CN1020396C - 通过吸附和洗脱从乳清中选择性地提取金属蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
从乳清中选择性提取金属蛋白质的方法,包括在颗粒状无机载体上进行吸附,然后用某些溶液洗脱所吸附的金属蛋白质,其特征在于,所述颗粒的粒壁表面涂布了一层具有酸性官能团的胺化多糖。
Description
本发明涉及一种从乳清中选择性地提取某些蛋白质的方法,即提取金属蛋白质,尤其是结合铁的金属蛋白质,例如乳铁传递蛋白,乳过氧化物酶和铁传递蛋白。
众所周知,蛋白质有好几千种。单是乳清就含有几百种蛋白质,其中有的是微量的金属蛋白质。
所谓“金属蛋白质”,是指对金属特别是对铁具有某种良好亲和性的蛋白质,现在研究这些蛋白质的人愈来愈多了,不仅因为它们具有营养意义,特别是作为生物学方法为乳婴提供铁质(例如乳铁传递蛋白),而且更重要的还在于它们具有药理学特性,特别是作为抗菌剂使用时更是如此。
已知有几种提取乳清蛋白质的方法。
在文献GB-A-871,541中曾建议一般采用离子交换树脂接触法来提取蛋白质,树脂是由一种惰性基质(硅藻土)组成,比表面积大,涂布一种交换剂凝胶(苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)。这种陈旧的技术可以大量地提取蛋白质,但没有选择性。
在文献FR-A-2,505,615(相应于US-A-4,436,658)中,曾建议对所需的乳铁传递蛋白和乳过氧化物酶这些金属蛋白质有选择地提取,办法是先在一种坚硬的固体载体上,例如二氧化硅载体上,在弱碱性介质(pH7.9-8.5)中渗滤乳清,
然后用一种酸性溶液洗脱被吸附的蛋白质。这种方法所得结果极佳,因为这是选择性提取。可是,此方法几乎没有得到发展,因为处理过的乳清立刻变成一种碱性物质,要是以后不做任何昂贵的处理,那么动物是无法食用这种碱性物质的。
在文献FR-A-2,359,634(相应于US-A-4,100,149)中,曾建议使乳清与一种阳离子交换树脂接触来提取蛋白质,树脂是由一种多孔无机载体组成的,粒度适宜(球粒二氧化硅),涂布一层网状人工合成高分子膜,膜上带有诸如羧基,磺基和膦基之类的用酸性官能团表示的阳离子交换基团。这一系统能够回收金属蛋白质,但上面结合着相当大比例的免疫球蛋白(参阅US-A-4,100,149,本专利的实例3和下文的实例7)。此外,金属蛋白质的提取收率低,据认为这些蛋白质的纯度也不够,要是以后不作昂贵的加工处理,则在经济上是不足取的。
在文献FR-A-2,319,299(相应于GB-A-1,544,867和US-A-4,673,734)中,曾主张一般地提取据说有好几千种的蛋白质,办法是把它们与一种多孔无机载体接触,载体表面涂布一层胺化多糖生物高分子。使用这种系统来纯化和分离诸如γ球蛋白、血红蛋白、清蛋白之类的生物大分子会获得极佳的结果,但用在乳清上却是无效的,因为这时结合的只是蛋白质的主要部分,而未结合那些诸如金属蛋白质之类的具有阳离子特征的蛋白质。因此这一技术不适合于从乳清中选择性地分离这些金属蛋白质。
本发明改正了这些缺陷。它涉及一种从乳清中提取金属蛋白质的方法,特别是通过吸附在某些固体载体上,然后再将已吸附的蛋白质进行洗脱,提取结合铁的蛋白质。更为特别的是,本发明涉及这样
一种方法,它具有选择性、经济性,且便于操作,尤其是它能真正选择性地和经济地从乳清中回收金属蛋白质,而不使乳清本身发生改变,就是说使乳清本身完全仍可利用,特别是既可以作为营养素,又可以作为能量供应体用于动物饲料,这些都是人们迄今尚未实现的。
通过把蛋白质吸附于颗粒状多孔无机载体上,然后使用溶液洗脱如此吸附的蛋白质,从乳清中提取这些金属蛋白质的这一方法,其特征在于所述颗粒表面涂布了一层胺化多糖,该多糖具有酸性官能团。
