CN102027118B - 含有dna甲基化状态改变的神经再生细胞 - Google Patents

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Abstract

本文公开了骨髓粘附干细胞(MASC)的后代细胞，将其移植入中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)损伤部位后能拯救和/或逆转各种神经疾病。此种细胞中某些基因的甲基化状态与MASC中的甲基化状态相比有所改变。还提供了通过改变某些基因的甲基化状态来制备植入CNS或PNS损伤部位后能拯救和/或逆转各种神经疾病的细胞的方法。

Description

含有DNA甲基化状态改变的神经再生细胞
关于联邦资助的声明
不适用。
领域
本发明属于神经疾病的细胞治疗和基因表达及分化的后成(epigenetic)调节领域。
背景
细胞分化可部分通过调节基因的表达来控制。转录(即，利用DNA作为模板合成mRNA分子)调控是调控基因表达的一种机制。例如，改变染色质结构和/或使转录调控蛋白结合基因中或基因附近的特定DNA序列，可导致对基因表达的转录调控。
实现基因表达转录控制的另一方式是化学改变DNA。此种调控形式中最广为研究的方面是DNA甲基化。在真核生物基因组中，DNA甲基化的主要形式是通过许多细胞甲基转移酶之一的作用使胞嘧啶转变为5-甲基-胞嘧啶。在大多数情况下，甲基化的C残基紧接于G残基上游。通常，基因中或基因附近C残基的甲基化与基因表达降低相关。在大多数情况下，CpG甲基化本身不是阻抑基因转录的直接原因，其机制看来是基因调控蛋白先前介导的永久性转录阻抑(perpetuate transcriptional repression)所致。
在某些脊椎动物的非细胞类型特异性基因(即，持家基因)上游区域中，CG二核苷酸基序的频率远高于依据基因组GC含量所预计的；此类区域称为CpG岛。CpG岛是C残基的甲基化状态可能影响相关基因转录的位点。相反，与特定基因相关的CpG岛或其它区域中的C残基甲基化状态可用作该基因转录状态的潜在指示和/或用作表征特定细胞类型的诊断标记。参见，例如WO2006/094836。
发明概述
本文公开了移植到神经系统损伤或疾病部位后能刺激神经恢复和/或神经再生的细胞。在某些实施方式中，所述细胞是骨髓粘附干细胞(MASC)的后代，但经体外处理和培养后其某些基因的甲基化状态发生改变。因此，本发明人发现，改变一种或多种基因的这种甲基化状态能使祖细胞转变成具有神经再生特性的后代细胞，这种特性是该祖细胞没有的。
作为这种发现的结果，本发明包括以下实施方式：
1.一种改变细胞基因的甲基化状态的方法，该方法包括：
(a)用包含编码Notch胞内结构域序列的多核苷酸转染细胞；和
(b)培养转染细胞，使该细胞或该细胞的一个或多个后代中所述基因的甲基化状态与未转染细胞中的该基因相比发生改变。
2.如实施方式1所述的方法，其中，所述基因是PITX2基因。
3.如实施方式1所述的方法，其中，所述基因是DNMT3b基因。
4.如实施方式1所述的方法，其中，所述基因是IGF2R基因。
5.如实施方式1所述的方法，其中，所述基因是SDF4基因。
6.如实施方式1所述的方法，其中，所述基因是ROPN1L基因。
7.如实施方式1所述的方法，其中，所述基因是TMEM179基因。
8.如实施方式1-5中任一项所述的方法，其中，所述后代细胞中所述基因的甲基化增加。
9.如实施方式1-6或7中任一项所述的方法，其中，所述后代细胞中所述基因的甲基化降低。
10.如实施方式9所述的方法，其中，序列C-A-T-C甲基-G-C-C-C转变成C-A-T-C-G-C-C-C。
11.如实施方式1-10中任一项所述的方法，其中，所述细胞是骨髓的粘附性基质细胞(MASC)。
12.一种制备细胞中某基因的甲基化状态改变的后代细胞的方法，该方法包括：
(a)用包含编码Notch胞内结构域的序列的多核苷酸转染祖细胞；
(b)培养转染细胞；和
(c)从转染细胞的后代中获得其中所述基因甲基化状态改变的一个或多个后代细胞。
13.如实施方式12所述的方法，其中，所述基因是PITX2基因。
14.如实施方式12所述的方法，其中，所述基因是DNMT3b基因。
15.如实施方式12所述的方法，其中，所述基因是IGF2R基因。
16.如实施方式12所述的方法，其中，所述基因是SDF4基因。
17.如实施方式12所述的方法，其中，所述基因是ROPN1L基因。
18.如实施方式12所述的方法，其中，所述基因是TMEM179基因。
19.如实施方式12-16中任一项所述的方法，其中，所述后代细胞中所述基因的甲基化比其祖细胞增加。
20.如实施方式12或17或18中任一项所述的方法，其中，所述后代细胞中所述基因的甲基化比其祖细胞降低。
