CN101720354A - 利用胎盘干细胞抑制肿瘤 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用胎盘干细胞和胎盘干细胞群来抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的方法。本发明还提供了基于肿瘤抑制来生产和选择胎盘干细胞和细胞群的方法，以及包含此类细胞和细胞群的组合物。

Description

利用胎盘干细胞抑制肿瘤
1.发明领域
本发明提供了利用胎盘干细胞来抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的方法。本发明还提供了用于抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的包含胎盘干细胞的化合物，胎盘干细胞的肿瘤抑制群的分离群，以及生产此类群的方法。
2.发明背景
人干细胞是能够产生多种成熟的人细胞系的全能性或多能性前体细胞。现有证据证实，干细胞可被用于再增殖多种组织(如果不是所有组织)和被用于恢复生理学和组织学功能。
已经表征过多种不同类型的哺乳动物干细胞。参见例如：Caplan等人，美国专利号5,486,359(人间充质干细胞)；Boyse等人，美国专利号5,004,681(胎儿和新生儿造血干细胞和前体细胞)；Boyse等人，美国专利号5,192,553(同上)；Beltrami等人，Cell 114(6)：763-766(2003)(心肌干细胞)；Forbes等人，J.Pathol.197(4)：510-518(2002)(肝脏干细胞)。脐带血和来源于脐带血的全部有核细胞已被用于移植，从而在已进行消融疗法(ablative therapy)的患者中部分或完全恢复造血功能。
胎盘是特别有吸引力的干细胞来源。由于哺乳动物胎盘来源充足并且通常作为医学废物丢弃，它们代表了医疗有用的干细胞的唯一来源。
目前已经证实，骨髓来源的间充质干细胞，当经过遗传修饰时，具有迁移和浸润到某些肿瘤细胞中的能力。参见例如：Hung等人，“Mesenchymal Stem Cell Targeting of Microscopic Tumors and Tumor StromaDevelopment Monitored by Noninvasive In vivo Positron Emission tomographyImaging，”Clin.Cancer Res.11(21)：7749-7756(2005)。某些遗传改造的骨髓来源的间充质干细胞系已经表现出可抑制肿瘤生长。参见Studney等人，“Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells as Vehicles for Interferon-βDelivery into Tumors，”Cancer Res.62：3603-3608(2002)(黑色素瘤细胞系)；Nakamura等人，“Antitumor Effect of Genetically Engineered MesenchymalStem Cells in a Rat Glioma Model，”Gene Therapy 11：1155-1164(2004(表达重组IL-2的间充质干细胞)。然而，间充质干细胞已经表现出在体内可促进至少一种肿瘤的生长。参见Zhu等人，“Mesenchymal Stem Cells Derivedfrom Bone Marrow Favor Tumor Cell Growth In Vivo，”Exp.Mol.Pathol.(在公开之前被电子公开，2005)(结肠腺癌细胞)。
然而，到目前为止，尚未描述过胎盘来源的干细胞抑制肿瘤生长，或者抑制肿瘤细胞增殖的能力。本发明提供了胎盘干细胞的此类用途及其群。
3.发明概述
本发明提供了利用胎盘干细胞、胎盘干细胞群、以及包含胎盘干细胞的组合物来抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的方法。本发明还提供了组合物，包括包含具有肿瘤细胞增殖抑制性质的胎盘干细胞的组合物。本发明还提供了基于其抑制肿瘤细胞增殖的能力而选择的胎盘细胞群，及具有此类性质的组合物。
一方面，本发明提供了抑制大量肿瘤细胞增殖的方法，包括将所述大量肿瘤细胞与大量胎盘干细胞接触一段时间，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述时间足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。在特定实施方案中，所述肿瘤细胞是实体瘤的一部分。在另一特定实施方案中，所述肿瘤细胞是非实体瘤细胞类型。在另一特定实施方案中，所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在所述方法的另一特定实施方案中，所述接触在体外进行。在另一特定实施方案中，所述接触在个体体内进行。所述个体可以是哺乳动物，例如人。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞与所述个体是HLA匹配的。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞与所述个体不是HLA匹配的。在另一更特定的实施方案中，所述接触包括将所述胎盘细胞静脉内施用至所述个体。在另一更特定的实施方案中，所述接触包括将所述胎盘干细胞在肿瘤位点或靠近肿瘤位点处施用至所述个体。在特定实施方案中，所述胎盘干细胞：表达CD200和HLA-G；表达CD73、CD105和CD200；表达CD200和OCT-4；表达CD73、CD105和HLA-G；表达CD73和CD105，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体，；和/或表达OCT-4并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。
在另一特定实施方案中，所述大量胎盘干细胞中的至少一部分被改造为表达细胞因子。在更特定的实施方案中，所述细胞因子是IFN-β或IL-2。
在另一特定实施方案中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞与一种或多种抗癌化合物接触。在另一特定实施方案中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞与大量间充质干细胞接触，例如：骨髓来源的间充质干细胞。在另一特定实施方案中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞与大量成纤维细胞接触。
在另一特定实施方案中，所述方法还包括将所述肿瘤细胞与一种或多种干细胞化学趋化剂(chemoattractant)接触。在更特定的实施方案中，所述化学趋化剂是基质来源的因子-1(SDF-1)。
所述方法可以采用与例如在个体中对肿瘤细胞增殖或肿瘤生长产生可检测地抑制所需的一样多的胎盘干细胞。例如，用于与大量肿瘤细胞接触的大量胎盘干细胞可以包含约1×105个胎盘干细胞、约1×106个胎盘干细胞、约1×107个胎盘干细胞、或约1×108个胎盘干细胞、或更多。在多个更特定的的实施方案中，所述方法包括向所述个体施用至少约1×105、至少约1×106、至少约1×107、或至少约1×108个胎盘干细胞。在多个更特定的的实施方案中，所述方法包括施用个体内肿瘤细胞数量的约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、或超过5倍的胎盘干细胞数量。可以使用任何本领域已知的方法来确定个体中肿瘤细胞的数量。肿瘤细胞定量的示例性方法描述于美国专利号6,365,362和6,645,731；Mehes等人，Haematologia 31(2)：97-109(2001)；和Hardingham等人，Cancer Research53：3455-3458(1993)中，其内容在此全文引用作为参考。在多个更特定的实施方案中，所述方法包括基于个体的重量施用大量胎盘干细胞。例如，所述方法包括向所述个体施用约1×103个胎盘干细胞/kg、5×103个胎盘干细胞/kg、1×104个胎盘干细胞/kg、5×104个胎盘干细胞/kg、1×105个胎盘干细胞/kg、5×105个胎盘干细胞/kg、1×106个胎盘干细胞/kg、5×106个胎盘干细胞/kg、1×107个胎盘干细胞/kg、5×107个胎盘干细胞/kg、或约1×108个胎盘干细胞/kg。在多个更特定的实施方案中，所述方法包括向所述个体施用至少约1×103个胎盘干细胞/kg、至少约5×103个胎盘干细胞/kg、至少约1×104个胎盘干细胞/kg、至少约5×104个胎盘干细胞/kg、至少约1×105个胎盘干细胞/kg、至少约5×105个胎盘干细胞/kg、至少约1×106个胎盘干细胞/kg、至少约5×106个胎盘干细胞/kg、至少约1×107个胎盘干细胞/kg、至少约5×107个胎盘干细胞/kg、或至少约1×108个胎盘干细胞/kg。
在多个其他更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞已在体外增殖不超过30次群倍增、不超过20次群倍增、不超过10次群倍增、或不超过5次群倍增。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞已经过冷冻保藏和在所述接触前解冻。在所述方法的更特定的实施方案中，与在缺少所述胎盘干细胞的条件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞被证实在体外抑制肿瘤细胞增殖，例如，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、或95％。
在另一特定实施方案中，所述方法还包括在向所述个体施用所述胎盘干细胞前，确定所述胎盘干细胞具有肿瘤细胞生长抑制活性，例如筛选所述胎盘干细胞对代表性的样本肿瘤细胞增殖的可检测地抑制。在本方法的更特定的实施方案中，在向所述个体施用前，与缺少所述胎盘干细胞的条件下等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞被证实在体外抑制肿瘤细胞增殖，例如，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、或95％。在某些实施方案中，在向含有肿瘤细胞的个体施用前，胎盘干细胞被确定通过直接接触、通过非直接接触(例如，通过可溶性因子)、或通过两者来抑制肿瘤细胞增殖。例如，在所述方法的特定实施方案中，在向所述个体施用前，在直接培养试验中，或在例如transwell试验中，或更优选的，同时在直接培养试验和transwell试验中，所述胎盘干细胞被证实在体外抑制肿瘤细胞增殖，例如，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％。在另一特定实施方案中，针对与将按照所述方法被施用所述胎盘干细胞的个体的内源性的肿瘤细胞具有相同细胞类型(例如：上皮、鳞状上皮)、相同组织起源(例如：乳腺、前列腺等)、或更优选的具有相同细胞类型和组织起源的肿瘤细胞，在体外筛选所述胎盘干细胞对肿瘤细胞增殖或肿瘤生长的抑制。在另一更特定的实施方案中，针对从所述个体的活体切片中获得的肿瘤细胞，或者从所述个体的血样中纯化或分离的肿瘤细胞，在体外筛选所述胎盘干细胞的肿瘤生长抑制活性。在所述方法的多个更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞可以来源于羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、脐带或灌流液，并在向所述患者施用前，与缺少所述胎盘干细胞的条件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞被证实在体外抑制肿瘤细胞增殖，如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％。
本发明还提供抑制大量肿瘤细胞，例如：血癌细胞生长或增殖的方法，其包括将所述大量肿瘤细胞与包含来源于大量胎盘干细胞培养物的条件培养基或上清液的组合物接触一段时间，与未接触所述条件培养基或上清液的大量肿瘤细胞相比，所述时间足以使所述条件培养基或上清液可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。在特定实施方案中，所述接触在体外进行。在另一特定实施方案中，所述接触在体内进行。在另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液来源于与大量肿瘤细胞共培养的大量胎盘干细胞。
在多个特定实施方案中，所述条件培养基或上清液来源于与大量肿瘤细胞共培养的大量胎盘干细胞，所述胎盘干细胞与肿瘤细胞的比例约1∶1、约2∶1、约3∶1、约4∶1，或约5∶1。所述方法可使用条件培养基或上清液，其来源于单独培养或与大量肿瘤细胞共培养的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞与使肿瘤细胞增殖或肿瘤生长实现可检测的抑制所需的一样多。例如，条件培养基或上清液可来源于培养物，所述培养物含有约1×105个胎盘干细胞、约1×106个胎盘干细胞、约1×107个胎盘干细胞、或约1×108个胎盘干细胞或更多。在另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液可来源于共培养物，所述共培养物含有约1×105至约5×105个胎盘干细胞和约1×105个肿瘤细胞、约1×106至约5×106个胎盘干细胞和约1×106个肿瘤细胞、约1×107至约5×107个胎盘干细胞和约1×107个肿瘤细胞、或约1×108至约5×108个胎盘干细胞和约1×108个肿瘤细胞。
在抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法的另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液是来源于包含单独的、或与肿瘤细胞共培养的大量胎盘干细胞的培养物的培养基或上清液，其中产生条件培养基的细胞数量是基于施用该条件培养基的个体的重量。例如，条件培养基或上清液可以是由以下培养物产生的条件培养基或上清液，所述培养物包含约1×103个胎盘干细胞/kg接受者体重、5×103个胎盘干细胞/kg、1×104个胎盘干细胞/kg、5×104个胎盘干细胞/kg、1×105个胎盘干细胞/kg、5×105个胎盘干细胞/kg、1×106个胎盘干细胞/kg、5×106个胎盘干细胞/kg、1×107个胎盘干细胞/kg、5×107个胎盘干细胞/kg、或1×108个胎盘干细胞/kg。在另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液是来源于共培养物的培养基或上清液，所述共培养物含有约1×103至约5×103个胎盘干细胞/kg和约1×103个肿瘤细胞/kg、约1×104至约5×104个胎盘干细胞/kg和约1×104个肿瘤细胞/kg、约1×105至约5×105个胎盘干细胞/kg和约1×105个肿瘤细胞/kg、约1×106至约5×106个胎盘干细胞/kg和约1×106个肿瘤细胞/kg、约1×107至约5×107个胎盘干细胞/kg和约1×107个肿瘤细胞/kg，或约1×108至约5×108个胎盘干细胞/kg和约1×108个肿瘤细胞/kg。
本发明还提供了生产细胞群的方法，所述群包含基于其抑制肿瘤细胞或肿瘤细胞群增殖，或抑制肿瘤生长的能力所选择的胎盘干细胞。例如，在一实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，其包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达OCT-4，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖，或抑制肿瘤的生长；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。
在另一实施方案中，本发明提供了生产分离的细胞群的方法，其包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一实施方案中，所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、CD105和CD200；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一实施方案中，所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和OCT-4；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一实施方案中，所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73和CD105；(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体；和(d)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一实施方案中，所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、CD105和HLA-G；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一实施方案中，所述方法包括选择这样的胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达OCT-4；(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体；和(d)可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞；以及从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在上述方法的更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞主要来源于羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜、或脐带。在另一更特定的实施方案中，所述方法中使用的干细胞是脐带干细胞。
在生产分离的胎盘干细胞群的上述方法中，在一实施方案中，所述方法可包括选择表现出间充质干细胞的至少一种特异性特征的细胞。在更特定的实施方案中，所述间充质干细胞的特异性特征是表达CD29、表达CD44、表达CD90、或表达上述的组合。在本方法的另一特定实施方案中，所述选择是利用抗体实现的。在另一特定实施方案中，所述选择是利用流式细胞仪实现的。在另一特定实施方案中，所述选择是利用磁珠实现的。在另一特定实施方案中，所述选择是利用荧光活化的细胞分选实现的。在上述方法的另一特定实施方案中，扩增所述细胞群。
本发明还提供例如，根据任一上述方法生产或选择的分离的胎盘干细胞群。在一实施方案中例如，本发明提供包含胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达OCT-4，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制大量肿瘤细胞的增殖。
在特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、CD105和CD200；和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和OCT-4；和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。
在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73和CD105；(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体；和(d)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、CD105和HLA-G；和(c)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。在另一特定实施方案中，所述分离的胎盘干细胞群包含胎盘干细胞，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达OCT-4；(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体；和(d)与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，已确定可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。
本发明还提供包含任一上述分离的胎盘干细胞群的组合物。在特定实施方案中，所述组合物还包含大量的非胎盘细胞，如非胎盘干细胞，如间充质干细胞，如骨髓来源的间充质干细胞。在特定实施方案中，所述组合物还包含大量的成纤维细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是被施用本发明中描述的胎盘干细胞组合物的个体的自体细胞。
在上述方法、分离的胎盘干细胞群和组合物中，可通过额外的标记来定义或选择胎盘干细胞。例如，所述表达CD200和HLA-G的胎盘干细胞还表达CD73和CD105，即，CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-或CD45-。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，当所述群当在允许胚样体形成的条件下培养时，所述大量的胎盘干细胞有助于从含有胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。
在另一更特定的实施方案中，所述表达CD73、CD105、CD200的胎盘干细胞也是HLA-G+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是，CD34-、CD38-或CD45-。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-和CD45-。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+。在另一特定实施方案中，当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，所述大量的胎盘干细胞有助于从含有胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。
在另一更特定的实施方案中，所述表达CD200和OCT-4的胎盘干细胞也表达CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是HLA-G+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-或CD45-。在另一更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-、和CD45-。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+。在另一特定实施方案中，当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞有助于从含有胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。
在另一更特定的实施方案中，所述表达CD73、CD105和HLA-G的胎盘干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-和CD45-。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是OCT-4+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD200+。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+。在另一特定实施方案中，当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，所述干细胞有助于从含有胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。