在以后的描述和权利要求书中,我们用“胺化多糖”来表示具有某种阳离子特征的一种胺化的生物高分子,例如葡聚糖、淀粉、纤维素、琼脂糖,以及其它糖类。根据本发明,这些生物高分子还具有一些酸性官能团,特别是具有像羧基或磺基之类的官能团。
换句话说,本发明为了要从已知含有几百种蛋白质的乳清中特异提取金属蛋白质,主要在于选择一种多孔无机载体,例如二氧化硅,其主要特征是,一方面它不是用人工合成高分子涂布的,而是用一种特定的生物高分子,即用一种胺化多糖涂布,而已知(FR-A-2,319,299)这一类型具有阳离子特征的生物高分子是不适用于这类提取的;另一方面,它具有某些酸性基团,而人们从另一文献(FR-A-2,359,634)得知这些酸性基团从工业方面看,所导致的选择性极差,因为回收率和纯度不够。
先有技术迫使人们一度放弃使用某些生物高分子,而本发明恰巧就在这时以完全意料不到的方式证实,利用特异性生物高分子,在这种情况下既然是通过酸性基团键合的,那么它就不仅可以选择性地提取乳清中的金属蛋白质,而且尤其还可以将此金属蛋白质与免疫球蛋
白很好地分开,最后有可能使回收率和蛋白质纯度有明显的改进,且操作条件可与工业加工过程相适合。这一选择尤其出人意料,事实上技术现状丝毫未使专业人员产生把具有阳离子特征的材料和另一种具有阴离子特征的材料结合起来的想法,因为这些特点从本质上说是对立的。
更出人意料的是,人们是用与酸性基团键合的多糖来涂布多孔二氧化硅颗粒才能成功,并且这是为了取得这样一种选择性。而已知具有酸性官能团的这一类型的阳离子交换树脂据说曾一度被拒绝(参阅上文述及的FR-A-2,359,654第1页第17行及下文)作为阳离子交换树脂用于蛋白质(根据失败的技术范畴所作的预测)。
因此,本发明在于一种独具特色的选择,以便在一个大类中进行精确的选择,这样一种选择本可以有利和经济地解决某一个问题,降低制造成本,提高生产力,然而先有技术却迫使人们放弃这样的挑选。
本申请人以一种完全出乎人们意料的方式证实,选择这些特异的多孔无机物颗粒可以:
一方面大大改进提取收率(两倍以上);
另一方面也是更主要的方面,特异地、选择性地并且是方便地从乳清中提取所要的金属蛋白质,同时又不使它与其它蛋白质混合,而提取收率和纯度也有很明显的改进(省时,省力,提高了生产率);
最后是,经过如此处理过的乳清不受影响,仍完全适于食用,保存了全部的营养价值。
这种选择还可以在接近中性PH的条件下操作,特别是可以在允
许选择性地和经济地收集所述的可溶状态金属蛋白质的某些条件下操作。
可以认为本发明中的选择是先有技术的综合。这些技术一方面是相互对立的,另一方面也是更重要的方面,已知某种化学产品不是它的不同组分的混合物。
实际操作时优先使用:
涂布无机物颗粒表面的多糖是葡聚糖或葡聚糖衍生物,例如一种胺化衍生物;
最好使用二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE)型的化合物,分子量至少为104道尔顿,最好为105-106道尔顿;
酸性基团是羧基或磺基;这些酸性基团最好通过二价烃基结合于糖类生物高分子上,尤其是通过诸如亚甲基或亚丙基之类的亚烷基结合于糖类生物高分子上。
多孔无机物颗粒优先采用无机氧化物,例如最好采用二氧化硅球形颗粒,特别是经过热解获得的二氧化硅形颗粒,特别是经过热解获得的二氧化硅球粒;
二氧化硅颗粒采用的是球粒,其特征为:
·粒度在10-1000μm之间,最好在100-300μm之间;
·比表面积在1-400m2/g之间,最好在15-200m2/g之间;
·平均孔径在5-200nm之间;