21.如实施方式20所述的方法，其中，序列C-A-T-C甲基-G-C-C-C转变成C-A-T-C-G-C-C-C。
22.如实施方式12-21中任一项所述的方法，其中，所述祖细胞是骨髓的粘附性基质细胞(MASC)。
23.一种将祖细胞转变成神经再生细胞的方法，该方法包括改变祖细胞一种或多种基因的甲基化状态。
24.如实施方式23所述的方法，其中，所述基因是PITX2基因。
25.如实施方式23所述的方法，其中，所述基因是DNMT3b基因。
26.如实施方式23所述的方法，其中，所述基因是IGF2R基因。
27.如实施方式23所述的方法，其中，所述基因是SDF4基因。
28.如实施方式23所述的方法，其中，所述基因是ROPN1L基因。
29.如实施方式23所述的方法，其中，所述基因是TMEM179基因。
30.如实施方式23-27中任一项所述的方法，其中，所述神经再生细胞中所述基因的甲基化比其祖细胞增加。
31.如实施方式23、28或29中任一项所述的方法，其中，所述神经再生细胞中所述基因的甲基化比其祖细胞降低。
32.如实施方式31所述的方法，其中，序列C-A-T-C甲基-G-C-C-C转变成C-A-T-C-G-C-C-C。
33.如实施方式23-32中任一项所述的方法，其中，所述祖细胞是骨髓的粘附性基质细胞(MASC)。
34.如实施方式23所述的方法，其中，通过以下步骤改变所述基因的甲基化状态：
(a)用包含编码Notch胞内结构域的序列的多核苷酸转染所述祖细胞；
(b)培养转染细胞；和
(c)从该转染细胞的后代中获得其中所述基因甲基化状态改变的一个或多个后代细胞；
其中所述基因的甲基化状态改变的后代细胞是神经再生细胞。
35.如实施方式30所述的方法，其中，通过以下步骤改变所述基因的甲基化状态：使所述祖细胞接触包含甲基化结构域和DNA-结合结构域的融合蛋白，或接触编码包含甲基化结构域和DNA-结合结构域的融合蛋白的核酸，所述DNA结合结构域经工程改造能结合所述基因中的一个或多个序列。
36.如实施方式31所述的方法，其中，通过以下步骤改变所述基因的甲基化状态：使所述祖细胞接触包含脱甲基结构域和DNA-结合结构域的融合蛋白，或接触编码包含脱甲基结构域和DNA-结合结构域的融合蛋白的核酸，所述DNA结合结构域经工程改造结能合所述基因中的一个或多个序列。
37.一种通过体外培养祖细胞使之传代产生的后代细胞，其中：
(a)所述后代细胞能支持神经组织生长和/或再生；
(b)所述后代细胞中一种或多种基因的甲基化状态与祖细胞相比发生改变；和
(c)在体外培养期间，不用包含编码Notch胞内结构域(NICD)序列的多核苷酸转染祖细胞及其任何后代细胞。
38.如实施方式37所述的细胞，其中，所述基因是PITX2基因。
39.如实施方式37所述的细胞，其中，所述基因是DNMT3b基因。
40.如实施方式37所述的细胞，其中，所述基因是IGF2R基因。
41.如实施方式37所述的细胞，其中，所述基因是SDF4基因。
42.如实施方式37所述的细胞，其中，所述基因是ROPN1L基因。
43.如实施方式37所述的细胞，其中，所述基因是TMEM179基因。
44.如实施方式37-41中任一项所述的细胞，其中，所述神经再生细胞中所述基因的甲基化比其祖细胞增加。
45.如实施方式37、42或43中任一项所述的细胞，其中，所述神经再生细胞中所述基因的甲基化比其祖细胞降低。
46.如实施方式45所述的细胞，其中，序列C-A-T-C甲基-G-C-C-C转变成C-A-T-C-G-C-C-C。
47.如实施方式37-46中任一项所述的细胞，其中，所述祖细胞是骨髓的粘附性基质细胞(MASC)。
48.如实施方式37所述的细胞，其中，通过以下步骤改变所述基因的甲基化状态：使所述祖细胞接触包含甲基化结构域和DNA-结合结构域的融合蛋白，或接触编码包含甲基化结构域和DNA-结合结构域的融合蛋白的核酸，其中所述DNA结合结构域经工程改造能结合所述基因中的一个或多个序列。
49.如实施方式37所述的细胞，其中，通过以下步骤改变所述基因的甲基化状态：使所述祖细胞接触包含脱甲基结构域和DNA-结合结构域的融合蛋白，或接触编码包含脱甲基结构域和DNA-结合结构域的融合蛋白的核酸，其中所述DNA结合结构域经工程改造能结合所述基因中的一个或多个序列。
50.一种鉴定神经再生细胞的方法，该方法包括检验所述细胞中一种或多种基因的甲基化状态，其中被检验基因的甲基化状态发生改变表明该细胞是神经再生细胞。
51.如实施方式50所述的方法，其中，用所述试验检测所述一种或多种基因的甲基化增加。
52.如实施方式50所述的方法，其中，用所述试验检测所述一种或多种基因的甲基化降低。
53.如实施方式50所述的方法，其中，用所述试验检测一种或多种第一基因的甲基化增加，和一种或多种第二基因的甲基化降低。