在另一更特定的实施方案中，所述表达CD73和CD105、并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时有助于从含有胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体的胎盘干细胞，还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是OCT-4+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD200+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是OCT-4+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-。
在另一更特定的实施方案中，所述表达OCT-4、并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时有助于从含有胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体的胎盘干细胞，也是CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD34-、CD38-和CD45-。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD200+。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-。
本发明中的方法、分离的群和组合物中使用的胎盘干细胞可来源于完整的胎盘，或胎盘的任何部分。例如，在多个实施方案中，所述胎盘干细胞主要或仅仅来源于羊膜、或羊膜和绒毛膜。在另一实施方案中，本发明的方法中使用的干细胞来源于脐带。
本发明还提供了包含胎盘干细胞的分离的细胞群，所述胎盘干细胞通过本发明中描述的选择肿瘤细胞抑制性胎盘细胞群的任何方法制备。例如，在一实施方案中，本发明提供了包含分离的胎盘干细胞的细胞群，其中所述胎盘干细胞：(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达OCT-4，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胚胎干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖，或肿瘤的生长。
本发明还提供了冷冻保藏的干细胞群，例如本发明中描述的包含胎盘干细胞的细胞群，其中所述细胞群是肿瘤细胞抑制性的。例如，本发明提供了CD200+、HLA-G+胎盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述细胞已被冷冻保藏，并且其中所述群用容器来容纳。本发明进一步提供了CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述干细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来容纳。本发明还提供了CD200+、OCT-4+胎盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述干细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来容纳。本发明还提供了CD73+、CD105+胎盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来容纳，并且其中当在允许胚样体形成的条件下与胎盘细胞群培养时，所述干细胞有助于一个或多个胚样体的形成。本发明还提供了CD73+、CD105+、HLA-G+胎盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来容纳。本发明还提供了OCT-4+胎盘干细胞群，与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖，其中所述细胞已被冷冻保藏，且其中所述群用容器来容纳，并且其中当在允许胚样体形成的条件下与胎盘细胞群培养时，所述干细胞有助于一个或多个胚样体的形成。
在任何前述冷冻保藏的群的特定实施方案中，所述容器是袋子。在多个特定实施方案中，所述群包括大约、至少或至多1×106个所述干细胞、5×106个所述干细胞、1×107个所述干细胞、5×107个所述干细胞、1×108个所述干细胞、5×108个所述干细胞，1×109个所述干细胞、5×109个所述干细胞、或1×1010个所述干细胞。在任何上述冷冻保藏的群的其它特定实施方案中，所述干细胞已经传代大约、至少或不超过5次、不超过10次、不超过15次、或不超过20次。在任何上述冷冻保藏的群的另一特定实施方案中，所述干细胞在所述容器内进行扩增。
本发明进一步提供了肿瘤细胞抑制性组合物，即，可检测地抑制肿瘤细胞或肿瘤细胞群增殖、或抑制肿瘤生长的组合物。在一实施方案中，本发明提供了包含上清液的组合物，所述上清液来源于本发明中描述的任何分离的胎盘细胞群的培养物。在另一实施方案中，本发明提供了包含培养基的组合物，所述培养基来源于分离的胎盘干细胞的培养物，其中所述胎盘细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达OCT-4，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或肿瘤细胞群的增殖、或肿瘤生长，其中所述胎盘干细胞的培养物已经在所述培养基中培养了24小时或更久。
在另一特定实施方案中，任何上述组合物包含基质。在更特定的实施方案中，所述基质是三维支架。在另一更特定的实施方案中，所述基质包括胶原、明胶、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、果胶、鸟氨酸、或玻璃粘连蛋白。在另一更特定的实施方案中，所述基质是羊膜或羊膜来源的生物材料。在另一更特定的实施方案中，所述基质包括胞外膜蛋白。在另一更特定的实施方案中，所述基质包括合成的化合物。在另一更特定的实施方案中，所述基质包括生物活性化合物。在另一更特定的实施方案中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体、或小于5000道尔顿的有机分子。
本发明还提供了包含胎盘干细胞的药物组合物，所述胎盘干细胞经过遗传改造以产生与肿瘤抑制相关的重组或外源性细胞因子。例如，在一实施方案中，本发明提供了包含大量胎盘干细胞的药物组合物，其中所述胎盘干细胞经过改造表达外源性IFN-β或IL-2。在特定实施方案中，所述胎盘干细胞以一定量表达外源性IFN-β或IL-2，与不表达外源性IFN-β或IL-2的胎盘干细胞相比，当所述肿瘤细胞与所述胎盘干细胞接触时，所述量导致对肿瘤细胞增殖的可检测的更大抑制。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达OCT-4，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖、或肿瘤生长。
3.1定义
如本发明中使用的，术语“约”表示与所述值例如±10％的偏差。
如本发明中使用的，术语“SH2”指与标记CD105上的表位结合的抗体。因此，被称为SH2+的细胞是CD105+的。参见例如：美国专利号5,486,359。
如本发明中使用的，术语“SH3”和“SH4”指与标记CD73上的表位结合的抗体。因此，被称为SH3+和/或SH4+的细胞是CD73+的。参见例如：美国专利号5,486,359。
如本发明中使用的，术语“分离的干细胞”是指基本上与干细胞来源的组织(如胎盘)中的其它、非干细胞分离的干细胞。如果在例如干细胞的收集和/或培养中，从干细胞中去除了至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％，或至少99％的与干细胞天然相关的非干细胞，则该干细胞是“分离的”。
如本发明中使用的，术语“分离的细胞群”是指基本上与细胞群来源的组织(如胎盘)中的其它细胞分离的细胞群。如果在例如干细胞的收集和/或培养中，从干细胞中去除了至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％，或至少99％的与细胞群或者衍生细胞群的细胞天然相关的细胞，则该干细胞是“分离的”。
如本发明中使用的，术语“胎盘干细胞”指不考虑形态学、细胞表面标记、或原代培养后的传代数，来源于哺乳动物胎盘的干细胞或前体细胞，其附着于组织培养基质上(例如：组织培养塑料或纤粘连蛋白包被的组织培养板)。术语“胎盘干细胞”涵盖了来源于哺乳动物胎盘的任何部分的干细胞或前体细胞，包括羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜盘、和/或脐带，以及来源于胎盘灌流液的细胞。然而，本发明中使用的术语“胎盘干细胞”不表示来源于脐带血的滋养层或细胞。如果细胞保留了干细胞的至少一种属性，例如分化为至少一种其它细胞类型的能力，则认为该细胞是“干细胞”。
如本发明中使用的，当特定标记是可检测的时，则干细胞对该标记是“阳性”的。例如，由于CD73在胎盘干细胞上以可检测地大于背景(例如，与同型对照相比)的量可检测，因此胎盘干细胞对CD73为阳性的(即，CD73+)。当标记可用于将所述细胞与至少一种其它细胞类型区分开时，或当所述标记在细胞中存在或表达时可用于选择或分离所述细胞，则该细胞也是所述标记阳性的。
在本方法的上下文中，“肿瘤细胞”是指表现出非正常生长模式的任何细胞，包括良性但增生的细胞、癌细胞、转移细胞等。“肿瘤细胞”可以是例如，实体瘤中的细胞、或具有形成实体瘤的潜力或能力的细胞、或非实体瘤的细胞，例如：血癌细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是来源于上皮、腺体或造血细胞来源的细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。
如本发明中使用的，“抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞增殖”是指与对照或标准相比，降低肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖量。例如，将例如大量胎盘干细胞存在时肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖与不存在该胎盘干细胞时相同类型的肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖相比。该术语涵盖了肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖的可检测的降低、增殖的中止、或肿瘤细胞数量的下降。
4.附图说明
图1：来源于灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带干细胞(E)的胎盘干细胞的活力。X-轴上的数字表示从中获得干细胞的胎盘。
图2：由FACSCalibur测定的来源于灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带(E)的HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞的百分比。X-轴上的数字表示从中获得干细胞的胎盘。
图3：由FACSAria.测定的来源于灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带(E)的HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞的百分比。X-轴上的数字表示从中获得干细胞的胎盘。
图4：在来源于胎盘灌流液的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图5：在来源于羊膜的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图6：在来源于绒毛膜的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图7：在来源于羊膜-绒毛膜盘的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图8：在来源于脐带的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表达。
图9：在来源于灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带(E)的干细胞中的HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的平均表达。
图10：胎盘干细胞和脐带干细胞抑制淋巴细胞样细胞系(LCL)肿瘤细胞生长。LCL单独培养，或与来源于羊膜-绒毛膜(AC)或羊膜(AM)的胎盘干细胞，或来源于脐带(UC)的干细胞共培养17天。胎盘干细胞与LCL的比例是2∶1。计数大AAD-细胞(对于UC，n＝3)。
图11：胎盘干细胞与骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)一样有效地杀死肿瘤细胞。显示了LCL与BM-MSC或脐带(UC)干细胞的6天共培养(n＝1)。
图12：胎盘干细胞肿瘤抑制的剂量依赖性。组织细胞性瘤、慢性髓性白血病(CML)、乳腺癌、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和结肠癌细胞单独孵育，或与胎盘干细胞以1∶2、1∶1、1.5∶1和2∶1的比例一起孵育。在共培养后，确定活的7-AAD-细胞的数量。然后计算自由生长培养物的胎盘干细胞抑制。在图例中，自由生长的肿瘤细胞的绝对数在每个细胞系说明后的括号内给出(数字表示105个细胞)。除LCL n＝4外，N＝2。
附图13A和13B：胎盘干细胞肿瘤抑制的抑制和接触依赖性。A：在transwells(黑色柱)或开放孔(A，空心柱)中，组织细胞性瘤、慢性髓性白血病、乳腺导管癌、LCL、视网膜瘤、肺癌、乳腺癌、和ALL细胞单独孵育，或与胎盘干细胞以1∶1的比例一起孵育。在6天后，计数活的7-AAD-细胞，并根据自由生长培养物中的细胞计数来计算抑制(B，计数的插入)。B：根据抑制数据，计算接触依赖性。除LCL n＝2外，Transwell：n＝1。
图14：来源于于结果显示在附图13A和13B中的实验中的上清液中高表达的细胞因子。在测试的25种细胞因子中，显示了LCL和组织细胞性淋巴瘤的IL-6、IL-8和MCP-1。比较图15A和15B。
图15A和15B：LCL/胎盘干细胞共培养物的细胞因子分泌谱。A；LCL单独或与胎盘干细胞在开口孔(LCL PDAC)或transwell(LCL PDACTW)中一起培养。用流式细胞仪计数活的CD23+细胞。B；用Luminex测定来源于A中实验中的上清液。N＝2。
图16A和16B：A：胎盘干细胞与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)对肿瘤细胞的抑制。巨核细胞白血病细胞系MEG-01、组织细胞性淋巴瘤、视网膜瘤、和慢性髓性白血病细胞单独孵育，或与脐带干细胞(UC)、羊膜-绒毛膜胎盘干细胞(AC)、或BM-MSC一起孵育。在共培养6天后，确定每种共培养物的活的AAD-细胞的数量。B：胎盘干细胞的肿瘤细胞抑制的时程。MEG-01细胞单独孵育，或与人脐带上皮细胞(HUVEC)、BM-MSC、或胎盘干细胞(PDAC)共培养。在共培养开始后第1、2、3、4和6天，确定每种培养物中的活细胞(Annexin V-、7-AAD-)数量。
图17：MEG-01细胞的胎盘干细胞肿瘤抑制的接触依赖性。来源于MEG-01/脐带干细胞共培养物的条件培养基抑制巨核细胞白血病细胞系(MEG-01)的肿瘤细胞生长。MEG-01细胞单独培养，或与脐带干细胞(MEG/UC)直接共培养，或在条件培养基(1∶2或1∶10比例)中培养，所述条件培养基收获自抑制性的MEG-01/脐带干细胞共培养物(UC)、MEG-01/骨髓间充质干细胞共培养物(BM)、或MEG-01/HUVEC共培养物(H)。在共培养6天后，确定活细胞(Annexin V-、7-AAD-)的数量。
图18：MEG-01/胎盘干细胞共培养物的细胞因子分泌谱。MEG-01、胎盘干细胞(PDAC)、BM-MSC、和HUVEC细胞单独培养，或以下列组合共培养：MEG-01/HUVEC、MEG-01/BM-MSC、或MEG-01/PDAC。收获7天培养物的上清液，并用Luminex测定血小板来源的生长因子-AA(PDGF-AA)、颗粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长相关的原癌基因-α(GROα)，和白血病抑制因子(LIF)的分泌。所述量以pg/ml显示。
图19：对基质细胞衍生因子(SDF-1)产生应答的脐带干细胞(UC1)的迁移。UC1胎盘干细胞在无血清培养基(基线)，或含有10％FBS、SDF-1、或SDF-1加CXCR4抑制剂AMD3100的培养基中孵育24小时。在向所述细胞中添加
Figure G2007800373556D00231
GR染料后，用荧光读板器在480nm/520nm处测量荧光。
5.发明详述
5.1利用胎盘干细胞抑制肿瘤细胞
本发明提供了利用胎盘干细胞抑制肿瘤细胞的增殖，和抑制肿瘤的生长。在一实施方案中，本发明提供了抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞增殖、或肿瘤生长、或非实体瘤细胞或大量非实体瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞、或肿瘤与大量胎盘干细胞接触一段时间，所述时间足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞的增殖或肿瘤的生长。
胎盘干细胞是例如在本发明中他处描述的胎盘干细胞(参见5.2节)。用于肿瘤细胞抑制的胎盘干细胞可来源于或获得自单个胎盘或多个胎盘。用于肿瘤细胞抑制的胎盘干细胞也可来源于单个物种，例如预期接受者的物种或预期其肿瘤细胞功能将被降低或抑制的物种，或可来源于多个物种。胎盘干细胞可来源于完整的胎盘或其任何部分，例如羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜盘、或脐带。来源于胎盘的任何部分的胎盘干细胞可在本发明的方法中使用。可以通过本领域技术人员已知的任何方法从胎盘或其部分收集胎盘干细胞，例如灌流或酶促消化。
肿瘤细胞可以是任何表现出成瘤性细胞生长和增殖的细胞，不论恶性或良性，并包括前癌性和癌性细胞。肿瘤细胞的实例包括但不限于：癌细胞、淋巴瘤细胞、母细胞瘤细胞、肉瘤细胞、和白细胞细胞。肿瘤细胞更特定的实例包括：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、鳞状上皮细胞癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、食道癌细胞、胰腺癌细胞、胶质母细胞瘤、子宫癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、结肠直肠癌细胞、子宫内膜癌细胞、唾液腺癌细胞、肾癌细胞、肝癌细胞、外阴癌细胞、甲状腺癌细胞、肝肉瘤细胞、和多种类型的头颈癌细胞。在特定实施方案中，所述肿瘤细胞是巨核母细胞淋巴瘤细胞、急性淋巴母细胞白血病细胞、急性T-细胞白血病、组织细胞性淋巴瘤细胞、骨髓急性髓性白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、视网膜瘤细胞、或肺癌细胞。
可以通过对怀疑癌化的组织实施组织切片或根据体液样品(例如从血样分离或纯化的细胞)来确定个体中肿瘤细胞的存在。然后可利用多种生物学、分子学、形态学、和细胞学方法来表征癌细胞或组织。特别的，生物学和分子标记可用来评估特征，如细胞来源的类型(如上皮细胞)、细胞的特定类型(例如器官类型，如乳腺或前列腺)、细胞生长或细胞生长潜力、细胞生长阻断、和超倍性状态。这些细胞标记选自但不限于分子、生物化学、和生物学标记和探针，这些标记单独使用或组合使用。
在本发明的上下文中，“接触”涵盖了在体外，例如在单个容器(如培养皿、瓶、小瓶等)中，将胎盘干细胞和肿瘤细胞放置于一起。“接触”还涵盖了在体内，例如同一个体(例如：哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、猫、绵羊、山羊、马、人等)中将胎盘干细胞和肿瘤细胞放置于一起，例如，通过将胎盘干细胞静脉内施用至个体，通过直接注射到肿瘤位点中，等等。在体内接触的一些实施方案中，所述胎盘干细胞和所述肿瘤细胞是细胞培养物中的细胞。在其它一些实施方案中，所述细胞是共培养在相同的物理空间中的，例如在同一培养皿或培养皿的孔中。在另一实施方案中，所述接触不要求所述胎盘干细胞和所述肿瘤细胞间的直接物理接触。例如，所述接触可以包括在独立的物理空间例如位于细胞培养皿的分离的孔中培养所述胎盘干细胞和所述肿瘤细胞，其中胎盘干细胞和肿瘤细胞共享所述胎盘干细胞和所述肿瘤细胞的培养基。在体内接触的某些实施方案中，胎盘干细胞和肿瘤细胞对于个体都是外源性的，即，两种类型的细胞都不是来源于个体内。在另一实施方案中，所述肿瘤细胞是通过肿瘤发生在个体内产生的肿瘤细胞，即，肿瘤细胞对个体是内源性的。在优选的实施方案中，所述接触(体外或体内)进行足够长的时间，并与足够数量的胎盘干细胞接触，从而在所述接触后的一段时间，足以使肿瘤细胞的增殖产生可检测的抑制。更优选的，在多个实施方案中，与缺少胎盘干细胞的条件下的免疫功能相比，在所述接触后的一段时间，所述接触足以抑制肿瘤细胞增殖至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％。甚至更优选的，肿瘤细胞或大量肿瘤细胞的增殖被完全抑制，从而在所述接触后的一段时间，所述肿瘤细胞不增殖，或其增殖不足以增加肿瘤细胞的总数。在多个实施方案中，该时间段是1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更长。
肿瘤细胞的抑制，例如个体中的肿瘤细胞，可以使用对肿瘤细胞增殖或肿瘤生长产生可检测的抑制所需要量的胎盘干细胞。例如，在本方法的多个实施方案中，大量胎盘干细胞与大量肿瘤细胞，例如，个体内的肿瘤细胞接触，其中所述大量胎盘干细胞包含约1×105个胎盘干细胞、约1×106个胎盘干细胞、约1×107个胎盘干细胞、约1×108个胎盘干细胞、约1×109个胎盘干细胞、约1×1010个胎盘干细胞、约1×1011个胎盘干细胞、约1×1012个胎盘干细胞或更多。
在其它实施方案中，所述方法包括向所述个体施用每千克个体体重至少约1×105、至少约1×106、至少约1×107、或至少约1×108个胎盘干细胞。在特定实施方案中，向含有大量肿瘤细胞的个体施用每千克个体体重约1百万个胎盘干细胞。
在多个更特定的实施方案中，本方法包括施用约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍，或超过5倍于个体中肿瘤细胞数量的胎盘干细胞。可使用本领域已知的任何方法来确定个体中的肿瘤细胞数量。肿瘤细胞定量的示例性方法描述于美国专利号6,365,362和6,645,731中；Mehes等人，Hemtologia31(2)：97-109(2001)；和Hardingham等人，Cancer Research 53：3455-3458(1993)，其全文在此全部引用作为参考。在多个更特定的实施方案中，所述方法包括基于个体的体重施用大量胎盘干细胞。例如，所述方法包括向所述个体施用约1×103个胎盘干细胞/kg、5×103个胎盘干细胞/kg、1×104个胎盘干细胞/kg、5×104个胎盘干细胞/kg、1×105个胎盘干细胞/kg、5×105个胎盘干细胞/kg、1×106个胎盘干细胞/kg、5×106个胎盘干细胞/kg、1×107个胎盘干细胞/kg、5×107个胎盘干细胞/kg、或约1×108个胎盘干细胞/kg。在多个更特定的实施方案中，所述方法包括向所述个体施用至少约1×103个胎盘干细胞/kg、至少约5×103个胎盘干细胞/kg、至少约1×104个胎盘干细胞/kg、至少约5×104个胎盘干细胞/kg、至少约1×105个胎盘干细胞/kg、至少约5×105个胎盘干细胞/kg、至少约1×106个胎盘干细胞/kg、至少约5×106个胎盘干细胞/kg、至少约1×107个胎盘干细胞/kg、至少约5×107个胎盘干细胞/kg、或至少约1×108个胎盘干细胞/kg。
在其它多个更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞已经在体外增殖不超过30次群倍增、不超过20次群倍增、不超过10次群倍增、或不超过5次群倍增。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞已被冷冻保藏并在所述接触前解冻。在本方法的其它特定实施方案中，与缺少所述胎盘干细胞条件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞抑制所述肿瘤细胞增殖约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％。
