CN101628005A - β-葡聚糖在抵抗生物战争武器和包括炭疽在内的病原体中的应用 - Google Patents

β-葡聚糖在抵抗生物战争武器和包括炭疽在内的病原体中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种方法以广泛保护军队和公众免受生物战争武器，尤其是如炭疽等传染媒介物的伤害。β(1，3)－葡聚糖，尤其是全葡聚糖颗粒、PGG－葡聚糖、和微粒葡聚糖，可提供一般性免疫增强，因此提高了身体抵御许多不同生物威胁的能力。在感染之前和之后施用时，显示β(1，3)－葡聚糖提高了对炭疽和其它传染性生物感染的抗性。3(1，3)－葡聚糖的抗感染机理似乎涉及对先天免疫系统的刺激，这通过增加细胞因子释放及CR3受体活化而实现。β(1，3)－葡聚糖在药学上稳定，相对紧密，并且使用中也没有显著的副作用。β(1，3)－葡聚糖还能增强其它医疗措施如抗生素、疫苗和免疫抗体等的效力。

Description

β-葡聚糖在抵抗生物战争武器和包括炭疽在内的病原体中的应用
本申请是于2003年10月9日提出的国际申请PCT/US2003/032196的分案申请。
发明领域
本发明涉及对生物战争武器的伤害的预防或治疗，尤其涉及炭疽等病原性生物感染的预防和治疗。
发明背景
炭疽杆菌(Bacillus anthracis)，或炭疽是当今最令民防计划者担心的潜在生物战剂之一。这种生物可制造有效的生物恐怖武器，因为其具有很高的死亡率，制备简单且易于以芽孢颗粒的形式储存，并可作为气雾剂的形式在广大的区域内传播。Thomas V.Inglesby等.，″Anthrax as a biologicalweapon：Medical and Public Health Management.″JAMA，281(18)1735-1745(1999)。这使炭疽被美国疾病预防控制中心(CDC)定为A类(高优先级)试剂。
生物战剂的散播可发生于气雾剂喷射、爆炸、或食物或水污染。作为一种有效的生物武器，空气传播的病原体必须分散成尺寸小于5μm 的精细颗粒。生物试剂的气雾化传播不需要先进的传播系统，可用农业的农药散播机、小船或卡车上的气雾剂发生器、背包喷射器、甚至是钱包大小的香水喷雾器进行散播。生物武器进攻很可能是隐蔽的，收到警报后或一旦怀疑生物战剂已经或将要使用，就应采取保护措施。CDC建议在鉴定所用特定生物战剂之前，先使用广谱抗生素应对生物战进攻的可能伤害。
CDC对生物战剂分有三个类别。A类生物战剂是最严重的。美国公共卫生系统和基层医护提供者必须为应对这些生物试剂做好充分准备，这些生物试剂包括在美国很少见的病原体。作为高优先级，A类试剂包括对国家安全造成危险的生物，因为它们易于散播或在人与人之间传播，导致高死亡率，具有对公众健康造成较大影响的潜力，可能导致公众恐慌和社会混乱，并需要为公共卫生预备采取特殊行动。这些试剂/疾病包括：炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)，肉毒杆菌毒素(Clostridium botulinum toxin)(肉毒中毒)，鼠疫杆菌(Yersinia pestis)(鼠疫)，大天花(Variola major)(天花)，野兔热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)(兔热病)，和病毒性出血热。
接下来是B类生物战剂。这是第二高优先级试剂，包括那些中度容易散播，导致中度发病率和低死亡率，需要特异性增强CDC诊断能力和加强疾病监督。这些试剂/疾病包括：伯纳特柯克斯体(Coxiella burnetti)(Q热)，布鲁菌属(Brucella species)(布鲁菌病)，鼻疽假单胞菌(Burkholderiamallei)(鼻疽病)，源于蓖麻(Ricinus communis)的蓖麻子蛋白毒素(蓖麻子)，产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)的ε毒素，葡萄球菌肠毒素B。
最后，是C类生物战剂。这些是第三高优先级试剂，包括新型病原体，因为这些新型病原体具有可用性、易于生产并传播、并有可能具有高发病率、死亡率和重大健康影响，因此在将来可通过改造而在大范围散播。这些试剂/疾病包括：Nipah病毒(Nipah virus)，汉滩病毒(hantaviruses)，蜱传出血热病毒，蜱传脑炎病毒，黄热病(yellow fever)，和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(结核病)。
A类生物战剂的一个例子是炭疽杆菌B.anthracis。炭疽杆菌是一种好氧革兰氏阳性杆菌，通常感染食草动物并导致严重的经常是致死的疾病。芽孢产生于30℃以下的土壤和无生命的物体上，但不产生于活组织中。芽孢可在有限时间段内抵御100℃以上的温度，这使它们能高度持久。人类可因接触被感染的动物或动物产品而获得此疾病。一旦进入体内，芽孢萌发成为“生长的(vegetative)”或活跃分裂的细胞。芽孢或被感染组织与破损皮肤之间的直接接触导致皮肤炭疽。接触后的2到5天内，形成小丘疹，然后是被水肿包围的坏死性溃疡。治疗后的死亡很少见，但未治疗人群的死亡率将近20％。摄入未熟透的肉类可以导致胃肠炭疽。在12到18小时内可继发恶心、呕吐及胃肠出血，并导致出血性淋巴炎。可能发生向血流的传播并继发死亡。
吸入性炭疽是生物战争应用中最可能的疾病形式，也是最危险的。现有的关于人类对吸入性炭疽反应的大量可用数据是1979年在前苏联斯维尔德洛夫斯克(Sverdlovsk)的一个军用微生物设备中炭疽孢子意外雾化释放的结果，导致了至少79例炭疽感染并且68例死亡。吸入炭疽孢子导致感染的最严重形式，在感染后1至5天内导致类似感冒的症状。吸入性炭疽的早期诊断是困难的并需要高怀疑指数，因为该疾病的第一阶段是相对良性的。然而，第二阶段突然发生，伴有突然发热、呼吸困难、发汗和休克，导致巨大淋巴结病和出血性脑膜炎。在疾病的第二阶段，发绀和低血压迅速发展，有时几小时内即发生死亡。Franz D.R.，等，″Clinicalrecognition and management of patients exposed to biological warfare agents.″JAMA，278，399-411(1997)。因为疾病发展迅速且初始症状相对温和，吸入性炭疽几乎总是致命的。Fritz等，Lab.Invest.，73，691-702(1995)。
炭疽杆菌感染的病理尚未完全了解。在最基本的水平上，通常血液中的过量复制是死于炭疽病人的死因。炭疽杆菌如此成功扩张的能力部分来自于其致病因子的产生，该致病因子可深度抑制免疫系统。炭疽杆菌的主要致病因子是一种抑制免疫系统巨噬细胞和嗜中性粒细胞摄入和破坏作用的聚-D-谷氨酸荚膜和外毒素。外毒素由三种蛋白成分组成；保护性抗原(PA)，致死因子(LF)，和水肿因子(EF)。Ballard等，PNAS，93，12531-12534(1996)。这些蛋白协同作用但并不总是结合在一起。保护性抗原结合于细胞表面以触发一种内涵体的形成，该内涵体用于传输水肿因子和致死因子通过胞内膜进入靶细胞的细胞质。水肿因子扰乱通过细胞膜的离子和水流，促发肿胀。致死因子是一种蛋白酶，其精确的作用机理仍然未知。Brossier等，Infect.Immun.，68，1781-1786(2000)。然而，已知致死毒素抑制巨噬细胞释放免疫信使白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、γ干扰素、和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
巨噬细胞在炭疽杆菌等许多用作生物战剂的病原生物的成功与否中起着关键作用。通过吞噬作用，巨噬细胞是与炭疽杆菌最先相互作用的细胞。在鼠吸入模型中从肺巨噬细胞的吞噬体隔室中分离出来的囊泡是芽孢萌发的最初位点。Guidi-Rontani等，Mol Microbiol.，31，9-17(1999)。巨噬细胞诱导抵御炭疽杆菌等病原体感染的宿主防御反应，如细胞因子分泌和细胞介导的细胞毒。萌发后毒性基因表达的早期开始是巨噬细胞应答的关键决定因素。LF蛋白对于巨噬细胞是溶解性的，亚溶解剂量的LF导致氧化一氮(NO)的减少和肿瘤坏死因子(TNF)的产生。Pellizzari等，FEBSLetters，462，199-204(1999)。另一方面，Hanna等人揭示亚溶解浓度的LF可通过活化的巨噬细胞而增加IL-1的生成。Hanna，等PNAS，90，10198-10201(1993)。随着巨噬细胞的激活，自然杀伤(NK)细胞和T细胞也积极参与了抵御炭疽等疾病的保护。与抗原初次接触后，观察到NK细胞活性上升，然后是其显著的抑制。Soloklin等，Zhurnal Mikrobiologii Epi.Immune.，5，72-76(1995)。应用抗炭疽等病原体的保护性抗体可增加NK细胞活性的持续时间。这暗示巨噬细胞和NK细胞在抵御炭疽等生物战剂的宿主防御机理中起主要作用。
