；(3)血液中异常细胞的数量增加或不增加--白血性或非白血性(亚白血性)的。白血病包括，例如，急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白细胞性白血病、嗜碱性细胞性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性细胞性白血病、Gross氏白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblasticleukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴球性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小成髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、骨髓粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利氏(Naegeli)白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、Rieder细胞白血病、Schilling氏白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病以及未分化细胞白血病。
其它的癌症包括例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺部肿瘤、原发性脑部肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
抗体的结构
已知基本的抗体结构单元包含了四聚体。每个四聚体由两对同样的多肽链构成，每对有一条“轻链”(大约25KDa)和一条“重链”(大约50-70KDa)。每条链的氨基末端部分包括大约100到110个或更多的氨基酸的可变区，主要负责抗原的识别。每条链的羧基末端部分限定了恒定区，主要负责效应子功能。人类的轻链被分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别将抗体的同种型确定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12个以上氨基酸的“J”区连接，在重链中也包括了大约10个以上氨基酸的“D”区。总的来说可以参见《基础免疫学》第七章(Fundamental Immunology Ch.7)，Paul，W.主编，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))(出于所有目的以其全文引为参考)。每对轻链/重链的可变区形成了抗原结合位点。
因此，完整的IgG抗体具有两个结合位点。除了在双功能抗体或双特异性抗体中之外，这两个结合位点是相同的。
所有的链都显示出同样的总体结构，相对保守的框架区(FR)被三个超可变区、也称为互补性决定区或CDR连接起来。来自每对的两条链的CDR通过框架区对齐，确保与特异性表位的结合。从N-末端到C-末端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸指派按照《免疫重要的蛋白的Kaba序列》的定义来进行(Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)(国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia & Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917，1987；Chothia等，Nature 342：878-883，1989。
双特异性或双功能抗体是具有两种不同的重链/轻链对和两种不同结合位点的人造杂合抗体。双特异性抗体可以通过各种不同的方法来生产，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见例如Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321，1990；Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553，1992。此外，双特异性抗体可以形成为“双抗体”(Holliger等，PNAS USA 90：6444-6448，1993)或“Janusins”(Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659，1991和Traunecker等，Int JCancer 7：51-52，1992)。双特异性抗体的生产与常规抗体的生产相比可能是劳动强度相对高的过程，并且双特异性抗体的产率和纯度通常较低。双特异性抗体不存在具有单一结合位点的片段形式(例如Fab、Fab′和Fv)。
Fab或scFv噬菌体文库
噬菌体展示文库鉴定与配体或转移细胞上的细胞表面受体、例如IGF-I、IGF-II或IGF-I受体特异性结合的抗体组合物的方法，使用了Fab或单链Fv(scFv)噬菌体文库。参见例如Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，85：5879-5883，1988；Chaudhary等，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.，87：1066-1070，1990；Zhang等，J.Virol.78：9233-9242，2004。已经描述了在噬菌体外壳蛋白上展示Fab或scFv文库的各种实施方案。噬菌体展示方法的改良也是已知的，例如在WO96/06213和WO92/01047(医学研究委员会(Medical Research Council)等)和WO97/08320(Morphosys)中描述，在此引为参考。Fab文库的展示是已知的，例如在WO92/01047(CAT/MRC)和WO91/17271(Affymax)中描述。
克隆到展示载体中的杂合抗体或杂合抗体片段，可以针对与转移细胞有关的适合的抗原、例如转移肿瘤细胞上的细胞表面受体或针对细胞表面受体的配体进行筛选，以便鉴定因为抗体或抗体片段将呈递于噬菌体或噬粒颗粒的表面上而维持良好的结合活性的变异体。参见例如Barbas III等的《噬菌体展示，实验室手册》(Phage Display，ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，2001，其内容在此引为参考。例如，在Fab片段的情况下，轻链和重链Fd产物是在lac启动子的控制之下，每条链具有与其融合的前导信号，以便引导到细菌宿主的周质空间中。抗体片段将能够在这个空间中适当地装配。重链片段被表达成与噬菌体外壳蛋白结构域的融合体，这使得装配的抗体片段整合到新制造的噬菌体或噬粒颗粒的外壳中。新的噬粒颗粒的产生需要加入含有所有必需的噬菌体基因的辅助噬菌体。一旦抗体片段的文库呈递在噬菌体或噬粒表面上，就进行被称为淘选的过程。借助于该方法，i)展示在噬菌体或噬粒颗粒表面上的抗体与目的抗原相结合，ii)没有结合的被洗掉，iii)将结合的颗粒从抗原上洗脱，以及iv)将洗脱下的颗粒暴露于新鲜的细菌宿主以便扩增富集的集合体，用于下一轮的选择。典型情况下，在对抗体克隆的特异性结合进行筛选之前，进行三或四轮的淘选。以这种方式，噬菌体/噬粒颗粒使得表现型(抗体)与基因型(DNA)结合的连锁使得抗体展示技术的使用非常成功。但是，其它的载体形式也可以用于这种人源化过程，例如将抗体片段文库克隆到裂解性噬菌体载体(修饰的T7或λ噬菌体Zap系统)中用于选择和/或筛选。
在选择了所需杂合抗体和/或杂合抗体片段后，可以考虑使用本技术领域的专业人员已知的任何技术大量地生产它们，例如原核或真核细胞表达等。例如，杂合抗体或片段可以使用常规的技术构建编码抗体重链的表达载体来生产，在该抗体重链中，CDR以及，如果需要的话，保持原始物种的抗体结合特异性所需的可变区框架的最少部分(按照本文描述的技术进行工程化)，源自原始物种的抗体，而抗体的剩余部分源自靶物种的免疫球蛋白，这可以按照本文的描述进行操作，由此产生了用于表达杂合抗体重链的载体。
在一个详细的实施方案中，Fab或单链Fv(scFv)抗体文库可以从患有各种癌症疾病的5、10、15或20个或更多的患者的外周血淋巴细胞来制备。然后可以使用合成的唾液酸化的Lewisx和LewisxBSA结合物来筛选完全人类的高亲和力Fab或scFv抗体。在一项研究中，通过ELISA、BIAcore和与胰腺腺癌细胞的细胞表面结合的流式细胞分析，证实了这些人类scFv抗体对唾液酸化的Lewisx和Lewisx的特异性。核苷酸测序揭示，获得了至少四种独特的scFv基因。Kd值范围从1.1到6.2×10-7M，与二次免疫应答产生的mAbs的亲和力相当。这些抗体对于探测糖类抗原的结构和功能、以及在人类肿瘤疾病的治疗中，可能是有价值的试剂。Mao等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：6953-6958，1999。
在另一个详细的实施方案中，噬菌体展示的组合抗体文库可用于产生和筛选针对与转移性细胞有关的适当抗原例如转移肿瘤细胞上的细胞表面受体或针对细胞表面受体的配体的各种各样的抗体。噬菌体外壳蛋白pVII和pIX可用于展示抗体Fv区域的异源二聚体结构。这种技术的方面已经扩展到构建大的人类Fab或单链Fv(scFv)文库，该文库在丝状噬菌体的pIX上展示4.5×109个成员。此外，文库的多样性、质量和应用通过针对6种不同的蛋白抗原筛选Fab或scFv克隆进行证实。值得注意的是，在经过少至三轮的淘选后，90％以上筛选出的克隆显示出了与它们各自的抗原的阳性结合。被分析的Fab或scFv也被发现是高亲和力的。例如，动力学分析(BIAcore)揭示，针对葡萄球菌肠毒素B和霍乱毒素B亚基的Fab或scFv分别具有纳摩尔和低于纳摩尔的解离常数，具有与通过免疫接种获得的mAB相当或更高的亲和力。也获得了高特异性，不仅在非常不同的蛋白之间，而且在更紧密相关的蛋白的情况下，例如蓖麻(Ricinus communis)(“篦麻毒素”)凝集素(RCA60和RCA120)，尽管在两者之间有大于80％的序列同源性。结果表明，pIX展示文库的性能可能超过了pIII展示形式，使得它理想地适合淘选各种各样的靶抗原。Gao等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：12612-12616，2001。
抗体或其它结合剂与抗原之间的特异性结合是指结合亲和力至少为10-6M。优选的结合剂以至少大约10-7M、并优选10-8M到10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的亲和力结合。术语表位是指能够与抗体特异性结合的抗原性决定簇。表位通常由分子例如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团构成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象与非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，前者的结合性会失去，而后者不会。
“表位”是指任何分子中能够被抗体或T细胞受体在一个或多个抗体或T细胞受体的抗原结合区上识别并被结合的部分。表位通常由分子例如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团构成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。“抑制性和/或中和性表位”是指表位当被抗体结合时，导致含有表位的分子或生物体的生物活性丧失，可以在体内、体外或原位发生，更优选在体内发生，包括IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的结合。当解离常数小于1μM、优选小于100nM和最优选小于10nM时，抗体被说成是特异性结合抗原。构象与非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，前者的结合性会失去，而后者不会。
被本发明的抗体、其片段和区域识别的表位可以包含5个以上的氨基酸，包括下面的IGF-I或IGF-II的氨基酸序列的每种或这两种的至少一个氨基酸，这提供了IGF-I或IGF-II的拓扑或三维表位，可以被本发明的抗IGF-I或IGF-II活性的抗体、其片段和可变区识别和/或结合。本发明也提供了测定IGF-I或IGF-II的中和和/或抑制活性的筛选方法。在本发明中，抗IGF-I或抗IGF-II中和活性或IGF-I或IGF-II抑制活性是指IGF-I或IGF-II中和性化合物阻断IGF-I或IGF-II的至少一种生物学活性的能力，例如阻止IGF-I或IGF-II与IGF-I受体结合，通过细胞内加工例如转录、翻译或翻译后修饰阻断IGF-I或IGF-II的生产、在细胞表面上表达、生物活性IGF-I或IGF-II的分泌或装配。此外，IGF-I或IGF-II中和性化合物可以通过诱导调控代谢途径例如参与IGF-I或IGF-II生产的上调或下调来发挥作用。或者，IGF-I或IGF-II中和性化合物可以通过降低细胞对IGF-I或IGF-II的灵敏度来调节该灵敏度。IGF-I或IGF-II中和性化合物可以选自抗体或其片段或部分，肽、肽模拟化合物或有机模拟化合物，如果按照本发明进行使用，能够在体外、原位或体内中和IGF-I或IGF-II活性，也可被视为IGF-I或IGF-II中和性化合物。可以用于确定IGF-I或IGF-II中和性化合物的IGF-I或IGF-II中和活性的筛选方法可以包含在体外或体内分析中。这样的体外分析可以包括针对下述的分析：(i)在体外MCF-7乳腺癌细胞分析中，抗体浓度为大约4nM以上对IGF-I受体磷酸化的抑制；(ii)抑制IGF-I或IGF-II与IGF-I受体的结合；或(iii)在细胞迁移分析中抑制细胞迁移。可选的或另外的，IGF-I或IGF-II中和性化合物的IGF-I或IGF-II中和活性的体内测试，可以使用本文描述的在体外MCF-7乳腺癌细胞分析中，大约4nM以上的抗体浓度对IGF-I受体磷酸化的抑制的体外分析来进行。
“中和性”是指抗体通过阻止人类IGF-I或IGF-II与其特异性受体IGF-IR结合，或通过抑制IGF-I或IGF-II通过其将发生结合的受体发送信号来抑制IGF-I或IGF-II活性。mAb，如果它在例如MCF-7乳腺癌细胞的磷酸化分析中测定为90％有效、优选95％有效、最优选100％有效抑制IGF-I或IGF-II的活性，则是中和性的。
本文使用的“药剂”是指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或从生物学材料制成的提取物。
“改变的抗体”是指由改变的免疫球蛋白编码区编码的蛋白，可以通过在选定的宿主细胞中表达来获得。这样的改变的抗体是工程化的抗体(例如嵌合抗体或人源化抗体)或缺少了全部或部分免疫球蛋白恒定区的抗体片段，例如Fv、Fab或F(ab)2等。
“改变的免疫球蛋白编码区”是指编码本发明的改变的抗体的核酸序列。当改变的抗体是CDR-嫁接的或人源化抗体时，编码来自非人类免疫球蛋白的互补性决定区(CDR)的序列被插入到含有人类可变区框架序列的第一个免疫球蛋白配偶体中。任选第一个免疫球蛋白配偶体与第二个免疫球蛋白配偶体可操作地连接。
“高亲和力”是指抗体的结合亲和力的特征通过表面等离子体共振测定时，对人类IGF-I或IGF-II的Kd等于或小于3.5×10-11M。
“对于人类IGF-I或IGF-II的结合特异性”是指对于人类IGF-I或人类IGF-II的高亲和力。单克隆抗体m705和m706对于人类IGF-I具有高结合特异性，并且不结合人类胰岛素。单克隆抗体m708和m708.2对于人类IGF-I和人类IGF-II具有高结合特异性，并且不结合人类胰岛素。