在一个变式中,处理乳清时,首先使它流经上文谈及的第一组型号的二氧化硅颗粒,此第一组型号含有弱阳离子交换剂酸性基团,特别是羧基,这是为了截留乳铁传递蛋白;然后在第二阶段将处理过
的乳清分批地流经第二组型号的二氧化硅颗粒,此第二组型号含有强阳离子交换剂酸性基团,特别是磺酸基团,这是为了截留乳过氧化物酶;
乳清是一种新鲜乳清,就是说,其pH值在6.3-6.6之间;在一个变式中,可以使用一种酸性乳清,就是说,其pH值在4.3-4.6之间。
用于实施本发明的方法,以及由此而显示出的优点都将在下文叙述的已实现的实例中一再得到重复,下列实例有示范意义,但无限制性,附图则简要表示了一种适于实施本发明方法的装置。
实例一:
在贮罐(1)中盛入400升干酪制备过程中得到的新鲜乳清(2)(pH6.4)。轻轻搅拌使之均匀。按已知方法将此乳清重新冷却至3-8℃之间。此乳清(2)约含有74.6mg/l乳铁传递蛋白和50.5mg/l乳过氧化物酶。
在另一贮罐(3)中盛入20升第一种溶液(4),此溶液约含有3g/l氯化钠(pH中性)。
将4千克多孔二氧化硅球状颗粒(6)装入柱(5),这种颗粒是IBF-Biotechnics公司销售的,注册商标为“CM-SPHERODEX-LS”,粒度在100-300μm之间,孔径约为100nm,比表面积约为25m2/g,孔壁涂布一层薄薄的不留空隙的二乙氨基乙基葡聚糖,它具有羧酸基团。
在第一阶段首先使贮罐(1)中的乳清(2)用4.5小时的时间流经二氧化硅(6)。
把处理过的乳清(7)收集到另一个贮罐(8)中,然后把它泵
入(9)中按常规法进行浓缩和干燥处理。这种pH未发生变化的乳清仍然含有大部分蛋白质。这样便可以将它用于动物饲料,作为营养添加剂使用。
一旦所有的乳清(2)通过了二氧化硅(6),开启阀门(10),以便将20升第一种中性pH的洗涤溶液(4)送至吸附柱中,用左上角编号(11)表示。
二氧化硅(6)已吸附乳清(2)中的所需的金属蛋白质。
一旦洗涤溶液(4)通过柱,即往贮罐(3)泵入15升第二种盐溶液(12),每升溶液含氯化钠13克。
待到此第二种溶液(12)自由地流过吸附柱(11),再开启阀门,把洗涤液收集到水槽(14)中。随后使用14升第三种盐溶液(32)洗涤被吸附的二氧化硅(6,11),此第三种盐溶液来自贮罐(3),每升溶液含氯化钠45克。将它们回收在另一个水槽(15)内。
将水槽(14)中的溶液移入到另一个水槽(20)内,然后再从那里移入一个超滤器(21)中,超滤器内注入一部分透析水(31)以便减小矿物质含量。使内容物流经有机膜(33),膜孔径相应于104道尔顿,温度在12-50℃之间。
然后将水槽(15)中的内容物移入水槽(20)中,方法同上。
把得到的渗透液回收到(34)中,用于在其它洗脱步骤中重新利用。
截留物(22)在超滤器(21)的出口回收。借助一个阀门(23)可以将这些截留物移到:
冷冻干燥器(24),从中回收到大量所需的金属蛋白质;
干燥塔(35),从中也回收到大量所需的金属蛋白质;
最好是一种分级分离装置(25),在IBF BIOTECHNIX公司出售的,注册商标为“SP-TRISACRYL LS”市售型号的有机凝胶上进行离子交换层析,把所需的两种蛋白质进行分级分离,它们分别是乳铁传递蛋白(26)和乳过氧化物酶(27)。
随后用来自贮罐(3)的水(29)洗涤二氧化硅(6)。经过这次洗涤后,再进行一次酸洗(1/10N盐酸溶液)。最后通过用20升pH5.5的醋酸钠溶液渗滤,使二氧化硅(6)再生。
于是,从初始的400升乳清(2)中得到:
一方面,几乎400升乳清提取液,适合直接用于动物饲料中,它保存有全部的营养价值;
另一方面:
·23·6克乳铁传递蛋白,即79%的提取比率,其纯度与此溶液中的其它蛋白质比较,至少为80%;
·2·8克乳过氧化物酶,即14%的提取比率,其纯度高于50%。
