CN101611143B - 将肽递送入胃粘膜的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗与非螺杆菌属细菌相关的疾病的肽递送领域，其中将所述肽体内递送至粘膜。具体而言，本发明涉及用于将肽递送至需要所述肽的动物的粘膜的方法，其包括步骤：i)将编码肽的基因插入编码幽门螺杆菌脲酶的基因以产生符合读框的基因，从而在表达所述符合读框的基因时，所述脲酶功能不受损；和ii)感染所述动物从而使幽门螺杆菌在粘膜建群。

Description

将肽递送入胃粘膜的方法和装置

领域

本发明概括地涉及基于螺杆菌属(Helicobacter)的载体、质粒载体和穿梭载体系统领域，提供包括非螺杆菌属肽的新螺杆菌属构建体。本发明还涉及用于治疗与非螺杆菌属细菌相关的疾病(non-Helicobacter associated disease)的肽递送领域，其中将所述肽体内递送至粘膜。

背景

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是几乎唯一存在于人的胃粘膜中的革兰氏阴性螺旋形细菌。人胃的酸性是基本上所有细菌建群(colonization)的有效屏障，而螺杆菌属菌种是例外。

已经记述了幽门螺杆菌是慢性感染的病原体。具体而言，已经确立螺杆菌属在消化性溃疡、胃腺癌和原发性胃淋巴瘤中扮演关键角色。

幽门螺杆菌具有独特的在人粘膜内建群并保持数十年的能力，不论是否产生粘膜炎性和免疫应答。这种特性使幽门螺杆菌成为一种用于递送肽穿过粘膜的有趣的候选者。然而，这种特殊的应用尚未用于粘膜递送系统，一部分原因是其涉及多种疾病。仍然需要对宿主的病理学风险降低的采用这些重要生物的肽递送系统。

粘膜递送的发展也已经受到常规方法递送的抗原免疫原性不足的阻碍，原因是宿主的天然屏障功能阻止了对粘膜区室的接近。因此，医学技术仍然需要在粘膜表面用于药理学活性分子(诸如肽)的改进的递送机制，其足以引发有用并且有益的免疫应答。这将提供一种用于药理学活性剂的有效的体内递送系统，以及一种用于免疫的有效方法，即，暴露在粘膜表面的抗原足以引发常规的体液和粘膜免疫应答。

内容

本发明致力于战胜上述挑战和与螺杆菌属的使用以及在疾病治疗中的用途相关的其它挑战。本发明列举了多种实施方式和应用，将其中的一些归纳如下。

根据一些方面，提供用于制备和使用基于螺杆菌属的构建体的组合物、方法和系统，所述构建体包含具有启动子区的螺杆菌属序列和编码感兴趣的非螺杆菌属分子的非螺杆菌属序列。在一些实施方案中，将这种构建体描述为载体或质粒载体，其中所述启动子序列能够调控编码感兴趣的分子的非螺杆菌属序列的表达。

螺杆菌属构建体：

在一个方面中，本发明提供包含螺杆菌属构建体的组合物，尤其是包含幽门螺杆菌核酸构建体的组合物。为了将肽递送入胃壁(胃粘膜)，将DNA序列插入幽门螺杆菌脲酶基因之间，从而使所述细菌能够表达编码的肽。

在一些实施方案中，螺杆菌属构建体的螺杆菌属核苷酸序列包含第一螺杆菌属序列Y1、第二螺杆菌属序列Y2和编码感兴趣的非螺杆菌属分子的非螺杆菌属序列X。这种构建体的一个实施方案的示意图在式1中显示：

式1：

------UreA---|----X-----|-----UreA---

感兴趣的非螺杆菌属核苷酸序列“X”可以包含编码感兴趣的肽的核酸序列。在一些实施方案中，所述非螺杆菌属序列X对于幽门螺杆菌菌种是异源的。在一些实施方案中，还可能描述这种感兴趣的分子在作为来自含所述构建体的重组螺杆菌属的表达产物引入动物时，能够为动物提供有益和/或治疗效果。

在一些实施方案中，所述构建体包含限定为天然UreA或UreB基因序列的第一部分的第一螺杆菌属序列Y1，限定为天然UreA或UreB基因的第二部分的第二螺杆菌属序列Y2，和感兴趣的非幽门螺杆菌核苷酸序列“X”。

在一些实施方案中，螺杆菌属构建体包含如图12中所示的构建体。

在其它实施方案中，将螺杆菌属构建体进一步限定为减毒的幽门螺杆菌构建体。

在一些实施方案中，幽门螺杆菌核酸构建体可以进一步包含启动子序列、分泌序列和/或报道基因序列。在具体的实施方案中，提供用螺杆菌属构建体构建体转化的重组细胞。在一些实施方案中，这些重组细胞是重组大肠杆菌细胞或幽门螺杆菌细胞。

在一些方面，含有所述螺杆菌属构建体的基于螺杆菌属的载体和载体质粒构建体包含限定为蛋白质、肽或任何其他分子的感兴趣的药理学活性分子。在一些实施方案中，可以进一步将分离的核酸分子描述为包含cDNA、基因组DNA、RNA或它们的杂交分子。在具体的实施方案中，核酸是cDNA。

作为举例，感兴趣的蛋白质和/或肽可以包括生长素释放肽、支链淀粉、胰岛素、促胃动素、β-葡糖苷酶、化学伴侣分子(chemical chaperone)或其它可用于治疗和/或处理(management)高歇病(Gauchers disease)、细胞消耗(cellwasting)、人免疫缺陷病(AIDS)、食欲抑制(appetite suppression)的分子，可用于治疗糖尿病的制备物，等等。

重组细胞：

在其它方面，提供包含重组细胞的组合物，包含用包括如本文所述的螺杆菌属构建体的质粒载体和/或载体转化的细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞包含编码感兴趣的非幽门螺杆菌药理学活性分子的序列。在其它实施方案中，编码感兴趣的非幽门螺杆菌药理学活性分子的核酸序列包含分泌信号多肽。在一些实施方案中，重组细胞能够在重组细胞表面分泌对应于感兴趣的非螺杆菌属分子的表达产物。在这种方式中，感兴趣的分子的表达产物可以在动物的粘膜表面递送或者穿过动物的粘膜表面递送，所述粘膜诸如肠粘膜。在一些实施方案中所述重组细胞是重组幽门螺杆菌细胞，诸如螺杆菌属菌株26695或B128。

药物制备物：

本发明提供多种药学可接受的制备物，将其配制用于向患者递送，诸如，例如，胃递送、口服递送或鼻内递送。在具体的实施方案中，所述组合物适合于在粘膜表面递送。在具体的实施方案中，所述组合物适合于递送至粘膜表面或内层(lining)。在一些实施方案中，粘膜表面是胃粘膜表面。

提供本文所述的特定类型和比例的特定螺杆菌属细菌、螺杆菌属构建体和其它递送运载体(delivery vehicle)，和制剂领域人员已知的那些配制技术，诸如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第20版，Mack Publishing Company中所述，将该文献具体地通过引用并入本文，可容易地制备组合物的多种递送形式用于实施本发明。

可以预见，所述递送系统可以应用于动物，尤其是灵长类(primates)，包括人，马(equines)，牛(bovines)，羊(ovines)，和啮齿动物(rodents)，鱼(fish)和鸟(birds)。还可以预期，所述制备物可以用于婴儿和成人，以及用于亲本(parentally)或用于向妊娠或哺乳中的哺乳动物施用。可以进一步将所述制备物和方法描述为适合于雄性和雌性动物。

疫茵：

在一些实施方案中，将所述组合物进一步限定为药理学可接受载体溶液中的疫苗。作为疫苗中的部分，将包含螺杆菌属构建体的组合物以如下方式引入动物，使表达的产物，即，感兴趣的分子“X”，能够与动物的粘膜表面接触。作为举例，动物的粘膜表面可以包括胃粘膜、鼻粘膜等。

在一些实施方案中，基于螺杆菌属的疫苗包含用基于螺杆菌的构建体转化的细胞，所述构建体诸如如本文所述的质粒载体。作为举例，用基于螺杆菌属的质粒载体转化的细胞可以包含大肠杆菌细胞或幽门螺杆菌细胞。在一些实施方案中，可以进一步将所述疫苗限定为活的减毒疫苗。在具体的实施方案中，所述组合物将包括佐剂。在一些实施方案中，所述疫苗能够提供感兴趣的非螺杆菌属分子在粘膜表面的递送。

接种/免疫：

在另一方面，提供用于接种动物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用包含疫苗的组合物，所述疫苗包含用如本文所述的基于螺杆菌属的载体和/或质粒载体转化的细胞。在其它实施方案中，所述方法提供有效量的感兴趣的药理学活性分子的递送，所述量足以消除或抑制动物中的疾病或特定的生理和/或病理状况，或足以引发对所述感兴趣的药理学活性分子特异性地免疫应答。

作为举例，所述可以在本发明的疫苗制备物中提供给动物的感兴趣的非螺杆菌属分子可以包含哺乳动物或非哺乳动物蛋白、肽、酶、激素或这些的任意组合。在具体的实施方案中，将感兴趣的分子进一步限定为感兴趣的药理学活性分子，其是感兴趣的人用药理学活性分子。在一些实施方案中感兴趣的药理学活性分子是人病原体分子/抗原，人蛋白抗原，诸如支链淀粉或其类似物(analog)或衍生物，生长素释放肽，或其类似物或衍生物。

在具体的实施方案中，本发明的疫苗提供免疫性和/或提高对人病原体、依波拉病毒(Ebola virus)、HIV病毒、马尔堡病毒(Marburg virus)、流感病毒等的疾病抗性。基于减毒的重组水泡性口炎病毒载体的可复制疫苗(replication competent vaccine)已经由Jones等(2005)⁴³描述，其包括依波拉糖蛋白和马尔堡糖蛋白。因此，根据本发明也可以提供含有本文所述的基于螺杆菌属的载体系统和质粒载体系统的疫苗制备物，其中将这些和其它糖蛋白与人病原体结合。

在另一方面，提供免疫动物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向动物提供包含如本文所述的螺杆菌属疫苗的组合物，和向动物施用足以在该动物中引发可接受的免疫应答的有效量的所述组合物。在一些实施方案中，所述可接受的免疫应答是在治疗方案(treatment regimen)施用时引发的，所述治疗方案包含所述组合物的一个或多个有效剂量。

本发明的说明书中通篇参考以下核酸和氨基酸序列：

SEQ ID NO：1-质粒pHP1的核苷酸序列(2796个核苷酸)+ve链。

SEQ ID NO：2-pHP1的核苷酸序列(2796个核苷酸)-ve链。

SEQ ID NO：3-质粒pHP3的核苷酸序列(3444个核苷酸)。

SEQ ID NO：4-丙型肝炎病毒抗原(HCV)核苷酸序列(580个核苷酸)。

SEQ ID NO：5-来自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的免疫原性编码序列的核苷酸序列135bp(45个氨基酸)。

SEQ ID NO：6-幽门螺杆菌HopE基因表面外露环(在nt504，aa第168位处)的核苷酸序列(1108个核苷酸)。

SEQ ID NO：7-上游引物(29个核苷酸)。

SEQ ID NO：8-下游引物(28个核苷酸)。

SEQ ID NO：9-寡核苷酸引物(15个核苷酸)。

SEQ ID NO：10-幽门螺杆菌插入构建体，即含感兴趣的核苷酸序列“X”的HopE基因的核苷酸序列。(580bp HopE-“X”bp-502bp HopE)。感兴趣的核苷酸序列“X”可以包含编码感兴趣的分子的核酸序列，所述分子诸如感兴趣的有生物学价值的分子。感兴趣的有生物学价值的分子可以包括酶、蛋白质、肽或其它分子，其在作为表达产物递送穿过粘膜表面(诸如胃粘膜)或在粘膜(诸如胃粘膜)表面递送时能够为动物提供有益效果或治疗效果。在一些实施方案中，“X”是包含60个核苷酸碱基至150个核苷酸碱基的核酸序列，或包含69个核苷酸碱基至138个核苷酸碱基的核酸序列。

SEQ ID NO：11-HopE和p60的融合蛋白的核苷酸序列，将p60核酸序列(23个氨基酸)插入HopE序列中的第504位核酸处(对应于氨基酸(aa)第168位)。

SEQ ID NO：12-HopE和HCCA的融合蛋白的核苷酸序列，将HCCA核酸序列(46个氨基酸)插入HopE核酸序列中的第504位核酸处(对应于氨基酸(aa)第168位)。

SEQ ID NO：13-p60的核酸序列(69个核苷酸碱基)。

SEQ ID NO：14-HCCA的核酸序列(138个核苷酸碱基)。

附图简述

本发明将结合附图进行描述，其中：

图1，根据本发明的一个实施方案，说明载体构建体pHPA1(2.8kb)。

图2，根据本发明的一个实施方案，展示质粒构建体pHP3(3.4kb)的示意图。

图3，根据本发明的一个实施方案，说明载体构建体pTM103-8。

图4，根据本发明的一个实施方案，说明柳氮磺胺吡啶(SSN)的化学结构。

图5，根据本发明的一个实施方案，说明使用与染料(Azure-A(天青色-A))缀合的离子交换树脂(Amberlite XE-96)的示意图。

图6，根据本发明的一个实施方案，说明HopE的预测结构，显示感兴趣序列的插入位点，所述感兴趣序列诸如编码HCCA或p60表位的核酸序列。改编自Bina等(Bina and associates)，将该参考文献通过引用具体并入本文。

图7，根据本发明的一个实施方案，说明使用SOE PCR产生的重组DNA分子。将编码HCCA或p60表位的DNA插入hopE中对应于HopE第168位氨基酸的位置。为了允许同源重组并且替换幽门螺杆菌中hopE的基因组拷贝，将与基因组hopE同源的序列包括在表位编码DNA插入位点的两侧。

图8，根据本发明的一个实施方案，提供幽门螺杆菌中重组基因的代表示意图。A栏：将抗原(Ag)编码DNA插入hopE中对应于第168氨基酸的位置，在对应于推定的表面外露环的区域内；B栏：将抗原编码DNA插入cagA，直接在终止密码子上游5’末端；C栏：将B128vacA用编码26695vacA启动子序列、信号序列(ss)、成熟(m)vacA、乘客结构域(passenger domain)和自动转运蛋白(AT)的DNA替换。插入的编码抗原的DNA直接在信号序列的上游。

图9，根据本发明的一个实施方案，提供对含HCCA(B128:HCCA:hopE)的幽门螺杆菌B128(7，13)的Western印迹分析，印迹A：1抗：α-HopE；2抗：α-兔-AP缀合物，泳道1：标记物；泳道2：B128；泳道3：B128:HCCA:hopE；泳道4：B128:p60:hopE。印迹B：1抗(1°antibody)：α-HCCA；2抗(2°antibody)；α-小鼠-AP-缀合物。泳道1：标记物；泳道2：B128:HCCA:hopE；泳道3：B128。印迹C：1抗：α-p60；2抗；α-小鼠-Ap缀合物(2抗)。泳道1：标记物；泳道2：B128:p60:hopE；泳道3：B128。白色箭头指示了对应于HopE或融合蛋白的条带。

图10，根据本发明的一个实施方案，呈现对含有插入HopE中的HCCA的幽门螺杆菌B128(B128:HCCA:hopE)进行的基于免疫荧光的显微分析。上排：相差显微术；下排：荧光显微术。A栏：幽门螺杆菌B128，1抗：α-HopE；2抗；α-兔Alexafluor 488(AF-488)。B栏：幽门螺杆菌B128，2抗；α-兔AF-488。C栏：幽门螺杆菌B 128，1抗：α-HCCA；2抗：α-小鼠AF-488。D栏：幽门螺杆菌B 128:HCCA:hopE，2抗：α-小鼠AF-488。E栏：幽门螺杆菌B128:HCCA-hopE，1抗：α-HCCA；2抗：α-小鼠AF-488。

图11，根据本发明的一个实施方案，呈现对重组幽门螺杆菌26695和B128(7.13)进行的基于全细胞的ELISA分析。A栏：重组体26695:HCCA:hopE或26695:p60:hopE；B栏：重组体B128:HCCA:hopEB128:p60:hopE；检测p60抗原：1抗：α-p60；2抗：α-小鼠-碱性磷酸酶(AP)缀合物；检测HCCA：1抗：α-HCCA；2抗：α-小鼠-AP缀合物。误差棒：SEM(n＝3)。

图12显示用于将抗原插入展示蛋白的潜在位点的位置。

图13显示使用SOE PCR的DNA装配过程。A：用于装配两个扩增子的方案。B：用于装配3个DNA扩增子的方案。

图14显示菌株幽门螺杆菌菌株X47中ureA或ureB的缺失区，用rpsL.ermB表达盒(ref)替换。X47的每个重组体仅含一种插入。

图15显示尿素平板对产生功能性脲酶的菌株的选择性。左侧(有生长)：野生型X47(脲酶阳性)；右侧(无生长)：含破坏UreA和UreB产生的rpsLermB表达盒的X47(脲酶阴性)。

图16显示幽门螺杆菌脲酶的分子结构。

图17显示使用链霉素反选系统转化幽门螺杆菌的方案。

图18显示用于将两个血细胞凝集素表位和FLAG表位符合读框融合(inframe fusion)的插入位点，通过它们相应的编号1a至8标明。还指明了接头和表位之间的小GPSL接头。显示了脲酶操纵子的基因组组成。箭头代表ureA、ureB、ispA和ureI基因。展现的DNA片段的长度用碱基对为单位(bp)表示。

图19显示重组脲酶的Western印迹分析。泳道1：蛋白质分子量标记；泳道2：位点1a；泳道3：位点3；泳道4：位点4；泳道5：位点8；泳道6：位点1a；泳道7：位点3；泳道8：位点4；泳道9：位点8。泳道2-5是1∶6稀释的样品。泳道6-9是1∶2稀释的样品。结果表明FLAG标记的表位出现在脲酶的位点1a、4和8处。在较高的稀释度，无法检出位点3的表位；在这种较高的稀释度表位是可以检出的(分别为泳道3和7)。

图20显示用200μl 10⁹cfu/ml的幽门螺杆菌在第0天胃内免疫的雌性C57BL/6小鼠(n＝5)。73天之后，取小鼠血液并收集血清。通过ELISA测定IgG滴度以测量HA-B细胞表位特异性IgG产生。BHIB表示用生长培养基BHIB免疫的对照组；X47表示用X47野生型幽门螺杆菌免疫的组；Si1a、Si3、Si4和Si8分别是用在插入位点1a、3、4和8表达血细胞凝集素表位的重组幽门螺杆菌免疫的组。黑色实心标记显示幽门螺杆菌建群的小鼠，而白色空心标记表示在73天时未建群的小鼠。

详述

相信本发明可以应用于包括螺杆菌属细菌或基于螺杆菌属的递送载体系统的多种不同类型的细菌和疫苗构建体。在描述本发明之前定义几个术语将是有益的。尽管本发明不必局限于这些应用，但是可以利用本文通过多个实施例的讨论来理解本发明的多个方面。

在详细描述本发明之前，应该理解本发明不具体限于所例举的方法，进而当然可以进行变化。还应该理解本文使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案，并不意欲对只通过所附权利要求书所限定的内容进行限制。