54.如实施方式50所述的方法，其中，所述一种或多种基因选自：PITX2、ROPN1L、DNMT3b、IGF2R、TMEM179和SDF4基因。
附图简述
不适用。
发明详述
用作诊断的甲基化状态
可利用对一种或多种感兴趣基因DNA中或附近特定CpG基序的甲基化状态改变的分析，来鉴定细胞，和将其与含不同DNA甲基化模式的其它细胞相区别。例如，如果干细胞或其它类型祖细胞中的特定CpG基序的C残基甲基化，当进一步分化时该C残基变成脱甲基；可将脱甲基的C残基用作分化步骤的标志。相反，C残基的甲基化可用作分化标志。不要求发生全部、所有的-或-绝无的甲基化状态改变；特定CpG基序甲基化改变的频率也可用于诊断。
可用本领域已知的许多方法区分甲基化与非甲基化的胞嘧啶残基。这些方法包括但不限于：用亚硫酸氢盐(bisulfite)处理DNA和用甲基化敏感性和甲基化依赖性限制性酶切割DNA的试验。亚硫酸氢盐(SO3 -)处理使非甲基化胞嘧啶脱氨基，将其转变成脱氧尿苷，其复制后成为新生DNA链中腺苷残基的模板。因此，亚硫酸氢盐处理导致C-G碱基对最终转变成T-A碱基对；这种转变可用标准DNA测序方法检测。亚硫酸氢盐处理不影响甲基化的C残基；因此，C甲基-G碱基对维持不变。
对于采用限制性酶的甲基化状态试验，可采用识别位点包含CG序列的酶。对于含CG序列的某些识别位点，如果C残基被甲基化，识别该位点的酶则不能切割，但该酶的同裂酶(即，识别同一序列的酶)能切割该位点而无论C残基是否甲基化。例如，HpaII和MspI均识别序列CCGG。MspI切割该位点而无论其第二C个残基是否甲基化。然而，HpaII只在第二个C残基非甲基化时才能切割该位点。因此，两种酶均能切割的CCGG序列表明该位点的第二个C残基未甲基化(即，该位点的序列为C-C-G-G)；而只被MspI切割表明第二个C残基为甲基化(即，该位点的序列为C-C甲基-G-G)。
实际上，分析特定CpG基序的甲基化状态包括鉴定包含感兴趣CpG基序的较长序列。通常选择的这种序列(常称这扩增子)包含一个或多个CpG二核苷酸基序(在不同细胞类型中甲基化状态可能不同)适合于扩增；例如通过聚合酶链式反应扩增。此类扩增子序列通常足够长，在哺乳动物基因组中是独特的。
涉及甲基化分析和可用于分析DNA甲基化的示范性扩增子的其它细节和其它信息见WO 2006/094836(2006年9月14日)，为了提供涉及甲基化分析和用于分析DNA甲基化的示范性扩增子更详细的其它信息，将其内容通过引用纳入本文。
祖细胞
祖细胞是可通过改变某些基因的甲基化状态而转变成神经再生细胞的任何类型非终末分化细胞。例如，美国专利号5,843,780；6,200,806和7,029,913所述的全能干细胞可用作祖细胞。全能干细胞可经培养(例如，美国专利号6,602,711和7,005,252)分化成各种类型的多能干细胞(例如，美国专利号6,280,718；6,613,568和6,887,706)，也可用作实施所述方法的祖细胞。
另一类示范性祖细胞是骨髓的粘附性基质细胞(MASC)，也称为骨髓基质细胞(BMSC)、骨髓粘附干细胞和间充质干细胞。MASC的示范性说明见美国专利申请公布号2003/0003090；Prockop(1997)Science 276：71-74和Jiang(2002)Nature 418：41-49。分离和纯化MASC的方法可见，例如美国专利号5,486,359；Pittenger等.(1999)Science 284：143-147和Dezawa等.(2001)Eur.J.Neurosci.14：1771-1776。可商品化购得人MASC(例如，马里兰州沃克斯维尔的BW公司(BioWhittaker，Walkersville，MD))或可通过，例如获得献血员的穿刺骨髓，然后选择粘附性骨髓细胞。参见，例如WO 2005/100552。
也可分离脐带血的MASC。参见，例如Campagnoli等.(2001)Blood98：2396-2402；Erices等.(2000)Br.J.Haematol.109：235-242和Hou等.(2003)Int.J.Hematol.78：256-261。
Notch胞内结构域
Notch蛋白是见于所有后生动物中的跨膜受体，可通过胞内信号传导影响细胞分化。Notch胞外结构域与Notch配体(例如，Delta、Serrate、Jagged)接触可导致Notch蛋白被蛋白酶两次水解切割，其中第二次被γ-分泌酶催化切割使Notch胞内结构域(NICD)释放入胞质中。在小鼠Notch蛋白中，该切割发生在氨基酸gly1734与val1744之间。NICD易位至核内，在该处发挥转录因子作用，募集其它转录调控蛋白(例如，MAM、组蛋白乙酰化酶)而减轻各种靶基因(例如，Hes 1)转录的阻抑。