有利地，在用于例如在个体中抑制肿瘤细胞生长或增殖前，可筛选胎盘干细胞，例如来源于特定的个体或个体库、来源于特定组织等等的胎盘干细胞的肿瘤抑制活性。因此，在特定实施方案中，利用胎盘干细胞抑制肿瘤细胞增殖或生长的方法包括：在向所述个体施用所述胎盘干细胞之前，在体外筛选所述胎盘干细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。在本方法的更特定的实施方案中，在向所述个体施用前，与缺少所述胎盘干细胞条件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞被证实在体外可抑制肿瘤细胞增殖例如，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、或95％，其中所述增殖通过在一段时间内相同条件下所产生的细胞数来测量。所述胎盘干细胞可以通过直接接触、通过可溶性因子、或通过两者来抑制肿瘤细胞。因此，在本方法的其它更特定的实施方案中，在向所述个体施用前，在体外在直接培养试验、在transwell试验、或更优选的同时在直接培养试验和transwell试验中验证了所述胎盘干细胞抑制肿瘤细胞增殖。
可以利用任何肿瘤细胞来筛选胎盘干细胞对肿瘤细胞增殖或生长的抑制，但更有效的筛选是那些在受感染的个体中的复现或试图复现肿瘤抑制的筛选。例如，在另一特定实施方案中，针对与施用所述胎盘干细胞的个体内的肿瘤细胞具有相同细胞类型(例如：上皮、鳞状上皮等)、相同组织起源(例如：乳腺、前列腺等)、或更优选的，相同细胞类型和相同组织起源的肿瘤细胞，在体外筛选所述胎盘干细胞的肿瘤生长抑制活性。在另一更特定的实施方案中，针对来源于所述个体的肿瘤细胞活体切片的、或从所述个体的血样纯化或分离的肿瘤细胞，在体外筛选所述胎盘干细胞的肿瘤生长抑制活性。
在本方法的多个更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞来源于羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、或脐带、或来源于胎盘灌流液，并在向所述个体施用前，与缺少所述干细胞条件下的等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞被证实可在体外抑制肿瘤细胞增殖例如，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、或95％。
对于体内接触胎盘干细胞和内源性肿瘤，例如实体瘤或血癌，所述胎盘干细胞可以采用本领域技术人员已知的向个体有效导入活细胞的任何方式来导入个体中。例如，可以通过静脉内灌流，或肌肉内、腹膜内、真皮内等方法导入胎盘干细胞。在优选的实施方案中，所述胎盘干细胞在肿瘤或肿瘤细胞的位点或周边被注射至个体体内。所述细胞还可以通过移植，例如天然或人造基质，如明胶来导入，其中所述胎盘干细胞陷入(enmesh)其中，并且一旦移植后，所述细胞可从中长出。此类基质的非限制性实例提供在如下5.6.1.4节中。
通过任何这类方法或本领域技术人员已知的其它方法将胎盘干细胞导入个体中，所述的导入足以有助于所述胎盘干细胞和肿瘤细胞之间的接触。将胎盘干细胞导入个体，特别是具有内源性肿瘤细胞的个体，可以包括单次导入，或在若干小时、若干天、若干星期、若干月或若干年内的多次导入。胎盘干细胞的每次导入可以包括一定数量的干细胞，所述量本身或在聚集物中足以可检测地抑制大量肿瘤细胞的增殖。对于体内施用，所述胎盘干细胞可配制成如下述5.6.1节中描述的药物组合物。
在体外实验中可以确定在体内条件下抑制的程度，例如，通过比较在优化生长条件下肿瘤细胞或大量肿瘤细胞在一段时间内产生的肿瘤细胞数量和接触胎盘干细胞的等量肿瘤细胞在等量时间内产生的肿瘤细胞数量。细胞(包括肿瘤细胞)的增殖可以通过任何本领域已知的方法来评估。例如，可以在多个时间点对培养细胞或个体内细胞进行取样，并采用血球计数器或类似仪器进行计数。所述肿瘤细胞可以采用被设计分离进入子细胞的非降解染料来染色，例如，用溴脱氧嘧啶(BrDU)、二醋酸羧基荧光素(CFSE)、或Oregon Green 488羧酸二乙酸(Invitrogen)来染色，并采用血细胞计数器来确定染色的程度。当所述肿瘤细胞与胎盘干细胞接触，且比不接触胎盘干细胞的肿瘤细胞表现出可检测的更低的每细胞染色量(例如，可检测的更低的平均每细胞染色量)时，所述胎盘干细胞抑制肿瘤细胞生长。对于特定数量的胎盘干细胞和一定量的肿瘤细胞，从在体外实验中抑制的程度可以外推出在个体内肿瘤或肿瘤细胞的抑制程度。
肿瘤生长的抑制可采用本领域已知的用于肿瘤成体内像或检测的任何方法来评估。例如，所述肿瘤细胞可采用肿瘤特异性抗体来标记，并可采用例如PET扫描或CAT扫描来成像，或可以利用X-射线来成像。肿瘤生长抑制的测定可通过，例如对肿瘤图像的视觉检查，通过确定肿瘤标记密度，通过确定肿瘤图像中肿瘤的区域等，来确认。体内肿瘤生长抑制的测定还可通过，检测或关注肿瘤相关症状的任何消除、改善、或恶化的减缓来确定。
所述个体可以是哺乳动物，例如人。在另一更特定的实施方案中，所述接触包括静脉内向所述个体施用所述胎盘细胞。在另一更特定的实施方案中，所述接触包括向所述个体的肿瘤位点或邻近位点施用所述胎盘细胞。
所述胎盘干细胞还可以与一种或多种第二类型的干细胞共同施用，例如来源于骨髓的间充质干细胞。此类第二干细胞可以与胎盘干细胞以例如约1∶10至约10∶1的比例向个体施用。
所述胎盘干细胞还可以与一种或多种不是干细胞的细胞类型共同施用。在特定实施方案中，所述胎盘干细胞与第二种个体自体的、大量细胞一起施用。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与成纤维细胞共同施用。在一些实施方案中，所述成纤维细胞是自体的成纤维细胞。所述成纤维细胞可以与胎盘干细胞以例如约1∶10至约10∶1的比例向个体施用。
所述胎盘干细胞还可以与一种或多种干细胞化学趋化剂一起施用。在特定实施方案中，所述干细胞化学趋化剂是SDF-1。
5.2胎盘干细胞和胎盘干细胞群
本发明抑制肿瘤细胞增殖的方法使用胎盘干细胞，即可从胎盘或其部分获得的干细胞，其(1)附着于组织培养基质；(2)具有分化为非胎盘细胞类型的能力；和(3)在足够的数量下，具有可检测地抑制肿瘤细胞或大量肿瘤细胞增殖的能力，或可检测地抑制肿瘤生长的能力。胎盘干细胞不来源于血液，例如，胎盘血或脐带血。在本发明的方法和组合物中使用的胎盘干细胞具有下述能力，并且可根据其能力进行选择：在体外或体内抑制癌细胞或大量癌细胞增殖，或在体内抑制肿瘤生长。
胎盘干细胞在起源上可以是胎儿或母体的(即，可以具有母亲或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群，或含有胎盘干细胞的细胞群，可包含在起源上仅为胎儿或母体的胎盘干细胞，或者可以包含胎儿和母体起源的胎盘干细胞的混合群。所述胎盘干细胞，和含有胎盘干细胞的细胞群可以通过如下描述的形态学、标记和培养特征来鉴别和选择。
5.2.1物理和形态学特征
当在原代培养或细胞培养时，本发明中使用的胎盘干细胞附着于组织培养基质上，例如组织培养容器的表面(如组织培养塑料)。培养中的胎盘干细胞一般呈现出成纤维细胞样、星状外观，从中央细胞体延伸出大量胞质突起。然而，所述胎盘干细胞与在相同条件下培养的成纤维细胞在形态学上不同，胎盘干细胞表现出大量多于成纤维细胞的此类突起。形态学上，胎盘干细胞也与造血干细胞是可区分的，其在培养中通常呈现出更圆的，或鹅卵石状的形态。
5.2.2细胞表面、分子和遗传标记
在本发明的方法和组合物中有用的胎盘干细胞和胎盘干细胞群，表达大量可用于鉴别和/或分离干细胞、或包含干细胞的细胞群的标记。本发明的胎盘干细胞和干细胞群(即，两种或多种胎盘干细胞)包括从胎盘或其任何部分(例如：羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜盘、胎盘小叶、脐带等)直接获得的干细胞和含有干细胞的细胞群。胎盘干细胞群还包括培养中的胎盘干细胞群(即，两种或多种)，和容器例如袋子中的群。然而，胎盘干细胞不是滋养层。
胎盘干细胞一般表达标记CD73、CD105、CD200、HLA-G、和/或OCT-4，并且不表达CD34、CD38、或CD45。胎盘干细胞还可以表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。这些标记可用于鉴别胎盘干细胞，并将胎盘干细胞与其它干细胞类型区分开。由于胎盘干细胞可以表达CD73和CD105，其可具有间充质干细胞-样特征。然而，由于胎盘干细胞可以表达胎儿-特异性标记CD200和HLA-G，其可以与间充质干细胞区分开，例如骨髓来源的间充质干细胞其既不表达CD200也不表达HLA-G。以相同的方式，缺少CD34、CD38和/或CD45的表达可鉴别胎盘干细胞为非造血干细胞。
在一实施方案中，本发明提供了包含大量为CD200+、HLA-G+的胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在分离群的特定实施方案中，所述干细胞还是CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在更特定的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+。在另一实施方案中，当在允许胚样体形成的条件下培养时，所述分离群产生一个或多个胚样体。
在另一实施方案中，本发明提供了包含大量为CD73+、CD105+、CD200+的胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在所述群的特定实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一特定实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-、或CD45-。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、和HLA-G+。在另一特定实施方案中，当在允许胚样体形成的条件下培养时，所述细胞群产生一个或多个胚样体。
本发明还提供了包含大量为CD200+、OCT-4+的胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一特定实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-、和CD45-。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、和HLA-G+。在另一特定实施方案中，当在允许胚样体形成的条件下培养时，所述群产生一个或多个胚样体。
本发明还提供了包含大量为CD73+、CD105+、和HLA-G+的胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在上述大量细胞的特定实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-、或CD45-。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-、和CD45-。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是OCT-4+。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是CD200+。在另一更特定的实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+。
本发明还提供了包含大量肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群，所述干细胞是CD73+、CD105+干细胞，其中所述大量的细胞当在允许胚样体形成的条件下培养时形成一个或多个胚样体，且其中所述干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-、或CD45-。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-、和CD45-。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是OCT-4+。在更特定的实施方案中，所述干细胞还是OCT-4+、CD34-、CD38-、和CD45-。
本发明还提供包含大量胎盘干细胞的分离细胞群，所述胎盘干细胞是OCT-4+干细胞，其中所述群当在允许胚样体形成的条件下培养时形成一个或多个胚样体，且其中所述干细胞被鉴定为可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。
在多个实施方案中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％的所述分离的胎盘细胞是OCT-4+干细胞。在上述群的特定实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一特定实施方案中，所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一特定实施方案中，所述干细胞是CD200+。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-。在另一特定实施方案中，所述群已经过扩增，例如传代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次，或至少20次。
在任何上述实施方案中，本方法还可以包括选择表达ABC-p(胎盘特异性ABC转运蛋白；参见例如：Allikmets等人，Cancer Res.58(23)：5337-9(1998))的胎盘细胞。本方法还可以包括选择表现出至少一种对例如间充质干细胞特异性的特征的细胞，例如：表达CD29、表达CD44、表达CD90、或上述组合的表达。
在另一实施方案中，本发明提供了包含大量肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞的分离细胞群，所述干细胞是CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-和CD133-。
在上述提到的胎盘干细胞的特定实施方案中，所述胎盘干细胞组成性分泌IL-6、IL-8和单核细胞化学趋化剂蛋白(MCP-1)。
每种上述大量胎盘干细胞都可以包含从哺乳动物胎盘直接获得和分离的胎盘干细胞，或者已经培养和传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多代的胎盘干细胞，或其组合。
上述肿瘤细胞抑制性的大量胎盘干细胞可以包含大约、至少、或不超过1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个胎盘干细胞。
5.2.3选择和生产胎盘干细胞群
在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方法，包括选择胎盘细胞群其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD200+、HLA-G+胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞可检测地抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。在特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-或CD45-的干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+的干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择还包括选择那些当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚样体的大量胎盘干细胞。
在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方法，包括选择大量胎盘细胞其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％的所述细胞是CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是HLA-G+的干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择还包括选择那些当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚样体的胎盘细胞群。
在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方法，包括选择大量胎盘细胞其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD200+、OCT-4+胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞可检测地抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。在特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是HLA-G+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+的胎盘干细胞。
在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方法，包括选择大量胎盘细胞其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73+、CD105+和HLA-G+胎盘干细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD200+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+的胎盘干细胞。
在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方法，包括选择大量胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73+、CD105+胎盘干细胞，并且其中所述大量细胞当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚样体，并且其中所述干细胞可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是OCT-4+的胎盘干细胞。在更特定的实施方案中，所述选择包括选择那些还是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。
在另一实施方案中，本发明还提供了从大量胎盘细胞中选择大量胎盘干细胞的方法，包括选择大量胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％的所述分离的胎盘干细胞是OCT-4+干细胞，并且其中所述大量的细胞当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚样体，并且其中所述干细胞可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。在特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD200+的胎盘干细胞。在更特定的实施方案中，所述选择包括选择那些还是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。
本发明还提供生产可以抑制肿瘤细胞增殖的胎盘干细胞群的方法。例如，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择任何上述大量胎盘干细胞，并从其它细胞，例如，其它胎盘细胞中分离大量胎盘干细胞。在特定实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘细胞，其中所述胎盘细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，且当所述群培养在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达OCT-4，并且当所述群培养在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；以及从其它细胞中分离所述胎盘细胞来形成细胞群。
在更特定的实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；和(c)可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一特定实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、CD105和CD200，和(c)可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一特定实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和OCT-4，和(c)可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一特定实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73和CD105，(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时形成胚样体，和(d)可检测的抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一特定实施方案中，本发明提供了生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD73、CD105和HLA-G，和(c)在MLR中可检测的抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。生产细胞群的方法包括选择胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达OCT-4，(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时形成胚样体，和(d)可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长；并且从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。
对于上述选择胎盘干细胞群的方法，所述选择可以包括确定所述胎盘干细胞的样品是否抑制癌细胞增殖，或抑制肿瘤生长，并且如果所述胎盘干细胞的样品可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长，则选择胎盘干细胞群。
5.2.4培养生长
对于任何哺乳动物细胞，本发明中描述的胎盘干细胞的生长，都部分依赖于选择用于生长的特定培养基。在最优条件下，胎盘干细胞一般在3-5天内数量加倍。在培养过程中，本发明的胎盘干细胞附着在培养基质上，例如组织培养容器的表面(例如：组织培养皿塑料、纤维粘连蛋白包被的塑料等)，并且形成单层细胞。
分离的胎盘细胞群包括本发明的胎盘干细胞，当在合适的条件下培养时，形成胚样体，即，在附着的干细胞层上生长的三维细胞簇。胚样体内的细胞表达与极早期的干细胞，例如：OCT-4、Nanog、SSE3和SSE4相关的标记。如同本发明中描述的胎盘干细胞，胚样体内的细胞一般不附着在培养基质上，但是在培养过程中仍然依附于附着的细胞。胚样体细胞的活力依赖于附着的胎盘干细胞，在缺少附着的胎盘干细胞时不形成胚样体。因此，附着的胎盘干细胞有助于在包含附着的胎盘干细胞的胎盘细胞群中的一个或多个胚样体的生长。不希望受制于理论，胚样体细胞被认为在附着的胎盘干细胞上的生长与胚胎干细胞在滋养层细胞上的生长相似。间充质干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞，在培养中不产生胚样体。
5.3获得胎盘干细胞的方法
5.3.1干细胞收集组合物
本发明进一步提供了收集和分离胎盘干细胞的方法。一般利用生理学可接受的溶液，例如，干细胞收集组合物从哺乳动物胎盘中获得干细胞。干细胞收集组合物详细地在2005年12月29日提交的名为“用于收集和保藏胎盘干细胞的改良组合物及利用组合物的方法(Improved Composition forCollecting and Preserving Placental  Stem Cells and Methods of Using theComposition)”的相关美国临时申请号60/754,969中进行了描述。