无论在前或在后的本文引用的所有公开文献、专利和专利申请均以其完整形式通过引用并入本文。然而，引用本文提及的公开文献是为了描述和披露该公开文献报道的并且可能结合本发明使用的方案、试剂和载体。不应将本文任何内容解释成承认以下事实，即由于这些内容在本发明之前而使本发明不能得到授权。

此外，除非另有说明，本发明的实施采用本领域技术中的常规免疫学和分子生物学技术和药理学。这些技术是技术工作者所熟知的，并且在文献中有完整的阐述。参见，例如，Coligan等，(Current Protocols in Protein Science(1999)Volume I and II(John Wiley & Sons Inc.)；Sambrook等，(MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd & 3rd Editions.Cold Spring HarborLaboratory press(1989)(2001)；和Bailey，S F.and Ollis，D.F.，BiochemicalEngineering，Fundamentals.McGraw-Hill Book Company，NY，1986。

必须注意的是，本文和所附权利要求中使用的单数形式的“一个”、“一种”和“所述”(该)包括复数涵义，除非上下文清楚地另外说明。因此，例如，“一种核酸”的涵义包括多个这样的核酸，而“一种分离的肽”的涵义是指一个或多个肽等。

除非另有限定，本文使用的全部技术和科学术语的意思与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的意思相同。尽管可以使用任何与本文所述的材料和方法相似或等同的那些来实施本发明，但是现在对优选的材料和方法进行描述。

向动物体内的特定靶位点递送治疗组合物和核酸一直是药物开发产业面临的挑战。本发明开发了基于螺杆菌属的细菌递送系统，其能够携带编码生物学活性剂的载体，其中这些剂在细菌表面表达或从细菌表面分泌。在一个实施方案中，所述细菌是螺杆菌属的菌种幽门螺杆菌。在一些实施方案中，所述幽门螺杆菌菌株可以是本领域已知的任何菌株。在一些实施方案中，所述幽门螺杆菌菌株是非致病性菌株，诸如基因组菌株26695。可以使用的另一菌株是幽门螺杆菌菌株B128，特别是变体7.13。

在另一实施方案中，采用螺杆菌属之外的细菌，其中所述细菌经过遗传变化而使其具有螺杆菌属或幽门螺杆菌特性，包括慢性(chronically)建群在胃粘膜或胃肠道、尿道、支气管上皮或其它粘膜表面的其它区域的能力，同时对宿主不具有显著的毒性。

在一个实施方案中，幽门螺杆菌经过操作从而已经去除和/或削弱了一些致病特性。例如，可以去除空泡细胞毒素和cag致病性岛(cag pathogenicityisland)基因，从而是该幽门螺杆菌致病性较低。可以使用化学的非特异性诱变使用N-甲基-N-硝基-亚硝基胍，或使用重组DNA技术，将减毒突变引入螺杆菌属细菌。

技术人员将认识到，本发明的方法可以用于递送生物学活性剂。合适的剂的实例包括能够在局部或全身发挥功能的剂，例如，能够发挥内分泌活性影响局部或全身代谢的剂，和/或能够调节属于免疫/造血系统的细胞活性的剂，和/或能够影响体内多种正常或赘生性细胞的生存力、生长和分化或影响免疫调节或诱导对损伤和感染的急性期炎性应答的剂，和/或能够增强或诱导针对细胞和组织感染的抗性(所述感染由作用于它们的靶细胞受体的趋化因子所介导)或上皮细胞的增殖或促进伤口愈合的剂，和/或调节体内细胞的物质表达或产生的剂。

这样的生物学活性剂的具体实例包括胰岛素、生长激素、促乳素、黄体生成素、甲状旁腺激素、促生长素抑制素、促甲状腺激素、血管活性肠肽；采用反向平行的4个α螺旋束结构的1类结构细胞因子诸如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、CM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL或IFNα/β；通常结合在细胞表面、形成对称的同源三聚体并且所述亚单位吸取了β-胶冻卷(β-jelly roll)构象(描述过以肿瘤坏死因子(TNF)家族的细胞因子为例的特定病毒的外壳蛋白的所述构象)的2类结构细胞因子，例如TNFα、TNFβ、CD40、CD27或FAS配体、IL-1家族细胞因子、成纤维细胞生长因子家族、血小板衍生的生长因子、转化生长因子β和神经生长因子；包含短链α/β分子的3类结构细胞因子，所述短链α/β分子作为各自在胞外区中含有至少一个EGF结构域的大跨膜前体分子产生，所述3类结构细胞因子例如，表皮生长因子家族的细胞因子、以它们拥有的围绕保守半胱氨酸残基的氨基酸序列为特征的趋化因子(C--C或C--X--C趋化因子亚组)或胰岛素相关的细胞因子；展现镶嵌结构4类结构细胞因子，诸如由不同结构域，例如，EGF、免疫球蛋白样和Kringle结构域构成的调蛋白或神经调节蛋白。

或者，所述生物学活性剂可以是如上定义的生物学活性剂的受体或拮抗剂。

在一些实施方案中，使用基于幽门螺杆菌的载体和/或载体质粒构建体来创建转化的细胞(诸如大肠杆菌细胞或螺杆菌属细胞)，所述细胞允许在施用了该转化的细胞制备物的宿主粘膜上表达和分泌感兴趣的非螺杆菌属药理学活性分子。转化的细胞内所含的分离的核酸分子(或载体)可以包含一种或多种核酸构建体，其中编码感兴趣的药理学活性分子的核酸在幽门螺杆菌调节序列的调控之下。

可以选择或构建含有适当的调节序列的合适的载体和穿梭载体序列，所述调节序列包括启动子序列、终止子片段、增强子序列、标记物基因和其它适合的序列。适当地，载体可以是质粒，病毒，例如噬菌体，或噬菌粒。关于进一步的细节，例如，参见Sambrook等，见上文。已知许多技术和方案用于核酸的操作和蛋白质的分析，例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达方面，如Short Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编辑.，John Wiley & Sons，1992中的详细描述。将上文的Sambrook等和Ausubel等的内容通过引用具体并入本文。

在一些实施方案中，将感兴趣的药理学活性分子的编码序列包含在操纵子中，即，用于多顺反子表达的核酸构建体。在操纵子中，从启动子的转录产生mRNA，所述mRNA包含多于一个编码序列，各自在上游具有其自身的适当定位的核糖体结合位点。由此，能够从单一的mRNA翻译多于一种剂(感兴趣的药理学活性分子)。操纵子的使用使得协同(coordinate)表达感兴趣的药理学活性分子成为可能。

包含感兴趣的药理学活性分子编码序列的核酸构建体或载体优选在用于在幽门螺杆菌中表达的启动子的调控下。

在一个实施方案中，根据本发明使用的启动子在幽门螺杆菌中组成型地表达。组成型启动子的使用避免了对供应诱导物或用于产生表达的其它调节信号的需求。优选地，所述启动子指导的表达以使幽门螺杆菌宿主细胞保持存活的水平进行，即，保留一些代谢活性，即使生长可能降低。那么有利的是，这种表达可以在低水平。例如，当表达产物在胞内积累时，表达的水平可以致使低于细胞蛋白质的约10％，优选大约或低于约5％，例如约1-3％的表达产物的积累。

在一些实施方案中，提供的方法包括向动物递送信使核酸序列，诸如mRNA序列，其对应于编码感兴趣的分子的核酸序列。作为举例，可以制备对应于治疗肽、蛋白质、激素或激素原的信使核酸序列(mRNA)，从而当所述信使核酸序列在动物中表达时为动物提供肽、蛋白质或激素。例如，这样的激素可以是胰岛素，而这样的激素原可以是胰岛素原。由此，可以预见本发明可用作基因治疗方法用于治疗人的疾病，诸如用于治疗糖尿病。

启动子对于使用的幽门螺杆菌菌株可以是同源的，即天然存在于该幽门螺杆菌菌株中的启动子。在一些实施方案中，启动子是阿拉伯糖诱导型启动子。其它启动子包括FlaB σ54启动子(Josenhans等，1998，FEMS Microbiol Lett，161(2)：263-73)、T7启动子和沙门氏菌属的nir B启动子(Chatfield等，1992，Biotechnology，10(8)：888-92)。

在另一实施方案中，启动子是诱导型的。可以与临床等级的载体一起使用的诱导型启动子包括，但不限于，如颁发给Kullen等的美国专利第6,242,194号中所述的诱导型启动子，乳糖诱导型启动子诸如在大肠杆菌质粒中使用的(例如Stratagene的pBluescript^TM)或乳杆菌属中的内源乳糖启动子，和在厌氧生长过程中诱导的启动子，诸如醇脱氢酶(adhE)的启动子，如Aristarkhov等，(1999)J.Bacteriology，178(14)，4327-4332)中所述。

在一个实施方案中，本发明的构建体还包括毒性基因。这些毒性基因优选在诱导型启动子的调控下，所以在处理完成时，能够轻易地通过诱导所述毒性基因的表达来消除螺杆菌属细菌。毒性基因的非限定性实例包括在诱导型启动子调控下的细菌自溶素。通过使用如本文所述的一种或多种诱导型启动子，稍后可以在适当的时间并且在胃肠道中适当的位置触发所述自溶基因。

在一些实施方案中，工程改造的螺杆菌属载体和质粒载体构建体对氧敏感。这种氧敏感性是另一种用于限制本发明的临床等级的载体散播的方法。人消化道(gut)环境的氧非常少，适合于厌氧和微需氧(microacrophulic)微生物包括螺杆菌属细菌的生长。由此，一旦它们通过肠内废物排出而离开人体进入富含氧的外界环境中时，消除螺杆菌属细菌的有效手段是将赋予氧敏感性的基因工程化至转化的微生物中。

本发明的核酸构建体或构建体也可以包含分泌信号序列。因此，在一些实施方案中，编码感兴趣的药理学活性分子(例如，非螺杆菌属多肽)的核酸可以提供用于在细胞膜表面分泌该分子，其中通过适当地将编码分泌信号序列的核酸序列与编码所述分子(多肽)的核酸序列偶联。可以在培养条件下在体外测试含有所述核酸的螺杆菌属细菌分泌多肽的能力，所述培养条件可维持该螺杆菌属细菌的生存力。

合适的分泌信号序列包括在革兰氏阴性生物诸如埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和沙门氏菌属(Salmonella)中具有活性的那些。分泌信号序列包括由一些葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株分泌的葡萄球菌激酶，已知其在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中均有功能(参见“Gene Expression Using Bacillus”，Rapoport(1990)，Current Opinions inBiotechnology，1：21-27)。

能够使用的其它分泌信号序列包括，例如，β-内酰胺酶基因(Talmadge等，1980，Proc.Natl.Acad Sci.USA 77：3369-3373)或肠侵染性大肠杆菌溶血素A(hlyA)(Su等，1992，Microbial Pathogen，13：465-476)。分泌信号序列的示例列表在Pugsley，1988，Protein secretion across the outer membrane ofgram-negative bacteria.In：Protein Transfer and Organelle Biogenesis，R.C.Dand and P.W.Robbins(编辑).Academic Press，Inc.，San Diego，pp 607-652中呈现。

选择性标记为研究人员和技术人员提供了一种在混合群体中分辨转化微生物与未转化微生物的便利手段。鉴定转化生物的一种手段是将选择性标记核酸序列并入含有感兴趣的基因的质粒。通常将选择性标记序列插入感兴趣的基因的下游并且由相同的启动子驱动(drive off)。结果，用感兴趣的基因成功转化的细胞也将转化有选择性标记核酸序列。当使用抗生素抗性作为选择性标记时，只有转化的细胞将会在含有该抗生素的培养基中存活和/或生长。

因此，抗生素抗性是在开发转化体时方便且大量使用的表型。然而，具有抗生素抗性基因作为选择标记的载体能够进行平行基因转移，其能够赋予其它生物抗生素抗性表型。这种风险在使用螺杆菌属作为治疗载体部分时特别严重。

为了使用螺杆菌属细菌作为对动物的基因递送系统，在一些实施方案中，本发明提供一种临床等级的载体系统，其不使用抗生素选择标记。对于使用本发明递送系统提供的抗生素抗性基因而言，可供选择的方式之一包括在“持家”基因中具有染色体缺失或致死突变的临床等级载体。然后，将有功能的类似持家基因插入编码感兴趣的药理学活性分子的质粒。由此，所述持家基因成为选择性标记，允许快速分离和鉴定转化体。

“持家基因”的实例包括编码多种代谢调节物和/或酶的基因，所述酶包括，但不限于激酶、蛋白酶、合成酶、脱氢酶等。对于本发明提供的抗生素抗性基因而言另一种可供选择的方式包括下述临床等级的载体，所述载体将报道基因并入含有编码感兴趣的药理学活性分子的基因的质粒。根据本发明的教导使用的报道基因的其它实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶和淀粉酶。

在一个实施方案中，感兴趣的药理学活性分子具有细胞因子活性。在The Cytokine Facts Rook，Callard and Gearing(1994)，Academic Press中讨论了细胞因子。具有细胞因子活性的优选的分子，诸如多肽是白介素，包括白介素-2(IL-2)和白介素6(IL-6)。

在一些实施方案中，螺杆菌载体和质粒载体系统包含如上所述的引入螺杆菌属细菌或其它合适的宿主细胞以提供转化细胞的核酸构建体。因此，另一方面提供一种方法，包括将公开的核酸引入非致病性螺杆菌属细菌。宿主细胞诸如螺杆菌属细菌的培养物的转化可以使用任何可用的技术。对于幽门螺杆菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体转染。

将质粒载体引入螺杆菌属细胞之后可以例如通过在适合于基因表达的条件下培养幽门螺杆菌来引起或允许从所述核酸进行表达。在用于表达感兴趣的药理学活性分子的条件下在培养基中培养螺杆菌属细菌可以用于验证该螺杆菌属细菌含有编码核酸并且能够产生编码的分子。

在另一方面，本发明提供一种体内递送治疗或预防剂量的生物学活性剂的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明幽门螺杆菌组合物和疫苗的非致病性制备物。

应该理解的是，本发明的方法和如本文所述的非侵染性(non-invasive)或非致病性螺杆菌属细菌的使用提供多种治疗方法，这些方法将使技术人员能够操作，例如，受试者的免疫应答。由此，在一个方面，提供调节细胞或组织的生存、生长、分化、效应子功能或对感染的易感性的方法，包括向受试者施用如本文所限定的非侵染性或非致病性的螺杆菌属细菌。

在另一方面，提供增强免疫应答的方法，所述免疫应答针对聚集在粘膜表面或相邻或远离的组织的肿瘤细胞或感染，该方法包括向受试者施用如本文所限定的非侵染性或非致病性的螺杆菌属细菌。

在另一方面，提供调节针对致病性传染剂的免疫应答类型(由抗体对细胞所介导的(antibody versus cell-mediated))的方法，包括向受试者施用如本文所限定的非侵染性或非致病性的螺杆菌属细菌。

在另一方面，提供调节炎性或肿瘤细胞浸润正常组织的方法，包括向受试者施用如本文所限定的非侵染性或非致病性的螺杆菌属细菌。

在一些方面，提供调控肿瘤细胞的生长速率、侵染速率或存活率的方法，包括向受试者施用如本文所限定的非侵染性或非致病性的螺杆菌属细菌。

在另一方面，提供诱导肿瘤细胞凋亡的方法，包括向受试者施用如本文所限定的非侵染性或非致病性的螺杆菌属细菌。

其它方面提供下调免疫应答的方法，包括向受试者施用如本文所限定的表达感兴趣的药理学活性分子的非侵染性或非致病性细菌。

在另一方面，提供治疗变应性自身免疫或其它免疫失调疾病状态的方法，包括向受试者施用表达感兴趣的药理学活性分子的非侵染性或非致病性螺杆菌属细菌。

所述受试者可以是任何灵长类、马、牛、猪(porcine)、羊、啮齿动物、鱼或鸟。在一个实施方案中，受试者是人。使用可以方便地是鼻内施用或口服。

在治疗的情况下，即，其中感兴趣的药理学活性分子是为受试者提供有益效果的生物学活性剂，所述剂的量和/或治疗方案将优选以“治疗有效量”提供，这足以对受试者显示出益处。这种益处可以是至少改善或降低至少一种症状的严重性或发作。在预防的情况下，所述量可足以降低后续的致病性攻击(challenge)对受试者的有害作用，例如通过增强免疫应答。施用的实际量，以及施用的速度和时程将依赖于施用的目的，例如，考虑到所述攻击的性质和严重性而寻求的生物学效果，并且是常规优化的主题。治疗的处方，包括预防免疫，例如，决定剂量等，在一般从业者和其它医学博士的责任范围内。

可以根据本发明单独施用或与其它治疗组合同时或相继施用包含螺杆菌属细菌的组合物。

本发明还提供包含所公开的螺杆菌属细菌的药物组合物。在一个实施方案中这种药物组合物优选适合于向粘膜施用。

根据本发明且进行使用的药物组合物除了螺杆菌属细菌可以包含，药学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或该领域技术人员熟知的其它材料。这些材料应该是无毒的并且应该不干扰感兴趣的药理学活性分子的效力。所述载体或其它材料的性质可依赖于施用的途径。对于口服施用，可以使用不含致热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性的胃肠外可接受的(parenterallyacceptable)水溶液。具有该领域相关技术的人员完全能够制备合适的溶液。可以按照需要包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。如讨论的，用于根据本发明施用的包含螺杆菌属细菌的药物可以包含一种或多种营养物质，例如，能量源诸如葡萄糖、氨基酸等。在另一方面，提供的药物制剂的制备方法包括将所公开的螺杆菌属细菌与适合于向个体施用的合适的载体介质一起配制。在一个实施方案中，药物适合应用于个体的粘膜。

在另一方面，提供用于药物用途的表达感兴趣的异源药理学活性分子的非致病性螺杆菌属细菌，例如，用于通过外科手术或疗法来治疗人或动物体的方法，包括预防(“免疫”)。

在一个实施方案中，所述方法可以用于治疗、防止或缓和疾病诸如癌症。所述方法和递送系统也可以用于治疗或防止免疫/造血系统的疾病或状况、生殖系统的疾病或状况、肌肉骨骼系统的疾病或状况、心血管系统的疾病或状况、描述为混合胎儿(mixed fetal)的疾病或状况、排泄系统的疾病或状况、神经/感觉系统的疾病或状况、内分泌系统的疾病或状况、呼吸系统的疾病或状况、消化系统的疾病或状况和与结缔组织/上皮组织相关的疾病或状况或由细菌、病毒或寄生物感染引起的疾病或状况。

在另一实施方案中，本文描述的螺杆菌属递送系统能够同时或相继递送多种不同的核酸分子，这些核酸分子编码能够治疗本文所述的多种状况或疾病的产物。此外，优选的递送系统也将递送能够产生其它期望的生理效果(诸如食欲抑制或增强)的组合物。

幽门螺杆菌中自杀系统的实例已经由Panthel等2003(Infection &Immunity，71：109-116)描述。这种系统将含有PhiXl74溶解基因E的质粒引入幽门螺杆菌。为了根除所述菌株，采用5小时的42℃温育。在体内这将意味着动物将消费45-50℃的饮品来将胃环境的温度升高至42℃以上。