另一方面，β-葡聚糖是一种复杂的碳水化合物并显示出作为免疫调节剂的潜力。其通常从几种来源得到，包括酵母、细菌、真菌和谷粒。这些来源提供有多种混合物和纯度的β-葡聚糖，并有多种不同的化学结构。β-葡聚糖的结构多样性源自葡萄糖分子可经许多不同方式相连的事实，导致了具不同物理特性的化合物。例如，从细菌和藻类分离的β(1，3)-葡聚糖是线型的，这使其作为食品增稠剂很有用。香菇多糖(来自香菇(Lentinusedodes)，担子菌(Basidiomycete)科)是一种高分子量(MW)β-葡聚糖，在(1，3)主链上每三个残基含有一个单葡萄糖支链连于(1，6)-β端。裂裥菌素(来自Schizophyllum commune，担子菌科)是类似的β-葡聚糖。来自大麦、燕麦或小麦的β-葡聚糖在主链上有混合的(1，3)-和(1，4)-β连接，但没有(1，6)-β分支，且通常是高分子量。侧链的频率，通称置换度或分支频率，调节二级结构和溶解度。由酵母分离的β-葡聚糖具有β(1-3)连接的葡萄糖单元的主链，该主链具有低水平的通过β(1-6)连接的分子间和分子内分支。基于大量发表的研究，公认面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)是优选的β(1，3)-葡聚糖来源，这基于其所得产物的纯度和活性。
S.cerevisiae的细胞壁主要含有β-葡聚糖，起支持其形状和机械强度的作用。虽然其作为食品级生物的应用最为人知，酵母还用于作为酵母聚糖的来源，酵母聚糖是一种用于刺激非特异性免疫应答的不溶性粗提物。酵母的酵母聚糖可作为β(1-3)葡聚糖的丰富来源。酵母分离的β(1-3)葡聚糖似乎可刺激免疫系统，部分是通过激活先天免疫系统作为机体抵抗真菌感染的基本防御部分。酵母β(1，3)-葡聚糖是一种多糖，主要由β(1-3)-连接的葡萄糖分子组成并含周期性的经β(1-6)连接的β(1-3)分支，更正式的名称是聚-(1，6)-β-D-吡喃(型)葡萄糖酰-(1，3)-β-D-吡喃(型)葡萄糖(poly-(1，6)-β-D-glucopyranosyl-(1，3)-β-D-glucopyranose)。
制备了具不同性质的多种形式的β(1，3)-葡聚糖。这些不同形式的差异在于它们的纯度、颗粒尺寸和溶解度。β-葡聚糖的一种较大且较难溶的形式是全葡聚糖颗粒(whole glucan particle)。全葡聚糖颗粒是酵母细胞壁残骸，其制备是从生长培养基中分离生长中的酵母，用碱处理完整的细胞壁，除去不需要的蛋白和核酸物质，以及细胞壁的甘露聚糖成分。通常，剩下的是纯化的2-5微米球形β-葡聚糖颗粒。全葡聚糖颗粒可从任何含葡聚糖的真菌细胞壁资源中获得，但优选的来源是S.cerevisiae。生产全葡聚糖颗粒的方法在本领域公知且公布于美国专利No.4,810,646，4,4992,540，5,037,972，5,082,936，5,250,436和5,506,124，其中所有内容在此结合一并作为参考。
β(1-3)葡聚糖另外一种被进一步处理过的形式是PGG葡聚糖，它是全化学名称聚-(1，6)-β-D-吡喃(型)葡萄糖酰(1，3)-β-D-吡喃(型)葡萄糖(poly-(1，6)-β-D-glucopyranosyl-(1，3)-β-D-glucopyranose)的简写。PGG葡聚糖(PGG)，在盐水中的一种特殊制剂，以为商标。通常，中性未衍生的β(1，3)-葡聚糖在生理介质中不溶，因为它们具有形成紧密相联的三螺旋纤维的趋势可抵抗水合作用。PGG由全葡聚糖颗粒制备，经一系列酸、碱和中性处理步骤后生成构象纯的、三螺旋可溶性葡聚糖制剂，此制剂可在中性pH下保存于清澈溶液中。生产PGG的方法在本领域中公知并公布于美国专利Nos.5,322,841，5,811,542，5,663,324，5,633,369和5,817,643，其内容在此结合一并作为参考。通过这种方法生产的可溶性葡聚糖是葡萄糖的带分支聚合物，依来源生物和所用确切处理条件的不同而含多种比例的β(1-3)和β(1-6)连接。PGG-葡聚糖分子的平均重量通常在约5,000到500,000道尔顿。
微粒葡聚糖是精制的葡聚糖以生产更小片段的全葡聚糖颗粒。生产微粒β-葡聚糖的方法公布于美国专利Nos.5,223,491，5,397,773，5,576,015，5,702,719和5,705,184，其中内容在此一并作为参考。用于制备微粒葡聚糖的β(1，3)-葡聚糖是通过本领域普通技术人员所知的传统方法从酵母菌细胞壁分离的。微粒葡聚糖通常的平均粒径优选约1.0微米或更小，更优选约0.20微米或更小。
β葡聚糖具有多种多样的活性。β-葡聚糖增强非特异性免疫和感染抗性的能力与内毒素相似。早期关于β(1，3)-葡聚糖对免疫系统作用的研究集中于小鼠。后来的研究表明β(1，3)-葡聚糖在许多其它种群中具有强烈的免疫刺激活性，包括蚯蚓、虾、鱼、鸡、大鼠、兔、豚鼠、羊、猪、牛和人类。综述见Vetvicka V.“β-glucans as immunomodulators″，JANA，3，24-31(2001)。基于这些研究作出结论，β(1，3)葡聚糖代表了一种活跃于进化谱中的免疫促进剂，可能代表了一种直接抵御真菌病原体的进化上保守的先天免疫应答。然而，尽管有大量研究，仍未能就用作免疫刺激剂的β(1，3)-葡聚糖的理想来源、尺寸和形式取得共识。
已经有一些关于应用β-葡聚糖预防感染的研究，主要在外科脓毒病的范围内。例如，Williams等评估了实验性脓毒病治疗中用β-葡聚糖和抗生素(庆大霉素)进行的组合免疫调节的作用。Williams等，″Synergistic effectof nonspecific immunostimulation and antibiotics in experimentalperitonitis″Surgery，，102(2)，208-14(1987)。这个特别的实验注意到预期大肠杆菌(E.coli)接种后单独的β-葡聚糖治疗对长期存活无有利影响。Kaiser进行了相似的研究，他用PGG葡聚糖和头孢唑啉(cefazoline)抗生素协同地预防葡萄球菌伤口感染。Kaiser A.B，Kemodle D.S.，″Synergismbetween poly-(1-6)-beta-D-glucopyranosyl-(1-3)-beta-D-glucopyranose glucanand cefazolin in prophylaxis of staphylococcal wound infection in a guinea pigmodel″，Antimicrob.Agents Chemother.，42(9)，2449-51(1998)。
β-葡聚糖的分子作用机理似乎包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞细胞膜上的特异性β-葡聚糖受体结合位点。甘露聚糖、半乳聚糖、α(1-4)连接的葡萄糖聚合物和β(1-4)连接的葡萄糖聚合物对此受体没有亲合力。近来的数据暗示CR3，C3补体蛋白的受体，起到β-葡聚糖主要受体的作用。结合到β-葡聚糖受体上的配基导致补体激活、吞噬作用、溶酶体酶释放，以及前列腺素、促凝血素和白细胞三烯生成，提供了一个更加功能化的先天免疫系统来抵御广泛的病原体攻击。
近来增强的生物恐怖威胁，其可能导致一种或多种病原生物的广泛散播，增强了我们的认识即我们只拥有较少可用的预防和治疗手段来保护美国公众。1970年，一个世界卫生组织(WHO)专家委员会估计在一个5百万人口的发达城市通过飞机投放50公斤炭疽将导致250,000伤亡，如无治疗预期其中100,000将会死亡。Health Aspects of Chemical and BiologicalWeapons，Geneva，Switzerland，WHO；98-99(1970)。一份来自美国国会技术评估局(Congressional Office of Technology Assessment)1993年的报告估计在华盛顿上风处喷雾投放100公斤炭疽芽孢将引起130,000到3,000,000人死亡-致死率达到或超过了氢弹爆炸的结果。技术评估局，美国国会，Office of Technology Assessment，US Congress，Washington，DC，″Proliferation of Weapons of Mass Destruction″，US Government PrintingOffice，53-55(1993).