关于Notch信号传导的其它细节和信息可见，例如Artavanis-Tsakonas等.(1995)Science 268：225-232；Mumm和Kopan(2000)Develop.Biol.228：151-165和Ehebauer等.(2006)Sci.STKE 2006(364)，cm7.[DOI：10.1 126/stke.3642006cm7]。
用编码人Notch胞内结构域的核酸转染祖细胞(例如，MASC)，然后通过药物选择和进一步培养富集转染的细胞，可产生基因组中DNA甲基化改变的神经再生细胞。其它细节参见以下实施例2。
细胞培养和转染
本领域知道培养细胞的标准方法。参见，例如R.I.Freshney“Culture ofAnimal Cells：A Manual ofBasic Technique(动物细胞培养：基础技术手册)”，第五版，Wiley，纽约，2005。
本领域也熟知将外源DNA引入细胞的方法(即，转染)。参见，例如Sambrook等.“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)”，第三版，冷泉港实验室出版社，2001；Ausubel等.，“Current Protocols inMolecular Biology(最新分子生物学方法)”，John Wiley & Sons(约翰威利父子公司)，纽约，1987和定期的更新。
转染和培养的示范性方法见以下实施例1和2。
靶向改变DNA甲基化的方法
由于祖细胞转变成神经再生细胞伴有某些基因甲基化状态的改变；可利用靶向改变甲基化状态将祖细胞转变成神经再生细胞。
本领域知道改变特定C残基甲基化状态的方法。为提高特定序列的甲基化，可采用包含DNA-结合结构域和甲基化结构域的融合蛋白。参见，例如Bestor U.S.2002/0188103(2002年12月12日)和WO 97/11972(1997年4月3日)。可用作甲基化结构域来源的示范性DNA甲基转移酶见上述参考文献。DNA甲基转移酶是能甲基化特定DNA序列的蛋白，所述特定DNA序列是CpG。该蛋白酶可以是突变的DNA甲基转移酶、野生型DNA甲基转移酶、天然产生的DNA甲基转移酶、天然产生DNA甲基转移酶的变体、截短的DNA甲基转移酶或能甲基化DNA的DNA甲基转移酶区段。DNA甲基转移酶可包括哺乳动物DNA甲基转移酶、细菌DNA甲基转移酶、M.Sssi DNA甲基转移酶和能甲基化DNA的其它蛋白质或多肽。
可用作构建融合蛋白的甲基化结构域来源的示范性DNA甲基转移酶包括但不限于：胞嘧啶DNA甲基转移酶、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、CpG甲基化酶、M.SssI、M.CviPI、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶、TaqI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、AluI甲基转移酶和SssI甲基转移酶。
为降低特定DNA序列的甲基化程度，可采用DNA-结合结构域与脱甲基化结构域之间的融合蛋白。示范性DNA脱甲基化结构域已见诸描述。参见，例如Bhattacharya等.(1999)Nature(伦敦)397：579-583；Cervoni等.(1999)J.Biol.Chem.274：8363-8366。
降低感兴趣序列甲基化程度的另一示范性方法是在细胞中表达DNA-结合结构域(结合感兴趣序列)与5-甲基胞嘧啶DNA-糖基化酶之间的融合蛋白。该融合蛋白能除去DNA糖-磷酸骨架中的甲基化胞嘧啶碱基，由细胞DNA修复酶替换为胞嘧啶。
也可通过阻断复制期间维持甲基化酶(maintenance methylase)与该序列的接触来实现感兴趣DNA序列脱甲基；从而阻止新复制的半甲基化DNA的未甲基化链被甲基化。下一轮复制将导致子代DNA双链体的感兴趣序列处无甲基。可通过在细胞中表达经工程改造能结合感兴趣序列的锌指DNA-结合结构域来实现此类阻断(参见下文)。
可通过构建包含甲基化结构域和DNA结合结构域的融合蛋白(或编码该融合蛋白的核酸)将甲基化结构域或脱甲基化结构域的活性靶向特定C残基，其中所述DNA-结合结构域能天然结合所选C残基处或附近的序列或经工程改造而能结合所选C残基处或附近的序列。所述DNA-结合结构域可以是天然产生的DNA-结合结构域或非天然产生而是经工程改造的DNA-结合结构域。