第二实例是L-Dap选择系统，通常用于允许细菌突变体在补充平板上存活(参见，例如，Kirata等1997(Infection & Immunity，65：4158-4164))。在这种系统中，动物受试者必需在它们的饮食中补充缺少的底物，即，二氨基庚二酸(DAP)，从而使DapE缺陷型幽门螺杆菌突变体存活。为了根除该突变体，停止DAP消费。

第三个可行的系统涉及幽门螺杆菌因其rdxA基因引起的甲硝基羟乙唑敏感性。过度复制rdxA基因对哺乳动物细胞和大肠杆菌有害。然而，所述细菌可以耐受两倍复制。因此能够工程改造本发明的螺杆菌属菌种以含有两个拷贝的rdxA，这防止正常突变依赖性rdxA丢失。向螺杆菌属基因组引入至少两个功能性rdxA基因将导致对甲硝基羟乙唑永久敏感的螺杆菌属菌株。Jeong等2000(J.Bacteriol.，182：5082-5090)显示由功能性rdxA基因产生的硝基还原酶将甲硝基羟乙唑从前药转化成杀细菌化合物。活性化合物的作用模式是引起螺杆菌属基因组的DNA断裂。

在说明书全文中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或变型诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解成意指包括所示的整数或整数的组，但是不排除任何其它整数或整数的组。

定义：

在介绍本发明之前，介绍一些将在下文使用的术语的定义可能有助于对本发明的理解。

术语“一种”和“所述”(该)用于本说明书意欲包括一个(单数)和多于一个(复数)。

短语“有效水平”是指感兴趣的药理学活性分子的期望活性水平并且不必限定于分子数。例如，通过使用直链淀粉拮抗剂降低支链淀粉的有效水平(作为示例的感兴趣的药理学活性分子)来刺激生长素释放肽分泌，并且受试者中存在的游离支链淀粉量不是必然降低。

本文定义的“抗生素基因”包括有意提供给载体并用作选择系统的异源核酸序列。术语“抗生素抗性基因”不包括将抗生素抗性赋予天然存在的微生物区系生物(micro-flora organism)的其它机制或基因。

术语“减毒的”用于本文例如描述细菌菌株，尤其是大肠杆菌或螺杆菌属菌株诸如幽门螺杆菌，定义为与天然的、野生型细菌菌株相比毒力和/或毒性(侵染性)较低(less virulent and/or toxic(invasive))的菌株。

术语“生物学活性”用于本文是指进行生物学功能的能力，并且在与多肽有关时暗示该多肽采用了一种与其天然构象相同或非常近似的稳定构象(“折叠形式”)。当正确或基本上正确折叠时，例如形成正确的折叠单元α-螺旋、β-折叠、结构域、二硫桥等，多肽应该具有进行其天然功能的能力。通常，多肽中的功能单元是结构域。

“临床等级载体”用于本文是指能够在螺杆菌属或经工程改造而具有螺杆菌属特性的非致病性细菌中表达的质粒或其它表达载体。本发明的临床等级的载体不使用抗生素抗性标记进行选择和/或经过了修饰以防止宿主之外的复制，例如，诸如自杀载体。

“可检测的免疫应答”用于本文是在动物中响应于抗原形成的抗体(体液的)或细胞毒性(细胞的)应答，其能够使用常规实验方法测量，包括，但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫SPOT(ELISPOT)、免疫荧光测定法(IFA)、补体结合测定法(CF)、Western印迹(WB)或它们的等效方法。

“感兴趣的基因”用于本文是指期望表达的任何核酸序列，其编码感兴趣的药理学活性分子，诸如，多肽或蛋白质。所述核酸序列可以包括或可以不包括启动子或其它调节组件。所述载体和质粒载体还包括能够产生反义RNA的构建体。

“基因治疗”用于本文定义为使用重组载体向需要的动物递送感兴趣的基因。感兴趣的基因可以是转基因，其编码治疗或预防性蛋白或多肽，包括，但不限于细胞因子、抗炎剂(anti-inflammatories)、抗增殖剂(anti-proliferative)、抗生素、代谢抑制剂/激活剂和免疫学活性抗原及其片段。此外，“基因治疗”用于本文包括针对遗传和非遗传疾病的基因替换技术。

术语螺杆菌属包括螺杆菌属的全部细菌，包括幽门螺杆菌和鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)。该术语还包括因为能够存在于(reside on)灵长类的胃粘膜和/或能够建立对粘膜慢性但分离(isolated)的感染而与幽门螺杆菌在生物学上相似的细菌。所述术语还包括经过修饰而使其具有幽门螺杆菌特性的细菌，所述特性诸如能够存在于胃粘膜。

“异源”多肽是非天然的或经过突变而不同于螺杆菌属或其祖先中存在的天然形式的肽，即，不由螺杆菌属细菌或其祖先天然表达或在引入螺杆菌属细菌或其祖先之前不由螺杆菌属细菌或其祖先表达的肽。

“宿主”用于本文定义本发明的治疗性化合物的预期受体。宿主包括所有动物。具体而言，宿主包括，但不限于，灵长类(包括人)、牛、马、犬(canine)、猫(feline)、猪、羊、兔(rabbit)、啮齿动物、鸟和鱼。

“免疫学惰性的(inert)”用于本文应该是指在其宿主中不激发显著的免疫应答的任何物质，包括微生物诸如微生物区系。本文使用的免疫学惰性材料的实例包括不锈钢、生物相容性聚合物诸如聚-L-丙交酯、医疗剂塑料和本发明的微生物区系生物。

“插入构建体”，如用于本文，将意指包含一部分的幽门螺杆菌核酸序列，诸如一部分的编码HopE基因的核酸序列，和编码感兴趣的分子的非螺杆菌属核酸序列的核酸构建体。

“分离的核酸”是这样的核酸序列，其与任何天然存在的核酸或与跨越超过三个单独的基因的天然存在的基因组核酸序列的任何片段不相同。因此所述术语涵盖，例如，(a)DNA分子，其具有天然存在的基因组DNA分子的部分的序列，但是在所述部分序列的两侧不是在天然存在它的生物基因组中在该分子这部分两侧的两个编码序列；(b)并入载体或原核生物或真核生物的基因组DNA的核酸，并入的方式使所得分子不同于任何天然存在的载体或基因组DNA；(c)单独的分子，诸如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制片段；和(d)作为杂交基因的一部分的重组核苷酸序列，即，编码融合蛋白的基因。

两个氨基酸序列或两个核酸的“百分比同一性”(同源性)利用Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268，1990的算法来测定，所述算法在Karlin和Altschul (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993)中得以改进。将这种算法整合入Altschul等(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，分值(score)＝100，词长(wordlength)＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，分值＝50，词长＝3，以获得与参照多肽(例如，SEQ ID NO：2)同源的氨基酸序列。为了获得带缺口(gapped)的比对来进行比较，利用在Altschul等(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)中介绍的Gapped BLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。

“药理学活性”分子，用于本发明的说明书中定义为分子，诸如肽、蛋白质、核酸或其它有机或无机物质，所述分子能够在细胞中，诸如在细胞培养物中，或在化学或生物化学反应介质或测定法中，或在动物中，引起药理学可检测的活性或应答。本发明的感兴趣的药理学活性分子可以包括，例如，如本文所述的生物学活性分子。

“感兴趣的分子”用于本发明的说明书中定义为蛋白质、肽或其它分子，当提供给细胞或动物时，其提供能够修正和/或治疗病状(pathology)、缺陷或其它认为适当的状况的蛋白质、肽、酶或其它分子，诸如在疾病的治疗中。

术语“报道基因”用于本文时是并入(或邻接)编码感兴趣的药理学活性分子的异源核酸序列中的核酸序列，其为表达感兴趣的分子的转化载体提供可识别的表型。报道基因的非限制性实例包括GFP、β-半乳糖苷酶、淀粉酶和CAT。

“筛选标记”用于本文是指提供给根据本发明的教导制备的转化载体的鉴定特征(表型)。在本发明的一个实施方案中，所述筛选标记是报道基因。

“选择性标记”、“选择性基因”、“报道基因”和“报道标记”(本文称作“选择性标记”)用于本文是指编码表型性状的核酸序列，所述表型性状允许快速鉴定和分离转化的细菌载体。通常而言，认为是“临床等级”和根据本发明的教导制备的细菌载体是具有不编码抗生素抗性的选择性标记的那些载体。

“显著的免疫应答”是将在动物中针对给定的抗原性分子或免疫原提供免疫性(即，引起特定抗体产生)的任何免疫应答。

如本文所述的感兴趣的药理学活性分子或所述分子的组合的“治疗有效量”应理解为包含有效地引起期望的应答但是不足以引起毒性反应的量。期望的应答，例如，可以在血样中构成充足的和/或可接受的可检测抗体效价水平的形成。有待向受试者施用的制备物的剂量和治疗持续时间将由主治需要治疗的受试者的保健专业人员决定，并且将考虑该受试者的年龄、性别、重量、现患疾病状态的程度和/或组织损伤，以及对受试者进行治疗所用的螺杆菌属细菌和感兴趣的基因的特定制剂产品。

“转基因”用于本文时指使用cDNA技术插入细胞中的基因，所述插入是以确保其作为正常基因的功能、复制和传递的方式而进行的。

“转化性核酸序列(transforming nucleic acid sequence)”用于本文是指包含编码感兴趣的药理学活性分子的核酸序列的质粒，或其它的表达盒。在本发明的一些实施方案中，核酸序列能够编码一种或多种治疗剂。“转化性核酸序列”也可以用来指“转基因”。在本发明的另一实施方案中，转化性核酸序列包括编码启动子和/或其它调控元件的核酸序列。

术语“癌症”用于本文时指瘤性(neoplastic)疾病(例如，白血病，癌和“过度增生性病症(hyper-proliferative disorders)”)。肿瘤可以位于选自下组的组织中：结肠、腹部、骨、乳房(胸部)、消化系统、肝、胰、前列腺、腹膜、肺、血液(例如，白血病)、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、子宫、眼、头和颈、神经(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸(thoracic)、和泌尿生殖器。

在一个实施方案中术语“癌症”还包括选自下组的肿瘤前的状况(pre-neoplastic condition)：增生(例如，子宫内膜增生)，组织变形(例如，结缔组织变形)和/或发育不良(例如，宫颈发育不良和支气管肺发育不良)。

在另一实施方案中，术语“癌症”还包括选自：良性肿瘤，纤维囊性病症和组织肥大的良性增生异常型病症。

术语“免疫/造血系统的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：贫血症、全血细胞减少症、白血球减少症、血小板减少症、白血病、霍金斯(Hodgkin’s)病、非霍金斯淋巴瘤、急性淋巴细胞贫血症(ALL)、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤、关节炎、哮喘、爱滋病(AIDS)、自体免疫疾病、类风湿性关节炎、肉芽肿疾病、免疫缺陷、炎症性肠病、脓毒病、中性白细胞减少症、中性白细胞增多症(neutrophilia)、银屑病(psoriasis)、对于移植器官和组织的免疫反应、系统性红斑狼疮、血友病、高凝性(hyper-coagulation)、糖尿病、心内膜炎、脑膜炎、莱姆病、乳糜泻(谷蛋白敏感)和变应性(allergies)。

术语“生殖系统的疾病或状况”用于本文时指选自下组的疾病或状况：隐睾病、前列腺炎、腹股沟疝、精索静脉曲张、间质细胞瘤(leydig cell tumor)、疣状癌、前列腺炎、软化斑、佩罗尼氏病(Peyronie’s disease)、阴茎癌、扁平细胞增生、痛经、卵巢腺癌、特纳(Turner’s)综合征、粘液脓性宫颈炎、Sertoli-Leydig瘤、卵巢癌、子宫癌、骨盆炎症性疾病、睾丸癌(testicular cancer)、前列腺癌、格来弗德氏(Klinefelter’s)综合征、Young′s综合症、早泄、糖尿病、囊性纤维化、Kartagener’s综合症、睾丸萎缩、睾丸雌化、无睾、睾丸异位、附睾炎、睾丸炎、淋病、梅毒、睾丸扭转(testicular torsion)、输精管结节(vasitisnodosa)、生殖细胞瘤、生殖细胞索基质瘤(stromal tumor)、痛经、子宫后倾(retroverted uterus)、子宫内膜异位、纤维瘤、子宫内膜异位、无排卵出血、闭经、库兴氏综合征、葡萄胎、阿谢曼氏(Asherman’s)综合征、过早绝经、性早熟、子宫息肉、功能性子宫出血、宫颈炎、慢性子宫颈炎、粘液浓性宫颈炎、子宫颈非典型增生、宫颈息肉、纳博特氏囊肿(Nabothian cysts)、子宫颈糜烂、宫颈机能不全、颈赘生物、假两性畸形和经前期综合征。

术语“肌肉骨骼系统的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：骨癌(例如，骨软骨瘤、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、巨细胞瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤)、培吉特氏病(Paget’sDisease)、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、骨髓炎、莱姆病、痛风、粘液囊炎、腱炎、骨质疏松症、骨关节炎、肌营养不良、线粒体肌病、恶病质和多发性硬化。

术语“心血管系统的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：粘液瘤、纤维瘤、横纹肌瘤、心血管异常(例如，先天性心脏缺陷、大脑动静脉畸形、中隔缺损)、心脏病(例如，心力衰竭、充血性心脏病、心律不齐、心动过速、纤维性颤动、心包疾病、心内膜炎)、心动停止、心瓣膜疾病(例如，狭窄、回流、脱垂)、血管病(例如，高血压、冠状动脉病、心绞痛、动脉瘤、动脉硬化、外周血管疾病)、低钠血、高钠血、低钾血和高钾血症。

术语“混合胎儿的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：脊柱裂、积水性无脑畸形、神经纤维瘤、胎儿乙醇综合征、糖尿病、PKU、唐氏(Down’s)综合症、派陶综合征(Patau syndrome)、爱德华斯氏综合症、特纳综合征、阿佩尔综合征(Apert syndrome)、卡彭特综合征(Carpentersyndrome)、康雷迪综合征、Crouzon综合征、皮肤松弛症、科妮利亚德兰吉综合征(Cornelia de Lange syndrome)、艾-范二氏综合征(Ellis-van Creveldsyndrome)、霍-奥二氏综合征(Holt-Oram syndrome)、卡塔格内综合征(Kartagener syndrome)、麦格二氏综合征(Meckel-Gruber syndrome)、农南综合征(Noonan syndrome)、Pallister-Hall综合征、鲁泰二氏综合征(Rubinstein-Taybi syndrome)、弯刀综合征(Scimitar syndrome)、史-里-奥三氏综合征(Smith-Lemli-Opitz syndrome)、血小板减少-桡骨缺损(TAR)综合征、特-柯二氏综合征(Treacher Collins syndrome)、威廉姆氏综合征(Williamssyndrome)、赫希施普龙氏病(Hirschsprung disease)、美克尔氏憩室(Meckel’sdiverticulum)、多囊肿肾病、特纳综合征、和性腺发育不全、克-费二氏综合征(Klippel-Feil syndrome)、成骨不全(ostogenesis imperfecta)、肌肉萎缩、台-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、维尔姆斯瘤(Wilm’s tumor)、神经母细胞瘤，和视网膜母细胞瘤。

术语“分泌系统的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：膀胱癌、前列腺癌、良性前列腺增生、膀胱病症(例如，尿失禁、尿潴留、尿路梗阻、尿路感染、间质性膀胱炎、前列腺炎、神经原性膀胱、血尿症)、肾病症(例如，肾积水、蛋白尿、肾衰竭、肾盂肾炎、尿石病、逆流性肾病和单侧梗阻性尿路病)。

术语“神经/感觉系统的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：脑癌(例如，脑干神经胶质瘤、脑瘤、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤和大脑星形细胞瘤、神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、帕金森氏病(Parkinson’s Disease)和特发性早老性痴呆(Idiopathic Presenile Dementia))、脑脊髓炎、脑型疟、脑膜炎、新陈代谢型脑病(例如，苯丙酮酸尿和丙酮酸羧化酶缺陷)、小脑共济失调、共济失调性毛细血管扩张和爱滋病性痴呆综合征、精神分裂症、注意力缺损病(attention deficit disorder)、亢进性注意力缺损病(hyperactive attention deficit disorder)、孤独症和强制性障碍(obsessivecompulsive disorders)。

术语“呼吸系统的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：呼吸系统癌症诸如喉癌、咽癌、气管癌、会厌癌、肺癌、鳞状细胞癌、小细胞(燕麦形细胞)癌、大细胞癌、腺癌、过敏反应、囊性纤维化、结节病、组织细胞增多病X、浸润型肺病(例如，肺纤维化和淋巴样间质性肺炎)、阻塞性气道病(例如，哮喘、肺气肿、慢性或急性支气管炎)、职业性肺病(例如，石末沉着病(silicosis)和石棉沉着病)、肺炎和胸膜炎。

术语“内分泌系统的疾病或病症”用于本文是指选自下组的疾病或状况：内分泌组织和器官的癌症(例如，下丘脑、脑垂体、甲状腺、甲状旁腺、胰腺、肾上腺、卵巢，和睾丸的癌症)、糖尿病(例如，尿崩症、I型和II型糖尿病)、肥胖症、涉及脑垂体的病症(例如，垂体机能亢进、垂体机能减退，和垂体性矮小症(pituitary dwarfism))、甲状腺机能减退、甲状腺机能亢进、甲状腺肿、生殖疾病(例如，男性和女性不育)、涉及肾上腺的病症(例如，艾迪逊氏病、皮质类固醇缺陷症和库兴氏综合征)、肾癌(例如，hypermephroma、移行细胞癌和威尔姆斯瘤)、糖尿病型肾病、间质性肾炎、多囊肿肾病、肾小球肾炎(例如，IgM肾小球系膜增生性肾小球肾炎和由自身免疫病症引发的肾小球肾炎(glomerulonephritis)；如古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′ssyndrome))和肾钙沉着症。

术语“消化系统的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：溃疡性结肠炎、阑尾炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、肝炎、肝性脑病、门静脉高压症、胆石病、消化系统癌症(例如，胆道癌、胃癌(stomach cancer)、结肠癌、胃癌(gastric cancer)、胰腺癌、胆管癌、结肠肿瘤(例如，息肉或癌症)和硬化症)、胰腺炎、溃疡疾病、幽门狭窄、肠胃炎、胃炎、胃萎缩、良性十二指肠瘤、膨胀、过敏性肠综合征、吸收障碍、先天性小肠病、细菌和寄生虫传染、巨结肠、赫希施普龙氏病(Hirschsprung’s disease)、无神经节性巨结肠、获得性巨结肠、结肠炎、肛门直肠病症(例如，肛瘘、痔)、先天性肝病(例如，威尔逊病(Wilson’s disease)、血色素沉着病、囊性纤维化、胆道闭锁和阿尔法1-抗胰蛋白酶缺陷症)、门静脉高血压、胆石病，和黄疸。

