CN102154391B - 脂肪分解酶及其在食品工业中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可从喜热裂孢菌属(Thermobifida)得到的脂肪分解酶在各种方法和用途中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂或磷脂或者将酰基从糖脂或磷脂转移至酰基受体。优选地，应用于这些方法和用途中的脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.5、7或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列，或包含SEQ ID No.6或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列。

Description

脂肪分解酶及其在食品工业中的应用
本申请是申请日为2005年7月18日、发明名称为“脂肪分解酶及其在食品工业中的应用”的中国专利申请200580024003.8的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的脂肪分解酶，特别是新的脂肪分解酶，和编码它的核苷酸序列。本发明还涉及新的脂肪分解酶的制备方法及其应用。本发明还涉及脂肪分解酶的方法及应用。
背景技术
EP 1 193 314中教导了对糖脂有活性的脂肪分解酶在面包制作中的有益应用。教导了，发现部分水解产物溶血糖脂具有很高的乳化剂功用。可是，也发现EP 1 193 314中教导的酶对甘油三酯具有显著的非选择性活性，会造成不必要的高游离脂肪酸。
EP 0 869 167中教导了来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)的具有磷脂酶活性的脂肪分解酶。该脂肪分解酶具有高的三酰基甘油酯水解(脂肪酶)活性。该酶现在由NovozymesA/S(丹麦)以Lipopan FTM来销售。
WO02/00852披露了五种脂肪酶和它们的编码多核苷酸，它们分离自Fusarium venenatum、F.sulphureum、Aspergillus berkeleyanum、黄色镰孢(F.culmorum)和腐皮镰孢(F.solani)。所有五种酶据说具有三酰甘油水解活性、磷脂酶和半乳糖脂酶活性。
已经生成了带有特定氨基酸替代和融合的脂肪分解酶变体；其中一些与野生型亲本酶相比，对极性脂质具有增强的活性。WO01/39602记载了这样一种变体，其称为SP979，是Thermomyces lanuginosus脂肪酶和EP 0 869167中记载的尖镰孢脂肪酶的融合物。已经发现该变体对磷脂和糖脂具有与甘油三酯相比显著高比率的活性。
WO02/094123中发现了，通过选择对生面团中的极性脂质(糖脂和磷脂)有活性但对甘油三酯或1-单-甘油酯基本上无活性的脂肪分解酶，可获得改良的功用。
在共同未决的PCT申请PCT/IB2005/000875中教导了，与甘油三酯相比，对极性脂质具有更高比率活性的野生型脂肪分解酶。可是，该文献没有教导来自链霉菌属(Streptomyces)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)或棒杆菌属(Corynebacterium)物种的脂肪分解酶。
在本发明之前，没有公开过来自链霉菌属菌种的对糖脂具有活性或显著活性的脂肪分解酶。同样，没有公开过来自喜热裂孢菌属物种或棒杆菌属物种的对糖脂具有活性或显著活性的脂肪分解酶。尽管已经从链霉菌属菌种中分离到了脂肪酶，即三酰甘油水解酶(参见例如Vujaklija等，ArchMicrobiol(2002)178：124-130)，这些酶从未鉴定为具有糖脂水解活性。
发明内容
本发明依据来自链霉菌属的具有显著半乳糖脂活性的脂肪分解酶的重大发现。具体而言，来自链霉菌属的脂肪分解酶具有显著的半乳糖脂水解活性和/或显著的半乳糖脂酰基转移酶活性，特别是在应用于根据本发明的方法和用途时。
另外，本发明依据来自喜热裂孢菌属或棒杆菌属的具有显著半乳糖脂活性的脂肪分解酶的重大发现。具体而言，来自喜热裂孢菌属或棒杆菌属的脂肪分解酶具有显著的半乳糖脂水解活性和/或显著的半乳糖脂酰基转移酶活性，特别是在应用于本发明的方法和用途时。
在一个广的方面，本发明涉及至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从链霉菌属菌种得到的。
在另一方面，本发明涉及至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶由选自下组的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；
b)因遗传密码简并而与SEQ ID No.3的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
本发明还进一步提供包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一方面，本发明提供至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQID No.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供编码脂肪分解酶的核酸，该脂肪分解酶包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
SEQ ID No.3如图3所示，而SEQ ID No.4如图4所示。
本发明还进一步提供编码脂肪分解酶的核酸，该核酸选自下组：
a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；
b)因遗传密码简并而与SEQ ID No.3的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
本发明还进一步提供根据本发明的脂肪分解酶在用于制备溶血糖脂，例如二半乳糖苷甘油单酯(DGMG)或单半乳糖苷甘油单酯(MGMG))的底物(优选食品)中的应用，其用根据本发明的脂肪分解酶处理糖脂(如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或单半乳糖苷甘油二酯(MGDG))来产生部分水解产物，即溶血糖脂。
在另一方面，本发明提供根据本发明的脂肪分解酶在用于制备溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的底物(优选食品)中的应用，其用根据本发明的酶处理磷脂(如卵磷脂)来产生部分水解产物，即溶血磷脂。
在一个广的方面，本发明涉及制备食品的方法，该方法包括将本发明的脂肪分解酶与食品的一种或多种成分混合。
本发明的另一个广的方面涉及由生面团制备焙烤品的方法，该方法包括将本发明的脂肪分解酶与生面团混合。
在另一方面，本发明涉及制备乳制品的方法，该方法包括将本发明的脂肪分解酶与乳制品的一种或多种成分混合。
在另一方面，本发明涉及本发明的脂肪分解酶在制备乳制品中的应用，以降低一种或多种以下有害效应：臭味和/或异味和/或油腻口味。
在本发明的另一方面，提供根据本发明的脂肪分解酶在处理蛋或基于蛋的产品中的应用，以产生溶血磷脂。
在本发明的另一方面，提供根据本发明的脂肪分解酶在处理蛋或基于蛋的产品中的应用，以产生溶血糖脂。
本发明的另一方面提供植物或食用油的酶促脱胶方法，其包括用根据本发明的脂肪分解酶处理所述食用或植物油，从而水解极性脂质(如磷脂和/或糖脂)的主要部分。
在另一方面，本发明提供根据本发明的脂肪分解酶在包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的方法中的应用。
在另一方面，本发明提供根据本发明的脂肪分解酶在用于降低食用油中磷脂含量的方法中的应用，其包括用根据本发明的脂肪分解酶处理所述油，从而水解磷脂的主要部分，并将含水解磷脂的水相与油分开。
还提供了制备根据本发明的脂肪分解酶的方法，该方法包括用包含编码脂肪分解酶的核苷酸序列的重组核酸转化宿主细胞，该宿主细胞能表达编码脂肪分解酶多肽的核苷酸序列，在核酸表达的条件下培养经转化宿主细胞并收获脂肪分解酶。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的脂肪分解酶在生物转化极性脂质(优选糖脂)以制造高价值产品，诸如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟酸酯中的应用。
本发明的另一方面涉及根据本发明的脂肪分解酶在植物或食用油的酶促脱胶方法中的应用，其包括用所述脂肪分解酶处理所述食用或植物油，从而水解极性脂质的主要部分。
本发明的另一方面涉及根据本发明的脂肪分解酶在包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的方法中的应用。
本发明还进一步涉及根据本发明的固定化的脂肪分解酶。
本发明的另一方面涉及制备溶血糖脂的方法，其包括用至少一种脂肪分解酶处理含糖脂的底物来产生所述溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明的另一方面涉及制备溶血磷脂的方法，其包括用至少一种脂肪分解酶处理含磷脂的底物来产生所述溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明的另一方面涉及植物或食用油的酶促脱胶方法，其包括用可从以下属之一得到的能水解极性脂质主要部分的脂肪分解酶处理所述食用或植物油：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明还涉及生物转化极性脂质以制造高价值产品的方法，其包括用可从以下属之一得到的脂肪分解酶处理所述极性脂质来产生所述高价值产品：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属，其中所述脂肪分解酶能水解所述极性脂质。
本发明的另一方面涉及制备食品的方法，其包括将至少一种脂肪分解酶与食品的一种或多种成分混合，其中所述脂肪分解酶能将存在的糖脂和/或磷脂水解进或成至少一种所述成分，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明的另一方面涉及脂肪分解酶在用于制备溶血磷脂的底物中的应用，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明另外涉及可从以下属之一得到的脂肪分解酶用于植物或食用油的酶促脱胶从而水解极性脂质主要部分的应用：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明的另一方面涉及可从以下属之一得到的脂肪分解酶在包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的方法中的应用：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明的另一方面涉及脂肪分解酶在生物转化极性脂质以制造高价值产品中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解所述极性脂质，且其中所述脂肪分解酶可从以下属之一得到：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明的另一方面涉及可从以下属之一得到的脂肪分解酶在制备食品中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂和/或磷脂：链霉菌属、棒杆菌属和喜热裂孢菌属。
本发明的各方面出现在权利要求中以及以下注释中。
关注可用于本发明的核苷酸序列的其它方面包括：包含本发明的序列的构建物；包含本发明中应用的序列的载体；包含本发明中应用的序列的质粒；包含本发明中应用的序列的转化细胞；包含本发明中应用的序列的转化组织；包含本发明中应用的序列的转化器官；包含本发明中应用的序列的转化宿主；包含本发明中应用的序列的转化生物体。本发明还涵盖利用本发明中应用的核苷酸序列来表达它的方法，诸如在宿主细胞中表达；包括转移它的方法。本发明进一步涵盖分离核苷酸序列的方法，诸如从宿主细胞分离。
关注可用于本发明的氨基酸序列的其它方面包括：编码本发明中应用的氨基酸序列的构建物；编码本发明中应用的氨基酸序列的载体；编码本发明中应用的氨基酸序列的质粒；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化细胞；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化组织；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化器官；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化宿主；表达本发明中应用的氨基酸序列的转化生物体。本发明还涵盖利用本发明中应用的氨基酸序列来纯化它的方法，诸如在宿主细胞中表达；包括转移它且然后纯化所述序列的方法。
为了便于参考，现在在合适的小节标题下论述本发明的这些和其它方面。可是，每个小节下的教导不必局限于每个特定的小节。
具体实施方式
适宜地，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码的脂肪分解酶。
优选地，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从链霉菌属菌种得到的。
在一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶优选是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶由选自下组的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；
b)因遗传密码简并而与SEQ ID No.3的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶优选是包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶优选是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
优选地，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从喜热裂孢菌属物种，优选褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)得到的。
优选地，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从棒杆菌属物种，优选Corynebacterium efficiens得到的。
在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码的脂肪分解酶。
在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是用于本文所述用途的包含SEQ ID No.5、7、8、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。
在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是用于本文所述用途的包含SEQ ID No.5、7或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。
更优选地，在一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ.ID.No.16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ.ID.No.12或14所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在一个实施方案中，用于根据本发明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶由选自下组的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；
b)因遗传密码简并而与SEQ ID No.3的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，根据本发明的脂肪分解酶可以是可从，优选就是从链霉菌属菌株L130或L131得到的，根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约，它们于2004年6月23日由Danisco A/S(Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，丹麦)保藏于国家工业、海洋和食品细菌保藏中心(NCIMB)(23 St Machar Street，Aberdeen Scotland，GB)，编号分别为NCIMB 41226和NCIMB 41227。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶至少作用于糖脂，诸如例如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)。适宜地，根据本发明的脂肪分解酶还可作用于一种或多种其它极性脂质底物，诸如磷脂，例如卵磷脂，如磷脂酰胆碱。
本文中所用的术语“能水解糖脂”的可选表述方式可以说成脂肪分解酶具有糖脂水解活性。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶水解糖脂，诸如例如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)，而且也水解磷脂，诸如卵磷脂，如磷脂酰胆碱。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶作用于糖脂，诸如DGDG或MGDG。
在一个方面，根据本发明的脂肪分解酶将DGDG水解成DGMG和/或将MGDG水解成MGMG。
在一个方面，根据本发明的脂肪分解酶将卵磷脂水解成溶血卵磷脂。
在脂肪分解酶至少能将酰基从糖脂转移至供体底物的情况中，极性脂质底物在本文中可称为“脂质酰基供体”。
在一个实施方案中，根据本发明的酶既具有磷脂酶和/或糖脂酶活性(根据国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会的酶命名法建议(1992)，通常归入E.C.3.1.1.26；E.C.3.1.1.4或E.C.3.1.1.32)，又具有酰基转移酶活性(通常归入E.C.2.3.1.x)，由此该酶能将酰基从脂质酰基供体转移至一种或多种受体底物，诸如以下一种或多种：甾醇；甾烷醇(stanol)；碳水化合物；蛋白质；蛋白质亚基；甘油。
共同未决的国际专利申请PCT/IB2004/000655中教导了脂质酰基转移酶及其应用。将该文件引入本文作为参考。可是，PCT/IB2004/000655中没有教导根据本发明来自链霉菌属的脂肪分解酶。
在有些方面，应用于本发明的方法和/或应用中的脂肪分解酶可能能将酰基从极性脂质(如本文所定义的)转移至一种或多种以下酰基受体底物：甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质或其亚基、或甘油。
对于有些方面，根据本发明的“酰基受体”可以是包含羟基(-OH)的任何化合物，诸如例如多元醇，包括甘油；甾醇；甾烷醇；碳水化合物；羟酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白质或其亚基，诸如例如氨基酸、蛋白质水解产物和肽(部分水解的蛋白质)；及其混合物和衍生物。
在有些方面，根据本发明的“酰基受体”可优选不是水。
在一个实施方案中，酰基受体优选不是甘油单酯和/或甘油二酯。
在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至甾醇和/或甾烷醇。
在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至碳水化合物。
在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至蛋白质或其亚基。适宜地，蛋白质亚基可以是以下一种或多种：氨基酸、蛋白质水解产物、肽、二肽、寡肽、多肽。
适宜地，在蛋白质或蛋白质亚基中，酰基受体可以是一种或多种以下蛋白质或蛋白质亚基成分：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸。
当蛋白质亚基是氨基酸时，适宜地，氨基酸可以是任何合适的氨基酸。适宜地，氨基酸可以是例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸中的一种或多种。
在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至甘油。
在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至羟酸。
在一个方面，优选该酶能将酰基从脂质转移至多元醇。
在一个方面，脂肪分解酶可能既能将酰基从脂质转移至甾醇和/或甾烷醇，又能将酰基从脂质转移至以下一种或多种：碳水化合物、蛋白质、蛋白质亚基、甘油。
本文中所用的术语卵磷脂涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
对于有些方面，优选脂质底物至少是糖脂，诸如例如DGDG。
对于有些方面，优选脂质底物也可以是磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。根据本发明的其它磷脂底物可以是N酰基磷脂酰乙醇胺(APE)或N酰基溶血磷脂酰乙醇胺(ALPE)中的一种或多种。
优选脂质底物是食物脂质，也就是说是食品的脂质成分。
对于有些方面，优选根据本发明的脂肪分解酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯。
在一个实施方案中，根据本发明的脂肪分解酶对甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯无活性或无显著活性。
适宜地，脂质底物或脂质酰基供体可以是一种或多种以下底物中存在的一种或多种脂质：脂肪，包括猪油、牛脂和黄油脂肪；油，包括提取自或衍生自棕榈油、向日葵油、大豆油、红花油、棉籽油、落花生油、玉米油、橄榄油、花生油、椰子油和油菜籽油的油。来自大豆、油菜籽或蛋黄的卵磷脂也是合适的脂质底物。脂质底物可以是燕麦脂质或其它基于植物的含半乳糖脂的材料。
在一个方面，脂质底物或脂质酰基供体优选是蛋黄中的卵磷脂(诸如磷脂酰胆碱)。
对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有8至22个碳的脂肪酸链长度的脂质。
对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有16至22个碳的脂肪酸链长度的脂质，更优选16至20个碳。
对于本发明的有些方面，脂质可以选自具有不超过14个碳的脂肪酸链长度的脂质，适宜地选自具有4至14个碳的脂肪酸链长度的脂质，适宜地4至10个碳，适宜地4至8个碳。
适宜地，根据本发明的脂肪分解酶至少展现糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。适宜地，根据本发明的脂肪分解酶也可展现磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。
对于有些方面，根据本发明的脂肪分解酶可只具有糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。
对于有些方面，根据本发明的脂肪分解酶是半乳糖脂酶(E.C.3.1.1.26)。可是，酶定为半乳糖脂酶的事实并不妨碍其具有其它附带活性，诸如针对例如其它极性脂质的活性。
本文中所用的术语“糖脂酶活性”和“半乳糖脂酶活性”可互换使用。
适宜地，对于有些方面，根据本发明的脂肪分解酶可能能将酰基从糖脂和/或磷脂转移至一种或多种受体底物。
适宜地，受体底物可以是一种或多种以下底物：甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质、甘油。
本文中所用的术语“极性脂质”指磷脂和/或糖脂。在有些方面，术语极性脂质优选至少指糖脂。
酶的糖脂酶活性；磷脂酶活性和/或三酰甘油脂肪酶活性可用下文介绍的测定法来测定。
半乳糖脂酶活性的测定(糖脂酶活性测定法(GLU-7))：
底物
将0.6％二半乳糖苷甘油二酯(Sigma D 4651)、0.4％Triton-X 100(SigmaX-100)和5mM CaCl2溶于pH 7的0.05M HEPES缓冲液。
测定流程：
将400μL底物加到1.5mL Eppendorf管中并在Eppendorf热混合器中于37℃放置5分钟。在时间t＝0分钟时，加入50μL酶溶液。用水代替酶来进行空白分析。将样品在Eppendorf热混合器中于37℃以10x100rpm混合10分钟。在时间t＝10分钟时，将Eppendorf管在另一个热混合器中于99℃放置10分钟，以终止反应。
使用WAKO GmbH的NEFA C试剂盒来分析样品中的游离脂肪酸。
根据在测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔量，计算在pH 7的酶活性GLU。
磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性测定法(PLU-7))：
底物
将0.6％L-α磷脂酰胆碱，95％植物(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2散布于pH 7的0.05M HEPES缓冲液。
测定流程：
将400μL底物加到1.5mL Eppendorf管中并在Eppendorf热混合器中于37℃放置5分钟。在时间t＝0分钟时，加入50μL酶溶液。用水代替酶来进行空白分析。将样品在Eppendorf热混合器中于37℃以10x100rpm混合10分钟。在时间t＝10分钟时，将Eppendorf管在另一个热混合器中于99℃放置10分钟，以终止反应。
使用WAKO GmbH的NEFA C试剂盒来分析样品中的游离脂肪酸。
根据在测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔量，计算在pH 7的酶活性PLU-7。
三酰甘油酯脂肪酶活性的测定：基于甘油三酯(三丁精)作为底物的的测定法(LIPU)：
基于三丁精的脂肪酶活性根据Food Chemical Codex(第四版，NationalAcademy Press，1996，p 803)来测量。其中的改变是，将样品溶于去离子水来代替甘氨酸缓冲液，而pH计设置点为5.5来代替7。
1LIPU定义为在测定条件下每分钟能释放出1微摩尔丁酸的酶量。
在一个实施方案中，优选根据本发明的脂肪分解酶是野生型脂肪分解酶。
本文中所用的术语“天然”和“野生型”指天然存在的酶。也就是说是，由内源遗传密码表达和从其内源宿主生物体中分离的酶，和/或与内源产生的成熟蛋白质序列(在共翻译和翻译后切割事件之后)相比尚未突变(即不含氨基酸删除、添加或替代)的异源产生的酶。本发明的天然和野生型蛋白质可由为了异源表达而优化了密码子的多核苷酸编码，而且也可包含为了在该宿主中表达而选择的非内源信号肽。
本文中所用的术语“变体”指由非内源遗传密码表达的蛋白质，其造成与天然或野生型序列相比成熟蛋白质序列内的一个或多个氨基酸改变(即氨基酸删除、添加或替代)。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶是可从(适宜地，可以是从)细菌得到的。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶可以是可从(优选从)链霉菌属菌种得到的。优选地，根据本发明的脂肪分解酶可以是可从(优选从)链霉菌属菌株L131或链霉菌属菌株L130得到的。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶包含与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少98％、优选至少99％同一性的氨基酸序列。
优选地，编码根据本发明的脂肪分解酶的核酸包含与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少98％、优选至少99％同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，酶对半乳糖脂底物的最优pH适宜地是约6-8，优选约6.5-7.5，更优选约7。
适宜地，根据本发明的脂肪分解酶可不受小麦粉中存在的脂肪酶抑制剂的抑制或显著抑制。本文中所用的术语“不受显著抑制”指根据本文中定义的标准磷脂酶(PUU-T)测定法，与LipopanFTM(NovozymesA/S，丹麦)的等效剂量(PLU)相比，酶对小麦粉中存在的脂肪酶抑制剂较不敏感。
适宜地，根据本发明的脂肪分解酶能将底物(即例如食品如生面团中的)中的至少10％半乳糖脂二酯水解成单酯。优选地，酶能将至少20％、更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％半乳糖脂二酯水解成单酯。适宜地，半乳糖脂二酯可以是MGDG或DGDG中的一种或多种，而单酯可以分别是MGMG或DGMG中的一种或多种。
适宜地，根据本发明的脂肪分解酶可分离自链霉菌属菌株L131或链霉菌属菌株L130的发酵液。
适宜地，酶可通过液相色谱来纯化。
纯化的脂肪分解酶的氨基酸序列可通过Edman降解、LC-MS和MALDI-TOF分析来测定。
适宜地，本文中所定义的酶可催化一种或多种以下反应：酯交换(interesterification)、酯转移(transesterification)、醇解、水解。
术语“酯交换”指酶促催化的酰基在脂质供体和脂质受体间的转移，其中脂质供体不是游离酰基。
本文中所用的术语“酯转移”指酶促催化的酰基从脂质供体(除了游离脂肪酸)至酰基受体(除了水)的转移。
本文中所用的术语“醇解”指通过与醇ROH反应来酶促切割酸衍生物的共价键，使得产物之一与醇的H结合而另一种产物与醇的OR基团结合。
本文中所用的术语“醇”指含羟基的烃基化合物。
本文中所用的术语“水解”指酶促催化酰基从脂质至水分子OH基团的转移。水解造成的酰基转移需要解离水分子。
本文中所用的术语“食品”指适合人和/或动物消费的物质。
适宜地，本文中所用的术语“食品”可指做好消费准备的形式的食品。可是，或者/另外，本文中所用的的术语食品可指用于制备食品的一种或多种食物材料。仅作为示例，术语食品涵盖由生面团产生的焙烤品以及用于制备所述焙烤品的生面团。
在一个优选的方面，本发明提供上文定义的食品，其中所述食品选自以下一种或多种：蛋，基于蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱，色拉调味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黄及其制成品；焙烤品，包括面包，蛋糕，甜面团(sweet dough)产品，叠层面团产品(laminated doughs)，液态奶蛋糊，松饼，油炸圈饼，饼干，薄脆饼干和曲奇饼；糖果，包括巧克力，糖果，饴糖，halawa，胶皮糖(gum)，包括无糖和加糖胶皮糖，泡泡糖，软泡泡糖，口香糖和布丁；冷冻产品，包括冰糕，优选冷冻乳制品，包括冰激凌和牛奶冻；乳制品，包括奶酪，黄油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳饮料和酸牛奶；慕思，生植物奶油，肉制品，包括经加工的肉制品；食用油和脂肪，搅打起泡和不起泡的产品，水包油乳状液，油包水乳状液，人造黄油，起酥油和涂抹物，包括低脂肪的和极低脂肪的涂抹物；调味品，蛋黄酱，蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的汤，饮料，香料乳状液和沙司。
适宜地，根据本发明的食品可以是“精制食物”，包括蛋糕、面粉糕饼、糖果、巧克力、奶油软糖等。
在一个方面，根据本发明的食品可以是生面团产品或焙烤产品，诸如面包、油炸产品、小吃、蛋糕、馅饼、核仁巧克力饼、小甜饼、面条、零食诸如薄脆饼干、全麦薄脆饼干、椒盐脆饼干、和薯片、和意大利面制品。
在另一方面，根据本发明的食品可以是植物衍生的食物产品，诸如面粉、预混合料、油、脂肪、可可油、人造稀奶油、色拉调味品、人造黄油、涂抹物、花生酱、起酥油、冰激凌、烹调油。
在另一方面，根据本发明的食品可以是乳制品，包括黄油，牛奶，奶油，奶酪诸如各种形式的(包括切碎的、整块的、切片的或搓碎的)天然的、经加工的、和人造的干酪，奶油干酪，冰激凌，冷冻甜品，酸奶，酸奶饮料，黄油脂肪，脱水乳脂肪，其它乳制品。根据本发明的酶可提高乳制品中的脂肪稳定性。
在奶酪中使用根据本发明的酶是特别有益的。所以，根据本发明的脂肪分解酶可有利地用于生产奶酪。脂肪分解酶催化牛奶中磷脂的水解，这有助于增加奶酪产量。优选地，在奶酪生产过程前或期间，可将根据本发明的脂肪分解酶加到牛奶(称为干酪用乳)中。
在另一方面，根据本发明的食品可以是含有动物衍生成分的食物产品，诸如经加工的肉制品、烹调油、起酥油。
在另一方面，根据本发明的食品可以是饮料、水果、水果什锦、蔬菜或葡萄酒。在有些情况中，饮料可含多达20g/l外加的植物甾醇。
在另一方面，根据本发明的食品可以是动物饲料。动物饲料可强化了植物甾醇和/或植物甾烷醇，优选强化了β-谷甾醇/甾烷醇。适宜地，动物饲料可以是家禽饲料。当食品是家禽饲料时，本发明可用于降低以根据本发明的食品喂养的家禽所产蛋的胆固醇含量。
在一个方面，优选食品选自以下一种或多种：蛋，基于蛋的产品，包括蛋黄酱，色拉调味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黄及其制成品。
优选地，根据本发明的食品是含水食品。适宜地，食品可包含10-98％的水，适宜地14-98％，适宜地18-98％的水，适宜地20-98％，适宜地40-98％，适宜地50-98％，适宜地70-98％，适宜地75-98％。
对于有些方面，根据本发明的食品可以不是纯的植物衍生油，诸如例如橄榄油、向日葵油、花生油、油菜籽油。为了免除猜疑，在本发明的有些方面，根据本发明的食品可包含油，但该食品不是主要由油或油混合物构成的。对于有些方面，优选食品包含少于95％的脂质，优选少于90％的脂质，优选少于85％，优选少于80％的脂质。所以，对于本发明的有些方面，油可以是食品的成分，但优选食品本身不是油。
专利申请WO2004/064987，WO2004/064537，PCT/IB2004/004374和GB0513859.9中教导了在食物应用中使用能转移酰基的脂肪分解酶的优势，将它们引入本文作为参考。