炭疽作为生物武器恐怖投放的第一证据将可能是寻求吸入性炭疽医学治疗的病人。一个城市或地区内突然出现大量病人，具急性发作的感冒样疾病且致死率达80％或更高，近一半的死亡发生在24到48小时内，这些提示炭疽或肺鼠疫投放的高度可能性。诊断炭疽的快速诊断检测，如对保护性抗原的酶联免疫吸收剂分析和聚合酶链式反应，只在国家参考实验室才有。其它生物战剂会同样难于以及时的方式应对。
传统的抗微生物治疗，比如抗生素，可用于治疗一些生物恐怖病原体，但通常对保护公众在接触传染源前免于感染没有用处。抗生素如环丙沙星(一种氟喹诺酮抗生素)和多西环素(一种四环素抗生素)对治疗炭疽有用处；然而，即使用多种抗生素对预防有症状的病人死于感染也经常是不够的。此外，已有报告发表称俄罗斯科学家一直在改造炭疽杆菌菌株以抵御抗生素。预防性地施用疫苗，如Ivins等公布于美国专利No.6,387,665，提供了保护公众免于感染的另一个方法。例如，一种美国炭疽疫苗，由失活的无细胞产物制成，已被指定给所有美国军队现役和预备役人员。不幸的是，一种疫苗只能抵御单一的微生物而不能对多种可能的病原性恐怖威胁提供广泛的抵御保护。而且，不建议广泛接种疫苗来保护普通公众，因为疫苗供应有限，且是否以不利副作用的风险来评判其广泛应用仍存在争论。开发安全有效的治疗方法的期限和提供经济的途径使这些治疗方法用于大规模军队和市民人口也是个重要问题。因而，很明显需要的是一种方法来抵御生物战争，这种方法在接触传染源之前和之后施用都能增加存活率，并且能对多种可能的生物战剂提供有效的防御，以及对于提供给广大公众来说并不昂贵，还要易于存储很长的时间。
发明概述
本发明提供了一种策略以广泛保护军队和公众免受生物战争武器的伤害，尤其是炭疽等传染剂。申请者已经发现了一种方法，在此方法中β-葡聚糖，尤其是全葡聚糖颗粒、PGG葡聚糖和微粒葡聚糖提供了一种优秀的方法以对生物战争武器提供防御，因为它们提供了一般性免疫(general immune)增强，从而提供了对多种生物威胁的增强了的防御。而且，β(1，3)-葡聚糖易于存储，因为它既是药学稳定的又相对紧密，这使它易于保存以备受到或怀疑有生物战剂攻击时使用。β(1，3)-葡聚糖使用还没有显著的副作用，这使其更容易应用于不能确定生物攻击或自然传染病爆发是否发生的情况下。最后，(1，3)-葡聚糖除了单独使用时有效外，还能增强疫苗和抗生素等其它医疗措施的效果。施用(1，3)-葡聚糖延长存活时间的能力暗示免疫调节介入也能为开始其它抗微生物治疗提供时间。
应用β-葡聚糖来广泛保护公众免于炭疽等多种病原微生物感染利用了β-葡聚糖的免疫系统增强作用。β-葡聚糖用于接触前的预防用药和/或作为接触后治疗法的一部分提供了暴露于病原性攻击后保护公众的两种策略。β-葡聚糖用作免疫调节剂还能增强疫苗、免疫血清和/或抗生素等其它医疗措施的效果。
β(1-3)葡聚糖的抗感染活性是通过刺激白细胞的杀微生物活性介导的，这些白细胞主要是先天免疫系统的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞。虽然不打算限于理论，这种免疫刺激似乎通过两种不同机理发生。首先，单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞在β(1，3)-葡聚糖结合到其细胞表面补体受体类型3(CR3)后被激发出细胞毒性活性。CR3的激活需要同时结合iC3b(一种补体蛋白)和一种二级刺激，如β(1，3)-葡聚糖。由于炭疽等细菌缺少β(1，3)-葡聚糖，因此提供这种聚糖有利于形成对受iC3b调理了的外界物质的增强的先天免疫应答。其次，β(1，3)-葡聚糖结合能交联呈递于多种白细胞细胞膜上的糖脂受体，引起一系列细胞应答。早期反应，如由蛋白激酶C介导的Ca2+流入和转录因子激活，导致全面增强的免疫应答。这些应答包括免疫细胞增殖和IL-1、IL-2和TNF-α等多种细胞因子的释放。巨噬细胞的激活尤为重要，因为它们是抵御外界物质的关键第一防线并被炭疽杆菌外毒素所抑制。
全身和口服施用β(1，3)-葡聚糖都能显著提高暴露于炭疽等病原体的动物的存活率。例如，据报道在使用传统治疗下，暴露于致死空气传播剂量炭疽人群的预期存活率只有20-30％。然而，本发明使用全葡聚糖颗粒或PGG-葡聚糖提供了＞80％的可能存活率。特定地，使用β(1，3)-葡聚糖使感染的实验动物存活率从30％提高到80％，使致死性感染了炭疽的动物的存活时间延长了2.5天，减少了存活的被感染动物器官中的细菌负荷，并增加了无细菌动物的比例。
总之，本发明提供了一种方法，通过施用预防有效量或治疗有效量的β(1，3)-葡聚糖以预防生物战剂对人类或动物造成的伤害。在一个优选的方案中，本发明提供了一种方法，通过施用预防或治疗有效量或治疗有效量的β(1，3)-葡聚糖来治疗或预防感染在被一种或多种传染剂感染的人或动物中的发病。优选地，所用的β(1，3)-葡聚糖是PGG-葡聚糖，全葡聚糖颗粒，微粒葡聚糖，或其组合。所述β(1，3)-葡聚糖可口服、局部、皮下、肌内、经皮、皮内、静脉内、或胃肠道施用。
在接触感染之前或之后，β葡聚糖优选施用的量从约0.1mg/Kg到约100mg/Kg PGG葡聚糖或约0.1mg/Kg到约500mg/Kg全葡聚糖颗粒，或其组合。更优选地，β-葡聚糖施用量从约1mg/Kg到约10mg/Kg PGG葡聚糖或约2mg/Kg到20mg/Kg全葡聚糖颗粒，或其组合。
本发明对预期用于生物恐怖的类型的传染剂感染提供有效的预防或治疗。这些传染剂包括CDC在A、B、C类生物战剂中所列的试剂。这些传染剂包括，但不限于，炭疽杆菌Bacillus anthracis(炭疽)，布鲁菌病(Brucellosis)，鼻疽假单胞菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)，霍乱，产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素，刚果-克利米亚出血热，埃博拉(Ebola)出血热，类鼻疽，鼠疫杆菌(Yersinia pestis)瘟疫，Q热，蓖麻毒蛋白，裂谷热(Rift Valley Fever)，石房蛤毒素，天花，葡萄球菌肠毒素B，单端孢霉烯真菌毒素(Trichothecene Mycotoxins)，兔热病，委内瑞拉马脑炎(Venezuelan Equine Encephalitis)，病毒性出血热，Nipah病毒，汉滩病毒，黄热病，多药抗性结核病，马尔堡病毒和登革热病毒。在一个优选方案中，本发明提供一种治疗和预防炭疽杆菌对人类或动物的感染的方法。此外，全葡聚糖颗粒、PGG-葡聚糖和微粒葡聚糖有潜力提供一种有效的免疫调节剂处理以预防或治疗传染剂所致感染，这些传染剂可能不属于生物恐怖，包括可能有药物抗性和/或对药物敏感的传染剂。
除了提供一种治疗和预防感染的方法，本发明还提供一种方法，通过施用预防或治疗有效量的β(1，3)-葡聚糖来预防生物战剂对人类或动物的损伤。在优选方案中使用的β-葡聚糖量与以上所列用于预防感染的量相同。在另一个方案中，本发明还提供方法，通过施用预防或治疗有效量的β(1，3)-葡聚糖与抗生素的协同组合，或在接种针对生物战剂的疫苗或用针对该生物战剂的血清或单克隆抗体治疗后再传递有效量的β(1，3)-葡聚糖，以预防生物战剂对人类或动物的损伤。
最后，本发明提供了一种β-葡聚糖的紧密组合物，该组合物可稳定地室温下储存至少两年。在一个优选方案中，用于这种稳定的、紧密的组合物的β-葡聚糖是全葡聚糖颗粒，它包含约80％量的所用组合物。拥有稳定的抗感染试剂的可用性使β-葡聚糖在储存以用于抵御可能的生物恐怖攻击方面十分理想。