术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2按照它们的标准意义使用(参见例如Harlow等，《抗体实验室手册》(Antibodies A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988))。
“工程化抗体”描述了一类改变的抗体，即全长的合成抗体(例如嵌合的或人源化的抗体而不是抗体片段)，其中选定的受体抗体的轻链和/或重链可变结构域的一部分，被来自一个或多个对于选定的表位具有特异性的供体抗体的类似部分所代替。例如，这样的分子可以包括其特征为人源化的重链与未修饰的轻链(或嵌合的轻链)相结合的抗体，反之亦然。工程化抗体的特征也可以是改变编码接受体的抗体轻链和/或重链可变结构域框架区的核酸序列，以便保留供体抗体的结合特异性。这些抗体可以包括本文描述的用来自供体抗体的CDR替换来自接受体抗体的一个或多个CDR(优选为所有的)。
“嵌合抗体”是指一类工程化抗体，其含有与来自接受体抗体的轻链和重链恒定区结合的来自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)。
“人源化抗体”是指一类工程化抗体，其CDR源自非人类的供体免疫球蛋白，分子的其它的来自免疫球蛋白的部分源自一个(或多个)人类免疫球蛋白。此外，可以改变框架支持残基以保留结合亲和力。参见例如Queen等，Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032，1989；Hodgson等，Bio/Technology，2：421，1991。
“供体抗体”是指给第一个免疫球蛋白配偶体贡献了其可变区、CDR或其它其功能性片段或其类似物的核酸序列的抗体(单克隆或重组)，从而提供了改变的免疫球蛋白编码区，并产生表达的改变抗体，该抗体具有供体抗体的抗原性特异性和中和性活性特征。
“接受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体(单克隆或重组)，它为第一个免疫球蛋白配偶体贡献了所有的(或任何部分，但优选所有的)编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的核酸序列。优选人类抗体是接受体抗体。
“CDR”被定义为抗体的互补性决定区氨基酸序列，它是免疫球蛋白重链和轻链的超变区。参见例如Kabat等，《免疫重要的蛋白序列》第四版，美国卫生与人类服务部，国立卫生研究院(Sequences of Proteinsof Immunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and HumanServices，National Institutes ofHealth(1987))。在免疫球蛋白的可变区部分中有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，本文中使用的“CDR”是指所有三个重链CDR或所有三个轻链CDR(或者如果合适，兼指所有重链和所有轻链CDR)。
CDR为抗体与抗原或表位的结合提供了大部分接触残基。本发明中的目的CDR源自供体抗体的可变重链和轻链序列，并包括了天然存在的CDR的类似物，其类似物也享有或保留了与它们所源自的供体抗体同样的抗原结合特异性和/或中和能力。
“享有抗原结合特异性或中和能力”是指例如，尽管mAb m705、m706、m708或m708.2可以以某种水平的抗原亲和力为特征，但由m705、m706、m708或m708.2的核酸序列编码的CDR，在适合的结构环境中可能具有更低或更高的亲和力。然而，预计m705、m706、m708或m708.2的CDR在这样的环境中也将识别与原初的单克隆抗体同样的表位。示例性的重链CDR包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7，示例性的轻链CDR包括SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。参见例如表1和表2。
“功能性片段”是部分重链或轻链可变序列(例如在免疫球蛋白可变区的氨基或羧基末端有少量缺失)，它保留了与片段所源自的抗体同样的抗原结合特异性和/或中和能力。
“类似物”是修饰了至少一个氨基酸的氨基酸序列，其中所述修饰可以是化学的或几个氨基酸(即不超过10个)的取代或重排，其中修饰允许氨基酸序列保留未修饰的序列的生物学特性，例如抗原特异性和高亲和力。例如，当在CDR编码区内或附近产生某些内切核酸酶限制性位点时，可以通过取代来构建(沉默)突变。
类似物也可以形成为等位基因变异。“等位基因变异或修饰”是编码本发明的氨基酸或肽序列的核酸序列中的变化。这样的变异或修饰可以是由于遗传密码的简并性，或者可以是特意工程化以提供所需的特征。这些变异或修饰可以产生或不产生任何编码的氨基酸序列的改变。
“载体剂”或“效应剂”是指非蛋白的载体分子，改变的抗体、和/或供体抗体的天然的或合成的轻链或重链、或供体抗体的其它片段可以通过常规方法与其相结合。这样的非蛋白载体可以包括在诊断领域中使用的常规载体，例如聚苯乙烯或其它塑料珠，多糖，例如在[Pharmacia]系统中使用的多糖，或其它可用于医学领域并可以安全用于人类和动物的非蛋白物质。其它效应剂可以包括用于螯合重金属原子的大环或放射性同位素。这样的效应剂也可以用于增加改变的抗体的半衰期，例如聚乙二醇。
免疫应答的成分可以在体外通过本技术领域的普通专业人员所熟知的各种不同的方法来检测。例如(1)细胞毒性T淋巴细胞可以与放射活性标记的靶细胞温育，并通过放射活性的释放来检测这些靶细胞的裂解；(2)辅助性T淋巴细胞可以与抗原和抗原呈递细胞温育，通过标准方法测量细胞因子的合成和分泌(Windhagen等，Immunity，2：373-80，1995)；(3)抗原呈递细胞可以与全蛋白抗原温育，通过T淋巴细胞活化分析或生物物理方法检测该抗原在MHC上的呈递(Harding等，Proc.Natl.Acad.Sci.，86：4230-4，1989)；(4)肥大细胞可以与交联它们的Fc-ε受体的试剂温育，通过酶免疫分析测量释放的组胺(Siraganian等，TIPS，4：432-437，1983)。
类似地，在模型生物体(例如小鼠)或人类患者中免疫应答的产物也可以通过本技术领域的普通专业人员所熟知的各种方法来检测。例如(1)对预防接种作出应答产生的抗体可以通过在临床实验室中目前使用的标准方法来容易地检测，例如ELISA；(2)免疫细胞向炎性位点的迁移可以通过刮取皮肤表面并放置在无菌容器来捕获通过刮取位点的迁移细胞来检测(Peters等，Blood，72：1310-5，1988)；(3)外周血单核细胞对有丝分裂原作出应答进行的增殖或混合的淋巴细胞反应，可以使用3H-胸腺嘧啶来测量；(4)PBMC中的粒细胞、巨噬细胞和其它吞噬细胞的细胞吞噬能力可以通过将PBMC与标记的颗粒一起放置在孔中来测量(Peters等，Blood，72：1310-5，1988)；以及(5)免疫系统细胞的分化可以通过用针对CD分子例如CD4和CD8的抗体来标记PBMC，并测量表达这些标记物的PMBC的分数来测量。
为方便起见，在本发明中，通常将免疫应答描述为“初次”或“二次”免疫应答。初次免疫应答，也被称为“保护性”免疫应答，是指在个体中作为某些初次暴露(例如初次“免疫”)于特定抗原例如细胞表面受体、配体、IGF-IIGF-II或IGF-E受体的结果而产生的免疫应答。这样的免疫可以例如作为某些自然暴露于抗原(例如被某些展示或呈递抗原的病原体初次感染)的结果而发生，或由于个体中被某些肿瘤的癌症细胞(例如转移的乳腺癌细胞)呈递的抗原而发生。或者，免疫也可以作为用含有抗原的疫苗接种个体的结果而发生。例如，疫苗可以是含有来自癌症细胞、例如转移的乳腺癌细胞的一种或多种抗原的癌症疫苗。
初次免疫应答可能随着时间变弱或衰减，甚至可能消失或至少变得减弱到不能检测到。因此，本发明还涉及“二次”免疫应答，在本文中也被描述为“记忆免疫应答”。术语二次免疫应答是指在已经产生过初次免疫应答后，在个体中引发的免疫应答。因此，可以引发二次免疫应答，例如，以加强现有的已经变弱或衰减的免疫应答，或重新产生以前的已经消失或不再能够检测到的免疫应答。可以施用引发二次免疫应答的药剂在后文中称为“加强剂”，因为该药剂可以被说成是“加强”了初次免疫应答。
举例而不是限制，二次免疫应答可以通过在个体中重新引入引发初次免疫应答的抗原来引发(例如通过重新接种疫苗)。但是，对抗原的二次免疫应答也可以通过施用不含有实际抗原的其它药剂来引发。例如，本发明提供了通过给个体施用针对IGF-I和IGF-II的抗体而加强二次免疫应答的方法。在这种方法中，不是必需将实际的抗原与针对IGF-I或IGF-II的抗体一起使用，并且含有抗体的组合物也不是必需含有抗原。二次或记忆免疫应答可以是体液(抗体)应答或细胞应答。二次或记忆体液应答是在刺激了第一次呈递抗原时产生的记忆B细胞后发生的。延迟型超敏(DTH)反应是一类由CD4+细胞介导的细胞性二次或记忆免疫应答。第一次暴露于抗原致敏了免疫系统，再次
暴露导致了DTH。
“免疫交叉反应性”或“免疫反应性”是指一种抗原，其与抗体特异性反应，所述抗体是使用同样的(“免疫反应性”)或不同的(“免疫交叉反应性”)抗原产生的。一般来说，抗原是IGF-I、IGF-II或IGF-I受体，或其子序列。
“免疫反应性条件”是指该条件使得针对抗原的特定表位所产生的抗体与该表位结合的可检测程度比该抗体与基本上所有其它表位的结合更高，一般来说比背景结合高至少两倍，优选比背景高至少5倍。免疫反应性条件依赖于抗体结合反应的模式，并且通常是在免疫分析方法中使用的条件。参见Harlow和Lane，《抗体，实验室指手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Publications，New York，1988中对于免疫分析模式和条件的描述。
“细胞表面受体”是指能够接受信号并将这样的信号传送过细胞质膜的分子和分子复合物。本发明的“细胞表面受体“的例子是转移细胞上的IGF-I受体。
“非特异性T细胞活化”是指T细胞不依赖于其抗原性特异性的刺激。
“效应细胞”是指参与免疫应答的效应阶段而不是免疫应答的识别和活化阶段的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括细胞毒性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜中性细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性细胞。效应细胞表达特异性Fe受体并执行特定的免疫功能。效应细胞可以诱导抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，例如嗜中性细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜酸性细胞和淋巴细胞参与了靶细胞的特异性杀死和将抗原呈递给免疫系统的其它成分，或与呈递抗原的细胞结合。效应细胞也可以吞噬靶抗原、靶细胞、转移的癌症细胞或微生物。
“靶细胞”是指可以被本发明的抗体或抗体组合物的靶定的对象(例如人和动物)中任何不需要的细胞。靶细胞可以是表达或过量表达人类IGF-I受体的细胞。表达人类IGF-I受体的细胞可以包括肿瘤细胞，例如乳腺癌细胞或转移的乳腺癌细胞。
转移的癌症细胞例如转移的乳腺癌细胞的抗体组合物的目的靶，包括但不限于在癌症例如转移的癌症和转移的乳腺癌中呈递的细胞表面受体、生长因子受体、IGF-I、IGF-II、IGF-I受体(参见例如BurtrumD.等，Cancer Res.，63：8912-8921，2003；Lu等，J.Biol.Chem.279：2856-2865，2004；Miyamoto等，Clin.Cancer Res.11：3494-3502，2005；Goya等，Cancer Research 64：6252-6258，2004.)、抗体、包括抗独特型抗体和自身抗体。其它的靶是粘附蛋白例如整联蛋白、选择蛋白和免疫球蛋白超家族成员。Springer，Nature，346：425-433，1990；Osborn，Cell，62：3，1990；Hynes，Cell，69：11，1992。其它的目的靶是生长因子受体(例如FGFR、PDGFR、EGF、her/neu、NGFR和VEGF)以及它们的配体。其它的靶是G-蛋白受体，包括物质K受体、血管紧张素受体、α-和β-肾上腺素能受体、5-羟色胺受体和PAF受体。参见例如Gilman，Ann.Rev.Biochem.56：625-649，1987。其它的靶包括离子通道(例如钙、钠、钾通道，介导多种药物抗性的通道蛋白)、毒蕈碱受体、乙酰胆碱受体、GABA受体、谷氨酸受体和多巴胺受体(参见Harpold，美国专利No.5,401,629和美国专利No.5,436,128)。其它的靶是细胞因子，例如白介素IL-1到IL-13、α-和β-肿瘤坏死因子、α-、β-和γ-干扰素、β-肿瘤生长因子(TGF-β)、集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。参见Aggrawal等主编的《人类细胞因子：基础和临床研究手册》(Human Cytokines：Handbook for Basic &Clinical Research)，Blackwell Scientific，Boston，Mass.，1991。其它的靶是激素、酶和细胞内和细胞间信使，例如腺苷环化酶、鸟苷环化酶和磷脂酶C。药物也是目的靶。靶分子可以是人类、哺乳动物或细菌的。其它的靶是抗原，例如来自病毒和细菌性微生物病原体和肿瘤的蛋白、糖蛋白和糖类。还有其它的靶描述在美国专利No.4,366,241中，在此出于所有目的以其全文引为参考。某些通过靶筛选的药剂仅仅与靶结合。其它的药剂激动或拮抗靶。
抗IGF-I或抗IGF-II抗体的重组表达
根据本发明，使用基于本文提供教导的已知技术，提供了抑制IGF-I或IGF-II与IGF-IR结合的重组人类抗体。这参见例如Ausubel等主编的《分子生物学现代方法》(Current Protocols in MolecularBiology)，Wiley Interscience，N.Y.(1987，1992，1993)；以及Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，其全部内容在此引为参考。
编码本发明的抗IGF-I或抗IGF-II抗体的DNA可以是编码重链恒定区(CH)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)中的至少一种的基因组DNA或cDNA。使用染色体基因片段作为编码鼠V区抗原结合片段的DNA来源的方便替代方法，是使用cDNA来构建嵌合的免疫球蛋白基因，例如，正如在Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 84：3439(1987)和J.Immunology 139：3521(1987)中报道的那样，在此以其全文引为参考。使用cDNA需要将适合宿主细胞的基因表达元件与基因相结合，以便实现所需蛋白的合成。使用cDNA序列优于基因组序列(含有内含子)，在于cDNA序列可以在缺少适合的RNA间接系统的细菌或其它宿主中表达。
这类用于合成这样的寡核苷酸的技术是众所周知的，被描述在例如Wu等，Prog.Nucl.Acid.Res.Molec.Biol.21：101-141(1978)和Ausubel等主编的《分子生物学现代方法》(Current Protocols inMolecular Biology)，Wiley Interscience(1987，1993)中，其全部内容在此引为参考。