所述干细胞收集组合物可以包括适合干细胞收集和/或培养的任何生理学可接受的溶液，例如，盐溶液(例如：磷酸缓冲盐溶液、Kreb氏液、改良的Kreb氏液、Eagle氏液、0.9％NaCl等)、培养基(例如：DMEM、H.DMEM等)等。
干细胞收集组合物可以包括用于保存胎盘干细胞的一种或多种组分，即，从收集时间到培养的时间内，保护胎盘干细胞免于死亡，或延缓胎盘干细胞的死亡，降低细胞群中胎盘干细胞的死亡数等。此类组分可以是例如，凋亡抑制剂(例如：半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)、血管扩张剂(例如：硫酸镁、抗高血压药物、心钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、皮质激素释放激素、亚硝基铁氰化钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)、坏死抑制剂(例如：2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐、或氯硝西泮)、TNF-α抑制剂、和/或携氧全氟化碳(例如：全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。
干细胞收集组合物可以包括一种或多种组织降解酶，例如：金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶等。此类酶包括但不限于：胶原酶(例如胶原酶I、II、III或IV，来源于溶组织梭状芽胞杆菌的胶原酶等)、分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶、LIBERASE、透明质酸酶等。
所述干细胞收集组合物可以包括杀菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的实施方案中，所述抗生素是大环内酯(例如：妥布霉素)、头孢菌素(例如：头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢罗齐、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉仙霉素、红霉素、青霉素(例如：青霉素V)、或喹诺酮(例如：氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在特定实施方案中，所述抗生素是抗革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌活性的，例如绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcus aureus)等。
干细胞收集组合物还可以包括一种或多种下列化合物：腺苷(约1mM至约50mM)、D-葡萄糖(约20mM至约100mM)、镁离子(约1mM至约50mM)、分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一实施方案中，以足够维持内皮完整性和细胞活性的量存在(例如：合成的或天然存在的胶体，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇以约25g/l至约100g/l、或约40g/l至约60g/l存在)、抗氧化剂(例如：叔丁对甲氧酚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，以约25μM至约100μM存在)、还原剂(例如：N-乙酰半胱氨酸，以约0.1mM至约5mM存在)、防止钙进入细胞内的试剂(例如：维拉帕米，以约2μM至约25μM存在)、硝化甘油(例如：约0.05g/L至约0.2g/L)、抗凝剂，在一实施方案中，以足够帮助防止残留血液凝结的量存在(例如，浓度为约1000单位/l至约100,000单位/l存在的肝素或水蛭素)、或含有阿米洛利的化合物(例如：以约1.0μM至约5μM的量存在的阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、环己基阿米洛利、二甲基阿米洛利、或异丁基阿米洛利)。
5.3.2胎盘的收集和处理
一般，在出生排出后立即回收人胎盘。在优选的实施方案中，在告知同意并采集患者与胎盘相关的完整医疗史后，从患者处回收胎盘。优选的，在分娩后继续记录医疗史。此类医疗史可用于调整胎盘或从其收获的干细胞的收获后的应用。例如，根据医疗史，人胎盘干细胞可用于与胎盘相关的婴儿、或用于所述婴儿的父母、兄弟姐妹或其他亲戚的个人化药物。
在回收胎盘干细胞之前，去除了脐带血和胎盘血。在一些实施方案中，在分娩后回收胎盘中的脐带血。所述胎盘可以采用常规的脐带血回收方法。一般使用针头或插管，在重力帮助下，将胎盘放血(参见例如：Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等人，美国专利号5,415,665)。所述针头或插管通常置于脐静脉内，并且可以轻轻地按摩胎盘帮助从胎盘中排出脐带血。可以商业方式来实施此类脐带血回收，例如LifeBank公司，Cedar Knolls，N.J.，ViaCord，Cord Blood Registry and Cryocell。优选的，对所述胎盘通过重力来放血不进行其他操作，从而使脐带血回收过程中的组织破坏最小化。
典型地，胎盘被从分娩室或初生室转移至另一地点，例如实验室，用于脐带血回收和干细胞收集，例如，通过灌流或组织解离。所述胎盘优选的在无菌的、保温的转移装置(维持胎盘温度在20-28℃)中转移，例如，将脐带近端夹紧的胎盘放置在无菌的、夹拉链封闭的塑料袋中，然后将其放置在保温容器内。在另一实施方案中，所述胎盘在实质上如2005年9月19日提交的未决美国专利申请号11/230,760中描述的脐带血收集试剂盒中转移。优选的，在分娩后4至24小时将胎盘递送至实验室。在某些实施方案中，在脐带血回收前，夹紧脐带近端，优选的在插入胎盘的4-5cm(厘米)内。在其它实施方案中，在脐带血回收后但是在胎盘的进一步处理前夹紧近端脐带。
在收集干细胞前，可以将胎盘储存在无菌条件下，并储存在室温或者5至25℃(摄氏度)的温度下。所述胎盘可以储存超过48小时的时间，并且优选的在灌流胎盘以去除任何残留的脐带血前储存4至24小时。所述胎盘优选的在5至25℃(摄氏度)下储存在抗凝剂溶液中。合适的抗凝剂溶液是本领域公知的。例如，可以使用肝素或华法令钠(warfarin sodium)溶液。在优选的实施方案中，所述抗凝剂溶液含有肝素溶液(例如，在1∶1000溶液中1％w/w)。在收集胎盘干细胞前，放血的胎盘优选地储存不超过36小时。
一旦按照上述一般收集和制备，哺乳动物胎盘或其部分可以按照本领域已知的任何方法处理，例如，可以被灌流或解离，如用一种或多种组织解离酶来解离从而获得干细胞。
5.3.3胎盘组织的物理解离和酶促消化
在一实施方案中，通过器官的物理解离，例如酶促消化，从哺乳动物胎盘中收集干细胞。例如，可以在与本发明的干细胞收集组合物接触的同时，例如将胎盘或其部分压碎(crush)、剪碎(shear)、绞碎(mince)、切块(dice)、切细(chop)、浸软(macerate)等，然后将组织用一种或多种酶来消化。胎盘或其部分还可以被物理的解离，并用一种或多种酶消化，然后将获得的材料浸入本发明的干细胞收集组合物或与本发明的干细胞收集组合物混合。任何物理解离的方法均可以使用，只要通过如台盼蓝不相容可确定，所述解离方法能使所述器官中多数的，更优选的大量，更优选的至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞存活。
在物理解离和/或酶促消化和干细胞回收前，所述胎盘可以被分割成部分。例如，可以从羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶或其任何组合中获得胎盘干细胞。脐带干细胞也可用于本发明的方法。在优选实施方案中，胎盘干细胞来源于包含羊膜和绒毛膜的胎盘组织。在另一特定实施方案中，胎盘干细胞来源于脐带。一般的，胎盘干细胞可以通过将胎盘组织解离为小块来获得，例如胎盘组织块的体积是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米。
优选的干细胞收集组合物包含一种或多种组织解离酶。酶促消化优选地使用酶的组合，例如基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，如胶原酶和分散酶的组合。在一实施方案中，胎盘组织的酶促消化使用了基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明质酸的粘多糖酶的组合，例如胶原酶、分散酶和透明质酸酶的组合或者LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，Ind.)和透明质酸酶的组合。可用于裂解胎盘组织的其它酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可被血清中的α2微球蛋白所抑制，因此用于消化的基质通常是无血清的。在酶促消化过程中通常使用EDTA和DNA酶来增加细胞回收的效率。消化物优选的被稀释从而避免干细胞陷入粘稠的消化物中。
任何组织消化酶的组合均可以使用。组织消化酶的典型浓度包括例如：50-200U/ml的I型胶原酶和IV型胶原酶，1-10U/ml的分散酶，和10-100U/ml的弹性蛋白酶。可以组合使用蛋白酶，即在同一消化反应中使用两种或多种蛋白酶，或者可以按顺序相继使用从而释放胎盘干细胞。例如，在一实施方案中，胎盘干细胞或其部分首先用合适量的I型胶原酶按2mg/ml消化30分钟，然后用0.25％的胰蛋白酶在37℃消化10分钟。丝氨酸蛋白酶优选地在使用其它酶后再连续使用。
在另一实施方案中，在从干细胞收集组合物中分离干细胞之前，向含有干细胞的干细胞收集组合物，或者向将在其中解离和/或消化组织的溶液中添加螯合剂来进一步解离组织，所述螯合剂例如乙二醇双(2-氨基乙醚)-N，N，N’N’-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
可以理解，当完整的胎盘或胎盘的一部分同时含有胎儿和母体细胞(例如，胎盘的一部分包含绒毛膜或绒毛小叶)时，收集的胎盘干细胞将同时包含来源于胎儿和母体源的胎盘干细胞的混合物。当胎盘的部分不含有或只含有可忽略量的母体细胞(例如，羊膜)时，收集的胎盘干细胞将几乎只含有胎儿的胚胎干细胞。
5.3.4.胎盘灌流
还可以通过灌流哺乳动物胎盘来获得胎盘干细胞。灌流哺乳动物胎盘以获得干细胞的方法公开在例如Hariri，美国专利号7,045,148中，和于2005年12月29日提交的，名为“用于收集胎盘干细胞和保存器官的改良基质以及使用该组合物的方法(Improved Medium for Collecting PlacentalStem Cells and Preserving Organs and Methods of Using the Composition)”的相关的美国临时申请号60/754,969中。
可以利用例如干细胞收集组合物作为灌流液，通过灌流例如通过胎盘脉管系统来收集胎盘干细胞。在一实施方案中，通过使灌流液流经脐动脉和/或脐静脉来灌流哺乳动物胎盘。可以利用如重力流入胎盘来实现灌流液在胎盘中的流动。优选的，利用泵如，蠕动泵来迫使灌流液流经胎盘。例如，可以用套管，如
Figure G2007800373556D00471
或塑料套管对脐静脉进行插管，所述套管与无菌的连接装置，如无菌管道相连。无菌的连接装置与灌流歧管相连。
在准备灌流中，胎盘优选的按脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式来定位(如，悬挂)。可以通过灌流液，例如本发明的干细胞收集组合物，在胎盘脉管系统或在胎盘脉管系统和相邻组织中的流通来灌流胎盘。在一实施方案中，脐动脉和脐静脉同时连接移液器，所述移液器通过可变的连接管与灌流液的储器相连。所述灌流液流入脐静脉和动脉。所述灌流液渗出和/或流经血管壁进入胎盘的周围组织，并从在孕期附着于母亲子宫上的胎盘表面合适的开放脉管中收集。所述灌流液还可以通过脐带开口导入，并允许从与母体子宫壁接触的胎盘壁中的开口流出或渗出。在另一实施方案中，所述灌流液流经脐静脉并从脐动脉收集，或者流经脐动脉并从脐静脉收集。
在一实施方案中，在灌流过程中夹紧脐带近端，更优选的，在脐带插入胎盘的4-5cm(厘米)内夹紧。
在放血过程中从哺乳动物胎盘首先收集的灌流液一般都被脐带血和/或胎盘血残留的血红细胞着色。随着灌流继续和残留的脐带血细胞从胎盘中洗出，灌流液变得越来越无色。一般30至100ml(毫升)灌流液足以初步将胎盘放血，但根据观察的结果可以使用或多或少的灌流液。
用于收集胎盘干细胞的灌流液体积可以根据收集的干细胞数量、胎盘大小、对单个胎盘进行的收集次数等来变化。在不同的实施方案中，灌流液的体积可以自50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL、或750mL至2000mL。一般，在放血后用700-800mL灌流液来灌流胎盘。
胎盘可以在数小时或数天的过程中进行多次灌流。当胎盘进行多次灌流时，可以在容器或其它合适的器皿中在无菌条件下维持或培养，并用干细胞收集组合物或标准灌流液(例如，普通的盐溶液如磷酸盐缓冲液(“PBS”))灌流，其中含有或不含抗凝剂(如，肝素、华法令钠、香豆素、双香豆素)，和/或含有或不含抗微生物剂(如，β-巯基乙醇(0.1mM)；抗生素如链霉素(如40-100μg/ml)、青霉素(如40U/ml)、两性霉素B(如0.5μg/ml))。在一实施方案中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而没有收集灌流液，从而所述胎盘在灌流和收集灌流液前，被维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个小时，或者2或3或更多天。灌流的胎盘可以被维持用于再进行一次或多次灌流，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时，并用如700-800mL灌流液再灌流第二次。所述胎盘可以灌流1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方案中，胎盘的灌流和灌流液的收集，如干细胞收集组合物，被重复直至回收的有核细胞数低于100细胞/ml。不同时间点的灌流液可以分别进一步处理用来回收时间依赖性的细胞群，如干细胞。不同时间点的灌流液也可以被混合。
不希望被任何理论约束，在放血并灌流胎盘足够长时间后，胎盘干细胞被认为迁移到被放血和灌流的胎盘的微循环中，根据本发明的方法，收集干细胞，优选的通过灌流冲洗到收集器皿中。灌流分离的胎盘不仅用来去除残留的脐带血，而且为胎盘提供了合适的营养，包括氧气。所述胎盘可以采用那些用于去除残留脐带血细胞的相似溶液来培养和灌流，优选的不用添加抗凝剂。
根据本发明方法的灌流导致获得的胎盘干细胞显著多于从未用所述溶液灌流，或者未经其它处理(例如，通过组织解离如酶促消化)来获得干细胞的哺乳动物胎盘中可获得的数量。在本文的上下文中，“显著多于”是指多至少10％。根据本发明的方法灌流产生的胎盘干细胞显著多于例如，从被培养的胎盘或其一部分的培养基中可获得的胎盘干细胞数量。
通过用包含一种或多种蛋白酶或其他组织解离酶的溶液灌流，可以从胎盘中分离干细胞。在特定实施方案中，将胎盘或其一部分(例如，羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或绒毛小叶、脐带或任何上述的组合)恢复至25-37℃，并在200mL培养基中用一种或多种组织解离酶孵育30分钟。收集灌流液中的细胞，降至4℃，并用包含5mM EDTA、2mM二硫苏糖醇和2mMβ-巯基乙醇的冷却抑制剂混合物洗涤。数分钟后，用本发明的冷却的(如4℃)干细胞收集组合物来洗涤干细胞。
可以理解，利用盘法(pan method)灌流获得的是胎儿和母体细胞的混合物，即通过该方法，灌流液在其从胎盘的母体侧渗出后被收集。结果，通过该方法收集的细胞包含混合的胎儿和母体来源的胎盘干细胞群。相反，仅通过胎盘脉管系统灌流，因为灌流液流经一根或两根胎盘血管，并仅通过剩余的血管收集，将导致胎盘干细胞群的收集物几乎都是胎儿来源的。
5.3.5胎盘干细胞的分离、分选和鉴别
来源于哺乳动物胎盘的干细胞，不论是否由灌流或酶促消化获得的，可以通过聚蔗糖(Ficoll)梯度离心从其它细胞中初步纯化(即分离)。此类离心可以遵循任何标准离心方法的速度等。例如，在一实施方案中，从胎盘收集的细胞是通过在5000×g室温离心15分钟从灌流液中回收的，其将细胞与例如污染的残渣和血小板分离开。在另一实施方案中，胎盘灌流液被浓缩至约200ml，轻轻地铺在Ficoll上，在22℃以约1100×g离心20分钟，收集低密度的细胞中间层用于进一步处理。
细胞沉淀可重悬于新鲜的干细胞收集组合物中，或适合干细胞维持的培养基中，例如含有2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)。可以利用例如(Nycomed Pharma，Oslo，挪威)，按照生产商的推荐方法来分离总单核细胞部分。
如本发明中使用的，“分离”的胎盘干细胞是指将一般在完整哺乳动物胎盘中与干细胞相关的细胞去除至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。当其存在于包含少于50％的一般在完整器官内与干细胞相关的细胞的细胞群中时，来源于器官的干细胞就是“分离的”。
通过灌流或消化获得的胎盘细胞，例如，可以采用，如具有0.2％EDTA(Sigma，St.Louis MO)的0.05％胃蛋白酶溶液通过差别胰酶消化来进一步或初步地分离。由于胎盘干细胞一般在约5分钟内从塑料表面脱离，而其它附着的群一般要求超过20-30分钟孵育，因此差别胰酶消化是可能的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex)的胰蛋白酶中和反应后，可以收获脱离的胎盘干细胞。在分离附着细胞的一实施方案中，等份的细胞，如5-10×106个细胞被放置在每个T-75瓶中，优选的纤连蛋白包被的T75瓶中。在此类实施方案中，所述细胞可以用商购的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)，并且置于组织培养箱(37℃，5％CO2)中来培养。在10-15天后，通过用PBS洗涤从瓶中去除非附着细胞。然后用MSCGM替代PBS。优选的每天检查培养瓶中不同附着细胞类型的存在，并且特别的鉴别和扩增成纤维样细胞簇。
从哺乳动物胎盘中收集的细胞数量和类型可以被监测：例如通过利用标准的细胞检测技术，如流式细胞仪、细胞分选、免疫组织化学(例如，用组织特异性或细胞标志特异性抗体染色)、荧光活化细胞分选(FACS)、磁性活化细胞分选(MACS)来测量细胞表面标记和形态学；通过利用光学或共聚焦显微镜来检测细胞形态学；和/或利用本领域公知的技术，例如PCR和基因表达谱来检测基因表达的改变。这些技术也可用于鉴别对于一种或多种特定标记呈阳性的细胞。例如，利用CD34的抗体，利用上述技术，可以确定细胞是否含有可检测量的CD34；如果是，则细胞是CD34+。同时，如果细胞产生足够的能被RT-PCR所检测的OCT-4 RNA，或者显著多于成体细胞的OCT-4 RNA，则该细胞是OCT-4+。细胞表面标记(例如CD标记如CD34)的抗体，和干细胞特异性基因例如OCT-4的序列，也是本领域公知的。
胎盘细胞，特别是已经经过Ficoll分离、差别附着，或两者的结合所分离的细胞可以利用荧光活化细胞分选仪(FACS)来分选。荧光活化细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光性质用于分离颗粒(包括细胞)的普遍已知的方法(Kamarch，1987，Methods Enzymol，151：150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发产生微小的电荷，从而允许混合物中正电和负电颗粒的电磁分离。在一实施方案中，用不同的荧光标签来标记细胞表面标记特异性抗体或配体。细胞经过细胞分选仪处理，从而允许基于其与所用抗体的结合能力来分离细胞。FACS分选的颗粒可以直接注入96-孔或384-孔板的单个孔中，从而便于分离和克隆。
在一个分选技术方案中，来源于胎盘的干细胞基于标记CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达来分选。它可以通过结合基于细胞在培养中的附着性质来选择干细胞的步骤来实现。例如，可以在基于标记表达的分选之前或之后实现附着选择干细胞。例如，在一实施方案中，首先基于CD34的表达来分选细胞；保留CD34-的细胞，并将CD200+HLA-G+的细胞与所有其它CD34-细胞分离。在另一实施方案中，基于标记CD200和/或HLA-G的表达来分选来源于胎盘的细胞；例如，表现出任一这些标记的细胞被分离以供进一步使用。在特定实施方案中，表达例如CD200和/或HLA-G的细胞可以进一步被分选，所述分选可以基于CD73和/或CD105的表达，或通过抗体SH2、SH3或SH4识别的表位，或缺少CD34、CD38或CD45的表达。例如，在一实施方案中，胎盘细胞通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或其缺失来分选，并且将CD200+、HLA-G+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-和CD4-5的细胞与其它胎盘细胞分离，供进一步使用。
在另一实施方案中，可以使用磁珠来分离细胞。可以利用磁性活化细胞分选(MACS)技术分选细胞，所述技术是基于颗粒结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力来分选颗粒的方法。对磁微珠可以进行多种有效的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。所述磁珠随后与细胞混合，从而允许结合。然后将细胞通过磁场，以分离出具有特定细胞表面标记的细胞。在一实施方案中，这些细胞可随后分离，并与偶联了抗其它细胞表面标记的抗体的磁珠再混合。所述细胞再次通过磁场，分离结合两种抗体的细胞。然后可以将此类细胞稀释入不同的培养皿中，例如微滴培养皿中用于克隆分离。
胎盘干细胞还可以基于细胞形态学和生长特征来表征和/或分选。例如，胎盘干细胞可以表征为在培养中具有成纤维细胞样表型，和/或基于成纤维细胞样表型来选择。胎盘干细胞还可以表征为具有形成胚样体的能力，和/或基于其形成胚样体的能力来选择。在一实施方案中，例如，将形状为成纤维细胞样，表达CD73和CD105，并在培养中产生一个或多个胚样体的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。在另一实施方案中，将培养中产生一个或多个胚样体的OCT-4+胎盘细胞与其它胎盘细胞分离。
在另一实施方案中，胎盘干细胞可以通过集落形成单位试验来鉴别和表征。集落形成单位试验是本领域公知的，例如MESEN CULTTM培养基(Stem Cell Technologies，Inc.，Vancouver British Columbia)。
利用本领域已知的标准技术，例如台盼蓝不相容试验、醋酸荧光素摄取试验、碘化丙锭摄取试验(评估活力)；和胸腺嘧啶核苷摄取试验、MTT细胞增殖试验(评估增殖)来分析胎盘干细胞的活力、增殖潜力和寿命。寿命可以通过本领域公知的方法可以确定，例如通过延长培养中群倍增的最大数来确定。
利用本领域已知的其它技术也可以用来将胎盘干细胞和其它胎盘细胞分离开，例如：期望细胞的选择性生长(阳性分选)、不需要细胞的选择性破坏(阴性选择)、基于混合群与例如大豆凝聚素的差别细胞可凝集性的分离、冻融步骤、过滤、常规离心和区带离心、离心冲洗(逆流离心)、单位重力分离、逆流分布、电泳等等。
5.4胎盘干细胞的培养
5.4.1培养基
分离的胎盘干细胞、或胎盘干细胞群、或从其中生长出胎盘干细胞的细胞或胎盘组织可被用于起始或接种细胞培养物。细胞一般转移到无菌的组织培养容器内，所述容器使用或未使用胞外基质或配体包被，例如层粘连蛋白、胶原(如：天然的或变性的)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻璃体粘附蛋白、和胞外膜蛋白(例如：MATRIGEL(BD Discovery Labware，Bedford，Mass.))。
可以在本领域认为适合干细胞培养的任何培养基和任何条件下培养胎盘干细胞。优选的，培养基包含血清。胎盘干细胞可以培养在例如：DMEM-LG(Dulbecco改良的必需培养基，低糖)/MCDB 201(鸡成纤维细胞基础培养基)，其含有ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1，和青霉素/链霉素；含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含有15％FBS的DMEM-HG；含有10％FBS、10％马血清和氢化可的松的IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)；含有10％FBS、EGF和肝素的M199；含有10％FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素的α-MEM(最低必需培养基)；含有10％FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素等的DMEM。优选的培养基是含有2％FBS、ITS、LA+BSA、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF，和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201。