附图简述
图1显示了β-葡聚糖对接触炭疽后存活时间的影响。
图2显示了β-葡聚糖处理后的小鼠在炭疽感染中存活的百分比。
图3显示了β-葡聚糖处理后肺中炭疽CFUs的减少。
图4显示了β-葡聚糖对无菌动物百分比的影响。
图5A显示了预防性口服全葡聚糖颗粒治疗法对致死性炭疽攻击下存活率的影响。
图5B显示了预防性口服全葡聚糖颗粒治疗法对致死性炭疽攻击下存活率的影响。
图6显示了治疗性口服全葡聚糖颗粒治疗法对致死性炭疽攻击下存活率的作用。
图7显示了全葡聚糖颗粒在室温下两年期间内的稳定性。
图8显示了C3-调理的酵母激活CR3同时需要iC3b结合和β-葡聚糖附着于凝集素位点。
图9显示了缺乏β-葡聚糖的细菌不触发经CR3的吞噬作用或脱粒作用。
图10显示可溶性β-葡聚糖结合到CR3后激活该受体触发脱粒并破坏iC3b靶向的细菌或肿瘤细胞。
图11显示胃内注射β-葡聚糖后脾内巨噬细胞CR3激活的动力学。
图12显示了β-葡聚糖和CR3依赖的刺激NK细胞分泌TNF-α。
发明详述
本发明提供了方法和组合物以预防或治疗暴露于病原体后的感染，所述病原体如那些应用于生物战争的病原体。在一个优选方案中，本发明提供方法和组合物以预防或治疗暴露于炭疽杆菌后的感染，炭疽杆菌也称为炭疽。
本发明中β葡聚糖所提供的抗感染性是对广泛保护军队和公众免受那些在生物战争中使用的病原体感染的有用策略。本发明的组合物包括β-葡聚糖。更明确地，本发明的组合物包括全葡聚糖颗粒，PGG-葡聚糖，微粒葡聚糖和其组合。PGG(聚-1-6-β-D-吡喃葡萄糖酰-1-3-β-D-吡喃葡萄糖)是一种高度纯化的可溶性葡萄糖聚合物，由全葡聚糖颗粒酸水解制备。β-葡聚糖组合物还可包括适当的载体、赋形剂、和/或辅剂。已发现本发明的组合物，包括一种或多种前述β-葡聚糖的形式，显著提高了被感染动物的存活率，包括那些被炭疽感染的动物。
β-葡聚糖制剂的结构-功能特性决定于其获得的来源。β-葡聚糖的来源可以是酵母或其它真菌，或其它任何含有此处所述性质的葡聚糖的来源。酵母细胞是葡聚糖的优选来源。本方法中使用的酵母菌株可以是任何酵母的菌株，包括，例如，S.cerevisiae，S.delbrueckii，S.rosei，S.microellipsodes，S.carlsbergensis，S.bisporus，S.fermentati，S.rouxii，Schizosaccharomycespombe，Kluyveromyces polysporus，Candida albicans，C.cloacae，C.tropicalis，C.utilis，Hansenula wingei，H.arni，H.henricii，H.americana，H.canadiensis，H.capsulata，H.polymorpha，Pichia kluyveri，P.pastoris，P.polymorpha，P.rhodanensis，P ohmeri，Torulopsis bovina和T.glabrata。
酵母细胞可通过本领域公知的方法生产。典型的生长培养基包括，例如，葡萄糖，蛋白胨和酵母提取物。酵母细胞可通过用于从液体培养基中分离生物质的典型方法从培养基中收获和提取。这些方法典型地包括过滤或离心等固-液分离过程。在本发明中，细胞优选收获于对数生长期的中后期，以使酵母细胞中糖原和几丁质的含量最少。
如前所述，本发明中所用两种β(1，3)-葡聚糖包括一种不溶性颗粒全葡聚糖颗粒，和一种可溶性产物，PGG-葡聚糖(PGG)。全葡聚糖颗粒可在提取出细胞蛋白、核酸、脂和大多数非葡萄糖基寡聚糖后从面包酵母细胞壁中纯化。剩下的是高度纯化的，2-10微米的球状β(1，3)-葡聚糖颗粒，这些颗粒保留了其来源细胞中葡聚糖的完整三维体内形态。
PGG(聚-(1，6)-β-D-吡喃葡萄糖酰-(1，3)-β-D-吡喃葡萄糖)是一种高度纯化的可溶性葡萄糖聚合物，由全葡聚糖颗粒酸水解制备。两种形式葡聚糖的制备如下所述。酵母是β-(1，3)葡聚糖的优选来源，但也能产生β(1，3)葡聚糖的其它来源也包括在本发明中。
微粒葡聚糖代表了本发明的另一种实施方案。通常，用于制备微粒葡聚糖的β(1，3)葡聚糖由本领域普通技术人员熟知的常规方法从酵母细胞中分离并处理以生产微粒β-葡聚糖。微粒葡聚糖通常具有的平均粒径优选约1.0微米或更小，更优选约0.20微米或更小。注意组合物可能包含此处所述多种形式的一种或更多。
全葡聚糖颗粒的制备描述于美国专利Nos.4,810,646，4,992,540，5,037,972，5,082,936，5,028,703，5,250,436和5,506,124，其所公开内容在此一并作为参考。此方法产生一种产物，该产物保留了体内发现的葡聚糖的形态和结构特性，因此称为全葡聚糖，或全葡聚糖颗粒。
全葡聚糖颗粒的制备包括用适当浓度的碱水溶液处理酵母以溶解一部分酵母并形成碱-氢氧化物-不溶性的主要含β(1-6)和β(1-3)键的全葡聚糖颗粒。通常所用碱为碱-金属的氢氧化物，如氢氧化钠或氢氧化钾。优选地，原材料主要包括从生长培养基分离的酵母。当用低浓缩酵母组合物作原料时，控制水溶液中氢氧化物反应物的消耗和将反应物浓度控制在优选范围内会更加困难。注意到全葡聚糖颗粒的结构-功能特性依赖于其获得的来源。全葡聚糖的来源可以是酵母或其它真菌，或其它任何含有此处所述性质的葡聚糖的来源。然而，酵母细胞是葡聚糖的优选来源。所用酵母应具有完整的、未破裂的细胞壁，因为所得全葡聚糖颗粒的优选性质依赖于一个完整的细胞壁。
处理步骤通过在氢氧化物的水溶液中提取酵母进行。胞内组分和细胞的甘露糖蛋白部分被溶于氢氧化物的水溶液中，留下不溶的基本不含蛋白质的细胞壁材料，其具有基本未改变的β(1-6)和β(1-3)连接的葡聚糖三维基架。在优选条件下实施此步骤使细胞壁中的甘露聚糖成分溶解在氢氧化物的水溶液中。胞内组分被水解并释放到可溶相中。优选地，消化的条件为至少在大部分细胞中，细胞壁的三维基架结构没有被破坏。更优选地，基本上所有的细胞壁葡聚糖保持未改变和完整。
氢氧化物水溶液消化步骤优选地在具有初始当量浓度为约0.1到约10.0的氢氧化物溶液中进行。典型的氢氧化物溶液包括周期表中碱金属族和碱土金属的氢氧化物。优选的氢氧化物水溶液为氢氧化钠和氢氧化钾的水溶液，因为它们易于得到。消化优选地在从约20℃到约121℃之间的温度下进行，温度越低需要的消化时间越长。当用氢氧化钠作为氢氧化物水溶液时，温度优选在从约80℃到约100℃，溶液的起始当量为从约0.75到约1.5。所加氢氧化物为过量的，这样，后面就不需要再加入。
通常每升氢氧化物溶液用约10克到约500克的干酵母。为了使蛋白等残余污染物的含量低于只用一步接触步骤，氢氧化物水溶液消化步骤优选地通过一系列接触步骤实施。即，希望从细胞中基本去除所有的蛋白物质。优选地这种去除要进行到这样的程度，即低于百分之一的蛋白保留在不溶性细胞壁葡聚糖颗粒中。另外的一个提取步骤优选地在pH为约2.0到约6.0的弱酸溶液中进行。典型的弱酸溶液包括盐酸、用盐酸和醋酸缓冲液将pH调到所需值的氯化钠溶液。提取步骤优选地在约20℃到约100℃温度下进行。如果必要，可对消化过的葡聚糖颗粒进一步洗涤和提取以使蛋白和污染物的水平降低到文中前述的优选含量。