因为遗传密码是简并的，一个以上的密码子可用于编码特定的氨基酸(Watson等，同上)。使用遗传密码，可以鉴定一个或多个不同的寡核苷酸，每个都能够编码氨基酸。特定的寡核苷酸将实际上构成有效的抗IGF-I或抗IGF-II抗体编码序列的概率，可以通过考虑在表达抗IGF-I或抗IGF-II抗体或片段的真核或原核细胞中异常的碱基配对关系和特定的密码子实际使用频率(编码特定的氨基酸)来估算。这样的“密码子使用规则”由Lathe等，J.Molec.Biol.183：1-12(1985)公开。使用Lathe的“密码子使用规则”，可以鉴定出单一寡核苷酸或一组寡核苷酸，其含有能够编码抗IGF-I或抗IGF-II可变区或恒定区序列的理论上“最可能的”核苷酸序列。
尽管有时氨基酸序列可以仅由单个寡核苷酸编码，但通常氨基酸序列可以由一组类似的寡核苷酸中的任何一个编码。重要的是，虽然在该组中的所有成员都含有能够编码肽片段的寡核苷酸并因此可能含有与编码肽片段的基因相同的寡核苷酸序列，但该组中只有一个成员含有与该基因的核苷酸序列一致的核苷酸序列。因为该成员存在于在组内，并且它即使是存在该组的其它成员的情况下也能够与DNA杂交，因此，以与使用单一寡核苷酸克隆编码蛋白的基因相同的方式，使用未分级的一组寡核苷酸，也是可能的。
寡核苷酸或寡核苷酸组，含有能够编码包括可变区或恒定区的抗IGF-I或抗IGF-II抗体或片段的理论上“最可能的”序列，其被用于鉴定能够与“最可能的”序列或序列组杂交的互补寡核苷酸或寡核苷酸组的序列。含有这样的互补序列的寡核苷酸可用作探针，鉴定和分离可变区或恒定区抗IGF-I或抗IGF-II基因(Sambrook等，同上)。
能够编码抗IGF-I或抗IGF-II可变区或恒定区的片段的适合的寡核苷酸或寡核苷酸组(或与这样的寡核苷酸或寡核苷酸组互补)通过本技术领域已知的方法，依靠来自能够表达抗IGF-I或抗IGF-II抗体或其可变区或恒定区的细胞的DNA、优选为cDNA制剂进行鉴定(使用上述程序)、合成和杂交。与“最可能的”抗IGF-I或抗IGF-II肽可变区或恒定区编码序列互补的单链寡核苷酸分子，可以使用本技术领域的普通专业人员所熟知的方法来合成(Belagaje等，J.Biol.Chem.254：5765-5780(1979)；Maniatis等，《基因表达控制中的分子机理》(Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression)，Nierlich等主编，Acad.Press，NY(1976)；Wu等，Prog.Nucl.Acid Res.Molec.Biol.21：101-141(1978)；Khorana，Science 203：614-625(1979))。此外，可以通过使用自动化合成仪来进行DNA合成。核酸杂交的技术在Sambrook等(同上)和Hayrnes等(《核酸杂交实用方法》(Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach)，IRL Press，Washington，DC(1985))中公开，其内容在此引为参考。诸如上述的技术或与其相似的技术已经成功地能够克隆人类醛脱氢酶基因(Hsu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3771-3775(1985))、纤连蛋白基因(Suzuki等，Bur.Mol.Biol.Organ.J.4：2519-2524(1985))、人类雌激素受体基因(Walter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7889-7893(1985))、组织型纤溶酶原激活剂基因(Pennica等，Nature 301：214-221(1983))和人类足月胎盘碱性磷酸酶互补DNA的基因(Keun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8715-8719(1985))。
在编码抗IGF-I或抗IGF-II可变区或恒定区的多核苷酸的另一种克隆方法中，通过将DNA、更优选为cDNA(来自能够表达抗IGF-I或抗IGF-II抗体或其可变区或恒定区的细胞)克隆到表达载体中，制备表达载体的文库。然后从文库中筛选成员，该成员能够表达竞争性抑制抗IGF-I或抗IGF-II抗体例如m705、m706、m708或m708.2与IGF-IR结合的蛋白，并且所具有的核苷酸序列能够编码与抗IGF-I或抗IGF-II抗体或其片段具有同样的氨基酸序列的多肽。在该实施方案中，DNA、或更优选为cDNA，从能够表达抗IGF-I或抗IGF-II抗体或片段的细胞中提取和纯化。纯化的cDNA裂成片段(通过剪切、内切核酸酶消化等)，产生DNA或cDNA片段的集合体。然后将来自该集合体的DNA或cDNA片段克隆到表达载体中，以产生表达载体的基因组文库，其成员每个都含有例如λ噬菌体文库中独特的克隆DNA或cDNA片段，在原核细胞(例如细菌)或真核细胞(例如哺乳动物、酵母、昆虫或真菌)中表达。参见例如Ausubel，同上；Harlow，同上；Colligan，同上；Nyyssonen等，Bio/Technology 11：591-595(Can 1993)；Marks等，Bio/Technology 11：1145-1149，1993。一旦分离了编码这些抗IGF-I或抗IGF-的可变区或恒定区的核酸，核酸就可以与其它的恒定区或重链或轻链编码核酸一起在宿主细胞中适当地表达，以提供以抑制性活性与IGF-I或IGF-II结合的重组Mab。这样的抗体优选包含鼠或人类的抗IGF-I或抗IGF-II可变区，该可变区含有具有负责抗原结合的互补性决定残基的框架残基。在优选实施方案中，上述核酸编码的抗IGF-I或抗IGF-II的可变轻链或重链，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7或SEQ ID NO：8的至少5个氨基酸的表位结合。
编码本发明的鼠和嵌合抗体、片段和区域的恒定(C)区的人类基因，可以通过已知的方法从人类胎儿肝脏文库衍生。人类C区基因可以源自任何人类细胞，包括表达和生产人类免疫球蛋白的细胞。人类CH区可以源自任何已知类型或同种型的人类H链，包括γ、μ、α、δ或ε及其亚型，例如G1、G2、G3和G4。因为H链同种型负责抗体的各种不同的效应功能，CH区的选择将以所需的效应功能为指导，例如补体固定、或抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)中的活性。优选CH区源自γ1(IgG1)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)或μ(IgM)。
人类抗体和抗体的人源化
人类抗体避免了与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的某些问题。存在这种鼠或大鼠来源的蛋白可能导致抗体的快速清除或导致患者产生针对抗体的免疫应答。为了避免使用鼠或大鼠来源的抗体，已经假定人们可以通过将人类抗体功能导入啮齿动物使得啮齿动物产生具有完全人类序列的抗体，从而开发出人源化抗体或产生完全人类的抗体。
在YAC中克隆和重建兆碱基级的人类基因座并将它们导入小鼠种系中的能力，提供了一种有力的方法来阐明非常大的或粗略作图的基因座的功能组分，并为人类疾病产生有用的模型。此外，使用这样的技术将小鼠的基因座用它们的人类等价物代替，为发育过程中人类基因产物的表达和调控、它们与其它系统的联络、以及它们在疾病诱导和发展中的参与，提供了独特的视角。
这种方略的重要实践应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人类免疫球蛋白(Ig)基因座导入内源性Ig基因已经被失活的小鼠中，为研究抗体的程序化表达和装配的潜伏机制以及它们在B细胞发育中的作用提供了机会。此外，这样的方略可以为完全人类的单克隆抗体(Mab)的生产提供理想的来源，这是在迈向人类疾病实现抗体疗法的重要里程碑。完全人类的抗体预期能够最小化小鼠或小鼠来源的Mab天生固有的免疫原性和过敏性反应，从而增加了施用抗体的功效和安全性。完全人类抗体的使用，预期可以在慢性和复发性人类疾病例如炎症、自身免疫和癌症等需要重复施用抗体的治疗中提供显著的优势。
实现这种目标的一种方法是用人类Ig基因座的大片段对小鼠抗体生产缺陷的小鼠种系进行改造，以期望这样的小鼠可以产生人类抗体的庞大的所有组成成分，同时不含有小鼠抗体。大的人类Ig片段将保留庞大的可变基因多样性以及对抗体生产和表达的适当调控。通过开发用于抗体多样化和筛选以及缺失对人类蛋白的免疫耐受性的小鼠工具，在这些的小鼠种系中重新产生的人类抗体全部组成成分将产生针对任何目的抗原、包括人类抗原的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地产生和筛选具有所需特异性的抗原特异性人类Mab。
这种通用方略被证实与我们在1994年发表的第一个XenoMouseTM种系的产生有关联。参见Green等，Nature Genetics 7：13-21，1994。XenoMouseTM种系用分别含有人类重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系表型片段的酵母人工染色体(YAC)进行改造，这些基因座含有核心可变区和恒定区序列ID。含有YAC的人类Ig被证明在抗体的重排和表达方面与小鼠系统是相容的，并且能够替代失活的小鼠Ig基因。这被它们诱导B细胞发育、产生完全人类抗体的成人样人类全部组成成分、以及产生抗原特异性人类Mab的能力所证明。这些结果也表明，导入含有较大数量V基因、其它的调控元件和人类Ig恒定区的人类Ig基因座的较大部分，能够基本上重现人类针对感染和预防接种的特征性体液应答的完整的全部组成成分。Green等的工作最近扩展到了通过分别导入兆碱基对规模的人类重链基因座和κ轻链基因座的种系表型YAC片段，导入了超过大约80％的人类抗体全部组成成分，以产生XenoMouseTM小鼠。参见Mendez等，Nature Genetics 15：146-156，1997；Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188：483-495，1998；以及1996年12月3日提交的美国专利申请系列号No.08/759,620，其公开内容在此引为参考。
这些方法进一步讨论和描述于下面的美国专利申请：1990年1月12日提交的系列号No.07/466,008、1990年11月8日提交No.07/610,515、1992年7月24日提交的No.07/919,297、1992年7月30日提交的No.07/922,649、1993年3月15日提交的No.08/031,801、1993年8月27日提交的No.08/112,848、1994年4月28日提交的No.08/234,145、1995年1月20日提交的No.08/376,279、1995年4月27日提交的No.08/430,938、1995年6月5日提交的No.08/464,584、1995年6月5日提交的No.08/464,582、1995年6月5日提交的No.08/463,191、1995年6月5日提交的No.08/462,837、1995年6月5日提交的No.08/486,853、1995年6月5日提交的No.08/486,857、1995年6月5日提交的No.08/486,859、1995年6月5日提交的No.08/462,513、1996年10月2日提交的No.08/724,752、和1996年12月3日提交的No.08/759,620。也参见Mendez等，Nature Genetics 15：146-156，1997以及Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188：483-495，1998。也参见1996年6月12日授权公告的欧洲专利No.EP 0 463 151B1，1994年2月3日公布的国际专利申请No.WO 94/02602，1996年10月31日公布的国际专利申请No.WO 96/34096，以及1998年6月11日公布的WO 98/24893。上面引用的每个专利、申请和参考文献的公开内容在此以其全文引为参考。
在另一种方法中，其他人，包括GenPharm International，Inc.，使用了一种“微小基因座”方法。在微小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的片(个体基因)，模拟了外源Ig基因座。因此，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二个恒定区(优选为γ恒定区)被构入构建体中，用于插入到动物中。这种方法被描述在Surani的美国专利No.5,545,807，以及Lonberg和Kay的各个美国专利No.5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650和5,814,318，Krimpenfort和Berns的美国专利No.5,591,669，Berns等的美国专利No.5,612,205、5,721,367、5,789,215，以及Choi和Dunn的美国专利No.5,643,763，以及GenPharmInternational于1990年8月29日提交的美国专利申请系列号No.07/574,748、1990年8月31日提交的No.07/575,962、1991年12月17日提交的No.07/810,279、1992年3月18日提交的No.07/853,408、1992年6月23日提交的No.07/904,068、1992年12月16日提交的No.07/990,860、1993年4月26日提交的No.08/053,131、1993年7月22日提交的No.08/096,762、1993年11月18日提交的No.08/155,301、1993年12月3日提交的No.08/161,739、1993年12月10日提交的No.08/165,699、1994年3月9日提交的No.08/209,741，其公开的内容在此引为参考。也参见欧洲专利No.0546073B1、国际专利申请No.WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884，其公开内容在此以其全文引为参考。还参见Taylor等，1992；Chen等，1993；Tuaillon等，1993；Choi等，1993；Lonberg等，1994；Taylor等，1994和Tuaillon等，1995；Fishwild等，1996；其公开内容在此以其全文引为参考。
通过使用微小基因座方法已经产生了具有Ig基因座的转基因小鼠。微小基因座方法的优点是包含Ig基因座的部分的构建体可以很快地产生并导入到动物中。但是，相应地，微小基因座方法的一个显著缺点是，从理论上说，通过包含小数量的V、D和J基因所导入的多样性不充分。事实上，发表的工作显然支持了这种担心。通过使用微小基因座方法产生的动物的B细胞发育和抗体生产显得迟缓。因此，围绕本发明进行的研究始终针对导入Ig基因座的大的部分，以便实现更大的多样性，并力图重建动物免疫的全部组成成分。
人类抗小鼠抗体(HAMA)应答已经引导制备嵌合或者说是人源化抗体的工业。尽管嵌合抗体具有人类恒定区和鼠类可变区，但预期可以观察到某些人类抗嵌合抗体(HACA)应答，特别是在抗体的长期或多剂使用中。因此，希望能够提供针对IGF-I或IGF-II的完全人类抗体，以便消除对HAMA或HACA应答的担心和/或影响。
人源化和展示技术