可用于培养胎盘干细胞的其它培养基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle基础培养基、Ham的F10培养基(F10)、Ham的F12培养基(F12)、Iscove的改良的Dulbecco培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz的L-15培养基、MCDB、DMIEM/F12、RPMI 1640、改良的DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)和CELL-GRO FREE。
培养基可以添加一种或多种组分，包括例如：血清(如：胎牛血清(FBS)，优选的约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选的约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如，血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素-样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸包括L-缬氨酸；和用于控制微生物污染的一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、和制霉菌素，单独或组合使用。
5.4.2胎盘干细胞的扩增和增殖
一旦分离胎盘干细胞或分离干细胞群(例如，与至少50％的胎盘细胞分离的干细胞或干细胞群，所述胎盘细胞在体内是通常与干细胞或干细胞群相关的)，就可以在体外增殖或扩增干细胞或干细胞群。例如，可以在组织培养容器(例如：皿、瓶、多孔板等)中培养胎盘干细胞群一段时间，足够使干细胞增殖至70-90％汇合度，即，直到干细胞及其后代占据组织培养容器的70-90％的培养表面区域。
胎盘干细胞可以允许细胞生长的密度接种在培养容器内。例如，所述细胞可以低密度(例如：约1,000至约5,000细胞/cm2)至高密度(例如：约50,000或更多细胞/cm2)来接种。在优选的实施方案中，在约0至约5％体积CO2的空气中培养细胞。在一些优选的实施方案中，在约2至约25％体积O2的空气中培养细胞，优选的在约5至约20％体积O2的空气中培养细胞。细胞优选的培养在约25℃至约40℃，优选的37℃。细胞优选的在培养箱中培养。所述培养基可以是静态的或搅动的，例如，利用生物反应器。胎盘干细胞优选的生长在低氧化压力下(例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)。
一旦获得70％-90％汇合度，细胞就可以传代。例如，所述细胞可以利用本领域公知的技术来酶促处理，例如胰蛋白酶消化，从而将其与组织培养表面分离。在通过移液除去细胞和计数细胞后，约20,000-100,000个干细胞，优选的约50,000个干细胞被传代到含有新鲜培养基的新培养容器内。一般的，新培养基与从中去除干细胞的培养基是相同类型的培养基。发明涵盖了已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次的胎盘干细胞群。
5.4.3胎盘干细胞群
本发明提供了胎盘干细胞群。胎盘干细胞群可以直接分离自一个或多个胎盘；即，所述胎盘干细胞群可以是包含胎盘干细胞的胎盘细胞群，所述胚胎肝细胞获自或包含于灌流液，或者来源于或包含于消化液(即，通过酶促消化胎盘或其部分所获得的细胞收集物)。还可以培养和扩增本发明的分离的胎盘干细胞来产生胎盘干细胞群。还可以培养和扩增包含胎盘干细胞的胎盘细胞群来产生胎盘干细胞群。
本发明的胎盘干细胞群包含胎盘干细胞，例如本发明中描述的胎盘干细胞。在多个实施方案中，在分离的胎盘干细胞群中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞是胎盘干细胞。即，胎盘干细胞群可以包含例如多至1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的非干细胞。
在本文的实施方案中，所述基质可以是能实现细胞(例如胎盘干细胞)的培养和/或选择的任何表面。一般的，所述基质是塑料，例如组织培养皿或多孔板塑料。组织培养塑料可以用生物分子例如层粘连蛋白或纤连蛋白包被。
可以通过细胞选择领域任何已知的方法来选择细胞(例如胎盘干细胞)用于胎盘干细胞群。例如，可以利用抗一种或多种细胞表面标记的抗体选择细胞，例如，在流式细胞仪或FACS。利用与磁珠连接的抗体可以实现选择。特异性针对某些干细胞相关标记的抗体是本领域已知的。例如，炕OCT-4抗体(Abcam，Cambridge，MA)、CD200抗体(Abcam)、HLA-G抗体(Abcam)、CD73抗体(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)、CD105抗体(Abcam；BioDesign International，Saco，ME)等。其他标记的抗体也是可商购的，例如：可以从如StemCell Technologies或BioDesign International获得的CD34、CD38和CD45抗体。
分离的胎盘干细胞群可以包括不是干细胞的胎盘细胞，或者不是胎盘细胞的细胞。
分离的胎盘干细胞群可以与一个或多个非干细胞或非胎盘细胞的群结合。例如，分离的胎盘干细胞群可以结合血液(例如：胎盘血或脐带血)、血液来源的干细胞(例如：来源于胎盘血或脐带血的干细胞)、血液来源的有核细胞的群、骨髓来源的间充质干细胞、骨来源的干细胞群、原始骨髓、成人(成体)干细胞、包含在组织内的干细胞群、培养的干细胞、完全分化的细胞的群(例如：软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌细胞、心肌细胞等)等。与每个群中总有核细胞的数量相比，分离的胎盘干细胞群内的细胞可以与大量另一种类型的细胞相结合，结合比例为约100,000,000∶1、50,000,000∶1、20,000,000∶1、10,000,000∶1、5,000,000∶1、2,000,000∶1、1,000,000∶1、500,000∶1、200,000∶1、100,000∶1、50,000∶1、20,000∶1、10,000∶1、5,000∶1、2,000∶1、1,000∶1、500∶1、200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1；1∶2、1∶5、1∶10、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1,000、1∶2,000、1∶5,000、1∶10,000、1∶20,000、1∶50,000、1∶100,000、1∶500,000、1∶1,000,000、1∶2,000,000、1∶5,000,000、1∶10,000,000、1∶20,000,000、1∶50,000,000，或约1∶100,000,000。在分离的胎盘干细胞群中的细胞也可以与多种细胞类型的大量细胞相结合。
在一实施方案中，分离的胎盘干细胞群与大量造血干细胞结合。此类造血干细胞可以是例如，包含在未处理的胎盘、脐带血或外周血中；在来源于胎盘血、脐带血或外周血的总有核细胞中；在来源于胎盘血、脐带血或外周血的分离的CD34+细胞群中；在未处理的骨髓中；在来源于骨髓的总有核细胞中；在来源于骨髓的分离的CD34+细胞群中；等等。
5.5胎盘干细胞的保存
胎盘干细胞可以置于允许长期储存的条件下，或置于抑制细胞死亡(如凋亡或坏死)的条件下保存。
如2005年12月29日提交的名为”用于收集和保藏胎盘干细胞的改良组合物及利用该组合物的方法(Improved Composition for Collecting andPreserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition)”的相关美国临时申请号60/754,969中所述，可以利用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物保存胎盘干细胞。在一实施方案中，本发明提供了保存干细胞群的方法，包括将所述干细胞群与含有凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的干细胞收集组合物相接触，与未接触凋亡抑制剂的干细胞群相比，其中所述凋亡抑制剂存在的量和时间可足以降低或预防干细胞群中的凋亡。在特定实施方案中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更特定的实施方案中，所述JNK抑制剂不调节所述干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，所述干细胞收集组合物包含所述凋亡抑制剂和在分离的相中的所述携氧全氟化碳。在另一实施方案中，所述干细胞收集组合物包含所述凋亡抑制剂和在乳液中的所述携氧全氟化碳。在另一实施方案中，所述干细胞收集组合物还包含乳化剂，例如卵磷脂。在另一实施方案中，在接触干细胞时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳处于约0℃和约25℃之间。在另一更特定的实施方案中，在接触干细胞时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳处于约2℃和约10℃之间，或约2℃和约5℃之间。在另一更特定的实施方案中，所述接触是在转移所述干细胞群的过程中实施的。在另一更特定的实施方案中，所述接触是在冷冻和融化所述干细胞群的过程中实施的。
在另一实施方案中，本发明提供了保存胎盘干细胞群的方法，包括将所述干细胞群与凋亡抑制剂和器官防腐化合物相接触，与未接触凋亡抑制剂的干细胞群相比，其中所述凋亡抑制剂存在的量和时间可足以降低或预防干细胞群中的凋亡。在特定实施方案中，所述器官防腐化合物是UW溶液(描述于美国专利号4,798,824中；其也被称为ViaSpan；还参见Southard等人，Transplantation 49(2)：251-257(1990))或者在Stern等人的，美国专利号5,552,267中描述的溶液。在另一实施方案中，所述器官防腐化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖，或其组合。在另一实施方案中，所述干细胞收集组合物还包含位于两相或位于乳液中的携氧全氟化碳。
在本方法的另一实施方案中，胎盘干细胞在灌流过程中与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳，器官防腐化合物，或其组合的干细胞收集组合物相接触。在另一实施方案中，在组织破坏(例如，酶促消化)过程中，所述干细胞产生接触。在另一实施方案中，在灌流收集后，或在组织破坏(例如，酶促消化)后，胎盘干细胞与所述干细胞收集化合物相接触。
一般的，在胎盘细胞收集、富集和分离过程中，优选的最小化或消除由于缺氧和机械压力导致的细胞胁迫。因此，在本方法的另一实施方案中，在收集、富集或分离过程中，干细胞或干细胞群在所述保存中暴露在低氧条件下少于6个小时，其中所述低氧条件是氧浓度低于正常的血氧浓度。在更特定的实施方案中，所述干细胞群在所述保存中暴露在所述低氧条件下少于2个小时。在另一更特定的实施方案中，在收集、富集或分离过程中，所述干细胞群暴露在所述低氧条件下少于1个小时、或少于30分钟、或不暴露于低氧条件下。在另一更特定实施方案中，在收集、富集或分离过程中，所述干细胞群不暴露于剪切力下。
本发明的胎盘干细胞可以冷冻保存，例如置于小容器(如安瓿瓶)中的冷冻保存培养基中。合适的冷冻保存培养基包括但不限于如下培养基，其包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如可商购的细胞冷冻培养基，例如：C2695、C2639或C6039(Sigma)。冷冻保存培养基优选的包含DMSO(二甲亚砜)，其浓度为例如约10％(v/v)。冷冻保存培养基可以包含其它试剂，例如甲基纤维素和/或甘油。在冷冻保存过程中，胎盘干细胞优选的以约1℃/分钟冷却。优选的冷冻保存温度是约-80℃至约-180℃，优选的约-125℃至约-140℃。在解冻使用前，冷冻保存的细胞可以转移到液氮中。在一些实施方案中，例如，一旦安瓿瓶达到约-90℃，就将其转移至液氮储存区域。冷冻保存的细胞优选的在温度约25℃至约40℃，优选的在温度约37℃下解冻。
5.6胎盘干细胞的用途
5.6.1包含胎盘干细胞的组合物
本发明的肿瘤细胞抑制的方法可以使用包含胎盘干细胞或其来源的生物分子的组合物。以相同的方式，本发明的大量胎盘干细胞和胎盘干细胞群可以与任何生理学可接受的，或医学可接受的化合物、组合物相结合，或与例如在研究或治疗中使用的仪器结合使用。
5.6.1.1冷冻保存的胎盘干细胞
本发明的肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞群可以保存，例如冷冻保存供后期使用。冷冻保存细胞，例如干细胞的方法是本领域公知的。胎盘干细胞群可以制备成易于向个体施用的形式。例如，本发明提供了包含在适合医学使用的容器内的胎盘干细胞群。此类容器可以是例如，无菌的塑料袋、瓶、罐，或其它可以方便的分配胎盘干细胞群的容器。例如，所述容器可以是适合将液体静脉施用至接受者的血袋或其它塑料的、医学可接受的袋。所述容器优选的是允许冷冻保存组合的干细胞群的容器。
冷冻保存的肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞群可以包括来源于单个供体，或多个供体的胎盘干细胞。所述胎盘干细胞群可以与目标接受者是完全的HLA匹配，或者部分的HLA-不匹配、或完全的HLA-不匹配。
因此，在一实施方案中，本发明提供了位于容器中的包含肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞群的组合物。在特定实施方案中，所述干细胞群是冷冻保存的。在另一特定实施方案中，所述容器是袋、瓶或罐。在更特定的实施方案中，所述袋是无菌塑料袋。在更特定的实施方案中，所述袋适合、允许或有助于静脉施用所述胎盘干细胞群。所述袋可以包括相互连接的多个内腔或隔室，其允许在施用前或施用过程中将胎盘干细胞与一种或多种其它溶液，例如药物进行混合。在另一特定实施方案中，所述组合物包括有助于冷冻保存所述组合的干细胞群的一种或多种化合物。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞群包含在生理可接受的水溶液中。在另一特定实施方案中，所述生理可接受的水溶液为0.9％NaCl水溶液。在更特定的实施方案中，所述胎盘干细胞群包含与所述干细胞群的接受者HLA匹配的胎盘细胞。在另一特定实施方案中，所述组合的干细胞群包括与所述干细胞群的接受者至少部分HLA不匹配的胎盘细胞。在另一特定实施方案中，所述胎盘干细胞来源于大量供体。
5.6.1.2药物组合物
肿瘤细胞抑制性的胎盘干细胞群，或包含胎盘干细胞的细胞群，可以配制成体内使用的药物组合物。此类药物组合物在制药可接受的载体(例如：用于体内施用的盐溶液或其它生理学可接受的溶液)中包含胎盘干细胞群，或包含胎盘干细胞的细胞群。本发明的药物组合物可以包括本发明其他部分描述的任何胎盘干细胞群，或胎盘干细胞类型。所述药物组合物可以包括胎儿、母体，或同时包括胎儿和母体的胎盘干细胞。本发明的药物组合物还可以包括来源于单个个体或胎盘，或来源于多个个体或胎盘的胎盘干细胞。
本发明的药物组合物可以包含任何肿瘤细胞抑制性数量的胎盘干细胞。例如，在不同的实施方案中，单个单位剂量的胎盘干细胞可以包含大约、至少、或不超过1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个胎盘干细胞。
本发明的药物组合物包含含有50％或更多活细胞的细胞群(即，群中至少50％的细胞是功能性的或活的)。优选的，群中至少60％的细胞是活的。更优选的，药物组合物的群中至少70％、80％、90％、95％或99％的细胞是活的。
5.6.1.3胎盘干细胞条件培养基
本发明的胎盘干细胞可用于生产肿瘤细胞抑制性的条件培养基，即含有干细胞分泌或排出的一种或多种生物分子，所述生物分子对大量一种或多种类型的肿瘤细胞具有可检测的肿瘤细胞抑制性效果。在多个实施方案中，所述条件培养基包含在其中胎盘干细胞已经生长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培养基。在其它实施方案中，所述条件培养基包含在其中胎盘干细胞已经生长达至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合度，或高达100％汇合度的培养基。此类条件培养基可用于支持胎盘干细胞，或另一类干细胞的分离群的培养。在另一实施方案中，所述条件培养基包含在其中的胎盘干细胞已经分化为成体细胞类型的培养基。在另一实施方案中，本发明的条件培养基包含在其中已经培养了胎盘干细胞和非胎盘干细胞的培养基。
因此，在一实施方案中，本发明提供了包含来源于胎盘干细胞培养物的培养基的组合物，其中所述胎盘干细胞(a)附着于基质；(b)表达CD200和HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73、CD105和HLA-G；或表达CD73和CD105，且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；或表达OCT-4，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和(c)可检测地抑制肿瘤细胞或肿瘤细胞群的生长或增殖。在特定实施方案中，所述组合物进一步包含大量的所述胎盘干细胞。在另一特定实施方案中，所述组合物包含大量的非胎盘细胞。在更特定的实施方案中，所述非胎盘细胞包括CD34+细胞，例如造血前体细胞，如外周血造血祖细胞，脐带血造血祖细胞，或胎盘血造血祖细胞。所述非胎盘细胞还可以包含其它干细胞，例如间充质干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞。所述非胎盘细胞还可以是一种或多种类型的成体细胞或细胞系。在另一特定实施方案中，所述组合物包含抗增殖剂，例如，抗MIP-1α抗体或抗MIP-1β抗体。
在特定实施方案中，胎盘干细胞条件培养基或上清液来源于与大量肿瘤细胞以胎盘干细胞比肿瘤细胞约1∶1、约2∶1、约3∶1、约4∶1或约5∶1的比例共培养的大量胎盘干细胞。例如，所述条件培养基或上清液可以来源于包含约1×105个胎盘干细胞、约1×106个胎盘干细胞、约1×107个胎盘干细胞、或约1×108个胎盘干细胞、或更多。在另一特定的的实施方案中，所述条件培养基或上清液来源于包含约1×105至约5×105个胎盘干细胞和约1×105个肿瘤细胞、约1×106至约5×106个胎盘干细胞和约1×106个肿瘤细胞、约1×107至约5×107个胎盘干细胞和约1×107个肿瘤细胞、或约1×108至约5×108个胎盘干细胞和约1×108个肿瘤细胞的共培养物。
在抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法的另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液是来源于培养物的培养基或上清液，所述培养物包含大量的单独培养的、或与肿瘤细胞共培养的胎盘干细胞，其中产生条件培养基的胎盘细胞数量是基于要对其施用所述条件培养基的个体的重量。例如，所述条件培养基或上清液可以是由以下培养物产生的条件培养基或上清液，所述培养物包含约1×103个胎盘干细胞/kg接受者体重、5×103个胎盘干细胞/kg、1×104个胎盘干细胞/kg、5×104个胎盘干细胞/kg、1×105个胎盘干细胞/kg、5×105个胎盘干细胞/kg、1×106个胎盘干细胞/kg、5×106个胎盘干细胞/kg、1×107个胎盘干细胞/kg、5×107个胎盘干细胞/kg、或1×108个胎盘干细胞/kg。在另一特定实施方案中，所述条件培养基或上清液是来源于共培养物的培养基或上清液，所述共培养物含有约1×103至约5×103个胎盘干细胞/kg和约1×103个肿瘤细胞/kg、约1×104至约5×104个胎盘干细胞/kg和约1×104个肿瘤细胞/kg、约1×105至约5×105个胎盘干细胞/kg和约1×105个肿瘤细胞/kg、约1×106至约5×106个胎盘干细胞/kg和约1×106个肿瘤细胞/kg、约1×107至约5×107个胎盘干细胞/kg和约1×107个肿瘤细胞/kg、或约1×108至约5×108个胎盘干细胞/kg和约1×108个肿瘤细胞/kg。
在特定实施方案中，适合向70kg的个体施用的条件培养基包含在约200mL培养基中由70,000,000个胎盘干细胞条件化的上清液。
条件培养基可被浓缩以制备可施用的药物级产品。例如，通过去除水分，例如蒸发、冻干等，可以浓缩条件培养基至约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更浓。在特定实施方案中，例如，来源于70,000,000个胎盘干细胞的200mL条件培养基可被浓缩至体积约180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL或更少。所述条件培养基还可以基本干燥为例如粉末。
5.6.1.4包含胎盘干细胞的基质
本发明还包括包含肿瘤细胞抑制性胎盘干细胞群，或肿瘤抑制性量的胎盘干细胞条件化培养基的基质，例如水凝胶、支架等。
本发明的胎盘干细胞可以接种在天然基质上，例如胎盘生物材料，如羊膜材料。此类羊膜材料可以是例如：直接从哺乳动物胎盘切割的羊膜；固定的或热处理的羊膜、基本干燥(即，＜20％H2O)的羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜等。优选的可以接种胎盘干细胞的胎盘生物材料描述在Hariri的，美国申请公开号2004/0048796中。基质例如水凝胶可以浸透或利用胎盘干细胞条件培养基来制备。
本发明的胎盘干细胞可以悬浮在适合例如注射的水凝胶溶液中。适合此类组合物的水凝胶包括自组装的肽，例如RAD16。在一实施方案中，水凝胶溶液包含可以允许在例如模具中硬化的细胞，从而形成具有细胞分散其中的、用于移植的基质。也可以培养此类基质中的胎盘干细胞使得细胞在移植前有丝分裂扩增。水凝胶是例如通过共价键、离子键或氢键交联的有机聚合物(天然的或合成的)，从而产生三维开放的点阵结构，从而将水分子陷于其中形成凝胶。水凝胶形成材料包括多糖，例如褐藻胶及其盐，肽、聚膦嗪和离子交联的聚丙烯酸脂，或嵌段聚合物，例如分别通过温度或pH交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。在一些实施方案中，本发明的水凝胶或基质是可生物降解的。
在本发明的一些实施方案中，所述制剂包含原位的可聚合凝胶(参见例如：美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等人，J.Control Release，78(1-3)：199-209(2002)；Wang等人，Biomaterials，24(22)：3969-80(2003))。
在一些实施方案中，所述聚合物在水性溶液(例如水、缓冲盐溶液、或乙醇水溶液)中至少是部分溶解的，所述聚合物具有带电的侧基，或其单价离子盐。具有酸性侧基、可以与阳离子反应的聚合物实例是聚(膦嗪)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)，和磺化聚合物，例如磺酸化聚苯乙烯。通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯醚单体或聚合物反应形成的具有酸性侧基的共聚物也可以使用。酸性基团的实例是羧酸基、磺酸基、卤代醇基(优选的氟代)、酚OH基、和酸性OH基。
本发明的胎盘干细胞或其共培养物可以接种在三维框架或支架上，并植入体内。此类框架可以与任何一种或多种生长因子、细胞、药物或其它组分联合植入，从而刺激组织形成或者增强或改善本发明的操作。
在本发明中可以使用的支架的实例包括非织毡(nonwoven mat)、多孔泡沫、或自组装肽。非织毡可以利用含有合成的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物(例如：PGA/PLA)的纤维形成(VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)。由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成的泡沫也可作为支架使用，其通过例如冷冻干燥或低压冻干处理形成(参见例如：美国专利号6,355,699)。