通过在不破坏细胞壁的情况下实施这些方法，提取过程可在比本领域以前的方法可能的更严格的pH和温度条件下进行，本领域以前的方法包括了一个破碎细胞壁的步骤。即，本发明的方法在应用这些严格的提取条件时避免了产物的降解，这些提取条件还允许去除耗时的多重提取步骤。氢氧化物水溶液处理后，最终的全葡聚糖产物包含约5％到约30％的初始酵母细胞重量；优选地产物按重量计为7％到15％。
所得全葡聚糖颗粒可根据需要进一步处理和/或进一步纯化。例如，所得葡聚糖可干燥成精细粉末(例如，通过烘箱干燥、冰冻干燥或喷雾干燥)；或可用有机溶剂处理(例如，乙醇，乙醚、丙酮、甲乙酮、氯仿)以去除任何痕量或有机可溶的物质，或用氢氧化物溶液再处理以去除可能存在的额外的蛋白或其它杂质。
上述方法所得的全葡聚糖颗粒由高纯葡聚糖组成，主要含有β(1-6)和β(1-3)连接的葡聚糖。处理后，所得全葡聚糖颗粒含有极低量的蛋白和糖原污染。优选地，所述全葡聚糖颗粒形状为直径约2微米到约10微米的球形，含高于85％重量百分比的己糖、约1％重量百分比的蛋白、无可检出量的甘露聚糖，如傅立叶变换红外光谱法(Fourier Transform InfraredSpectroscopy)所测。从已有方法得到的葡聚糖含有比本发明所得葡聚糖高得多的几丁质和糖原。
可采用次级化学处理以改变β(1-3)或β(1，6)键的量，所述处理中全葡聚糖颗粒用一种酶或一种酸进行处理。对于从某些酵母菌株提取的全葡聚糖颗粒，酶处理导致了粘度降低，对其它的，则导致了粘度升高，但通常，改变了所得葡聚糖的化学特性和流体力学特性。例如用一种葡聚糖酶处理，如地衣多糖酶，改变β(1-3)键，这改变了全葡聚糖颗粒在水悬液中的流体力学性质。再例如，用弱酸处理，如己酸，改变了β(1-3)连接，这又改变了全葡聚糖颗粒在水悬液中的流体力学性质。关于这种次级化学处理的描述公开于美国专利Nos.6,020,324和6,143,731。
PGG-葡聚糖的制备述于美国专利Nos.5,322,841，5,811,542，5,663,324，5,633,369和5,817,643，其所公开内容在此一并作为参考。这种方法包括用一系列酸和碱处理来处理全葡聚糖颗粒以产生在中性pH下可形成清澈溶液的可溶性葡聚糖。本发明所用全葡聚糖可以是干燥粉末的形式，由前述方法制备。没有必要为了本发明而采用最后的有机提取和洗涤步骤。
为了制备PGG，全葡聚糖颗粒在能充分溶解酸溶性葡聚糖部分的条件下悬于酸溶液中。对于大多数葡聚糖，pH约1到约5以及温度约20到约100℃的酸溶液就足够了。优选地，所用酸为能溶解酸溶性葡聚糖部分的有机酸。浓度为约0.1到约5M的乙酸或浓度为约50％到约98％(w/v)的蚁酸可用于此目的。处理优选在约90℃下进行。处理时间从约1小时到约20小时不等，依赖于酸浓度、温度和全葡聚糖的来源。例如，修饰过的葡聚糖比天然存在的或野生的葡聚糖含有更多的β(1-6)分支，需要更苛刻的条件，即更长的接触时间和更高的温度。此酸处理步骤可在相似或不同条件下重复进行。也可使用来自菌株S.cerevisiae R4的修饰过的全葡聚糖颗粒，其含有比天然存在的葡聚糖更高水平的β(1-6)分支。处理进行两次：先用0.5M乙酸在90℃处理3小时，然后用0.5M乙酸在90℃处理20小时。
然后用适当的分离技术把酸不溶性葡聚糖颗粒从溶液中分离出来，例如离心或过滤。用碱性化合物如氢氧化钠将所得淤浆的pH调至约7到约14。然后把淤浆重悬于热碱液中，所述热碱液具有足以溶解葡聚聚合物的浓度和温度。可用于此步骤的碱性化合物包括碱金属或碱土金属的氢氧化物，如氢氧化钠或氢氧化钾，其浓度从约0.1到约10N。此步骤可在约4℃到约121℃，优选地从20℃到100℃的温度下进行。在本方法的一个实施方案中，所用条件为1N的氢氧化钠溶液在约80-100℃下接触时间为大约1-2小时。所得混合物含有溶解了的葡聚糖分子和颗粒的葡聚糖残渣，通常因杂质蛋白和糖的氧化而具暗棕色。用适当的分离技术去除颗粒残渣，如离心和/或过滤。
所得溶液含有可溶性葡聚糖分子。可选地，此溶液可被浓缩至渗余物可溶性葡聚糖级分的5至10倍浓度以得到范围在约1至5mg/ml的可溶性葡聚糖浓度。此步骤可采用适当的浓缩技术进行，例如，采用超滤，使用标称分子量水平(NMWL)或截流范围在约1,000到100,000道尔顿的膜。截止分子量约10,000道尔顿的膜尤其适用于此步骤。
此步骤所得的浓缩级分富含可溶的、具生物活性的PGG。为得到药用溶液，所得葡聚糖浓缩物被进一步纯化，例如，通过透析过滤。在本发明的一个实施方案中，用大约10倍体积的碱溶液进行透析，碱溶液浓度范围约0.2到0.4N。经此步骤后可溶性葡聚糖的优选浓度是约2到约5mg/ml。溶液的pH值用酸，如盐酸，调节到7-9的范围内。可能存在的痕量蛋白样物质可通过将所得溶液与带正电的介质接触而去除，这类介质如DEAE-纤维素、QAE-纤维素或Q-琼脂糖。蛋白样物质对葡聚糖产品质量有害，可能使溶液变色并有助于形成凝胶网络，从而限制了所得中性葡聚糖聚合物的可溶性。经此步骤后得到清澈的溶液。
所得高度纯化的、清澈的葡聚糖溶液可使用适于肠胃外施用的药用介质(例如，注射用无菌水，磷酸盐缓冲液(PBS)，等渗盐溶液，葡萄糖)进一步纯化，例如透析。用于此透析步骤的优选的膜具有标称截流分子量约10,000道尔顿。葡聚糖溶液的最终浓度调节至约0.5到5mg/ml的范围。根据肠胃外产品的药品生产标准，所得溶液可通过经0.22μm过滤器而最终灭菌。从这一步骤得到的可溶性葡聚糖制剂是无菌的、非抗原性的和基本不含热原的，并且可于室温下长期储存而不降解。
生产微粒β-葡聚糖的方法公开于美国专利Nos.5,223,491，5,397,773，5,576,015，5,702,719和5,705,184，其内容在此一并作为参考。通常，可通过分离β(1，3)葡聚糖并将对其处理以得到小粒径来生产微粒β-葡聚糖。为得到期望的更小的微粒葡聚糖粒径的处理方法的一个例子，包括使用搅拌机、球磨机把β(1，3)葡聚糖磨碎成更小的颗粒。一种磨碎或减小粒径的方法采用了一种带钝刃的搅拌机，在其中葡聚糖被搅拌足够长的时间，优选几分钟，以把颗粒完全磨碎至期望的尺寸而不使混合物过热。另一种磨碎方法包含在一个带10mm不锈钢研磨珠的球磨机中研磨葡聚糖混合物。后者在期望得到约0.20微米或更小粒径时尤其优选。
β(1，3)葡聚糖的另一种形式是中性可溶葡聚糖。中性可溶葡聚糖(NSG)一词虽然用于描述一种已取得专利的与PGG-葡聚糖相关的组合物，但是是一个涵盖了所有构型的水溶性葡聚糖的更一般性的词汇。PGG-葡聚糖典型地指β-葡聚糖的三螺旋形式，而NSG通常指单链螺旋形式。
施用于本发明方法中的组合物任选地包括，除全葡聚糖颗粒以外，PGG、微粒葡聚糖或其组合，其它组分如载体、赋形剂、辅剂和/或其它的有益活性组分。这些其它有益活性组分可能包括与前述生物战争病原体相应的抗生素。特定组合物中包括的其它组分可根据该组合物将要施用的方式而定。例如，口服施用的组合物片剂可包括，除了β-葡聚糖外，填充剂(如乳糖)、粘合剂(如羧甲基纤维素、阿拉伯胶、凝胶)、辅剂、调味剂、着色剂、其它活性试剂(如药物、矿物质、维生素)和包衣材料(如蜡或增塑剂)。另外，以液体形式施用的组合物可包括全葡聚糖颗粒、PGG、微粒葡聚糖或其组合，以及可选的乳化剂、调味剂和/或着色剂。另外，肠胃外施用的组合物，包括全葡聚糖颗粒、PGG、微粒葡聚糖或其组合，也可在水、无菌盐水、PBS、葡萄糖或其它生物相容性载体中混合、溶解或乳化。