正如在前面就人类抗体产生所讨论的那样，产生免疫原性降低的抗体是有利的。在某种程度上，这可以结合使用人源化技术和使用适当文库的展示技术来实现。应该认识到，鼠类抗体或其它物种的抗体可以使用本技术领域已知的技术进行人源化或灵长动物化。参见例如Winter和Harris，Immunol Today 14：43-46，1993；以及Wright等，Crit.Reviews in Immunol 12：125-168，1992。目的抗体可以通过重组DNA技术进行改造，用相应的人类序列代替CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域(参见WO 92/02190和美国专利No.5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,792、5,714,350和5,777,085)。此外，使用Ig cDNA来构建嵌合的免疫球蛋白基因在本技术领域中也是已知的(Liu等，PNAS USA 84：3439，1987和J.Immunol.139：3521，1987)。从杂交瘤或其它产生抗体的细胞分离mRNA，并用其生产cDNA。目的cDNA可以通过聚合酶链反应使用特异性引物来扩增(美国专利No.4,683,195和4,683,202)。或者，制备并筛选文库，以分离目的序列。然后将编码抗体可变区的DNA序列与人类恒定区序列融合。人类恒定区基因的序列可以在Kabat等(1991)《免疫重要的蛋白序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，NIH publication no.91-3242中找到。人类C区基因可以从已知的克隆容易地获得。同种型的选择可以根据所需的效应功能例如补体固定、或在抗体依赖性细胞性细胞毒性中的活性作为指导。优选的同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。对本发明的抗体来说，特别优选的同种型是IgG2和IgG4。可以使用人类轻链恒定区κ或λ的任一种。然后通过常规的方法表达嵌合的、人源化的抗体。
抗体片段，例如Fv、F(ab′)2和Fab，可以通过完整蛋白的裂解来制备，例如蛋白酶或化学裂解。或者，可以设计截短的基因。例如，编码F(ab′)2片段的一部分的嵌合基因，将包含编码CH1结构域和H链的铰链区的DNA序列，后面跟有翻译终止密码子以产生截短的分子。
在另一种方法中，可以使用编码重链和轻链J区的保守序列来设计寡核苷酸，用作引物在J区中导入适用的限制性位点，用于随后V区片段与人类C区片段的连接。C区cDNA可以通过位点定向诱变进行修饰，以便在人类序列的类似位置上放置限制性位点。
表达载体包括质粒、反转录病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。方便的载体是编码功能完整的人类CH或CL免疫球蛋白序列的载体，带有改造过的适当的限制性位点，以便任何VH或VL序列可以容易地插入和表达。在这样的载体中，通常在插入的J区中的剪接供体位点和人类C区前的剪接接受体位点之间发生剪接，剪接也在人类CH外显子内存在的剪接区域中发生。多聚腺苷化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点上。产生的嵌合抗体可以与任何强启动子连接，包括反转录病毒的LTR，例如SV-40早期启动子(Okayama等，Mol.Cell.Bio.3：280，1983)、Rous肉瘤病毒LTR(Gorman等，P.N.A.S.79：6777，1982)、以及莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等，Cell41：885，1985)、天然1g启动子等。
此外，人类抗体或来自其它物种的抗体可以通过展示类型的技术来产生，包括但不限于噬菌体展示、反转录病毒展示、核糖体展示和其它技术，使用的技术是本技术领域中熟知，产生的分子可以进行进一步的成熟，例如亲和力成熟，这样的技术是本技术领域中熟知的。Wright和Harris，同上；Hanes和Plucthau，PNAS USA 94：4937-4942，1997(核糖体展示)；Parmley和Smith，Gene 73：305-318，1988(噬菌体展示)；Scott，TIBS 17：241-245，1992；Cwirla等，PNAS USA 87：6378-6382，1990；Russel等，Nucl.Acids Research 21：1081-1085，1993；Hoganboom等，Immunol.Reviews 130：43-68，1992；Chiswell和McCafferty，TIBTECH 10：80-84，1992；以及美国专利No.5,733,743。如果使用展示技术生产非人类的抗体，这样的抗体可以按照上面的描述进行人源化。
使用这些技术，可以产生针对IGF-I表达细胞或IGF-II表达细胞、IGF-I或IGF-II或IGF-I或IGF-II形式、其表位或肽的抗体，以及其表达文库(参见例如美国专利No.5,703,057)，该文库在随后可以按照上面的描述筛选上面描述的活性。
其它治疗方法的设计和产生
按照本发明并基于在本文中产生和表征的针对IGF-I或IGF-II的抗体活性，便于设计其它的治疗方法，包括其它的抗体、或抗体之外的其它拮抗剂或化学部分。这样的方法包括但不限于具有类似的结合活性或功能性的抗体，改进的抗体疗法例如双特异性抗体、免疫毒素和放射性标记治疗物、产生肽的治疗物、基因治疗剂特别是胞内抗体、反义治疗物以及小分子。此外，正如上面讨论的那样，本发明的抗体的效应功能可以通过同种型转换成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM而变化，用于各种不同的治疗应用。
对于产生补体固定是所需属性的改进抗体疗法来说，可能可以通过使用例如双特异性物质、免疫毒素或放射性标记物来回避依赖补体杀死细胞。
对于双特异性抗体来说，可以产生这样的双特异性抗体，它们包含(i)两个抗体，一个对IGF-I或IGF-II具有特异性，另一个针对结合在一起的第二种分子具有特异性；(ii)单个抗体，其一条链对IGF-I或IGF-II具有特异性，第二条链特异性针对第二种分子；或(iii)单链抗体，对IGF-I或IGF-II和其它分子具有特异性。这样的双特异性抗体可以使用众所周知的技术来产生，例如对于(i)和(ii)来说，参见例如Fanger等，Immunol Methods 4：72-81，1994和Wright和Harris，同上；对于(iii)来说，参见例如Traunecker等，Int.J.Cancer 7：51-52，1992。
此外，也可以制备“κ体(Kappabodies)”(Ill等，Protein Eng 10：949-57，1997)、“微小抗体(Minibodies)”(Martin等，EMBO J.13：5303-9，1994)、“双抗体(Diabodies)”(Holliger等，PNAS USA 90：6444-6448，1993)或“Janusins”(Traunecker等，EMBO J 10：3655-3659，1991和Traunecker等，Int J Cancer 7：51-52，1992)。
对于免疫毒素来说，可以使用本技术领域熟知的技术对抗体进行修饰以担当免疫毒素。参见例如Vitetta，Immunol Today 14：252，1993。也参见美国专利No.5,194,594。对于制备放射性标记的抗体来说，这样的修饰抗体也可以利用本技术领域熟知的技术来容易地制备。参见例如Junghans等，《癌症的化疗和生物疗法》(Cancer Chemotherapyand Biotherapy)655-686(第二版，Chafier和Longo主编，LippincottRaven，1996)。也参见美国专利No.4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE 35,500)、5,648,471和5,697,902。每种免疫毒素和放射性标记分子都可能杀死表达IGF-I或IGF-II的细胞，特别是本发明的抗体在其中是有效的细胞。
对于产生治疗肽来说，通过利用与IGF-I或IGF-II有关的结构信息和针对它们的抗体例如本发明的抗体(在下面就小分子进行讨论)或筛选肽文库的抗体，可以产生针对IGF-I或IGF-II的治疗性肽。肽治疗物的设计和筛选在Houghten等，Biotechniques 13：412-421，1992；Houghten PNAS USA 82：5131-5135，1985；Pinalla等，Biotechniques 13：901-905，1992；Blake和Litzi-Davis，BioConjugate Chem.3：510-513，1992中讨论。免疫毒素和放射性标记的分子也可以用类似的方式，结合上面关于抗体所讨论的肽部分来制备。
与抗体与抗原的结合相关的重要信息可以通过噬菌体展示实验来收集。这样的实验通常是通过淘选结合本发明抗体的表达随机肽的噬菌体文库完成的，以确定是否可以分离到结合的肽。如果成功，可以从结合的肽收集特定表位的信息。
一般来说，基于噬菌体M13系统，表达随机肽的噬菌体文库可以从New England Biolabs购买(7聚体和12聚体文库，分别为Ph.D.-7肽7聚体文库试剂盒和Ph.D.-12肽12聚体文库试剂盒)。7聚体文库代表了大约2.0×109个独立克隆的多样性，代表了207＝1.28×10-9个可能的7聚体序列中的大部分，如果不是全部的话。12聚体文库含有大约1.9×109个独立的克隆，代表了2012＝4.1×1015个12聚体序列中的潜在序列空间的仅仅非常少的样本。每个7聚体和12聚体文库按照制造商的推荐方法进行淘选或筛选，其中用抗体包被板来捕获适当的抗体(例如用山羊抗人IgG Fc来捕获IgG抗体)，之后清洗。结合的噬菌体用0.2M pH 2.2的甘氨酸-HCl洗脱。经过三轮严紧性恒定(0.5％Tween)的筛选/扩增后，通过使用DNA测序，可以对来自文库的与一种或多种抗体反应的克隆进行表征。肽的反应性可以通过ELISA测定。关于肽的表位分析的进一步讨论也可以参见Scott和Smith，Science 249：386-390，1990；Cwirla等，PNAS USA 87：6378-6382，1990；Felici等，J.Mol.Biol.222：301-310，1991；以及Kuwabara等，NatureBiotechnology 15：74-78，1997。
通过本发明，也便利了通过常规技术进行基因和/或反义治疗物的设计。这样的方式可以用于调节IGF-I或IGF-II的功能。与此相关，本发明的抗体便利了设计和使用与其相关的功能性分析方法。反义治疗物的设计和方略在国际专利申请No.WO 94/29444中进行了详细的讨论。基因治疗的设计和方略是众所周知的。但是，具体来说，使用涉及胞内抗体的基因治疗技术可能证明是特别有利的。参见例如Chen等，Human Gene Therapy 5：595-601，1994和Marasco，Gene Therapy 4：11-15，1997。与基因治疗物相关的总体设计和考虑也在国际专利申请No.WO 97/38137中讨论。编码本发明的抗体(例如mAb、m705、m706、m708和m708.2或其它)的遗传物质可以包含在适当的表达系统中(无论是病毒、减毒的病毒、非病毒、裸露的等)并施用于宿主，以在宿主中体内产生抗体。
本发明中也设想了小分子治疗物。可以在本发明的基础上设计药物以调节IGF-I或IGF-II的活性。从IGF-I或IGF-II分子的结构以及它与本发明中的其它分子例如本发明的抗体IGF-IR等的相互作用获得的知识，可用于合理地设计其它的治疗方式。就此而言，合理的药物设计技术例如X-射线晶体学、计算机辅助(或协助)分子模拟(CAMM)、定量或定性结构-活性关系(QSAR)以及类似的技术，可用于将药物发现的成就集中起来。合理的设计允许预测蛋白或合成结构，该结构可以与用于修饰或调节IGF-I或IGF-II活性的分子或其特定形式发生相互作用。这样的结构可以化学合成或在生物系统中表达。这种方法综述在Capsey等的《遗传工程人类治疗药物》中(Genetically EngineeredHuman Therapeutic Drugs，Stockton Press，NY，1988)。事实上，基于与其它分子(例如本发明中的抗体)的已知的或勾画的结构-活性关系合理地设计分子(肽、肽模拟物、小分子等)，已经普遍变成了常规。参见例如Fry等，Proc Natl Acad Sci USA 95：12022-7，1998；Hoffman等，J Mol Biol 282：195-208，1998；Ginalski等，Acta Biochim Pol 44：557-64，1997；Jouko等，Biochem J 322：927-35，1997；Singh等，J MedChem 40：1130-5，1997；Mandel等，Nat Biotechnol 14：323-8，1996；Monfardini等，Proc Assoc Am Physicians 108：420-31，1996；Furet等，J Comput Aided Mol Des 9：465-72，1995。
此外，可以设计和合成组合文库并用于筛选程序，例如高通量筛选工作。
在转基因小鼠中制备抗体
本发明的抗体优选通过利用转基因小鼠来制备，该小鼠中插入了产生人类抗体的基因组的主要部分，但使其缺乏内源性鼠类抗体的产生。然后，这样的小鼠能够生产人类免疫球蛋白分子和抗体，但缺乏生产鼠类免疫球蛋白分子和抗体。但是，具体来说，小鼠转基因生产以及从其产生的抗体的优选实施方案在1996年12月3日提交的美国专利申请系列号No.08/759,620中公开，其公开内容在此引为参考。也参见Mendez等，Nature Genetics 15：146-156，1997，其公开内容在此引为参考。
通过使用这样的技术，我们生产了针对各种不同抗原的完全人类的单克隆抗体。择要而言，我们用目的抗原免疫了XenoMouseTM系的小鼠，从表达抗体的小鼠回收了淋巴细胞(例如B细胞)，将这些回收的细胞与骨髓类型的细胞系融合，制备永生的杂交瘤细胞系，并对这样的杂交瘤细胞系进行筛选和选择，以鉴定生产特异性针对目的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。我们在本发明中利用这些技术制备特异性针对IGF-I和IGF-II的抗体。在本文中，我们描述了产生特异性针对IGF-I或IGF-II的抗体的多个杂交瘤细胞系的生产。此外，我们提供了这样的细胞系生产的抗体的性质，包括这些抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
从293浮游式(free style)细胞系衍生的抗体mAb m705、m706、m708和m708.2按照本文的描述表达。每种通过上述细胞系生产的抗体是完全的人类IgG1重链和人类IgG1轻链。一般来说，本发明的抗体具有非常高的亲和力，当通过固相或溶液相进行测量时，通常具有从大约10-9到大约10-11M的Kd。
应该认识到，本发明的抗体可以在杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列可用于转化适当的哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。转化可以通过将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法来进行，包括，例如，将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体)中并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或通过本技术领域已知的转染方法，例如在美国专利No.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(这些专利在此引为参考)中的示例。使用的转化方法依赖于待转化的宿主。将异源的多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法在本技术领域中是众所周知的，包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、粒子轰击、在脂质体、肽结合物、树状聚体中包裹多核苷酸，以及将DNA直接微注射到核中。