游离脂肪酸的产生对食品可能是有害的。在食品中，游离脂肪酸与臭味和/或异味以及其他有害效应(包括诸如例如奶酪的乳制品中的油腻口味)有关。适宜地，在本发明的有些实施方案中，脂肪分解酶能将脂肪酸从脂质转移至酰基受体，例如甾醇和/或甾烷醇。因此，食品中游离脂肪酸的整体水平不增加或仅仅增加到不显著的程度。所以，在奶酪生产中，根据本发明的能转移酰基的脂肪分解酶可提供一种或多种以下出乎预料的技术效果：减少奶酪中的溢油(oiling-off)效应；增加奶酪产量；增强香味；降低恶臭；降低“油腻”口味。
本文教导的能将酰基转移至碳水化合物以及甾醇和/或甾烷醇的脂肪分解酶的应用对于含蛋食品是特别有益的。具体而言，在蛋和蛋制品中，糖，特别是葡萄糖的存在常常视为是不利的。蛋黄可包含多达1％的葡萄糖。根据本发明，该不想要的糖可方便地通过“酯化”糖以形成糖酯来去除。
食用油中存在甘油二酯是不利的。具体而言，食用油(特别是棕榈油)中的甘油二酯可导致油的品质低。适宜地，在本发明的有些实施方案中，本文教导的脂肪分解酶能将脂肪酸从脂质转移至酰基受体，这降低油中甘油二酯的水平，而不增加或显著增加游离脂肪酸的水平。
本文教导的脂肪分解酶能水解食用或植物油中的磷脂的主要部分。这在植物或食用油的酶促脱胶中是高度有益的。适宜地，在本发明的有些实施方案中，脂肪分解酶可能能将脂肪酸从脂质转移至酰基受体。因此，有利的是，油中的游离脂肪酸的整体水平不增加或仅仅增加到不显著的程度。游离脂肪酸的产生对食用油可能是有害的。优选地，根据本发明的方法导致食用油脱胶，其中游离脂肪酸的积聚降低和/或消除。
本发明的权利要求将解释为包括上文所列每种食品。
在本文提及的有些应用中，特别是食物应用，诸如面包房应用，根据本发明的脂肪分解酶可以与一种或多种常规乳化剂一起使用，包括例如甘油单酯、脂肪酸甘油单酯和二酯的二酰基酒石酸酯、糖酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)和卵磷脂。
另外/或者，根据本发明的酶可以与一种或多种其它合适的食用级酶一起使用。所以，除了本发明的脂肪分解酶，可将至少一种其它酶加到焙烤品和/或生面团中，这在本发明的范围之内。这样的其它酶包括淀粉降解酶诸如内切或外切淀粉酶，支链淀粉酶，脱支酶，半纤维素酶包括木聚糖酶，纤维素酶，氧化还原酶如葡萄糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶诸如氧化麦芽糖的，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶和己糖氧化酶，蛋白酶，和酰基转移酶(诸如例如PCT/IB2004/000575中所述的那些)。
本发明涵盖食物酶组合物，包括包含根据本发明的酶的面包和/或生面团改良组合物，且任选还包含其它酶，诸如一种或多种其它合适的食用级酶，包括淀粉降解酶诸如内切或外切淀粉酶，支链淀粉酶，脱支酶，半纤维素酶包括木聚糖酶，纤维素酶，氧化还原酶如葡萄糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶诸如氧化麦芽糖的，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶和己糖氧化酶，蛋白酶，和酰基转移酶(诸如例如PCT/IB2004/000575中所述的那些)。
在本文提交的有些应用中，特别是食物应用，诸如面包房应用，根据本发明的脂肪分解酶可以与一种或多种酶底物联合或顺序加入。仅作为示例，根据本发明的脂肪分解酶可以与一种或多种极性脂质底物和/或一种或多种酰基受体底物一起加入。
在本文提及的有些应用中，特别是食物应用，诸如面包房应用，根据本发明的脂肪分解酶可以与一种或多种羟酸一起使用，包括例如酒石酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸或抗坏血酸。
本文中所用的术语“改良的特性”指可通过本发明脂肪分解酶的作用改良的任何性质。具体而言，根据本发明的脂肪分解酶的应用导致一种或多种以下特征：增加焙烤品体积；改善焙烤品团粒结构(crumb structure)；焙烤品中的抗走味(anti-staling)特性；对生面团增加强度、增加稳定性、减少粘性和/或改善切削加工性。
通过与不添加根据本发明的脂肪分解酶而制备的生面团和/或焙烤品进行比较，评估了改良的特性。
本文中所用的术语“焙烤品”包括由生面团制备的产品。可通过本发明有利地制备的焙烤品(无论是白色、浅色或深色类型的)的例子包括以下一种或多种：典型地块或卷形式的面包(包括白、粗面粉和黑面包)，蒸汽小圆面包，法国棍子面包，比塔饼，玉米面豆卷，玉米粉圆饼，小麦粉圆饼，蛋糕，薄烤饼，饼干，脆面包，意大利面制品，面条等。
根据本发明的生面团可以是经过发酵的生面团或将进行发酵的生面团。生面团可以以各种方式发酵，诸如通过加入碳酸氢钠等，或通过加入合适的酵母培养物，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包酵母)培养物。
本发明还涉及根据本发明的脂肪分解酶用于生产意大利面制品生面团的应用，优选由硬质小麦粉或相当品质的面粉制备而来。
根据本发明的脂肪分解酶适合用于植物或食用油的酶促脱胶。在加工植物或食用油中，用根据本发明的脂肪分解酶处理食用或植物油，从而水解极性脂质(如磷脂)的主要部分。优选由极性脂质水解得到脂肪酰基。由于水解了极性脂质，如磷脂的主要部分(即超过50％)，脱胶过程通常导致食用油中极性脂质，特别是磷脂的含量降低。典型地，将含水解极性脂质(如磷脂)的水相与油分离。适宜地，食用或植物油可最初(用根据本发明的酶处理前)具有50-250ppm的磷含量。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的脂肪分解酶在生物转化极性脂质(优选糖脂)以制造高价值产品，诸如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟酸酯中的应用。PCT/IB2004/004374中详述了脂肪分解酶，特别是能将酰基从极性脂质底物(优选糖脂)转移至酰基受体的脂肪分解酶在生物转化极性脂质中的应用及其优势，引入本文作为参考。
在一个实施方案中，用于本发明方法中的脂肪分解酶可以是固定化的。在酶是固定化的情况中，可使包含酰基供体、任选的酰基受体、和任选的水的混合物通过柱子，例如包含固定化酶的柱子。通过固定酶，有可能容易地重新使用它。
适宜地，固定化酶可用在流动反应器或间歇反应器中，其装有包含溶于水中的脂质酰基供体和任选的酰基受体的反应混合物。当存在酰基受体时，供体和受体处在两相系统或乳状液中。反应混合物可任选经搅拌或经超声波处理。例如，一旦反应达到平衡，可以分离反应混合物和固定化酶。适宜地，可以分馏反应产物，例如通过疏水相互作用层析、结晶或高真空度蒸馏。
固定化脂质酰基转移酶可利用本领域已知的固定技术来制备。有许多制备固定化酶的方法，这对于本领域技术人员来说是显然的(例如EP 0 746608；或Balcao V.M.等，Enzyme Microb Technol.1996年5月1日，18(6)：392-416；或Retz等，Chem Phys Lipids，1998年6月，93(1-2)：3-14；Bomscheuer等，Trends Biotechnol.2002年10月，20(10)：433-7；Plou等，Biotechnology，92(2002)：55-66；Warmuth等，1992，Bio Forum 9：282-283；Ferrer等，2000，J.Chem.Technol.Biotechnol.75：1.8；或Christensen等，1998，Nachwachsende Rohstoff 10：98-105；Petersen和Christenen，2000，AppliedBiocatalysis，Harwood Academic Publishers，Amsterdam中提到的技术，将每篇文献引入本文作为参考)。
可用于本文的技术包括例如与Eupergit C共价偶联、吸附到聚丙烯上和硅造粒。
根据本发明的脂肪分解酶
用于根据本发明的应用和/或本文所述方法的脂肪分解酶优选是至少能水解半乳糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中该酶由选自下组的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；
b)因遗传密码简并而与SEQ ID No.3的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
优选用于根据本发明的应用和/或本文所述方法的脂肪分解酶是包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
可是，用于根据本发明的应用和/或本发明方法的脂肪分解酶可以是可从链霉菌属菌种得到的任何脂肪分解酶，其至少能水解半乳糖脂和/或能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体底物。
用于根据本发明的应用和/或本发明方法的具有半乳糖脂酶活性的合适脂肪分解酶可包含以下氨基酸序列之任一和/或由以下核苷酸序列编码：
Thermobifida\fusca GDSx 548 aa
SEQ ID No.5
ZP 00058717
  1 mlphpagerg evgaffallv gtpqdrrlrl echetrplrg rcgcgerrvp pltlpgdgvl
 61 cttsstrdae tvwrkhlqpr pdggfrphlg vgcllagqgs pgvlwcgreg crfevcrrdt
121 pglsrtrngd ssppfragws lppkcgeisq sarktpavpr ysllrtdrpd gprgrfvgsg
181 praatrrrlf lgipalvlvt altlvlavpt gretlwrmwc eatqdwclgv pvdsrgqpae
241 dgeflllspv qaatwgnyya lgdsyssgdg ardyypgtav kggcwrsana ypelvaeayd
301 faghlsflac sgqrgyamld aidevgsqld wnsphtslvt igiggndlgf stvlktcmvr
361 vplldskact dqedairkrm akfettfeel isevrtrapd arilvvgypr ifpeeptgay
421 ytltasnqrw lnetiqefnq qlaeavavhd eeiaasggvg svefvdvyha ldgheigsde
481 pwvngvqlrd latgvtvdrs tfhpnaaghr avgervieqi etgpgrplya tfavvagatv
541 dtlagevg
SEQ ID No.6
   1 ggtggtgaac cagaacaccc ggtcgtcggc gtgggcgtcc aggtgcaggt gcaggttctt
  61 caactgctcc agcaggatgc cgccgtggcc gtgcacgatg gccttgggca ggcctgtggt
 121 ccccgacgag tacagcaccc atagcggatg gtcgaacggc agcggggtga actccagttc
 181 cgcgccttcg cccgcggctt cgaactccgc ccaggacagg gtgtcggcga cagggccgca
 241 gcccaggtac ggcaggacga cggtgtgctg caggctgggc atgccgtcgc gcagggcttt
 301 gagcacgtca cggcggtcga agtccttacc gccgtagcgg tagccgtcca cggccagcag
 361 cactttcggt tcgatctgcg cgaaccggtc gaggacgctg cgcaccccga agtcggggga
 421 acaggacgac caggtcgcac cgatcgcggc gcaggcgagg aatgcggccg tcgcctcggc
 481 gatgttcggc aggtaggcca cgacccggtc gccggggccc accccgaggc tgcggagggc
 541 cgcagcgatc gcggcggtgc gggtccgcag ttctccccag gtccactcgg tcaacggccg
 601 gagttcggac gcgtgccgga tcgccacggc tgatgggtca cggtcgcgga agatgtgctc
 661 ggcgtagttg agggtggcgc cggggaacca gacggcgccg ggcatggcgt cggaggcgag
 721 cactgtggtg tacggggtgg cggcgcgcac ccggtagtac tcccagatcg cggaccagaa
 781 tccttcgagg tcggttaccg accagcgcca cagtgcctcg tagtccggtg cgtccacacc
 841 gcggtgctcc cgcacccagc gggtgaacgc ggtgaggttg gcgcgttctt tgcgctcctc
 901 gtcgggactc cacaggatcg gcggctgcgg cttgagtgtc atgaaacgcg accccttcgt
 961 ggacggtgcg gatgcggtga gcgtcgggtg cctcccctaa cgctccccgg tgacggagtg
1021 ttgtgcacca catctagcac gcgggacgcg gaaaccgtat ggagaaaaca cctacaaccc
1081 cggccggacg gtgggtttcg gccacactta ggggtcgggt gcctgcttgc cgggcagggc
1141 agtcccgggg tgctgtggtg cgggcgggag ggctgtcgct tcgaggtgtg ccggcgggac
1201 actccgggcc tcagccgtac ccgcaacggg gacagttctc ctcccttccg ggctggatgg
1261 tcccttcccc cgaaatgcgg cgagatctcc cagtcagccc ggaaaacacc cgctgtgccc
1321 aggtactctt tgcttcgaac agacaggccg gacggtccac gggggaggtt tgtgggcagc
1381 ggaccacgtg cggcgaccag acgacggttg ttcctcggta tccccgctct tgtacttgtg
1441 acagcgctca cgctggtctt ggctgtcccg acggggcgcg agacgctgtg gcgcatgtgg
1501 tgtgaggcca cccaggactg gtgcctgggg gtgccggtcg actcccgcgg acagcctgcg
1561 gaggacggcg agtttctgct gctttctccg gtccaggcag cgacctgggg gaactattac
1621 gcgctcgggg attcgtactc ttcgggggac ggggcccgcg actactatcc cggcaccgcg
1681 gtgaagggcg gttgctggcg gtccgctaac gcctatccgg agctggtcgc cgaagcctac
1741 gacttcgccg gacacttgtc gttcctggcc tgcagcggcc agcgcggcta cgccatgctt
1801 gacgctatcg acgaggtcgg ctcgcagctg gactggaact cccctcacac gtcgctggtg
1861 acgatcggga tcggcggcaa cgatctgggg ttctccacgg ttttgaagac ctgcatggtg
1921 cgggtgccgc tgctggacag caaggcgtgc acggaccagg aggacgctat ccgcaagcgg
1981 atggcgaaat tcgagacgac gtttgaagag ctcatcagcg aagtgcgcac ccgcgcgccg
2041 gacgcccgga tccttgtcgt gggctacccc cggatttttc cggaggaacc gaccggcgcc
2101 tactacacgc tgaccgcgag caaccagcgg tggctcaacg aaaccattca ggagttcaac
2161 cagcagctcg ccgaggctgt cgcggtccac gacgaggaga ttgccgcgtc gggcggggtg
2221 ggcagcgtgg agttcgtgga cgtctaccac gcgttggacg gccacgagat cggctcggac
2281 gagccgtggg tgaacggggt gcagttgcgg gacctcgcca ccggggtgac tgtggaccgc
2341 agtaccttcc accccaacgc cgctgggcac cgggcggtcg gtgagcgggt catcgagcag
2401 atcgaaaccg gcccgggccg tccgctctat gccactttcg cggtggtggc gggggcgacc
2461 gtggacactc tcgcgggcga ggtggggtga cccggcttac cgtccggccc gcaggtctgc
2521 gagcactgcg gcgatctggt ccactgccca gtgcagttcg tcttcggtga tgaccagcgg
2581 cggggagagc cggatcgttg agccgtgcgt gtctttgacg agcacacccc gctgcaggag
2641 ccgttcgcac agttctcttc cggtggccag agtcgggtcg acgtcgatcc cagcccacag
2701 gccgatgctg cgggccgcga ccacgccgtt gccgaccagt tggtcgaggc gggcgcgcag
2761 cacgggggcg agggcgcgga catggtccag gtaagggccg tcgcggacga ggctcaccac
2821 ggcagtgccg accgcgcagg cgagggcgtt gccgccgaag gtgctgccgt gctggccggg
2881 gcggatcacg tcgaagactt ccgcgtcgcc taccgccgcc gccacgggca ggatgccgcc
2941 gcccagcgct ttgccgaaca ggtagatatc ggcgtcgact ccgctgtggt cgcaggcccg
//
Thermobifida\fusca\-GDSx
SEQ ID No.7
  1 vgsgpraatr rrlflgipal vlvtaltlvl avptgretlw rmwceatqdw clgvpvdsrg
 61 qpaedgefll lspvqaatwg nyyalgdsys sgdgardyyp gtavkggcwr sanaypelva
121 eaydfaghls flacsgqrgy amldaidevg sqldwnspht slvtigiggn dlgfstvlkt
181 cmvrvpllds kactdqedai rkrmakfett feelisevrt rapdarilvv gyprifpeep
241 tgayytltas nqrwlnetiq efnqqlaeav avhdeeiaas ggvgsvefvd vyhaldghei
301 gsdepwvngv qlrdlatgvt vdrstfhpna aghravgerv ieqietgpgr plyatfavva
361 gatvdtlage vg
Corynebacterium\effciens\GDSx 300aa
SEQ ID No.8
  1 mrttviaasa llllagcadg areetagapp gessggiree gaeastsitd vyialgdsya
 61 amggrdqplr gepfclrssg nypellhaev tdltcqgavt gdlleprtlg ertlpaqvda
121 ltedttlvtl siggndlgfg evagcireri agenaddcvd llgetigeql dqlppqldrv
181 heairdragd aqvvvtgylp lvsagdcpel gdvseadrrw aveltgqine tvreaaerhd
241 alfvlpddad ehtscappqq rwadiqgqqt dayplhptsa gheamaaavr dalglepvqp
//
SEQ ID No.9
   1 ttctggggtg ttatggggtt gttatcggct cgtcctgggt ggatcccgcc aggtggggta
  61 ttcacggggg acttttgtgt ccaacagccg agaatgagtg ccctgagcgg tgggaatgag
 121 gtgggcgggg ctgtgtcgcc atgagggggc ggcgggctct gtggtgcccc gcgacccccg
 181 gccccggtga gcggtgaatg aaatccggct gtaatcagca tcccgtgccc accccgtcgg
 241 ggaggtcagc gcccggagtg tctacgcagt cggatcctct cggactcggc catgctgtcg
 301 gcagcatcgc gctcccgggt cttggcgtcc ctcggctgtt ctgcctgctg tccctggaag
 361 gcgaaatgat caccggggag tgatacaccg gtggtctcat cccggatgcc cacttcggcg
 421 ccatccggca attcgggcag ctccgggtgg aagtaggtgg catccgatgc gtcggtgacg
 481 ccatagtggg cgaagatctc atcctgctcg agggtgctca ggccactctc cggatcgata
 541 tcgggggcgt ccttgatggc gtccttgctg aaaccgaggt gcagcttgtg ggcttccaat
 601 ttcgcaccac ggagcgggac gaggctggaa tgacggccga agagcccgtg gtggacctca
 661 acgaaggtgg gtagtcccgt gtcatcattg aggaacacgc cctccaccgc acccagcttg
 721 tggccggagt tgtcgtaggc gctggcatcc agaagggaaa cgatctcata tttgtcggtg
 781 tgctcagaca tgatcttcct ttgctgtcgg tgtctggtac taccacggta gggctgaatg
 841 caactgttat ttttctgtta ttttaggaat tggtccatat cccacaggct ggctgtggtc
 901 aaatcgtcat caagtaatcc ctgtcacaca aaatgggtgg tgggagccct ggtcgcggtt
 961 ccgtgggagg cgccgtgccc cgcaggatcg tcggcatcgg cggatctggc cggtaccccg
1021 cggtgaataa aatcattctg taaccttcat cacggttggt tttaggtatc cgcccctttc
1081 gtcctgaccc cgtccccggc gcgcgggagc ccgcgggttg cggtagacag gggagacgtg
1141 gacaccatga ggacaacggt catcgcagca agcgcattac tccttctcgc cggatgcgcg
1201 gatggggccc gggaggagac cgccggtgca ccgccgggtg agtcctccgg gggcatccgg
1261 gaggaggggg cggaggcgtc gacaagcatc accgacgtct acatcgccct cggggattcc
1321 tatgcggcga tgggcgggcg ggatcagccg ttacggggtg agccgttctg cctgcgctcg
1381 tccggtaatt acccggaact cctccacgca gaggtcaccg atctcacctg ccagggggcg
1441 gtgaccgggg atctgctcga acccaggacg ctgggggagc gcacgctgcc ggcgcaggtg
1501 gatgcgctga cggaggacac caccctggtc accctctcca tcgggggcaa tgacctcgga
1561 ttcggggagg tggcgggatg catccgggaa cggatcgccg gggagaacgc tgatgattgc
1621 gtggacctgc tgggggaaac catcggggag cagctcgatc agcttccccc gcagctggac
1681 cgcgtgcacg aggctatccg ggaccgcgcc ggggacgcgc aggttgtggt caccggttac
1741 ctgccgctcg tgtctgccgg ggactgcccc gaactggggg atgtctccga ggcggatcgt
1801 cgttgggcgg ttgagctgac cgggcagatc aacgagaccg tgcgcgaggc ggccgaacga
1861 cacgatgccc tctttgtcct gcccgacgat gccgatgagc acaccagttg tgcaccccca
1921 cagcagcgct gggcggatat ccagggccaa cagaccgatg cctatccgct gcacccgacc
1981 tccgccggcc atgaggcgat ggccgccgcc gtccgggacg cgctgggcct ggaaccggtc
2041 cagccgtagc gccgggcgcg cgcttgtcga cgaccaaccc atgccaggct gcagtcacat
2101 ccgcacatag cgcgcgcggg cgatggagta cgcaccatag aggatgagcc cgatgccgac
2161 gatgatgagc agcacactgc cgaagggttg ttccccgagg gtgcgcagag ccgagtccag
2221 acctgcggcc tgctccggat catgggccca accggcgatg acgatcaaca cccccaggat
2281 cccgaaggcg ataccacggg cgacataacc ggctgttccg gtgatgatga tcgcggtccc
2341 gacctgccct gaccccgcac ccgcctccag atcctcccgg aaatcccggg tggccccctt
2401 ccagaggttg tagacacccg cccccagtac caccagcccg gcgaccacaa ccagcaccac
2461 accccagggt tgggatagga cggtggcggt gacatcggtg gcggtctccc catcggaggt
2521 gctgccgccc cgggcgaagg tggaggtggt caccgccagg gagaagtaga ccatggccat
2581 gaccgccccc ttggcccttt ccttgaggtc ctcgcccgcc agcagctggc tcaattgcca
2641 gagtcccagg gccgccaggg cgatgacggc aacccacagg aggaactgcc cacccggagc
2701 ctccgcgatg gtggccaggg cacctgaatt cgaggcctca tcacccgaac cgccggatcc
2761 agtggcgatg cgcaccgcga tccacccgat gaggatgtgc agtatgccca ggacaatgaa
2821 accacctctg gccagggtgg tcagcgcggg gtggtcctcg gcctggtcgg cagcccgttc
2881 gatcgtccgt ttcgcggatc tggtgtcgcc cttatccata gctcccattg aaccgccttg
2941 aggggtgggc ggccactgtc agggcggatt gtgatctgaa ctgtgatgtt ccatcaaccc
//
S.coelicolor\GDSx 268 aa
SEQ ID No.12
NP 625998.
  1 mrrfrlvgfl sslvlaagaa ltgaataqaa qpaaadgyva lgdsyssgvg agsyisssgd
 61 ckrstkahpy lwaaahspst fdftacsgar tgdvlsgqlg plssgtglvs isiggndagf
121 adtmttcvlq sessclsria taeayvdstl pgkldgvysa isdkapnahv vvigyprfyk
181 lgttciglse tkrtainkas dhlntvlaqr aaahgftfgd vrttftghel csgspwlhsv
241 nwlnigesyh ptaagqsggy lpvlngaa
//
SEQ ID No.13
   1 cccggcggcc cgtgcaggag cagcagccgg cccgcgatgt cctcgggcgt cgtcttcatc
  61 aggccgtcca tcgcgtcggc gaccggcgcc gtgtagttgg cccggacctc gtcccaggtg
 121 cccgcggcga tctggcgggt ggtgcggtgc gggccgcgcc gaggggagac gtaccagaag
 181 cccatcgtca cgttctccgg ctgcggttcg ggctcgtccg ccgctccgtc cgtcgcctcg
 241 ccgagcacct tctcggcgag gtcggcgctg gtcgccgtca ccgtgacgtc ggcgccccgg
 301 ctccagcgcg agatcagcag cgtccagccg tcgccctccg ccagcgtcgc gctgcggtcg
 361 tcgtcgcggg cgatccgcag cacgcgcgcg ccgggcggca gcagcgtggc gccggaccgt
 421 acgcggtcga tgttcgccgc gtgcgagtac ggctgctcac ccgtggcgaa acggccgagg
 481 aacagcgcgt cgacgacgtc ggacggggag tcgctgtcgt ccacgttgag ccggatcggc
 541 agggcttcgt gcgggttcac ggacatgtcg ccatgatcgg gcacccggcc gccgcgtgca
 601 cccgctttcc cgggcacgca cgacaggggc tttctcgccg tcttccgtcc gaacttgaac
 661 gagtgtcagc catttcttgg catggacact tccagtcaac gcgcgtagct gctaccacgg
 721 ttgtggcagc aatcctgcta agggaggttc catgagacgt ttccgacttg tcggcttcct
 781 gagttcgctc gtcctcgccg ccggcgccgc cctcaccggg gcagcgaccg cccaggcggc
 841 ccaacccgcc gccgccgacg gctatgtggc cctcggcgac tcctactcct ccggggtcgg
 901 agcgggcagc tacatcagct cgagcggcga ctgcaagcgc agcacgaagg cccatcccta
 961 cctgtgggcg gccgcccact cgccctccac gttcgacttc accgcctgtt ccggcgcccg
1021 tacgggtgat gttctctccg gacagctcgg cccgctcagc tccggcaccg gcctcgtctc
1081 gatcagcatc ggcggcaacg acgccggttt cgccgacacc atgacgacct gtgtgctcca
1141 gtccgagagc tcctgcctgt cgcggatcgc caccgccgag gcgtacgtcg actcgacgct
1201 gcccggcaag ctcgacggcg tctactcggc aatcagcgac aaggcgccga acgcccacgt
1261 cgtcgtcatc ggctacccgc gcttctacaa gctcggcacc acctgcatcg gcctgtccga
1321 gaccaagcgg acggcgatca acaaggcctc cgaccacctc aacaccgtcc tcgcccagcg
1381 cgccgccgcc cacggcttca ccttcggcga cgtacgcacc accttcaccg gccacgagct
1441 gtgctccggc agcccctggc tgcacagcgt caactggctg aacatcggcg agtcgtacca
1501 ccccaccgcg gccggccagt ccggtggcta cctgccggtc ctcaacggcg ccgcctgacc
1561 tcaggcggaa ggagaagaag aaggagcgga gggagacgag gagtgggagg ccccgcccga
1621 cggggtcccc gtccccgtct ccgtctccgt cccggtcccg caagtcaccg agaacgccac
1681 cgcgtcggac gtggcccgca ccggactccg cacctccacg cgcacggcac tctcgaacgc
1741 gccggtgtcg tcgtgcgtcg tcaccaccac gccgtcctgg cgcgagcgct cgccgcccga
1801 cgggaaggac agcgtccgcc accccggatc ggagaccgac ccgtccgcgg tcacccaccg
1861 gtagccgacc tccgcgggca gccgcccgac cgtgaacgtc gccgtgaacg cgggtgcccg
1921 gtcgtgcggc ggcggacagg cccccgagta gtgggtgcgc gagcccacca cggtcacctc
1981 caccgactgc gctgcggggc
//
S.avermitilis\GDSx 269 aa
SEQ ID No.14
NP 827753.