术语“结缔/上皮的疾病或状况”用于本文是指选自下组的疾病或状况：结缔组织变形、混合结缔组织病、局灶性上皮增生、上皮化生、粘膜上皮发育异常、移植物对抗宿主的疾病、多肌炎、囊性增生、大脑发育异常、组织肥大(tissue hypertrophy)、阿尔茨海默氏病、淋巴组织增生病症、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstron′s macroglobulinemia)、克罗恩氏病、恶性贫血、特发性艾迪逊氏病(idiopathic Addison’s disease)、肾小球肾炎、大疱性类天疱疮、斯耶格伦氏综合征(Sjogren′s syndrome)、糖尿病、囊性纤维化、骨母细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、骨质疏松症、osteocarthritis、牙周病、伤口愈合、复发性多软骨炎、脉管炎、多发性结节性动脉炎、多发性肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、蜂窝织炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮、硬皮病、CREST综合征、多肌炎、皮肤肌炎、混合结缔组织病、复发性多软骨炎、脉管炎、亨-舍二氏综合征(Henoch-Schonlein syndrome)、结节性红斑、多发性结节性动脉炎(polyarteritisnodosa)、暂时性(巨细胞)动脉炎、高安氏动脉炎(Takayasu’s arteritis)、多发性肉芽肿病、莱特尔氏综合征(Reiter’s syndrome)、贝切特氏综合征(Behcet’ssyndrome)、关节强硬性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、蜂窝织炎、瘢痕瘤、埃-当二氏综合征(Ehler Danlos syndrome)、马方综合征(Marfan syndrome)、弹性假黄色瘤、成骨不全、软骨发育不良、大疱性表皮松解、阿尔帕特综合征(Alport syndrome)和皮肤松弛症。

短语“生长素释放肽相关的疾病和状况”指任何能够通过调节生长素释放肽活性来治疗预防或减轻的状况。这些包括由生长素释放肽增强、加剧或刺激的病症，例如，生长激素释放或驱使进食(drive to eat)。生长素释放肽的生理作用被认为包括，例如，刺激生长激素释放，刺激泌乳细胞和促肾上腺皮质素细胞分泌激素，促进食欲和心血管作用，抗甲状腺和乳腺癌(breasttumor)增生作用，以及通过迷走神经介导调节胃活动性和酸分泌。(见WO2005021026)。

当术语的定义背离通常所用的术语意义时，申请人意在采用本文提供的定义，除非明确指出。

现在本发明将仅参考下面的非限制性实施例来进一步进行描述。然而，应该理解的是，下面的实施例是举例说明性的并且决不应该将其视为对本文所述发明的共性的限制。具体而言，尽管本发明详细描述了具体的幽门螺杆菌菌株的应用，显而易见的是本文的发现不受限于该菌株。

实施例1.用于稳定表达外源蛋白质的载体和转基因幽门螺杆菌生物

对幽门螺杆菌的遗传操纵是不常见的。本实施例证实了本发明提供遗传转化的螺杆菌属细菌，特别是转化的幽门螺杆菌的应用。使用源自螺杆菌属细菌的质粒和质粒载体制备转化的细菌，以前在非螺杆菌属生物诸如大肠杆菌的操作中，已经将这作为了研究的对象。

可以将在文献中所述的几种幽门螺杆菌质粒成功地转化到幽门螺杆菌/大肠杆菌穿梭载体中。已经报道了许多大肠杆菌菌株对于DNA吸收天然是有活性的。还已经将对于链霉素、利福平和甲硝唑的抗性标记成功转化到大多数幽门螺杆菌的菌株中。然而，尽管可以将来自大肠杆菌和其它生物的质粒DNA引入幽门螺杆菌中，但是不能稳定地维持这些质粒。而且，不能将幽门螺杆菌质粒转化到大肠杆菌或螺杆菌属菌种中。因此，必须构建幽门螺杆菌穿梭载体。

在图1和2中所显示的示意图中举例说明了来自幽门螺杆菌的两个质粒。已经对载体pHPAI(2.8kb)(图1)和pHP3(3.4kb)(图2)进行了测序，并且揭示了pHPAI通过θ(theta)质粒复制模式进行复制。与滚环复制质粒相反，在复制过程中θ质粒不产生单链DNA中间体，并且因此是更稳定的载体候选物，因为它们不易发生不正常的重组。此外，pHPAI的复制起点(ori)包含一系列的涉及复制控制和维持稳定的拷贝数的定向重复序列(称为“重复子”)。载体pHP3共享许多这样的特征。在下面显示了这两个载体的核苷酸序列。

以双链形式显示质粒pHP1(上面的链是(+链)SEQ ID：1；下面的链是(-链)SEQ ID NO：2)

GTCATGCGCGTTGTTTTTAATTACATTTTAAACAACTTGTTGTTGTTTTTACATGTTTTACTCGC    65

CAGTACGCGCAACAAAAATTAATGTAAAATTTGTTGAACAACAACAAAAATGTACAAAATGAGCG

ATGCGCGCGCGTGAGGGATTGGGGGTTGCAACCCCCTAAATAACGAAGCTGTAGGGTTTCTCATT    130

TACGCGCGCGCACTCCCTAACCCCCAACGTTGGGGGATTTATTGCTTCGACATCCCAAAGAGTAA

TTTGTGGTGAAAATGAATAAAACAGAACTTCTTGCCAACACTAACAGAACTTCTTGCCAACACTA    195

AAACACCACTTTTACTTATTTTGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAACGGTTGTGAT

ACAGAACTTCTTGCCAACACTAACAGAACTTCTTGCCAACACTAACAGAACTTCTTTATTTTAAA    260

TGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAAATAAAATTT

GTTATGATTATTAACAATTTTTAGACATAATAACAGCGTGTGAAGATACTTTTGTAGCGGTATTT    325

CAATACTAATAATTGTTAAAAATCTGTATTATTGTCGCACACTTCTATGAAAACATCGCCATAAA

CCTATGTGCGGCAAAATTTGGAGCAATTAGCTTGACTTGGTTGAGTTAGTGGGTTGGAGGATAGA    390

GGATACACGCCGTTTTAAACCTCGTTAATCGAACTGAACCAACTCAATCACCCAACCTCCTATCT

GAGGGCGACACCTCGTTAGGAGGTATCAATGTGAAAGTATTTGTCGTATTAGTTCTAGTATTAGT    455

CTCCCGCTGTGGAGCAATCCTCCATAGTTACACTTTCATAAACAGCATAATCAAGATCATAATCA

AATTCTCGCACAATTGCTATATTAGGCTTATTCGTGGTCTAACCCCTTGTTTATGGGGGTTGGCT    520

TTAAGAGCGTGTTAACGATATAATCCGAATAAGCACCAGATTGGGGAACAAATACCCCCAACCGA

CGTTATAAGCATACTGATACGATCACACTTATTATACACCAAAAGATAAGGAGTATAGAGTGGAA    585

GCAATATTCGTATGACTATGCTAGTGTGAATAATATGTGGTTTTCTATTCCTCATATCTCACCTT

TTTGATCAATCAGATTTACAAAAAGCGTTGAAAATATTAGATACACTCCCACAAACCCCACAAAT    650

AAACTAGTTAGTCTAAATGTTTTTCGCAACTTTTATAATCTATGTGAGGGTGTTTGGGGTGTTTA

TGAGCTACAAAAACAAGAAATACAAAACCGCATCAACAAAATAACAGAGACAATCATTAAAGAAT    715

ACTCGATGTTTTTGTTCTTTATGTTTTGGCGTAGTTGTTTTATTGTCTCTGTTAGTAATTTCTTA

TACTATCAAAGCATGAAATCAAGAAAGAAGAACTAGAACCCACTCTAACCCCAAAACCCACACCA    780

ATGATAGTTTCGTACTTTAGTTCTTTCTTCTTGATCTTGGGTGAGATTGGGGTTTTGGGTGTGGT

CTCAAAGAGCCACAAACCACCCCAACACCATGCAAAGATTTAGTGGTTAGCACCCCTAAAGATAA    845

GAGTTTCTCGGTGTTTGGTGGGGTTGTGGTACGTTTCTAAATCACCAATCGTGGGGATTTCTATT

AACCTAATATCACCTACCACAATAACGCTAATAAGGTCAATCTAGGGAAATTGAGCGAAAGGGAA    910

TTGGATTATAGTGGATGGTGTTATTGCGATTATTCCAGTTAGATCCCTTTAACTCGCTTTCCCTT

GCCAATCTTTTATTCGCTATTTTTCAAAAACTCAAAGCCCAAGGGAATACCCTCATTCGTTTTGA    975

CGGTTAGAAAATAAGCGATAAAAAGTTTTTGAGTTTCGGGTTCCCTTATGGGAGTAAGCAAAACT

ACCGCAAGATTTGAAACGCATGCTAAACATAGATATTTCTAATGAGCGCTTATCAGAAGTCGTTA    1040

TGGCGTTCTAAACTTTGCGTACGATTTGTATCTATAAAGATTACTCGCGAATAGTCTTCAGCAAT

TTAAGCTGTGGGATAGCATTAAAACCGCTGATTTTTGGAAAATTAGCGAAACCGAAACTTCAATC    1105

AATTCGACACCCTATCGTAATTTTGGCGACTAAAAACCTTTTAATCGCTTTGGCTTTGAAGTTAG

ATTCAAGAAAATTACATGCTTTTTAGTCGGTGTAAAATTGAATTGAACAAACCGAGTAAAGATTT    1170

TAAGTTCTTTTAATGTACGAAAAATCAGCCACATTTTAACTTAACTTGTTTGGCTCATTTCTAAA

GAAGTATTTAGAAATCCAACTCAACGATAACTATCAAGACTTACTCAACAATCTGGGCATGGGTC    1235

CTTCATAAATCTTTAGGTTGAGTTGCTATTGATAGTTCTGAATGAGTTGTTAGACCCGTACCCAG

AATACACTTCTTTCAATCTGTTAGAATTTCAAAGAGTGAGGGGTAAATACGCTAAAACGCTCTAT    1300

TTATGTGAAGAAAGTTAGACAATCTTAAAGTTTCTCACTCCCCATTTATGCGATTTTGCGAGATA

CGCTTGCTCAAGCAATACAAAAGCACAGGGATTTTGAGCGTGGAATGGACTCAATTCAGGGAGCT    1365

GCGAACGAGTTCGTTATGTTTTCGTGTCCCTAAAACTCGCACCTTACCTGAGTTAAGTCCCTCGA

TTTAGACATTCCAAAAGACTACAAAATGGAAAACATCGATCAAAAAGTCTTAACCCCCTCTCTCA    1430

AAATCTGTAAGGTTTTCTGATGTTTTACCTTTTGTAGCTAGTTTTTCAGAATTGGGGGAGAGAGT

AAGAACTCAGAAAAATCTACCCTTTTGAACACTTGAGCTATAAAAAAGAACGCAAAAGCCATTAC    1495

TTCTTGAGTCTTTTTAGATGGGAAAACTTGTGAACTCGATATTTTTTCTTGCGTTTTCGGTAATG

AAGCGCAAAGTAACCCACATTGATTTTTATTTTGAGCAATTTCCTTAAGGCGAAAATAAGAAACA    1560

TTCGCGTTTCATTGGGTGTAACTAAAAATAAAACTCGTTAAAGGAATTCCGCTTTTATTCTTTGT

AAACAAAGCCGACAAGCAACGCGCTCAAAGGGACATCAAGCTTGTAGCATGGGATATTCACAACC    1625

TTTGTTTCGGCTGTTCGTTGCGCGAGTTTCCCTGTAGTTCGAACATCGTACCCTATAAGTGTTGG

AAATCGCTAAAAGAAACGCAAAAGCCACTATGGAAGCTAGGTTTCTTGAATTGAAAACTTTGATC    1690

TTTAGCGATTTTCTTTGCGTTTTCGGTGATACCTTCGATCCAAAGAACTTAACTTTTGAAACTAG

GGCTATCAGTTCAGGAACAATGACAGTAGGAACAAATTAAAGATTGACAACACCACTTTTGAAAG    1755

CCGATAGTCAAGTCCTTGTTACTGTCATCCTTGTTTAATTTCTAACTGTTGTGGTGAAAACTTTC

AATCAAATGTATTTACATGTATCTTAACCCTAAAAATAAGCATAACCCCCAAAAATTCCTTGTAT    1820

TTAGTTTACATAAATGTACATAGAATTGGGATTTTTATTCGTATTGGGGGTTTTTAAGGAACATA

CCAACAAGACATTCGCATTGGAACTACTATATATCAATAGATACAGCCTAAAAAAAAGACAACTT    1885

GGTTGTTCTGTAAGCGTAACCTTGATGATATATAGTTATCTATGTCGGATTTTTTTTCTGTTGAA

GCTAGAAGAATTTAACCCCCCAAAATCCACCCTATCACCAACGAACCTATCAAGGAATTTGCAGA    1950

CGATCTTCTTAAATTGGGGGGTTTTAGGTGGGATAGTGGTTGCTTGGATAGTTCCTTAAACGTCT

ATACATCGGCAAAACGATTAACATCACCAACTTCAATGTGGATCAATGCCATGAGGGAATCAGCA    2015

TATGTAGCCGTTTTGCTAATTGTAGTGGTTGAAGTTACACCTAGTTACGGTACTCCCTTAGTCGT

ACTACCTGACAATCACTAGGATCGTGAACTGGACGTAATCGGATCTGTATTTGGTCCAGATGTGG    2080

TGATGGACTGTTAGTGATCCTAGCACTTGACCTGCATTAGCCTAGACATAAACCAGGTCTACACC

ATAAGCCTGGGACTTCTCAAGCCTTTCATTGCTAAAGTGAGAAAATTTGGGGATTGGTTCAAGAA    2145

TATTCGGACCCTGAAGAGTTCGGAAAGTAACGATTTCACTCTTTTAAACCCCTAACCAAGTTCTT

CACTACAGGTGAAAAGACAGATGCATGCTGACTAAACTCATAGAAAAACTGAATCACGAAAGAAA    2210

GTGATGTCCACTTTTCTGTCTACGTACGACTGATTTGAGTATCTTTTTGACTTAGTGCTTTCTTT

GAATGCAAGCAGAAAACAAACACCTAAAAGAACAAGGACTAGAAAAAATCTACACTCAAAAAGAC    2275

CTTACGTTCGTCTTTTGTTTGTGGATTTTCTTGTTCCTGATCTTTTTTAGATGTGAGTTTTTCTG

TACGAGCAGTTAAAAGAACAGCATTTGAAAGAAATTGAAGCACTCAAAAAAGAAATCCAAAAAAC    2340

ATGCTCGTCAATTTTCTTGTCGTAAACTTTCTTTAACTTCGTGAGTTTTTTCTTTAGGTTTTTTG

CAAGCAAGAAACATACACGCAACCAAAAGAATGTAGCCATTTAGCGCATTCTTTTAGCCCTAATT    2405

GTTCGTTCTTTGTATGTGCGTTGGTTTTCTTACATCGGTAAATCGCGTAAGAAAATCGGGATTAA

CATTCTTTCAATCAAAATCCGACTAATTCATCGGCTAAACGCTAAAAATCGCTTAAAACGAAAAA   2470

GTAAGAAAGTTAGTTTTAGGCTGATTAAGTAGCCGATTTGCGATTTTTAGCGAATTTTGCTTTTT

TACAAAGCAAAAAACTTCATTCCCCTTTTAGTCGTTAACCATTTAGCCAATCTAACTAGTTTAGC   2535

ATGTTTCGTTTTTTGAAGTAAGGGGAAAATCAGCAATTGGTAAATCGGTTAGATTGATCAAATCG

ATCTAAAGGCGAATCTATCTTGTGTTAGACATCCAACCTTACCAAAACCGCAGAGCGAGCTTAAG   2600

TAGATTTCCGCTTAGATAGAACACAATCTGTAGGTTGGAATGGTTTTGGCGTCTCGCTCGAATTC

AGAGATTCAAGCGGTTTTGCACGATTGTTTGCTGCCAAGAAAACCAACAAGCGAAGTAAGGCGCA   2665

TCTCTAAGTTCGCCAAAACGTGCTAACAAACGACGGTTCTTTTGGTTGTTCGCTTCATTCCGCGT

TAGACAAAAGCGCATCGCAGTTTGAAAGCGTAGGCGTCAGAAGTGGTTTGCGTTAGAATCAAACA   2730

ATCTGTTTTCGCGTAGCGTCAAACTTTCGCATCCGCAGTCTTCACCAAACGCAATCTTAGTTTGT

AGATAGCGCAAACCTGGCGTTAGGCTAAAAAACCCCTAAAAACTAAAACCCCAAAATATGTAGTGC  2796

TCTATCGCGTTTGGACCGCAATCCGATTTTTTGGGGATTTTTGATTTTGGGGTTTTATACATCACG

以单链形式显示质粒pHP3(SEQ ID NO：3)：

TCTACACAATTAACAATCTTTAGCTACAATAACAGCGTGTGAAGATGCTTTCACAGCGGT        60

ATTTCCTATGTGCGGCAAAATTTGGAGCAATTAACTTGACTTGGTTGGGTTAGTGGGTTG        120

GAGGATAGAGAGGGCGACACCTCGTTAGGAGGTATCAATGTGAAAGTATTTGTCGTATTA        180

GTTCTAGTATTAGTAATTCTCGCACAATTGCTATATTAGGCTTATTTGTGGTCTAACCCC        240

TTGTTTATGGGGGTTAGATCCTTATAAGCATACTGATACGATCACACTTATTATACACCA        300

AAAGATAAGGAGTATAGAGTGGAATTTGATCAATTAGAATCACAAAGATCAGACTTACAA        360

AAAGTGTTAAAAGAATTAGATACACTCCCAAAAACCCCACAAATTGAGCTACAAAAACAA        420

GAAATACAAAACCGCATCAACAAAATAACAGACACAATCATTAAAGAATTACTATCAAAA        480

CATGAAATCAAAAAAGAAGAACTAGAACCCACTCTAACCCCAAAACCCACACCAACAAAA        540

GAGCCACAAACCACCCCCACACCATGCAAAAATTTAGTGGTTAGCACCCCTAAAGATAAA        600

ACCTATATCACCTACCACAATAACGCTAATAAGGTCAATCTAGGGAAATTGAGCGAAAGG        660

GAAGCCAATCTTTTATTCGCTATTTTTCAAAGGCTTAAAGATCAAGGGAATACCCTCATT        720

CGTTTTGAACCGCAAGATTTAAAACGCATGATCATGGTCAAATCCAACTTAACCAACAGG        780

CAATTATTGCAAGTCTTAAAAAATTTGCTTGACAACATTAGCGGTGCTAATTTTTGGATC        840

AATTAGAGAGCATGTTGAAAATGGCGAAATCTATGAAGATCACACTAGCTACATGCTTTT        900

CAAACAATTTGAAATCCGCATCCATAAGCCAACACAAACTATAGAATACTTAGATGTCCA        960

ACTCAATGATAGCTATCAATACTTGCTCAACAATCTAGGAATGGGCGGTCAATACACTTC        1020

TTTCAATCTCTTAGAATTTCAAAGGGTGAGGGGCAAATAGTGAGAGCGTTAAATTTCCCC        1080

CCCCTATTCCCCTTAAAAAGGACCCTTATCCCAGGGAATTTTTGGCCCCAATACAATTAG        1140

GGCCAAAAACCCGGTCCCTTCCATGGCTTAACCAACCCAATTGGGGGATTCCAATTTCCC    1200

CTGGATGGGAATAACCCAAGGCTTTTTTTGAAAATTCCACCTACCATTTGGTCCAAAATT    1260

GGATGGACAATTCCAAATTCCAAATCTTCTTTTCCAAGAATGGGGGCCAACCCTTGACAA    1320

ACTCCTTAAACCTTTTCATTCGGCTAAAAGGTTGAAAAACATTTGGAAGATTTGGTTTAA    1380

GGAAATATTTATCGGGTGAAAAGACCAGATGCATGGCTAACTTAAACTCCATAGAAAAAC    1440

TGAATCACGAAAGAAAGAATGCTATCAAAAATGGCATTTACCACTTGATCCAAATCAAAT    1500

TTTCTTACAACTCCAATCGCATTGAAGGAAGCGGTTTGACTTATGAACAAACCGCTCATA    1560

TTTTTGACAAATCCGTTCTCATAACTGAAAAAAACACCAATATCAAACTTGATGATATTT    1620

TTGAAACTATCAATCATTTTGAATGCGTGAATTACTTGCTTGAAAGCTATAAAGAACCTT    1680

TGAGTTTAGAATACTTTAAGAATTTACACAAAATCTTGAAAAAGAATTGTTCTGATGAAG    1740

TTATTGGTGATTTTAAAAAACGCCCTAATTTTGTAGGCAATAGCGCCACAACAAGACCCA    1800

AATTAGTTGAAAGCGAATTGACAAATCTTGTGAAAAATTATCAACGCAACCTTGAAGTGA    1860

GTTTGAAAAACAATATCATGCCTTTCATCATAGAAAACGAACACAAAGCCTTTTACTACA    1920

GGGGCATCAAAGAATATGACAACACAAAAGGCTACTTGAAAGACACCATTTTGCAAAGTC    1980

AAGACAATTTCAATGAAATGGTTAGCTATTTCTTTTCTTGAGTGAAACCGCTTATTTTTG    2040

CTTGTGTGCTTTTGTTTTTTGCGTTTTTAGTTGTAGGTGGTAAGAAATATCGGTTTTTTG    2100

CTTTTCGTTGGTTGTAGGCGATTTTAGATAGCAAAAAACAGCTAAAAAATCCAAGCAACC    2160

TAATTGATTTCAAACCAACTTCATTTCCCTTTTAGTCGTTAGCCATTTAGCCAATCTAAC    2220

TAGTTTAGCATCTAAAAGCGCATATAACTTGAGTTAGCAATCCAACCAATACTAAAACCG    2280

CCTAGCGAAGCGTTAGCGAGCAAAATAAGCGGTTTTAGACCGATTGTTTGCTGACAAGCA    2340

AACACCAATAAGCGAGCGTTAGCGAGCATGGACAAAAGCGCATCGCAGTTTGAAAGCGTA    2400

GGCGTTAGCCGAAGCTGTTTTGCGTAAGCAAATCAAACAAGATAGCGCAAGCCGAGGTGC    2460

AGCCCAAGAATTTGAATTAATCCATGCGGTGTTTAGGGCGTTTTAGCGTGATCGCTTTAT    2520

TACATGTTTTAAACAGCATGCTGTTTTTTACATGTTTTACTCGCATGCGCGCGCGCTAGG    2580

TATTGGTGGTTGGAATAGCCTAAATAACGCAGCTGTATGGTTTCTCATTTTTCGGTGACA    2640

ATGAATAAGGGGTAGTTCTTGCGAGTCATAAGTGTAGTTCTTGCGAGTCATAAGTGTAGT    2700

TCTTGCGAGTCATAAGTGTAGTTCTTGCGAGTCATAAGTGTAGTTCTCTTCACAATATCT    2760

ACACAATTCACAATCTCTAGCTACAATAACAGCGTGTGAAGATGCTTTCACAGCGGTATT    2820

TCCTATGTGCGGCAAAATTTGGAGCAATTAGCTTTAAAAGCTAGTGGGTTGGGAGTTTGT    2880

AGCGGGTATGCACTCCGTTAGGAGGCACACCATGAAAGCATTTTTGATAGTAGTGATTTT    2940

AGTGGTAATCTTGACACAGCCACTATATTAAAACCTTAGCGTTTTAATAACCCTTATAAG    3000

TCCGCCAAGACTTCTTAAGGGTTTCACTCCTGTTATTATATCGTCTTTTGAAAAATAAGC    3060

ATTAAAAGGCGCTTAAATGCCCATGAATACGAATTTTGAACAGCTTAGAAAACAAGAATT    3120

GGAATTACGAAAATTATTAGAAGAATTAGAAACGCTCCCACAAACCCCACAAATTAAACT    3180

GCAAAAACAAAAAATACAAACTTACATAGACAAGATAACACCAAGTATTTTGAGCGGTTT    3240

TGATCAAAAATTCAAAGAAATTATAGAAAATCTATCAAATGAATTTGAAAAAGAAAAATC    3300

CACACCACTCAAAGAGCCACAAACCACCCCCACACCATGCAAAGATTTAGTGGTTAGCAC    3360

CCCTAAAGATAACACCTATACCACCTACCACAATAACGCTAATAAGGTCAATCTAGGGAA    3420

ATTGAGCGAAAGGGAAGCCAATCT                                        34440

在SEQ ID NO：4中提供克隆的另外的核苷酸序列，其包括编码45个氨基酸的肽的135bp片段(SEQ ID NO：5)。这种更小的45个氨基酸的肽是丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的免疫原性多肽。在下面用指定的具有下划线的135个核苷酸显示编码所述45个氨基酸的肽的核酸序列(SEQ ID NO：5)。

CATGAGCACG AATCCTAAAC CTCAAAGAAA AACCAAACGT AACACCAACC

GTCGCCCACA GGACGTCAAG TTCCCGGGTG GCGGTCAGAT CGTTGGTGGA

GTTTACTTGT TGCCGCGCAG GGGCCCTAGA TTGGGTGTGC GCGCGACGAG

GAAGACTTCC GAGCGGTCGC AACCTCGAGG TAGACGTCAG CCTATCCCCA

AGGCACGTCG GCCCGAGGGC AGGACCTGGG CTCAGCCCGG GTACCCTTGG

CCCCTCTATG GCAATGAGGG TTGCGGGTGG GCGGGATGGC TCCTGTCTCC

CCGTGGCTCT CGGCCTAGCT GGGGCCCCAC AGACCCCCGG CGTAGGTCGC

GCAATTTGGG TAAGGTCATC GATACCCTTA CGTGCGGCTT CGCCGACCTC

ATGGGGTACA TACCGCTCGT CGGCGCCCCT CTTGGAGGCG CTGCCAGGGC

CCTGGCGCAT GGCGTCCGGG TTCTGGAAGA CGGCGTGAAC TATGCAACAG

GGAACCTTCC TGGTTGCTCT TTCTCTATCT TCCTTCTGGC CCTGCTCTCT

TGCCTGACTG TGCCCGCTTC AGCCTACCAA -SEQ ID NO：4。

AATCCTAAAC CTCAAAGAAA AACCAAACGT AACACCAACC GTCGCCCACA

GGACGTCAAG TTCCCGGGTG GCGGTCAGAT CGTTGGTGGA GTTTACTTGT

TGCCGCGCAG GGGCCCTAGA TTGGGTGTGC GCGCG -SEQ ID NO：5.

将SEQ ID NO：4的核酸在SEQ ID NO：4的nt504位置(以粗体/下划线指出，对应于蛋白质产物的氨基酸残基168)克隆到幽门螺杆菌26695的hopE基因(SEQ ID NO：6，在下面显示)中，从而将使表达产物作为HopE基因产物的表面外露环的部分定位。这种构建体，被称为载体pTMI03-8(图3)，在大肠杆菌的表面上表达。

ATGCCATAGC ATTTTTATCC ATAAGATTAG CGGATCCTAC CTGACGCTTT

TTATCGCAAC TCTCTACTGT TTCTCCATAC CCGTTTTTTG GGCTAACAGG

AGGAATTAAC C

1     ATGGAATTTA TGAAAAAGTT TGTAGCTTTA GGGCTTCTAT CCGCAGTTTT

51    AAGCTCTTCG TTGTTAGCCG AAGGTGATGG TGTTTATATA GGGACTAATT

101   ATCAGCTTGG ACAAGCCCGT TTGAATAGTA ATATTTATAA TACAGGGGAT

151   TGCACAGGGA GTGTTGTAGG TTGCCCCCCA GGTCTTACCG CTAATAAGCA

201   TAATCCAGGA GGCACCAATA TCAATTGGCA TGCTAAATAC GCTAATGGGG

251   CTTTGAATGG TCTTGGGTTG AATGTGGGTT ATAAGAAGTT CTTCCAGTTC

301   AAGTCTTTTG ATATGACAAG CAAGTGGTTT GGTTTTAGAG TGTATGGGCT

351   TTTTGATTAT GGGCATGCCA CTTTAGGCAA GCAAGTTTAT GCACCTAATA

401   AAATCCAGTT GGATATGGTC TCTTGGGGTG TGGGGAGCGA TTTGTTAGCT

451   GATATTATTG ATAACGATAA CGCTTCTTTT GGTATTTTTG GTGGGGTCGC

501   TATCGGCGGT AACACTTGGA AAAGCTCAGC GGCAAACTAT TGGAAAGAGC

551   AAATCATTGA AGCTAAGGGT CCTGATGTTT GTACCCCTAC TTATTGTAAC

601   CCTAACGCTC CTTATAGCAC CAAAACTTCA ACCGTCGCTT TTCAGGTATG

651   GTTGAATTTT GGGGTGAGAG CCAATATTTA CAAGCATAAT GGCGTAGAGT

701   TTGGCGTGAG AGTGCCGCTA CTCATCAACA AGTTTTTGAG TGCGGGTCCT

751   AACGCTACTA ATCTTTATTA CCATTTGAAA CGGGATTATT CGCTTTATTT

801   AGGGTATAAC TACACTTTTT

CTCGAGATCT GCAGCTGGTA CGATATGGGA ATTCGAAGCT TTCTAGAACA

AAAACTCATC TCAGAAGAGG ATCTGAATAG CGCCGTCGAC CATCATCATC

ATCATTGAGT TTAACGGTCT CCAGCTTGGC TGTTTTGGCG GATGAGAGAA

GATTTTCAGC CTGATACAGA TTAAATC SEQ ID NO：6

简而言之，成功分离hopE基因的一种方法是通过使用Taq DNA聚合酶从幽门螺杆菌22695中扩增。可以通过使用DNA合成仪诸如Perkin-ElmerApplied Biosystems，Inc.332型(ABI；Mississauga，Ontario，Canada)，构建包含BamHI位点的上游引物5′-AAGGATCCGATAGGAATGTAAAGGAATGG-3′(SEQ ID NO：7)和包含EcoRI位点的下游引物5′-CCGAATTCTAAAGGCATGAACGCTTGCA-3′(SEQ ID NO：8)。可以以与lac启动子相同的方向将所得PCR片段平端克隆到pBluescript II KS(+)中的EcoRV位点中。

接着，可以设计PCR引物以将两个独特的限制性酶切位点克隆到hopE基因中以插入来自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的135bp的免疫原编码序列。可以使用如下的递降扩增程序来进行使用Taq DNA聚合酶的PCR扩增。将PCR热循环仪的程序设定为：在96℃进行4分钟初始变性步骤，随后在65℃的初始退火温度上(持续90秒)进行18个循环，每个连续的循环减少0.5℃，在72℃进行6分钟延伸步骤，并在96℃变性1分钟。在完成开始的18个循环后，可以通过使用72℃的延伸和96℃的变性步骤，和55℃的不变退火温度来进行另外的14个扩增循环。接着，通过柱纯化所得扩增子，用乙醇沉淀，并通过用DNA聚合酶的Klenow片段消化制造平端。可以用限制性酶消化所述PCR产物以去除模板DNA，并将其重新连接入适合的载体诸如在阿拉伯糖诱导型启动子调控下的pTMI03.8，并转化到大肠杆菌JM105中。

可以在PCR扩增反应中通过使用寡核苷酸引物5′-AGATCTAAGGACGTC-3′(SEQ ID NO：9)加反向测序引物鉴定重组克隆。可以对鉴定的克隆进行测序以证实插入的限制性核酸内切酶位点符合读框并且在hopE基因中没有引入错误。接着，可以使用标准技术插入来自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的135bp的免疫原性编码序列。

一旦创建了载体pTMI03-8，则将其转化到大肠杆菌中，在37℃培养所述大肠杆菌，接着收获细胞并通过Western印迹来证实(continued)HCV插入物的表达。

简而言之，如下进行该程序。从约20个平板收获细胞并重悬在在10mMTris-HCl(pH8.0)中具有50mg DNase I(Boehringer Mannheim)的20％蔗糖中。接着用弗氏压碎器(French press)以15,000lb/in²破坏细胞。将破裂的细胞覆盖在在10mM Tris-HCl(pH8.0)中的1ml 70％和6ml 70％蔗糖的蔗糖分级梯度上。收集外膜级分，用150,000x g产生沉淀，并将所述沉淀物重悬在100ml蒸馏水中。

或者，可以将来自500ml对数期培养物的外膜溶解在10mM Tris-HCl(pH 8.0)-3％n-辛基-聚氧乙烯中，在23℃温育1小时，并在173,000×g离心30分钟。将沉淀物重悬在10mM Tris-HCl-3％n-辛基-聚氧乙烯-5mM EDTA(pH8.0)中，在23℃温育1小时，并在173,000x g离心30分钟，收集上清液。Western免疫印迹指示在第二个溶解步骤的上清液中的HCV/hopE的存在。将包含HCV/hopE的上清液与等体积的0.125M Tris-HCl(pH 6.8)，4％(wt/vol)十二烷基硫酸钠(SDS)和20％(vol/vol)甘油混合并进行SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。如果需要，可以将HCV/hopE条带从凝胶的未染色部分切除并在4℃过夜洗脱到10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，和100mM NaCl中。接着，可以在SDS-PAGE凝胶上运行洗脱上清液以检查纯度，并使用标准技术进行Western免疫印迹。例如，可以以15μg/泳道的浓度上载分离的外膜。接着，在不连续的12％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE进行电泳。接着，用考马斯亮蓝对蛋白质进行染色。对于Western免疫印迹，可以将未染色的凝胶电印迹到Immobilon-P膜(Millipore，Bedford，Mass.)上。在2℃，用在磷酸缓冲盐水(PBS)中的3％牛血清白蛋白(BSA；Boehringer Mannheim)-0.1％Tween 20(Sigma)封闭2小时后，接着在37℃将所述膜与在1％BSA-0.05％吐温20中的1/10,000稀释的抗-HCV兔抗血清一起在PBS中温育1小时。接着，将所述膜用PBS洗涤并与1/5,000稀释的碱性磷酸酶缀合的二抗(Bio-Rad，Richmond，California)一起在37℃温育1小时。用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP，Calbiochem.La Jolla，California)和氮蓝四唑(NBT，Sigma)检测结合的抗体。

实施例2.用于稳定表达的表达载体和抗原的选择

因为HopE是幽门螺杆菌的天然蛋白质并且为该生物所耐受，因此能够形成可用于在幽门螺杆菌中表达外源抗原或其它异源基因产物的构建体。可以容易地如上所述开发的其它幽门螺杆菌/大肠杆菌穿梭载体包括，例如，包含两个质粒复制起点和适合于每个宿主的标记物的载体。标记物可能包括氯霉素/卡那霉素抗性基因以及能够由大肠杆菌和幽门螺杆菌转录系统二者识别的启动子。

可以通过使用多种大肠杆菌质粒中的任一(例如，pBR322)来满足对于在大肠杆菌中复制的要求。

可以测试构建的穿梭载体在大肠杆菌和幽门螺杆菌二者中的复制，并且与在文献中描述的现存的穿梭质粒比较。

理想地，待表达的抗原或其它异源基因产物的选择将是对于幽门螺杆菌和大肠杆菌无毒并且在递送到哺乳动物的选定位点时，具有高免疫原性(或具有另外的理想的性质)的抗原和其它异源基因产物。在用于哺乳动物免疫的被表达抗原的情况中，这样的位点可以是粘膜位点。

如在实施例1中所述，可以在大肠杆菌的表面表达hopE/HCV核心抗原融合蛋白。pTMI03-S的产物(图3)优选地靶向幽门螺杆菌外膜，从而使其在粘膜环境中显示HCV核心抗原。

已经对作为人抗原的破伤风类毒素(TT)进行了广泛的研究，并且对针对其的免疫应答进行了充分表征。当在细菌孢子的表面上显示，通过口服或鼻内施用时，TT激发良好的粘膜免疫应答(Duc & Cutting，2003，Expert OpinionBiol Ther，3(8)，1263-70)。所述破伤风毒素C片段可以融合到如上所述的hopE基因产物中或被改造以包含膜固着点(anchor)和细胞表面靶序列。该系统的优势是存在充分表征的鼠模型来评价接种疫苗程序的有效性，而在HCV的情况中，已知的鼠模型通常依赖于免疫缺陷型小鼠。已经显示用巨细胞病毒(CMV)的gB蛋白针对致死剂量的表达gB抗原的经改造的痘苗病毒来免疫小鼠。因此，可以使用在实施例1中所述的方法构建包含取代HCV抗原的gB抗原的穿梭载体诸如本文所述的那些。

许多启动子可以在穿梭载体中使用。理想地，所用的启动子可通过螺杆菌属细菌的天然体内建群机制或通过用无毒的食品或可以食用的化学品诱导来进行诱导。例如，可以使用来自幽门螺杆菌组氨酸激酶HP 165。所述来自幽门螺杆菌组氨酸激酶HP 165的启动子被报道通过酸性pH进行诱导，并且可以作为涉及胃粘膜建群的毒力因子。这种启动子的益处是能够在体外制备构建体。外源抗体仅在暴露于胃粘膜的酸性环境时才表达。

其它的启动子包括在pTMI03.8中所用的阿拉伯糖诱导型启动子和FlaBσ54启动子(Josenhans等，1998，EEMSMicrobialLett.，161(2)，263-73)，在组成型和诱导型的大肠杆菌系统中使用的T7启动子和在厌氧环境中诱导的沙门氏菌的nir启动子(Chatfield等，1992，Biotechnology，10(8)：888-92)。可以利用Angelini等(2004)(Plasmid，51：101-107)发展的系统测试这些启动子的任一种在幽门螺杆菌中发挥作用的能力，所述系统使用CAT和GFP报道基因作为幽门螺杆菌质粒载体中启动子活性的指示。

表达的靶位点将依赖于所用的抗原或其它基因产物。最初的研究集中在HopE蛋白和融合多肽上，其将表达的多肽(例如，抗原)靶向到幽门螺杆菌的细胞表面上。

质粒稳定性也是非常重要的，尽管抗生素抗性基因作为质粒维持的选择性决定子的用途可以用于体外，在体内则实用性较弱。一种备选方案为平衡致死系统，例如，在沙门氏菌属中失活使用的asd基因。天然存在于幽门螺杆菌中的asd基因编码天冬氨酸酯-β-半醛脱氢酶(二氨基庚二酸(DAP)的生物合成途径中的酶，革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖的基本组分)。在DAP缺失的条件下，asd突变体进行裂解。由于DAP并不存在于哺乳动物组织中，这种平衡致死系统强调对所有存活的幽门螺杆菌携带包含重组asd基因的质粒的要求。