本发明的胎盘干细胞还可以接种在生理学可接受的陶瓷材料上，或与其接触，所述陶瓷材料包括但不限于：磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙和磷酸四钙、羟磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、磷酸镁钙、生物学活性玻璃例如及其混合物。目前可商购的多孔生物相容性陶瓷材料包括(CanMedica Corp.，Canada)、
Figure G2007800373556D00682
(Merck BiomaterialFrance，France)、(Mathys，AG3 Bettlach，Switzerland)，和矿化胶原骨骼移植产品，例如HEALOSTM(DePuy，Inc.，Raynham，MA)和
Figure G2007800373556D00684
RHAKOSSTM和(Orthovita，Malvern，Pa.)。所述框架可以是天然和/或合成材料的混合物、掺合物(blends)或复合材料。
在另一实施方案中，胎盘干细胞可以接种在毡上，或与其接触，所述毡可以由生物可吸收性材料制成的复丝(multifilament yarn)组成，所述生物可吸收性材料为例如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物，或透明质酸。
在另一实施方案中，本发明的胎盘干细胞可以接种在可以是复合结构的泡沫支架上。此类泡沫支架可以模制成有用的形状，例如需要修复、取代或强化的机体特定结构的一部分。在一些实施方案中，在接种本发明的细胞前，用例如0.1M乙酸处理框架，再将框架孵育在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中，从而增加细胞附着。可以修饰基质的外表面来改善细胞的附着或生长，以及组织的分化，例如通过血浆包被基质，或添加一种或多种蛋白质(例如：胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、葡萄糖胺聚糖(例如：硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等)、细胞基质，和/或其它材料，例如但不限于明胶、褐藻胶、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
在一些实施方案中，所述支架包括使其具有非血栓形成性的材料，或用所述材料处理。这类处理和材料还可以促进和维持内皮生长、迁移和胞外基质沉积。这类材料和处理的实例包括但不限于天然材料例如基膜蛋白(如层粘连蛋白和IV型胶原)、合成材料例如EPTFE，和含硅嵌段聚氨酯脲(segmented polyurethaneurea silicones)例如PURSPANTM(The PolymerTechnology Group，Inc.，Berkeley，Calif.)。所述支架还可以包含抗血栓形成剂例如肝素；所述支架还可以在用胎盘干细胞接种之前进行处理以改变表面电荷(例如用血浆包被)。
5.6.2联合治疗
本发明中描述的胎盘干细胞和胎盘干细胞组合物，可以是包括一种或多种其它抗癌剂的抗癌治疗方案的一部分。此类抗癌剂是本领域公知的。可以施用至患有癌症的个体的特定抗癌剂包括但不限于：阿西维辛、阿克拉霉素、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、六甲蜜胺、安波毒素、乙酰双氢胺蒽醌、安沙可林、阿纳托(司)唑、安曲霉素、天冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿替派、含氮霉素、巴马司他、苄替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、比折来新、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡鲁睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡波铂、卡莫司汀、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、塞来考昔(COX-2抑制剂)、苯丁酸氮芥、西罗里霉素、顺氯氨铂、克拉屈滨、甲磺  酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎呱宁、甲磺酸地扎呱宁、地吖醌、多西紫杉醇、阿霉素(doxorubicin)、盐酸阿霉素、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸甲雄烷酮、偶氮霉素、依达曲沙、盐酸依洛尼塞、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、磷雌氮芥、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺、盐酸法罗唑啉、法扎拉滨、芬维A胺(fenretinide)、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟环胞苷、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、依莫佛新、异丙铂、依立替康、盐酸依立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马丙考、美登素(maytansine)、盐酸氮芥、甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑(melphalan)、美诺立尔、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托克星、丝裂红素、丝林霉素、丝裂马菌素、丝裂霉素C、丝裂帕菌素、米托坦、盐酸米托蒽醌、霉酚酸、噻氨酯哒唑、诺加霉素、奥马铂、奥昔舒仑、紫杉醇、培门冬酶(Pegaspargase)、佩里霉素、戊氮芥、硫酸匹来霉素、过磷酰胺、溴丙哌嗪、嗪消安、盐酸吡罗蒽醌、光辉霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐酸甲基苄肼、嘌呤霉素、盐酸嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、双曲秦、磷乙酰天冬氨酸钠、稀疏霉素、盐酸螺旋锗、螺莫司汀、顺螺铂、链黑霉素、链佐星、磺氯苯脲、他利霉素、替可加兰钠、泰索帝、喃氟啶、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、塞替派、噻唑呋林、替拉扎明、枸橼酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西立滨、曲美沙特、曲美沙特葡萄糖醛酸酯、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、尿嘧啶芥、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸环氧长春碱、酒石酸长春瑞滨、硫酸异长春碱、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼拉汀、新制癌素、和盐酸佐柔比星。
其它抗癌药物包括但不限于：20-表-1，25-二羟维生素D3、5-乙炔尿嘧啶、阿比特龙、阿克拉霉素、酰富烯、腺环戊醇、阿多来新、阿地白介素、ALL-TK拮抗剂、六甲蜜胺、氨莫司汀、2，4-二氯苯氧乙酸(amidox)、阿米斯丁、氨基-γ-酮戊酸、氨柔比星、安吖啶、氯咪喹酮、阿纳托(司)唑、穿心莲内酯、血管生成抑制剂、拮抗剂D、拮抗剂G、安雷利克斯、抗-背侧化形态建成蛋白-1、抗雄激素、抗前列腺癌、抗雌激素、抗瘤酮、反义寡核苷酸、阿非迪霉素甘氨酸盐、凋亡基因调节子、凋亡调控子、脱嘌呤核酸、ara-CDP-DL-PTBA、精氨酸脱氨酶、asulacrine、阿他美坦、阿曲氮芥、axinastatin 1、axinastatin 2、axinastatin 3、阿扎司琼、阿扎毒素、重氮酪氨酸、浆果赤霉素III衍生物、balanol、巴马司他、BCR/ABL拮抗剂、benzochlorins、苯甲酰十字孢碱、β-内酰胺类衍生物、β-alethine、β-克拉霉素B、桦木酸、bFGF抑制剂、比卡鲁胺、比山群、双氮丙啶精胺、双奈法德、bistratene A、比折来新、breflate、溴匹立明、布多替钛、丁硫氨酸亚矾胺、卡泊三醇、卡弗他丁C、喜树碱衍生物、卡培他滨、氨甲酰-氨基-三唑、羧氨三唑、CaRest M3、CARN 700、软骨来源的抑制剂、卡折来新、酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)、澳粟精胺、杀菌肽B、西曲瑞克、二氢卟酚、磺胺氯喹噁啉、西卡前列素、顺式卟啉、克拉屈滨、氯米芬类似物、克霉唑、collismycin A、collismycin B、考布他汀A4、考布他汀类似物、conagenin、crambescidin 816、克立那托、cryptophycin 8、cryptophycin A衍生物、Curacin A、环戊烷蒽醌、cycloplatam、cypemycin、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、溶细胞因子、磷酸己烷雌酚、达昔单抗、地西他滨、脱氢代代宁B、地洛瑞林、地塞米松、右异环磷酰胺、右丙亚胺、右维拉帕米、地吖醌、代代宁B、3，4-二羟基苯氧肟酸(DIDOX)、二乙基精脒、二氢-5-氮胞苷、二氢泰克索，9-、dioxamycin、二苯螺莫司汀、多西他奇、二十二醇、多拉司琼、去氧氟尿苷、阿霉素、屈洛昔芬、屈大麻酚、duocarmycin SA、依布硒啉、依考莫司汀、依地福新、依决可单抗、依洛尼塞、榄烯、乙嘧替氟、表柔比星、依立雄胺、雌氮芥类似物、雌激素激动剂、雌激素拮抗剂、依他硝唑、依托泊甙磷酸脂、依西美坦、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、非格司亭、非那司提、flavopiridol、氟卓斯汀、fluasterone、氟达拉滨、fluorodaunorunicinhydrochloride、福酚美克、福美坦、福司曲星、福替目丁、钆替沙林、硝酸镓、加洛他滨、加尼瑞克、明胶酶抑制剂、吉西他滨、谷胱甘肽抑制剂、hepsulfam、heregulin、乙撑-双乙酰胺、金丝桃素、伊班膦酸、去甲氧正定霉素、碘昔芬、伊决孟酮、依莫佛新、伊洛马司他、伊马替尼(例如
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)、咪喹莫特、免疫刺激肽、胰岛素样生长激素-1受体抑制剂、干扰素激动剂、干扰素、白介素、碘苄胍、碘阿霉素、甘薯苦醇，4-、伊罗普拉、伊索格拉定、isobengazole、异高软海绵素B、伊他司琼、jasplakinolide、kahalalide F、片螺素-N-三乙酸酯、兰乐肽、leinamycin、来诺拉提、硫酸香菇多糖、leptolstatin、来曲唑、白血病抑制因子、白细胞-α-干扰素、利普安+雌激素+孕酮、亮丙瑞林、左旋咪唑、利阿唑、线型聚酰胺类似物、亲脂性二糖肽、亲脂性铂化合物、lissoclinamide 7、洛铂、胍乙基磷酸丝氨酸、洛美曲索、氯尼达明、洛索蒽醌、罗唑利宾、勒托替康、lutetium texaphyrin、lysofylline、裂解肽、美坦辛、mannostatin A、马马司他、马丙考、maspin、基质溶解因子抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、美诺立尔、美巴龙(merbarone)、美替瑞林、蛋氨酸酶、甲氧氯普胺、MIF抑制剂、米非司酮、米替福新、米立司亭、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素类似物、米托萘胺、丝裂毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂草素、莫法罗汀、莫拉司亭、Erbitux，人绒毛膜促性腺激素、单磷酰脂质A+分支杆菌细胞壁sk、莫哌达醇、芥子抗癌剂、印度洋海绵素(mycaperoxide)B、分枝杆菌细胞壁提取物、myriaporone、N-乙酰地那林、N-取代苯酰胺、纳发阮林、那瑞替喷、纳洛酮+喷他佐辛、napavin、萘萜二醇(naphterpin)、那托司亭、奈达铂、奈莫柔比星、奈立膦酸、安得乐、nisamycin、一氧化氮调节子、氧化亚氮抗氧化剂、nitrullyn、oblimersenO6-苯甲基鸟嘌呤、奥曲肽、okicenone、寡核苷酸、奥那司酮、奥坦西隆、oracin、口服细胞因子诱导剂、奥马铂、奥沙特隆、奥克赛铂、oxaunomycin、紫杉醇、紫杉醇类似物、紫杉醇衍生物、palauamine、棕榈酰根霉素、帕米膦酸、人参(炔)三醇、帕诺米芬、副细菌素(parabactin)、帕折普汀、培门冬酶、培得星、戊聚硫钠、喷司他丁、pentrozole、潘氟隆、过磷酰胺、紫苏子醇、吩嗪酮霉素(phenazinomycin)、乙酸苯酯、磷酸酶抑制剂、溶链菌、盐酸匹罗卡品、吡喃阿霉素、吡曲克辛、胎盘素A、胎盘素B、纤溶酶原激活物抑制剂、铂复合物、铂化合物、铂-三胺复合物、卟吩姆钠、泊非霉素、强的松、丙苯二-吖啶酮、前列腺素J2、蛋白酶体抑制剂、蛋白A免疫调节子、蛋白激酶C抑制剂、蛋白激酶C抑制剂，微藻(microalgal)、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂、嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、红紫素、吡唑啉吖啶、吡醇羟乙酯血红蛋白聚氧乙烯偶联物、raf拮抗剂、雷替曲塞、雷莫司琼、ras法尼基蛋白转移酶抑制剂、ras抑制剂、ras-GAP抑制剂、脱甲基瑞替普汀、铼Re186羟乙二磷酸、根霉素、核酶、RII维安酯(retinamide)、罗希吐碱(rohitukine)、胞壁酰基二肽、罗喹美克、rubiginone Bl、ruboxyl、沙芬戈、saintopin、SarCNU、sarcophytol A、沙莫司亭、Sdi 1模拟物、司莫司汀、衰老源性抑制剂1、正义寡脱氧核苷酸、信号转导抑制剂、西索菲兰、索布佐生、硼卡钠、苯基乙酸钠、solverol、生长素介质结合蛋白、索纳明、膦门冬酸、spicamycin D、螺莫司汀、脾脏五肽(Splenopentin)、spongistatin 1、角鲨胺、stipiamide、间充质溶解素抑制剂、sulfinosine、强效血管活性肠肽拮抗剂、suradista、苏拉明、苦马豆碱、他莫司汀、甲碘化他莫昔芬、牛碘莫司汀、他佐罗汀、替可加兰钠、替加氟、tellurapyrylium、端粒酶抑制剂、替莫泊芬、替尼泊苷、十氧化四氯、tetrazomine、thaliblastine、噻可拉林、促血小板生成素、促血小板生成素模拟物、胸腺法新、胸腺生成素受体激动剂、胸腺曲南、促甲状腺激素、乙基锡初紫红素(Tin-ethyl etiopurpurin)、替拉扎明、二氯环戊二烯钛、topsentin、托瑞米芬、翻译抑制剂、维甲酸、三乙酰尿苷、曲西立滨、曲美沙特、曲普瑞林、托吡西隆、妥罗雄脲、酪氨酸激酶抑制剂、tyrphostins、UBC抑制剂、乌苯美司、泌尿生殖窦来源的生长抑制因子、尿激酶受体拮抗剂、伐普肽、variolin B、维拉雷琐、藜芦明、verdins、维替泊芬、长春瑞滨、vinxaltine、vitaxin、伏氯唑、扎诺特隆、折尼拉汀、亚苄维C、和净司他丁斯酯。
5.6.3检测
本发明的胎盘干细胞可用于鉴别增强胎盘干细胞抑制肿瘤细胞增殖能力的化合物或组合物的检测。优选的，所述检测用于这样类型的癌症，其中在缺少此类化合物或组合物的条件下，肿瘤细胞可以抑制所述癌症的增殖。
在优选的实施方案中，本发明的胎盘干细胞与测试化合物和肿瘤细胞，例如肿瘤细胞系相结合，并在例如，存在和缺少测试化合物的条件下，确定胎盘干细胞对肿瘤细胞的影响。与缺失测试化合物时相比，如果存在测试化合物时肿瘤细胞增殖可检测地降低了，则测试化合物增强了胎盘干细胞抑制肿瘤细胞增殖的能力。在一实施方案中，例如，本发明提供了鉴别增强胎盘干细胞肿瘤抑制作用的化合物的方法，包括在允许肿瘤细胞增殖的条件下，在存在所述化合物时将第一大量干细胞与第二大量肿瘤细胞相接触，其中，如果与未接触所述化合物的大量肿瘤细胞相比，所述化合物导致肿瘤细胞增殖可检测的改变，则所述化合物被鉴别为增强胎盘干细胞肿瘤抑制作用的化合物。第一大量和第二大量可以是相同数量或不同数量的细胞。在特定实施方案中，所述肿瘤细胞是来源于活组织切片的肿瘤细胞。在另一特定实施方案中，所述肿瘤细胞是肿瘤细胞系的细胞。
本发明还提供了从一组或一套化合物中鉴别出最佳的增强胎盘干细胞肿瘤细胞增殖抑制作用的一个或多个化合物的方法。由于不同的癌症具有不同的遗传和生物化学起源和特征，以及不同的病原学，因此，不同的化合物对于增强胎盘干细胞的肿瘤细胞抑制作用的效果或高或低。例如，此类一组或一套化合物可以是这样的一组或一套抗癌或抗肿瘤化合物，例如非限制性的，上述5.6.2节中列举的抗癌或抗肿瘤化合物。例如，在此类实施方案中，在存在胎盘干细胞的条件下，可以用一组化合物测试获自患癌个体的肿瘤细胞，以鉴别最适合治疗个体的一个或多个所述抗癌或抗肿瘤化合物。
因此，在一实施方案中，本发明提供了从大量化合物中选择化合物的方法，包括，对于所述大量化合物中的每一个化合物，在允许肿瘤细胞增殖的条件下，在存在所述大量化合物中的一个化合物时，将第一大量干细胞与第二大量肿瘤细胞相接触，并与未接触所述化合物的大量肿瘤细胞相比，从所述大量化合物中，鉴别出能增强肿瘤细胞增殖至大于预定标准程度的一种或多种化合物。此类预定标准可以是例如，在所述大量化合物中的所述化合物，其中所述化合物为所述大量化合物中表现出最大增强程度的一个化合物；在所述大量化合物中表现出最大增强程度的2、3、4、5、6、7、8、9或10个化合物；在所述大量化合物中表现出最大增强程度的前5％、10％、15％、20％的化合物；增强胎盘干细胞的肿瘤细胞抑制作用的任何所述大量化合物等。优选的，本方法用于选择向所述患癌个体施用的1、2、3、4或5种化合物。
6.实施例
6.1实施例1：胎盘干细胞的培养
通过灌流或物理解离，例如酶促消化，自分娩后的哺乳动物胎盘获得胎盘干细胞。细胞培养在这样的培养基中，所述培养基包含60％DMEM-LG(Gibco)、40％MCDB-201(Sigma)、2％胎牛血清(FCS)(HycloneLaboratories)、1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、1×亚麻酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)、10-9M地塞米松(Sigma)、10-4M抗坏血酸2-磷酸(Sigma)、表皮生长因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems)和100U青霉素/1000U链霉素。
培养细胞的培养瓶按如下方法制备。通过向瓶内添加含有5ng/ml人FN(Sigma F0895)的5mL PBS，来使纤粘连蛋白(FN)包被T75瓶。将含有FN溶液的瓶置于37℃下30分钟。然后，在细胞培养前去除FN溶液。在处理后不需要干燥培养瓶。可选的，将瓶在4℃保持与FN溶液的接触过夜或更久；在培养前，温暖培养瓶并去除FN溶液。
通过灌流分离的胎盘干细胞
按以下方法建立来源于胎盘灌流液的胎盘干细胞培养。将来源于Ficoll梯度的细胞接种在按上述制备的FN包被的T75瓶中，密度为15ml培养基中50-100×106个细胞/瓶。一般的，接种5至10瓶。在37℃下孵育瓶12-18小时，从而允许贴壁细胞的附着。向每个瓶添加10ml温热PBS，以去除悬浮液中的细胞，并轻轻地混合。然后去除15ml培养基，并用15ml新鲜培养基替换。在开始培养后的3-4天更换所有的培养基。在进行后续的培养基更换中，去除50％的或7.5ml培养基。
从约第12天开始，在显微镜下检查培养物，以检查贴壁细胞克隆的生长。当细胞培养物成为约80％汇合度时，一般在开始培养后第13至18天之间，通过胰酶消化来收获贴壁细胞。从这些原代培养物中收获的细胞命名为0代(zero)。
通过物理解离和酶促消化分离的胎盘干细胞
按以下方法从消化的胎盘组织中建立胎盘干细胞培养。将灌流的胎盘以母体侧向上的方式置于无菌纸片上。用刀片刮去胎盘母体侧约0.5cm的表层，并用刀片切除约1×2×1cm的胎盘组织块。然后将该胎盘组织切碎成约1mm3的小片。将这些小片收集在50ml的Falcon管中，并用胶原酶IA(2mg/ml，Sigma)消化30分钟，再用胰酶-EDTA(0.25％，GIBCO BRL)在37℃水浴中处理10分钟。获得的溶液在400g室温离心10分钟，去除消化溶液。将细胞沉淀重悬在约10倍体积的PBS中(例如，5ml的细胞沉淀用45ml PBS重悬)，将管在400g室温离心10分钟。将所述组织/细胞沉淀重悬在130mL培养基中，每个纤粘连蛋白包被的T-75瓶中接种13ml细胞。细胞在37℃和5％CO2的湿润空气下孵育。在此阶段胎盘干细胞可选择地进行冷冻保存。
胎盘干细胞的继代培养和扩增
在37℃水浴中快速解冻冷冻保存的细胞。用10ml温热培养基迅速从冷冻管中移出胎盘干细胞，并转移至15ml无菌管中。将细胞在400g室温离心10分钟。通过吹打将细胞轻轻地重悬在10ml的温热培养基中，并且通过台盼蓝排除法来确定活细胞数。然后，以约6000-7000个细胞/cm2的量将细胞接种至按上述方法制备的FN-包被的瓶中(约5×105细胞/T-75瓶)。将细胞在37℃、5％CO2和90％湿度下孵育5分钟。当细胞达到75-85％汇合度时，从瓶中无菌地去除并抛弃所有使用过的培养基。加入3ml的0.25％胰酶/EDTA(w/v)溶液以覆盖细胞层，并且在37℃、5％CO2和90％湿度下孵育细胞5分钟。轻叩瓶一次或两次以促进细胞脱离。一旦＞95％的细胞变圆并脱离，就向每个T-75瓶中加入7ml温热培养基，并通过移液吹打将溶液分散在整个细胞层表面若干次。
按上述方法计数细胞并确定活力后，在1000 RPM室温下离心细胞5分钟。通过用培养基轻轻地重悬来源于一个T-75瓶的细胞沉淀，并将所述细胞平均地置于两个FN-包被的T-75瓶中，来传代细胞。
利用上述方法，贴壁的胎盘干细胞群被鉴定表达CD105、CD117、CD33、CD73、CD29、CD44、CD10、CD90和CD133标记，并且不表达CD34或CD45标记。所述细胞可以表达或不表达HLA-ABC和/或HLA-DR。
6.2实施例2：从胎盘结构中分离干细胞
6.2.1材料&方法
6.2.1.1目标表型的分离
从正常的、足月妊娠的胎盘中获得五个不同的胎盘细胞群。所有供体均提供了对其胎盘供研究目的使用的完全书面同意。检查了五个胎盘细胞群：(1)胎盘灌流液(来源于胎盘脉管系统的灌流)；和以下的酶促消化物：(2)羊膜、(3)绒毛膜、(4)羊膜-绒毛膜盘；以及(5)脐带。将各种胎盘组织置于无菌PBS(Gibco-Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中清洁，并将其置于分开的无菌培养皿中。用无菌外科手术刀切碎各种组织，并置于50mL Falcon锥形管内。用1×胶原酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在37℃水浴中消化切碎的组织20分钟，离心，然后用0.25％胰酶-EDTA(Gibco-Invitrogen Corp)在37℃水浴中消化10分钟。在消化后离心各种组织，并用无菌PBS(Gibco-Invitrogen Corp)漂洗一次。然后过滤重新溶解的细胞两次，一次用100μm细胞过滤器，并且一次用30μm分离滤器，以去除任何残留的胞外基质或细胞碎片。
6.2.1.2细胞活力评估和细胞计数
在消化后使用人工的台盼蓝排除方法来计算细胞数和评估细胞活力。细胞按1∶1的比例与台盼蓝染料(Sigma-Aldrich)混合，并且利用血球计数器确定细胞活力。
6.2.1.3细胞表面标记表征
选择HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+的细胞用于表征。通过两台Becton-Dickinson流式细胞仪来鉴别、定量和表征具有该表型的细胞，所述流式细胞仪是FACSCalibur和FACS Aria(Becton-Dickinson，San Jose，CA，USA)。以约10μL抗体/1百万个细胞的比例对各种胎盘细胞染色，在室温下摇床上染色30分钟。使用下列抗人抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗HLA-G的单克隆抗体(Serotec，Raleigh，NC)、抗CD10的单克隆抗体(BD Immunocytometry Systems，San Jose，CA)、抗CD44的单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen，San Jose，CA)和抗CD105的单克隆抗体(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)；藻红蛋白(PE)偶联的抗CD44、CD200、CD117和CD13的单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；藻红蛋白-Cy5(PE Cy5)偶联的抗CD117的链霉亲和素和单克隆抗体(BDBiosciences Pharmingen)；藻红蛋白-Cy7(PE Cy7)偶联的抗CD33和CD10的单克隆抗体(BD Biosciences)；别藻蓝蛋白(APC)偶联的抗CD38的链霉亲和素和单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；和生物素化的CD90(BD Biosciences Pharmingen)。在孵育后，漂洗细胞一次，以去除未结合的抗体，并用4％多聚甲醛(USB，Cleveland，OH)在4℃固定过夜。第二天，漂洗细胞两次，通过30μm分离滤器过滤，并在流式细胞仪上计数。