就此而言，可采用锌指DNA-结合结构域，因为可工程改造锌指蛋白使之能结合所选的任何DNA序列。锌指结合结构域包含一种或多种锌指结构。Miller等.(1985)EMBO J 4：1609-1614；Rhodes(1993)Scientific AmericanFebruary：56-65；美国专利号6,453,242。一个锌指通常长约30个氨基酸，含有4个锌-配位的氨基酸残基。结构研究证明规范的(C2H2)锌指基序含有两个β片层(维持通常含有两个锌-配位的半胱氨酸残基的β转角)和α螺旋(通常含有两个锌配位的组氨酸残基)。
锌指包括规范的C2H2锌指(即，锌离子与两个半胱氨酸和两个组氨酸残基配位)和非规范锌指，例如C3H锌指(其中锌离子与三个半胱氨酸和一个组氨酸残基配位)和C4锌指(其中锌离子与四个半胱氨酸残基配位)。非-规范锌指也可包括其中除半胱氨酸或组氨酸以外的一个氨基酸取代这些锌配位残基的那些锌指。参见，例如WO 02/057293(2002年7月25日)和US2003/0108880(2003年6月12日)。
可工程改造锌指结合结构域使之结合所选序列。参见，例如Beerli等.(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等.(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等.(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416。与天然产生的锌指蛋白相比，锌指结合结构域经工程改造后具有新的结合特异性。工程改造方法包括但不限于：理性设计和各类经验选择方法。理性设计包括，例如利用包含三联(或四联)核苷酸序列和各锌指氨基酸序列的数据库，此数据库中各三联或四联核苷酸序列与结合该特定三联或四联序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关。参见，例如美国专利号6,140,081；6,453,242；6,534,261；6,610,512；6,746,838；6,866,997；7,067,617；美国专利申请公布号2002/0165356；2004/0197892；2007/0154989；2007/0213269；和国际专利申请公布号WO 98/53059和WO2003/016496。
包括噬菌体展示、相互作用陷阱、杂交选择和双-杂交系统在内的示范性选择方法公开于美国专利号5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,140,466；6,200,759；6,242,568；6,410,248；6,733,970；6,790,941；7,029,847和7,297,491；以及美国专利申请公布号2007/0009948和2007/0009962；WO 98/37186；WO 01/60970和GB 2,338,237。
增强锌指结合结构域的结合特异性描述可参见，例如美国专利号6,794,136(2004年9月21日)。关于指间接头序列(inter-finger linkersequence)，锌指工程改造的其它方面参见美国专利号6,479,626和美国专利申请公布号2003/0119023。还参见Moore等.(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1432-1436；Moore等.(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：1437-1441和WO 01/53480。
为了公开示范性甲基化结构域和脱甲基化结构域(野生型和突变型)、本领域已知的设计方法、锌指DNA-结合结构域的选择和工程改造和构建包含甲基化结构域和/或锌指DNA-结合结构域的融合蛋白，此章节中题为“靶向改变DNA甲基化的方法”的所有参考文献通过引用全文纳入本文。
实施例
实施例1：制备骨髓的粘附性基质细胞(MASC)
将获自人献血员的骨髓穿刺物分成12.5ml等份装入50ml试管，各管加入12.5ml生长培养液(10％FBS，αMEM配制，补加了青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺)。颠倒混合试管内含物后，200x g离心试管8分钟。弃去上层清澈液，用新鲜生长培养液将下层体积调节至25ml，再混合和离心试管。再除去上层。再将各试管下层的体积调节至25ml，将所有试管的内含物合并在250ml试管中。用台盼蓝排除法测定细胞浓度和测定有核细胞数后，将细胞接种在各含40ml生长培养液的T225瓶中，密度为每瓶总共100x106个有核细胞。37℃，在CO2培养箱中培养各瓶3天，在此期间MASC粘附于瓶壁。
3天后，摇晃各瓶除去培养液和未粘附的细胞。用补加了青霉素/链霉素的40mlαMEM洗涤各瓶三次；然后各瓶中加入40ml预热的(37℃)生长培养液，37℃，在CO2培养箱中培养细胞。在此期间，每3-4天将培养液更换成40ml新鲜生长培养液，监测细胞的集落生长和细胞密度。