为了使用asd基因系统，利用标准基因敲除方案灭活asd基因的基因组拷贝。随后这种幽门螺杆菌菌株将只能在提供DAP或具有包含asd基因的质粒时生长。

可以用于类似目的的其它系统包括大肠杆菌肠毒素(enterotoxin)或霍乱毒素(cholera toxin)(CT)作为粘膜佐剂。还可以使用佐剂强化粘膜免疫应答。两种这类佐剂为CT和大肠杆菌肠毒素(LT)，其中将表达的抗原融合到LTB和CTB突变体上，其保持它们的强效粘膜佐剂特性但具有减弱的毒性。

实施例3.毒力，LD ₅₀

如在实施例1和2中所述，基于螺杆菌属细菌的载体诸如pHP3和pHP623能够提供针对在哺乳动物诸如小鼠或人中的感染的保护。在本实施例中，使用小鼠模型来证实使用基于螺杆菌属细菌的系统将感兴趣的药理学活性分子递送给哺乳动物包括人的应用性。使用鼠模型来证实幽门螺杆菌的转基因菌株体内激发针对表达的表面抗原的血清学应答的活性。

用野生型幽门螺杆菌来感染小鼠，同时如在实施例2中所述用温度敏感性的幽门螺杆菌管饲接种其它的小鼠。按照在表1中显示的计划表，对来自对照和测试动物的血清测试抗体，并且在处死的动物上进行胃组织学研究。还可以使用小鼠尿素呼吸测试。

观察到毒力减少了50％(从75％到40％)。特异性抗体效价在基线上增加了4倍，表明血清学应答。在基线、12、24和48周采血清样品。在这些时间，处死10、10和20只动物并且进行胃的组织学研究。

实施例4.温度敏感型幽门螺杆菌菌株的毒力和抗原性的比较

为了检测在涉及外膜蛋白的表达/修饰的毒力中的变化，如在实施例3中所述用温度-敏感型幽门螺杆菌接种了小鼠。用野生型幽门螺杆菌菌株来感染相同大小的对照组的小鼠。使用非侵入的方式确定幽门螺杆菌的存在或不存在。在3和6个月时，对小鼠采血进行抗体测定。处死后，进行组织学研究以测试胃炎并证实建群。

实施例5.评价温度敏感型幽门螺杆菌疫苗针对肺炎球菌(Pneumococcal) 抗原的功效的LD ₅₀ 研究

为了证实基于螺杆菌属细菌的疫苗对抗标准的病原体(肺炎球菌(pneumococcus))的保护作用，用温度敏感型幽门螺杆菌通过管饲法接种小鼠。用野生型幽门螺杆菌菌株感染相同大小的对照组。如在实施例4中所述，使用非侵入性方式来确定幽门螺杆菌的存在或不存在。在感染后6个月，按照Aaberge等的方法(1995，Microb.Pathog.，18：141-152)，用10倍于活的毒性4型肺炎球菌的LD₅₀的量(～20CFU/小鼠)给所有的小鼠进行腹膜内激发。

考虑到在对照中75％的致死性，研究具有0.8的统计效力(power)以检测致死率中50％的减少(75％比50％)。

实施例6.小鼠的幽门螺杆菌状态的确定：呼吸测试方法

在本实施例中，将在人中所用的尿素呼吸测试进行改进以用在小鼠中。

给10只小鼠饲喂缺乏脲酶的饮食(未蒸煮的大豆)。接着，通过管饲法给小鼠施用3.7kBq的在200μl的调味柠檬酸盐中的^[14]C尿素，并将其置于充满空气的2L塑料拉链包(Ziploc bag)中达20分钟。接着，在不交换包中空气的情况下，移去小鼠。接着，引入在乙醇中的0.1mmol的季铵盐，并将闪烁体加入季铵盐溶液中，计数达10分钟或多到1,000dpm的数值。

实施例7.人的研究

为了证实在人中的毒力和抗体应答，使用如“Baylor菌株”的幽门螺杆菌菌株，并将采取下列标准：

1.被感染的个体无症状，仅有温和的组织学损伤，并且没有感染肝炎病毒或HIV的迹象。

2.分离株是单一菌株，cagA阴性的，并且对甲硝基羟乙唑、克拉霉素(clarithromycin)、四环素和羟氨苄青霉素敏感。

3.接受激发的志愿者是这样的健康人，其具有正常胃组织学，无胃溃疡病史，在家中没有年幼的儿童，不经常与年幼儿童接触，并且对可能在治疗感染中需要的抗生素不过敏。

激发由在就寝时间的40mg的法莫替丁(famotidine)，随后在早晨的通过口服在牛肉汁中的幽门螺杆菌组成。每日接触受试者，进行14天。在7天和14天后进行13c-UBT并在2周和3个月后进行用定量培养物进行的内窥镜检查和组织学研究。使用抗生素来消除感染。

实施例8.用于体内检测野生型和/或TSHP的外部化学标记物的开发

可以用于体内检测野生型或TSHP的化学标记物的实例是柳氮磺胺吡啶(SSN)，其结构显示在图4中。在无菌小鼠和常规大鼠中的研究已经显示肠道细菌仅仅负责重氮键还原，导致SSN的还原代谢和磺胺吡啶和5-氨基水杨酸盐的释放。将催化这种反应的酶称为重氮还原酶(同物异名偶氮还原酶)。被给药SSN的常规大鼠在尿和粪便中排泄5-氨基水杨酸盐和磺胺嘧啶(和它们各自的缀合物)，而无菌大鼠没有显示SSN降解的迹象。

一些细菌菌种已经显示具有重氮还原酶(AZR’s)。早期的生物信息学研究已经指出幽门螺杆菌可以不包含AZR基因。类似的相似序列的存在也已经产生了阴性结果。在这些情况下，可以使用具有活力和功能性偶氮还原酶的幽门螺杆菌(TSHP)的转基因菌株(azr+TSHP)评估这些标记的应用。

用EcoRI和HindIII消化质粒pTM103-02，并将其与来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的用EcoRI和HindIII处理的偶氮还原酶(AZR)基因连接，产生了包含HopE 168aa和AZR命名的pTMI03-azr的载体。将这种质粒转化到大肠杆菌中来评估HopE和枯草芽孢杆菌AZR表达是否发生。当用全长C型肝炎核心抗原(HCCA)类似地处理pTMI02时，使用Western印迹和抗-HopEAbs证实了HopE::HCCA向大肠杆菌外膜的转运。

用azr+TSHP通过管饲法感染小鼠(n＝30)，并且一旦建立了AZR的体内表达，在尿和粪便中产生5-氨基水杨酸盐和磺胺吡啶(和它们各自的缀合物)，可以开始人试验。

实施例9.使用DIAGNEX BLUE作为标记物

诊断剂“Diagnex Blue”由缀合了染料(Azure-A)的离子交换树脂(Amberlite XE-96)组成。这种测试依赖于树脂-染料组合在小于2.5的pH解离，随后染料被吸附并出现在尿中的事实。在尿中不存在染料的人是胃酸缺乏。这种原理显示在图5中。

可以使用相同的原理来测试幽门螺杆菌。例如，如果树脂与尿素一起应用，在pH＞7.0时解离的染料-树脂组合可以检测脲酶。这将在幽门螺杆菌存在的粘膜层中产生pH＞7.0，因此释放染料。

用野生型幽门螺杆菌菌株接种小鼠(n＝30)，同时使用无菌的小鼠(n＝30)作为对照(预研究)。在容许幽门螺杆菌建立活性感染的优化阶段后，将预定量的树脂-染料复合物通过管饲法引入测试组和对照组。随后是尿素溶液(范围0.01M到0.5M)。将小鼠饲养在代谢笼中，并监测和定量天青(azure)染料的排泄。对树脂和尿素浓度的不同比率进行测试以证实待使用的优化组合。

实施例10.递送制剂

对于递送形式，提供本实施例来证明利用本发明提供气溶胶喷雾制剂。在这些实施方案的一些中，气溶胶喷雾可以在使用适合的推进剂的情况下，采用加压包装或喷雾器的形式。在加压气溶胶的情形中，可以通过提供阀门以递送计量的量来确定剂量单位。将所述制剂制备为粉末通过吸入来施用。还可以通过雾化包含按照本发明的组合物的溶液或悬液来进行通过吸入的施用。

还可以将按照本发明的组合物在用于口服消化的液体中配制从而作为静脉内制剂施用给受试者。

如果适合，使用另外的适合的药物助剂(auxiliary)，通过本领域技术人员所熟悉的方法来制备所有的本发明的各种制剂。按照本发明的组合物有利地包含螺杆菌属菌种，所述螺杆菌物种单独存在或与其它需要的成分组合。

可以将任何上述单独的或组合的螺杆菌属细菌制剂包括在药物组合物中，所述药物组合物包含按照本发明的药学可接受组合物。本文所述的药物组合物可以以固体(例如粉末、颗粒(particle)、颗粒剂(granule)、小药囊(sachet)、片剂、胶囊等)，半固体(凝胶、糊剂等)或液体(溶液、分散体(dispersion)、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、混合物等)形式存在，并适合于通过例如胃肠道和胃粘膜施用。所述药物组合物可以因此以适应于在应用前在液体介质中分散的粉末或颗粒形式存在。

以液体形式存在的药物组合物可以以包含螺杆菌属细菌组合物和电解质溶液的分散体形式存在，所述电解质溶液诸如，例如适应于生理条件的组合物，例如生理可接受的溶液。

按照本发明的药物组合物还可以包含其它的治疗性、预防性和/或诊断性活性物质。

在另一方面，本发明涉及包含第一和第二容器的药物试剂盒，所述第一容器包括包含按照本发明的质粒和/或质粒载体的重组螺杆菌属细菌组合物，所述第二容器包含用于螺杆菌属细菌组合物的分散介质，伴随在应用前在分散介质中施用和/或投入(dosing)螺杆菌组合物的说明书。

在试剂盒中包含的按照本发明的螺杆菌属细菌组合物可以以粉末或颗粒形式存在。

按照本发明的药物试剂盒可以包括这样的说明书，所述说明书推荐在分散到分散介质中后螺杆菌属细菌组合物应该施用的时间阶段。

实施例11.用螺杆菌属-疫苗制备物进行的免疫调节

TH1应答(1型T-辅助细胞)是细胞介导的应答。推测过度的这种活性是疾病诸如类风湿性关节炎(RA)和狼疮的病因。相反，TH-2是疫苗的抗体型血清学应答特征。本实施例证明利用本发明用于提供这样一种技术，当用按照本发明的基于螺杆菌属细菌的疫苗处理制备物处理时，在动物中获得TH-2型响应。

尽管幽门螺杆菌产生抗体应答(TH2)，但是最近已经注意到胃粘膜的主要应答可能是TH1细胞介导的应答。因此，预期本发明在提供给动物的粘膜时可以提供这两种类型的免疫应答。

可以使用如本文所述的螺杆菌属载体和载体质粒系统来激发动物中的抗体应答。作为举例，在WO-0194599中描述了在构建体中应用基因表达盒的系统，其提供细菌，梭菌属(Clostridium)的转化以及后续的蛋白质(S-层蛋白质)从转化的梭菌属细菌表面的分泌，这起动了粘膜接种疫苗，将所述WO-0194599的全部内容通过引用并入本文。这些构建体还可以包括选自ORF1、ORF3、ORF5-7、ORF7或ORF11的分泌前导序列。

按照疫苗的一些实施方案，基于螺杆菌属的载体和载体质粒可以包括编码细菌表层蛋白质的序列。在本文将表层蛋白质定义为存在于细菌外膜上并且能够暴露在细菌表面上的具有蛋白质性质的任何分子，包括例如蛋白质，糖蛋白和脂蛋白。S层蛋白可以连续地并自发地以比细胞中任何其它种类蛋白质更大的量产生。

还在WO-97/28263中提供了制备重组细胞制备物的方法，所述重组细胞制备物包括具有S-层蛋白质的革兰氏阴性宿主细胞，梭菌属细菌。可以对所述方法进行修改并按照(followed)本文所述的程序进行，以结合S-蛋白质作为本发明的螺杆菌属构建体的部分。

因此，在一些载体和载体质粒构建体中，提供包含螺杆菌属序列和感兴趣的非螺杆菌属药理学活性分子的融合蛋白。为了增加使用本发明的螺杆菌属构建体的疫苗的免疫原性，融合蛋白的螺杆菌属序列可以包括编码S-层蛋白质的序列。已经报道了包含S-层蛋白质作为融合蛋白的部分从而在芽孢杆菌属细菌表面表达S-层蛋白质(参见WO-95/19371，描述球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))，因此增加所述制备物的免疫原性的芽孢杆菌属构建体。

已经提供了针对一些疾病的粘膜免疫，包括口服脊髓灰质炎(polio)疫苗和针对由大肠杆菌引起的霍乱和腹泻的口服(可饮用)的疫苗(灭活的疫苗)。在一些实施方案中，预期本发明的疫苗可以因此包括灭活的疫苗。

本发明意欲保护(contemplate)活的疫苗，因为这样的疫苗将提供单剂量，长效的疫苗接种，原因在于载体生物，螺杆菌属细菌将持续产生抗原，即感兴趣的非螺杆菌属药理学活性分子，并加强体内免疫性。此外，所述疫苗将与佐剂组合施用。这些佐剂包括分子诸如氢氧化铝或脂质小泡，其通过钝化施用的移除特定位点(slowing its removal forte site of administration)而增加对于所述疫苗的暴露时间。佐剂还通过引起被称为细胞因子和趋化因子的免疫调节肽的产生来发挥作用(Brewer等1997，J.Cytokines Cell Mol.Ther.，4：223-246)。因此，本发明的疫苗可以包括细胞因子佐剂以增加免疫应答。

当口服施用或胃部施用于哺乳动物诸如人或动物时，转化的螺杆菌属细菌或大肠杆菌将为胃肠建群提供需要的多肽，通过作为建群的天然位点的胃壁产生和呈递所需多肽。胃肠道周围由专门设置各种类型的免疫应答的巨大(immense)免疫装置围绕。因此，重组螺杆菌属疫苗或产生肽的菌株的胃肠建群能够使免疫刺激比传统疫苗接种长得多。此外，抗原可以优先呈递到消化道壁或内腔。

实施例12.螺杆菌属细菌及其作为食欲抑制剂的应用

提供本实施例来证实使用本发明作为将螺杆菌属细菌用在提供抑制食欲的制备物和治疗方案中的方法。具体而言，预期包含减毒的螺杆菌属细菌以及感兴趣的非螺杆菌属药理学活性分子的构建体向消化道粘膜的递送提供了一种有效的方式来提供对调节食欲和饱食感(satiety)的消化道-脑枢椎(gut-brain axis)的抑制，所述感兴趣的药理学活性分子调节生长素释放肽或生长素释放肽激动剂的水平。

研究表明生长素释放肽是食欲刺激剂，即生长素释放肽增加小鼠的食物摄取(Asakawa等2003，Gut，52(7)：947-52)。还已经报道生长素释放肽减少在啮齿类动物的脂肪组织中的脂肪利用(Tschop等，2000，Nature，407：708-13)，以及参与大鼠脂肪形成(Choi等(2003)，Endocrinology，144(3)：751-9)。还已经报道生长素释放肽为饥饿信号，当可用营养低时促进受试者进食。

将美国专利第6,967,237号-Bednarek(2005)中涉及生长素释放肽类似物和核酸构建体的教导，以及美国专利申请公开第20050191317号-Bachmann等(2005)中涉及生长素释放肽-载体缀合物的教导，通过引用具体并入本文，因为这些教导补充和/或进一步加强了对本发明的理解和评价。

生长素释放肽，作为生长激素促分泌素受体(GHS-R)的内源性配体，刺激培养的垂体(pituitary)细胞以剂量依赖型的方式释放生长激素(GH)，并且由A-样细胞产生和分泌出来，所述A-样细胞主要在胃底的泌酸腺(oxyntic gland)中发现。目前已知生长素释放肽不仅在GH释放，还在控制食欲和体重中发挥作用。

已经显示胃肠外和脑室内(intracerebo-ventricularly)施用生长素释放肽都刺激食物摄取并提高自由取食的小鼠和大鼠的体重，甚至对于具有GH缺陷的那些动物来说亦是如此。食欲和体重的控制可以不依赖于GH释放。

生长素释放肽，一种28个氨基酸的肽，当其第三个丝氨酸残基被n-辛酸酰化时得以激活，并且GHS-R响应于最开始的四或五个残基，包括整个生长素释放肽的辛酰化的丝氨酸残基。已经显示GHS-R存在于垂体、下丘脑、肾上腺、甲状腺、胰腺、心肌、脾和睾丸中。生长素释放肽刺激NPY和AGRP mRNA在下丘脑的表达。生长素释放肽的中枢食欲促进(orexigenic)作用由下丘脑中表达NPY/AGRP的神经元介导。还已经报道了生长素释放肽抑制迷走神经传入活性。生长素释放肽的外周食欲促进作用至少可以部分地由其对于迷走神经传入活性的抑制作用所介导。IL-1β是促炎性细胞因子，其通过刺激瘦蛋白(leptin)的表达和释放，和/或通过模仿来自瘦蛋白的过量负反馈信号对于下丘脑的影响而介导恶病质进程。

有人提出如果在消化道粘膜上给动物提供生长素释放肽拮抗剂将减少动物的食物摄取并减少体重增长。

实施例13.伴随细胞消耗的癌症和艾滋病

本实施例说明了本发明用作预防或抑制细胞消耗的制备物的用途，特别是与艾滋病和癌症的患病状态相关联的细胞消耗。

恶病质是这样一种病症，其特征是消瘦(wasting)、憔悴(emaciation)、虚弱(feeblemess)和营养不良(inanition)。最近据报道在癌症恶病质的小鼠模型中生长素释放肽和生长素释放肽mRNA在胃中的水平都得以上调。在血浆IL-1β水平提高的恶病质小鼠中，生长素释放肽的血浆浓度也随着恶病质的进程而提高。这种结果提示在生长素释放肽动力学和由IL-1介导的恶病质进程之间可能存在着密切的关系。IL-1β是一种使食欲减退(anorexigenic)的物质，就像CCK、瘦蛋白、胃泌激素(gastrin)相关蛋白和铃蟾肽(bombesin)，并且拮抗生长素释放肽的作用。

Asakawa等报道了胃肠外施用的IL-1β减少下丘脑的NPY mRNA表达以及胃中的前原生长素释放肽(preproghrelin)mRNA表达，并且腹膜内施用的生长素释放肽抑制IL-1β诱导的厌食的严重性。

已知幽门螺杆菌感染是在胃炎、胃溃疡病和胃恶性肿瘤形成中的一种主要病理因素。幽门螺杆菌附着到胃粘膜上诱导炎症，其与各种细胞因子，包括IL-1β的释放相关联。

据临床上观察根除幽门螺杆菌通常会带来一些营养参数的改善，如体重和总胆固醇、总蛋白质和白蛋白的血清水平。已经报道幽门螺杆菌感染能够修饰蒙古沙鼠(Mongolian gerbils)的血浆和胃生长素释放肽动力学。不过，在人中，已经报道幽门螺杆菌感染并不与血浆生长素释放肽水平的任何改变相关联，尽管已经有人显示根除幽门螺杆菌与血浆生长素释放肽水平的提高相关联。