施用β-葡聚糖制剂的方式可以是口服、肠内、局部、肠胃外、静脉内、皮下、腹膜内、肌内或鼻内。然而，口服施用β(1，3)-葡聚糖是本发明的优选方案，因为口服施用既方便侵害性又低。另外，已发现口服施用有好处，因为其可刺激先天免疫系统，特别是当其在派伊尔氏淋巴集结(Peyer′spatches)内开始接触巨噬细胞后。派伊尔氏淋巴集结(Peyer′s patches)小肠内特异化了的区间，将抗原传递给肠道相关淋巴组织(GALT)的免疫细胞。被激活的巨噬细胞运动到GALT，在那里它们将存在外界抗原通知免疫系统的其它成员，导致先天免疫系统的其它成员如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞的激活。
组合物施用的形式(如粉末、片剂、胶囊、溶液、乳剂)将依其施用的途径而定。组合物施用的量依个体情况而定，至少部分地决定于下列考虑，病人感染或受伤害的严重性、病人状况或全面健康情况、病人体重、接受其它治疗前的可用时间以及施用的方式(如口服组合物可能比全身用药组合物施用更大的量)。通常，单剂量一般含有大约0.01mg到500mg β-葡聚糖/每公斤体重，优选地是1mg到250mg β-葡聚糖/每公斤体重，更优选地是2mg到20mg β-葡聚糖/每公斤体重。
已发现本发明中β-葡聚糖的前述形式在长期储存中也能保持稳定。全葡聚糖颗粒可以药丸的形式保存于室温且可口服、局部或全身施用。PGG或NSG可以溶液的形式储存于室温，经常是全身施用。全葡聚糖颗粒和PGG在25℃下都能稳定至少2年。图7描述了对在室温(25℃)下存放了超过25个月期间的ImucellTM WGP β-葡聚糖实时稳定性研究的结果。样品组合物每月检测一次，在这25个月期间，未显示有任何活性β-葡聚糖数量的减少发生。存在的β-葡聚糖的平均百分比为79.3％，标准偏差5.3。
为了阐明β-葡聚糖组合物抵抗可能的生物武器的活性，在小鼠模型系统上开展了一系列研究以揭示PGG和全葡聚糖颗粒如何能增强对炭疽感染的抗性。在这些研究中全葡聚糖颗粒(ImucellTMWGP Glucan)纯化自面包酵母的细胞壁，PGG由全葡聚糖颗粒经酸水解而制备。
检测了全身用PGG或全葡聚糖颗粒对随后暴露于炭疽杆菌芽孢的小鼠组的预防性作用。所有的实验进行两次。统计分析基于这两组相互独立的数据进行。结果显示于图1，清楚地表明单剂量PGG(Betafectin；2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖颗粒(10mg/Kg)显著增加了存活时间。在这些实验中，感染了炭疽的对照组的平均存活时间为8.4/8.5天。而用PGG处理的组(10.2/11.5天)和用全葡聚糖颗粒处理的组(10/11.5天)平均存活时间显著延长。对汇合自这两个实验的数据进行的分析揭示，与对照(8.45天)相比较，PGG-处理小鼠的存活(10.86天)或全葡聚糖颗粒处理小鼠的存活(10.80天)在统计学上有显著升高。
用β(1，3)-葡聚糖进行全身预防性处理的炭疽-保护作用显示于图2，该图显示了用PGG或全葡聚糖颗粒处理过的小鼠在炭疽感染期间的存活者百分比。在炭疽杆菌致命攻击的前两天施用单剂量PGG葡聚糖(50μg)或全葡聚糖颗粒(200μg)或对照盐水。感染后10天期间内，每天记录存活者的数量。在这些实验中，22只对照动物中只有7只活过了观察期。相对地，PGG处理的22只中有19只，全葡聚糖颗粒处理的22只中有18只存活了相同的时间。
PGG(Betafectin)和全葡聚糖对宿主先天抗微生物免疫应答的刺激导致了增强的微生物杀死，如图3和图4中所示处理过的动物肺内微生物的生物负荷的显著降低所证明的那样。这些实验的结果表明单剂量的Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖颗粒(10mg/Kg)显著降低了肺内细菌负荷，并增加了观察期末无菌小鼠的数量。β(1，3)-葡聚糖引起的宿主免疫应答增强，导致显著百分比的处理过的受炭疽攻击存活小鼠(＞80％)在刺激后10天仍保持无菌，这通过肺内炭疽杆菌CFUs的相对缺乏可知。
如前面所指出的，口服施用β(1，3)-葡聚糖是本发明的优选方案，因为口服施用既方便，侵害性又低，还导致对派尔氏淋巴集结中巨噬细胞的刺激。图5A和图5B显示了预防性口服全葡聚糖颗粒治疗法对在致死性炭疽攻击下小鼠存活率的影响。图5A所示存活结果表明每日口服预防性剂量的全葡聚糖颗粒(＞2mg/kg)显著增加了炭疽存活者的数量。在这些实验中，10只对照动物中只有5只在炭疽感染中存活(存活率50％)。相对地，用日口服剂量2或20mg/kg全葡聚糖颗粒进行预防性处理的动物显示出100％存活率。每周四次口服2mg/kg的预防性剂量则不如每日剂量给药有效，因为取得显著的保护效果要求20mg/kg的全葡聚糖剂量(图5B)。
上述研究表明β-葡聚糖在接触前施用可有效抵御炭疽。图6中显示了在致死性炭疽攻击后施用口服全葡聚糖颗粒治疗对小鼠存活率的影响。每日口服治疗剂量的全葡聚糖颗粒(＞1.5mg/kg)也显著增加了炭疽存活者的数量。治疗性给药在感染后一小时开始。在这些实验中，10只对照动物中只有3只在炭疽感染后存后(30％存活率)。相对地，在1.5mg/kg口服全葡聚糖颗粒的治疗剂量水平下，80％处理过的小鼠存活，在13.3mg/kg口服全葡聚糖颗粒的治疗剂量水平下，90％处理过的小鼠存活。因此，除了预防性施用外，即使在接触后给药，口服全葡聚糖颗粒对降低炭疽感染的致死率也是有效的。这表明β-葡聚糖在应对未受警告而已经暴露的市民的炭疽感染会有帮助，这是在恐怖袭击中可能的情景，这一点很重要。
另外，出于几个原因，施用β-葡聚糖比直接施用IL-1等细胞因子更有效，那些细胞因子常独立用作免疫调节剂。首先，β-葡聚糖除了其对细胞因子的作用以外还有其它作用，如其直接激活免疫细胞的活性抵抗受调理传染性颗粒的能力。β-葡聚糖还刺激多种细胞介质以平衡的比例内源性释放，由于所诱导的多种免疫介质的协同效应而提供了一个更强的免疫应答。最后，细胞因子-正主要通过重组工程技术制造-纯化困难且昂贵，并显示出相当大的毒性和不利副作用。
另外，具免疫调节性质的葡聚糖聚合物都带有共同的β(1-3)连接的线性葡萄糖主链。许多种类，如香菇多糖和硬葡聚糖，在主链上还含有在葡萄糖单元的C-6原子上的周期性分支。表1列出了许多具免疫调节性质的葡聚糖及所报道的它们的一般连接结构。
表1
Figure G200910164627XD00201
无论材料是什么来源(如，生物)，所有列于表1的分支葡聚糖在分支上都含有至少一个单葡萄糖单位通过一个β(1-6)键连到主链上。
β(1，3)-葡聚糖的抗感染作用机理主要是通过刺激单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞而起作用。许多这些细胞被传染性颗粒所释放的毒素所抑制，如炭疽释放的毒素。因此，β(1，3)-葡聚糖协助直接应对感染的不利效果。β(1，3)-葡聚糖作用机理的细节如下所述。
CR3受体在β-葡聚糖的免疫调节活性中起到十分重要的作用。CR3在介导对β-葡聚糖的应答中起的作用见于对iC3b-调理的酵母嗜中性粒细胞吞噬作用机理的深入研究。当补体C3b已经附着到一个表面，它可能被一种血清蛋白剪切生成一个更小的片断，iC3b。如果iC3b已经被“失活”而不能起到形成膜攻击复合物的功能，它保持附着在该表面，在那里起到吸引嗜中性粒细胞和巨噬细胞的作用，后者可吞噬或相反摧毁被标记的(“受调理的”)细胞。在嗜中性粒细胞和巨噬细胞表面是结合iC3b的第3类补体受体(CR3)。酵母被免疫系统清除的过程阐述于图8.