实例二:
重复实例一,在透析水(31)中加入2g/l用抗坏血酸稳定的硫酸亚铁铵。这样便使所需的蛋白质达到铁饱和状态,这就提高了蛋白质的营养功效。
实例三:
重复实例一,并做下列变动。
首先是不用二氧化硅(6),而用注册商标为
SP-SPHERODEX-LS的市售型号的多孔二氧化硅颗粒,用量相同,颗粒壁涂布一层二乙氨基乙基葡聚糖,它是用磺基丙基键合的,其物理性质接近实例一的颗粒。
处理306升来自干酪制备过程的新鲜乳清,pH为6.4,含乳铁传递蛋白46.2mg/l和乳过氧化物酶44.7mg/l。把流量调至100升/小时。在贮罐(3)中盛入17升含氯化钠3g/l的第一种溶液(4)。
洗脱液(12)由28升盐溶液组成,氯化钠浓度为15g/l,此洗脱液能回收1.23克乳铁传递蛋白和0.6克乳过氧化物酶于(14)中。
第二种洗脱液(32)由27升浓度为45g/l氯化钠的溶液组成,此洗脱液能回收2.7克乳铁传递蛋白和5.1克乳过氧化物酶于(15)中。
最后,用另一种洗脱液(30)处理,它由21升浓度为60克/升的氯化钠溶液组成。获得4.0克乳铁传递蛋白。
于是就能回收:
·7.93克乳铁传递蛋白(收率为57%)
·5.7克乳过氧化物酶(收率为42%)
实例四:
重复实例一,不用干酪制造中的新鲜乳清,代替它的是198升pH4.5的酪蛋白生产中的酸性乳清,乳铁传递蛋白的含量为84.0mg/l,乳过氧化物酶含量为37.0mg/l。
乳清在含羧基的二氧化硅颗粒上面的流量调至100升/小时。
同前,用20升氯化钠浓度为3g/l的溶液(4)洗涤。
第一次洗脱(12)用20升氯化钠浓度为15g/l的溶液进行。获得2.08克乳铁传递蛋白和1.6克乳过氧化物酶。
第二次洗脱(32)用31升氯化钠浓度为45g/l的溶液进行。获得3.7克乳铁传递蛋白。
于是回收到:
·5.78克乳铁传递蛋白(收率为35%),
·1.6克乳过氧化物酶(收率为22%)。
实例五:
重复实例三,用180升酪蛋白生产中的pH4.5的酸性乳清,乳铁传递蛋白的含量为87mg/l,乳过氧物化酶含量为33mg/l。
含盐洗涤液(4)的氯化钠浓度为3g/l,共12升。
第一次洗脱(12)用38升氯化钠浓度为15g/l的溶液进行。获得1.3克乳铁传递蛋白和0.16克乳过氧化物酶。
第二次洗脱(32)用28升氯化钠浓度为45g/l的溶液进行。获得3.0克乳铁传递蛋白和3.9克乳过氧化物酶。
于是便回收到:
·4.3克乳铁传递蛋白(收率为27%),
·4.06克乳过氧化物酶(收率为69%)。
实例六:
这个实例说明按本发明所进行的一种处理,即使同一乳清流经两个串联的柱,每个柱各含一种不同型的二氧化硅颗粒,粒壁涂布了一层胺化多糖。
第一个柱含有4千克与实例一相同的(羧基)CM SPHERODEX
LS二氧化硅颗粒,用2.5小时渗滤250升干酪制造中的新鲜乳清,乳清中的乳铁传递蛋白含量为81.5mg/l,乳过氧化物酶的含量为52.0mg/l。
把经过如此处理的乳清盛入一个适当的贮罐内,然后用15升氯化钠浓度为3g/l的水溶液(4)洗涤二氧化硅(6,11)。
接着先用15升氯化钠浓度为13g/l的第一种溶液(12)洗脱,所收集的溶液中含1.87克乳过氧化物酶和0.85克乳铁传递蛋白,然后再用16升氯化钠浓度为45g/l的溶液进行第二次洗脱(32),这时就可以收集到19.0克乳铁传递蛋白。
如此收集到:
·19.85克乳铁传递蛋白(收率为98%)
·1.87克的乳过氧化物酶(收率为14%)。
第二个柱盛有2.5千克与实例三相同的SP SPHERODEX LS颗粒(磺基丙基),用此柱渗滤250升经处理过的贮存乳清,乳清的流量为100升/小时。
这种乳清实际上不再含有乳铁传递蛋白,但还含有乳过氧化物酶,含量为42.1mg/l。