可以用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本技术领域中是熟知的，包括可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系，包括但不限于中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO0、HeLa细胞、幼仓鼠肾脏(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)，以及许多其它的细胞系。非哺乳动物细胞包括但不限于可用于表达重组抗体的细菌、酵母、昆虫和植物。对抗体CH2结构域进行位点定向诱变以消除糖基化可能是优选的，以防止由于非人类的糖基化导致的免疫原性、药代动力学和/或效应功能的改变。表达方法通过确定何种系统产生最高的表达水平和产生具有组成性IGF-I或IGF-II结合性质的抗体来选择。
此外，生产细胞系表达本发明的抗体(或其它从其产生的部分)可以使用许多已知的技术来增强。例如，谷氨酰胺合成酶和DEFR基因表达系统是在特定条件下增强表达的常用方法。高表达的细胞克隆可以使用常规的技术来鉴定，例如有限稀释克隆和微滴(Microdrop)技术。GS系统在欧洲专利No.0 216 846、0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请No.89303964.4中进行了全面或部分的讨论。
本发明的抗体也可以转基因生产，通过产生免疫球蛋白重链和轻链序列目的序列的转基因哺乳动物或植物，并产生可从中回收的抗体形式来进行。对于在哺乳动物中转基因生产来说，抗体可以在山羊、奶牛或其它哺乳动物的乳汁中生产和回收。参见例如美国专利No.5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。
对于本发明抗体的功能性分析来说，这些抗体被证明是IGF-I或IGF-II及其与IGF-IR结合的强效抑制剂。例如，本发明的抗体如mAbm705、m706、m708和m708.2被证实与IGF-I或IGF-I和IGF-II结合。参见图2。例如，本发明的抗体如mAb m708.2显示出在MCF-7乳腺癌细胞中抑制了IGF-IR的磷酸化。
本发明所证实的结果表明，本发明的抗体具有某些性质，其可以使本发明的抗体比目前的治疗抗体在肿瘤疾病的治疗中更有效地对抗IGF-I或IGF-II。
具体来说，本发明的抗体mAb m705、m706、m708和m708.2具有高度期望的性质。它们的结构特征、功能或活性提供促进了上面讨论的其它抗体或其它分子的设计或选择的标准。
治疗方案
本发明提供了药物组合物，其含有与可药用载体配制在一起的一种或多种抗体组合、例如针对IGF-I或IGF-II的抗体(单克隆、多克隆或单链Fv；完整的或其结合片段)。某些组合物包括多种(例如，两种以上)本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分的组合。在某些组合物中，组合物的每种抗体或其抗原结合部分是与抗原独特的预先选定的表位结合的单克隆抗体或人类序列抗体。
在预防性应用中，给怀疑患有疾病或病症(即肿瘤疾病)或处于该疾病或病症风险中的患者施用药物组合物或药物，其用量足以消除或降低疾病的风险、降低严重性、或延迟发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为学症状、疾病发展过程中其并发症以及中间病理表现型。在治疗性应用中，给怀疑患有或已经患有这样的疾病的患者施用药物组合物或药物，其用量足以治愈、或至少部分遏制疾病的症状(生物化学、组织学和/或行为学症状)，包括疾病发展过程中其并发症以及中间病理表现型。足够实现治疗性或预防性治疗的量被定义为治疗有效或预防有效的剂量。在预防性和治疗性方案中，药剂通常施用数剂，直到产生了充分的免疫应答。通常，监测免疫应答，如果免疫应答开始减弱，则重复使用剂量。
有效剂量
本发明的抗体组合物，例如针对IGF-I或IGF-II的抗体，在治疗本文描述与癌症相关的病症或疾病例如转移癌时的有效剂量，根据许多不同的因素而变化，包括给药的方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人类还是动物、其它用药、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但是也可以治疗非人类的哺乳动物包括转基因哺乳动物。治疗剂量需要滴定，以使安全性和功效最佳。
对于抗体给药来说，剂量范围从0.0001到100mg/kg、更通常0.01到5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案需要每两周用药一次，或每月一次或每3-6个月一次。在某些方法中，两种以上具有不同结合特异性的单克隆抗体同时施用，在这种情况下每种施用的抗体剂量在所指的范围内。抗体通常多次施用。单剂之间的间隔可以是周、月或年。间隔也可以是不规则的，按照所测量的患者血液抗体水平来指示。在某些方法中，将剂量调整到使血浆抗体浓度达到1-1000μg/ml，在某些方法中调整到25-300μg/ml。或者，抗体也可以作为持续释放的制剂给药，在这种情况下需要降低给药频率。剂量和频率根据患者中抗体的半衰期而变化。一般来说，人类抗体显示出最长的半衰期，然后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，可以在较长时期中以相对低的频率施用相对低的剂量。一些患者在其余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的时间间隔使用相对高的剂量，直到疾病的进程降低或终止，并优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。然后，患者可以施用预防性方案。
编码免疫原的核酸的剂量范围从每个患者大约10ng到1g、100ng到100mg、1μg到10mg、或30-300μg DNA。感染性病毒载体的剂量在每剂10-100或更多病毒粒子的范围内变化。
给药途径
诱导免疫应答的抗体组合物，例如针对IGF-I或IGF-II抗体，用于治疗与癌症相关的病症和疾病，例如转移癌，其可以通过肠胃外、局部、静脉、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方式给药，作为吸入物用于抗体制剂靶向脑部病变的预防性治疗，和/或治疗性治疗。免疫原性剂的最典型的给药途径是皮下，尽管其它途径也同样有效。其次最常见的途径是肌内注射。这种类型的注射最典型是在臂部或腿部肌肉内进行。在某些方法中，药剂被直接注射到沉积物要积累的具体组织中，例如颅内注射。肌内注射或静脉内输注对于抗体的给药是优选的。在某些方法中，具体的治疗性抗体被直接注射到颅内。在某些方法中，抗体作为缓释组合物或装置例如MedipadTM装置施用。
本发明的药剂能够任选与至少部分有效地治疗各种不同的疾病包括各种不同的癌症相关疾病的其它药剂组合给药。在肿瘤转移到脑的情况下，本发明的药剂也可以与增加本发明的药剂通过血脑屏障(BBB)的其它药剂结合给药。
制剂
用于诱导免疫应答的抗体组合物，例如针对IGF-I或IGF-II抗体，用于治疗与癌症相关的病症和疾病例如转移癌，通常是作为含有活性治疗剂，即，与各种不同的其它可药用成分的药物组合物施用。(参见《雷氏药物学》(Remington′s Pharmaceutical Science)第15版，MackPublishing Company，Easton，Pa.，1980)。优选的形式依赖于目的给药方式和治疗应用。根据所需的制剂，组合物也可以包含可药用的、无毒性的载体或稀释剂，它们被定义为通常用于配制动物或人类给药的药物组合物的介质。选择稀释剂，使其不影响组合的生物学活性。这样的稀释剂的例子是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲的盐水、林格(Ringer′s)溶液、葡萄糖溶液和Hank′s溶液。此外，药物组合物或制剂也可以含有其它的载体、佐剂或无毒性的、非治疗性的、无免疫原性的稳定剂等。
药物组合物也可以含有大型的代谢缓慢的大分子例如蛋白、多糖如壳聚糖、聚乙酸、聚羟基乙酸和共聚物(例如胶乳功能化的SepharoseTM、琼脂糖、纤维素等)、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和脂类聚集体(例如油滴或脂质体)。此外，这些载体可以作为免疫刺激剂(即佐剂)发挥作用。
对于肠胃外给药来说，本发明的组合物可以作为物质在生理可接受的稀释剂与可药用载体的溶液或悬浮液的可注射剂给药，可药用载体可以是无菌液体例如水油类、盐水、甘油或乙醇。此外，辅助物质例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等也可以存在于组合物中。药物组合物的其它成分是石油、动物、植物或合成来源的成分，例如花生油、大豆油和矿物油。一般来说，多元醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液来说。抗体可以以积存(depot)注射剂或植入制剂的形式给药，它们可以被配制成可以使得活性成分的持续释放。示例性的组合物含有5mg/mL单克隆抗体，配制在由50mM L-组氨酸和150mM NaCl组成的水性缓冲液中，用HCl调整到pH 6.0。
通常，组合物被制备成可注射物，例如液体溶液或悬浮液；也可以制备成适合在注射前溶解或悬浮在液体介质中的固体形式。制剂也可以乳化或包裹在脂质体或微粒例如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物中，以增强上面讨论过的佐剂的效果。Langer，Science 249：1527，1990和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28：97-119，1997。本发明的药剂可以以积存注射剂或植入制剂的形式给药，它们可以被配制成允许活性成分的持续或脉冲式的释放。
适于其它给药方式的其它制剂包括口服、鼻内和肺部制剂、栓剂和透皮敷剂。
对于栓剂来说，粘合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这样的栓剂可以从含有0.5％到10％、优选1％到2％范围的活性成分的混合物形成。口服制剂包含赋形剂、例如药品级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，并含有10％-95％的活性成分，优选25％-70％。
局部敷剂可以产生透皮或皮内投送。局部给药可以通过将药剂与霍乱毒素或其脱毒衍生物或亚基或其它类似的细菌毒素共同给药来促进。Glenn等，Nature 391：851，1998。共同给药可以通过将成分作为混合物或作为通过化学交联或表达为融合蛋白而获得的连接分子进行使用来实现。
或者，透皮投送可以使用皮肤贴剂或使用转移体(transferosome)来实现。Paul等，Eur.J.Immunol.25：3521-24，1995；Cevc等，Biochem.Biophys.Acta 1368：201-15，1998。
药物组合物一般被配置成无菌的、基本上等渗的，并完全符合美国药品与食品管理局的所有良好生产规范(GMP)法规。
诊断应用
本发明的抗体和抗体组合物用作诊断试剂的特征。用于诊断方法以鉴定转移的肿瘤细胞例如转移的乳腺癌细胞的人类抗体，优选使用上面描述的方法来生产。这些方法事实上产生了无限数量的本发明的抗体和抗体组合物，具有对任何所需抗原的任何表位结合特异性和非常高的结合亲和力。一般来说，抗体对其靶的结合亲和力越高，在免疫分析中为除去非特异性结合的物质而不除去靶抗原可以执行的清洗条件越严紧。因此，在上述分析中使用的本发明的抗体和抗体组合物通常具有至少108、109、1010、1011或1012M-1的结合亲和力。此外，期望用作诊断试剂的抗体具有足够的速度(on-rate)，以在标准条件下在至少12小时、优选至少5小时和更优选至少1小时内达到平衡。
在要求了权利的方法中使用的本发明的抗体和抗体组合物优选具有高的免疫反应性，即抗体分子正确折叠以便它们能够与它们的靶抗原特异性结合的百分率。这可以通过将编码抗体的序列如上所述在大肠杆菌中表达来实现。这样的表达通常产生至少80％、90％、95％或99％的免疫反应性。
本发明的某些方法利用了本发明的抗体和抗体组合物的多克隆制剂作为诊断试剂，其它方法使用了单克隆分离物。使用多克隆混合物相对于由一种单克隆抗体制成的组合物来说有许多优点。通过与靶上的多个位点结合，多克隆抗体或其它多肽可以产生比结合单一位点的单克隆抗体更强的信号(用于诊断)。此外，单克隆制剂可以与原型靶序列的大量变异体(例如等位基因变异体、种变异体、株变异体、药物诱导的脱逸变异体)结合，而单克隆抗体可能只与原型序列或其较窄范围的变异体结合。但是，单克隆抗体在存在或可能存在紧密相关的抗原下检测单一抗原是有利的。
在使用按照前述的方法制备的多克隆人类抗体的方法中，制剂通常含有对于目的靶抗原具有不同表位特异性的多种不同的抗体。在使用单克隆抗体的某些方法中，希望含有具有不同表位结合特异性的两种抗体。表位结合特异性的不同可以通过竞争分析来确定。
样品和靶。尽管人类抗体可以用作任何种类样品的诊断试剂，但作为人类样品的诊断试剂最为有用。样品可以从患者的任何组织或体液获得。样品的优选来源包括全血、血浆、精液、唾液、泪液、尿液、粪便物质、汗液、口颊、皮肤和毛发。样品也可以从内部器官的活体组织检查或从癌症获得。样品可以从进行诊断或研究的临床患者获得，或者可以从无病的个体获得，作为对照或用于基础研究。
方法可用于检测任何类型的靶抗原。示例性的靶抗原包括引起人类疾病的细菌、真菌和病毒病原体，例如HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。其它的靶抗原是其表达水平或组成与人类疾病或其它表现型有关的人类蛋白。这样的抗原的例子包括粘附蛋白、激素、生长因子、细胞受体、自身抗原、自身抗体和淀粉样沉积。其它的目的靶包括肿瘤细胞抗原，例如癌胚抗原。其它目的抗原是I类和II类MHC抗原。
用于诊断分析的形式。人类抗体可以以多种不同的标准分析形式用于检测给定的靶。这样的形式包括免疫沉淀、Western印迹、ELISA、放射免疫分析和免疫测量分析。参见Harlow & Lane，同上；美国专利No.3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,879,262、4,034,074、3,791,932、3,817,837、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074和4,098,876，每个在此以其全文并且出于所有目的引为参考。
免疫测量或三明治分析法是优选的形式。参见美国专利No.4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375，每个在此以其全文并且出于所有目的引为参考。这样的分析方法使用了固定在固相上的一种抗体或一群抗体，以及溶液中的另一种抗体或一群抗体。典型情况下，溶液中的抗体或抗体群是标记的。如果使用抗体群，它们通常含有与靶抗原内的不同表位特异性结合的抗体。因此，同一群抗体可用于固相和溶液抗体。如果使用单克隆抗体，具有不同结合特异性的第一种和第二种单克隆抗体被用于固相和溶液相。固相和溶液抗体可以以任何次序或同时与靶抗原接触。如果固定相抗体先接触，分析被称为正向分析。相反，如果溶液抗体先接触，分析被称为反向分析。如果靶与两种抗体同时接触，分析被称为同时分析。在将靶与抗体接触后，将样品温育一段时间，通常在大约10分钟到大约24小时之间变化，通常为大约1小时。然后进行清洗步骤，以除去样品中没有与用作诊断试剂的抗体特异性结合的成分。当固相和溶液抗体在分别的步骤中进行结合时，清洗可以在任何一个或这两个结合步骤之后进行。清洗后，对结合进行定量，通常是检测通过标记的溶液抗体结合而连接到固相上的标记物来进行的。通常，对于给定的一对抗体或一群抗体和给定的反应条件来说，从含有已知浓度的靶抗原的样品制备标准曲线。然后通过内推法从校正曲线读出被测试的样品中抗原的浓度。被分析物可以从平衡时被结合的标记的溶液抗体的量测量，或通过在平衡达到之前的一系列时间点处动力学测量结合的标记溶液抗体进行测量。这样的曲线的斜率是样品中所测量的靶浓度。