当培养物达到25-30％汇合(通常每个集落10,000-20,000个细胞，10-14天内)时，收集MASC(M0代)进一步传代。一次最多收集10个T-225瓶的MASC。除去各瓶的培养液，用20ml DPBS w/o Ca/Mg(DPBS-/-，HyClone)洗涤贴壁细胞2次。各瓶中加入10ml 0.25％胰蛋白酶/EDTA(加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))，室温培育各瓶约5分钟。当细胞脱离和集落分散成单个细胞时，加入10ml生长培养液灭活胰蛋白酶，然后轻柔混合。取出瓶中的细胞悬浮液，合并在250ml试管中。以200xg离心试管8分钟。小心吸弃上清液，将潮湿的细胞沉淀重悬于生长培养液中至细胞浓度估计约为1x106个细胞/毫升。测定活细胞数，将细胞以每瓶2 x106个细胞浓度接种在T225瓶的生长培养液中(M1代)。培养细胞3-5天，或直至85-90％汇合，每2-3天更换培养液。当85-90％汇合时，用胰蛋白酶处理收集M1代细胞，如上所述再以每瓶2 x106个细胞接种T225瓶，产生M2代培养物。如果需要，每3天M2培养物中加入新鲜培养液。当M2代培养物达到85-90％汇合时(通常在3-5天内)，收集之进行转染产生NRC(以下实施例2)或冻存供将来使用。
实施例2：制备神经再生细胞(NRC)
如下所示，收集M2代培养物的MASC制备神经再生细胞，也称为NRC或SB623细胞。
A.制备转染混合物
用编码Notch胞内结构域的质粒转染M2代MASC制备神经再生细胞。质粒(pN2)包含pCI-neo主链(威斯康星州麦迪逊普罗麦格公司(Promega，Madison，WI))，在此主链编码人Notch-1蛋白的氨基酸1703-2504的序列(编码胞内结构域)中引入多克隆位点。每瓶MASC含有40μg质粒和0.2ml溶液的5ml转染混合物。为制备此转染混合物，用玻璃移液管将适量(取决于细胞转染的培养瓶数)溶液加入无菌250ml试管的αMEM中。轻柔混合溶液，室温培育5分钟。然后在/αMEM混合物中滴加适量质粒DNA，轻柔混合，室温培育30分钟。
先取5ml置于加入40ug pEGFP质粒的15ml试管，再向/MEM混合物中加入pN2DNA。用该液转染1瓶细胞作为转染效率的对照。
B.转染
对于转染，用胰蛋白酶处理收获M2代MASC(如实施例1所述)，以每瓶40ml生长培养液，2.5 x106个细胞的密度接种T225瓶。当细胞达到50-70％汇合(通常在18-24小时内)时，将它们的生长培养液每瓶更换为35ml转染培养液(αMEM+10％FBS，不含青霉素/链霉素)以供转染。
加入转染培养液后3小时，用移液器将5ml转染混合物(以上章节A)直接加入各T-225瓶，避免接触生长表面，然后轻柔混合。用40μg pEGFP质粒转染对照T-225瓶，测定转染效率。
37℃，培养转染混合物24小时后，将转染培养液替换为αMEM+10％FBS+青霉素/链霉素。
C.选择转染的细胞
转染48小时后将培养液每瓶替换为40ml选择培养液(含有100μg/mlG-418的生长培养液)，选择掺入了质粒DNA的细胞。选择开始后3天和5天提供新鲜的选择培养液。7天后，除去选择培养液，细胞用40ml生长培养液培养。培养约3周(18-21天)，每2-3天更换新鲜生长培养液。
选择开始后约3周，当存活细胞开始形成集落时收集细胞。室温下，用移液管吸弃瓶中培养液，各瓶加入不含Ca2+/Mg2+的20ml DPBS。轻轻淋洗培养表面，吸弃洗涤液，重复淋洗步骤。然后各瓶中加入10ml预热的(37℃)0.25％胰蛋白酶/EDTA，淋洗生长表面，室温培育各瓶5-10分钟。用显微镜监测培养细胞确保细胞完全脱离。脱离完全时，每瓶加入10ml生长培养液灭活胰蛋白酶。清洗培养表面的混合物，用10ml移液管抽吸4-5次混合，将细胞悬液转移入50ml无菌锥底离心管。将收集的几瓶细胞合并在一个试管中。如果有细胞团块，让其沉淀，将悬液移至新鲜试管。
室温，800rpm(200x g)离心细胞悬液8分钟。吸弃上清液。扣击试管打散沉淀细胞，各管加入不含Ca2+/Mg2+的约10ml DPBS，用10ml移液管轻柔抽吸4-5次重悬细胞，获得均匀细胞悬液。
D.扩增转染细胞
测定经转化、选择的细胞悬液的细胞数，将细胞以每瓶2 x106个细胞接种T225瓶(接种的活细胞约30％)。将该培养物标注为M2P1(第一代)。每2-3天给M2P1培养物加入新鲜培养液，当细胞达到90-95％汇合时(通常在传代后4-7天)，收集之再以每瓶2 x106个细胞接种，产生M2P2代。当M2P2培养物达到90-95％汇合时，收集之供进一步试验。