刺激CR3依赖的吞噬作用或脱粒作用需要CR3内两个不同位点的同时连接；一个是iC3b特异的而另一个位点是酵母细胞壁β-葡聚糖特异性的。如图9所示，因为缺乏细胞表面CR3-结合的β-葡聚糖，受iC3b调理的细菌经CR3被结合于嗜中性粒细胞，但并不能有效刺激吞噬作用或脱粒作用。然而，如图10所示，加入β-葡聚糖可结合到CR3的凝集素位点以激活免疫细胞载运该受体触发对外来物质的脱粒和/或吞噬作用。富含甘露聚糖和β-葡聚糖的可溶性酵母聚糖衍生的多糖显示出结合CR3的高亲合性，诱导出被激活的受体状态。
图11证实了由β葡聚糖提供的CR3在免疫调节中的作用。此图表明口服大麦葡聚糖(100mg/Kg)诱导了体外脾巨噬细胞对iC3b包被肿瘤靶的增强了的细胞毒性。口服葡聚糖的同时注射抗CR3单克隆抗体则消除了这种毒性。具体地，本图显示了CR3在刺激β葡聚糖引起的巨噬细胞细胞毒性应答中的重要作用。如前所述，巨噬细胞经常被炭疽等有害病原体抑制，所以它们的激活可直接应对这种效应。
NK细胞是对感染的先天免疫应答中另一个重要的成员。NK细胞介导宿主防御的功能既包括对病原体的直接细胞毒性也包括TNF-α和IFN-γ等细胞因子的分泌，这些细胞因子可潜在地调节免疫应答并召集破坏癌细胞的巨噬细胞。尽管已表明NK细胞对病原体的直接细胞毒是由CR3的激活所介导的，另有研究表明这种相同的CR3激活甚至可能也触发细胞因子的分泌。为证实此点进行了实验，其结果见于图12。小分子β-葡聚糖结合到CR3导致受体的激活，这种激活在随后结合至iC3b调理的靶细胞触发下产生细胞因子释放。EC3bi靶在这类多糖激活缺乏时不能触发NK细胞细胞因子释放，如培养基对照所示。在CR3被多糖激活后，与iC3b-靶细胞的结合导致TNF-α(也有IFN-γ，IFN-α，和IL-6，未显示)的分泌。加入5mg/ml的抗CD11b单克隆抗体(OKM1)阻断了NK细胞对所有四种细胞因子的分泌。抗CR3既阻断了β-葡聚糖结合于CR3，也阻断了激活了的CR3结合于EC3bi靶细胞上的iC3b。
图12显示的结果表明NK细胞分泌细胞因子与CR3活化产生细胞毒是平行发生的。颗粒β-葡聚糖，触发有力的CR3依赖的嗜中性粒细胞过氧化物爆发，也同样触发NK细胞CR3依赖的细胞因子释放。细胞因子分泌并不发生在小分子可溶性β-葡聚糖结合于CR3时发生的初始CR3激活步骤，而只是继发于被β-葡聚糖激活的CR3与iC3b-调理的靶细胞交联所触发的CR3激活步骤。将NK细胞与EC3bi在培养基中单独培养，并不刺激NK细胞溶解EC3bi，也不触发细胞因子分泌。然而，当用可溶(或颗粒)β-葡聚糖激活NK细胞CR3后再加入EC3bi，这时ELISA可检测到TNF-α，IFN-α，IFN-γ，和IL-6的分泌。这种细胞因子释放是CR3依赖性的，因为当与靶EC3bi同时加入抗CD121b单克隆抗体时其被阻断了。
通常，本发明的组合物可在疑有暴露于病原体之前或之后施用于个体以增强该个体抗感染的能力。医疗领域内的熟练技术人员将有能力根据患者的身体条件和所怀疑的病原体来决定施药时长和剂量。该组合物也可作为预防处理的常规应用，增强那些在具有比普通环境更高的暴露于有害病原体风险的工作环境中工作的个体的抗感染能力，如卫生工作者或在活跃的生物战争环境中工作的士兵。
本发明在下述实施例中被进一步阐述。
实施例
实施例1
β-葡聚糖对NK细胞细胞因子释放的刺激
人NK细胞与颗粒酵母β-葡聚糖或可溶性CR3-结合的多糖共同在37℃下培养18小时。用ELISA分析培养物上层清液中TNF-α。颗粒酵母β-葡聚糖(2μg/ml)和灰树花多糖(grifolan)(≥500kDa可溶性β-葡聚糖，来自多叶奇果菌(Grifola frondosa)，2μg/ml)能够结合并交联CR3分子表面的凝集素位点，导致细胞活化和TNF-α和IL-6(未显示)的分泌。与之对照，小分子(20kDa)可溶性酵母β-葡聚糖(MP β-葡聚糖；2.0μg/ml)和SZP(可溶性酵母聚糖多糖制剂，含有β-寡聚甘露糖和/或β-葡聚糖；2.0μg/ml)只结合于单个CR3分子，而在缺乏靶细胞时不触发细胞因子释放。小分子β-葡聚糖与CR3的结合导致受体的激活，这种激活在随后结合至iC3b调理的靶细胞(受iC3b-″+EC3b″调理的羊红细胞)触发下产生细胞因子释放。EC3bi靶在缺乏这种多糖激活时不能触发NK细胞细胞因子释放，如培养基对照所示。在CR3被多糖激活后，与iC3b-靶细胞的结合导致TNF-α(也有IFN-γ，IFN-α，和IL-6，未显示)的分泌。加入5mg/ml的抗CD11b单克隆抗体(OKM1)阻断了NK细胞对所有四种细胞因子的分泌。抗CR3既阻断了β-葡聚糖结合于CR3，也阻断了激活了的CR3结合于EC3bi靶细胞上的iC3b。
实施例2
感染的β-葡聚糖治疗
在小鼠中开发了一种脓血症模型以表征PGG-葡聚糖在保护免疫无损宿主抵御严重感染中的效力。该模型采用的小鼠经0.1ml E.coli菌株TVDL-rat(大约10CFU/ml)混悬剂腹内攻击24小时后，通过经胸廓心脏穿刺单剂注射的方法静脉内施用PGG。小鼠送回它们的笼子并无限制供应食物和水。一个10只小鼠的对照组在施用PGG的时间点用0.1ml无菌盐水注射。攻击后48小始记录治疗组和盐水对照组的致死率。给盐水小鼠的存活率为20％。然而，以0.01、0.1、1、和5mg/小鼠的剂量给PGG小鼠的存活率分别为90％，75％，70％和70％。此结果表明，与盐水对照组相比(p＜0.05)，在低至0.01mg/小鼠(0.5mg/kg体重)的剂量下，PGG显著降低了致死率。
实施例3
炭疽动物模型
将炭疽杆菌(Bacillus anthracis)Vollum 1B，一种致命的、有荚膜的、产毒素菌株(来自USAMRIID，Ft.Detrick，MD，USA)培养于血琼脂平板上并悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，动物在一个位于加拿大DRES的3级生物污染设备内进行攻击。细胞悬液在PBS中80℃下热休克11分钟以杀死营养细胞，-80℃分装保存。冰冻的芽孢储存物稀释后用于保护性研究。动物在标准实验室条件下培养于笼中，每笼最多5只小鼠，无限制供应水和食物。注射于Biosafety Fumehoods内在可靠的动物上进行。
用于炭疽的模型是公知的小鼠(Balb/c)模型，以前曾被Welkos等描述(Infect.Immun.51：795-800，1986)。雌性Balb/c小鼠(6周龄，14到16克)购自Charles River。动物的处理在BL-3通风橱内在可靠的动物上进行。本实验所用所有方法都被DRES实验动物管理委员会(IACC)认可于BK01-01协议下，实验动物的饲养依照加拿大动物管理委员会，《实验动物饲养和使用指南》卷1，第2版。给五个不同小鼠组(10只动物/剂量)在胁腹处皮下接种大约1、5、10、102芽孢，所用芽孢来自储存于0.1ml容器内冰冻的炭疽芽孢储存物(用一只1ml注射器，22号针)。通过接种0.1ml感染用悬液于血琼脂平板来证实感染剂量。接种后24小时读取菌落形成单位(CFUs)。
实施例4
全身性PGG和全葡聚糖颗粒处理的炭疽感染动物的存活率。
10只动物的各组在胁腹处皮下注射(在第2天)(用1ml注射器，22号针)50μg/小鼠的Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖颗粒(10mg/Kg)。在第0天，给动物皮下注射214.9±97.1炭疽芽孢/小鼠。对照组，未接受Betafectin或全葡聚糖颗粒，包含于每个系列之中。通过接种0.1ml感染用悬液于血琼脂平板来证实感染剂量。在感染后最初的2天中每天一次对动物进行观察，接下来的日子里每天观察2次，直至研究结束。对小鼠每日观察10到11天(或直至死亡)，垂死的动物被人道处死。记录存活时间并计算LD50和LD70。在感染后的第10或11天处死所有的存活者。