使用抗小鼠IgG抗体(BD Biosciences Pharmingen)染色的样本作为阴性对照来调节光电倍增管(PMTs)。使用抗人抗体单次染色的样本作为阳性对照来调节光谱重叠/补偿。
6.2.1.4细胞分选和培养
用7-氨基放线菌素D(7AAD；BD Biosciences Pharmingen)和特异性针对目标表型的单克隆抗体对一套胎盘细胞染色。以约10μL抗体/1百万个细胞的比例对各种胎盘细胞染色，在室温下摇床上染色30分钟。然后，在BD FACS Aria上阳性分选这些细胞中表达目标表型的活细胞，并铺板培养。将分选的(目标群)和”所有”(未分选)的胎盘细胞群铺板用于比较。以表1中列举的细胞密度(细胞/cm2)将细胞铺板在纤粘连蛋白(Sigma-Aldrich)包被的96孔板上。细胞密度以及是以两次重复还是三次重复将细胞类型铺板，根据表达目标表型的细胞数来确定和管理。
表I：细胞铺板密度
Figure G2007800373556D00811
向96孔板的每个孔中加入完全培养基(60％DMEM-LG(Gibco)和40％MCDB-201(Sigma)、2％胎牛血清(Hyclone Labs.)、1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、1×亚麻酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)、10-9M地塞米松(Sigma)、10-4M抗坏血酸2-磷酸(Sigma)、表皮生长因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems)、和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems)，并将平板置于5％CO2/37℃孵育箱中。在第7天，向每个孔中加入100μL完全培养基。监控96孔板约2周，并在第12天完成培养物的最终评估。
6.2.1.5数据分析
利用标准的脉冲选通技术(gating technique)在FlowJo(Tree Star，Inc)上分析FACSCalibur数据。利用FACSDiva软件(Becton-Dickinson)分析BDFACS Aria数据。利用偶极甄别脉冲选通和标准脉冲选通技术使偶极最小化，来分析FACS Aria数据。所有结果均汇编于Microsoft Excel中，并且所有数值在本发明中均以平均值±标准差(数字，均值的标准误差)表示。
6.2.2结果
6.2.2.1细胞活力
利用人工台盼蓝排除方法来评估消化后活力(图1)。来源于大部分消化组织(来源于羊膜、绒毛膜或羊膜-绒毛膜盘)的细胞的平均活力约为70％。羊膜产生的细胞具有的平均活力为74.35％±10.31％(n＝6，SEM＝4.21)，绒毛膜具有的平均活力为78.18％±12.65％(n＝4，SEM＝6.32)，羊膜-绒毛膜盘具有的平均活力为69.05％±10.80％(n＝4，SEM＝5.40)，脐带具有的平均活力为63.30％±20.13％(n＝4，SEM＝10.06)。来源于灌流，但未经过消化的细胞保留了最高的平均活力，89.98％±6.39％(n＝5，SEM＝2.86)。
6.2.2.2细胞定量
分析了五个不同的胎盘群来源的细胞以确定HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞的数量。根据BD FACSCalibur数据的分析结果，观察到羊膜、灌流液和绒毛膜分别含有这些细胞的最大总数：30.72±21.80个细胞(n＝4，SEM＝10.90)、26.92±22.56个细胞(n＝3，SEM＝13.02)、和18.39±6.44个细胞(n＝2，SEM＝4.55)。羊膜-绒毛膜盘和脐带分别含有表达目标表型的细胞的最少总数：4.72±4.16个细胞(n＝3，SEM＝2.40)和3.94±2.58个细胞(n＝3，SEM＝1.49)。
相似的，当分析表达目标表型的总细胞百分比时，观察到羊膜和胎盘灌流液含有表达该表型的最高百分比，分别是0.0319％±0.0202％(n＝4，SEM＝0.0101)和0.0269％±0.0226％(n＝3，SEM＝0.0130)(图2)。虽然脐带含有少量表达目标表型的细胞(图2)，但是它含有表达目标表型的细胞的第三高的百分比，0.020％±0.0226％(n＝3，SEM＝0.0131)(图2)。绒毛膜和羊膜-绒毛膜盘含有表达目标表型的细胞的最低百分比：分别是0.0184％±0.0064％(n＝2，SEM＝0.0046)和0.0177％±0.0173％(n＝3，SEM＝0.010)(图2)。
与BD FACSCalibur分析的结果一致，BD FACS Aria数据也鉴别了羊膜、灌流液和绒毛膜比其它来源提供更高数量的HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞。在羊膜、灌流液和绒毛膜中表达目标表型的细胞平均总数分别是：126.47±55.61个细胞(n＝15，SEM＝14.36)、81.65±34.64个细胞(n＝20，SEM＝7.75)和51.47±32.41个细胞(n＝15，SEM＝8.37)。羊膜-绒毛膜盘和脐带含有最小总数的表达目标表型的细胞，分别是44.89±37.43个细胞(n＝9，SEM＝12.48)和11.00±4.03个细胞(n＝9，SEM＝1.34)。
BD FACS Aria数据揭示了B和A细胞来源含有最高的HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞百分比，分别是0.1523±0.0227％(n＝15，SEM＝0.0059)和0.0929±0.0419％(n＝20，SEM＝0.0094)(图3)。D细胞来源含有第三高的表达目标表型的细胞百分比，0.0632±0.0333％(n＝9，SEM＝0.0111)(图3)。C和E细胞来源含有最低的表达目标表型的细胞百分比，分别是0.0632±0.0249％(n＝15，SEM＝0.0064)和0.0457±0.0055％(n＝9，SEM＝0.0018)(图3)。
在对每种细胞来源的HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+细胞鉴定和定量后，还进一步分析和表征了其细胞的细胞表面标记HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200和CD105的表达。
6.2.2.3胎盘灌流液来源的细胞
胎盘灌流液来源的细胞是HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13一致阳性的(图4)。针对灌流液来源的细胞的每种标记的平均表达如下：37.15％±38.55％(n＝4，SEM＝19.28)的细胞表达HLA-G、36.37％±21.98％(n＝7，SEM＝8.31)的细胞表达CD33；39.39％±39.91％(n＝4，SEM＝19.96)的细胞表达CD117、54.97％±33.08％(n＝4，SEM＝16.54)的细胞表达CD10、36.79％±11.42％(n＝4，SEM＝5.71)的细胞表达CD44、41.83％±19.42％(n＝3，SEM＝11.21)的细胞表达CD200、74.25％±26.74％(n＝3，SEM＝15.44)的细胞表达CD90、35.10％±23.10％(n＝3，SEM＝13.34)的细胞表达CD38、22.87％±6.87％(n＝3，SEM＝3.97)的细胞表达CD105、和25.49％±9.84％(n＝3，SEM＝5.68)的细胞表达CD13。
6.2.2.4羊膜来源的细胞
羊膜来源的细胞是HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13一致阳性的(图5)。针对羊膜来源的细胞的每种标记的平均表达如下：57.27％±41.11％(n＝3，SEM＝23.73)的细胞表达HLA-G；16.23％±15.81％(n＝6，SEM＝6.46)的细胞表达CD33、62.32％±37.89％(n＝3，SEM＝21.87)的细胞表达CD117、9.71％±13.73％(n＝3，SEM＝7.92)的细胞表达CD10、27.03％±22.65％(n＝3，SEM＝13.08)的细胞表达CD44、6.42％±0.88％(n＝2，SEM＝0.62)的细胞表达CD200、57.61％±22.10％(n＝2，SEM＝15.63)的细胞表达CD90、63.76％±4.40％(n＝2，SEM＝3.11)的细胞表达CD38、20.27％±5.88％(n＝2，SEM＝4.16)的细胞表达CD105、和54.37％±13.29％(n＝2，SEMN9.40)的细胞表达CD13。
6.2.2.5绒毛膜来源的细胞
绒毛膜来源的细胞是HLA-G、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38和CD13一致阳性的，而CD33和CD105的表达各异(图6)。针对绒毛膜来源的细胞的每种标记的平均表达如下：53.25％±32.87％(n＝3，SEM＝18.98)的细胞表达HLA-G、15.44％±11.17％(n＝6，SEM＝4.56)的细胞表达CD33、70.76％±11.87％(n＝3，SEM＝6.86)的细胞表达CD117；35.84％±25.96％(n＝3，SEM＝14.99)的细胞表达CD10、28.76％±6.09％(n＝3，SEM＝3.52)的细胞表达CD44、29.20％±9.47％(n＝2，SEM＝6.70)的细胞表达CD200；54.88％±0.17％(n＝2，SEM＝0.12)的细胞表达CD90、68.63％±44.37％(n＝2，SEM＝31.37)的细胞表达CD38；23.81％±33.67％(n＝2，SEM＝23.81)的细胞表达CD105、和53.16％±62.70％(n＝2，SEM＝44.34)的细胞表达CD13。
6.2.2.6羊膜-绒毛膜盘来源的细胞
羊膜-绒毛膜盘来源的细胞是HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13一致阳性的(图7)。针对羊膜-绒毛膜盘来源的细胞的每种标记的平均表达如下：78.52％±13.13％(n＝2，SEM＝9.29)的细胞表达HLA-G、38.33％±15.74％(n＝5，SEM＝7.04)的细胞表达CD33、69.56％±26.41％(n＝2，SEM＝18.67)的细胞表达CD117、42.44％±53.12％(n＝2，SEM＝37.56)的细胞表达CD10；32.47％±31.78％(n＝2，SEM＝22.47)的细胞表达CD44、5.56％(n＝1)的细胞表达CD200；83.33％(n＝1)的细胞表达CD90；83.52％(n＝1)的细胞表达CD38；7.25％(n＝1)的细胞表达CD105；和81.16％(n＝1)的细胞表达CD13。
6.2.2.7脐带来源的细胞
脐带来源的细胞是HLA-G、CD33、CD90、CD38、CD105和CD13一致阳性的，而CD117、CD10、CD44和CD200的表达各异(图8)。针对脐带来源的细胞的每种标记的平均表达如下：62.50％±53.03％(n＝2，SEM＝37.50)的细胞表达HLA-G、25.67％±11.28％(n＝5，SEM＝5.04)的细胞表达CD33、44.45％±62.85％(n＝2，SEM＝44.45)的细胞表达CD117、8.33％±11.79％(n＝2，SEM＝8.33)的细胞表达CD10、21.43％±30.30％(n＝2，SEM＝21.43)的细胞表达CD44、0.0％(n＝1)的细胞表达CD200；81.25％(n＝1)的细胞表达CD90；64.29％(n＝1)的细胞表达CD38、6.25％(n＝1)的细胞表达CD105、和50.0％(n＝1)的细胞表达CD13。
所有标记平均表达的概况如图9所示。
6.2.2.8 BD FACS Aria分选报告
表达最大百分比的HLA ABC、CD45、CD34和CD133的三种不同的胎盘细胞群(来源于灌流液、羊膜和绒毛膜的细胞)用7AAD和这些标记的抗体来染色。阳性分选这三个群中表达目标表型的活细胞。BD FACS Aria分选的结果如表2所示。
表2：
Figure G2007800373556D00861
将三种不同的阳性分选的细胞群(“分选的”)及其相应的未分选的细胞铺板，并于第12天评估培养的结果(表3)。分选的灌流液来源的细胞，以40,600/cm2的密度铺板，获得小的、圆的、未贴壁的细胞。三组未分选的灌流液来源的细胞中的两组，均以40,600/cm2的密度铺板，获得大部分小的、圆的、未贴壁的细胞，并且围绕孔的边缘分布着一些贴壁细胞。未分选的灌流液来源的细胞，以93,800/cm2的密度铺板，获得大部分小的、圆的、未贴壁的细胞，并且围绕孔的边缘分布着一些贴壁细胞。
分选的羊膜-来源的细胞，以6,300/cm2的密度铺板，获得小的、圆的、未贴壁的细胞。未分选的羊膜-来源的细胞，以6,300/cm2的密度铺板，获得小的、圆的、未贴壁的细胞。未分选的羊膜-来源的细胞，以62,500/cm2的密度铺板，获得小的、圆的、未贴壁的细胞。
分选的绒毛膜-来源的细胞，以6,300/cm2的密度铺板，获得小的、圆的、未贴壁的细胞。未分选的绒毛膜-来源的细胞，以6,300/cm2的密度铺板，获得小的、圆的、未贴壁的细胞。未分选的绒毛膜-来源的细胞，以62,500/cm2的密度种植，获得小的、圆的、未贴壁的细胞。
在其它实施方案中，上述圆的、未贴壁细胞的初始群，在进一步培养下，附着在组织培养表面上，并且呈现出特征性的成纤维细胞样形状。一般的，所述贴壁细胞丧失了CD117的表达，并且是持续的CD10+、CD34-、CD105+和CD200+。
6.3实施例3：胎盘干细胞的分化
贴壁的胎盘干细胞分化为若干不同的细胞系。通过物理解离来源于胎盘内的解剖学位点的组织，包括羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶或其任何组合，以从胎盘中分离出贴壁的胎盘干细胞，并通过物理解离脐带组织以获得脐带干细胞。
在含有低浓度的胎牛血清和有限的生长因子的培养基中建立胎盘干细胞和脐带干细胞。流式细胞仪分析显示，胎盘干细胞一般的以百分比呈现出CD200+CD105+CD73+CD34-CD45-表型。胎盘干细胞被发现分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞系。
在含有IBMX、胰岛素、地塞米松和吲哚美辛的诱导培养基中，胎盘干细胞在3-5周内转变成脂肪充满性脂肪细胞(fat laden adipocyte)。在成骨诱导培养条件下，胎盘干细胞被发现形成骨结节(nodule)，并在其胞外基质中具有钙沉积。PDAC的软骨分化在微丸(micropellet)状态下进行，并通过在组织聚合物中糖胺聚糖的形成来验证。
6.4实施例4：利用胎盘干细胞抑制肿瘤细胞
本发明中描述的胎盘干细胞具有抑制肿瘤细胞生长和增殖的能力。
6.4.1材料和方法
使用的肿瘤细胞系包括来源于实验室供体的类淋巴母细胞系(LCL)，和购自ATCC的人细胞系(CML-CRL-2099；乳腺导管瘤-CRL-2343；急性淋巴细胞性白血病-CCL-119；结肠癌-CRL-5942)。使用的细胞系包括人成视网膜细胞瘤、组织细胞性淋巴瘤、肺癌、急性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠腺癌、和乳腺癌细胞系。LCL来源于在存在EBV和环孢霉素A条件下培养的外周血单核细胞，所述EBV来源于B95.8裂解性EBV系。在R20培养基(RPMI 1640和胎牛血清(Celgro))中2周后，将癌细胞维持在R10培养基中。肿瘤细胞系维持在R10培养基中。
来源于脐带组织的酶促消化的脐带干细胞(第3代)，在96孔板或24孔板中铺板，该板具有或不具有Transwell小室(transwellinsert)。利用特定实验中指示的细胞数实施胎盘干细胞和肿瘤细胞的共培养(如下)。在培养后，收集非贴壁肿瘤细胞，并用7-氨基-放线菌素D(7-AAD)染色评估活力。
对于上清液细胞因子分析，收集50μL培养上清液，并在
Figure G2007800373556D00881
分析仪上利用阵列分析25种细胞因子：IL-1β、IL-1ra、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、嗜酸细胞活化趋化因子、RANTES和MCP-1。
6.4.2结果
6.4.2.1不同的肿瘤细胞系的抑制
为了研究胎盘干细胞的肿瘤抑制潜力，将EBV转化的肿瘤细胞单独培养或与来源于不同胎盘部位的胎盘干细胞共同培养。LCL细胞在培养基中单独生长超过17天，至约40,000个细胞。然而，当以1∶2的比例，在存在来源于羊膜-绒毛膜(AC)或羊膜(AM)的胎盘干细胞，或存在脐带干细胞(UC)的条件下培养LCL细胞时，所述生长抑制至约10,000个细胞，抑制约75％(图10)。
将胎盘干细胞对LCL增殖的抑制与骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)的抑制作用进行比较。LCL经过单独培养，与胎盘或UC干细胞共培养，或与BM-MSC共培养六天，计数每种条件下的细胞数。在6天的培养时程中，LCL单独增殖至约23,000个细胞。相反，以1∶2比例培养的LCL+BM-MSC获得约38,000个LCL细胞。然而，令人惊奇的，LCL+胎盘干细胞(1∶2)条件下，在6天的培养中，仅获得约5,000个LCL细胞，这表示胎盘干细胞或脐带干细胞与BM-MSC相比，显著增强LCL生长的抑制。参见图11。
为了确定胎盘干细胞肿瘤抑制的特异性，根据其与人类癌症流行病学的相关性设计了一组肿瘤细胞系。所有的肿瘤细胞系都在悬浮液中生长以有助于与贴壁的胎盘干细胞分离。实施滴度实验来确定在0∶1、1∶2、1∶1、1.5∶1或2∶1(图12)的比例下，胎盘干细胞对组织细胞性淋巴瘤细胞、白血病(CML)细胞、乳腺导管癌细胞和急性淋巴细胞性白血病细胞、或结肠癌细胞的肿瘤细胞抑制效果。在胎盘干细胞比肿瘤细胞为2∶1的比例下，胎盘细胞系表现出对组织细胞性淋巴瘤和CML最大程度的抑制，分别导致约60％和48％的抑制。然而，在测试比例下，这些细胞系仅表现出微弱的剂量应答。与急性淋巴细胞性白血病(ALL)系一样，乳腺导管癌细胞系也表现出更强的剂量应答倾向。值得注意的是，结肠癌细胞在更大量胎盘干细胞的条件下表现出更弱的抑制。
利用更多的肿瘤细胞系，以相同方式在胎盘干细胞比肿瘤细胞为1∶1的条件下实施了后续实验(13A)，验证并扩展了上述结果。与缺失胎盘干细胞的条件下生长的肿瘤细胞相比，除乳腺癌和ALL外，所有的肿瘤细胞系均被抑制50％至75％。然而，在前述实验中呈中度抑制(10％至20％)的乳腺癌和ALL，在共培养中表现出被胎盘干细胞活化。即，共培养表现出增加乳腺癌和ALL细胞的数量。
在transwell实验中评估了抑制的接触依赖性(图13B)。HL显示了最小的抑制接触依赖性，12％。CML的抑制是22％接触依赖的，同时CAC的抑制是42％，LCL是51％接触依赖的。结果泛泛的显示出肿瘤细胞系的生长率和抑制的接触依赖性之间的反比关系。
综上所述，上述数据表明胎盘干细胞最稳定的抑制成视网膜细胞瘤、组织细胞系淋巴瘤和CML。
6.4.2.2细胞因子分泌谱
为了研究胎盘干细胞肿瘤抑制作用的分泌谱，从胎盘干细胞培养物中收集上清液，并利用
Figure G2007800373556D00901
分析仪和25种细胞因子的阵列来分析上清液。实施两种实验，一种仅利用LCL，第二种利用包括LCL细胞在内的八种肿瘤细胞系组。在第一种实验中，在胎盘干细胞与LCL细胞的6天培养后，收集受到抑制的肿瘤细胞，并计数活的7-AAD-细胞。如图14A所示，胎盘干细胞对LCL增殖的抑制是强烈的接触抑制的，比如，胎盘干细胞抑制在敞口孔(open well)中共培养的LCL增殖，而不抑制transwell共培养的LCL增殖。然而，在敞口孔和transwell条件下，细胞因子分泌谱仅有轻微改变(图14B)。单独的LCL以纳克/毫升量级分泌MIP-1α和MIP-1β，而共培养物则含有与胎盘干细胞单独培养时可见量相应的IL-6、IL-8和MCP-1。MIP-1α和MIP-1β的值没有显著改变。
为了确定广泛的肿瘤系样本的细胞因子分泌谱，利用相同的25种细胞因子阵列分析了来源于在图15A和15B中描述的共培养实验的上清液。LCL/PDAC共培养物的共培养分泌谱也大致相似，其中检测到预期量的IL-6、IL-8和MCP-1。然而，未发现明显的MIP-1α/β的量。在筛选的其它七个系中，组织细胞性淋巴瘤表现出与LCL相似的谱，而其它6种细胞系全面抑制的分泌谱。
6.4.2.3结论
根据实施例中呈现的数据，可以得出如下结论：胎盘干细胞对广泛的肿瘤细胞系表现出肿瘤细胞生长抑制效果，所述肿瘤细胞系包括组织细胞性淋巴瘤、慢性髓性白血病、结肠腺癌、成视网膜细胞瘤和肺癌。这些肿瘤细胞系来源于不同起源，例如：上皮、腺体和造血的细胞类型，这表明胎盘干细胞在临床条件下可以有效对抗广泛的肿瘤类型。这些效果是部分的接触依赖性的，并且接触依赖性与肿瘤生长速度相关。对于测试的八种肿瘤系，乳腺癌和ALL细胞表现出被共培养的胎盘干细胞激活。
6.5实施例5：利用胎盘干细胞抑制慢性髓性白血病细胞。
本发明的胎盘干细胞显示出以接触依赖的方式抑制巨核母细胞白血病细胞生长的能力。
6.5.1材料和方法
在这些研究中使用的肿瘤细胞系包括慢性髓性白血病细胞系MEG-01(慢性髓性白血病细胞；ATCC#CRL-2021)、组织细胞性淋巴瘤和成视网膜瘤细胞系。
脐带干细胞(UC)、羊膜-绒毛膜干细胞(AC)、骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、或人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)在24孔组织培养板中单独培养，或与肿瘤细胞共培养6天，其起始细胞数为5×10^4个细胞每孔。因此，当胎盘干细胞以1∶1比例与肿瘤细胞共培养时，每种细胞类型每个孔接种各5×10^4个细胞。当使用5∶1的比例时，25×10^4个胎盘干细胞与5×10^4个肿瘤细胞一起接种。通过比较共培养物中的活细胞(膜联蛋白-V-、7-AAD-)数与对照培养物(仅肿瘤细胞)中的活细胞数，来计算肿瘤细胞抑制。
对于凋亡研究，收集共培养的MEG-01细胞，并用膜联蛋白V和碘化丙锭在开始共培养后的0、3和6天染色，通过流式细胞仪分析。对于细胞周期分析，固定共培养的细胞，透化并用碘化丙锭在开始共培养后的0、1、2、3、4和6天染色，并通过流式细胞仪分析DNA含量分布。
对于上清液细胞因子分析，收集50μL培养上清液，并用分析仪分析下列细胞因子：血小板衍生生长因子(PDGF-AA)、粒-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长相关的原癌基因α(GROα)、和白血病抑制因子(LIF)的分泌，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、成纤维细胞生长因子(FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、可溶性白介素-2(sIL-2)、和血管内皮生长因子(VEGF)。
6.5.2结果
为了印证相对于BM-MSC，胎盘干细胞对其它肿瘤细胞系的增强的肿瘤细胞生长抑制作用，确定了胎盘干细胞对慢性髓性白血病(CML)细胞的生长抑制。单独培养MEG-01(巨核母细胞白血病)细胞，或与BM-MSC、脐带干细胞(UC)、或羊膜-绒毛膜干细胞(AC)以1∶1比例共培养6天。根据公式：100-([共培养中的#膜联蛋白-V-、7-AAD-细胞/单独培养的#膜联蛋白-V-、7-AAD-细胞]*100)确定百分比抑制。MEG-01细胞与BM-MSC的共培养导致在共培养6天后获得了约25％生长抑制。然而，MEG-01细胞与脐带或AC胎盘干细胞的共培养物导致在6天后获得了大于75％的抑制；与羊膜-绒毛膜细胞的共培养物获得了大于90％的抑制(图16A)。共培养的脐带干细胞也抑制组织细胞性淋巴瘤细胞和成视网膜细胞瘤细胞；然而，与MEG-01细胞中观察到的抑制作用相比，这些细胞系中的抑制作用(HL：～20％；Rb：～50％)只是中等的。