经过渗滤后,用20.5升氯化钠浓度为3g/l的溶液洗柱。
然后再用37升氯化钠浓度为15g/l的溶液洗脱,获得1.7克乳过氧化物酶。
接着用18升氯化钠浓度为45g/l的溶液洗脱,获得9.3克乳过氧化物酶。
结果,第二次处理获得11克乳过氧化物酶,几乎等于初始乳清中的总量(每升含13克中就被洗脱出11+1.87=12.87克)。
换言之,在两种型号不同的二氧化硅颗粒上连续两次乳清渗滤操作,有可能从初始乳清中提取到几乎全部的乳铁传递蛋白和乳过氧化物酶。
实例七:
重复实例一,不用“CM-SPHERODEX-LS”二氧化硅,代替它的是一种“亲水性的”多孔二氧化硅,其物理性质与实例一所示相同。在这种亲水性多孔二氧化硅上涂布着一层键合了羧甲基酸性基团的人工合成丙烯聚合物,符合序言中提到的FR-A-2,359,634的技术。
用300升pH6.4的新鲜乳清流过2.5千克的这种二氧化硅,流量为75升/小时,乳清中乳铁传递蛋白含量为50.2mg/l,乳过氧化物酶含量为33.8mg/l。
洗脱后,获得:
一方面,300升乳清(9),可用作供家畜食用的营养素;
另一方面:
·120克各类蛋白质,主要含有免疫球蛋白,
·7.1克乳铁传递蛋白(对照实例-79%的收率,此处为47%),对照80%的纯度,此处为不足40%,
·0.9克乳过氧化物酶(对照14.9%的收率,此处为9%),对照实例-50%的纯度,此处的纯度低于30%。
这样,这种乳铁传递蛋白和这种乳过氧物化酶便与比例颇大的免疫球蛋白混合在一起,因此,必须把它们分离开来。
换言之,这种先有技术用于金属蛋白质时,不仅收率明显低,而且这些金属蛋白质的纯度也较差,于是这就需要以后进行一些纯化操
作。
实例八:
重复实例一,使用与实例1相同的多孔二氧化硅,但涂布的是IBF-BIOTECHNICS公司销售的二乙氨基乙基葡聚糖膜,商品名为DEAE SPHERODEX-LS(专利US-A-4,673,734的技术)。
乳清中的主要蛋白质部分被结合,不包括所要的乳铁传递蛋白和乳过氧化物酶,它们是与乳清(9)一起流走的。
最后这两个实例很好地说明,按本发明所做的选择有出人意料的效果。
利用涂布了一种胺化的但没有被键合的生物高分子,就得不到所需结果,即不能特异地提取乳铁传递蛋白和乳过氧化物酶。
这样,二氧化硅球粒虽然相同,但这里用的球粒上面涂布了一层具有酸性官能团的人工合成高分子,使用这些二氧化硅球粒就可以收集到金属蛋白质,但结合有其它蛋白质,收率和纯度也都明显不够(参阅上文实例七)。
本发明的提取乳铁传递蛋白和乳过氧化物酶的方法,与迄今所提出的方法是不同的,其区别主要表现在:
选择性地提取这两种蛋白质,这是一直难以提取的,因为这类蛋白质的数量极少,而且是与其它蛋白质混合在一起的;
操作简便;
提取收率特别高,与先有技术收率相比,差不多高出两倍(主要参阅实例七和八)。
提取到的金属蛋白质纯度高,无疑这是由于提取的特异性较高。
这样回收的金属蛋白质,即主要是如乳铁传递蛋白和乳过氧化物
酶这样的结合铁的金属蛋白质,可以成功地用于已知的应用中,例如:
动物营养,以保护消化道和起到生长因子的作用;
兽医领域,有抗肠道和乳房感染的活性;
人类饮食和营养,主要起运载铁的作用;
制药领域:眼科学、胃肠学、牙科学、皮肤病学、妇科学等。
Claims (17)
1、从乳清中选择性地提取金属蛋白质的方法,其中在一种颗粒状多孔无机载体上进行吸附,然后用溶液洗脱所吸附的金属蛋白质,其特征在于,所述颗粒的粒壁表面涂布了一层具有酸性官能团的胺化多糖。
2、权利要求1的方法,其特征在于涂布无机颗粒壁的多糖生物高分子是葡聚糖。
3、权利要求2的方法,其特征在于葡聚糖是二乙氨基乙基葡聚糖。
4、权利要求1-3中任一项的方法,其特征在于酸性基团是羧基或磺酸基。