  1 mrrsritayv tslllavgca ltgaataqas paaaatgyva lgdsyssgvg agsylsssgd
 61 ckrsskaypy lwqaahspss fsfmacsgar tgdvlanqlg tlnsstglvs ltiggndagf
121 sdvmttcvlq sdsaclsrin takayvdstl pgqldsvyta istkapsahv avlgyprfyk
181 lggsclagls etkrsainda adylnsaiak raadhgftfg dvkstftghe icssstwlhs
241 ldllnigqsy hptaagqsgg ylpvmnsva
//
SEQ ID No.15
   1 ccaccgccgg gtcggcggcg agtctcctgg cctcggtcgc ggagaggttg gccgtgtagc
  61 cgttcagcgc ggcgccgaac gtcttcttca ccgtgccgcc gtactcgttg atcaggccct
 121 tgcccttgct cgacgcggcc ttgaagccgg tgcccttctt gagcgtgacg atgtagctgc
 181 ccttgatcgc ggtgggggag ccggcggcga gcaccgtgcc ctcggccggg gtggcctggg
 241 cgggcagtgc ggtgaatccg cccacgaggg cgccggtcgc cacggcggtt atcgcggcga
 301 tccggatctt cttgctacgc agctgtgcca tacgagggag tcctcctctg ggcagcggcg
 361 cgcctgggtg gggcgcacgg ctgtgggggg tgcgcgcgtc atcacgcaca cggccctgga
 421 gcgtcgtgtt ccgccctggg ttgagtaaag cctcggccat ctacgggggt ggctcaaggg
 481 agttgagacc ctgtcatgag tctgacatga gcacgcaatc aacggggccg tgagcacccc
 541 ggggcgaccc cggaaagtgc cgagaagtct tggcatggac acttcctgtc aacacgcgta
 601 gctggtacga cggttacggc agagatcctg ctaaagggag gttccatgag acgttcccga
 661 attacggcat acgtgacctc actcctcctc gccgtcggct gcgccctcac cggggcagcg
 721 acggcgcagg cgtccccagc cgccgcggcc acgggctatg tggccctcgg cgactcgtac
 781 tcgtccggtg tcggcgccgg cagctacctc agctccagcg gcgactgcaa gcgcagttcg
 841 aaggcctatc cgtacctctg gcaggccgcg cattcaccct cgtcgttcag tttcatggct
 901 tgctcgggcg ctcgtacggg tgatgtcctg gccaatcagc tcggcaccct gaactcgtcc
 961 accggcctgg tctccctcac catcggaggc aacgacgcgg gcttctccga cgtcatgacg
1021 acctgtgtgc tccagtccga cagcgcctgc ctctcccgca tcaacacggc gaaggcgtac
1081 gtcgactcca ccctgcccgg ccaactcgac agcgtgtaca cggcgatcag cacgaaggcc
1141 ccgtcggccc atgtggccgt gctgggctac ccccgcttct acaaactggg cggctcctgc
1201 ctcgcgggcc tctcggagac caagcggtcc gccatcaacg acgcggccga ctatctgaac
1261 agcgccatcg ccaagcgcgc cgccgaccac ggcttcacct tcggcgacgt caagagcacc
1321 ttcaccggcc atgagatctg ctccagcagc acctggctgc acagtctcga cctgctgaac
1381 atcggccagt cctaccaccc gaccgcggcc ggccagtccg gcggctatct gccggtcatg
1441 aacagcgtgg cctgagctcc cacggcctga atttttaagg cctgaatttt taaggcgaag
1501 gtgaaccgga agcggaggcc ccgtccgtcg gggtctccgt cgcacaggtc accgagaacg
1561 gcacggagtt ggacgtcgtg cgcaccgggt cgcgcacctc gacggcgatc tcgttcgaga
1621 tcgttccgct cgtgtcgtac gtggtgacga acacctgctt ctgctgggtc tttccgccgc
1681 tcgccgggaa ggacagcgtc ttccagcccg gatccgggac ctcgcccttc ttggtcaccc
1741 agcggtactc cacctcgacc ggcacccggc ccaccgtgaa ggtcgccgtg aacgtgggcg
1801 cctgggcggt gggcggcggg caggcaccgg agtagtcggt gtgcacgccg gtgaccgtca
1861 ccttcacgga ctgggccggc ggggtcgtcg taccgccgcc gccaccgccg cctcccggag
1921 tggagcccga gctgtggtcg cccccgccgt cggcgttgtc gtcctcgggg gttttcgaac
//
Thermobifida\fusca\-GDSx
SEQ ID No.16
  1 mgsgpraatr rrlflgipal vlvtaltlvl avptgretlw rmwceatqdw clgvpvdsrg
 61 qpaedgefll lspvqaatwg nyyalgdsys sgdgardyyp gtavkggcwr sanaypelva
121 eaydfaghls flacsgqrgy amldaidevg sqldwnspht slvtigiggn dlgfstvlkt
181 cmvrvpllds kactdqedai rkrmakfett feelisevrt rapdarilvv gyprifpeep
241 tgayytltas nqrwlnetiq efnqqlaeav avhdeeiaas ggvgsvefvd vyhaldghei
301 gsdepwvngv qlrdlatgvt vdrstfhpna aghravgerv ieqietgpgr plyatfavva
361 gatvdtlage vg
//
Therrmobifida\fusca\-GDSx
SEQ ID No.17
  1 ctgcagacac ccgccccgcc ttctcccgga tcgtcatgtt cggcgactcc ctcagcgaca
 61 ccggcaagat gtactccaag atgcgcggct acctgccgtc ctccccgccg tactacgagg
121 gccgcttctc gaacggcccg gtctggctgg agcagctgac gaagcagttc cccggcctga
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所以，在另一方面，本发明提供了脂肪分解酶在食品中用于制备溶血糖脂，例如二半乳糖苷甘油单酯(DGMG)或单半乳糖苷甘油单酯(MGMG))的应用，其通过用根据本发明的脂肪分解酶处理糖脂(如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或单半乳糖苷甘油二酯(MGDG))来产生部分水解产物，即溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在另一方面，本发明还进一步提供了脂肪分解酶在食品中用于制备溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的应用，其通过用酶处理磷脂(如卵磷脂)来产生部分水解产物，即溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在另一方面，本发明还进一步提供了脂肪分解酶在蛋或基于蛋的产品中用于水解磷脂和/或糖脂的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在另一方面，本发明提供了脂肪分解酶在底物(优选食品)中用于水解脂肪酰基的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在另一方面，本发明提供了脂肪分解酶在食用油中用于降低磷脂含量的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在另一方面，本发明涉及脂肪分解酶在底物(优选含极性脂质(优选糖脂)的生物转化混合物)中用于生产高价值产品，诸如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟酸酯的应用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在一个优选的方面，本发明涉及用于本文中所述用途的包含SEQ ID No.8、14或16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。
更优选地，本发明涉及包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶的应用。
在一个广的方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从喜热裂孢菌属(Thermobifida)物种，优选褐色喜热裂孢菌(T.fusca)得到的。
在另一个广的方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从棒杆菌属(Corynebacterium)物种，优选C.efficiens得到的。
在另一个广的方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶是可从，优选就是从除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)得到的。
在另一方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQ ID No.5、7、8、12、或16或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，或该酶由SEQ ID No.6、9、13、或17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在另一方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQ ID No.14或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，或该酶由SEQ ID No.15所示的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在另一方面，本发明可提供至少能水解糖脂和/或至少能将酰基从半乳糖脂转移至一种或多种酰基受体的脂肪分解酶，其中该酶包含SEQ ID No.16或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，或该酶由SEQ ID No.17所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一编码。
在本发明的一个实施方案中，优选可从中(或就是从中)得到脂肪分解酶的链霉菌属菌种不是龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)。
在本发明的一个实施方案中，优选可从中(或就是从中)得到脂肪分解酶的链霉菌属菌种不是天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。
优点
本发明的一个优点是脂肪分解酶具有显著的糖脂水解活性。对于来自链霉菌属菌种的脂肪分解酶来说，这是令人惊讶的。另外，对于来自喜热裂孢菌属和棒杆菌属物种的脂肪分解酶来说，这是令人惊讶的。
本发明的另一优点是脂肪分解酶不具有三酰甘油水解活性或具有不显著的三酰甘油水解活性。
分离的
在一个方面，优选序列是分离形式的。术语“分离的”指序列至少基本上不含至少一种在自然界中找到时和在自然界中与该序列天然相连的其它成分。
纯化的
在一个方面，优选序列是纯化形式的。术语“纯化的”指序列处于相对纯的状态-如至少约90％纯、或至少约95％纯或至少约98％纯。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文定义的特定特性的酶的核苷酸序列。
本文中所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的，它可以是双链的或单链的，无论代表有义或反义链。
本发明涉及的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA、和RNA。优选它指DNA，更优选编码本发明的cDNA序列。
在一个优选的实施方案中，本发明实质范围所涉及和涵盖的核苷酸序列不包括在其天然环境中以及与其天然相连序列连接时的根据本发明的天然核苷酸序列，其中天然相连序列也在其天然环境中。为了便于提及，我们称这种优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。在这点上，术语“天然核苷酸序列”指在其天然环境中且与其天然相连的完整启动子可操作连接时的完整核苷酸序列，其中启动子也在其天然环境中。可是，在其天然生物体中的核苷酸序列表达之后，可以分离和/或纯化本发明范围所涵盖的氨基酸序列。可是优选本发明范围所涵盖的氨基酸序列可由其天然生物体中的核苷酸序列表达，但其中核苷酸序列不受该生物体中与之天然相连的启动子的控制。
核苷酸序列的制备
典型地，利用重组DNA技术(即重组DNA)来制备本发明范围所涵盖的核苷酸序列。可是，在本发明的一个可选实施方案中，利用本领域众所周知的化学方法(参见Caruthers MH等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)，可完整或部分合成核苷酸序列。
可以从产生所述酶的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化编码具有本文定义的特定特性的酶的核苷酸序列。本领域众所周知用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的多种方法。举例来说，一旦鉴定和/或分离和/或纯化到合适的序列，则可通过PCR扩增技术来制备更多序列。
进一步举例来说，可以使用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果知道酶的氨基酸序列或酶的部分氨基酸序列，则可以合成带标记的寡核苷酸探针，并用于从由生物体制备的基因组文库鉴定编码酶的克隆。或者，可使用含有与其它已知酶基因同源的序列的带标记寡核苷酸探针来鉴定编码酶的克隆。在后一种情况中，使用较低严谨度的杂交和洗涤条件。
或者，可如下鉴定编码酶的克隆，将基因组DNA片段插入表达载体，诸如质粒，用得到的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌涂布到含酶底物(如葡糖苷酶(麦芽糖酶)生成酶用麦芽糖)的琼脂平板上，从而可鉴定表达酶的克隆，由此可鉴定编码酶的克隆。
又或者，可通过已确定的标准方法来合成制备编码酶的核苷酸序列，如Beucage S.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869所述的亚磷酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等，(1984)EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在亚磷酰胺法中，合成寡核苷酸，如在自动DNA合成仪中，纯化，退火，连接并克隆到合适的载体中。
核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源的、混合的合成和cDNA来源的，或混合的基因组和cDNA来源的，其按照标准技术通过连接合成、基因组或cDNA来源的(如果合适)的片段来制备。每个连接的片段对应于完整核苷酸序列的各部分。也可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)来制备DNA序列，例如US 4,683,202或Saiki R K等，Science(1988)239，pp487-491中所述。
由于遗传密码的简并性，可以方便地制备如下核苷酸序列，其中对于由原始核苷酸序列编码的有些或所有氨基酸，三联体密码子的使用率已经改变，从而产生与原始核苷酸序列具有低同源性但编码如原始核苷酸序列所编码的相同或变体氨基酸序列的核苷酸序列。例如，对于大多数氨基酸，遗传密码的简并性位于三联体密码子中的第三位(摆动位)(参见Stryer，Lubert，Biochemistry，第三版，Freeman Press，ISBN 0-7167-1920-7)，因此，其中所有三联体密码子在第三位都“摆动”的核苷酸序列与原始核苷酸序列将具有约66％的同一性，可是改变后的核苷酸序列将编码如原始核苷酸序列所编码的相同、或变体一级氨基酸序列。
因此，本发明还涉及如下任何核苷酸序列，对于至少一种编码氨基酸的三联体密码子，具有可变的三联体密码子使用率，但编码如原始核苷酸序列所编码多肽序列的相同、或变体多肽序列。
另外，特定生物体通常对使用哪些三联体密码子来编码氨基酸具有偏好。优选的密码子使用率表可广泛获得，并可用于制备密码子优化基因。这样的密码子优化技术常规用于优化异源宿主中转基因的表达。
分子进化
一旦分离得到编码酶的核苷酸序列，或者鉴定得到推定的编码酶的核苷酸序列，可能希望更改选择的核苷酸序列，例如可能希望对序列进行突变，从而制备根据本发明的酶。
可以使用合成寡核苷酸来导入突变。这些寡核苷酸含有期望突变位点侧翼的核苷酸序列。
Morinaga等，Biotechnology，1984，2：646-649中公开了一种合适的方法。Nelson和Long，Analytical Biochemistry，1989，180：147-151中描述了将突变导入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。
除了定点诱变，诸如上文所述，可以随机导入突变，例如使用商品化试剂盒，诸如Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或Clontech的DiversifyPCR随机诱变试剂盒。EP 0 583 265涉及优化基于PCR的诱变的方法，它也可以联合使用诱变性DNA类似物，诸如EP 0 866 796中所述。错误倾向PCR技术适于生成具有优选特征的脂肪分解酶变体。WO 02/06457涉及脂肪酶的分子进化。
获取新序列的第三种方法是使用任何数目的限制酶或诸如DNA酶I等酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新装配成编码功能性蛋白质的全长核苷酸序列。或者，可以使用一种或多种不同的核苷酸序列，并在重新装配全长核苷酸序列的过程中导入突变。DNA改组和家族改组技术适于生成具有优选特征的脂质酰基转移酶变体。EP 0 752 008、EP 1 138 763、EP 1 103606中可找到适于进行“改组”的方法。改组还可以联合其它形式的DNA诱变，正如US 6,180,406和WO 01/34835中所述。
由此，有可能在体内或在体外在核苷酸序列中生成大量的定点或随机诱变，并随后通过多种手段对所编码多肽筛选改进的功能性。可以使用例如in silico(计算机芯片)和exo介导的重组方法(见WO 00/58517、US6,344,328、US 6,361,974)来进行分子进化，其中所生成的变体保留与已知酶或蛋白质的很低同源性。由此获得的此类变体可能具有与已知脂肪分解酶的显著结构类似性，但是它们具有很低的氨基酸序列同源性。
作为一个非限制性实例，还可以将多核苷酸序列的突变或天然变体与野生型或其它突变或天然变体重组以生成新的变体。也可以对此类新变体筛选所编码多肽的改进的功能性。
上述和类似分子进化方法的应用容许在没有关于蛋白质结构或功能的任何现有知识的条件下鉴定和选择具有优选特征的本发明酶变体，且容许生成不可预测的但有利的突变或变体。分子进化在本领域中用于优化或改变酶活性的应用有许多例子，这样的例子包括但不限于以下一种或多种：优化在宿主细胞中或在体外的表达和/或活性、提高酶活性、改变底物和/或产物特异性、提高或降低酶或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中的酶活性/特异性。
正如本领域技术人员清楚知道的，使用分子进化工具，可以改变酶以改进酶的功能性。
适宜地，本发明所使用的脂肪分解酶可以是变体，即与亲本酶相比可包含至少一处氨基酸替代、删除或添加。酶变体保留与亲本酶的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％同源性。合适的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选地，亲本酶对得上pfam00657共有序列。
在一个优选的实施方案中，脂肪分解酶变体保留或掺入在GDSx、GANDY和HPT模块中发现的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。
可以使用分子进化工具对酶诸如在水性环境中没有或具有低半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性的脂肪酶进行突变以导入或增强半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性，由此生成适用于本发明组合物和方法的具有显著半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性的脂肪分解酶。
适宜地，酶变体对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯可以不具有活性。
或者，本发明所使用的酶变体对甘油三酯可以具有升高的活性，和/或对以下一种或多种也可以具有升高的活性：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖苷甘油单酯、单半乳糖苷甘油单酯。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有本文定义的特定特性的酶的氨基酸序列。
本文中所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
可以由合适的来源制备/分离氨基酸序列，或者可以人工合成，或是可以使用重组DNA技术来制备。
本发明所涵盖的酶可与其它酶联合使用。因此，本发明还覆盖酶的组合，其中该组合包含本发明的酶和其它酶，它可以是根据本发明的其它酶。这方面在以后的节中讨论。
优选地，本发明实质范围所涉及和涵盖的氨基酸序列不是天然的酶。在这点上，术语“天然的酶”指在其天然环境中且由其天然核苷酸序列表达的完整的酶。
同一性/同源性
本发明还涵盖酶的任何氨基酸序列或编码这种酶的任何核苷酸序列的同源物的应用。
在本文中，术语“同源物”指与氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的实体。在本文中，术语“同源性”可以等同于“同一性”。这些术语在本文中可互换使用。
在本文的背景中，认为同源氨基酸序列包括与序列可以是至少87或90％相同的氨基酸序列，优选与序列至少95、96、97、98或99％相同。典型地，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的例如活性位点等。尽管同源性也可认为是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的背景中，优选以序列同一性来表示同源性。
在本文的背景中，认为同源核苷酸序列包括与编码本发明酶的核苷酸序列(主题序列)可以是至少85或90％相同的核苷酸序列，优选至少95、96、97、98或99％相同。典型地，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可认为是相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的背景中，优选以序列同一性来表示同源性。
对于氨基酸序列和核苷酸序列，可以目测进行同源性比较，或者更常用的是借助易于获得的序列比较程序。这些商业性计算机程序能计算两种或多种序列之间的％同源性。
可以对毗邻序列计算％同源性，即将一种序列与其它序列进行对比，并将一种序列中的每一个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接进行比较，每次一个残基。这称为“无缺口”对比。通常，只对较短数目的残基进行这种无缺口对比。
尽管这是一种非常简单且可靠的方法，然而它未能考虑例如在其它方面相同的成对序列中一处插入或删除将引起后面的氨基酸残基无法进行对比，由此可能导致在进行整体对比时％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法设计成在考虑到可能的插入和删除的条件下生成最佳对比，不过度处罚整体同源性得分。这是通过在序列对比中插入“缺口”以设法使局部同源性最大化而实现的。
可是，这些更加复杂的方法给对比中发生的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的缺口的序列对比-反应了两种比较序列之间的较高相关性-将获得比具有更多缺口的其它序列对比更高的得分。通常使用“仿射缺口代价(affine gap costs)”，即对缺口的存在处以较高代价，而对缺口中的每一个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然将以较少缺口生成优化对比。大多数对比程序容许更改缺口罚分。可是，在使用这种软件进行序列比较时，优选使用缺省值。例如在使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是缺口-12且每个延伸-4。
因此，最大％同源性的计算首先需要生成最佳对比，其中要考虑缺口罚分。适用于进行这种对比的一种计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等，1984，Nuc.Acids Research，12：387)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel等，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，第4版，第18章)、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.403-410)、和GENEWORKS比较工具套。BLAST和FASTA都能进行离线和在线搜索(见Ausubel等，1999，Short Protocols in MolecularBiology，7.58-7.60)。
可是，对于有些应用，优选使用GCG Bestfit程序。还可以使用称为BLAST 2 Sequences的一种新工具来比较蛋白质和核苷酸序列(见FEMSMicrobiol Lett 1999，174(2)：247-50；及FEMS Microbiol Lett 1999，177(1)：187-8)。
尽管最终的％同源性可以根据同一性进行测量，然而对比过程自身通常不是基于“全是或全非”成对比较。而是，通常使用尺度相似性评分矩阵根据化学相似性或进化距离给每对比较赋予得分。常用的此类矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公开的缺省值或定制的符号比较表，如果提供的话(进一步的细节见用户手册)。对于有些应用，优选使用GCG软件包的公开缺省值，或者在其它软件的情况中，使用缺省矩阵，诸如BLOSUM62。
或者，可以使用以与CLUSTAL(Higgins DG和Sharp PM，1988，Gene73(1)：237-244)类似的算法为基础的DNASISTM(Hitachi Software)中的多重对比特色来计算百分比同源性。
一旦软件生成了最佳对比，就有可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常作为序列比较的一部分来执行它，并生成一个数值结果。
在本发明的一个优选方面，使用以下软件和设置来计算百分比序列同源性/同一性。对于氨基酸序列，使用AlignX VectorNTI(Vector NTI Advance9.1，Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，美国)为每个可能的氨基酸序列对来计算同一性(同源性)或“正数”百分比。设置是缺省参数(缺口开始罚分-10，缺口延伸罚分0.1)。
对于核酸序列，使用Informax Inc.(美国)的AlignX VectorNTI程序为每个可能的核酸序列对计算同一性(同源性)或“正数”百分比。设置是缺省设置，对于DNA为：缺口开始罚分：15和缺口延伸罚分：6.66(对于多重对比，使用相同设置)。
优选地，横跨全长氨基酸序列(如SEQ ID No.4、5、7、8、10、12和14)计算氨基酸同一性(同源性)，或对于核酸，则是编码各自全长氨基酸序列的相应多核苷酸。优选的是，可以通过对成熟多肽，即经过共翻译或翻译后加工，例如N-末端信号肽切割、或C-末端切割事件的多肽序列比较同源性/同一性来计算氨基酸或核酸同一性(同源性)。
序列还可以具有生成沉默改变并导致功能等同物的氨基酸残基删除、插入或替代。可以根据氨基酸特性(诸如残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性本质)的相似性进行审慎的氨基酸替代，因此以功能组形式将氨基酸在一起分组是有用的。可仅仅根据氨基酸侧链的性质将它们在一起分组。可是，另外包括突变数据是更有用的。如此衍生的氨基酸组出于结构原因可能是保守的。这些组可以范氏(Venn)图的形式描述(Livingstone C.D.和Barton G.J.，1993，″Protein sequence alignments：a strategy for the hierarchical analysis of redisue conservation″，Comput.Appl.Biosci.，9：745-756；Taylor W.R.，1986，″Theclassification of amino acid conservation″，J.Theor.Biol.，119：205-218)。例如根据下表所描述的普遍接受的氨基酸范氏图分组，可进行保守替代。
本发明还涵盖可以发生的同源替代(替代和替换在本文中都用于指用可选氨基酸残基交换现有残基)，即相似替代，诸如碱性替代碱性、酸性替代酸性、极性替代极性等。也可以发生非同源替代，即由一类残基变成另一类，或者牵涉非天然氨基酸，诸如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
还可以用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸序列变体可以包含合适的间隔基团，它可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间，除了氨基酸间隔物诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基以外，还包括烃基，诸如甲基、乙基或丙基。变异的另一种形式牵涉类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基的存在，这是本领域技术人员充分理解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指氨基酸残基变体，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而非α-碳原子。本领域知道用于制备类肽形式的肽的方法，例如Simon RJ等，PNAS，1992，89(20)：9367-9371；及Horwell DC，TrendsBiotechnol.1995，13(4)：132-134。
本发明所使用的核苷酸序列可以在其中包含合成的或修饰的核苷酸。本领域知道对寡核苷酸的许多不同类型修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯(methylphosphonate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解可以通过本领域可利用的任何方法来修饰本文所述核苷酸序列。可以为了增强本发明核苷酸序列的体内活性或寿命而进行这些修饰。
本发明还涵盖与本文所述序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，那么该序列可作为探针用于在其它生物体中鉴定相似编码序列等。
可以以多种方式获得与本发明序列不是100％同源但属于本发明范围内的多核苷酸。可以通过例如探查由一群个体例如来自不同人群的个体制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。另外，可以获得其它同源物，而且这些同源物及其片段一般能与本文序列表中所示序列发生选择性杂交。可以通过由其它物种制备cDNA文库或基因组DNA文库并在中等至高严谨度条件下用包含所附序列表中任一序列的完整或部分序列的探针探查这些文库来获得这些序列。类似考虑应用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
还可以使用简并PCR获得变体和株系/物种同源物，其中所用引物设计成靶向变体和同源物中编码本发明序列中保守氨基酸序列的序列。可以通过例如对比来自几个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域知道的计算机软件来进行序列对比。例如广泛使用GCG WisconsinPileUp程序。
简并PCR所使用的引物将包含一个或多个简并位置，而且将在比用针对已知序列的单一序列引物来克隆序列时更低的严谨条件使用。
或者，可以通过已鉴定序列的定点诱变来获得这些多核苷酸。这在例如为了对多核苷酸序列将要在其中表达的特定宿主细胞优化密码子偏爱性而需要沉默密码子序列改变时可能是有用的。为了导入限制酶识别位点或改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能，可能还需要其它序列改变。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于生成引物，例如PCR引物，用于进行可选扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规手段用显现标记物标记的探针，或者可以将多核苷酸克隆到载体中。这些引物、探针和其它片段的长度将是至少15个、优选至少20个、例如至少25个、30个或40个核苷酸，而且同样由本文所使用的术语本发明多核苷酸所涵盖。
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何手段来生成根据本发明的多核苷酸，诸如DNA多核苷酸和探针。还可以通过标准技术来克隆它们。
一般而言，将通过合成手段来生成引物，牵涉逐步制造期望的核酸序列，每次一个核苷酸。使用自动化技术实现这一目的的技术在本领域是易于获得的。
通常将使用重组手段例如PCR(聚合酶链反应)克隆技术来生成较长的多核苷酸。引物可以设计成包含合适的限制酶识别位点，从而能够将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。
有生物学活性的
优选地，变体序列等至少与本文所示序列一样有生物学活性。
本文中所用的“有生物学活性的”指具有与天然存在序列相似的结构功能(但不必是相同程度)、和/或相似的调节功能(但不必是相同程度)、和/或相似的生化功能(但不必是相同程度)的序列。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或是能与本发明的序列或其互补序列发生杂交的序列。
本文中所用的术语“杂交”应当包括“一条核酸链与一条互补链通过碱基配对而结合的过程”，以及在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明还涵盖能与本文所示序列或其任何衍生物、片段或衍生物的互补序列发生杂交的核苷酸序列的用途。
术语“变体”还涵盖能与本文所示核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。
优选地，术语“变体”涵盖能在严谨条件(如50℃和0.2x SSC{lx SSC＝0.15M NaCl2、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文所示核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。
更优选地，术语“变体”涵盖能在高严谨条件(如65℃和0.1x SSC{lxSSC＝0.15M NaCl2、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文所示核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。
本发明还涉及能与本发明核苷酸序列(包括本文所示那些的互补序列)发生杂交的核苷酸序列。
本发明还涉及能与本发明核苷酸序列(包括本文所示那些的互补序列)发生杂交的序列的互补核苷酸序列。
本发明的范围还包括能在中度至最高严谨条件下与本文所示核苷酸序列发生杂交的多核苷酸序列。
在一个优选的方面，本发明覆盖能在严谨条件(如50℃和0.2x SSC)下与本发明核苷酸序列或其互补序列发生杂交的核苷酸序列。
在一个更优选的方面，本发明覆盖能在高严谨条件(如65℃和0.1xSSC)下与本发明核苷酸序列或其互补序列发生杂交的核苷酸序列。
重组的
在一个方面，用于本发明的序列是重组序列-即利用重组DNA技术制备的序列。
这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力范围内。文献中阐明了这些技术，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，1-3册，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。
合成的
在一个方面，用于本发明的序列是合成的序列-即通过体外化学或酶促合成制备的序列。它包括但不限于用宿主生物体的最优密码子使用率而得到的序列-诸如甲基营养型酵母毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula)。
酶的表达
可以将本发明所使用的核苷酸序列掺入重组可复制载体。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或由相容宿主细胞复制和表达所述核苷酸序列(以酶的形式)。
可以使用控制序列，如调节序列来控制表达。