实施例3：比较MASC与NRC之间的甲基化模式
如以上实施例1所述，制备3位独立献血员各自的MASC(标注为D33、D39和D41)。如以上实施例2所述，用各MASC制品的一部分制备神经再生细胞。分离6份细胞制品各自的基因组DNA，比较3位献血员各自的神经再生细胞DNA甲基化状态与他们的MASC祖细胞DNA甲基化状态。
按照以下三条标准分析基因的甲基化状态并选择：
1.分析MASC的甲基化与间充质细胞系的已知DNA甲基化标记；
2.利用差别甲基化杂交对MASC基因组作广泛筛查(genome-widescreen)，鉴定有甲基化标记的基因；和
3.文献中报道对胚胎干细胞分化有影响的基因。
为分析甲基化状态，对按照上述标准选择的基因的所选部分(扩增子)进行亚硫酸氢盐测序。某些基因显示MASC与NRC之间的甲基化状态没有明显差异。这些基因列于表1。许多基因所含扩增子显示MASC与NRC之间的甲基化状态有差异。这些基因列于表2。其中有5种基因的甲基化差异足够显著可用于区分NRC与MASC。这些基因是PITX2(也称为垂体同源框2；RIEGbicoid-相关同源框转录因子)、ROPN1L(Ropporin 1-样蛋白；AKAP-相关精子蛋白)、DNMT3b(DNA C5-N-甲基转移酶3b)、IGF2R(胰岛素样生长因子2受体)和SDF4(基质细胞-衍生因子4)。这5种基因中所选扩增子甲基化差异的细节见表3-7。
表3-7显示了各扩增子内许多CpG基序的甲基化状态。“对照细胞”指MASC，“靶细胞”指NRC。获得三位不同献血员的细胞，制备各献血员的MASC和NRC。SB101 MASC和SB102 NRC得自同一献血员；SB103 MASC和SB104 NRC获自第二位献血员；SB105 MASC和SB106 NRC获自第三位献血员。各表显示不同扩增子获得的结果。各表中第2-7列显示MASC(第2-4列)和NRC(第5-7列)的扩增子(由1列冒号后的数字标识)内特定CpG位点的甲基化水平。MASC测得的各CpG平均甲基化水平见第8列，NRC的见第9列，MASC与NRC之间的平均甲基化水平差别见第10列。
第11列显示各CpG基序测得的“费希尔评分(Fisher Score)”。
按下死皮公共计算费希尔评分。
([平均甲基化值(MASC)-平均甲基化值(NRCs)]2)/([标准偏差(MASC)]2+[标准偏差(NRCs)]2)
费希尔标准可表明特定CpG位点的甲基化水平差异。费希尔评分1以上认为有显著差异。
这些数据显示与MASC相比，NRC中PITX2、DNMT3b、IGF2R和SDF4基因中CpG基序的甲基化增加。相反，与MASC相比，NRC中RPON1L基因中CpG基序的甲基化降低。类似地，TMEM179的甲基化降低。特别是，与它们的MASC祖细胞相比，NRC中扩增子549中292位甲基化C残基的脱甲基代表有显著差异。
因此，这些甲基化改变对NRC有诊断意义；此外，对于制备的NRC，其它方法也测得相同的甲基化改变。
表1：显示MASC与NRC之间甲基化有差异的扩增子
  扩增子编号   基因
  32   CD4前体
  38   胶原α3(VI)
  105   胶原α1(II)
  112   Prolargin前体
  121   骨桥蛋白
  127   BMP4
  135   Anexin 6
  179   HIF 1A
  208   GLI3
  308   角蛋白8
  475   LRRK 1
  488   KCTD 5
  509   Frizzled 1前体
  510   HAND 2
  514   ZNF 74
  522   PKNOX 2
  528   GENSCAN 00000032124
  532   Q9C015
  537   C15orf27
  546   GENSCAN 00000000442
  563   GENSCAN 00000003261
  扩增子编号   基因
  824   LIF
  827   OCT4
  830   DNMT3B
  831   IGF2R
  832   IGF2R
  835   SLUG
  836   SLUG
  837   PTN
  838   PTN
  839   ID3
  840   ID3
  841   ID4
  842   ID4
  843   SDF4
  845   KLF2
  846   KLF2
  847   P107/RBL1
  848   P107/RBL1
  849   RELN
  850   RELN
  851   SST
  852   SST
表2：MASC与NRC中甲基化有差别的扩增子
扩增子ID    基因
18          GDF5
16          4FGFR1