用于上述方法的适当支持物包括例如硝酸纤维素膜、尼龙膜以及衍生化的尼龙膜，还有粒子，例如琼脂糖、基于葡聚糖的凝胶、浸试条(dipsticks)、微粒、微球、磁性粒子、试管、微量滴定板、SEPHADEXTM(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway N.J.)。固定化可以通过吸附或通过共价结合。任选抗体可以与接头分子例如生物素连接，用于结合表面结合接头例如亲和素。
标记物
在分析中使用的具体标记物或可检测基团不是本发明的关键方面，只要它不显著干扰分析中使用的抗体的特异性结合就行。可检测基团可以是任何具有可检测的物理或化学性质的物质。这样的可检测标记物在免疫分析领域中已经得到了很好的发展，一般来说，大部分任何可用于这样的方法中的标记物都可应用于本发明。因此，标记物是可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组成。在本发明中有用的标记物包括磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如荧光素异硫氰酸酯、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记物(例如3H、14C、35S、125I、121I、112In、99mTc)其它成像剂例如微泡(用于超声成像、18F、11C、15O(用于正电子发射断层成像)、99mTC、111In(用于单光子发射断层成像)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它在ELISA中常用的酶)，以及量热标记物例如胶体金或彩色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠子。描述了这样的标记物的应用的专利包括美国专利No.3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，每个在此以其全文并出于所有目的引为参考。也参见《荧光探针和研究化学物质手册》(Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals)(第6版)，Molecular Probes，Inc.，Eugene OR.。
标记物可以按照本技术领域熟知的方法直接或间接地与所需的分析成分结合。正如上面指出的那样，可以使用多种多样的标记物，标记物的选择依赖于所需的灵敏度、与化合物结合的容易程度、稳定性要求、可用的仪器以及处置规定。
非放射性标记物通常通过间接方法连接。一般来说，将配体分子(例如生物素)共价连接到分子上。然后将配体与抗配体(例如链亲和素)分子结合，后者或者本身可检测，或者与信号系统例如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物共价连接。可以使用多种配体和抗配体。当配体具有天然的抗配体时，例如生物素、甲状腺素和皮质醇，它可以联合标记的、天然存在的抗配体使用。或者，任何半抗原或抗原性化合物可以与抗体组合使用。
分子也可以与信号产生化合物直接结合，例如通过与酶或荧光团结合。用作标记物的目的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶、特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、7-羟基香豆素等。化学发光化合物包括荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。对于可以使用的各种不同标记或信号产生系统的综述，参见美国专利No.4,391,904，在此以其全文并出于所有目的引为参考。
检测标记物的方法对于本技术领域的专业人员来说是熟知的。因此，例如，当标记物是放射性标记物时，检测工具包括放射自显影中的闪烁计数器或照相底片。当标记物是荧光标记物时，可以通过用适当波长的光激发荧光色素并检测产生的荧光来进行检测。荧光可以通过照相底片、通过使用电子检测器例如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增器等进行目测检测。同样地，酶标记物可以通过提供酶的适合底物并检测得到的反应产物来检测。最后，简单的量热标记物可以简单地通过观察与标记物相关的颜色来检测。因此，在各种浸试条分析中，结合的金通常显示粉红色，而各种结合的珠子显示出珠子的颜色。
某些分析形式不需要使用标记的成分。例如，凝集分析可用于检测靶抗体的存在。在这种情况中，抗原包被的颗粒被含有靶抗体的样品凝集。在这种形式中，成分不需要标记，靶抗体的存在通过简单的目测检查来检测。
通常，IGF-I或IGF-II蛋白和针对IGF-I或IGF-II的抗体，通过与提供可检测信号的物质共价或非共价地连接进行标记。
毒性
优选治疗有效剂量的本文描述的抗体组合物将提供治疗益处而不产生显著的毒性。
本文描述的蛋白的毒性可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物学方法来测定，例如通过测定LD50(群体的50％致死剂量)或LD100(群体的100％致死剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数。从这些细胞培养物分析和动物研究获得的数据可用于调配对人类使用无毒性的剂量范围。本文描述的蛋白的剂量优选位于循环浓度的范围内，包括毒性很低或没有毒性的有效剂量。剂量可以在该范围内根据使用的剂型和采用的给药途径而变化。准确的制剂、给药途径和剂量可以由具体医生根据患者的情况选择(参见例如Fingl等，1975，《治疗的药物学基础》第一章(The Pharmacological Basis ofTherapeutics，Ch.1)。
试剂盒
在本发明的范围内还包括了含有本发明的组合物(例如单克隆抗体、人类序列抗体、人类抗体、多特异性和双特异性分子)以及使用说明书的试剂盒。试剂盒还可以含有至少一种其它试剂，或本发明的一种或多种其它人类抗体(例如与第一种人类抗体不同的抗原中的表位结合的、具有互补活性的人类抗体)。试剂盒通常包含了标签，指示试剂盒中的包含物的目的用途。术语标签包括试剂盒上或与试剂盒一起提供、或者说随着试剂盒提供的任何书写的或记录的材料。
下列在本说明书中描述和下面的实施例中进一步描述的cDNA克隆，将根据布达佩斯公约的要求于____保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209。m705VH的cDNA克隆的ATCC登录号为____，保藏于______。m705VL的cDNA克隆的ATCC登录号为____，保藏于______。m706VH的cDNA克隆的ATCC登录号为.____，保藏于______。m706VL的cDNA克隆的ATCC登录号为____，保藏于______。m708VH的cDNA克隆的ATCC登录号为____，保藏于______。m708VL的cDNA克隆的ATCC登录号为____，保藏于______。m708.2VH的cDNA克隆的ATCC登录号为____，保藏于______。m708.2VL的cDNA克隆的ATCC登录号为____，保藏于______。
根据本公开，其它的实施方案和应用对于本技术领域的专业人员来说是显而易见的。
示例的实施方案
实施例1
针对人类IGF-I的噬菌体展示的人类Fab的筛选
大多数，如果不是所有，现有的针对IGF-II的抗体不是人类的，而通常是小鼠来源的。为了发展针对IGF-II的人类mAb，我们使用了最近开发的、含有1010个不同的噬菌体展示的Fab的天然人类Fab大文库。将重组人类IGF-I与dynal珠结合，用作靶抗原进行抗体文库的淘选。经过三轮淘选之后，使用IGF-I作为靶，通过噬菌体ELISA筛选了200个随机的个体噬菌体克隆。在表现出与IGF-I明显结合并进行了测序的克隆中，3个Fab具有独特的序列s；将它们在细菌中作为可溶性Fab进行表达，纯化，并测试结合活性。两个被命名为m705和m706的Fab只显示出对IGF-I的结合特异性，而一个Fab，m708，在ELISA中显示出了显著水平的与IGF I和IGF II二者的结合，并被选择用于亲和力成熟和表征。
在按照材料和方法中的描述进行轻链改组的m708突变体文库构建后，获得了2x108个独立的克隆。针对结合了IGFI的珠子进行了两轮淘选，通过噬菌体ELISA从第二轮的淘选中筛选出200个克隆，经过DNA测序和ELISA结合测试后鉴定到5个独特的克隆，克隆m708.2显示出对IGF I和IGF II二者的结合活性最高，被选出进行下一步的表征。
表1、具有被鉴定的CDR1、CDR2和CDR3的m705和m706抗体蛋白序列。
m705(IGF-I特异性mAb)
VH
Q V Q L V Q S G V E V K K P G A S V K V P C K A S G Y T F T S Y Y M H W V R Q A P
                                                     CDR1
G Q G L E W M G I I N P S G G S T S Y A Q K F Q G R V T M T R D T S T S T V Y M E L S
                    CDR2
S L R S E D T A V Y Y C A R D D F W S G A V G M D V W G Q G T T V T V S S
                                   CDR3
(SEQ ID NO：1)
VL
D I Q M T Q S P A T L S L S P G E R A T L S C R A S Q D V G S D L A W Y Q Q K P G Q P
                                                      CDR1
P R L L V S D A S N R A T G I P A R F S G S G S G T D F K L T I N S L E P E D S A V Y Y
          CDR2
C Q Q R R R W P P G A T F G G G T K V E I K R
          CDR3
(SEQ ID NO：2)
m706(IGF-I特异性mAb)
VH
E V Q L V Q S G V D V K K P G S S V KV S C K A S G G T F S S Y A I S W V R Q A P G
                                                    CDR1
Q G L E W M G G I I P I F G T A N Y A Q K F Q G R V T I T A D E S A S T A Y M E L S S
                   CDR2
L R S E D T A V Y Y C A S G Y E G P L W A F D I W G Q G T M V T V S S
                               CDR3
(SE Q ID NO：3)
VL
Q A S Q S V L T Q P P S V S A A P G Q R V S I S C S G S S S N I G N Y H V S W Y Q H L
                                                             CDR1
P G R A P K L L I Y D N S K R P S G I P D R F S G S K S G T S A T L D I T G L Q T G D E
                    CDR2
G D Y Y C A T W D T S L R W V F G T G T K V T V L
                 CDR3
(SEQ ID NO：4)
表2、m708和m708.2是针对IGF-I和IGF-II的交叉反应性单克隆抗体。具有被鉴定的CDR1、CDR2和CDR3的VH和VL抗体蛋白序列。
m708
VH
Q V Q L Q Q S G A E V K K P G S S V K V S C K A S G G T F S S Y A I S W V R Q A P G
                                                      CDR1
Q G L E W M G G I I P I L G I A N Y A Q K F Q G R V T I T A D E S T S T A Y M E L S S L
                   CDR2
R S E D T A V Y Y C A R G P R G Y S Y N F D Y W G Q G T L V T V S S
                              CDR3
(SEQ ID NO：5)
VL
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A
                                                     CDR1
P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y
            CDR2
C Q Q S Y S T P S T F G G G T K V E I K R
        CDR3
(SEQ ID NO：6)
m708.2
VH
Q V Q L Q Q S G A E V K K P G S S V K V S C K A S G G T F S S Y A I S W V R Q
                                                        CDR1
A P G Q G L E W M G G I I P I L G I A N Y A Q K F Q G R V T I T A D E S T S T A
                            CDR2
Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R G P R G Y S Y N F D Y W G Q G T L V T V S S
                                         CDR3
(SEQ ID NQ：7)
VL
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I A C R A S Q T I S R Y L N W Y Q Q K P
                                                       CDR1
G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V S S R F S G S G S G T E F T L T I S S L Q P E
                  CDR2
D F A T Y F C Q Q T Y S P P I T F G Q G T R L E I K R
                   CDR3
(SEQ ID NO：8)