根据所使用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列而生成的酶可以是分泌的，或者可以是包含在细胞内的。编码序列可以设计成含有信号序列，它指导序列所编码物质穿过特定原核或真核细胞膜的分泌。
表达载体
术语“表达载体”指能够在体内或在体外进行表达的构建物。
优选地，将表达载体掺入合适宿主生物体的基因组。术语“掺入”优选覆盖稳定的掺入基因组。
本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接调节序列，该调控序列能够通过合适的宿主生物体提供核苷酸序列的表达。
可以如下文所述将本发明所使用的载体转化到合适的宿主细胞中，以提供本发明多肽的表达。
载体的选择，例如质粒、粘粒或噬菌体载体，常常取决于它将要导入的宿主细胞。
本发明所使用的载体可以含有一种或多种选择标记基因，诸如赋予抗生素抗性的基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，可以通过共转化来进行选择(如WO 91/17243中所述)。
可以在体外使用载体，例如用于生成RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
由此，在另一个实施方案中，通过将本发明的核苷酸序列导入可复制载体，将载体导入相容宿主细胞，并在促使载体复制的条件下培养宿主细胞，本发明提供了制备本发明的核苷酸序列的方法。
载体还可以包含使得载体能够在所讨论宿主细胞中进行复制的核苷酸序列。这些序列的实例有质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
调节序列
在有些应用中，本发明所使用的核苷酸序列可操作连接调节序列，它能够通过诸如选择的宿主细胞提供核苷酸序列的表达。举例来说，本发明覆盖包含本发明核苷酸序列且其与这种调节序列可操作连接的载体，即载体是表达载体。
术语“可操作连接”指位置毗邻，其中所述组件的相互关系容许它们以其预期方式发挥功能。与编码序列可操作连接的调节序列的连接方式使得能够在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调节序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。
术语“启动子”采用本领域常用含义，例如RNA聚合酶结合位点。
还可以通过选择异源调节区，例如启动子、分泌前导序列、和终止子区，来实现编码本发明酶的核苷酸序列的表达增强。
优选地，根据本发明的核苷酸序列可操作连接至少一个启动子。
适于指导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的实例在本领域是众所周知的。
构建物
术语“构建物”-与诸如“缀合物”、“盒”和“杂合物”等术语同义-包含根据本发明使用的核苷酸序列且其直接或间接与启动子相连。
间接相连的实例在本发明的启动子和核苷酸序列之间提供合适的间隔区，诸如内含子序列，诸如Sh1内含子或ADH内含子。术语“融合”在本发明中也是如此，包括直接或间接相连。在有些情况中，该术语不覆盖编码蛋白质的核苷酸序列与通常相连的野生型基因启动子的天然组合，且它们都处于其天然环境中。
构建物甚至可以包含或表达容许选择基因构建物的标记。
对于有些应用，优选的是，本发明的构建物包含至少一种本发明的核苷酸序列且其可操作连接启动子。
宿主细胞
术语“宿主细胞”在涉及本发明时包括包含上文所述核苷酸序列或表达载体且用于重组生产具有本文定义的特定特性之酶的任何细胞。
由此，本发明的另一个实施方案提供了经核苷酸序列转化或转染而表达本发明酶的宿主细胞。将要选择与所述载体相容的细胞，而且可以是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选地，宿主细胞不是人类细胞。
合适的细菌宿主生物体的实例有革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。
根据编码本发明酶的核苷酸序列的本质和/或进一步加工所表达蛋白质的愿望，真核宿主可能是优选的，诸如酵母或其它真菌。一般而言，酵母细胞比真菌细胞更加优选，因为它们易于操作。可是，有些蛋白质或是难以由酵母细胞分泌，或是在有些情况中难以正确加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况中，应当选择不同的真菌宿主生物体。
使用合适的宿主细胞，诸如酵母、真菌和植物宿主细胞，可以提供翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、lapidation以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是赋予本发明重组表达产物以最佳生物学活性所需要的。
宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶减除的菌株。
可修改宿主细胞的基因型以改善表达。
宿主细胞修饰的例子包括蛋白酶缺陷、补充罕见的tRNA、和修改细胞质中的还原势(reductive potential)以增强二硫键形成。
例如，如Kane，Curr Opin Biotechnol，1995，6：494-500，″Effects of rarecodon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli″中所示例/描述的，宿主细胞大肠杆菌可过度表达罕见的tRNA以改善异源蛋白质的表达。如Bessette，Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：13703-13708，″Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichiacoli cytoplasm″中所示例/描述的，宿主细胞可以是许多还原酶缺陷的，由此适宜形成稳定的二硫键。
在一个实施方案中，宿主细胞是细菌，优选革兰氏阳性细菌，优选宿主细胞选自放线细菌(Actinobacteria)，诸如双歧杆菌属(Biofidobacteria)和气单胞菌属(Aeromonas)，特别优选杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)。仍更优选放线菌目(Actinomicetales)，诸如棒杆菌属，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和诺卡氏菌属(Nocardia)。特别优选链霉菌科(Streptomycetaceae)，诸如链霉菌属，特别是浅青紫链霉菌(S.lividans)。
微生物宿主可用于表达半乳糖脂酶基因，如真细菌、古细菌或真菌，包括酵母。优选真细菌，例如后壁菌门(Firmicutes)(低GC的革兰氏阳性细菌)，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其它芽孢杆菌属物种，乳酸细菌，诸如乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)的物种。
也优选革兰氏阴性的变形菌(Proteobacteria)，特别是伽马变形菌(Gammaproteobacteria)，诸如属于假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和埃希氏杆菌属(Escherichia)的宿主物种，尤其是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。
在另一个实施方案中，宿主细胞与天然宿主物种是同一个属的，即在与分离得到重组基因的物种同一属的物种中重新引入并表达重组基因。
在另一个实施方案中，宿主细胞是天然宿主物种，即在与分离得到重组基因的同一物种中重新引入并表达重组基因。
生物体
术语“生物体”在涉及本发明时包括能够包含编码根据本发明的酶的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子在存在于生物体中时能够容许根据本发明的核苷酸序列表达的任何生物体。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
术语“转基因生物体”在涉及本发明时包括包含编码根据本发明的酶的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子能够容许编码本发明酶的核苷酸序列在生物体内表达的任何生物体。优选地，将核苷酸序列掺入生物体的基因组。
术语“转基因生物体”不覆盖处于其天然环境中的天然核苷酸编码序列，此时它们处于其天然启动子的控制之下，而后者同样处于其天然环境中。
因此，本发明的转基因生物体包括包含编码根据本发明的酶的核苷酸序列、根据本发明的构建物、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织、或其产物中的任何一种或组合的生物体。
例如，转基因生物体还可以包含编码本发明酶的核苷酸序列且其处于异源启动子的控制之下。
宿主细胞/生物体的转化
如上所述，宿主生物体可以是原核或真核生物体。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌和枯草杆菌。
关于原核宿主转化的讲授在本领域有很好的记录，例如见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前进行合适的修改，诸如清除内含子。
可以使用本领域知道的多种方法转化丝状真菌细胞，诸如牵涉以已知方式形成原生质体，转化原生质体，随后再生细胞壁的过程。EP 0 238 023中描述了使用曲霉(Aspergillus)作为宿主微生物。
另一种宿主生物体可以是植物。关于转化植物的一般技术的综述见Potrykus，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1991，42：205-225；及Christou，Agro-Food-Industry Hi-Tech，1994年3月/4月，17-27。关于植物转化的其它讲授见EP-A-0449375。
下面的节介绍了关于转化真菌、酵母和植物的一般教导。
转化的真菌
宿主生物体可以是真菌，诸如丝状真菌。合适的这种宿主的实例包括属于嗜热霉属(Thermomyces)、支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)等的任何成员。
讲授丝状真菌转化的综述见US-A-5741665，它声明用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术在本领域是众所周知的。关于应用于粗糙链孢霉(N.crassa)的技术的综述见例如Davis和de Serres，Methods Enzymol，1971，17A：79-143。
关于转化丝状真菌的其它技术的综述见US-A-5674707。
在一个方面，宿主生物体可以是曲霉属的，诸如黑曲霉(Aspergillusniger)。
还可以通过遵循例如Martinelli S.D.、Kinghorn J.R.编的《Aspergillus：50years on Progress in industrial microbiology》，第29卷，Elsevier Amsterdam1944，p641-666中Turner G(1944)著的“Vectors for genetic manipulation”的讲授来制备根据本发明的转基因曲霉。
关于丝状真菌中的基因表达的综述见Punt等，2002，Trends Biotechnol，2002年5月，20(5)：200-6；Archer和Peberdy，Crit Rev Biotechnol，1997，17(4)：273-306。
转化的酵母
在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。
关于异源基因在酵母中表达的原理的综述见例如Methods Mol Biol，1995，49：341-54及Curr Opin Biotechnol，1997年10月，8(5)：554-60。
在这个方面，可以使用酵母作为异源基因表达的媒介，诸如物种啤酒糖酵母(Saccharomyces cereviseae)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(见FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)：45-66)。
关于在啤酒糖酵母中表达异源基因和分泌基因产物的原理的综述见EHinchcliffe和E Kenny，1993，“Yeast as a vehicle for the expression ofheterologous genes”，Yeast，Vol.5，Anthony H Rose和J Stuart Harrison编，第2版，Academic Press Ltd.。
关于酵母的转化，已经开发了数种转化方案。例如，可以通过遵循Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Science of the USA，75：1929；Beggs，JD，1978，Nature，London，275：104；及Ito，H等，1983，JBacteriology，153：163-168的讲授来制备根据本发明的转基因糖酵母。
可以使用多种选择标记来选择经过转化的酵母细胞，诸如营养缺陷标记和显性抗生素抗性标记。
转化的植物/植物细胞
适于本发明的宿主生物体可以是植物。关于一般技术的综述可以见Potrykus，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1991，42：205-225及Christou，Agro-Food-Industry Hi-Tech，1994年3月/4月，17-27的论文。
培养和生产
可以在有益于生成所编码酶且易于从细胞和/或培养基中回收酶的条件下培养经过本发明核苷酸序列转化的宿主细胞。
用于培养细胞的培养基可以是适于培养所讨论宿主细胞且使得酶表达的任何常规培养基。
由重组细胞生成的蛋白质可以展示在细胞表面上。
可利用公知的方法，从宿主细胞分泌酶并方便地从培养基中回收。
分泌
通常希望表达宿主将酶分泌到培养基中，由此可以更加容易地回收酶。根据本发明，可以根据期望的表达宿主来选择分泌前导序列。杂合信号序列也可用于本发明的背景。
异源分泌前导序列的典型实例有来自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸的两种形式，例如来自曲霉属)、α-因子基因(酵母，例如糖酵母属、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、和汉逊氏酵母)、或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的分泌前导序列。
举例来说，关于大肠杆菌中异源蛋白质分泌的综述见Methods Enzymol，1990，182：132-43。
检测
本领域知道用于检测和测量氨基酸序列表达的多个方案。实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、和荧光激活细胞分拣术(FACS)。
本领域技术人员知道多种标记物和缀合技术，它们可用于多种核酸和氨基酸测定法。
许多公司，诸如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)，供应用于这些流程的商品化试剂盒和方案。
合适的报道分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光、或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等。讲授这些标记物的用途的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
同样，可以如US-A-4,816,567中所述生成重组免疫球蛋白。
融合蛋白
可以以融合蛋白的形式生成根据本发明使用的氨基酸序列，例如以便于它的提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)、和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体与目的蛋白质序列之间包含蛋白水解切割位点从而能够切除融合蛋白序列也是方便的。
优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白质序列的活性。
关于大肠杆菌中的基因融合表达系统的综述见Curr.Opin.Biotechnol.1995，6(5)：501-6。
在本发明的另一个实施方案中，可以将氨基酸序列与异源序列连接以编码融合蛋白。例如，为了对肽库筛选能够影响物质活性的试剂，编码表达受到商品化抗体识别的异源表位的嵌合物可能是有用的。
大规模应用
在本发明的一个优选实施方案中，将氨基酸序列用于大规模应用。
优选地，培养宿主生物体后产生的氨基酸序列的量为1g每升至约2g每升总细胞培养液体积。
优选地，培养宿主生物体后产生的氨基酸序列的量为100mg每升至约900mg每升总细胞培养液体积。
优选地，培养宿主生物体后产生的氨基酸序列的量为250mg每升至约500mg每升总细胞培养液体积。
食物
本发明的组合物可用作-或用于制备-食物。本文中，术语“食物”以广义来使用，并覆盖用于人的食物以及用于动物的食物(即饲料)。在一个优选的方面，食物是用于人消费的。
食物可以是溶液的形式或作为固体-这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
食物成分
本发明的组合物可用作食物成分。
本文中所用的术语“食物成分”包括加到或可加到功能食物或食品中的配方，并包括在需要例如酸化或乳化的极其多种产品中能以低水平使用的配方。
食物成分可以是溶液的形式或作为固体-这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
食物产品
本发明的组合物可用于制备诸如以下一种或多种的食物产品：糖果产品、乳制品、肉制品、禽产品、鱼产品和焙烤品。
本发明还提供了制备食物或食物成分的方法，该方法包括将根据本发明的脂肪分解酶与其它食物成分混合。
在附带的权利要求书中和在以下附图和实施例中呈现了进一步优选的方面。
附图描述
图1显示了PCR片段SEQ ID No.1，其是部分非酶编码多核苷酸；该序列是广泛用于分类学比较的核糖体16S RNA基因；
图2显示了PCR片段SEQ ID No.2，其是部分非酶编码多核苷酸；该序列是广泛用于分类学比较的核糖体16S RNA基因；
图3显示了编码根据本发明的脂肪分解酶的多核苷酸(SEQ ID No.3)；
图4显示了根据本发明的脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.4)；
图5显示了脂肪分解酶表达载体pGTK(L131)和pET11(131-51)的结构；
图6显示了来自链霉菌属菌种L130的脂肪分解酶对生面团中的二半乳糖苷甘油二酯的效果图；
图7显示了来自链霉菌属菌种L131的脂肪分解酶对生面团中的二半乳糖苷甘油二酯的效果图；
图8显示了来自链霉菌的脂肪分解酶对生面团中的甘油三酯的效果图；
图9显示了得自链霉菌属菌种L131的脂肪分解酶对半乳糖脂底物的pH图谱；
图10显示了提取自经标记为#236的大肠杆菌中表达的链霉菌脂肪分解酶处理的生面团的脂质的TLC板；泳道1＝对照；泳道2＝#236，0.225 PLU-7/g面粉；泳道3＝#236，0.45PLU-7/g面粉；泳道4＝#236，0.675PLU-7/g面粉；泳道5＝DGDG参照材料。
图11显示了由pUC18(L131R)和pIJ48构建的表达载体pRX487；
图12以图的形式显示了温度对来自链霉菌属菌种L131的脂肪分解酶的稳定性和活性的影响；
图13以图的形式显示了来自链霉菌属菌种L131、除虫链霉菌、Corynebacterium efficiens、和褐色喜热裂孢菌的半乳糖脂酶的底物特异性；
图14显示了用于在谷氨酸棒杆菌中表达褐色喜热裂孢菌脂肪酶的表达载体pCB5(TF)的结构；
图15显示了L131与同源除虫链霉菌和褐色喜热裂孢菌的序列对比；
图16显示了粗制大豆油样品的酶处理反应产物的HPTLC板。泳道1＝对照，泳道2＝99％粗制油和1％K371的10％水溶液，泳道3＝98％粗制油和2％K371的10％水溶液，泳道4＝97％粗制油和3％K371的10％水溶液，泳道5＝99.7％粗制油和0.3％Lecitase UltraTM#3108的1％水溶液，泳道6＝99％粗制油、0.3％Lecitase UltraTM#3108和0.7％水的1％水溶液。分析磷脂酰胆碱(PC)作为参照；和
图17显示了粗制大豆油样品的酶处理反应产物的HPTLC板。泳道1＝对照，泳道2＝99％粗制油和1％K371的10％水溶液，泳道3＝98％粗制油和2％K371的10％水溶液，泳道4＝97％粗制油和3％K371的10％水溶液，泳道5＝99.7％粗制油和0.3％Lecitase UltraTM#3108的1％水溶液，泳道6＝99％粗制油、0.3％ Lecitase UltraTM#3108和0.7％水的1％水溶液，以及胆固醇酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯和植物甾醇的参考泳道。
实施例1：产半乳糖脂酶的细菌菌株的鉴定。
从芬兰南部收集的土壤中分离得到具有相似表型的两个微生物菌株，编号为L130和L131。使用寡核苷酸引物536f(CAGCMGCCGCGGTAATWC)和1392r-引物(ACGGGCGGTGTGTRC)通过标准PCR扩增这两个菌株的16S RNA基因。对得到的PCR片段部分测序。SEQ ID No.1和2是非酶编码多核苷酸。这些序列是广泛用于分类学比较的核糖体16S RNA基因。发现SEQ ID No.1和SEQ ID No.2具有高度相似性。然后将该序列与GenBank中的16S RNA基因序列作比较。对于这两个分离株，观察到与Streptomycesthermosacchari的16S RNA基因序列有最高同源性(97％)。所以，将菌株命名为链霉菌属菌种L130和链霉菌属菌种L131。
实施例2：链霉菌属菌种L130和L131菌株的脂肪分解酶(半乳糖脂酶)样品的制备。
将链霉菌L130接种0.5升LB培养基并在旋转摇床上以200rpm和30℃培养2天。将该培养物作为接种体接种10升装有相同培养基的发酵罐。以30℃、搅拌速率600rpm和通气量0.5v/v继续培养3天。将发酵液通过离心(15分钟、5000rpm)澄清并加入Triton X-100至终浓度0.1％。用Vivaflow200超滤器(Vivascience AG，Hannover，德国)将溶液浓缩至300ml。将浓缩液用10升含2mM CaCl2和2mM MgCl2的20mM Tris HCl缓冲液pH 7透析，然后用0.5升85％甘油透析。根据上文定义的测定法(GLU-7)，得到的制品含90U半乳糖脂酶活性。
在相同条件下培养链霉菌L131菌株，并通过相同流程浓缩培养液。得到的半乳糖脂酶制品含70U活性。
实施例3：烘焙实验
来自细菌分离株L130和L131的半乳糖脂酶对极性脂质底物，半乳糖脂(DGDG)和磷脂显示出高活性(半乳糖脂酶和磷脂酶活性)，与尖镰孢脂肪酶(Lipopan FTM Novozymes A/S丹麦)相当：可是，发现来自细菌分离株L130和L131的半乳糖脂酶(即根据本发明的脂肪分解酶)对甘油三酯不具有显著的活性。这与尖镰孢脂肪酶-LipopanFTM的活性形成极大反差。
如实施例2中所述制备细菌分离株L130和L131的脂肪分解酶，并在标准测定条件中和在生面团中进行分析以表征它们对糖脂、磷脂和甘油三酯的活性。
小规模进行烘焙实验和生面团模型系统。两种酶在面粉中对半乳糖脂很有活性。
材料和方法
如实施例3制备每种酶的三个样品。每个样品如表1所示进行标注：
表1
  ID   生物体   标注   GLU-7   PLU-7
  180   链霉菌属菌种L130A   脂肪分解酶0.58PLU/ml   0.95   1.31
  181   链霉菌属菌种L130B   脂肪分解酶0.44PLU/ml   0.91   1.31
  182   链霉菌属菌种L130C   脂肪分解酶1.8PLU/ml   1.21   1.53
  183   链霉菌属菌种L131A   脂肪分解酶0.54PLU/ml   0.63   1.29
  184   链霉菌属菌种L131B   脂肪分解酶0.64PLU/ml   0.84   1.16
  185   链霉菌属菌种L131C   脂肪分解酶0.85PLU/ml   1.35   1.17
通过上文提到的磷脂酶活性测定法(PLU-7)和半乳糖脂酶活性测定法(GLU-7)来评估酶的磷脂酶和半乳糖脂酶活性。
生面浆实验
在12ml有盖离心管中称取0.8克小麦粉。加入1.5ml含酶的水。在样品在回转器(Whirley)上混合并在加热箱中于30℃放置60分钟。加入6ml 9∶1的正丁醇∶乙醇，再次混合样品直至面粉很好的分散到溶剂中。将试管在水浴中于95℃放置10分钟。然后再次混合并在旋转设备上以45rpm放置45分钟。
然后将样品以2000g离心10分钟。将2ml上清液转移至10ml打兰杯(dram glass)。在氮气下于70℃蒸发掉溶剂。
通过GLC分析分离的脂质。
气相色谱
Perkin Elmer 8420毛细管气相层析，装有WCOT熔融石英柱，12.5mx0.25mm IDx0.1μm 5％苯基-甲基-硅树脂(购自Crompack的CP SiI 8 CB)。
载体：氦。
注射：1.5μL，分流(with split)。
检测仪：FID.385℃。
烤炉程序：         1      2     3       4
烤炉温度[℃]       80     200   240     360
等温时间[分钟]     20     0     1       0
升温速率[℃/分钟]  20     10    12
样品制备：将从0.2克面粉提取的脂质溶于2mL 2∶1的庚烷∶吡啶，其中含有2mg/mL内部标准十七烷。将500μL样品转移至曲颈瓶。加入100μLMSTFA(N-甲基-N-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺)并于90℃将反应保温15分钟。
计算：根据这些成分的参照混合物来测定甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、游离脂肪酸和半乳糖脂的响应因子。根据这些响应因子来计算生面团中的脂质。
结果。
对来自链霉菌属的酶的样品分析磷脂酶和半乳糖脂酶活性，其结果如表2所示。还计算了PLU-7/GLU-7活性比率。样品的平均比率是1.4，但在有些样品中有些偏差，其可由分析偏差来解释。
表2
  样品ID   生物体   GLU-7   PLU-7   PLU-7/GLU-7比率
  180   L130A   0.95   1.31   1.4
  181   L130B   0.91   1.31   1.4
  182   L130C   1.21   1.53   1.3
  183   L131A   0.63   1.29   2.0
  184   L131B   0.84   1.16   1.4
  185   L131C   1.35   1.17   0.9
生面团实验。
在如材料和方法所述的生面浆实验中测试酶对小麦脂质的活性。通过GLC分析来自生面团的分离脂质，如表3所示。
表3.生面团脂质的GLC分析(以面粉重量为基准的％)。FFA＝游离脂肪酸。MGMG＝单半乳糖苷甘油单酯。DGMG＝二半乳糖苷甘油单酯。MGDG＝单半乳糖苷甘油二酯。DGDG＝二半乳糖苷甘油二酯。TRI＝甘油三酯。
  样品   酶剂量
  ID   PLU/g面粉   FFA   MGMG   DGMG   MGDG   DGDG   TRI
  185   0.105   0.1642   0.0042   0.0380   0.0345   0.1520   0.5515
  185   0.263   0.1687   0.0130   0.0670   0.0239   0.0941   0.5470
  185   0.526   0.2096   0.0121   0.0664   0.0158   0.0617   0.5460
  185   1.05   0.2597   0.0036   0.0546   0.0068   0.0303   0.5301
  182   0.097   0.1542   0.0051   0.0563   0.0313   0.1148   0.5475
  182   0.244   0.1687   0.0159   0.0785   0.0200   0.0566   0.5280
  182   0.488   0.2095   0.0055   0.0646   0.0098   0.0219   0.5418
  182   0.976   0.2581   0.0092   0.0439   0.0043   0.0045   0.5579
  对照   0   0.1529   0.0006   0.0188   0.0440   0.1443   0.5054
  Lipopan FTM   1.47   0.23   0.03   0.10   0.01   0.07   0.44
表3的结果确认了，在链霉菌属菌种L130和L131的发酵上清液中分离出的酶对生面团中的半乳糖脂很有活性。二酯DGDG和MGDG水解成相应的单酯DGMG和MGMG。图6和7也图示了结果。这些结果确认了，这两种酶在0-0.2单位/g面粉的低剂量很有活性并产生了相应量的单酯。在0.4-1单位/克面粉的更高剂量时，DGDG进一步降解，但也观察到一些单酯水解。这可能暗示，酶对半乳糖脂分子中的脂肪酸位置不是特异性的。
如图8所示，几乎不存在酶对甘油三酯的活性。因此得出结论，所测试的酶对甘油三酯不具有显著的效果。这也与以三丁精作为底物进行的一些实验一致，其中没有观察到有活性。
小结
在链霉菌属菌种的发酵上清液中分离出脂肪分解酶。
发现脂肪分解酶具有磷脂酶和半乳糖脂酶两种活性，但对甘油三酯无显著活性。对于所测试的样品，磷脂酶∶半乳糖脂酶活性的比率约为1.4。
生面浆实验确认了，酶对面粉中的半乳糖脂有活性。酶在0-0.2单位/g面粉的很低剂量时在生面团中有活性。商品化的磷脂酶，像Lipopan FTM(Novozymes A/S，丹麦)，需要高3-4倍的剂量才能获得对半乳糖脂的相同效果。生面浆实验还确认了，来自链霉菌属菌种的酶对甘油三酯不具有可测量的活性。
实施例4：从链霉菌属菌种L131克隆脂肪分解酶基因。
利用修正的标准方法从链霉菌属菌种L131分离染色体DNA。将细菌在旋转摇床上在30℃和高通气条件下(每个0.5升带有障板的烧瓶装有100ml培养基，200rpm)在LB培养基中培养至早期稳定期。从500ml细菌培养液离心收集细胞，并用裂解缓冲液(550mM葡萄糖、100mM Tris、2mMEDTA，pH 8.0)洗涤一次。
将细胞团重悬于10ml裂解缓冲液，并加入溶菌酶至1mg/ml。将细胞于37℃保温至少15分钟。溶菌酶消化后，将细菌悬浮液的等分试样转移至1％SDS溶液中，并于600nm测量所得混合物的吸光度。调整溶菌酶量和保温时间，使得根据A600的降低情况所有细胞中至少70-90％得到裂解。在该时间点，向细菌悬浮液中加入SDS至1％和蛋白酶至0.1mg/ml。将悬浮液于56℃保温30分钟，然后用苯酚和氯仿抽提。氯仿抽提后，用醋酸钠(0.5M终浓度)和异丙醇(0.6vol/vol)沉淀DNA，并用70％乙醇洗涤DNA团，真空干燥并溶于含RNA酶A(0.01mg/ml)的TE缓冲液(10mM Tris、1mMEDTA)。
用限制性内切核酸酶Sau3A部分消化DNA，并将水解产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离。通过电泳从琼脂糖凝胶上分离出3-10kb的Sau3A片段。使用Stratagene(La Jolla，美国)的ZAP表达/预消化载体/Gigapack克隆试剂盒(产品#239615)将该DNA制品用来构建基因文库。按照Stratagene提供的方案，进行连接、包装、扩增文库并将其转变成噬菌粒形式。在如下制备的指示板上筛选质粒形式的所得基因文库。将80ml含25mg/l卡那霉素的无菌LB琼脂置于每个15cm皮氏培养皿中并使之凝固。随后，加入10ml上层琼脂层，其含有0.5％DGDG和0.0005％番红O。以约5000个克隆每个15cm平板的密度涂布基因文库。将平板于37℃保温24小时，然后于室温保温4天。从文库中挑选在指示板上形成红晕的克隆，并通过在新的指示板上克隆来纯化。
将从该克隆分离的质粒(命名为pBK(L131))用于重新转化大肠杆菌菌株XL1-Blue MRF′，使之带有卡那霉素抗性。所有这些转化子都表现出半乳糖脂酶阳性表型。pBK(L131)含有约7.5kb的插入物。对该插入物测序。发现一个测出序列的区域(SEQ ID No.3)含有可读框(SEQ ID No.4)，其编码显示出与来自龟裂链霉菌的已知脂肪酶有同源性的蛋白质。该脂肪酶，脂肪酶/酯酶/酰基转移酶的所谓GDSX家族的一个成员，仅已知能水解中性脂质和人造脂肪酶底物。
构建原始插入物的一系列删除体和亚克隆，并测试半乳糖脂酶活性。发现携带原始插入物的3kb EcoRI-SacI片段的删除衍生物仍保持全部的DGDG酶活性。该数据与部分DNA的结果高度关联。一个区域证明了与已知脂肪酶有同源性。该区域随后测得完整序列。将该序列与GenBank作比较，揭示了经过生化表征的L131半乳糖脂酶的最接近同源物(58.5％)是来自龟裂链霉菌的脂肪酶，在WO04/064987和WO04/064537中鉴定为脂质∶酰基转移酶。
L131半乳糖脂酶在大肠杆菌中的表达。
使用标准pET系统，其中基因在T7噬菌体启动子的控制之下，在大肠杆菌中表达L131半乳糖脂酶。
L131半乳糖脂酶在浅青紫链霉菌中的表达。
用于在浅青紫链霉菌中表达L131半乳糖脂酶的穿梭载体pRX487-5(图11)(衍生自pIJ4987：Kieser T.等，Practical Streptomyces genetics.The JohnInnes Foundation，Crowes，Norwich，英格兰，2000)组合了大肠杆菌质粒pUC18和浅青紫链霉菌质粒pIJ487。在pRX487-5中，pUC18的lac启动子置于pIJ487的无启动子的卡那霉素磷酸转移酶基因的上游。事实上，经质粒转化的大肠杆菌不仅具有氨苄青霉素抗性而且具有至少低水平(5mg/l)的卡那霉素抗性。载体含有未经修饰的S.thermosacchari染色体DNA的EcoRI-XbaI片段，其包含完整的半乳糖脂酶基因编码序列，约有160bp上游非编码序列和420bp下游非编码序列。根据指示板上晕形成的判断，所有转化子显示出相似水平的半乳糖脂酶活性。相似地，在以10升水平培养携带pRX487-5的浅青紫链霉菌并在指示板上克隆时，所有克隆表现出能产生等量的半乳糖脂酶活性。在用直接来自平板的无性繁殖细胞接种的小摇瓶培养物中，转化子通常在培养3天后产生约10-20mU/ml半乳糖脂酶活性。在用重组浅青紫链霉菌的孢子接种摇瓶培养物时，与更高的生物量积累对应，测得更高的半乳糖脂酶活性(约30mU/ml)。在发酵罐中在高通气条件下以补料分批模式培养携带pRX487-5的浅青紫链霉菌(详情参见材料和方法)，在该实验中，生物量积累达到了170g/升(湿重)。因此，检测到更高的半乳糖脂酶活性-约1U/ml。
L131的生化特性。
测试了L131的一些生化特性。发现酶的最适pH约为6.5-7.5(图9)。酶对DGDG在约50℃的温度展示出最大活性。在该温度以上发生失活，但不剧烈，于90℃保温20分钟后检测到约10％的剩余活性(图12)。
实施例5：根据本发明的链霉菌属L131脂肪分解酶基因在大肠杆菌中的表达
用引物oL131-5(GGTGAATTCATGAGATTGACCCGATCCCTGTCGG，有义引物)和oL131-3(ACTTCTAGAGCGGCGCCACCGTGACGTACA，反义引物)通过PCR扩增pBK(L131)的可读框，其编码根据本发明的推定脂肪分解酶。用EcoRI和XbaI消化扩增的DNA片段并克隆到枯草杆菌-大肠杆菌穿梭载体pGTK44中。该载体是通过用pGT44(Kerovuo J.等，Biotechnology Letters 22，1311-1317，2000)的EcoRI-SalI片段替换含degQ36启动子的质粒pGTK44(Povelainen等，Biochem J.371，191-197，2003)的SalI-EcoRI片段而构建的。
利用指示板在用所得质粒pGTK44(L131)转化的大肠杆菌中检测到半乳糖脂酶活性(图5)。对照转化子(含亲本质粒pGTK44)是半乳糖脂酶阴性的。所以，SEQ ID No 4所代表的蛋白质序列确实拥有半乳糖脂酶活性。相同的引物对从链霉菌属菌种L130的染色体DNA扩增出相同大小的片段(通过琼脂糖凝胶电泳)，进一步确认了先前关于两个分离株及其半乳糖脂酶基因密切相似的观察结果。
对于在T7噬菌体启动子控制下的大肠杆菌中的表达，用链霉菌属菌种L131d染色体DNA作为模板，并用两种寡核苷酸引物(oL131-51GGTCATGCTAGCATGAGATTGACCCGATCCCTGTCGG和oL131-31GCATGGATCCGCGGCGCCACCGTGACGTACA)通过PCR扩增推算的半乳糖脂酶编码区。用NheI和BamHI消化PCR产物并与用相同限制性内切核酸酶消化的pET11a(Novagen，美国)载体连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌菌株XL-Blue1 MRF′，分离出具有与pET11(131-51)结构对应的限制性样式的12个不同质粒克隆(图4)。将每个质粒克隆分别用于转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，并在含半乳糖脂酶活性指示层的LB-氨苄青霉素上培养所得转化子(实施例4)。大多数克隆确实表达了有活性的半乳糖脂酶。选择一个克隆(pET11(131-51)-12)作为后续表征的重组半乳糖脂酶来源。
分析了在大肠杆菌中表达的酶(标记为#236)，并在使用本文中教导的GLU-7测定法和PLU-7测定法进行分析时，发现其具有：0.33GLU/ml和0.36PLU/ml。
在液体培养中，大肠杆菌BL21(DE3)在LB-氨苄青霉素培养基中培养40小时后(37℃，200rpm摇动)表达约2mU/ml半乳糖脂酶活性。基本上在培养基中发现了所有活性。在用pET11a(Novagen，美国)转化并在相同条件下培养的大肠杆菌BL21(DE3)中没有检测到半乳糖脂酶活性。
将约4升含半乳糖脂酶的培养液在旋转蒸发器上浓缩至约300ml，并在15升含2mM CaCl2和2mM MgCl2的20mM Tris HCl缓冲液pH 7中进行透析。将透析后的材料在旋转蒸发器上再次浓缩至约30ml并在2升50％甘油中进行透析。得到的制品(18ml)含有约100mU/ml半乳糖脂酶活性。
还在生面团中测试了在大肠杆菌中表达的酶(标记为#236)。如显示TLC板的图10所示，在生面团中观察到对半乳糖脂的高活性。
实施例6：来自链霉菌属菌种L131的根据本发明的脂肪分解酶基因在不同宿主中的表达。
实施例5中概述了载体pGTK44(L131)的构建。除了大肠杆菌，该载体可用于在芽胞杆菌中生成根据本发明的链霉菌属L131脂肪分解酶。利用该载体仅仅是在芽胞杆菌中表达根据本发明的L131脂肪分解酶的许多可能途径之一。例如，pGTK44(L131)中采用的pst启动子可用在芽胞杆菌中有活性的任何其它强组成性或受调节启动子替换。本领域知道许多这样的启动子。例如，degQ36启动子(Yang M等，J.Bacteriol.166：113-119，1986)、cdd启动子，也称为p43(Wang PZ、Doi RH，J.Biol.Chem.259：8619-8625，1984)、淀粉酶或中性蛋白酶启动子等。除了pGTK44(L131)和基于pTZ12复制子的其它芽胞杆菌载体(Aoki T.等，Mol.Gen.Genet.208：348-352，1987)，可使用任何其它质粒载体(如pUB110及其衍生物，Gryczan TJ等，J.Bacteriol.134：318-29，1978)。