滴定炭疽芽孢储存物以确定LD50和LD70；对炭疽模型中，LD50确定为227芽孢/小鼠，LD70为313芽孢/小鼠。这些研究中的平均感染剂量为214.9±97.1芽孢/小鼠。所有实验进行两次。结果以两组独立系列的数据和来自两个实验的汇合数据进行表示。统计分析基于两组独立系列的数据和来自两个实验的汇合数据进行。
图1显示的结果清楚表明，单剂量Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖颗粒(10mg/Kg)显著延长了存活时间。感染了炭疽的对照组平均存活时间是8.4/8.5天。而用Betafectin处理的组(10.2(p＝0.044)/11.5(p＝0.00029)天)和用全葡聚糖颗粒处理的组(10.0(p＝0.064)/11.5(p＝0.00029)天)平均存活时间显著延长。对汇合了实验1和2的数据进行的分析揭示Betafectin-处理小鼠的存活(10.86天)或全葡聚糖颗粒处理小鼠的存活(10.80天)与对照(8.45天，分别有p＝0.00021和0.00038)相比较，在统计学上有显著升高。
图2显示的结果清楚表明，单剂量Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖颗粒(10mg/Kg)显著增加了存活者的数量。在这些实验中，22只对照动物中只有7只活过了观察期。相对地，Betafectin处理的22只中有19只(86.36％；p＝0.00005)，全葡聚糖颗粒处理的22只中有18只(81.82％；p＝0.00024)存活了相同的时间。
实施例5
全身性PGG和全葡聚糖颗粒处理的炭疽感染动物的细菌负荷
为了测定全身性PGG和全葡聚糖颗粒处理后炭疽感染动物的细菌负荷，实验动物如实施例3中所述行进感染和处理。在死亡时，或感染后的第10到第11天，收获主要器官(肝、脾、和肺)和排出感染位点的淋巴结，称重并在20ml PBS中匀浆以进行细菌计数。所得匀浆进行1/10、1/100、1/1000和1/10000稀释并用0.1ml培养基接种于固体培养基(血琼脂培养皿)以估算CFU/器官的数量。菌落计数前将培养皿在37℃培养24小时。每个实验重复一次，用student′s T检验确定p值。
图3和4显示的结果表明单剂量的Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖颗粒(10mg/Kg)显著降低了肺内细菌负荷，并增加了观察期末无菌小鼠的数量。这些实验中，对照动物显示出在观察期末存活者中1.77×106/3.96×105CFU/g肺的细菌负荷。相对地，Betafectin处理的存活动物具有显著降低的细菌负荷2.6×105CFU/g(p＜0.05)肺，全葡聚糖颗粒处理的存活动物具有显著降低的水平至5.5×105CFU/g肺(p＜0.05)。总计，40.9％的对照动物在观察期末为无细菌的，相比较之下Betafectin处理的动物的86.4％(p＝0.0436)和全葡聚糖颗粒处理的动物的90.9％(p＝0.0194)。
实施例6
用PGG和全葡聚糖颗粒对炭疽感染的小鼠进行口服预防性处理
全葡聚糖颗粒的口服预防性炭疽保护作用通过强饲施用全葡聚糖颗粒的水悬液(40或400μg/小鼠)(从第-7天到第0天每日，或在第-7、-4.5、-2、0天一周四次)。基于工作人员安全需求禁止操作炭疽感染的小鼠，全葡聚糖颗粒的治疗性口服保护效力这样检测，以饮用水中0.3％w/v羧甲纤维素(CMC-P325G，PL Thomas)悬液的形式施用全葡聚糖颗粒(第0天到第+10天每日)，全葡聚糖的浓度根据每天提供0，40或400μg每小鼠/天计算，此计算基于估算的饮用水消耗为6.5ml水/小鼠/天。实际剂量通过每天测量水消耗确定，再以每天每只笼内活着的小鼠数量为系数，计算结果为0，22.6±3.5和200.3±36.4μg每小鼠/天。对照组接受载体强饲或其饮用水中只有羧甲纤维素。在第0天，口服给药后一小时，用LD60剂量的炭疽芽孢对动物进行皮下感染。每日观察动物直至研究结束(第10天)并记录存活时间。存活百分比通过每日存活动物的数量与每组中被感染动物的总数(n＝10)的比值进行计算。每个口服剂量给药实验进行一次。采用Fischer精确检验确定P值。
图5A所示的存活结果表明每日的全葡聚糖颗粒口服预防性给药(＞2mg/kg)还显著增加了炭疽存活者的数量。在这些实验中，10只对照动物中只有5只在炭疽感染中存活(50％存活)。相对地，用日口服剂量2或20mg/kg全葡聚糖颗粒进行预防性处理的动物显示出100％存活(p＝0.016)。相反，图5B显示每周四次口服2mg/kg的预防性剂量不如每日剂量有效(p＝0.41)，因为取得显著的保护效果要求20mg/kg的全葡聚糖剂量(p＝0.016)。
每日口服治疗剂量的全葡聚糖颗粒(＞1.5mg/kg)还有效增加了炭疽存活者的数量(图6)。在这些实验中，10只对照动物中只有3只在炭疽感染后存活(30％存活)。相对地，在1.5mg/kg口服全葡聚糖颗粒的治疗剂量水平下，80％处理过的小鼠存活(p＝0.038)，在13.3mg/kg口服全葡聚糖颗粒的治疗剂量水平下，90％处理过的小鼠存活(p＝0.01)。
虽然本发明的实施方案和应用已被详细展示和描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离此处所述本发明概念的情况下，除上述外还有许多改进是可能的。因此本发明的范围仅被所附权利要求所限。

Claims (11)

1.未衍生的β(1，3)-葡聚糖在制备用于治疗或预防人或动物中的炭疽感染的药物中的应用，其中所述药物包含有效量的未衍生的β(1，3)-葡聚糖。
2.权利要求1所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中所述未衍生的β(1，3)-葡聚糖包含PGG葡聚糖、全葡聚糖颗粒、或PGG葡聚糖和全葡聚糖颗粒的组合。
3.权利要求2所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中每天施用约0.1-100mg/Kg的PGG葡聚糖。
4.权利要求2所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中每天施用约0.1-500mg/Kg的全葡聚糖颗粒。
5.权利要求3所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中每天施用约1-10mg/Kg的PGG葡聚糖。
6.权利要求4所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中每天施用约2-20mg/Kg的全葡聚糖颗粒。
7.权利要求2所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中每天施用约0.1-100mg/Kg的PGG葡聚糖和约0.1-500mg/Kg的全葡聚糖颗粒的组合。
8.权利要求7所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中每天施用约1-10mg/Kg的PGG葡聚糖和约2-20mg/Kg的全葡聚糖颗粒的组合。
9.权利要求1所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中所述未衍生的β(1，3)-葡聚糖通过口服施用。
10.权利要求1所述的未衍生的β(1，3)-葡聚糖的应用，其中所述药物另外包含抗生素。
11.未衍生的β(1，3)-葡聚糖在制备用于治疗或预防人或动物中的炭疽感染的药物中的应用，其中所述药物包含未衍生的β(1，3)-葡聚糖和抗生素的协同组合。
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