表1显示了IGF-I特异性单克隆抗体m705和m706的VH和VL区。每个抗体的CDR区被下划线。表1显示了IGF-I特异性和IGF-II特异性单克隆抗体m708和m708.2的VH和VL区。每个抗体的CDR区被下划线。m708和m708.2的CDR区序列是：VL：QSISS(SEQ ID NO：9)，VL：AAS(SEQ ID NO：10)，VL：QQSYSTPSTF(SEQ ID NO：11)，VH：GGTFSSYA(SEQ ID NO：12)，VH：GIIPILGIA(SEQID NO：13)，和VH：ARGPRGYSYNFDY(SEQ ID NO：14)。
图1显示了针对IGF-I筛选的与IGF-I或IGF-I和IGF-II结合的人类单克隆抗体。m705(No.5)和m706(No.6)与IGF-I反应但不与IGF-II反应。m708(No.8)与IGF-I和IGF-II交叉反应。
图2显示了与IGF-I和IGF-II结合的IgG 708.2的ELISA结合分析。使用m708Fab和m606Fab结合作为对照，显示了m708.2Fab与人类IGF-I和IGF-II的ELISA结合分析。IgG 708.2Fab证实了对IGF-I和IGF-II二者的结合亲和力。IgG 606Fab证实了对IGF-II的结合亲和力。IgG 708Fab证实了对IGF-I的结合亲和力高于它对IGF-II的结合亲和力。
实施例2
抑制IGF-IR和胰岛素受体的磷酸化
图3显示了IgG 708.2在MCF-7细胞中抑制了IGF-IR的磷酸化。MCF-7细胞在无血清培养基中饥饿6小时，然后加入含有1.5nM IGF-I或10nM IGF-II以及标明浓度的IgG708.2的处理培养基。20分钟后将细胞冷却并裂解。将IGF-IR免疫沉淀，使用磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体检测磷酸化的受体。IGF-IR的总量通过使用与免疫沉淀中同样的多克隆抗体来检测。
图4显示了通过针对IGF-I筛选到的人类单克隆抗体抑制IGF-I与可溶性IGF-IR的结合。m705和m708的浓度是400nM。m706的浓度是100nM。IGF-I的浓度是50nM，IGF-II是500nM。
图5显示了在MCF7细胞中，通过抗IGF-II人类抗体IgG1 m708对IGF-II和IGF-I诱导的IGF-IR磷酸化的剂量依赖性抑制。m708的浓度是从0到125nM。IGF-I的浓度是1.5nM，IGF-II是10nM。
图6显示了IgG1m708.2对癌症细胞运动性的抑制。癌症细胞的运动性对于肿瘤的转移是根本的。进行了细胞迁移分析以测试IgGm708.2是否能够抑制MCF-7细胞迁移通过8μm的膜孔。40nmol/L浓度的IgG m708.2在含有5％胎牛血清的培养基中抑制了40％的细胞迁移。
图7显示了通过ELISA分析检测的单克隆抗体m705、m706和m708对IGF-I和IGF-II的结合特异性。数据显示出m705和m706与IGF-I特异性结合，而m708与IGF-I和IGF-II二者结合。
图8显示了单克隆抗体m705、m706和m708在IGF-I和IGF-I受体之间结合的结合竞争。m705、m706和m708每个都显示出在IGF-I和IGF-I受体之间结合的竞争性抑制。
图9显示了单克隆抗体m708.2IgG与IGF-II的结合。m708.2IgG与IGF II的结合亲和力Kd为大约0.8x10-10M。
单克隆抗体m705和m706对于人类IGF-I具有高结合特异性，但不与人类胰岛素结合。单克隆抗体m708和m708.2对人类IGF-I和人类IGF-II具有高的结合特异性，并且不与人类胰岛素结合。
实施例3
材料与方法
噬菌体展示Fab文库的淘选。重组人类IGF I被用于筛选含有1010个独特克隆的人类天然Fab噬菌体文库。Zhang等，J.Virol.78：9233-9242，2004。重组人类IGF I被结合到磁珠上用作文库淘选的靶。10μg抗原被用于第一轮淘选。1012个扩增的噬菌体用于淘选，清洗后，将结合在珠子上的噬菌体直接用于感染指数生长的TG1细胞，并用M13KO7辅助噬菌体拯救。淘选用2μg抗原重复两次，每轮后清洗10次。在第三轮后挑取200个个体菌落，接种到96孔板中的2YT培养基中，用于噬菌体ELISA筛选。
轻链改组的噬菌体展示文库的产生和筛选。原始的人类Fab噬菌体展示文库被用作改组文库中的VL全部组成成分的来源。从原始文库制备的噬粒首先用Nco I和Spe I消化，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳以缺失所有的VH全部组成成分。克隆m708的VH结构域的编码基因通过Stratagene的易错PCR试剂盒进行扩增以导入随机突变，然后通过交叠延伸拼接(SOE)PCR与CH1基因片段融合。将融合的片段用Nco I和Spe I消化，从凝胶中纯化，然后连接到纯化的骨架载体中，产生VL改组的Fab全部组成成分。用连接混合物通过电穿孔转化大肠杆菌TG1细胞。将转化的TG1细胞平铺在含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2YT琼脂板上。在37℃温育过夜后，将所有在平板上生长的菌落刮到5ml 2YT AG培养基中，与1.2ml 50％甘油混合(终浓度为10％)，分成等份，储存在-70℃作为突变文库储液。
针对IGF-I筛选VL改组的文库。文库储液(100μl)在20ml 2YT培养基中生长到对数期，用M13K07辅助噬菌体拯救，在2YT培养基中(含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT)在30℃扩增过夜。将噬菌体制备物在4％PEG、0.5M NaCl中沉淀，重新悬浮在1ml PBS中，作为噬菌体文库储液。按照原始文库淘选中的描述，在结合了人类IGF-I的磁珠上进行两轮生物淘选。
从Fab到IgG1的转变。将pComb3H中的Fab克隆到pDR12中，以允许同时表达重链和轻链。参见，例如，Barbas III等《噬菌体展示实验室手册》(Phage Display，A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001。简单来说，首先通过Xba I和Sac I位点将重链可变区克隆到pDR12中。然后通过HindIII和EcoRI位点将轻链序列(VL+CL)克隆到pDR12中。
Fab和IgG1的表达。用含有Fab序列的pCombIII质粒转化HB2151细胞。将单个新鲜的菌落接种到2YT培养基+100Ag/mL氨苄青霉素+0.2％葡萄糖中。将培养物在37℃以250rpm摇动，直到A600＝0.5。加入异丙基-L-硫代-h-D-半乳糖吡喃糖苷(1mmol/L)以诱导表达。在30℃过夜生长后收获培养物。将细菌以5,000Xg离心15分钟。将沉淀重新悬浮在含有多粘菌素B(10,000单位/mL)的PBS中。通过在室温温育45分钟将可溶性Fab从外周胞质释放出来。提取物以15,000g离心30分钟进行澄清。回收澄清的上清液用于在蛋白G柱子上纯化。
IgG1在293浮游式细胞中表达。按照制造商(Invitrogen)的说明书，使用293Fectin来转染293浮游式细胞。转染4天后，收获培养上清液。在蛋白A柱子上纯化IgG。
ELISA结合分析。抗原以50ng/孔的量在窄孔96孔板上于4℃包被过夜。对于噬菌体ELISA来说，将来自每轮淘选的1010个噬菌体与抗原温育。结合的噬菌体用抗M13-HRP多克隆抗体(Pharmacia，Piscataway，NJ)检测。对于可溶性Fab结合分析来说，使用抗Flag HRP结合物来检测结合。
通过表面等离子体共振测定动力学速度常数和亲和力。通过表面等离子体共振技术，使用Biacore 1000仪器(Pharmacia)，分析了各种不同的Fab与人类IGF I和IGF-II之间的相互作用。使用碳二亚胺偶联化学将IGF I和IGF-II共价固定在传感芯片(CM5)上。制备了对照参比表面用于非特异性结合和折射率变化。对于相互作用的动力学分析来说，以30μL/分钟的流速注射不同浓度的Fab，使用的运行缓冲液含有150mmol/L NaCl、3mmol/L EDTA和0.005％P-20(pH 7.4)。通过使用非线性数据分析程序BIAevaluation 3.2，将结合和解离相数据与1∶1Langumir整体模型同时拟合。所有的实验在25℃进行。
磷酸化分析。将MCF-7细胞以每个孔1.0×106个细胞的量接种到6孔板中的完全生长培养基中。过夜培养后，用无血清DMEM漂洗细胞，然后在无血清DMEM中培养6小时。将细胞与各种不同浓度的重组Fab或IgG温育30分钟，然后加入IGF-II至终浓度为10nmol/L。在某些情况下，抗体与IGF-II被同时加入到培养物中，但是不预先混合。加入IGF II后20分钟，将细胞在冰上激冷，在冷的PBS中漂洗，并在1mL裂解缓冲液[50mmol/L HEPES(pH 7.4)，150mmol/L NaCl，10％甘油，1％Triton X-100，1.5mmol/L MgCl2，2mmol/L钒酸钠，以及蛋白酶抑制剂]中裂解。将裂解物在冰上保持30分钟，然后以.17,000Xg离心30分钟。将上清液用于免疫沉淀：20AL的蛋白G Sepharose4B和2Ag的兔抗IGF-IR h(C-20，Santa Cruz Biotechnologies，SantaCruz，CA)。在深度清洗后，将免疫沉淀物在4％到12％NUPAGE上电泳，转移到聚聚偏氟乙烯膜上，用抗磷酸酪氨酸mAb 4G10成印迹。将膜分成条带，用C-20多克隆抗体重新探测以检测免疫沉淀物中的总IGF-IR，或用C-19检测总胰岛素受体。对于Akt和MAPK使用相似的步骤，只是使用识别磷酸-Akt和磷酸-MAPK的抗体进行Western印迹。
细胞迁移分析。按照制造商(Corning Life Sciences Q5)的说明书，使用带有8μm孔径的聚碳酸酯膜的Transwell培养板。简单来说，底部孔含有2.6mL DMEM，其中含有5％胎牛血清和不同浓度的抗体。含有5％胎牛血清的DMEM和无血清的DMEM被用作阳性和阴性对照。上部插入物中含有1.5mL在无血清DMEM中的0.5×106个MCF-7单细胞悬浮液。将细胞在37℃培养箱中温育。4小时后，将结合到膜的上侧面的细胞用棉球签清除。在膜的下侧面上的细胞用Hema3试剂盒(Fischer)染色。从transwell上取下膜，安放在显微镜载玻片上，在显微镜下对细胞计数。
当在本文中对物理性质例如分子量或化学性质例如化学公式使用范围时，这些范围的所有组合和子组合及其中的具体实施方案都旨在包括在内。
在本文件中引用或描述的每个专利、专利申请和出版物的公开内容，在此以其全文引为参考。
本技术领域的专业人员将会认识到，可以对本发明的实施方案进行大量的改变和修饰，这样的改变和修饰可以在不背离本发明的精神的情况下做出。因此，所附的权利要求旨在覆盖处于本发明的真实精神和范围之内的所有这样的等价变化。

Claims (85)

1.与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的单克隆抗体，在其重链可变区中含有SEQ ID NO：7显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7至少90％同源的氨基酸序列。
2.与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的单克隆抗体，在其轻链可变区中含有SEQ ID NO：8显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8至少90％同源的氨基酸序列。
3.与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的单克隆抗体，在其重链可变区或轻链可变区中分别含有SEQ IDNO：7和8显示的氨基酸序列，或分别至少90％同源的氨基酸序列。
4.权利要求3的抗体，其含有下列的至少一种CDR序列：VL：QSISS(SEQ ID NO：9)，VL：AAS(SEQ ID NO：10)，VL：QQSYSTPSTF(SEQ ID NO：11)，VH：GGTFSSYA(SEQ ID NO：12)，VH：GIIPILGIA(SEQ ID NO：13)，或VH：ARGPRGYSYNFDY(SEQ ID NO：14)。
5.权利要求2的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD或IgE抗体。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgG1κ或IgG1λ同种型。
7.权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgG4κ或IgG4λ同种型。
8.权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD或IgE抗体。
9.权利要求2的抗体，其中所述抗体是IgG1κ或IgG1λ同种型。
10.权利要求2的抗体，其中所述抗体是IgG4κ或IgG4λ同种型。
11.权利要求3的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD或IgE抗体。
12.权利要求3的抗体，其中所述抗体是IgG1κ或IgG1λ同种型。
13.权利要求3的抗体，其中所述抗体是IgG4κ或IgG4λ同种型。
14.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人类、非人类灵长动物、兔、大鼠或小鼠的抗体，或其组合。
15.权利要求2的抗体，其中所述抗体是人类、非人类灵长动物、兔、大鼠或小鼠的抗体，或其组合。
16.权利要求3的抗体，其中的抗体是人类、非人类灵长动物、兔、大鼠或小鼠的抗体，或其组合。
17.权利要求3的抗体，其中所述抗体具有下列特征中的一个或多个：(i)在体外MCF-7乳腺癌细胞分析中，在大约4nM以上的抗体浓度下抑制IGF-1受体的磷酸化；(ii)抑制与IGF-1受体的IGF-I结合或IGF-II结合；或(iii)在细胞迁移分析中抑制细胞的迁移。
18.权利要求3的抗体，当使用重组的人类胰岛素样生长因子I或人类胰岛素样生长因子II作为被分析物和抗体作为配体通过表面等离子体共振(SPR)进行测定时，其解离平衡常数(KD)为大约10-8M以下。
19.权利要求3的抗体，其中所述抗体能够以大约108M-1以上的结合亲和力与人类胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II结合。
20.权利要求3的抗体，其是完整的抗体，完整的IgG1抗体，完整的IgG2抗体，完整的IgG3抗体，完整的IgG4抗体，完整的IgM抗体，完整的IgA1抗体，完整的IgA2抗体，完整的分泌性IgA抗体，完整的IgD抗体或完整的IgE抗体，其中所述抗体在真核细胞中被糖基化。
21.权利要求3的抗体，其是抗体片段或单链抗体。
22.权利要求4的抗体，其是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，包含(i)SEQ ID NO：7显示的可变重链氨基酸序列或与SEQ ID NO：7至少90％同源的可变重链序列，通过接头肽与SEQ ID NO：8显示的可变轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO：8至少90％同源的可变轻链酸序列融合，所述可变重链氨基酸序列与免疫球蛋白铰链区多肽融合，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
23.权利要求3的抗体，其中所述抗体以至少1010M-1的平衡结合常数(Ka)与预定的抗原结合。
24.权利要求3的抗体，其中所述抗体以至少109M-1的平衡结合常数(Ka)与预定的抗原结合。
25.权利要求3的抗体，其中所述抗体以至少109M-1的平衡结合常数(Ka)与预定的抗原结合。
26.权利要求3的抗体，其中所述抗体是单克隆的。