用于表达根据本发明的链霉菌属L131脂肪分解酶基因的其它优选宿主是高GC的革兰氏阳性细菌，特别是链霉菌属(例如浅青紫链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、灰色链霉菌(S.griseus)、纳塔尔链霉菌(S.natalensis)、锈赤链霉菌(S.rubiginosus)、橄榄链霉菌(S.olivaceus)、橄榄产色链霉菌(S.olivochromogenes)、紫红链霉菌(S.violaceoruber))，在这些宿主中，可以在多拷贝载体(如利用pIJ110衍生物，诸如pIJ486，Ward等，Mol.Gen.Genet.203：468-478，1986)上在其自身启动子之下导入根据本发明的脂肪分解酶基因，或者置于强链霉菌启动子的控制之下，例如ermE*(Schmitt-John T、Engels JW，Appl.Microbiol.Biotechnol.36：493-498，1992)或硫链丝菌素可诱导的tipA启动子(Kieser T等，在《Practical StreptomycesGenetics》中，p.386，The John Innes Foundation，Norwich，英国，2000)。
除了原核宿主，可以在许多合适的真菌物种之一中表达L131脂肪分解酶基因。具体而言，诸如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等酵母是合适的。在酵母中，可以将脂肪分解酶基因置于任何已知强酵母启动子的控制下，诸如糖酵解启动子(PGK、GDH、ENO等)、磷酸盐饥饿诱导的启动子诸如PHO5、乙醇/甲醇代谢的启动子诸如酿酒酵母中的ADH1启动子、或多形汉逊酵母或巴斯德毕氏酵母中的甲醇可诱导启动子。
在任何宿主中表达脂肪分解酶时，构建编码序列SEQ ID No.4的合成或半合成基因将是有益的。同样，根据可通过实施例4中所解释的计算机同源性检索得到的序列，可以设计部分或完全合成的基因。这种序列可引入野生型脂肪分解酶基因中缺乏的许多有用特征。例如，可修正密码子偏好以更好地适应表达宿主的密码子偏好。可用于所有宿主的密码子偏好修正的一个特殊例子是将SEQ ID No 3的GTG起始密码子转变成ATG。对于本领域技术人员显而易见的另一项典型修正是将L131脂肪分解酶的天然链霉菌信号序列换成在所选表达宿主中天然的或已知有功能的信号序列。
前面用于L131脂肪分解酶的有用表达系统的例子集中于利用质粒载体将脂肪分解酶基因导入表达宿主。这确实是实现本发明的优选模式。可是，将表达盒(包括启动子、脂肪分解酶基因编码区和任选的转录终止子)整合到染色体中的一种可选方法也是可行的。具体而言，将表达盒多拷贝的整合到宿主染色体中将是有效的。
可以有益地突变表达脂肪分解酶基因的重组宿主以降低培养基中的蛋白酶活性水平。任何此类重组宿主的培养可在存在稳定酶的化合物时进行。此类化合物可以是各种蛋白质(如酪蛋白、血清清蛋白的胨)或不同的脂质、溶血脂质或洗涤剂(如半乳糖脂、单和二酰甘油或Triton X-100)。
实施例7：链霉菌属L131脂肪分解酶及其衍生物的酰基转移酶活性
有些脂肪酶可能还具有酰基转移酶活性。具体而言，GDSX家族的有些成员，例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)酰基转移酶(P10480)(在共同未决的国际申请PCT/IB2004/000655中有教导)，具有高酰基转移酶活性。所以，预测链霉菌属L131脂肪分解酶可能也具有酰基转移酶活性。通过随机突变/定向进化可进一步增强该活性。另外，由于嗜水气单胞菌酰基转移酶和链霉菌属L131脂肪分解酶共享相同的整体蛋白质折叠，有可能将链霉菌属L131脂肪分解酶的底物特异性与气单胞菌属酶的高转移酶效率结合起来。可通过靶向诱变/蛋白质设计或通过基因改组的已知技术来实现该结合。
实施例8：来自其它链霉菌属物种的可选脂肪分解酶的鉴定。
GDSX酯酶家族(Upton C、Buckley JT，Trends Biochem.Sic.20：178-179，1995，pfam00657.11)是在活性位点丝氨酸周围共享特定序列基序(GDSX，其中X是疏水氨基酸残基)的一组酯酶/脂肪酶/酰基转移酶。该组酶也称为脂肪酶家族II(Arpigny JL、Jaeger K-E，Biochem.J.343：177-183，1999)。尽管该家族包括许多不同类型的酯酶、脂肪酶和酰基转移酶，但是根据本发明的脂肪分解酶是GDSX酶。
所以，本发明教导的链霉菌属菌种L131脂肪分解酶(半乳糖脂酶)序列可用于在计算机上鉴定来自其它链霉菌属物种的其它半乳糖脂酶。
为了确定蛋白质是否具有根据本发明的GDSX基序，优选将序列与pfam数据库的隐蔽马尔科夫(Markov)模型序型(profile)(HMM序型)进行比较。
pfam是蛋白质结构域家族的数据库。pfam包含排列好的每个家族的多重序列对比，以及用于在新序列中鉴定这些结构域的序型隐蔽马尔科夫模型(序型HMM)。关于pfam的介绍见Bateman A等，2002，Nucleic Acids Res.30：276-280。隐蔽马尔科夫模型在致力于蛋白质分类的许多数据库中得到采用，综述见Bateman A和Haft DH，2002，Brief Bioinform 3：236-245。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed &list_uids＝12230032&dopt＝Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed &list_uids＝11752314&dopt＝Abstract
关于隐蔽马尔科夫模型的详细解释和它们在pfam数据库中是如何应用的见Durbin R、Eddy S和Krogh A，1998，Biological sequence analysis；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4。Hammer软件包可以从华盛顿大学(St Louis，USA)获得。
或者，可以使用Hammer软件包来鉴定GDSX基序，指令见Durbin R、EddyS和Krogh A，1998，Biological sequence analysis；probabilistic models ofproteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4及其参考文献，以及此说明书中提供的HMMER2序型。
可以通过例如目前位于下列网站的几个服务器访问PFAM数据库。
http://www sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
数据库提供了能够输入蛋白质序列的搜索工具。使用数据库的默认参数，就将对蛋白质序列分析是否存在Pfam结构域。GDSX结构域是数据库中已经确定的结构域，因此它在任何检索序列中的存在都将受到识别。数据库将对检索序列报告其与Pfam00657共有序列的对比。
优选地，在与Pfam00657共有序列对比时，本发明组合物/方法所使用的脂肪分解酶具有GDSx模块、GANDY模块和HPT模块中的至少一个、优选超过一个、优选超过两个。适宜地，脂肪分解酶可以具有GDSx模块和GANDY模块。或者，酶可以具有GDSx模块和HPT模块。优选地，酶包含至少GDSx模块。
pfam00657GDSX结构域是区分具有此结构域的蛋白质与其它酶的独特鉴别物。
另外/或者，通过与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示一种或多种PCR序列片段进行序列同一性比较和/或杂交，可以从其它链霉菌属物种鉴定可选脂肪分解酶。适宜地，可以与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中超过15个核苷酸的片段，优选与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中超过20个核苷酸的片段进行比较。适宜地，可以使用SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的完整序列。优选地，在高或很高严谨条件下进行杂交。与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列指示可能是根据本发明的脂肪分解酶，即半乳糖脂酶的来源的链霉菌属菌株。
实施例9：应用于本申请方法和用途中的半乳糖脂酶的鉴定
如上所述，新的Streptomyces thermosacchari L131序列提供了在计算机上鉴定新的家族II半乳糖脂酶的可能性。在这方面，特别感兴趣的一个特别区域是GDSX基序。
GDSX基序由四个保守氨基酸构成。优选地，基序中的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，GDSX基序的丝氨酸可以位于与Brumlik和Buckley，Journal of Bacteriology，1996年4月，Vol.178，No.7，p 2060-2064中讲授的嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Ser-16对应的位置。
为了确定蛋白质是否具有GDSX基序，优选将序列与pfam数据库的隐蔽马尔科夫模型序型(HMM序型)进行比较。如实施例8中所述，pfam是蛋白质结构域家族的数据库。所以，pfam数据库还可用于鉴定来自链霉菌属以外的属的合适的酶。
或者，可以使用Hammer软件包来鉴定GDSX基序，指令见Durbin R、EddyS和Krogh A，1998，Biological sequence analysis；probabilistic models ofproteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4及其参考文献，以及此说明书中提供的HMMER2序型。
优选地，根据本发明的脂肪分解酶包含GDSX基序。
在与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No 4)对比时，
i)本发明的、或应用于本发明方法中的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶，优选具有GDSx基序，更优选GDSY基序。
和/或
ii)本发明的、或应用于本发明方法中的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶，优选具有GANDY模块，更优选GANDY模块，其包含氨基酸GGNDx，更优选GGNDA或GGNDL。
和/或
iii)本发明的、或应用于本发明方法中的酶，优选具有HTP模块。
并优选
iv)本发明的、或应用于本发明方法中的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶，优选具有GDSY基序和GANDY模块和HTP模块(保守的组氨酸)，所述GANDY模块包含氨基酸GGNDx，优选GGNDA或GGNDL。
在这点上，本发明人鉴定了与链霉菌属L131同源但不含GDSX基序的序列：即Novosphingobium aromaticivorans(NAL)
Novosphingobium\aromaticivorans\GDSx 284 aa
SEQ ID No.10
ZP 00094165
  1 mgqvklfarr capvllalag lapaatvare aplaegaryv algssfaagp gvgpnapgsp
 61 ercgrgtlny phllaealkl dlvdatcsga tthhvlgpwn evppqidsvn gdtrlvtlti
121 ggndvsfvgn ifaaacekma spdprcgkwr eiteeewqad eermrsivrq iharaplarv
181 vvvdyitvlp psgtcaamai spdrlaqsrs aakrlarita rvareegasl lkfshisrrh
241 hpcsakpwsn glsapaddgi pvhpnrlgha eaaaalvklv klmk
/
SEQ ID No.11
  1 tgccggaact caagcggcgt ctagccgaac tcatgcccga aagcgcgtgg cactatcccg
 61 aagaccaggt ctcggacgcc agcgagcgcc tgatggccgc cgaaatcacg cgcgaacagc
121 tctaccgcca gctccacgac gagctgccct atgacagtac cgtacgtccc gagaagtacc
181 tccatcgcaa ggacggttcg atcgagatcc accagcagat cgtgattgcc cgcgagacac
241 agcgtccgat cgtgctgggc aagggtggcg cgaagatcaa ggcgatcgga gaggccgcac
301 gcaaggaact ttcgcaattg ctcgacacca aggtgcacct gttcctgcat gtgaaggtcg
361 acgagcgctg ggccgacgcc aaggaaatct acgaggaaat cggcctcgaa tgggtcaagt
421 gaagctcttc gcgcgccgct gcgccccagt acttctcgcc cttgccgggc tggctccggc
481 ggctacggtc gcgcgggaag caccgctggc cgaaggcgcg cgttacgttg cgctgggaag
541 ctccttcgcc gcaggtccgg gcgtggggcc caacgcgccc ggatcgcccg aacgctgcgg
601 ccggggcacg ctcaactacc cgcacctgct cgccgaggcg ctcaagctcg atctcgtcga
661 tgcgacctgc agcggcgcga cgacccacca cgtgctgggc ccctggaacg aggttccccc
721 tcagatcgac agcgtgaatg gcgacacccg cctcgtcacc ctgaccatcg gcggaaacga
 781 tgtgtcgttc gtcggcaaca tcttcgccgc cgcttgcgag aagatggcgt cgcccgatcc
 841 gcgctgcggc aagtggcggg agatcaccga ggaagagtgg caggccgacg aggagcggat
 901 gcgctccatc gtacgccaga tccacgcccg cgcgcctctc gcccgggtgg tggtggtcga
 961 ttacatcacg gtcctgccgc catcaggcac ttgcgctgcc atggcgattt cgccggaccg
1021 gctggcccag agccgcagcg ccgcgaaacg gcttgcccgg attaccgcac gggtcgcgcg
1081 agaagagggt gcatcgctgc tcaagttctc gcatatctcg cgccggcacc atccatgctc
1141 tgccaagccc tggagcaacg gcctttccgc cccggccgac gacggcatcc cggtccatcc
1201 gaaccggctc ggacatgctg aagcggcagc ggcgctggtc aagcttgtga aattgatgaa
1261 gtagctactg cactgatttc aaatagtatt gcctgtcagc tttccagccc ggattgttgc
1321 agcgcaacag aaacttgtcc gtaatggatt gatggtttat gtcgctcgca aattgccgtc
1381 gaagggaacg ggcgcgtcgc tcgttaacgt cctgggtgca gcagtgacgg agcgcgtgga
1441 tgagtgatac tggcggtgtc atcggtgtac gcgccgccat tcccatgcct gtacgcgccg
//
该酶包含序列“GSSF”而不是GDSX。
测试后发现该酶不包含根据本发明的糖脂酶活性。
所以，在尝试鉴定其它合适的半乳糖脂酶时，GDSx基序可能是重要的。
注意，已经纯化和生化鉴定并显示出与链霉菌属L131约56％序列同源性的来自龟裂链霉菌的酶(Abramic M.等，1999；Vujaklija D.等，2002)，已知水解中性脂质，诸如三油精或脂肪的硝基苯基酯。来自龟裂链霉菌的酶还可水解根据本发明的半乳糖脂酶。相似地，可得到其基因组序列数据的其它两个链霉菌属物种-天蓝色链霉菌A2(3)和除虫链霉菌可能含有具有半乳糖脂酶活性的酶，例如NP 625998和NP 827753在GenBank中现在注释为“推测的分泌型水解酶”。
通过相似方法可鉴定链霉菌属L131半乳糖脂酶的许多其它有用同源物。利用Align X、VectorNTI的Clustal W成对对比算法使用缺省设置，通过与L131序列对比，可鉴定适用于本发明方法中的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶。
或者，通过与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)对比，可鉴定适用于本发明方法中的半乳糖脂酶。
图15显示了L131与来自除虫链霉菌和褐色喜热裂孢菌的同源物的序列对比。图15图示了保守的GDSx基序(在L131和除虫链霉菌和褐色喜热裂孢菌中的GDSY)、或为GGNDA或为GGNDL的GANDY盒、和HPT模块(认为是保守的催化性组氨酸)。这三个保守模块在图15中突出显示。
在与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No 4)对比时，有可能鉴定出三个保守区，GDSx模块、GANDY模块和HTP模块(进一步详情可见WO04/064987)。
实施例10：基因克隆和表达载体的构建
使用Corynebacterium efficiens DSM 44549、褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fiisca)DSM 43792和除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)DSM 46492来分离与S.thermosacchari L131的半乳糖脂酶基因同源的基因。
符合DSM编号的菌株保藏于德国微生物和细胞培养物保藏机构(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)并可公开获得。
使用大肠杆菌菌株XL-Blue MRF′、BL21(DE3)(Novagen)和S17-1(Simon R.等，1983)、枯草杆菌BD 170、浅青紫链霉菌菌株1326(John LinesCentre)、谷氨酸棒杆菌DSM 20300作为异源表达的宿主。还使用杀鲑气单胞菌菌株DSM 12609作为表达宿主。
我们实验室从自然环境中分离到了S.thermosacchari L131、弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)P3-42和超压肠杆菌(Enterobacter nimipressuralis)P1-60并通过16S rRNA基因测序进行了分类学鉴定。
此项研究中使用以下培养基。使用LB(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l NaCl，pH 7.0)、2xYT(10g/l NaCl、10g/l酵母提取物、16g/l胰蛋白胨)来培养大肠杆菌和其它革兰氏阴性细菌。使用营养肉汤(3g/l牛肉提取物、5g/l蛋白胨，pH 7.0)来培养C.efficiens和N.aromaticivorans，使用YM肉汤(3g/l酵母提取物、3g/l麦芽提取物、5g/l蛋白胨、10g/l右旋糖，pH 7.0)来培养除虫链霉菌，培养基65(4g/l葡萄糖、4g/l胰蛋白胨、10g/l麦芽提取物、2g/l CaCO3，pH 7.2)用于褐色喜热裂孢菌。
DNA分离。
通过标准碱裂解流程结合Qiagen柱纯化方法来分离质粒。从链霉菌中制备性分离质粒DNA是一个例外。在该情况中，使用CsCl梯度平衡离心作为最终的纯化步骤。
用于将DNA导入微生物菌株的方法。
通过电穿孔使用1mm电击杯和以下电穿孔参数设置来转化大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株：1800V，25℉。200μl枯草杆菌BD170通过基于天然感受态(natural competence)的“巴黎”法来转化(Harwood C.R.和Cutting S.M.，1990)。浅青紫链霉菌通过原生质体法来转化(Kieser T.等，2000)。利用Harayama等(1980)的滤器交配(filter mating)法通过与大肠杆菌的接合而将DNA导入杀鲑气单胞菌。
杀鲑气单胞菌的利福平抗性突变体的构建。
将来自杀鲑气单胞菌DSM 12609过夜培养物的约108个细胞置于含5-30mg/l利福平的一系列LB琼脂板上。使用SpectroLinker XL-1500设备(Spectronics Corp.美国)用短波紫外线照射平板。照射剂量为4-6J/M2。将平板于30℃保温2天。挑选在30mg/l利福平上生长的几个克隆并在50mg/l利福平上进行额外的测试。选出了耐受50mg/l利福平的一个克隆(命名为R1)进行后续工作。
用于L131半乳糖脂酶同源物的大肠杆菌表达载体的构建。
通过PCR，利用染色体DNA作为模板并利用两种寡核苷酸引物oSAL-5(GGGAATTCCATATGAGACGTTCCCGAATTACG)和oSAL-3(GCATGGATCCGGTGACCTGTGCGACGG)，扩增除虫链霉菌的脂肪酶基因。对于褐色喜热裂孢菌和Corynebacterium efficiens脂肪酶基因的扩增，所用寡核苷酸引物分别是oTFL-5(GGGAATTCCATATGGGCAGCGGACCACGTG)和oTFL-3(GCATGGATCCGACACGCACGGCTCAACG)、oCEL-5(GGGAATTCCATATGAGGACAACGGTCATCG)和oCEL-3(GCATGGATCCGGCATCGGGCTCATCC)。用NdeI和BamHI消化PCR产物并与用相同限制性内切核酸酶消化的pET11a(Novagen，美国)连接。
如下构建用于浅青紫链霉菌的L131半乳糖脂酶表达载体。质粒pUC18(L131RX)含有携带L131脂肪酶基因的原始克隆DNA片段(pBK(L131))的1.37kb EcoRI-XbaI片段，用EcoRI消化该质粒并与用EcoRI消化的pIJ487(Kieser等，2000)连接。该连接导致形成了pIJ487和pUC18(L131RX)相对取向不同的两种重组质粒。为了后续工作，根据限制性分析选择其中pUC18的lac启动子位于pIJ487的无启动子neoR基因侧翼的变体。该构建物命名为pRX487-5(图11)。除了氨苄青霉素抗性，该质粒还赋予大肠杆菌对至少3mg/l卡那霉素的抗性。用0.1-10μg pRX487-5转化浅青紫链霉菌1326的原生质体，使之带有硫链丝菌素(1.2mg/l)和卡那霉素(5mg/l)抗性。根据DGDG-番红指示板测定法的判断，这些转化子生成活性半乳糖脂酶。将转化子置于添加有5mg/ml卡那霉素的SM板(Kieser等，2000)上，并使之形成孢子。将得到的孢子用于接种摇瓶和发酵罐培养物。
用于谷氨酸棒杆菌的表达载体的构建。
用于此项工作的所有表达载体都是基于质粒pCB5的，该质粒是携带质粒pSR1(Yoshihama等，1985)的谷氨酸棒杆菌复制子和大肠杆菌的ColE1复制子的穿梭载体。该载体中所使用的启动子衍生自编码谷氨酸棒杆菌主要分泌蛋白-PS1的cop1基因。酶由它们的天然基因来表达，包括未修饰的信号肽，如褐色喜热裂孢菌(图14)。
发酵条件
产脂肪酶的链霉菌属菌株的发酵。
在摇瓶中，在含有(每升)10g蛋白胨、5g酵母提取物、2g K2HPO4和10g葡萄糖(pH 7.0)并添加合适抗生素的培养基中培养产脂肪酶的重组浅青紫链霉菌菌株：使用浓度硫链丝菌素为1.2mg/l、卡那霉素为20mg/l、氯霉素为1.5mg/l而红霉素为1.5mg/l。使用通过在SM板上培养转化子而产生的孢子悬浮液来起动培养。
对于补料-分批发酵，使用Braun Biostat E发酵罐(10升)。初始培养基(7升)含有(每升)：蛋白胨20g、酵母提取物10g、葡萄糖20g和上述合适的抗生素(除了硫链丝菌素，其不用于10升培养)。以30℃、恒定的10升/分钟通气量和600rpm搅拌速率进行培养。如前面段落中所述，在2升爱伦美氏(Erlenmeyer)烧瓶中培养接种体(每次发酵2x250ml)。发酵以分批模式进行18-20小时，然后将含30％葡萄糖和12.5％蛋白胨的溶液以0.5ml/分钟的速率投入发酵罐培养物中。每天两次无菌采集培养物样品(30ml)。
重组谷氨酸棒杆菌菌株的发酵。
在含50mg/l卡那霉素的LB中以30℃和200rpm摇动速率培养谷氨酸棒杆菌的摇瓶培养物。
重组杀鲑气单胞菌菌株的发酵。
在摇瓶中，在添加了链霉素和卡那霉素(为20mg/l)的2xYT培养基中培养重组杀鲑气单胞菌菌株。为了诱导tac启动子，向生长培养基中加入IPTG(1-5mM)或乳糖(1-10％)。
以发酵罐规模测试用于在杀鲑气单胞菌中生产重组酰基转移酶的两组条件。在第一个实验中，初始培养基(7升)是添加有2％葡萄糖、50mg/l卡那霉素和50mg/l链霉素的2xYT，而补料溶液(3升)含有25％葡萄糖、10％胰蛋白胨和5％酵母提取物、100mg/l卡那霉素和链霉素。以10升/分钟通气量、600rpm搅拌速率和28℃进行培养。用25％NH3和10％磷酸将pH调至7.5。用0.5升杀鲑气单胞菌过夜培养物接种发酵罐，并以分批模式培养24小时。在该时间点，加入IPTG至5mM并以50ml/h的速率开始补料。
在第二个实验中，修改初始培养基，即用乳糖代替葡萄糖。补料溶液为2升20％乳糖。发酵温度提高至30℃，并将培养基的pH降至7.0。如第一个实验进行接种，并在初始培养基中培养20小时后开始补料(100ml/h)。
酶测定法
番红板筛选方法。
在番红板筛选中，底层含有培养基+添加剂，1.5％琼脂糖和0.002％番红(0.2％储存水溶液，无菌过滤)，而顶层为0.7％琼脂糖、1％DGDG和0.002％番红。
半乳糖脂酶活性的测定(糖脂酶活性测定法(GLU-7))：
底物
将0.6％二半乳糖苷甘油二酯(Sigma D 4651)、0.4％Triton-X 100(SigmaX-100)和5mM CaCl2溶于pH 7的0.05M HEPES缓冲液。
测定流程：
将400μL底物加到1.5mL Eppendorf管中并在Eppendorf热混合器中于37℃放置5分钟。在时间t＝0分钟时，加入50μL酶溶液。用水代替酶来进行空白分析。将样品在Eppendorf热混合器中于37℃以10x100rpm混合10分钟。在时间t＝10分钟时，将Eppendorf管在另一个热混合器中于99℃放置10分钟，以终止反应。
使用WAKO GmbH的NEFA C试剂盒来分析样品中的游离脂肪酸。
根据在测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔量，计算在pH 7的酶活性GLU。
磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性测定法(PLU-7))：
底物
将0.6％L-α磷脂酰胆碱，95％植物(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2散布于pH 7的0.05M HEPES缓冲液。
测定流程：
将400μL底物加到1.5mL Eppendorf管中并在Eppendorf热混合器中于37℃放置5分钟。在时间t＝0分钟时，加入50μL酶溶液。用水代替酶来进行空白分析。将样品在Eppendorf热混合器中于37℃以10x100rpm混合10分钟。在时间t＝10分钟时，将Eppendorf管在另一个热混合器中于99℃放置10分钟，以终止反应。
使用WAKO GmbH的NEFA C试剂盒来分析样品中的游离脂肪酸。
根据在测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔量，计算在pH 7的酶活性PLU-7。
使用棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)进行的分光光度测定法。
通过在30℃进行的分光光度测定法测量脂肪酶活性，其中以pNPP作为底物并使用含0.4％Triton X-100和0.1％阿拉伯树胶的50mM Tris-马来酸盐缓冲液(pH 6.5)。在二噁烷中制备底物储存液(100mM)。通过将酶加入反应混合物中来开始动力学测量。为了评估初始水解活性，用Spectramax读板仪每20秒测定410nm处吸收的增加达20分钟。一个单位的脂肪酶活性定义为每分钟释放出1μmol对硝基酚的酶量。通过使用1mM每种底物，以相同方式测量了对其它p-NP酯的活性(Abramic M.等，1999)。
pH和温度对脂肪酶活性的影响的测定。
为了测定pH对酶活性的影响，通过半乳糖脂酶活性测定法对pH 2-10的范围进行了测量，只是实验中所用的缓冲液如下：pH 2-3.5的甘氨酸-HCl；pH 4-5的NaOAc；pH 5.5-7.5的Tris-马来酸盐；pH 7.5-9的Tris-HCl；pH 10的CAPS。
通过将酶的等分试样在冰上保温60分钟后在各种温度(22℃-90℃)保温20分钟，来测定温度对半乳糖脂酶稳定性的影响。通过半乳糖脂酶活性测定法来分析剩余活性。
为了检测对半乳糖脂酶活性的最佳温度，在所需温度(范围为20℃-70℃)平衡常用的测定混合物，并加入2或4μl酶开始反应。通过半乳糖脂酶活性测定法来分析活性，但使用较短的时间(20分钟)。
实施例11：生物多样性研究中的半乳糖脂酶候选物的表征。
Streptomyces thermosacchari L131半乳糖脂酶序列提供了在计算机上鉴定新的家族II半乳糖脂酶的可能性。
可鉴定出链霉菌属L131半乳糖脂酶的许多其它有用同源物，例如来自褐色喜热裂孢菌的“推测的蛋白质”(ZP_00058717)和来自Corynebacteriumefficiens的“推测的蛋白质”(NP_738716)。
我们克隆并表达了链霉菌属L131半乳糖脂酶的3种同源物：除虫链霉菌(SAL)、褐色喜热裂孢菌(TFL)、和Corynebacterium efficiens(CEL)的基因。利用pET表达系统在大肠杆菌中表达所有基因。首先利用含番红的DGDG-指示板来分析重组大肠杆菌菌株，发现除虫链霉菌、褐色喜热裂孢菌和C.efficiens的酶具有半乳糖脂酶活性。
进一步检验显示半乳糖脂酶活性的酶。研究了那些半乳糖脂酶候选物的底物特异性(图13)。测试了候选酶针对DGDG、卵磷脂、橄榄油、丁酸硝基苯酯、癸酸硝基苯酯(NP-D)和棕榈酸硝基苯酯的活性。发现酶具有非常不同的底物特异性图谱。在使用NP-D作为底物的测定法中测试了酰基转移酶活性，并用NEFA试剂盒量化释放出的硝基酚和游离脂肪酸。初步数据提示，至少来自褐色喜热裂孢菌的酶具有针对甘油和葡萄糖的转移酶活性。
测试了半乳糖脂酶候选物的热稳定性。发现Corynebacterium efficiens的酶是对热最稳定的，而除虫链霉菌的酶是对热最敏感的。
实施例12：Streptomyces thermosacchari L131的脱胶试验
在粗制大豆油中测试来自Streptomyces thermosacchari L131的磷脂酶。
材料和方法
K371：将在浅青紫链霉菌中表达的Streptomyces thermosacchari L131酶在淀粉上冷冻干燥。
(活性：108PLU-7/g)。
Lecitase Ultra(#3108)，来自Novozymes，丹麦
胆固醇酯：Fluka 26950
植物甾醇：Generol 122N，来自Henkel，德国
粗制大豆油：来自The Solae Company，Aarhus，丹麦
卵磷脂：L-α磷脂酰胆碱，95％植物(Avanti#441601)
磷脂酶活性
磷脂酶测定法与实施例10中所用的相同。
HPTLC
进样仪：自动TLC取样器4，CAMAG
HPTLC板：20x10cm，Merck no.1.05641。使用前在160℃活化30分钟。
加样：利用自动TLC进样仪将1μl含8％油的缓冲液溶液加进HPTLC板。
运行缓冲液4：75∶25∶4的氯仿∶甲醇∶水
运行缓冲液5：70∶30∶1的P-醚(P-ether)∶甲基-叔丁基酮∶醋酸
加样/洗脱时间：
运行缓冲液4：20分钟
运行缓冲液5：10分钟
TLC显影
将平板在烤炉中于160℃干燥10分钟，冷却，并浸入含6％乙酸铜的16％H3PO4。于160℃另外干燥10分钟，并直接进行评估。
脱胶实验
将Streptomyces thermosacchari L131(K371)以表4所示配方用于脱胶研究。
将样品于40℃放置18小时并摇动，然后采集样品进行HPTLC分析，将样品溶于2∶1的氯仿∶甲醇。
表4.粗制大豆油用Streptomyces thermosacchari L131和Lecitase UltraTM脱胶
  泳道   1   2   3   4   5   6
  粗制大豆油   ％   99   99   98   97   99.7   99
  K371，10％水溶液   ％   1   2   3
  Lecitase UltraTM，1％水溶液   ％   0.3   0.3
  水   ％   1   0   0   0   0.7
HPTLC分析结果如图16和图17所示。
图16显示了根据表4的粗制大豆油样品的酶处理反应产物的TLC板(缓冲液4)。作为参照，还分析了磷脂酰胆碱(PC)。也显示了磷脂酰乙醇胺(PE)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)。
图16中的TLC结果清楚显示了磷脂酰胆碱完全被加入油中的Streptomyces thermosacchari L131去除了。只有最低剂量(泳道2)未能完全水解磷脂。在有5％的水(泳道6)时，Lecitase UltraTM也水解油中的磷脂，但不添加额外的水(泳道5)则只有部分磷脂水解。
图17显示了根据表4的粗制大豆油样品的酶处理反应产物的TLC(缓冲液5)。胆固醇酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯和植物甾醇作为参照。也显示了游离脂肪酸(FFA)。
图17所示的结果显示了磷脂的水解与游离脂肪酸的形成一致。
结论。
上述结果确证了，Streptomyces thermosacchari L131有效水解粗制大豆油中的磷脂，并是对植物油脱胶的合适的可选的酶。
将以上说明书中提及的所有文献引入本文作为参考。对本领域技术人员而言，在不背离本发明范围和精神的情况下，本发明所述的方法和系统的各种修改和变化将是显而易见的。尽管本发明已经结合具体的优选实施方案进行了描述，但是应当理解，所要求的发明不应过度局限于这些具体的实施方案。实际上，对于生化和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意图包括在所附权利要求书的范围内。
参考文献
Abramic M.，Lescic I.，Korica T.，Vitale L.，Saenger W.，Pigac J.Purification and properties ofextracellular lipase from Streptomyces rimosus.Enzyme and Microbial Technology 25，522-529(1999)
Harayama S.，Masataka T.，Iino T.High-frequency mobilisation of the chromosome ofEscherichia coli by a nutant of plasmid RP4 temperature sensitive for maintenance.Mol.Gen.Genet.180，47-56(1980)。
Harwood C.R.and Cutting S.M.Molecular biological methods for Bacillus.John Wiley &Sons Ltd.，West Sussex，England(1990)
Kieser T.，Bibb M.J.，Buttner M.J.，Chater K.F.，Hopwood D.A.Practical Streptomycesgenetics.The John Innes Foundation，Crowes，Norwich，England(2000)
Vujaklija D.，Schroder W.，Abramic M.，Zou P.，Lescic L，Franke P.，Pigac J.A novelstreptomycete lipase：cloning，sequencing and high-level expression of the Streptomycesrimosus GDS(L)-lipase gene.Arch.Microbiol.178，124-130(2002)
Yoshihama M，Higashiro K，Rao EA，Akedo M，Shanabruch WG，Follettie MT，Walker GC，Sinskey AJ.Cloning vector system for Corynebacterium glutamicum.J Bacteriol.162(2)：591-597(1985)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
                国际局表格
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
BP/4表(只此一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
                    国际局表格
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
BP/9表(第1页)
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
BP/9表(第2页且最后一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
                  国际局表格
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
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布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
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1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
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4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
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序列表
<110>丹尼斯科公司(DANISCO A/S)
<120>脂肪分解酶及其在食品工业中的应用
<130>P020282CNB
<140>200580024003.8
<141>2005-07-18
<150>GB 0416035.4
<151>2004-07-16
<150>US 60/591,185
<151>2004-07-26
<150>GB 0513859.9
<151>2005-07-07
<160>32
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>435
<212>DNA
<213>链霉菌属(Streptomyces sp.)