有人提出幽门螺杆菌可以用作载体来向需要它的患者提供支链淀粉(amylin)，例如通过作为针对胃粘膜的载体运载体(carrier vehicle)发挥作用。在一些实施方案中，将螺杆菌属载体构建成包括支链淀粉、支链淀粉激动剂、类似物和衍生物，以及支链淀粉激动剂(包括降钙素、降钙素基因相关肽)，和它们的类似物，从而降低生长素释放肽水平。

支链淀粉拮抗剂能够提高生长素释放肽水平。用支链淀粉、链淀粉激动剂、支链淀粉拮抗剂、或其它降低支链淀粉有效水平的化合物如抗体来调节支链淀粉的有效水平，可以抑制，或在拮抗剂和抗体的情况下刺激生长素释放肽分泌。因此，该方法的一些实施方案涉及通过直接或间接的手段提高支链淀粉或支链淀粉激动剂的有效水平，或通过利用支链淀粉拮抗剂降低支链淀粉的有效水平或抑制支链淀粉产生，来调节生长素释放肽的内源水平。

实施例14.高歇病的治疗

本实施例证实使用本发明用作治疗缘自酶缺陷的疾病，如高歇病的用途。高歇病是人类最常见的溶酶体贮存病症，其源自葡糖脑苷脂酶(GC)这种酶的缺陷(Nolta等，(1992)，J.Clin.Invest.90(2)：342-348)。

用包含编码化学伴侣的序列的螺杆菌属疫苗构建体提供酶替换治疗。(Sawker等，(2002)，PNAS USA 99(24)：15428-15433)。由此可以获得功能性β-糖苷酶(β-Glu，葡糖脑苷脂酶)水平的提高。特别地，可以将化学伴侣脱氧野尻霉素(NN-DNJ)用于幽门螺杆菌构建体中并口服或胃内施用于患者。

作为又一实施方案的部分，提供如本文所述的基于螺杆菌属细菌的构建体，其包含具有感兴趣的非螺杆菌属药理学活性分子的载体，在这种情况下，所述活性分子编码葡糖脑苷脂酶(GC)。在Nolta等(1992)中描述，将逆转录病毒介导的葡糖脑苷脂酶培养的高歇骨髓转移作为治疗高歇病的一种方法。然而，这种方法是极具侵入性的。使用包含编码缺陷酶，葡糖脑苷脂酶的序列的本发明的基于螺杆菌属细菌的构建体的可选酶替代疗法提供了针对这种疗法更具有吸引力和不那么昂贵的可选方法。

实施例15.淋巴瘤的治疗

提供本实施例来证实使用本发明来提供适合于治疗和/或抑制细菌诱导的恶性肿瘤，诸如淋巴瘤，特别是MALT淋巴瘤的有用制备物的应用，其中使用包含如本文所述的螺杆菌属载体和/或质粒载体的疫苗接种制备物。

Sutton等(2004)(Vaccine，22(20)：2541-6)报道了针对猫胃螺杆菌(Helicobacter felis)对动物进行疫苗接种/免疫后，导致针对细菌诱导的恶性肿瘤，具体为原发性胃MALT淋巴瘤的保护。

本文的幽门螺杆菌构建体也可以用于提供针对细菌诱导的恶性肿瘤的疫苗接种保护，并且具体而言针对原发性胃MALT淋巴瘤，所述构建体包含适合于提供包括除猫胃螺杆菌之外的感兴趣的免疫原性抗原在内的免疫制备物的载体和/或质粒载体。作为举例，所述质粒载体的一些实施方案将包括融合蛋白，其包含幽门螺杆菌编码序列和非幽门螺杆菌编码序列，即，例如，除猫胃螺杆菌抗原种类之外的。

实施例16.使用幽门螺杆菌的活疫苗递送系统

本实施例证实在活疫苗中使用幽门螺杆菌的应用，并且特别是使用幽门螺杆菌作为活的病毒制备物的部分来将感兴趣的蛋白质递送至动物的胃粘膜。具体而言，本实施例证实使用本发明用于通过重组幽门螺杆菌外膜的外表面提供感兴趣的抗原向动物胃粘膜的递送。

本研究首先使用幽门螺杆菌菌株B128，变体7.13进行(Franco等(2005)。将赋予蔗糖敏感性和卡那霉素抗性的sacB表达盒插入幽门螺杆菌的hopE基因。

本文证明幽门螺杆菌可作为有用的运载体用于疫苗递送，并且为治疗动物尤其是人提供改进的细菌递送形式。在确立基于幽门螺杆菌的疫苗在对人治疗中的应用时重要的因素包括以下各项：

1.大多数感染有幽门螺杆菌的人是无症状的；

2.幽门螺杆菌的感染诱导获得性免疫应答和先天免疫应答二者；

3.幽门螺杆菌的感染能够在胃粘膜中保持，促使长时间暴露于抗原；

4.幽门螺杆菌的感染产生破坏胃上皮的分子，由此促进细菌暴露于粘膜下的免疫系统；

5.用于幽门螺杆菌的基因组数据和分子技术容易获得，由此促进其遗传操作。

HopE是一种幽门螺杆菌的外膜蛋白。本实施例证实可以修饰编码这种蛋白质的核酸序列使其包括期望的编码感兴趣的分子的序列(“X”)，其后含有这种经修饰的HopE-序列的幽门螺杆菌可以用在疫苗中，从而将所述感兴趣的分子(“X”)递送至动物的粘膜表面。

在本实施例中，使用p60蛋白和HCCA蛋白来证实递送理论的证据，并且作为可用于提供这种经工程改造的幽门螺杆菌HopE基因的蛋白质的简单实例。

方法：

细菌菌株和培养物

将幽门螺杆菌菌株B128(7.13)(52)或26695(64)培养在补充了5％马血的Columbia琼脂(Oxoid，Basingstoke，United Kingdom)上，并且在微需氧条件(10％CO2)下在37℃温育。通过天然转化(65，66)转化幽门螺杆菌。使用氯霉素(10μg/mL)或卡那霉素(10μg/mL)选择转化体。将大肠杆菌菌株DH5-α(67)在37℃培养在LuriaBertani(LB)培养基中并且通过电穿孔(68)转化。使用5％(w/v)蔗糖、卡那霉素(50ug/mL)或氨苄青霉素(100ug/mL)选择转化体。使用DNeasy Tissue Kit(Quiagen)提取基因组DNA。使用QlAprep Spin MiniprepKit(Quiagen)进行质粒提取。

重组DNA分子的构建

通过使用剪接重叠延伸(SOE)PCR(69)装配单独的PCR产物，由此构建了重组DNA分子。设计引物以在PCR产物末端引入12bp的重叠，其允许产物在PCR过程中结合在一起(图8)。所有预备扩增使用Pwo聚合酶(RochePharmaceuticals)进行。

构建重组DNA以将氯霉素抗性基因插入hopE。使用引物HopEF3和HopER3扩增了一个包括hopE的一部分和延伸的上游的区域(产物A)。从pHe12(70)使用引物CATF和CATR扩增了opa启动子和氯霉素抗性基因(产物B)。使用引物HopEF4和HopER5扩增了包括hopE的一部分和延伸的下游的区域。使用引物HopEF3和HopER5如Chalker等(69)所述将产物A、B和C连接在一起。

使用基于sacB的选择系统(71)实现了等位基因替换(allelic replacement)。将赋予蔗糖敏感性和卡那霉素抗性的sacB表达盒插入感兴趣的基因。将重组DNA转移至蔗糖敏感性幽门螺杆菌。转化体为蔗糖抗性，得自用转化的DNA替换了sacB。

将sacB表达盒与hopE DNA通过多个步骤连接。首先，使用引物HopEF6和HopER6扩增了hopE基因。将纯化的扩增子用Ncol和Bglll(RochePharmaceuticals)消化。将扩增子和以类似方式消化的pBADMyc-HisB(Invitrogen Life Technologies)使用Quick-stick Ligation Kit(Bioline)连接并且转移至大肠杆菌，产生质粒pBAD1。其次，使用引物HopEF7和HopER7扩增了DNA区，其包括在hopE和下游推定的mraW基因(编码5-S-腺苷甲基转移酶(5-S-adenosylmethyltransferase))之间的804bp的基因间区域。将纯化的扩增子用Bglll和Xball消化，连接至以类似方式消化的pBAD1，并且转移至大肠杆菌以产生质粒pBAD2。最后，使用引物KanSacF和KanSacR从pENKSF(59)扩增sacB表达盒。将所述扩增子和pBAD2用Bglll消化，连接，并且转移至大肠杆菌以产生质粒pBAD3。

类似地，将sacB表达盒插入cagA和vacA。对于cagA，在第一步使用引物cagAF2和cagAR2来扩增直接在cagA基因下游的区域，并且用Xbal和Bglll消化。在第二步中，将延伸至3’末端的cagA的一部分使用引物cagAF1和cagAR1扩增并且用Bglll和Ncol消化。在最后一步中，使用BgIll从pBAD3切下sacB表达盒，并且插入以类似方式消化的pBADMyc-HisB。对于vacA，在第一步使用引物vacAF4和vacAR4扩增了包括vacA的C末端区的一部分，并且用HindIll和Xbal消化。将所述片段克隆入以类似方式消化的pUC19以产生pUC1。其次，使用引物vacAF3和vacAR3扩增了包括vacA的N末端区的一部分，并且用EcoRl和Kpnl消化。将所述片段克隆入以类似方式消化的pUC1以产生pUC2。最终，使用引物KanSacF和KanSacR扩增了sacB表达盒，并且用BgIll消化以产生pUC3。

构建重组分子以将编码丙型肝炎病毒核心抗原(HCCA)或单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)p60的抗原部分的DNA插入hopE，替换sacB表达盒。使用连接PCR产物A、B和C的SOE PCR产生重组DNA分子。使用引物HopEF8和HopER1扩增了从hopE的起点延伸至nt 573的A区(产物A)。通过扩增引物HCCAF1、HCV.2a、HCV3.s、HCCAR1产生了编码HCCA抗原的序列从aa 7-53的一个区(产物B)。hopE nt 573的下游区使用HopEF2和HopER8扩增(产物C)。将产生自SOE PCR的产物克隆入质粒pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen Life Technologies)以产生pCR4HCH。

类似地，将p60抗原的DNA编码部分插入hopE和cagA。对于hopE，使用引物HopEF8和HopER9扩增了从hopE起点延伸到nt 573的区域(产物A)。通过退火引物Lmp60F2和Lmp60R2产生了p60抗原(产物B)。使用引物HopEF9和HopER8扩增了直接在hopE nt 573下游的区(产物C)。将从SOEPCR获得的产物克隆入经Smal消化的pUC19质粒以产生pUCHLm。对于cagA，使用引物CagAF6和CagER6扩增了包括cagA的3′端的一个区(产物A)。通过退火引物Lmp60F2和Lmp60R2产生了p60抗原(产物B)。使用cagAF6和cagAR8扩增了直接在cagA下游的区(产物C)。将获得自SOE PCR的产物克隆入经Smal消化的pUC19以产生pUCCLm。

对于vacA，使用引物vacAF1和vacAR1从菌株26695扩增了包括基因启动子和信号序列的vacA的一个区(产物1)。通过退火引物Lmp60F3和Lmp60R3产生了p60抗原(产物B)。使用vacAF2和vacAR2扩增了包括编码自转运子(autotransporter)和成熟VacA的区在内的部分(产物C)。将产自SOE PCR的产物用Xbal和kpnl消化，并且克隆入以类似方式消化的pUC2以产生pUCVLm。

Western印迹分析

为了测定重组细菌是否产生了HopE和抗原表位的融合，进行了Western印迹分析。

从24小时的血琼脂HEPES(pH 7.4)收获幽门螺杆菌，并且通过在4500rcf离心5分钟产生沉淀，再通过超声进行破坏。将裂解物在4500rcf离心5分钟以沉淀未裂解的细菌，将未裂解的细菌弃去。为了收获完整的膜级分，将上清液在100000rcf离心60分钟。全部流程在4℃进行。将样品重悬在HEPES缓冲液中，并且添加至等体积的Laemmli缓冲液。使蛋白质在12％Tris-HCI Ready Gel(BioRad)中通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，之后电转移至0.45pM硝酸纤维素(Biorad)。为了检测HopE和其它蛋白质，将膜用10％或5％的脱脂乳(non-fat dairy milk；NFDM)Tris缓冲盐溶液(TBS)pH 7.4封闭。用一抗或二抗在1％NFDM的TBS溶液中探测膜。多克隆兔抗HopE抗体是捐赠的(Astra Zenica)，并且以2∶4000的稀释度使用。单克隆小鼠抗p60(K3A7)是捐赠的(University of Wurzburg，Germany)，并且2∶4000的稀释度使用。小鼠抗HCCA(C7-50；Sigma)的稀释度为2∶4000。将二抗与碱性磷酸酶缀合，并且使用氮蓝氯化四唑(nitro blue tetrazoliumchloride)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酶溶液(Roche Applied Science)来检测。

基于免疫的表面定位测定法

将幽门螺杆菌从24小时血琼脂平板收获到磷酸盐缓冲盐溶液(PBS；pH7.4)中。将细菌清洗总共3次，并且标准化至OD(600nm)0.5。将清洗的细菌与用聚-L-赖氨酸涂覆的腔式载玻片在4℃过夜结合。将结合的细菌用0.25％戊二醛固定，其后将戊二醛用100mM甘氨酸缓冲液封闭。在后续步骤之间，将载玻片在含0.05％吐温20的PBS(PBST)中清洗3次。将载玻片用PBST中的3％牛血清白蛋白(BSA)在37℃封闭(lock)2小时。将一抗在含1％BSA的PBST中以1∶200稀释，并且在室温温育1.5小时。将与Alexafluor488缀合的二抗在PBST中以1∶400稀释，并且在37℃温育2小时。清洗载玻片并且使用荧光显微术检测表面结合的抗体。以类似于间接免疫荧光研究的方式进行基于全细胞的ELISA，除了下述例外：将细菌与Maxisorp(Nunc)平板在4℃结合过夜或结合1小时；将一抗以1∶300稀释；将与碱性磷酸盐缀合的二抗以1∶1000稀释；使用硝基苯磷酸(Sigma)作为底物用于使用微量滴定平板读数器(microtiter plate reader)在405nm的检测。

结果

重组幽门螺杆菌的构建

产生了重组幽门螺杆菌B 128(7.13)或26695，其在hopE、cagA或vacA基因中含有sacB表达盒。在这些基因内的特定位置将sacB表达盒用编码抗原的DNA替换。将HCCA和p60抗原DNA二者插入hopE中对应于成熟HopE的氨基酸168的位置，其在推定的环结构内(51)。将p60抗原DNA插入使其直接在cagA终止密码子的上游，对应于CagA的C末端。VacA和抗原蛋白的融合在菌株B128(7.13)中进行，该菌株不产生VacA。将p6抗原DNA与26695启动子、信号序列和自转化子DNA结合，之后插入B128(7.13)vacA。

融合蛋白和表面呈递的分析

目前为止仅分析了与HCCA或p60抗原融合的HopE。对产生插入hopE中的HCCA(B128:HCCA:hopE)或p60抗原(B128:p60:hopE)DNA的幽门螺杆菌B128的Western印迹分析显示所述抗原与HopE融合(图9)。具体而言，使用抗HopE抗体进行的分析显示，在重组幽门螺杆菌中，天然HopE(约31kDa)被与p60抗原(约32kDa)或HCCA(约35kDa)融合的HopE替换。使用抗原特异性抗体的进一步分析检测到了类似大小的蛋白质。

为了检验表面呈递，采用了两种间接的基于免疫的表面定位测定法。对幽门螺杆菌B128:HCCA:hopE进行的基于免疫荧光的显微分析表明了与HCCA融合的HopE的表面呈递(图10)。然而，与p60抗原融合的HopE的表面定位不能确认。通过基于全细胞的ELISA分析确认了这些结果(图11B)。使用这种方法仅在细菌与ELISA平板过夜结合之后才检测到了p60抗原(图11A)。

本实施例中的研究首先使用幽门螺杆菌菌株B128，变体7.13(Franco，2005)(52)进行。将赋予蔗糖敏感性和卡那霉素抗性的sacB表达盒插入幽门螺杆菌的hopE基因。将编码HCCA或p60表位的DNA与hopE使用剪接重叠延伸(SOE)PCR结合。将重组DNA使用天然转化和同源重组转移至蔗糖敏感的幽门螺杆菌中。重组幽门螺杆菌是蔗糖抗性的，其得自用转化DNA替换了sacB。在本文描述的测定法中使用了表1中呈现的以下寡核苷酸引物：

表1-寡核苷酸引物：

表2-使用和开发的幽门螺杆菌菌株：

幽门螺杆菌菌株B128的天然转化生成了重组细菌，如通过序列分析确认的，该重组细菌产生与p60或HCCA DNA融合的hopE。所得融合蛋白大于未改变的HopE(图8)。使用荧光显微术显示了对HCCA表面定位的确认(图9)，并且从基于全细胞的ELISA分析的结果得到了证实。

实施例17.测定脲酶基因中用于FLAG标签插入的位点

认为疫苗抗原在幽门螺杆菌细胞表面上或在分泌蛋白质上的呈递将允许开发抗原特异性保护性免疫应答。在这项研究中，蛋白质UreA和UreB被认为是呈递分子。这些分子结合形成多亚单位的酶脲酶。选择脲酶有几个理由，它是：

1.最丰富的幽门螺杆菌蛋白之一(＞总蛋白质的5％)；

2.在幽门螺杆菌感染过程中是抗原性的；

3.结构已知；

4.活性易于通过集落染色检测

5.在培养过程中能够直接选择活性脲酶

6.认为脲酶在体内是关键的，这允许了对活性脲酶的选择。

脲酶亚单位的结合是复杂的，并且该酶是否可耐受任何插入也是未知的。因此，使用FLAG标签(8aa)来调查插入的初始耐受，其后用与p60抗原相邻的FLAG标签调查(供31aa)。FLAG是短的免疫原性标签，其具有可用的商业抗体。单核细胞增生利斯特氏菌p60蛋白是高免疫原性的胞壁质水解酶，其对于细胞分裂是关键的。所述蛋白质由利斯特氏菌属菌种大量分泌到生长培养基中，大小约为60-kDa，并且由Iap(侵入相关蛋白(invasion-associated protein))编码。在本研究中使用的p60部分由p60蛋白的CD4T细胞和B细胞表位组成，并且已经证明了当由在其表面表达所述表位的沙门氏菌属免疫接种菌株呈递时，赋予针对鼠利斯特氏菌病(murinelisteriosis)的保护。

作为可供选择的抗原载体，也考虑了相关的HcpA和HcpC蛋白。已经解析了HcpC的晶体结构。这些分子属于Sel-1样蛋白家族，最有可能分泌，并且人的免疫系统能够“看见”它们。在细菌培养中不需要它们，在感染过程中需要它们或它们对活力(vigor)有贡献的可能性还有待检测。