27.权利要求3的抗体，其中所述抗体是F(ab’)2、Fab、Fv或Fd片段。
28.权利要求3的抗体，其中所述抗体是抗原特异性的。
29.分离的人类单克隆抗体，其与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合。
30.权利要求29的抗体，其含有下列的至少一种CDR序列：VL：QSISS(SEQ ID NO：9)，VL：AAS(SEQ ID NO：10)，VL：QQSYSTPSTF(SEQ ID NO：11)，VH：GGTFSSYA(SEQ ID NO：12)，VH：GIIPILGIA(SEQ ID NO：13)，或VH：ARGPRGYSYNFDY(SEQ ID NO：14)。
31.与人类胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类重链可变区中含有SEQ ID NO：1显示的氨基酸序列或与SEQID NO：1至少90％同源的氨基酸序列。
32.与人类胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类轻链可变区中含有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：2至少90％同源的氨基酸序列。
33.与人类胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类重链可变区中含有SEQ ID NO：3显示的氨基酸序列或与SEQID NO：3至少90％同源的氨基酸序列。
34.与人类胰岛素样生长因子I结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类轻链可变区中含有SEQ ID NO：4显示的氨基酸序列或与SEQ IDNO：4至少90％同源的氨基酸序列。
35.与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类重链可变区中含有SEQ ID NO：5显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：5至少90％同源的氨基酸序列。
36.与人类胰岛素样生长因子I和人类胰岛素样生长因子II结合的分离的人类单克隆抗体，在其人类轻链可变区中含有SEQ ID NO：6显示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：6至少90％同源的氨基酸序列。
37.药物组合物，其含有权利要求1的抗体和可药用的载体。
38.药物组合物，其含有权利要求2的抗体和可药用的载体。
39.药物组合物，其含有权利要求31的抗体和可药用的载体。
40.药物组合物，其含有权利要求32的抗体和可药用的载体。
41.药物组合物，其含有权利要求33的抗体和可药用的载体。
42.药物组合物，其含有权利要求34的抗体和可药用的载体。
43.药物组合物，其含有权利要求35的抗体和可药用的载体。
44.药物组合物，其含有权利要求36的抗体和可药用的载体。
45.分离的重组抗IGF-I和抗IGF-II抗体或其抗原结合片段，所述抗体含有人类恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)竞争性抑制m708.2抗体(ATCC登录号为_________)与人类IGF-I和人类IGF-II的结合，以及(ii)在体内以至少1X108升/摩尔的亲和力与人类IGF-I和人类IGF-II的中和性表位结合，以通过表面等离子体共振所测出的结合常数(Ka)表示。
46.权利要求45的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段含有人类恒定区和人类可变区。
47.权利要求45的抗体或抗原结合片段，其含有至少一条人类轻链和至少一条人类重链。
48.权利要求47的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链含有m708.2(ATCC登录号为_______)的轻链的所有抗原结合区。
49.权利要求47的抗体或抗原结合片段，其中所述重链含有m708.2(ATCC登录号为_______)的重链的所有抗原结合区。
50.权利要求47的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链含有m708.2(ATCC登录号为_______)的轻链的所有抗原结合区，并且其中所述重链含有m708.2(ATCC登录号为_______)的重链的所有抗原结合区。
51.分离的重组抗IGF-I和抗IGF-II抗体或其抗原结合片段，所述抗体含有人类恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)含有m708.2抗体(ATCC登录号为_______)的抗原结合区，以及(ii)在体内以至少1X108升/摩尔的亲和力与人类IGF-I和人类IGF-II的中和性表位结合，以通过表面等离子体共振所测出的结合常数(Ka)表示。
52.分离的重组抗IGF-I和抗IGF-II抗体或其抗原结合片段，所述抗体含有人类IgG1恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)竞争性抑制m708.2抗体(ATCC登录号为_______)与人类IGF-I和人类IGF-II的结合，以及(ii)在体内以至少1X108升/摩尔的亲和力与人类IGF-I和人类IGF-II的中和性表位结合，以通过表面等离子体共振所测出的结合常数(Ka)表示。
53.分离的重组抗IGF-I和抗IGF-II抗体或其抗原结合片段，所述抗体含有人类IgG1恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)含有m708.2抗体(ATCC登录号为_______)的抗原结合区，以及(ii)在体内以至少1X108升/摩尔的亲和力与人类IGF-I和人类IGF-II的中和性表位结合，以通过表面等离子体共振所测出的结合常数(Ka)表示。
54.在样品中检测人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的方法，该方法包括：(a)提供样品；(b)将(a)的样品与特异性结合含有人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的多肽的人类单克隆抗体m708或m708.2，在允许多肽配体与人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II结合的条件下进行接触；以及(c)检测抗体m708或m708.2与样品中人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的结合，其中检测到结合表明在样品中存在人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II；从而探明样品中的人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II。
55.在样品中检测人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的方法，该方法包括：(a)提供样品；(b)将(a)的样品与特异性结合含有人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的多肽的人类单克隆抗体m708或m708.2，在允许多肽配体与人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II结合的条件下进行接触；以及(c)检测抗体m708或m708.2与样品中人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的结合，其中检测到结合表明在样品中存在人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II；从而探明样品中的人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II。
56.在样品中检测人类胰岛素生长因子I的方法，该方法包括：(a)提供样品；(b)将(a)的样品与特异性结合含有人类胰岛素生长因子I的多肽的人类单克隆抗体m705或m706，在允许多肽配体与人类胰岛素生长因子I结合的条件下进行接触；以及(c)检测抗体m705或m706与样品中人类胰岛素生长因子I的结合，其中检测到结合表明在样品中存在人类胰岛素生长因子I；从而探明样品中的人类胰岛素生长因子I。
57.分离的核酸，其编码权利要求1、2、31、32、33、34、35或36的蛋白/抗体的重链免疫球蛋白可变结构域序列或轻链免疫球蛋白可变结构域序列。
58.药物组合物，其含有权利要求57的核酸和可药用载体。
59.重组细胞，其含有一种或多种编码权利要求1、2、31、32、33、34、35或的抗体的免疫球蛋白可变结构域序列的核酸。
60.宿主细胞，其含有的第一个核酸序列编码含有抗体的HC可变结构域的多肽以及第二个核酸序列编码含有抗体的LC可变结构域的多肽，其中所述抗体是权利要求1、2、31、32、33、34、35或36的蛋白。
61.制备能够与胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II结合的抗体的方法，所述方法包括将权利要求57的核酸在提供用于所述核酸表达的条件下在宿主细胞中表达，然后回收该抗体。
62.鉴定特异性针对人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的多肽配体的方法，包括：(a)提供噬菌体文库，该文库包含表达候选物人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子I结合多肽的噬菌体；(b)将所述噬菌体文库与人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II蛋白进行接触，以及(c)检测人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II蛋白与噬菌体的结合；从而鉴定特异性针对人类胰岛素生长因子I和胰岛素生长因子II的多肽配体。
63.在哺乳动物对象中治疗肿瘤疾病的方法，其包括给哺乳动物对象施用含有抗体的药物组合物，所述抗体具有SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并以有效减轻或消除哺乳动物对象中的肿瘤疾病的量与胰岛素样生长因子I特异性结合。
64.权利要求63的方法，其中所述抗体与胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II特异性结合。
65.权利要求64的方法，其中所述抗体还含有SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
66.权利要求63的方法，其中所述抗体与细胞毒性剂相连。
67.权利要求66的方法，其中所述细胞毒性剂是细胞毒性药物。
68.权利要求66的方法，其中所述细胞毒性剂是放射性同位素。
69.权利要求63的方法，其中所述肿瘤疾病是实体肿瘤、血液恶性肿瘤、白血病、结肠直肠癌、良性或恶性乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合症、子宫内膜息肉、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫腺肌病、腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或星形母细胞瘤。
70.权利要求69的方法，其中所述肿瘤疾病是所述哺乳动物对象中的肿瘤细胞转移。
71.权利要求70的方法，其中所述肿瘤疾病是所述哺乳动物对象中的乳腺癌转移。
72.在怀疑患有肿瘤疾病或怀疑处于肿瘤疾病风险下的哺乳动物对象中诊断癌症的方法，其包括：
从对象的血液或组织获得测试样品，测试样品含有细胞群体，
提供含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的抗体来检测在细胞群体内的细胞上是否存在IGF-I标志，
对IGF-I标志检测到的细胞群体进行分析以鉴定并表征细胞，在细胞上或细胞中存在IGF-I标志表明在哺乳动物对象中的肿瘤疾病或肿瘤疾病风险。
73.权利要求72的方法，还包括提供含有SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中的氨基酸序列的抗体，以检测在细胞群体内的细胞上或细胞中是否存在IGF-II标志和IGF-I标志，并对通过IGF-I标志和IGF-II标志检测到的细胞群体进行分析以鉴定细胞和表征，在细胞中或细胞上存在IGF-I标志和IGF-II标志表明哺乳动物对象中的肿瘤疾病或肿瘤疾病的风险。
74.权利要求73的方法，其中在样本中的细胞上或细胞中存在IGF-I标志或IGF-II标志表明哺乳动物对象中存在转移癌。
75.权利要求73的方法，其中在样本中的细胞上或细胞中存在IGF-I标志或IGF-II标志表明哺乳动物对象中存在早期癌症。
76.权利要求73的方法，其中在样本中的细胞上或细胞中不存在IGF-I标志和IGF-II标志表明哺乳动物对象中存在无疾病状态或没有可检测的疾病状态。
77.权利要求72的方法，其中在样本中的细胞上或细胞中存在或不存在IGF-I标志或IGF-II标志对癌症治疗或癌症恢复过程中的治疗处理进行监测。
78.权利要求72的方法，其还包含了与抗体相连的成像部分。
79.权利要求78的方法，其中所述成像部分可以通过磁共振光谱、X-射线光谱或正电子发射断层成像(PET)进行成像。
80.权利要求78的方法，其中所述连接是共价键。
81.权利要求78的方法，其中所述连接是非共价键。
82.权利要求72的方法，其中所述肿瘤疾病是实体肿瘤、血液恶性肿瘤、白血病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、子宫平滑肌瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、多囊性卵巢综合症、子宫内膜息肉、前列腺癌、前列腺肥大、垂体癌、子宫腺肌病、腺癌、脑膜瘤、黑素瘤、骨癌、多发性骨髓瘤、CNS癌、神经胶质瘤或星形母细胞瘤。
83.在哺乳动物对象中治疗癌症的药物候选化合物的筛选方法，包括，
给怀疑患有癌症的对象施用治疗有效量的药物候选化合物，
在用药物候选化合物治疗之前和之后，从对象的血液或组织获得测试样品，测试样品含有怀疑含有肿瘤细胞的细胞群体，
提供含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的抗体用于检测在测试样品中的细胞上是否存在IGF-I标志，
对IGF-I标志检测到的细胞群体进行分析，以鉴定药物候选化合物治疗之前测试样品中的肿瘤细胞，与药物候选化合物治疗之后相比较，其中在治疗后样本中存在的肿瘤细胞数量与治疗前样本中肿瘤细胞数量相比降低，表明药物候选化合物在治疗哺乳动物对象的癌症中的有效性。
84.权利要求83的方法，还包括提供含有SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的抗体，以检测在测试样品中的细胞上是否存在IGF-II标志和IGF-I标志，并对IGF-I标志和IGF-II标记物检测到的细胞群体进行分析，以鉴定药物候选化合物治疗之前测试样品中的肿瘤细胞，与药物候选化合物治疗之后相比较，其中在治疗后样本中存在的肿瘤细胞数量与治疗前样本中肿瘤细胞是数量相比降低，表明药物候选化合物在治疗哺乳动物对象的癌症中的有效性。
85.权利要求83的方法，其中所述癌症是转移癌或早期癌。
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