相对于BM-MSC的抑制，胎盘干细胞对于MEG-01抑制的时程如图16B中所示。在BM-MSC和脐带干细胞共培养物中，在第2天均观察到了MEG-01细胞的令人惊奇的抑制；然而，在UC共培养物中，第6天仍然强烈的维持了生长抑制，而同时，与BM-MSC的共培养物仅中度抑制了生长。这些结果表明，在慢性髓性白血病(CML)细胞中，胎盘干细胞相对于BM-MSC可增强肿瘤细胞生长抑制，并印证了在LCL细胞中观察到的胎盘干细胞的增强的肿瘤抑制效果。所示结果还表明，CML细胞相对于其它血癌细胞类型(例如：组织细胞性淋巴瘤)或实体瘤细胞类型(例如：成视网膜细胞瘤)，对胎盘干细胞的抑制尤为敏感。
虽然不希望受到任何特定机理或理论的约束，仍然研究了脐带干细胞可以何种方式实现对肿瘤细胞生长的抑制。特别的，检查了与脐带干细胞共培养6天的MEG-01细胞中凋亡标记的存在，并分析细胞周期阻滞的诱导，并评估了其随巨核细胞系的成熟。通过诱导凋亡没有表现出发生生长抑制，因为与单独培养的MEG-01细胞、或与HUVEC细胞共培养的MEG-01细胞(数据未显示)相比，与脐带干细胞共培养的MEG-01细胞中的活细胞(膜联蛋白-V-、PI-)、凋亡细胞(膜联蛋白-V+、PI-)和坏死细胞(膜联蛋白-V+、PI+)百分比未发现显著差异。此外，与脐带干细胞的共培养物未显示诱导细胞周期阻滞，因为在与脐带干细胞、HUVEC、BM-MSC共培养的MEG-01细胞中，或在单独培养的MEG-01细胞(数据未显示)中，没有观察到DNA含量分布上的显著差异。此外，脐带干细胞对MEG-01的生长抑制未表现出是随巨核细胞系成熟的结果，因为与脐带干细胞、BM-MSC、和HUVEC细胞共培养的MEG-01细胞都表现出与成巨核细胞成熟标记CD36诱导的相似的水平(数据未显示)。因此，胎盘干细胞的MEG-01生长抑制表现为凋亡-、细胞周期-和成熟-非依赖性的方式。
6.5.2.1胎盘干细胞的接触非依赖性MEG-01生长抑制
为了研究胎盘干细胞对MEG-01生长抑制的接触依赖，进行了利用来源于抑制的MEG-01/胎盘干细胞共培养物的条件化培养基的生长抑制检测(图17)。MEG-01细胞生长在RPMI的基本培养基中，用来源于MEG-01/脐带干细胞共培养物、MEG-01/BM-MSC共培养物、或MEG-01/HUVEC共培养物的条件化培养基以1∶2或1∶10(条件化培养基：非条件化培养基)的比例来替代培养基。阴性对照细胞(单独的MEG)在不用条件化培养基替换初始培养基的条件下生长。MEG-01细胞直接与脐带干细胞共培养作为阳性对照(MEG/UC)。采用MEG-01/脐带干细胞共培养条件化培养基(1∶2)处理的MEG-01细胞，与和脐带干细胞直接共培养的MEG-01细胞(MEG/UC)的抑制程度相同，这表明脐带干细胞生产的可溶性生长因子是MEG-01细胞生长抑制的原因。
6.5.2.2细胞因子分泌谱
为了研究共培养基质中存在的可溶性因子是否涉及MEG-01细胞的抑制，在6天的培养后，收集来源于单独培养的MEG-01、UC干细胞、BM-MSC和HUVEC细胞，或分别与UC干细胞、BM-MSC和HUVEC共培养的MEG-01细胞的上清液，并分析下列细胞因子的存在：FGF-2、TNF-α、GM-CSF、PDGF、EGF、GRO-α、sIL-2、VEGF和LIF。发现当PDAC细胞与MEG-01细胞共培养时，高分泌PDGF-AA和GM-CSF，其水平超过两种细胞系各自单独培养时的水平(图18)。PDAC/MEG-01共培养物中高分泌GRO-α，并且在单独培养的PDAC细胞中也发现了相似的GRO-α水平。
6.5.2.3结论
来源于巨核母细胞白血病细胞系MEG-01的生长抑研究的结果提示，和与骨髓间充质干细胞共培养相比，与胎盘干细胞共培养导致增强的肿瘤细胞生长抑制。并不希望受到任何特定操作理论的约束，抑制表现为生长抑制的结果，并非凋亡诱导、细胞周期阻滞或随巨核细胞系MEG-01细胞成熟的结果。胎盘干细胞的抑制可以涉及可溶性生长因子的作用。候选因子包括PDGF-AA、GM-CSF、GRO-α和LIF。并非意在受到任何特定操作理论的约束，认为这些因子的分泌通过对先天和适应性免疫功能的吸引，增强胎盘干细胞的生长抑制效果，可以在体内产生有益的影响。
与测试的其它肿瘤细胞系(组织细胞性淋巴瘤、成视网膜细胞瘤)相比，巨核母细胞白血病细胞显示了对胎盘干细胞共培养的更高的灵敏度，这表明慢性髓性白血病可以特别应答胎盘干细胞组合物的治疗应用。
6.6实施例6：利用胎盘干细胞抑制白血病和淋巴瘤细胞
6.6.1材料和方法
为了进一步验证和扩展在MEG-01慢性髓性淋巴瘤系获得的结果，测试了脐带干细胞和羊膜绒毛膜干细胞对其它白血病和淋巴瘤细胞系的接触非依赖性抑制作用。该研究中使用的细胞系包括可购自ATCC的多个白血病细胞系，包括巨核母细胞淋巴瘤系MEG-01(ATCC#CRL-2021)；急性成淋巴细胞性白血病系CCRF-CEM(ATCC#CCL-119)；急性T细胞白血病系J.RT3-T3.5(ATCC#TIB-153)；组织细胞性淋巴瘤U937(ATCC#CRL-1593.2)；骨髓急性髓性白血病系KG-I(ATCC#CRL-8031)；和慢性髓性白血病系KU812(ATCC#CRL-2099)。
简而言之，肿瘤细胞系单独培养，或与脐带(UC)干细胞或羊膜-绒毛膜(AC)胎盘干细胞以1∶1和5∶1的比例(干细胞∶肿瘤细胞)在24孔组织培养板中(除非另外提及)以直接共培养(DC)和transwell(TW)的形式共培养。在培养7天后，从悬浮液中收集肿瘤细胞，重悬在200Ml磷酸缓冲盐溶液中，用膜联蛋白-V和碘化丙锭染色。利用Becton Dickinson FACS Calibur流式细胞仪确定活细胞数(膜联蛋白V+、PI-细胞)。
6.6.2结果
对白血病和淋巴瘤细胞系的生长抑制检测的结果如表3所示。百分比表示了在7天共培养后，相对于单独培养的对照细胞所留存的活细胞百分比。
表3：脐带干细胞或羊膜-绒毛膜干细胞对白血病和淋巴瘤细胞系的抑制
  干细胞系(脐带(UC)；羊膜-绒毛膜(AC))   肿瘤系   1∶1TW   1∶1DC   5∶1TW   5∶1DC   1∶1TWMEG-01   1∶1DCMEG-01
  UC1   CCRF-CEM   49％   32％   16％   3％   42％   16％
  UC1   CCRF-CEM   48％   34％   16％   7％   60％   21％
  AC1   CCRF-CEM   79％   49％   43％   31％   55％   41％
  UC1   J.RT3-T3.5   56％   27％   28％   19％   71％   45％
  AC1   J.RT3-T3.5   74％   105％   69％   34％   34％   28％
  UC1   U937   50％   19％   11％   16％   45％   20％
  UC1   KG1   76％   18％   60％   27％   43％   31％
  UC1   KG1   68％   44％   50％   21％   53％   47％
  UC2   KG1   131％   88％   139％   27％   50％   51％
  UC3   KG1   117％   74％   17％   10％   31％   23％
  干细胞系(脐带(UC)；羊膜-绒毛膜(AC))   肿瘤系   1∶1TW   1∶1DC   5∶1TW   5∶1DC   1∶1TWMEG-01   1∶1DCMEG-01
  UC4   KG1   118％   21％   82％   22％   38％   34％
  AC1   KG1   87％   81％   102％   62％   68％   44％
  UC4   KU812   47％   8％   23％   5％   67％   26％
  AC1   KU812   91％   71％   42％   16％   58％   27％
  AC1   KU812   21％   8％   17％   NA   48％   27％
  AC1   KU812   12％   17％   12％   NA   69％   87％
  AC2   KU812   42％   10％   42％   9％   49％   56％
在直接培养和transwell形式中，胎盘细胞系UC1和AC1都抑制CCRF-CEM细胞系。相对于transwell形式，与胎盘干细胞的直接培养略微更有效地抑制CCRF-CEM生长。在直接和transwell形式中，5∶1的培养比例对抑制CCRF-CEM生长都更有效。
对U937系也观察到相似的结果。直接共培养抑制只比transwell抑制略微更有效，其中以5∶1为最佳培养比例。KG-1细胞一般表现出对脐带或胎盘干细胞共培养较低的灵敏度；然而，当与脐带干细胞系UC1、UC3和UC4共培养时，在直接培养和transwell形式中仍然都观察到生长抑制。直接培养对KG-1细胞的抑制比transwell的抑制更有效，其中5∶1比例的培养表现出比1∶1更大的抑制效果。KU812细胞表现出对胎盘干细胞共培养的最高灵敏度，其抑制作用在几乎所有测试条件下都大于50％。直接培养的抑制比transwell抑制更有效；然而，KU812的transwell抑制在1∶1培养比例时大于50％。
为了排除由于在T24组织培养孔中共培养7天后养分耗竭造成生长抑制的可能性，利用与24孔测试中使用的相同的起始细胞数在T25瓶中进行共培养(50×103个MEG-01细胞)。因此，共培养以T24方法提供的营养物量的10倍量有效地进行共培养。以1∶1比例与UC干细胞共培养七天的MEG-01被抑制51％；当以5∶1比例培养时，MEG-01细胞被抑制69％。相似的，当MEG-01以1∶1比例与AC胎盘干细胞共培养7天时，观察到53％抑制；当以5∶1比例共培养时，观察到66％抑制(数据未显示)。这些结果表示，胎盘干细胞在体外对MEG-01细胞的抑制作用不是由于培养环境中营养物的耗尽引起的。
6.6.2.1结论
综上所述，这些结果表明：脐带干细胞和羊膜-绒毛膜干细胞对白血病和淋巴瘤细胞系的生长抑制是强有力的，并可以接触非依赖性的方式发生。当在相同的肿瘤细胞类型中，观察到实验批次间抑制程度的变化时，这些结果通常反映了胎盘干细胞，例如脐带干细胞和羊膜-绒毛膜干细胞，以直接的或接触非依赖性方式，抑制多种血癌细胞类型的生长的能力。当以干细胞比肿瘤细胞为5∶1的比例直接共培养时，脐带干细胞和羊膜-绒毛膜干细胞对测试的每种肿瘤系都组成型的表现出大于50％的抑制效果(除了用AC1干细胞系处理的KG1细胞外；其观察到38％抑制)。因此，这些数据还支持在治疗条件下将胎盘干细胞用于治疗多种肿瘤，并特别支持将胎盘干细胞用于治疗不同细胞类型的血液肿瘤，包括巨核母细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性T细胞性白血病、组织细胞性淋巴瘤、骨髓急性骨髓性白血病和慢性髓细胞性白血病。
6.7实施例7：胎盘干细胞应答SDF-1的迁移
本发明的胎盘干细胞表现出应答化学趋化剂SDF-1的存在的迁移能力。
6.7.1材料和方法
为了测试胎盘干细胞应答化学趋化剂的迁移能力，在存在基质细胞来源因子-1(SDF-1)的条件下，利用Cell Biolabs CYTOSELECTTM细胞迁移检测试剂盒，测量胎盘干细胞的迁移。所示检测在24孔板中加入了聚碳酸酯膜插入物(8μm孔径)。所述膜作为屏障，将迁移细胞与未迁移细胞区分开。迁移细胞能够向化学趋化剂伸展出突起(通过肌动蛋白细胞骨架重建)，并最终穿过聚碳酸酯膜的孔。然后，将这些迁移细胞从膜上解离，并用结合细胞核酸后发出荧光的染料(
Figure G2007800373556D00991
GR染料；InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)检测。简而言之，脐带胎盘干细胞是在无血清培养基中以细胞悬浮液的形式制备的。将SDF-1直接单独加入到细胞悬浮液中，或与SDF-1受体CSCR4阻断剂(AMD3100)联合加入。在细胞培养孵育箱中孵育24小时后检测细胞。
6.7.2结果
图19显示脐带胎盘干细胞向胎牛血清和SDF-1迁移。在24小时培养后，不添加血清或SDF-1条件下孵育的胎盘干细胞表现出等于6.0荧光单位的细胞迁移。在24小时后，向细胞悬浮液添加10％FBS获得等于12.7荧光单位的细胞迁移。在24小时后，向细胞悬浮液添加1μg/ml SDF-1获得等于15.0荧光单位的细胞迁移。然而，添加SDF-1受体CSCR4阻断剂AMD3100，显著抑制了应答SDF-1的胎盘干细胞迁移。在24小时后，在同时存在SDF-1和AMD3100条件下的胎盘干细胞迁移相当于7.0荧光单位，其与不添加SDF-1或血清条件下观察到的迁移水平接近。
结论
这些结果表明胎盘干细胞具有应答特定化学趋化剂而迁移的能力。SDF-1受体CSCR4在多种肿瘤细胞上表达。因此，这些结果表明向肿瘤位点同时施用SDF-1和胎盘干细胞可以延长胎盘干细胞在靶肿瘤位点的定位，并有助于胎盘干细胞-肿瘤细胞相互作用，从而增强胎盘干细胞的肿瘤细胞生长抑制效果。
等同物：
本发明不限于本说明书描述的特定实施方案的范围内。实际上，根据前述说明书和所附附图，除了描述过的改进方案外，本发明的各种改进方案对本领域技术人员都将是显而易见的。此类改进方案都意在落入所附权利要求的保护范围内。
本发明中引用的各种出版物、专利和专利申请，其公开内容在此全文引用作为参考。

Claims (54)

1.抑制大量肿瘤细胞增殖的方法，包括将所述大量肿瘤细胞与大量胎盘干细胞接触一段时间，与未接触胎盘干细胞的大量所述肿瘤细胞相比，所述时间足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。
2.权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞：
表达CD200和HLA-G，
表达CD73、CD105和CD200，
表达CD200和OCT-4，
表达CD73、CD105和HLA-G，
表达CD73和CD105，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体，和/或
表达OCT-4，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体。
3.权利要求1的方法，其中所述肿瘤细胞是实体瘤的一部分。
4.权利要求1的方法，其中所述大量肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞或肺癌细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述接触是在体外进行的。
6.权利要求1的方法，其中所述接触是在体内进行的。
7.权利要求6的方法，其中所述接触是在含有所述肿瘤细胞的个体内进行的。
8.权利要求7的方法，其中所述个体是哺乳动物。
9.权利要求8的方法，其中所述哺乳动物是人。
10.权利要求7的方法，其中所述接触包括向所述个体静脉内施用所述胎盘细胞。
11.权利要求7的方法，其中所述接触包括在肿瘤位点处或其附近向所述个体静脉内施用所述胎盘细胞。
12.权利要求1的方法，其中至少部分的所述胎盘干细胞以被改造以表达细胞因子。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞因子是IFN-β或IL-2。
14.权利要求1的方法，还包括将所述肿瘤细胞与一种或多种抗癌化合物接触。
15.权利要求1的方法，包括将所述肿瘤细胞与大量间充质干细胞接触。
16.权利要求15的方法，其中所述间充质干细胞是骨髓来源的间充质干细胞。
17.权利要求7的方法，包括向所述个体施用至少1×105个胎盘干细胞。
18.权利要求7的方法，包括向所述个体施用至少1×106个胎盘干细胞。
19.权利要求7的方法，包括向所述个体施用至少1×107个胎盘干细胞。
20.权利要求7的方法，包括向所述个体施用至少1×108个胎盘干细胞。
21.权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞已经在体外增殖不超过30次群倍增。
22.权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞已经在体外增殖不超过20次群倍增。
23.权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞已经在体外增殖不超过10次群倍增。
24.权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞已经在体外增殖不超过5次群倍增。
25.权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞已经过冷冻保存并在所述接触前解冻。
26.权利要求1的方法，其中与缺少所述胎盘干细胞的条件下等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞抑制所述肿瘤细胞增殖至少50％。
27.权利要求1的方法，其中与缺少所述胎盘干细胞的条件下等量肿瘤细胞的增殖相比，所述胎盘干细胞抑制所述肿瘤细胞增殖至少75％。
28.权利要求7的方法，包括在所述接触前，确定所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞的增殖。
29.权利要求28的方法，其中所述样本的肿瘤细胞是与接触所述胎盘干细胞的所述肿瘤细胞组织起源相同的肿瘤细胞。
30.权利要求29的方法，其中所述样本的肿瘤细胞是个体的肿瘤细胞。
31.权利要求28的方法，其中所述确定包括确定所述胎盘干细胞的直接接触可检测地抑制所述样本的肿瘤细胞。
32.权利要求28的方法，其中所述确定包括确定在所述样本的肿瘤细胞和所述胎盘干细胞之间没有直接接触的条件下，所述胎盘干细胞可检测地抑制所述样本的肿瘤细胞。
33.药物组合物，包含大量胎盘干细胞，其中所述胎盘干细胞已经改造以表达外源性IFN-β或IL-2。
34.权利要求33的药物组合物，其中所述胎盘干细胞
(a)附着于基质，
(b)表达CD200和HLA-G，或
表达CD73、CD105和CD200，或
表达CD200和OCT-4，或
表达CD73、CD105和HLA-G，或
表达CD73和CD105，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体，或
表达OCT-4，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和
(c)已被鉴别为可检测地抑制肿瘤细胞或肿瘤细胞群的增殖，或肿瘤的生长。
35.生产胎盘干细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其
(a)附着于基质，
(b)表达CD200和HLA-G，或
表达CD73、CD105和CD200，或
表达CD200和OCT-4，或
表达CD73、CD105和HLA-G，或
表达CD73和CD105，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体，或
表达OCT-4，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和
确定所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞或肺癌细胞；和
从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。
36.生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其(a)附着于基质，和(b)表达CD200和HLA-G；确定所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞或肺癌细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。
37.生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其(a)附着于基质，和(b)表达CD73、CD105和CD200；确定所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞或肺癌细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。
38.生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其(a)附着于基质，和(b)表达CD200和OCT-4；确定所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞或肺癌细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。
39.生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其(a)附着于基质，和(b)表达CD73和CD105，和(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体；确定所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞或肺癌细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。
40.生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其(a)附着于基质，和(b)表达CD73、CD105和HLA-G；确定所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞或肺癌细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。
41.生产细胞群的方法，包括选择胎盘干细胞，其(a)附着于基质，和(b)表达OCT-4，和(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体；确定所述胎盘干细胞可检测地抑制肿瘤细胞增殖，其中所述肿瘤细胞是组织细胞性淋巴瘤细胞、慢性髓性白血病细胞、急性T-细胞白血病细胞、急性髓性白血病细胞、结肠腺癌细胞、成视网膜细胞瘤细胞或肺癌细胞；和从其它细胞中分离所述胎盘干细胞以形成细胞群。
42.权利要求35-41的任一项的方法，其中所述胎盘干细胞来源于羊膜、羊膜-绒毛膜盘、脐带或胎盘灌流液。
43.根据权利要求35-41的任一项的方法生产的分离的胎盘干细胞群。
44.包含胎盘干细胞的分离的细胞群，其中所述胎盘干细胞：
(a)附着于基质，
(b)表达CD200和HLA-G，或
表达CD73、CD105和CD200，或
表达CD200和OCT-4，或
表达CD73、CD105和HLA-G，或
表达CD73和CD105，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体，或
表达OCT-4，并且当所述群在允许胚样体形成的条件下培养时，有助于在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚样体；和
(c)已被确定为与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。
45.包含胎盘干细胞的分离的细胞群，所述胎盘干细胞(a)附着于基质，(b)表达CD200和HLA-G，和(c)已被确定为与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。
46.包含胎盘干细胞的分离的细胞群，所述胎盘干细胞(a)附着于基质，(b)表达CD73、CD105和CD200，和(c)已被确定为与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。
47.包含胎盘干细胞的分离的细胞群，所述胎盘干细胞(a)附着于基质，(b)表达CD200和OCT-4，和(c)已被确定为与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。
48.包含胎盘干细胞的分离的细胞群，所述胎盘干细胞(a)附着于基质，(b)表达CD73和CD105，(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体，和(d)已被确定为与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。
49.包含胎盘干细胞的分离的细胞群，所述胎盘干细胞(a)附着于基质，(b)表达CD73、CD105和HLA-G，和(c)已被确定为与未与胎盘干细胞接触的大量肿瘤细胞相比，可检测地抑制所述大量肿瘤细胞的增殖。
50.包含胎盘干细胞的分离的细胞群，所述胎盘干细胞(a)附着于基质，(b)表达OCT-4，(c)当在允许胚样体形成的条件下培养时，形成胚样体，和(d)已被确定为可检测地抑制MLR中CD4+或CD8+T细胞的增殖。
51.包含权利要求44-50的任一项分离的胎盘细胞群的组合物。
52.权利要求51的组合物，还包括大量非胎盘细胞。
53.权利要求52的组合物，其中所述非胎盘细胞包括间充质干细胞。
54.权利要求53的组合物，其中所述间充质干细胞是骨髓来源的间充质干细胞。
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