5、权利要求4的方法,其特征在于酸性基团是通过二价烃基结合在糖类生物高分子上。
6、权利要求5的方法,其特征在于二价烃基是亚烷基。
7、权利要求1-3中任一项的方法,其特征在于多孔无机颗粒是二氧化硅球粒,其性质如下:
粒度在10-1000μm之间;
比表面积在1-400m2/g之间;
平均孔径在5-200nm之间。
8、权利要求4的方法,其特征在于多孔无机颗粒是二氧化硅球粒,其性质如下:
粒度在10-1000μm之间;
比表面积在1-400m2/g之间;
平均孔径在5-200nm之间。
9、权利要求5的方法,其特征在于多孔无机颗粒是二氧化硅球粒,其性质如下:
粒度在10-1000μm之间;
比表面积在1-400m2/g之间;
平均孔径在5-200nm之间。
10、权利要求6的方法,其特征在于多孔无机颗粒是二氧化硅球粒,其性质如下:
粒度在10-1000μm之间;
比表面积在1-400m2/g之间;
平均孔径在5-200nm之间。
11、权利要求1-3中任一项的方法,其特征在于,处理乳清,首先使之流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了一层具有羧基的胺化多糖;其特征还在于经过如此处理过的乳清,批量地流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了另一层表面具有磺酸基的胺化多糖。
12、权利要求5的方法,其特征在于,处理乳清,首先使之流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了一层具有羧基的胺化多糖;其特征还在于经过如此处理过的乳清,批量地流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了另一层表面具有磺酸基的胺化多糖。
13、权利要求6的方法,其特征在于,处理乳清,首先使之流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了一层具有羧基的胺化多糖;其特征还在于经过如此处理过的乳清,批量地流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了另一层表面具有磺酸基的胺化多糖。
14、权利要求7的方法,其特征在于,处理乳清,首先使之流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了一层具有羧基的胺化多糖;其特征还在于经过如此处理过的乳清,批量地流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了另一层表面具有磺酸基的胺化多糖。
15、权利要求9的方法,其特征在于,处理乳清,首先使之流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了一层具有羧基的胺化多糖;其特征还在于经过如此处理过的乳清,批量地流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了另一层表面具有磺酸基的胺化多糖。
16、权利要求10的方法,其特征在于,处理乳清,首先使之流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了一层具有羧基的胺化多糖;其特征还在于经过如此处理过的乳清,批量地流经二氧化硅颗粒,粒壁表面涂布了另一层表面具有磺酸基的胺化多糖。
17、权利要求1的方法,其特征在于乳清是新鲜乳清。
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