<400>1
gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc     60
gtaaacggtg ggcactaggt gtgggcaaca ttccacgttg tccgtgccgc agctaacgca    120
ttaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg    180
cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg    240
cttgacatac accggaaacg gccagagatg gtcgccccct tgtggtcggt gtacaggtgg    300
tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttcgggt taagtcccgc aacgagcgca    360
accttatcct gtgttgccag cggatccctt cgggggtgcc ggggactcac gggagactgc    420
cggggtcaac tcgga                                                     435
<210>2
<211>435
<212>DNA
<213>链霉菌属
<400>2
gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc     60
gtaaacggtg ggcactaggt gtgggcaaca ttccacgttg tccgtgccgc agctaacgca    120
ttaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg    180
cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg    240
cttgacatac accggaaacg gccagagatg gtcgccccct tgtggtcggt gtacaggtgg    300
tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa    360
cccttatcct gtgttgccag cggatccctt cgggggtgcc ggggactcac gggagactgc    420
cggggtcaac tcgga                                                     435
<210>3
<211>1371
<212>DNA
<213>链霉菌L131
<400>3
acaggccgat gcacggaacc gtacctttcc gcagtgaagc gctctccccc catcgttcgc     60
cgggacttca tccgcgattt tggcatgaac acttccttca acgcgcgtag cttgctacaa    120
gtgcggcagc agacccgctc gttggaggct cagtgagatt gacccgatcc ctgtcggccg    180
catccgtcat cgtcttcgcc ctgctgctcg cgctgctggg catcagcccg gcccaggcag    240
ccggcccggc ctatgtggcc ctgggggatt cctattcctc gggcaacggc gccggaagtt    300
acatcgattc gagcggtgac tgtcaccgca gcaacaacgc gtaccccgcc cgctgggcgg    360
cggccaacgc accgtcctcc ttcaccttcg cggcctgctc gggagcggtg accacggatg    420
tgatcaacaa tcagctgggc gccctcaacg cgtccaccgg cctggtgagc atcaccatcg    480
gcggcaatga cgcgggcttc gcggacgcga tgaccacctg cgtcaccagc tcggacagca    540
cctgcctcaa ccggctggcc accgccacca actacatcaa caccaccctg ctcgcccggc    600
tcgacgcggt ctacagccag atcaaggccc gtgcccccaa cgcccgcgtg gtcgtcctcg    660
gctacccgcg catgtacctg gcctcgaacc cctggtactg cctgggcctg agcaacacca    720
agcgcgcggc catcaacacc accgccgaca ccctcaactc ggtgatctcc tcccgggcca    780
ccgcccacgg attccgattc ggcgatgtcc gcccgacctt caacaaccac gaactgttct    840
tcggcaacga ctggctgcac tcactcaccc tgccggtgtg ggagtcgtac caccccacca    900
gcacgggcca tcagagcggc tatctgccgg tcctcaacgc caacagctcg acctgatcaa    960
cgcacggccg tgcccgcccc gcgcgtcacg ctcggcgcgg gcgccgcagc gcgttgatca   1020
gcccacagtg ccggtgacgg tcccaccgtc acggtcgagg gtgtacgtca cggtggcgcc   1080
gctccagaag tggaacgtca gcaggaccgt ggagccgtcc ctgacctcgt cgaagaactc   1140
cggggtcagc gtgatcaccc ctcccccgta gccgggggcg aaggcggcgc cgaactcctt   1200
gtaggacgtc cagtcgtgcg gcccggcgtt gccaccgtcc gcgtagaccg cttccatggt   1260
cgccagccgg tccccgcgga actcggtggg gatgtccgtg cccaaggtgg tcccggtggt   1320
gtccgagagc accgggggct cgtaccggat gatgtgcaga tccaaagaat t            1371
<210>4
<211>267
<212>PRT
<213>链霉菌L131
<400>4
Met Arg Leu Thr Arg Ser Leu Ser Ala Ala Ser Val Ile Val Phe Ala
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ile Ser Pro Ala Gln Ala Ala Gly Pro
            20                  25                  30
Ala Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Asn Gly Ala Gly
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Asp Ser Ser Gly Asp Cys His Arg Ser Asn Asn Ala Tyr
    50                  55                  60
Pro Ala Arg Trp Ala Ala Ala Asn Ala Pro Ser Ser Phe Thr Phe Ala
65                  70                  75                  80
Ala Cys Ser Gly Ala Val Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Gln Leu Gly
                85                  90                  95
Ala Leu Asn Ala Ser Thr Gly Leu Val Ser Ile Thr Ile Gly Gly Asn
            100                 105                 110
Asp Ala Gly Phe Ala Asp Ala Met Thr Thr Cys Val Thr Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Ser Thr Cys Leu Asn Arg Leu Ala Thr Ala Thr Asn Tyr Ile Asn Thr
    130                 135                 140
Thr Leu Leu Ala Arg Leu Asp Ala Val Tyr Ser Gln Ile Lys Ala Arg
145                 150                 155                 160
Ala Pro Asn Ala Arg Val Val Val Leu Gly Tyr Pro Arg Met Tyr Leu
                165                 170                 175
Ala Ser Asn Pro Trp Tyr Cys Leu Gly Leu Ser Asn Thr Lys Arg Ala
            180                 185                 190
Ala Ile Asn Thr Thr Ala Asp Thr Leu Asn Ser Val Ile Ser Ser Arg
        195                 200                 205
Ala Thr Ala His Gly Phe Arg Phe Gly Asp Val Arg Pro Thr Phe Asn
    210                 215                 220
Ash His Glu Leu Phe Phe Gly Asn Asp Trp Leu His Ser Leu Thr Leu
225                 230                 235                 240
Pro Val Trp Glu Ser Tyr His Pro Thr Ser Thr Gly His Gln Ser Gly
                245                 250                 255
Tyr Leu Pro Val Leu Asn Ala Asn Ser Ser Thr
            260                 265
<210>5
<211>548
<212>PRT
<213>褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)
<400>5
Met Leu Pro His Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Val Gly Ala Phe Phe
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Val Gly Thr Pro Gln Asp Arg Arg Leu Arg Leu Glu Cys
            20                  25                  30
His Glu Thr Arg Pro Leu Arg Gly Arg Cys Gly Cys Gly Glu Arg Arg
        35                  40                  45
Val Pro Pro Leu Thr Leu Pro Gly Asp Gly Val Leu Cys Thr Thr Ser
    50                  55                  60
Ser Thr Arg Asp Ala Glu Thr Val Trp Arg Lys His Leu Gln Pro Arg
65                  70                  75                  80
Pro Asp Gly Gly Phe Arg Pro His Leu Gly Val Gly Cys Leu Leu Ala
                85                  90                  95
Gly Gln Gly Ser Pro Gly Val Leu Trp Cys Gly Arg Glu Gly Cys Arg
            100                 105                 110
Phe Glu Val Cys Arg Arg Asp Thr Pro Gly Leu Ser Arg Thr Arg Asn
        115                 120                 125
Gly Asp Ser Ser Pro Pro Phe Arg Ala Gly Trp Ser Leu Pro Pro Lys
    130                 135                 140
Cys Gly Glu Ile Ser Gln Ser Ala Arg Lys Thr Pro Ala Val Pro Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Leu Leu Arg Thr Asp Arg Pro Asp Gly Pro Arg Gly Arg Phe
                165                 170                 175
Val Gly Ser Gly Pro Arg Ala Ala Thr Arg Arg Arg Leu Phe Leu Gly
            180                 185                 190
Ile Pro Ala Leu Val Leu Val Thr Ala Leu Thr Leu Val Leu Ala Val
        195                 200                 205
Pro Thr Gly Arg Glu Thr Leu Trp Arg Met Trp Cys Glu Ala Thr Gln
    210                 215                 220
Asp Trp Cys Leu Gly Val Pro Val Asp Ser Arg Gly Gln Pro Ala Glu
225                 230                 235                 240
Asp Gly Glu Phe Leu Leu Leu Ser Pro Val Gln Ala Ala Thr Trp Gly
                245                 250                 255
Asn Tyr Tyr Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Asp Gly Ala Arg
            260                 265                 270
Asp Tyr Tyr Pro Gly Thr Ala Val Lys Gly Gly Cys Trp Arg Ser Ala
        275                 280                 285
Asn Ala Tyr Pro Glu Leu Val Ala Glu Ala Tyr Asp Phe Ala Gly His
    290                 295                 300
Leu Ser Phe Leu Ala Cys Ser Gly Gln Arg Gly Tyr Ala Met Leu Asp
305                 310                 315                 320
Ala Ile Asp Glu Val Gly Ser Gln Leu Asp Trp Asn Ser Pro His Thr
                325                 330                 335
Ser Leu Val Thr Ile Gly Ile Gly Gly Asn Asp Leu Gly Phe Ser Thr
            340                 345                 350
Val Leu Lys Thr Cys Met Val Arg Val Pro Leu Leu Asp Ser Lys Ala
        355                 360                 365
Cys Thr Asp Gln Glu Asp Ala Ile Arg Lys Arg Met Ala Lys Phe Glu
    370                 375                 380
Thr Thr Phe Glu Glu Leu Ile Ser Glu Val Arg Thr Arg Ala Pro Asp
385                 390                 395                 400
Ala Arg Ile Leu Val Val Gly Tyr Pro Arg Ile Phe Pro Glu Glu Pro
                405                 410                 415
Thr Gly Ala Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Ser Asn Gln Arg Trp Leu Asn
            420                 425                 430
Glu Thr Ile Gln Glu Phe Asn Gln Gln Leu Ala Glu Ala Val Ala Val
        435                 440                 445
His Asp Glu Glu Ile Ala Ala Ser Gly Gly Val Gly Ser Val Glu Phe
    450                 455                 460
Val Asp Val Tyr His Ala Leu Asp Gly His Glu Ile Gly Ser Asp Glu
465                 470                 475                 480
Pro Trp Val Asn Gly Val Gln Leu Arg Asp Leu Ala Thr Gly Val Thr
                485                 490                 495
Val Asp Arg Ser Thr Phe His Pro Asn Ala Ala Gly His Arg Ala Val
            500                 505                 510
Gly Glu Arg Val Ile Glu Gln Ile Glu Thr Gly Pro Gly Arg Pro Leu
        515                 520                 525
Tyr Ala Thr Phe Ala Val Val Ala Gly Ala Thr Val Asp Thr Leu Ala
    530                 535                 540
Gly Glu Val Gly
545
<210>6
<211>3000
<212>DNA
<213>褐色喜热裂孢菌
<400>6
ggtggtgaac cagaacaccc ggtcgtcggc gtgggcgtcc aggtgcaggt gcaggttctt     60
caactgctcc agcaggatgc cgccgtggcc gtgcacgatg gccttgggca ggcctgtggt    120
ccccgacgag tacagcaccc atagcggatg gtcgaacggc agcggggtga actccagttc    180
cgcgccttcg cccgcggctt cgaactccgc ccaggacagg gtgtcggcga cagggccgca    240
gcccaggtac ggcaggacga cggtgtgctg caggctgggc atgccgtcgc gcagggcttt    300
gagcacgtca cggcggtcga agtccttacc gccgtagcgg tagccgtcca cggccagcag    360
cactttcggt tcgatctgcg cgaaccggtc gaggacgctg cgcaccccga agtcggggga    420
acaggacgac caggtcgcac cgatcgcggc gcaggcgagg aatgcggccg tcgcctcggc    480
gatgttcggc aggtaggcca cgacccggtc gccggggccc accccgaggc tgcggagggc    540
cgcagcgatc gcggcggtgc gggtccgcag ttctccccag gtccactcgg tcaacggccg    600
gagttcggac gcgtgccgga tcgccacggc tgatgggtca cggtcgcgga agatgtgctc    660
ggcgtagttg agggtggcgc cggggaacca gacggcgccg ggcatggcgt cggaggcgag    720
cactgtggtg tacggggtgg cggcgcgcac ccggtagtac tcccagatcg cggaccagaa    780
tccttcgagg tcggttaccg accagcgcca cagtgcctcg tagtccggtg cgtccacacc    840
gcggtgctcc cgcacccagc gggtgaacgc ggtgaggttg gcgcgttctt tgcgctcctc    900
gtcgggactc cacaggatcg gcggctgcgg cttgagtgtc atgaaacgcg accccttcgt    960
ggacggtgcg gatgcggtga gcgtcgggtg cctcccctaa cgctccccgg tgacggagtg   1020
ttgtgcacca catctagcac gcgggacgcg gaaaccgtat ggagaaaaca cctacaaccc   1080
cggccggacg gtgggtttcg gccacactta ggggtcgggt gcctgcttgc cgggcagggc   1140
agtcccgggg tgctgtggtg cgggcgggag ggctgtcgct tcgaggtgtg ccggcgggac   1200
actccgggcc tcagccgtac ccgcaacggg gacagttctc ctcccttccg ggctggatgg   1260
tcccttcccc cgaaatgcgg cgagatctcc cagtcagccc ggaaaacacc cgctgtgccc   1320
aggtactctt tgcttcgaac agacaggccg gacggtccac gggggaggtt tgtgggcagc   1380
ggaccacgtg cggcgaccag acgacggttg ttcctcggta tccccgctct tgtacttgtg   1440
acagcgctca cgctggtctt ggctgtcccg acggggcgcg agacgctgtg gcgcatgtgg   1500
tgtgaggcca cccaggactg gtgcctgggg gtgccggtcg actcccgcgg acagcctgcg   1560
gaggacggcg agtttctgct gctttctccg gtccaggcag cgacctgggg gaactattac   1620
gcgctcgggg attcgtactc ttcgggggac ggggcccgcg actactatcc cggcaccgcg   1680
gtgaagggcg gttgctggcg gtccgctaac gcctatccgg agctggtcgc cgaagcctac   1740
gacttcgccg gacacttgtc gttcctggcc tgcagcggcc agcgcggcta cgccatgctt   1800
gacgctatcg acgaggtcgg ctcgcagctg gactggaact cccctcacac gtcgctggtg   1860
acgatcggga tcggcggcaa cgatctgggg ttctccacgg ttttgaagac ctgcatggtg   1920
cgggtgccgc tgctggacag caaggcgtgc acggaccagg aggacgctat ccgcaagcgg   1980
atggcgaaat tcgagacgac gtttgaagag ctcatcagcg aagtgcgcac ccgcgcgccg   2040
gacgcccgga tccttgtcgt gggctacccc cggatttttc cggaggaacc gaccggcgcc   2100
tactacacgc tgaccgcgag caaccagcgg tggctcaacg aaaccattca ggagttcaac   2160
cagcagctcg ccgaggctgt cgcggtccac gacgaggaga ttgccgcgtc gggcggggtg   2220
ggcagcgtgg agttcgtgga cgtctaccac gcgttggacg gccacgagat cggctcggac   2280
gagccgtggg tgaacggggt gcagttgcgg gacctcgcca ccggggtgac tgtggaccgc   2340
agtaccttcc accccaacgc cgctgggcac cgggcggtcg gtgagcgggt catcgagcag   2400
atcgaaaccg gcccgggccg tccgctctat gccactttcg cggtggtggc gggggcgacc   2460
gtggacactc tcgcgggcga ggtggggtga cccggcttac cgtccggccc gcaggtctgc   2520
gagcactgcg gcgatctggt ccactgccca gtgcagttcg tcttcggtga tgaccagcgg   2580
cggggagagc cggatcgttg agccgtgcgt gtctttgacg agcacacccc gctgcaggag   2640
ccgttcgcac agttctcttc cggtggccag agtcgggtcg acgtcgatcc cagcccacag   2700
gccgatgctg cgggccgcga ccacgccgtt gccgaccagt tggtcgaggc gggcgcgcag   2760
cacgggggcg agggcgcgga catggtccag gtaagggccg tcgcggacga ggctcaccac   2820
ggcagtgccg accgcgcagg cgagggcgtt gccgccgaag gtgctgccgt gctggccggg   2880
gcggatcacg tcgaagactt ccgcgtcgcc taccgccgcc gccacgggca ggatgccgcc   2940
gcccagcgct ttgccgaaca ggtagatatc ggcgtcgact ccgctgtggt cgcaggcccg   3000
<210>7
<211>372
<212>PRT
<213>褐色喜热裂孢菌
<400>7
Val Gly Ser Gly Pro Arg Ala Ala Thr Arg Arg Arg Leu Phe Leu Gly
1               5                   10                  15
Ile Pro Ala Leu Val Leu Val Thr Ala Leu Thr Leu Val Leu Ala Val
            20                  25                  30
Pro Thr Gly Arg Glu Thr Leu Trp Arg Met Trp Cys Glu Ala Thr Gln
        35                  40                  45
Asp Trp Cys Leu Gly Val Pro Val Asp Ser Arg Gly Gln Pro Ala Glu
    50                  55                  60
Asp Gly Glu Phe Leu Leu Leu Ser Pro Val Gln Ala Ala Thr Trp Gly
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Tyr Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Asp Gly Ala Arg
                85                  90                  95
Asp Tyr Tyr Pro Gly Thr Ala Val Lys Gly Gly Cys Trp Arg Ser Ala
            100                 105                 110
Asn Ala Tyr Pro Glu Leu Val Ala Glu Ala Tyr Asp Phe Ala Gly His
        115                 120                 125
Leu Ser Phe Leu Ala Cys Ser Gly Gln Arg Gly Tyr Ala Met Leu Asp
    130                 135                 140
Ala Ile Asp Glu Val Gly Ser Gln Leu Asp Trp Asn Ser Pro His Thr
145                 150                 155                 160
Ser Leu Val Thr Ile Gly Ile Gly Gly Asn Asp Leu Gly Phe Ser Thr
                165                 170                 175
Val Leu Lys Thr Cys Met Val Arg Val Pro Leu Leu Asp Ser Lys Ala
            180                 185                 190
Cys Thr Asp Gln Glu Asp Ala Ile Arg Lys Arg Met Ala Lys Phe Glu
        195                 200                 205
Thr Thr Phe Glu Glu Leu Ile Ser Glu Val Arg Thr Arg Ala Pro Asp
    210                 215                 220
Ala Arg Ile Leu Val Val Gly Tyr Pro Arg Ile Phe Pro Glu Glu Pro
225                 230                 235                 240
Thr Gly Ala Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Ser Asn Gln Arg Trp Leu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Ile Gln Glu Phe Asn Gln Gln Leu Ala Glu Ala Val Ala Val
            260                 265                 270
His Asp Glu Glu Ile Ala Ala Ser Gly Gly Val Gly Ser Val Glu Phe
        275                 280                 285
Val Asp Val Tyr His Ala Leu Asp Gly His Glu Ile Gly Ser Asp Glu
    290                 295                 300
Pro Trp Val Asn Gly Val Gln Leu Arg Asp Leu Ala Thr Gly Val Thr
305                 310                 315                 320
Val Asp Arg Ser Thr Phe His Pro Asn Ala Ala Gly His Arg Ala Val
                325                 330                 335
Gly Glu Arg Val Ile Glu Gln Ile Glu Thr Gly Pro Gly Arg Pro Leu
            340                 345                 350
Tyr Ala Thr Phe Ala Val Val Ala Gly Ala Thr Val Asp Thr Leu Ala
        355                 360                 365
Gly Glu Val Gly
    370
<210>8
<211>300
<212>PRT
<213>Corynebacterium efficiens
<400>8
Met Arg Thr Thr Val Ile Ala Ala Ser Ala Leu Leu Leu Leu Ala Gly
1               5                   10                  15
Cys Ala Asp Gly Ala Arg Glu Glu Thr Ala Gly Ala Pro Pro Gly Glu
            20                  25                  30
Ser Ser Gly Gly Ile Arg Glu Glu Gly Ala Glu Ala Ser Thr Ser Ile
        35                  40                  45
Thr Asp Val Tyr Ile Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ala Ala Met Gly Gly
    50                  55                  60
Arg Asp Gln Pro Leu Arg Gly Glu Pro Phe Cys Leu Arg Ser Ser Gly
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Pro Glu Leu Leu His Ala Glu Val Thr Asp Leu Thr Cys Gln
                85                  90                  95
Gly Ala Val Thr Gly Asp Leu Leu Glu Pro Arg Thr Leu Gly Glu Arg
            100                 105                 110
Thr Leu Pro Ala Gln Val Asp Ala Leu Thr Glu Asp Thr Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Leu Ser Ile Gly Gly Asn Asp Leu Gly Phe Gly Glu Val Ala Gly
    130                 135                 140
Cys Ile Arg Glu Arg Ile Ala Gly Glu Asn Ala Asp Asp Cys Val Asp
145                 150                 155                 160
Leu Leu Gly Glu Thr Ile Gly Glu Gln Leu Asp Gln Leu Pro Pro Gln
                165                 170                 175
Leu Asp Arg Val His Glu Ala Ile Arg Asp Arg Ala Gly Asp Ala Gln
            180                 185                 190
Val Val Val Thr Gly Tyr Leu Pro Leu Val Ser Ala Gly Asp Cys Pro
        195                 200                 205
Glu Leu Gly Asp Val Ser Glu Ala Asp Arg Arg Trp Ala Val Glu Leu
    210                 215                 220
Thr Gly Gln Ile Asn Glu Thr Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg His Asp
225                 230                 235                 240
Ala Leu Phe Val Leu Pro Asp Asp Ala Asp Glu His Thr Ser Cys Ala
                245                 250                 255
Pro Pro Gln Gln Arg Trp Ala Asp Ile Gln Gly Gln Gln Thr Asp Ala
            260                 265                 270
Tyr Pro Leu His Pro Thr Ser Ala Gly His Glu Ala Met Ala Ala Ala
        275                 280                 285
Val Arg Asp Ala Leu Gly Leu Glu Pro Val Gln Pro
    290                 295                 300
<210>9
<211>3000
<212>DNA
<213>Corynebacterium efficiens
<400>9
ttctggggtg ttatggggtt gttatcggct cgtcctgggt ggatcccgcc aggtggggta     60
ttcacggggg acttttgtgt ccaacagccg agaatgagtg ccctgagcgg tgggaatgag    120
gtgggcgggg ctgtgtcgcc atgagggggc ggcgggctct gtggtgcccc gcgacccccg    180
gccccggtga gcggtgaatg aaatccggct gtaatcagca tcccgtgccc accccgtcgg    240
ggaggtcagc gcccggagtg tctacgcagt cggatcctct cggactcggc catgctgtcg    300
gcagcatcgc gctcccgggt cttggcgtcc ctcggctgtt ctgcctgctg tccctggaag    360
gcgaaatgat caccggggag tgatacaccg gtggtctcat cccggatgcc cacttcggcg    420
ccatccggca attcgggcag ctccgggtgg aagtaggtgg catccgatgc gtcggtgacg    480
ccatagtggg cgaagatctc atcctgctcg agggtgctca ggccactctc cggatcgata    540
tcgggggcgt ccttgatggc gtccttgctg aaaccgaggt gcagcttgtg ggcttccaat    600
ttcgcaccac ggagcgggac gaggctggaa tgacggccga agagcccgtg gtggacctca    660
acgaaggtgg gtagtcccgt gtcatcattg aggaacacgc cctccaccgc acccagcttg    720
tggccggagt tgtcgtaggc gctggcatcc agaagggaaa cgatctcata tttgtcggtg    780
tgctcagaca tgatcttcct ttgctgtcgg tgtctggtac taccacggta gggctgaatg    840
caactgttat ttttctgtta ttttaggaat tggtccatat cccacaggct ggctgtggtc    900
aaatcgtcat caagtaatcc ctgtcacaca aaatgggtgg tgggagccct ggtcgcggtt    960
ccgtgggagg cgccgtgccc cgcaggatcg tcggcatcgg cggatctggc cggtaccccg   1020
cggtgaataa aatcattctg taaccttcat cacggttggt tttaggtatc cgcccctttc   1080
gtcctgaccc cgtccccggc gcgcgggagc ccgcgggttg cggtagacag gggagacgtg   1140
gacaccatga ggacaacggt catcgcagca agcgcattac tccttctcgc cggatgcgcg   1200
gatggggccc gggaggagac cgccggtgca ccgccgggtg agtcctccgg gggcatccgg   1260
gaggaggggg cggaggcgtc gacaagcatc accgacgtct acatcgccct cggggattcc   1320
tatgcggcga tgggcgggcg ggatcagccg ttacggggtg agccgttctg cctgcgctcg   1380
tccggtaatt acccggaact cctccacgca gaggtcaccg atctcacctg ccagggggcg   1440
gtgaccgggg atctgctcga acccaggacg ctgggggagc gcacgctgcc ggcgcaggtg   1500
gatgcgctga cggaggacac caccctggtc accctctcca tcgggggcaa tgacctcgga   1560
ttcggggagg tggcgggatg catccgggaa cggatcgccg gggagaacgc tgatgattgc   1620
gtggacctgc tgggggaaac catcggggag cagctcgatc agcttccccc gcagctggac   1680
cgcgtgcacg aggctatccg ggaccgcgcc ggggacgcgc aggttgtggt caccggttac   1740
ctgccgctcg tgtctgccgg ggactgcccc gaactggggg atgtctccga ggcggatcgt   1800
cgttgggcgg ttgagctgac cgggcagatc aacgagaccg tgcgcgaggc ggccgaacga   1860
cacgatgccc tctttgtcct gcccgacgat gccgatgagc acaccagttg tgcaccccca   1920
cagcagcgct gggcggatat ccagggccaa cagaccgatg cctatccgct gcacccgacc   1980
tccgccggcc atgaggcgat ggccgccgcc gtccgggacg cgctgggcct ggaaccggtc   2040
cagccgtagc gccgggcgcg cgcttgtcga cgaccaaccc atgccaggct gcagtcacat   2100
ccgcacatag cgcgcgcggg cgatggagta cgcaccatag aggatgagcc cgatgccgac   2160
gatgatgagc agcacactgc cgaagggttg ttccccgagg gtgcgcagag ccgagtccag   2220
acctgcggcc tgctccggat catgggccca accggcgatg acgatcaaca cccccaggat   2280
cccgaaggcg ataccacggg cgacataacc ggctgttccg gtgatgatga tcgcggtccc   2340
gacctgccct gaccccgcac ccgcctccag atcctcccgg aaatcccggg tggccccctt   2400
ccagaggttg tagacacccg cccccagtac caccagcccg gcgaccacaa ccagcaccac   2460
accccagggt tgggatagga cggtggcggt gacatcggtg gcggtctccc catcggaggt   2520
gctgccgccc cgggcgaagg tggaggtggt caccgccagg gagaagtaga ccatggccat   2580
gaccgccccc ttggcccttt ccttgaggtc ctcgcccgcc agcagctggc tcaattgcca   2640
gagtcccagg gccgccaggg cgatgacggc aacccacagg aggaactgcc cacccggagc   2700
ctccgcgatg gtggccaggg cacctgaatt cgaggcctca tcacccgaac cgccggatcc   2760
agtggcgatg cgcaccgcga tccacccgat gaggatgtgc agtatgccca ggacaatgaa   2820
accacctctg gccagggtgg tcagcgcggg gtggtcctcg gcctggtcgg cagcccgttc   2880
gatcgtccgt ttcgcggatc tggtgtcgcc cttatccata gctcccattg aaccgccttg   2940
aggggtgggc ggccactgtc agggcggatt gtgatctgaa ctgtgatgtt ccatcaaccc   3000
<210>10
<211>284
<212>PRT
<213>Novosphingobium aromaticivorans
<400>10
Met Gly Gln Val Lys Leu Phe Ala Arg Arg Cys Ala Pro Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Gly Leu Ala Pro Ala Ala Thr Val Ala Arg Glu Ala Pro
            20                  25                  30
Leu Ala Glu Gly Ala Arg Tyr Val Ala Leu Gly Ser Ser Phe Ala Ala
        35                  40                  45
Gly Pro Gly Val Gly Pro Asn Ala Pro Gly Ser Pro Glu Arg Cys Gly
    50                  55                  60
Arg Gly Thr Leu Asn Tyr Pro His Leu Leu Ala Glu Ala Leu Lys Leu
65                  70                  75                  80
Asp Leu Val Asp Ala Thr Cys Ser Gly Ala Thr Thr His His Val Leu
                85                  90                  95
Gly Pro Trp Asn Glu Val Pro Pro Gln Ile Asp Ser Val Asn Gly Asp
            100                 105                 110
Thr Arg Leu Val Thr Leu Thr Ile Gly Gly Asn Asp Val Ser Phe Val
        115                 120                 125
Gly Asn Ile Phe Ala Ala Ala Cys Glu Lys Met Ala Ser Pro Asp Pro
    130                 135                 140
Arg Cys Gly Lys Trp Arg Glu Ile Thr Glu Glu Glu Trp Gln Ala Asp
145                 150                 155                 160
Glu Glu Arg Met Arg Ser Ile Val Arg Gln Ile His Ala Arg Ala Pro
                165                 170                 175