227         LPIN1
825         NANOG
826         NANOG
834         NNAT
497         PITX2
549         ROPN1L
829         DNMT3b
833         IGF2R
844         SDF4
1303        TMEM179
实施例4：ROPN1L基因甲基化状态的改变
分析了NRC中含有ROPN1L基因甲基化状态改变的扩增子的核苷酸序列，与MASC相比，以精确鉴定甲基化状态改变的核苷酸。该分析的结果见表8。
表8：ROPN1L基因中特定胞嘧啶残基的甲基化改变
实施例5：含有DNA甲基化改变的NRC的神经再生特性
如实施例2所述制备的，具有实施例3和4所述甲基化改变的神经再生细胞，可用于治疗各种中枢和外周神经系统疾病。参见，例如，共同拥有的WO2009/023251(2009年2月19日)；其内容出于所有目的通过引用全文纳入本文。
也可将本发明所述和特征鉴定的细胞进一步处理后，转变成具有神经细胞和神经前体细胞特性的细胞。参见，例如美国专利申请公布号2006/0166362(2006年7月27日)，其内容通过引用纳入本文，该申请公开了此类示范性处理和经处理的细胞的特性。还参见美国专利申请公布号2006/0216276(2006年9月28日)，其内容通过引用纳入本文，该申请公开了如此处理的细胞的其它特性。

Claims (7)

1.一种改变骨髓粘附性基质细胞基因甲基化状态的方法，该方法包括：
(a)用包含编码Notch胞内结构域序列的多核苷酸转染所述细胞；和
(b)培养转染的细胞，使该细胞或该细胞的一个或多个后代中所述基因的甲基化状态与未转染细胞中的该基因相比发生改变；其中所述基因选自：PITX2、DNMT3b、IGF2R和SDF4；
其中所述方法不包括加入脱甲基化试剂的步骤。
2.一种制备细胞中某基因甲基化状态改变的后代细胞的方法，该方法包括：
(a)用包含编码Notch胞内结构域序列的多核苷酸转染骨髓粘附性基质细胞；
(b)培养转染细胞；和
(c)从转染细胞的后代中获得其中所述基因甲基化状态改变的一个或多个后代细胞；其中所述基因选自：PITX2、DNMT3b、IGF2R和SDF4；
其中所述方法不包括加入脱甲基化试剂的步骤。
3.一种改变骨髓粘附性基质细胞基因甲基化状态的方法，该方法包括：
(a)用包含编码Notch胞内结构域序列的多核苷酸转染所述细胞；和
(b)培养转染的细胞，使该细胞或该细胞的一个或多个后代中所述基因的甲基化状态与未转染细胞中的该基因相比发生改变；其中所述基因选自：ROPN1L和TMEM179；
其中所述方法不包括加入脱甲基化试剂的步骤。
4.一种制备细胞中某基因甲基化状态改变的后代细胞的方法，该方法包括：
(a)用包含编码Notch胞内结构域序列的多核苷酸转染骨髓粘附性基质细胞；
(b)培养转染细胞；和
(c)从转染细胞的后代中获得其中所述基因甲基化状态改变的一个或多个后代细胞；其中所述基因选自：ROPN1L和TMEM179；
其中所述方法不包括加入脱甲基化试剂的步骤。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述后代细胞中所述基因的甲基化增加。
6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述后代细胞中所述基因的甲基化降低。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，序列C-A-T-C甲基-G-C-C-C转变成C-A-T-C-G-C-C-C。
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Application publication date: 20110420

Assignee: Okonvision biomedical (Shanghai) Co.,Ltd.

Assignor: Aokangweishi biomedical (Hong Kong) Co., Ltd

Contract record no.: X2020990000354

Denomination of invention: Neural regenerating cells with alterations in DNA methylation

Granted publication date: 20140730

License type: Exclusive License

Record date: 20200717

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