基于前述内容，此项工程的目的是测定脲酶中耐受FLAG标签插入的位点；将利斯特氏菌属p60蛋白表位插入建群幽门螺杆菌菌株的小鼠中脲酶的耐受位点，和将利斯特氏菌属p60蛋白表位插入建群幽门螺杆菌菌株的小鼠中HcpA和HcpC的耐受位点。

方法

通常将细菌培养在基于血的培养基中。使用的菌株是26695的链霉素抗性的(StrR)变体(在密码子43的rpsL突变)，还有X47(由于rpsL密码子88的突变已经是StrR抗性的)。基因融合采用了Douglas Berg Lab(Washington University)开发的链霉素反选系统，表3中描述的引物和天然转化(图17)。

通过将rspLermB(rpsLermB)表达盒插入感兴趣的基因来产生受体菌株(图14)。用含有FLAG和用于同源重组的侧翼序列的PCR产物替换rspLermB(rpsLermB)表达盒，所述替换赋予链霉素抗性和脲酶活性。在含有链霉素和尿素和酚红的琼脂平板上选择具有功能性脲酶的转化体(表4)。只有产生功能性重组脲酶的那些细菌能够在尿素平板上生长(图15)。

选择了很可能耐受氨基酸插入的脲酶中的8个位点(图16)，和HcpA和HcpC中各2个位点(图12b；图12c)。将PCR产物在第二轮PCR中剪接在一起并用于对受体菌株的DNA转化(图13a)，所述PCR产物携带由5个或6个半随机密码子在侧翼包围的期望表位(FLAG)，选择排除3个可能的终止密码子中的2个。进行类似的方法来将p60表位插入FLAG的相邻处(p60FLAG)。然而将基因组模板DNA稀释并且将所得扩增子用DpnI处理以去除基因组DNA(图13b)。

结果

将ureA和ureB基因缺失，并且还缺失了对应于3个不同的潜在插入位点组的ureA或ureB的三个小部分，并且使用Dr.SungSook Choi(Sahmyook University，目前在Berg Lab进行休假学期(sabbatical))的rpsLermB反选表达盒进行替换(图14)。通过DNA转化使用装配的PCR产物替换三个rpsLermB插入，所述PCR产物在ureA或B的8个位点中的每一个含有FLAG标签。选择含有功能性脲酶的用这些PCR产物制备的细菌转化体，并且通过DNA测序确认了三个在位点3、4和8含有FLAG标签(图12a)。扩增装配的PCR产物以将与FLAG标签相邻的p60抗原插入所述8个位点的脲酶中。用所述装配的产物转化幽门螺杆菌，产生了分离的重组体，通过PCR检测到所述重组体在功能性脲酶中的位点1a、3或4处含有p60FLAG标签(图12a)。

实施例18.分析幽门螺杆菌脲酶中FLAG标签的插入

通过应用晶体学对称映射(crystallographic symmetry operator)已经从沉积坐标(deposited coordinates)(PDB-id：1e9y)重新构建了幽门螺杆菌脲酶复合物的三维结构。脲酶形成一个大的球形复合体，并且由12个UreA(SwissProt-id：P14916)和12个UreB(SwissProt-id：P69996)多肽链组成(图16a)。对这种复合体表面暴露的环进行视觉观察，所述环还表现出高度的热移动性(high thermal mobility)。图16b显示根据热移动性染色的分子表面。

视觉观察揭示了三个似乎适合于插入Flag(Fag)标签(DYKDDDDK肽)的位点。根据它们的适合性排列所述位点：

位点1-此位点似乎最合适。UreB的残基324-333完全暴露于溶剂并且显示高度的热柔性(thermal flexibility)(图16b中的红色表面)。高柔性似乎是因缺乏与脲酶核心的稳定化相互作用而引起的。因此，肽链的所述构象未受抑制，并且似乎适合于接纳较大插入物的插入。通过用Flag十肽替换UreB(P69996)的残基L324DKSIKEDVQ333(注意L324是晶体结构中的赖氨酸)。由于所述环相对较长，几种替换和插入是可能的并且应该进行测试。尽管这种环柔性非常好，但是它在几种UreB序列中惊人地十分保守。除非其参与了未知的细胞功能(例如粘附于幽门螺杆菌细胞壁)，应该没有对脲酶分子功能的干扰。

位点2-UreA(P14916)的残基H224GAKSDDN231似乎适合于替换为Flag十肽，但是不适合于插入较大的片段，诸如例如丙型肝炎外壳蛋白，因为这种环位于接近三重对称轴(three-fold symmetry axis)处。所述环位于接近UreA C末端处，其暴露于溶剂、具有柔性并且几乎不显示与脲酶核心的相互作用。因此突变应该不影响脲酶活性。N231和UreA C末端之间的7个氨基酸与对称相关的亚单位相互作用。因此我将建议保留这些残基，尽管多重序列比对显示UreA C末端几乎不具有序列保守性。

位点3-UreA的残基E101ANGKLV107也被替换成DYKDDDDK。全部的结构应该都耐受一个额外氨基酸的插入，因为这种环显示高度的热柔性。多重序列比对揭示这种环在来自不同物种的UreA同源物中含有插入。

仅基于HP脲酶结构认为这些位点最佳。已经基于HP脲酶结构与来自其它细菌的同源脲酶结构的重叠检查了这些位点。这些重叠可用于鉴定刚性的并且十分保守的位点，并将它们与可用于插入表位的柔性表面环区分。全部相当类似的脲酶结构说明由于功能限制所以基本不存在结构柔性。然而，重叠确认了位点1到3，UreA C末端和UreB N末端适合于接纳标签。此外，我们在UreB上发现了三个额外的位点应该被考虑作为备份。

编号参考SwissProt条目P69996：

位点4(UreB).NNPSKEE(65)NNNNNN DYKDDDDK NNNNNN L(66)DLIIT...

位点5(UreB).HIEVNPE(541)NNNNNN DYKDDDDK NNNNNN T(542)YHVFV...

位点6(UreB).YHVFVDG(549)NNNNNN DYKDDDDK NNNNNN K(550)EVTSKP...

由于N和C末端可以自由接近，我将会建议将Flag标签置于C末端(与3到4个填充残基(padding residue)一起)

...DILKQLKIKV XXX(Flag-标签)

或紧接着前导肽在残基25和26之间，诸如

...GGLMA XXX(Flag-标签)XXX EQDPK...

其中″X″表示填充残基。除了HcpC(Hp1098)，我还会考虑HcpA(Hp0211)。迄今为止我们已知HcpA激发较强的IFN-γ释放，其与小鼠免疫模型中较好的保护十分相关。用于HcpA的相应的构建体将是

...ALKELKIEL XXX(Flag-标签)

和

...RGLMA XXX(Flag-Tag)XXX EPDAK...

从结构的角度看完全不需要插入接头，因为两个末端都是可以自由接近的。因此省略(skip)用于C末端构建体的接头，只要将Flag标签置于紧接着天然C末端之后即可。对于N末端构建体，我们会将两个氨基酸长的接头置于Nm末端信号肽和Flag标签之间。这样做的理由是，对于有关前导肽酶精确切割位点的预测有些含糊，而我们想要避免前导肽酶在Flag标签内部的某处切割。用于HcpA和-C的可能的构建体看上去将是这样

(HcpA/Hp0211)

MLGNVKKTLFGVLCLGTLCLRGLMA EP(Flag-标签)EPDAKELVNLGIESA...

(HcpC/Hp 1098)

MLENVKKSFFRVLCLGALCLGGLMA EQ(Flag-标签)EQDPKELVGLGAKSY...

对于折叠成确定三维结构的较大标签，我们可能必需考虑接头。

培养基制备

以下抗生素和生长补充剂(growth supplement)的组合允许在不含真菌和细菌污染的常规基底(basis)上培养幽门螺杆菌。

1.混合培养基组分，确保使添加的抗生素的体积充足

2.一旦经过高压灭菌，将培养基在水浴中降至50℃

3.预热100mL抗生素贮液，使得最终培养基浓度为IsoVitaleX(0.4％v/v)、两性霉素B(8μg/mL)、万古霉素(6μg/mL)和三甲氧苄二氨嘧啶(5μg/mL)。并预热血液。

4.向经高压灭菌的培养基添加预热的血液

5.充分混合，设法避免产生气泡

6.向经高压灭菌的培养基添加预热的100mL抗生素溶液

7.充分混合，设法避免产生气泡

8.向培养基添加任何溶于乙醇的抗生素(红霉素)

9.倒板。

用于小鼠研究的培养基额外补充有萘啶酮酸(nalidixic acid)(10μg/mL)、多粘菌素B(10μg/mL)和杆菌肽(200μg/mL)。

尿素选择平板

表4

用于选择脲酶阳性幽门螺杆菌的培养基的组成

贮藏培养基

胰蛋白酶大豆液体培养基(g/L)和20％(v/v)甘油。将24小时培养物通过搅棒混入(swizzle in)这种培养基，并使用干冰瞬时冷冻(snap freeze)。用于样品时不将贮液解冻，而是从冷冻表面刮取细胞用于培养。贮液可以重复使用多次。

液体培养基

Brucella液体培养基(g/L)补充有7％(v/v)马血清和万古霉素(6μg/mL)。通常在50mL螺口盖锥形瓶中使用10mL，以150rpm摇动，在37℃，于受控通气培养箱(control gas incubator)中。

通过SOE PCR装配

通过SOE PCR装配所有构建体，并且用于转化细菌。该过程示于图13。

幽门螺杆菌的转化

Berg转化方案的示意图示于图17。

实施例19.流感血细胞凝集素表位与脲酶的融合

使用A/PR/8/34血细胞凝集素(HA)表位作为抗原用于通过重组脲酶呈递并由幽门螺杆菌递送。选择用于所述方案的HA表位是HAT细胞表位(氨基酸序列：SFERFEIFPKE)和HA B细胞表位(氨基酸序列：WLTEKEGSYP)。这些表位在疫苗中的组合应该导致对宿主中体液和细胞介导的两种应答的激发。将全部构建体通过SOE PCR使用图13中所示过程装配。通过PCR构建了A/PR/8/34血细胞凝集素(HA)表位对应的核酸序列，所述PCR使用下文所列的引物，并且将所述核酸序列如图18中所示插入脲酶。幽门螺杆菌的转化按照图17中所示的转化方案示意图进行，并且选择功能性重组脲酶融合物。

为了检测重组脲酶内的表位，进行了Western印迹分析。在流感表位相邻处包括FLAG蛋白标签序列使得对重组蛋白的检测可以使用可商购的抗体进行。Western印迹分析显示FLAG插入在较小蛋白亚单位ureA的位点1a处，和较大蛋白亚单位ureB的位点4和8处。在位点3检测到了非常低的FLAG蛋白标签的信号(图19)。这个条带大小有误，对应于ureA而非ureB上的FLAG标签。

实施例20.使用流感血细胞凝集素表位与脲酶的融合物的免疫

为了测定经遗传修饰的幽门螺杆菌的免疫原性，用200μl 10⁹cfu/ml表达位于脲酶位点1a、3、4或8处的HA表位的幽门螺杆菌(si1a、si3、si4和si8)胃内免疫C57BL/6小鼠。73天之后，收集血清并且通过ELISA测定抗HA IgG效价。简言之，用5mg/ml经由其C末端(SFERFEIFPKEC)与核糖核酸酶H偶联的B细胞表位肽涂覆平板，并且在4℃温育过夜。在用2％PBST-BSA在37℃封闭平板2小时之后，添加血清样品，并且将平板在室温温育1小时。使用碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗来检测抗HA IgG抗体。使用硝基苯磷酸作为底物并且在30分钟后用NaOH终止反应。在405nm测量光密度(OD)。图20显示用活的重组幽门螺杆菌免疫的小鼠在73天的胃内建群之后产生了抗原特异性抗体。20只经免疫小鼠中的5只在血清中产生了抗原特异性抗体。发现20只经免疫小鼠中的11只小鼠在73天之后存在幽门螺杆菌的建群。这些血清学阳性小鼠存在于用si1a、si4和si8重组幽门螺杆菌免疫的组中。在用si3重组幽门螺杆菌免疫的组中不存在抗原特异性免疫应答。

将本申请引用的全部文献、专利、刊物文章和其它材料通过引用并入本文。

尽管已经结合本发明的数种实施方案参考附图对本发明进行了充分描述，但是应该理解，对于本领域技术人员而言多种变化和修改可以是显而易见的。这些变化和修改应理解为包括在由所附权利要求书限定的本发明的范围之内，除非它们背离了本发明。

参考文献

将下文所列参考文献以及说明书中引用的参考文献通过引用以补充、解释、提供背景技术或教导本文所用方法、技术和/或组合物的程度并入本文。

1.US 6,570,004-Blaser等(2003)。

2.US 6,680,179-Collins等(2004)。

3.US 6,383,496-Curtiss等(2002)。

4.US 6,150,170-Powell等(2000)。

5.US 6,410,012-Seizmore等(2002)。

6.US 6,550.419-Hone等(2002)。

7.US 6,531,313-Goudsmit等(2003)。

8.US 6,682,729-Powell等(2004)。

9.美国专利公开2005/0075298-Chen等(2005)。

10.美国专利公开2002/0176848-Seizemore等(2002)。

11.美国专利公开2005/0096288-Guevara等(2005)。

12.美国专利公开2004/0236072-Olmsted等(2004)。

13.美国专利公开2004/0203039-Hensel等(2004)。

14.美国专利公开2004/0005325-Kusters等(2004)。

15.美国专利公开2002/0032152-Torossian(2002)。

16.美国专利公开2003/0170264-Turner等(2003)。

17.美国专利公开2003/0204068-Blasec等(2003)。

18.美国专利公开2002/0161192-Meyer等(2002)。

19.WO96/33274-Covacci等(1996)。

20.WO99/21959-Ellis等(1999)。

21.WO01/94599-Burman等(2001)。

22.WO2005021026-Baron，等(2005)。

23.Graham等(2002)，Gastroenterology，123：1637-1648。

24.Liu等(2005)，World J.Gastroentero.，11(14)：2154-2156。

25.Conway(2005)，Curr.Pharm.Res.，11(6)：775-90。

26.Sawker等(2002)，PNAS USA，99(24)：15428-15433。

27.Sutton等(2004)，Vaccine，22(20)：2541-6。

28.Kang等(2005)，World J.Gastroentero.，11(3)：454-456。

29.Moschos等(2004)，Immunology and Cell Biology，82(6)：628-637。

30.Reddy等(2004)，Inter.J.Antimicrob.Agents，24(6)：536-47。

31.Bai等(2003)，Sheng Wugong Cheng Xu Bao，19(4)：433-8。

32.Nolta等(1992)，J.Clin.Invest，90(2)：342-348。

33.Shi等(2005)，Helicobacter，10(1)：71-9。

34.Deml等(2005)，Infection Immunity，73(8)：4732-42。

35.Cosima等(2005)，Trends in Immunology，26(4)：199-207。

36.Velin等(2005)，Gastroenterology，129(1)：142-155.

37.Kong等(2000)，NAR，28(17)3216-3223。

38.Mao等(2003)，World J.Gastroentero.，9(7)：1529-1536。

39.Chu等(2005)，World J.Gastroentero，11(23)：3518-22。

40.Kathy Parton.(2000)，Institute of Veterinary，Animal and BiomedicalSciences，“Helicobacter mustelae as vector for biological control in stoats”Wildlife Health and Conservation Research Program；Landcare Research(Funding Body)。

41.Forrester & Parton(2000)，NZ Vet.J.，48：65-69.

42.Spranger等(2005)，Br.Nutr.，93(6)：765-71。

43.Garbom等(2004)，Infect Immun.，72(3)：1333-1340。

44.Tschop等(2000)，Nature，407：908-13。

45.Choi等(2003)，Edocrinology，144(3)。

46.Remington’s Pharmaceutical Sciences，20^th edition，Mack PublishingCompany。

47.Jones等(2005)，Nat.Med.11(7)：786-90。

48.Curtis(2005)，In Mestecky，等(编辑.)，Mucosal Immunity，3 ed.Academic Press，pp.1009-1037。

49.Portal-Calthay & Perez-Perez(2006)，Clin.Sci(Lond)，110：305-314。

50.Amieva等(2003)，Science，300：1430-1343。

51.Bina等(2000)，J.Bacteriol.，182：2370-2375。

52.Franco等(2005)，PNAS USA，102：10646-10651.

53.Doig等(1995)，J.Bacteriol，177：5447-5452。

54.Doig & Trust(1994)，Infect Immun，62，4526-4533。

55.Odenbreit等(2000)，Science，287，1497-1500。

56.Orsini等(1998)，Helicobacter，3：15-20。

57.Hohlfeld等(2006)，Mol Microbiol，59：1624-1637。

58.Sarker等(2004)，Acta Paediatr，93：1432-1436。

59.Fischer等(2001)，Infect Immun：，67：69-6775。

60.Chien等(1999)，J Clin Microbiol，37：1393-1397。

61.Bubert等(1992)，J Bacteriol，174：8166-8171。

62.Spreng等(2003)，Vaccine，21：746-752。

63.Kuhn&Goebel(1989)，Infect Immun，57：55-61。

64.Akopyants等(1995)，Infect Immun，63：116-121。

65.Bijlsma等(1999)，Infect Immun，67：2433-2440。

66.Wang等(1993)，J Gen Microbiol，139：2485-2493。

67.Hanahan(1983)，J.Mol Biol，166：557-580。

68.Dower等(1988)，核酸s Res，16：6127-6145。

69.Chalker等(2001)，J Bacteriol，183：1259-1268。

70.Heuermann & Haas(1998)Mol Gen Genet，257：519-528。

71.Copass等(1997)Infect Immun，65：1949-1952。

Claims (5)

1.核酸构建体在制备可递送到哺乳动物的粘膜的用于治疗哺乳动物中非螺杆菌相关疾病之药物中的用途，所述核酸构建体包括

(i)天然UreA或UreB基因的第一部分的第一幽门螺杆菌核苷酸序列，

(ii)天然UreA或UreB基因的第二部分的第二幽门螺杆菌核苷酸序列，和

(iii)位于所述第一和第二幽门螺杆菌核苷酸序列之间的感兴趣的非螺杆菌核苷酸序列，其中所述构建体一表达所述感兴趣的非螺杆菌核苷酸序列与功能性脲酶就被一起表达，和其中所述感兴趣的非螺杆菌核苷酸序列的表达产物可被递送到所述哺乳动物的粘膜，和其中

所述感兴趣的非螺杆菌核苷酸序列在编码幽门螺杆菌UreA蛋白的位点103，231或239的氨基酸的位点插入到幽门螺杆菌UreA基因，或

所述感兴趣的非螺杆菌核苷酸序列在编码幽门螺杆菌UreB蛋白的位点2，66，327，542或550的氨基酸的位点被插入到幽门螺杆菌UreB基因。

2.权利要求1的用途，其中所述感兴趣的非螺杆菌核苷酸序列编码抗原。

3.权利要求1或2的用途，其中所述药物包括用核酸构建体转化的幽门螺杆菌菌株。

4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述药物是疫苗。

5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述哺乳动物的粘膜是所述哺乳动物的胃粘膜。