Leu Ala Arg Val Val Val Val Asp Tyr Ile Thr Val Leu Pro Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Thr Cys Ala Ala Met Ala Ile Ser Pro Asp Arg Leu Ala Gln Ser
        195                 200                 205
Arg Ser Ala Ala Lys Arg Leu Ala Arg Ile Thr Ala Arg Val Ala Arg
    210                 215                 220
Glu Glu Gly Ala Ser Leu Leu Lys Phe Ser His Ile Ser Arg Arg His
225                 230                 235                 240
His Pro Cys Ser Ala Lys Pro Trp Ser Asn Gly Leu Ser Ala Pro Ala
                245                 250                 255
Asp Asp Gly Ile Pro Val His Pro Asn Arg Leu Gly His Ala Glu Ala
            260                 265                 270
Ala Ala Ala Leu Val Lys Leu Val Lys Leu Met Lys
        275                 280
<210>11
<211>1500
<212>DNA
<213>Novosphingobium aromaticivorans
<400>11
tgccggaact caagcggcgt ctagccgaac tcatgcccga aagcgcgtgg cactatcccg     60
aagaccaggt ctcggacgcc agcgagcgcc tgatggccgc cgaaatcacg cgcgaacagc    120
tctaccgcca gctccacgac gagctgccct atgacagtac cgtacgtccc gagaagtacc    180
tccatcgcaa ggacggttcg atcgagatcc accagcagat cgtgattgcc cgcgagacac    240
agcgtccgat cgtgctgggc aagggtggcg cgaagatcaa ggcgatcgga gaggccgcac    300
gcaaggaact ttcgcaattg ctcgacacca aggtgcacct gttcctgcat gtgaaggtcg    360
acgagcgctg ggccgacgcc aaggaaatct acgaggaaat cggcctcgaa tgggtcaagt    420
gaagctcttc gcgcgccgct gcgccccagt acttctcgcc cttgccgggc tggctccggc    480
ggctacggtc gcgcgggaag caccgctggc cgaaggcgcg cgttacgttg cgctgggaag    540
ctccttcgcc gcaggtccgg gcgtggggcc caacgcgccc ggatcgcccg aacgctgcgg    600
ccggggcacg ctcaactacc cgcacctgct cgccgaggcg ctcaagctcg atctcgtcga    660
tgcgacctgc agcggcgcga cgacccacca cgtgctgggc ccctggaacg aggttccccc    720
tcagatcgac agcgtgaatg gcgacacccg cctcgtcacc ctgaccatcg gcggaaacga    780
tgtgtcgttc gtcggcaaca tcttcgccgc cgcttgcgag aagatggcgt cgcccgatcc    840
gcgctgcggc aagtggcggg agatcaccga ggaagagtgg caggccgacg aggagcggat    900
gcgctccatc gtacgccaga tccacgcccg cgcgcctctc gcccgggtgg tggtggtcga    960
ttacatcacg gtcctgccgc catcaggcac ttgcgctgcc atggcgattt cgccggaccg   1020
gctggcccag agccgcagcg ccgcgaaacg gcttgcccgg attaccgcac gggtcgcgcg   1080
agaagagggt gcatcgctgc tcaagttctc gcatatctcg cgccggcacc atccatgctc   1140
tgccaagccc tggagcaacg gcctttccgc cccggccgac gacggcatcc cggtccatcc   1200
gaaccggctc ggacatgctg aagcggcagc ggcgctggtc aagcttgtga aattgatgaa   1260
gtagctactg cactgatttc aaatagtatt gcctgtcagc tttccagccc ggattgttgc   1320
agcgcaacag aaacttgtcc gtaatggatt gatggtttat gtcgctcgca aattgccgtc   1380
gaagggaacg ggcgcgtcgc tcgttaacgt cctgggtgca gcagtgacgg agcgcgtgga   1440
tgagtgatac tggcggtgtc atcggtgtac gcgccgccat tcccatgcct gtacgcgccg   1500
<210>12
<211>268
<212>PRT
<213>天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400>12
Met Arg Arg Phe Arg Leu Val Gly Phe Leu Ser Ser Leu Val Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Ala Ala Leu Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gln Ala Ala Gln Pro
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Asp Gly Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly
        35                  40                  45
Val Gly Ala Gly Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Asp Cys Lys Arg Ser
    50                  55                  60
Thr Lys Ala His Pro Tyr Leu Trp Ala Ala Ala His Ser Pro Ser Thr
65                  70                  75                  80
Phe Asp Phe Thr Ala Cys Ser Gly Ala Arg Thr Gly Asp Val Leu Ser
                85                  90                  95
Gly Gln Leu Gly Pro Leu Ser Ser Gly Thr Gly Leu Val Ser Ile Ser
            100                 105                 110
Ile Gly Gly Asn Asp Ala Gly Phe Ala Asp Thr Met Thr Thr Cys Val
        115                 120                 125
Leu Gln Ser Glu Ser Ser Cys Leu Ser Arg Ile Ala Thr Ala Glu Ala
    130                 135                 140
Tyr Val Asp Ser Thr Leu Pro Gly Lys Leu Asp Gly Val Tyr Ser Ala
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Lys Ala Pro Asn Ala His Val Val Val Ile Gly Tyr Pro
                165                 170                 175
Arg Phe Tyr Lys Leu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Leu Ser Glu Thr Lys
            180                 185                 190
Arg Thr Ala Ile Asn Lys Ala Ser Asp His Leu Asn Thr Val Leu Ala
        195                 200                 205
Gln Arg Ala Ala Ala His Gly Phe Thr Phe Gly Asp Val Arg Thr Thr
    210                 215                 220
Phe Thr Gly His Glu Leu Cys Ser Gly Ser Pro Trp Leu His Ser Val
225                 230                 235                 240
Asn Trp Leu Asn Ile Gly Glu Ser Tyr His Pro Thr Ala Ala Gly Gln
                245                 250                 255
Ser Gly Gly Tyr Leu Pro Val Leu Asn Gly Ala Ala
            260                 265
<210>13
<211>2000
<212>DNA
<213>天蓝色链霉菌
<400>13
cccggcggcc cgtgcaggag cagcagccgg cccgcgatgt cctcgggcgt cgtcttcatc   60
aggccgtcca tcgcgtcggc gaccggcgcc gtgtagttgg cccggacctc gtcccaggtg   120
cccgcggcga tctggcgggt ggtgcggtgc gggccgcgcc gaggggagac gtaccagaag   180
cccatcgtca cgttctccgg ctgcggttcg ggctcgtccg ccgctccgtc cgtcgcctcg   240
ccgagcacct tctcggcgag gtcggcgctg gtcgccgtca ccgtgacgtc ggcgccccgg   300
ctccagcgcg agatcagcag cgtccagccg tcgccctccg ccagcgtcgc gctgcggtcg   360
tcgtcgcggg cgatccgcag cacgcgcgcg ccgggcggca gcagcgtggc gccggaccgt   420
acgcggtcga tgttcgccgc gtgcgagtac ggctgctcac ccgtggcgaa acggccgagg   480
aacagcgcgt cgacgacgtc ggacggggag tcgctgtcgt ccacgttgag ccggatcggc   540
agggcttcgt gcgggttcac ggacatgtcg ccatgatcgg gcacccggcc gccgcgtgca   600
cccgctttcc cgggcacgca cgacaggggc tttctcgccg tcttccgtcc gaacttgaac   660
gagtgtcagc catttcttgg catggacact tccagtcaac gcgcgtagct gctaccacgg   720
ttgtggcagc aatcctgcta agggaggttc catgagacgt ttccgacttg tcggcttcct   780
gagttcgctc gtcctcgccg ccggcgccgc cctcaccggg gcagcgaccg cccaggcggc    840
ccaacccgcc gccgccgacg gctatgtggc cctcggcgac tcctactcct ccggggtcgg    900
agcgggcagc tacatcagct cgagcggcga ctgcaagcgc agcacgaagg cccatcccta    960
cctgtgggcg gccgcccact cgccctccac gttcgacttc accgcctgtt ccggcgcccg   1020
tacgggtgat gttctctccg gacagctcgg cccgctcagc tccggcaccg gcctcgtctc   1080
gatcagcatc ggcggcaacg acgccggttt cgccgacacc atgacgacct gtgtgctcca   1140
gtccgagagc tcctgcctgt cgcggatcgc caccgccgag gcgtacgtcg actcgacgct   1200
gcccggcaag ctcgacggcg tctactcggc aatcagcgac aaggcgccga acgcccacgt   1260
cgtcgtcatc ggctacccgc gcttctacaa gctcggcacc acctgcatcg gcctgtccga   1320
gaccaagcgg acggcgatca acaaggcctc cgaccacctc aacaccgtcc tcgcccagcg   1380
cgccgccgcc cacggcttca ccttcggcga cgtacgcacc accttcaccg gccacgagct   1440
gtgctccggc agcccctggc tgcacagcgt caactggctg aacatcggcg agtcgtacca   1500
ccccaccgcg gccggccagt ccggtggcta cctgccggtc ctcaacggcg ccgcctgacc   1560
tcaggcggaa ggagaagaag aaggagcgga gggagacgag gagtgggagg ccccgcccga   1620
cggggtcccc gtccccgtct ccgtctccgt cccggtcccg caagtcaccg agaacgccac   1680
cgcgtcggac gtggcccgca ccggactccg cacctccacg cgcacggcac tctcgaacgc   1740
gccggtgtcg tcgtgcgtcg tcaccaccac gccgtcctgg cgcgagcgct cgccgcccga   1800
cgggaaggac agcgtccgcc accccggatc ggagaccgac ccgtccgcgg tcacccaccg   1860
gtagccgacc tccgcgggca gccgcccgac cgtgaacgtc gccgtgaacg cgggtgcccg   1920
gtcgtgcggc ggcggacagg cccccgagta gtgggtgcgc gagcccacca cggtcacctc   1980
caccgactgc gctgcggggc                                               2000
<210>14
<211>269
<212>PRT
<213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)
<400>14
Met Arg Arg Ser Arg Ile Thr Ala Tyr Val Thr Ser Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Val Gly Cys Ala Leu Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gln Ala Ser Pro Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Thr Gly Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly
        35                  40                  45
Val Gly Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Ser Gly Asp Cys Lys Arg Ser
    50                  55                  60
Ser Lys Ala Tyr Pro Tyr Leu Trp Gln Ala Ala His Ser Pro Ser Ser
65                  70                  75                  80
Phe Ser Phe Met Ala Cys Ser Gly Ala Arg Thr Gly Asp Val Leu Ala
                85                  90                  95
Asn Gln Leu Gly Thr Leu Asn Ser Ser Thr Gly Leu Val Ser Leu Thr
            100                 105                 110
Ile Gly Gly Asn Asp Ala Gly Phe Ser Asp Val Met Thr Thr Cys Val
        115                 120                 125
Leu Gln Ser Asp Ser Ala Cys Leu Ser Arg Ile Asn Thr Ala Lys Ala
    130                 135                 140
Tyr Val Asp Ser Thr Leu Pro Gly Gln Leu Asp Ser Val Tyr Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ile Ser Thr Lys Ala Pro Ser Ala His Val Ala Val Leu Gly Tyr Pro
                165                 170                 175
Arg Phe Tyr Lys Leu Gly Gly Ser Cys Leu Ala Gly Leu Ser Glu Thr
            180                 185                 190
Lys Arg Ser Ala Ile Asn Asp Ala Ala Asp Tyr Leu Asn Ser Ala Ile
        195                 200                 205
Ala Lys Arg Ala Ala Asp His Gly Phe Thr Phe Gly Asp Val Lys Ser
    210                 215                 220
Thr Phe Thr Gly His Glu Ile Cys Ser Ser Ser Thr Trp Leu His Ser
225                 230                 235                 240
Leu Asp Leu Leu Asn Ile Gly Gln Ser Tyr His Pro Thr Ala Ala Gly
                245                 250                 255
Gln Ser Gly Gly Tyr Leu Pro Val Met Asn Ser ValAla
            260                 265
<210>15
<211>1980
<212>DNA
<213>除虫链霉菌
<400>15
ccaccgccgg gtcggcggcg agtctcctgg cctcggtcgc ggagaggttg gccgtgtagc     60
cgttcagcgc ggcgccgaac gtcttcttca ccgtgccgcc gtactcgttg atcaggccct    120
tgcccttgct cgacgcggcc ttgaagccgg tgcccttctt gagcgtgacg atgtagctgc    180
ccttgatcgc ggtgggggag ccggcggcga gcaccgtgcc ctcggccggg gtggcctggg    240
cgggcagtgc ggtgaatccg cccacgaggg cgccggtcgc cacggcggtt atcgcggcga    300
tccggatctt cttgctacgc agctgtgcca tacgagggag tcctcctctg ggcagcggcg    360
cgcctgggtg gggcgcacgg ctgtgggggg tgcgcgcgtc atcacgcaca cggccctgga    420
gcgtcgtgtt ccgccctggg ttgagtaaag cctcggccat ctacgggggt ggctcaaggg    480
agttgagacc ctgtcatgag tctgacatga gcacgcaatc aacggggccg tgagcacccc    540
ggggcgaccc cggaaagtgc cgagaagtct tggcatggac acttcctgtc aacacgcgta    600
gctggtacga cggttacggc agagatcctg ctaaagggag gttccatgag acgttcccga    660
attacggcat acgtgacctc actcctcctc gccgtcggct gcgccctcac cggggcagcg    720
acggcgcagg cgtccccagc cgccgcggcc acgggctatg tggccctcgg cgactcgtac    780
tcgtccggtg tcggcgccgg cagctacctc agctccagcg gcgactgcaa gcgcagttcg    840
aaggcctatc cgtacctctg gcaggccgcg cattcaccct cgtcgttcag tttcatggct    900
tgctcgggcg ctcgtacggg tgatgtcctg gccaatcagc tcggcaccct gaactcgtcc    960
accggcctgg tctccctcac catcggaggc aacgacgcgg gcttctccga cgtcatgacg   1020
acctgtgtgc tccagtccga cagcgcctgc ctctcccgca tcaacacggc gaaggcgtac   1080
gtcgactcca ccctgcccgg ccaactcgac agcgtgtaca cggcgatcag cacgaaggcc   1140
ccgtcggccc atgtggccgt gctgggctac ccccgcttct acaaactggg cggctcctgc   1200
ctcgcgggcc tctcggagac caagcggtcc gccatcaacg acgcggccga ctatctgaac   1260
agcgccatcg ccaagcgcgc cgccgaccac ggcttcacct tcggcgacgt caagagcacc   1320
ttcaccggcc atgagatctg ctccagcagc acctggctgc acagtctcga cctgctgaac   1380
atcggccagt cctaccaccc gaccgcggcc ggccagtccg gcggctatct gccggtcatg   1440
aacagcgtgg cctgagctcc cacggcctga atttttaagg cctgaatttt taaggcgaag   1500
gtgaaccgga agcggaggcc ccgtccgtcg gggtctccgt cgcacaggtc accgagaacg   1560
gcacggagtt ggacgtcgtg cgcaccgggt cgcgcacctc gacggcgatc tcgttcgaga   1620
tcgttccgct cgtgtcgtac gtggtgacga acacctgctt ctgctgggtc tttccgccgc   1680
tcgccgggaa ggacagcgtc ttccagcccg gatccgggac ctcgcccttc ttggtcaccc   1740
agcggtactc cacctcgacc ggcacccggc ccaccgtgaa ggtcgccgtg aacgtgggcg   1800
cctgggcggt gggcggcggg caggcaccgg agtagtcggt gtgcacgccg gtgaccgtca   1860
ccttcacgga ctgggccggc ggggtcgtcg taccgccgcc gccaccgccg cctcccggag   1920
tggagcccga gctgtggtcg cccccgccgt cggcgttgtc gtcctcgggg gttttcgaac   1980
<210>16
<211>372
<212>PRT
<213>褐色喜热裂孢菌
<400>16
Met Gly Ser Gly Pro Arg Ala Ala Thr Arg Arg Arg Leu Phe Leu Gly
1               5                   10                  15
Ile Pro Ala Leu Val Leu Val Thr Ala Leu Thr Leu Val Leu Ala Val
            20                  25                  30
Pro Thr Gly Arg Glu Thr Leu Trp Arg Met Trp Cys Glu Ala Thr Gln
        35                  40                  45
Asp Trp Cys Leu Gly Val Pro Val Asp Ser Arg Gly Gln Pro Ala Glu
    50                  55                  60
Asp Gly Glu Phe Leu Leu Leu Ser Pro Val Gln Ala Ala Thr Trp Gly
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Tyr Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Asp Gly Ala Arg
                85                  90                  95
Asp Tyr Tyr Pro Gly Thr Ala Val Lys Gly Gly Cys Trp Arg Ser Ala
           100                 105                 110
Asn Ala Tyr Pro Glu Leu Val Ala Glu Ala Tyr Asp Phe Ala Gly His
        115                 120                 125
Leu Ser Phe Leu Ala Cys Ser Gly Gln Arg Gly Tyr Ala Met Leu Asp
    130                 135                 140
Ala Ile Asp Glu Val Gly Ser Gln Leu Asp Trp Asn Ser Pro His Thr
145                 150                 155                 160
Ser Leu Val Thr Ile Gly Ile Gly Gly Asn Asp Leu Gly Phe Ser Thr
                165                 170                 175
Val Leu Lys Thr Cys Met Val Arg Val Pro Leu Leu Asp Ser Lys Ala
            180                 185                 190
Cys Thr Asp Gln Glu Asp Ala Ile Arg Lys Arg Met Ala Lys Phe Glu
        195                 200                 205
Thr Thr Phe Glu Glu Leu Ile Ser Glu Val Arg Thr Arg Ala Pro Asp
    210                 215                 220
Ala Arg Ile Leu Val Val Gly Tyr Pro Arg Ile Phe Pro Glu Glu Pro
225                 230                 235                 240
Thr Gly Ala Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Ser Asn Gln Arg Trp Leu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Ile Gln Glu Phe Asn Gln Gln Leu Ala Glu Ala Val Ala Val
            260                 265                 270
His Asp Glu Glu Ile Ala Ala Ser Gly Gly Val Gly Ser Val Glu Phe
        275                 280                 285
Val Asp Val Tyr His Ala Leu Asp Gly His Glu Ile Gly Ser Asp Glu
    290                 295                 300
Pro Trp Val Asn Gly Val Gln Leu Arg Asp Leu Ala Thr Gly Val Thr
305                 310                 315                 320
Val Asp Arg Ser Thr Phe His Pro Asn Ala Ala Gly His Arg Ala Val
                325                 330                 335
Gly Glu Arg Val Ile Glu Gln Ile Glu Thr Gly Pro Gly Arg Pro Leu
            340                 345                 350
Tyr Ala Thr Phe Ala Val Val Ala Gly Ala Thr Val Asp Thr Leu Ala
        355                 360                 365
Gly Glu Val Gly
    370
<210>17
<211>968
<212>DNA
<213>褐色喜热裂孢菌
<400>17
ctgcagacac ccgccccgcc ttctcccgga tcgtcatgtt cggcgactcc ctcagcgaca    60
ccggcaagat gtactccaag atgcgcggct acctgccgtc ctccccgccg tactacgagg   120
gccgcttctc gaacggcccg gtctggctgg agcagctgac gaagcagttc cccggcctga    180
cgatcgccaa cgaggccgag gggggcgcga ccgcagtcgc ctacaacaag atctcctgga    240
acccgaagta ccaggtcatt aacaacctcg actacgaggt cacccagttc ttgcagaagg    300
actcgttcaa gcccgacgac ctggtcatcc tgtgggtggg cgccaacgac tacctggcct    360
acggttggaa cacggagcag gacgccaagc gggtgcgcga cgccatctcg gacgcggcaa    420
accgcatggt cctgaacggc gcgaagcaga tcctgctgtt caacctgccc gacctgggcc    480
agaacccgtc cgcccgctcc cagaaggtcg tcgaggccgt ctcgcacgtg tccgcctacc    540
acaacaagct gctcctcaac ctcgcccggc agctcgcccc gacgggcatg gtcaagctgt    600
tcgagatcga caagcagttc gcggagatgc tgcgcgaccc ccagaacttc ggcctgagcg    660
acgtggagaa cccgtgctac gacggcggct acgtgtggaa gccgttcgcc acccggtccg    720
tctcgaccga ccggcagctg tcggccttct cgccccagga gcgcctggcg atcgctggca    780
acccgctcct ggcacaggcg gtagcttcgc cgatggcccg ccgctcggcc tcgcccctca    840
actgcgaggg caagatgttc tgggaccagg tccaccccac caccgtggtc cacgccgccc    900
tctcggagcg cgccgccacc ttcatcgaga cccagtacga gttcctcgcc cactagtcta    960
gaggatcc                                                             968
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>18
cagcmgccgc ggtaatwc                                                   18
<210>19
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>19
acgggcggtg tgtrc                                                      15
<210>20
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>20
ggtgaattca tgagattgac ccgatccctg tcgg                                 34
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>21
acttctagag cggcgccacc gtgacgtaca                                        30
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>22
ggtcatgcta gcatgagatt gacccgatcc ctgtcgg                                37
<210>23
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>23
gcatggatcc gcggcgccac cgtgacgtac a                                      31
<210>24
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>24
gggaattcca tatgagacgt tcccgaatta cg                                     32
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>25
gcatggatcc ggtgacctgt gcgacgg                                           27
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>26
gggaattcca tatgggcagc ggaccacgtg                                        30
<210>27
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>27
gcatggatcc gacacgcacg gctcaacg                                          28
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>28
gggaattcca tatgaggaca acggtcatcg                                         30
<210>29
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>29
gcatggatcc ggcatcgggc tcatcc                                             26
<210>30
<211>225
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>共有序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(36)
<223>GDSY基序
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(94)..(98)
<223>GANDY模块
<400>30
Met Arg Arg Ser Arg Phe Leu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Thr Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Gly Ala Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Ala Tyr Val Ala Leu
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Ser Ser Gly Asp
        35                  40                  45
Cys Arg Ser Thr Lys Ala Tyr Pro Ala Leu Trp Ala Ala Ala His Ala
    50                  55                  60
Ser Ser Phe Ser Phe Ala Cys Ser Gly Ala Arg Thr Tyr Asp Val Leu
65                  70                  75                  80
Ala Gln Leu Leu Asn Ser Thr Leu Val Ser Ile Thr Ile Gly Gly Asn
                85                  90                  95
Asp Ala Gly Phe Ala Asp Met Thr Thr Cys Val Leu Ser Asp Ser Ala
           100                 105                 110
Cys Leu Arg Ile Ala Ala Lys Tyr Ile Thr Leu Pro Ala Arg Leu Asp
        115                 120                 125
Ser Val Tyr Ser Ala Ile Thr Arg Ala Pro Ala Arg Val Val Val Leu
    130                 135                 140
Gly Tyr Pro Arg Ile Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Ser Thr Lys Arg Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ile Asn Asp Ala Ala Asp Leu Asn Ser Val Ile Ala Lys Arg Ala
                165                 170                 175
Ala Asp His Gly Phe Thr Phe Gly Asp Val Thr Phe Gly His Glu Leu
            180                 185                 190
Cys Ser Ala Pro Trp Leu His Ser Leu Thr Leu Pro Val Ser Tyr His
        195                 200                 205
Pro Thr Ala Gly His Ala Ala Gly Tyr Leu Pro Val Leu Asn Ser Ile
    210                 215                 220
Thr
225
<210>31
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>序列基序
<220>
<221>位点
<222>(4)..(4)
<223>X是疏水性氨基酸残基
<400>31
Gly Asp Ser Xaa
1
<210>32
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>序列基序
<220>
<221>位点
<222>(5)..(5)
<223>Tyr、Ala或Leu
<400>32
Gly Ala Asn Asp Tyr
1               5

Claims (28)

1.制备溶血磷脂的方法，所述方法包括用至少一种脂肪分解酶处理含磷脂的底物来产生所述溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从喜热裂孢菌属得到，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
2.植物油的酶促脱胶方法，所述方法包括用可从喜热裂孢菌属得到的能水解极性脂质主要部分的脂肪分解酶处理所述植物油，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
3.食用油的酶促脱胶方法，所述方法包括用可从喜热裂孢菌属得到的能水解极性脂质主要部分的脂肪分解酶处理所述食用油，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
4.生物转化极性脂质以制造高价值产品的方法，所述方法包括用可从喜热裂孢菌属得到的脂肪分解酶处理所述极性脂质来产生所述高价值产品，其中所述脂肪分解酶能水解所述极性脂质，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码，其中所述高价值产品是以下一种或多种：碳水化合物酯、蛋白质酯、蛋白质亚基酯和羟酸酯。
5.制备食品的方法，所述方法包括将至少一种脂肪分解酶与食品的一种或多种成分混合，其中所述脂肪分解酶能水解存在于至少一种所述成分中的糖脂和/或磷脂或能水解作为至少一种所述成分的糖脂和/或磷脂，且其中所述脂肪分解酶可从喜热裂孢菌属得到，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
6.制备溶血糖脂的方法，所述方法包括用至少一种脂肪分解酶处理含糖脂的底物来产生所述溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从喜热裂孢菌属得到，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
7.根据权利要求1-6之任何一项的方法，其中所述脂肪分解酶能将酰基从糖脂转移至一种或多种酰基受体底物。
8.根据权利要求5的方法，其中所述食品选自以下一种或多种：基于蛋的产品，乳制品，食用油，调味品，焙烤品，糖果，冷冻产品，肉制品和涂抹食品。
9.根据权利要求5的方法，其中所述食品选自以下一种或多种：蛋；慕思，生植物奶油；脂肪，搅打起泡和不起泡的产品，水包油乳状液，油包水乳状液，人造黄油，起酥油；蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的汤，饮料和香料乳状液。
10.根据权利要求8的方法，其中所述基于蛋的产品包括蛋黄酱，色拉调味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黄及其制成品；焙烤品包括面包，蛋糕，甜面团产品，叠层面团产品，液态奶蛋糊，松饼，油炸圈饼，饼干，薄脆饼干和曲奇饼；糖果包括巧克力，饴糖，halawa，胶皮糖和布丁；冷冻产品包括冰糕；乳制品包括奶酪，黄油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳饮料和酸牛奶；肉制品包括经加工的肉制品；涂抹食品包括低脂肪的和极低脂肪的涂抹物。
11.根据权利要求8的方法，其中所述糖果是无糖和加糖胶皮糖，泡泡糖，软泡泡糖，口香糖；所述冷冻产品为冷冻乳制品。
12.根据权利要求11的方法，其中所述冷冻乳制品包括冰激凌和牛奶冻。
13.根据权利要求5的方法，其中所述食品是焙烤品，且至少一种所述成分是生面团。
14.根据权利要求5的方法，其中所述食品是蛋或基于蛋的产品。
15.根据权利要求5的方法，其中所述食品是乳制品。
16.脂肪分解酶在用于制备溶血磷脂的底物中的应用，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从喜热裂孢菌属得到，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
17.可从喜热裂孢菌属得到的脂肪分解酶用于植物油的酶促脱胶从而水解极性脂质主要部分的应用，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ IDNo.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
18.可从喜热裂孢菌属得到的脂肪分解酶用于食用油的酶促脱胶从而水解极性脂质主要部分的应用，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ IDNo.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
19.可从喜热裂孢菌属得到的脂肪分解酶在包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的方法中的应用，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
20.脂肪分解酶在生物转化极性脂质以制造高价值产品中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解所述极性脂质，且其中所述脂肪分解酶可从喜热裂孢菌属得到，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQID No.6所示的核苷酸序列编码，其中所述高价值产品是以下一种或多种：碳水化合物酯、蛋白质酯、蛋白质亚基酯和羟酸酯。
21.可从喜热裂孢菌属得到的脂肪分解酶在制备食品中的应用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂和/或磷脂，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
22.脂肪分解酶在用于制备溶血糖脂的底物中的应用，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可从喜热裂孢菌属得到，所述脂肪分解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示或者由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码。
23.根据权利要求16至22之任何一项的应用，其中所述脂肪分解酶能将酰基从糖脂转移至一种或多种酰基受体底物。
24.根据权利要求22的应用，其中所述溶血糖脂是DGMG或MGMG。
25.根据权利要求21的应用，其中所述食品是乳制品。
26.根据权利要求21的应用，其中所述食品是蛋或基于蛋的产品，且其中所述脂肪分解酶能将酰基转移至一种或多种酰基受体底物以降低一种或多种以下有害效应：臭味和/或异味和/或油腻口味。
27.根据权利要求21的应用，其中所述食品是焙烤品。
28.根据权利要求16的应用，其中所述底物是食用油。
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Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0112226D0 (en) * 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
ES2188190T5 (es) 1998-07-21 2007-11-16 Danisco A/S Producto alimentario.
ES2284897T3 (es) 2001-05-18 2007-11-16 Danisco A/S Procedimiento para la preparacion de una masa con una enzima.
DE602004030000D1 (de) 2003-01-17 2010-12-23 Danisco Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel
US20050196766A1 (en) 2003-12-24 2005-09-08 Soe Jorn B. Proteins
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
GB0716126D0 (en) * 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
DK1791933T3 (da) 2004-07-16 2011-09-05 Danisco Fremgangsmåde til enzymatisk afkogning af olie
CN101194019A (zh) † 2005-06-13 2008-06-04 诺维信公司 生产脱胶的脂肪酸烷基酯
CA2673954C (en) 2007-01-25 2015-09-15 Danisco A/S Production of a lipid acyltransferase from transformed bacillus licheniformis cells
CN102559627B (zh) * 2007-01-25 2014-09-10 杜邦营养生物科学有限公司 由地衣芽孢杆菌转化细胞制备脂酰基转移酶
JP5179208B2 (ja) 2007-01-30 2013-04-10 三菱化学フーズ株式会社 グリセロ糖脂質リパーゼ
DK2602263T3 (da) 2007-11-21 2019-10-21 Roskilde Univ Polypeptider omfattende en isbindende aktivitet
NZ585870A (en) * 2007-12-21 2012-04-27 Danisco Process for edible oil refining using a lipid acyltransferase
GB0807161D0 (en) * 2008-04-18 2008-05-21 Danisco Process
GB0812559D0 (en) 2008-07-09 2008-08-13 Danisco Method
GB0905367D0 (en) * 2009-03-27 2009-05-13 Danisco Method
US8945644B2 (en) * 2009-06-15 2015-02-03 Cavitation Technologies, Inc. Process to remove impurities from triacylglycerol oil
EP2281874A1 (en) 2009-07-31 2011-02-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Production of ß-Cells
WO2011045629A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Danisco A/S Lipid acyltransferase proteins and methods of making them
GB0920089D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Danisco Method
DK2545150T3 (en) 2010-03-12 2018-11-19 Dupont Nutrition Biosci Aps COURSE OF ACTION
GB201007668D0 (en) 2010-05-07 2010-06-23 Danisco Method
EP2582809A1 (en) 2010-06-17 2013-04-24 DuPont Nutrition Biosciences ApS Process
US9493749B2 (en) 2011-02-23 2016-11-15 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process modifications to enhance chlorophyll degradation
AR085251A1 (es) 2011-02-23 2013-09-18 Danisco Proceso para tratar aceite vegetal
ES2696576T3 (es) 2011-07-12 2019-01-17 Impossible Foods Inc Métodos y composiciones para productos de consumo
US20140220217A1 (en) 2011-07-12 2014-08-07 Maraxi, Inc. Method and compositions for consumables
CN103889243A (zh) 2011-07-12 2014-06-25 马拉克西公司 用于消费品的方法和组合物
WO2013104660A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for treating a plant oil comprising hydrolysing chlorophyll or a chlorophyll derivative and involving partial caustic neutralisation
WO2013104659A2 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process
US9677027B2 (en) 2012-02-17 2017-06-13 Clariant Produkte (Deutschland) Gmbh Composition for enzymatic oil degumming
US10039306B2 (en) 2012-03-16 2018-08-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
WO2013160372A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for treating plant oil involving addition of serial doses of chlorophyll or chlorophyll derivative degrading enzyme
WO2013160374A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for refining crude plant oil involving enzymatic hydrolysis and gum recycling
RU2646057C2 (ru) 2012-06-14 2018-03-01 БАНДЖ ГЛОБАЛ ИННОВЕЙШН ЭлЭлСи Способ получения низконасыщенных масел
WO2014013538A1 (ja) * 2012-07-17 2014-01-23 国立大学法人福島大学 プラスマローゲンの加水分解方法、プラスマローゲンの測定方法、ホスホリパーゼ含有組成物、ホスホリパーゼの製造方法
JP6401703B2 (ja) 2012-09-14 2018-10-10 アールイージー ライフ サイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 改善されたエステルシンターゼ特性を有する酵素変種
CN102907552B (zh) * 2012-10-08 2015-08-05 云南冷云食品饮料有限责任公司 一种添加脂肪分解酶的低脂冰淇淋及其制作工艺
RU2672489C2 (ru) 2013-01-11 2018-11-15 Импоссибл Фудз Инк. Немолочный аналог сыра, содержащий коацерват
EP4104682A3 (en) 2013-01-11 2023-02-22 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for affecting the flavour and aroma profile of consumables
EP2971519B1 (en) 2013-03-15 2020-10-28 United Technologies Corporation Method for working airfoil clusters of a gas turbine engine
EP2792735A1 (de) * 2013-04-16 2014-10-22 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Verfahren zur Verbesserung der wässrigen enzymatischen Entschleimung von Pflanzenölen
EP2799531A1 (de) 2013-05-03 2014-11-05 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Einsatz von Phosphatasen zur enzymatischen Entschleimung von Triglyceriden
KR20160140790A (ko) 2014-03-31 2016-12-07 임파서블 푸즈 인크. 분쇄 고기 모조물
WO2015150372A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method for increasing crude palm oil yields
KR20240023194A (ko) 2014-07-18 2024-02-20 게노마티카 인코포레이티드 지방 디올의 미생물 생산
DK3234083T3 (en) 2014-12-19 2019-04-01 Dupont Nutrition Biosci Aps RECOVERY OF OIL FROM PALM SUSPENSION
MX2018000708A (es) * 2015-07-17 2019-07-08 Keclon Sa Composiciones y metodos para desgomar aceite.
RU2763469C2 (ru) 2017-02-20 2021-12-29 Новозимс А/С Липолитический фермент для применения в хлебопечении
WO2019183213A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 Cargill, Incorporated Synthetic ester and mineral oil dielectric fluids with increased stability
CN110699178B (zh) * 2019-10-17 2022-10-25 贵州长顺八妹农副产品开发有限公司 一种菜籽油中不饱和脂肪酸的提取方法
AU2021227090A1 (en) 2020-02-28 2022-07-14 Chr. Hansen A/S Lipases, compositions, methods and uses thereof
CN112574975B (zh) * 2020-09-30 2022-04-01 华南理工大学 甘油酯脂肪酶突变体g28c-p206c及其编码基因与应用
GB202015772D0 (en) 2020-10-05 2020-11-18 Univ Newcastle Pngase enzymes
CN112450421B (zh) * 2020-10-19 2022-09-23 杭州师范大学 一种低油腻味的蛋黄酱及制备方法
KR20220095932A (ko) 2020-12-30 2022-07-07 주식회사 아데니스 고 hlb 레시틴의 제조시스템 및 그를 이용하여 제조된 고 hlb 레시틴
WO2023031266A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 Chr. Hansen A/S Yarrowia lipolytica and its use for producing lipases specifically liberating short chain fatty acids
WO2023092018A1 (en) * 2021-11-17 2023-05-25 Dupont Nutrition Biosciences Aps Improved enzymatic modification of galactolipids in food

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1331742A (zh) * 1998-11-27 2002-01-16 诺维信公司 脂解酶变体

Family Cites Families (362)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT110768B (de) 1927-09-29 1928-10-10 Patiag Patentverwertungs Und I Windkraftmaschine.
US2888385A (en) * 1952-11-28 1959-05-26 Grandel Felix Process of making a preparation containing lipases and oxidases
US3260606A (en) * 1964-04-29 1966-07-12 Taiyo Food Co Ltd Enzymatic treatment of egg
GB1092775A (en) * 1965-07-07 1967-11-29 Knud Aunstrup Preparation of amyloglucosidase
DK109695C (da) 1966-02-09 1968-06-10 Dansk Siemens Aktieselskab Kobling til automatisk udsendelse af forud bestemte signalfølger, navnlig kaldenumre i telekommunikationsanlæg, samt kodekort til brug i koblingen.
US3368903A (en) 1966-02-18 1968-02-13 Vanderbilt Co R T Baked goods dough and method
CH461935A (fr) * 1966-05-03 1968-08-31 Menzi Robert Procédé de fabrication de pâtes alimentaires séchées
DE1900959A1 (de) * 1969-01-09 1970-08-27 Unilever Nv Verfahren zur Herstellung von Pflanzenphosphatiden mit universeller Emulgierkraft
US3634195A (en) * 1969-09-08 1972-01-11 Miles Lab Production of lipase
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
GB1375783A (zh) 1972-02-04 1974-11-27
GB1442418A (en) 1972-12-14 1976-07-14 Procter & Gamble Method of cleansing polyester-containing fabrics
IL46862A (en) 1974-04-08 1977-12-30 Baxter Travenol Lab Lipolytic enzyme flavoring system for fat-containing food
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3973042A (en) * 1974-05-10 1976-08-03 Cornell Research Foundation, Inc. Flavor development by microbial lipases in pasteurized milk blue cheese
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
GB1525929A (en) * 1974-11-25 1978-09-27 Unilever Ltd Stabilised emulsions comprising phospholipoprotein
GB1577933A (en) 1976-02-11 1980-10-29 Unilever Ltd Fat process and composition
US4160848A (en) * 1977-04-18 1979-07-10 Pennwalt Corporation Antistaling agent for bakery products
JPS6049477B2 (ja) * 1977-04-19 1985-11-01 協和醗酵工業株式会社 グリセロ−ル酸化酵素およびその製造法ならびにグリセロ−ル酸化酵素を用いるグリセロ−ルの定量法
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
JPS5850719B2 (ja) 1978-10-18 1983-11-11 協和醗酵工業株式会社 トリグリセライドの定量方法
JPS602279Y2 (ja) 1979-03-06 1985-01-22 日本板硝子株式会社 コンクリ−トまたはモルタル注入装置
US4399218A (en) * 1980-02-05 1983-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Method and reagent for the determination of glycerin
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
WO1982003873A1 (en) 1981-05-07 1982-11-11 Halling Peter James Fat processing
JPS57189638U (zh) 1981-05-29 1982-12-01
JPS57189637U (zh) 1981-05-29 1982-12-01
JPS58148696U (ja) 1982-03-31 1983-10-05 三菱重工業株式会社 高速増殖炉
JPS6030488B2 (ja) 1982-11-10 1985-07-17 協和醗酵工業株式会社 生地の改良剤およびそれを含有してなる生地
JPS59172485A (ja) 1983-03-18 1984-09-29 Tetsuzo Kato ２，２−ジメチル−１，３−ジオキシン−４−オン誘導体の製造法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS59183881U (ja) 1983-05-25 1984-12-07 東商株式会社 スナツク飲料のセツト収納袋
DK289083A (da) 1983-06-23 1984-12-24 Novo Industri As Lipase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
DK402583D0 (da) 1983-09-05 1983-09-05 Novo Industri As Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf
DK152763C (da) 1983-09-05 1988-10-24 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat
JPS6078529U (ja) 1983-11-04 1985-05-31 オムロン株式会社 押しボタンスイツチ
US4707364A (en) 1984-01-27 1987-11-17 Miles Laboratories, Inc. Composition for accelerating cheese aging
JPS60147578U (ja) 1984-03-13 1985-10-01 トヨタ車体株式会社 クオ−タインナパネル等内板のカバ−取付構造
JPS60258766A (ja) 1984-06-05 1985-12-20 Matsushita Electric Ind Co Ltd 光情報記録再生装置
US4636468A (en) 1984-06-25 1987-01-13 Genencor, Inc. Lipolytic enzyme derived from a aspergillus microorganism having an accelerating effect on cheese flavor development
CA1262654A (en) 1984-08-10 1989-11-07 Takaoki Torigoe Food quality improving agent
NL8402979A (nl) * 1984-09-28 1986-04-16 Tno Werkwijze voor het bestrijden van vaatverwelkingsziekten bij gewassen, in het bijzonder de iepeziekte.
JPS61181390A (ja) 1985-02-06 1986-08-14 Amano Pharmaceut Co Ltd 酵素によるグリセライドの製造法
US4689297A (en) * 1985-03-05 1987-08-25 Miles Laboratories, Inc. Dust free particulate enzyme formulation
US5219733A (en) * 1985-03-06 1993-06-15 Yoshikawa Oil & Fat Co., Ltd. Process for preparing fatty acid esters
EP0195311B2 (en) 1985-03-06 1996-01-17 Yoshikawa Oil &amp; Fat Co., Ltd. Process for preparing fatty acid esters
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS61242542A (ja) 1985-04-22 1986-10-28 Fuji Oil Co Ltd チ−ズ風味材の製造法
US5310679A (en) * 1985-05-13 1994-05-10 Artiss Joseph D Composition for reducing turbidity in samples of biological fluids
GB8514708D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
GB8514707D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
GB8525012D0 (en) * 1985-10-10 1985-11-13 Cpc International Inc Carbohydrate refining process
JPH065501Y2 (ja) 1986-01-21 1994-02-09 丸井産業株式会社 沓摺盗み用金具
GB2185990B (en) * 1986-02-05 1990-01-24 Unilever Plc Margarine fat
US5536661A (en) * 1987-03-10 1996-07-16 Novo Nordisk A/S Process for the production of protein products in aspergillus
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5766912A (en) * 1986-03-17 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Humicola lipase produced in aspergillus
US5874558A (en) * 1986-03-17 1999-02-23 Novo Nordisk Nucleic acid encoding a recombinant humicola sp. lipase
JPH0324096Y2 (zh) 1986-04-14 1991-05-27
JPS62262997A (ja) * 1986-05-02 1987-11-16 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ワツクスの製造方法
JPS62285749A (ja) 1986-06-03 1987-12-11 日東製粉株式会社 パン類の製造方法
JPS6344892A (ja) 1986-08-13 1988-02-25 Kao Corp 油脂類のエステル交換反応方法
DK157560C (da) 1986-08-29 1990-06-11 Novo Nordisk As Enzymatisk detergentadditiv, detergent indeholdende det enzymatiske detergentadditiv og fremgangsmaade til vask af tekstiler.
ATE110768T1 (de) * 1986-08-29 1994-09-15 Novo Nordisk As Enzymhaltiger reinigungsmittelzusatz.
EP0260573A3 (de) 1986-09-18 1989-03-22 Lucas Meyer GmbH &amp; Co Verfahren zur Herstellung eines hydrolysierten Lecithins, sowie Anwendung des hydrolysierten Lecithins
WO1988002775A1 (en) 1986-10-17 1988-04-21 Novo Industri A/S Positionally non-specific lipase from candida sp, a method for producing it, its use and a recombinant dna process for producing it
US5273898A (en) 1986-10-17 1993-12-28 Noro Nordisk A/S Thermally stable and positionally non-specific lipase isolated from Candida
WO1988003365A1 (en) 1986-11-05 1988-05-19 George Weston Foods Limited Novel improvers for flour and yeast raised baked goods
US5108457A (en) 1986-11-19 1992-04-28 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system with modified enzyme
KR900003014B1 (ko) * 1986-12-27 1990-05-04 도오아 야꾸힌 고오교오 가부시끼가이샤 양식어(養殖魚)용 사료 첨가제
JPH088866B2 (ja) * 1987-03-10 1996-01-31 株式会社ヤクルト本社 ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法
US5219744A (en) * 1987-08-26 1993-06-15 Ajinomoto Co., Inc. Process for modifying fats and oils
ES2076939T3 (es) 1987-08-28 1995-11-16 Novo Nordisk As Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola.
EP0321811B2 (en) 1987-12-21 1999-12-22 Dsm N.V. Method for improving flour dough
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
DE3887694T2 (de) 1988-01-14 1994-05-19 Novo Nordisk As Vorrichtung zur bestimmung der koagulationszeit einer blutprobe.
DK77788A (da) * 1988-02-16 1989-08-17 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af kokosnoedolie
JP3079276B2 (ja) * 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
EP0334462B2 (en) 1988-03-25 2002-04-24 Genencor International, Inc. Molecular cloning and expression of genes encoding lipolytic enzymes
US5232846A (en) * 1988-08-09 1993-08-03 Unitika Ltd. Method for producing a thermostable lipoprotein lipase from streptomyces
JP2709736B2 (ja) 1988-08-11 1998-02-04 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
GB8906837D0 (en) 1989-03-23 1989-05-10 Unilever Plc Bread improvers
DE3920561A1 (de) * 1989-06-23 1991-01-10 Knoll Ag Verfahren zur vermeidung von verdauungsstoerungen bei pflanzenfressenden tieren
ATE160176T1 (de) 1989-07-07 1997-11-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung eines proteins mittels eines durch mehrfachkopieintegrierung eines expressionsvektors transformierten pilzes
US5213968A (en) * 1989-08-21 1993-05-25 Nestec S.A. Process for preparing emulsifying agents
DK0426211T3 (da) 1989-09-29 1994-01-31 Unilever Plc Næringsmiddelprodukt indeholdende tørret lyso-phospholipoprotein
US5677160A (en) * 1989-10-30 1997-10-14 Henkel Corporation Fat splitting process
WO1991006661A1 (en) 1989-11-03 1991-05-16 Opta Food Ingredients, Inc. Lipase-catalyzed in situ generation of mono- and di-glycerides
US5288619A (en) * 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
JPH03262492A (ja) 1990-03-06 1991-11-22 P Macneil Gerald モノグリセリドの製造方法
DK19991D0 (da) * 1991-02-06 1991-02-06 Novo Nordisk As Proteinpraeparationer
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
NZ237549A (en) 1990-03-23 1993-06-25 Gist Brocades Nv Production of enhanced levels of enzymes in the seeds of transgenic plants and the use of these seeds
KR100237148B1 (ko) 1990-05-09 2000-01-15 한센 핀 베네드 엔도글루칸아제 효소를 함유하는 셀룰라제 제조물
US5814501A (en) 1990-06-04 1998-09-29 Genencor International, Inc. Process for making dust-free enzyme-containing particles from an enzyme-containing fermentation broth
JP3006085B2 (ja) 1990-11-30 2000-02-07 オリエンタル酵母工業株式会社 製パン改良剤及びそれを用いる製パン法
EP0468731A1 (en) 1990-07-26 1992-01-29 Oriental Yeast Co., Ltd. Bread improver and method of producing bread
US5869438A (en) * 1990-09-13 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
ATE169671T1 (de) 1990-09-13 1998-08-15 Novo Nordisk As Lipase-varianten
US5892013A (en) * 1990-09-13 1999-04-06 Novo Nordisk A/S Lipase variants
CA2058056C (en) 1990-12-21 1996-11-05 Chiaki Saito Method of decreasing cholesterol concentration in food
EP0571421B1 (en) 1991-02-13 1995-07-26 SCHNEIDER, Manfred P. Enzymatic reverse hydrolysis of hydrophilic substrates - preparation of amphiphilic compounds
PH31068A (en) 1991-03-07 1998-02-05 Ici Plc Process for the production of terephthalic acid.
DE4112440C1 (zh) 1991-04-16 1992-10-22 Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De
EP0585285B1 (en) * 1991-05-01 1998-08-12 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes
US5502045A (en) 1991-05-03 1996-03-26 Raision Tehtaat Oy Ab Use of a stanol fatty acid ester for reducing serum cholesterol level
DE4115938A1 (de) 1991-05-16 1992-11-19 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen
GB9114734D0 (en) 1991-07-09 1991-08-28 Univ London Process for modifying proteins
CA2077020A1 (en) 1991-09-03 1993-03-04 Yoshikazu Isono Process for producing lipoprotein-containing substance having reduced lipid content and food containing substance thus produced
US5879920A (en) * 1991-10-07 1999-03-09 Genencor International, Inc. Coated enzyme-containing granule
EP0542351B1 (en) 1991-11-11 1996-01-17 Akzo Nobel N.V. Process for the preparation of salt granulates
MX9206979A (es) 1991-12-04 1993-07-01 Novo Nordisk As Metodo de clonacion de proteinas en levaduras
AU667503B2 (en) 1991-12-20 1996-03-28 Novo Nordisk Health Care Ag A stabilized pharmaceutical formulation comprising growth hormone and histidine
EP0558112A1 (en) 1992-02-25 1993-09-01 Unilever N.V. Enzymic diglyceride removal
CA2079839A1 (en) 1992-02-28 1993-08-29 Vincent Destefanis Calcium peroxide and ascorbic acid containing compositions as replacements for bromate in breadmaking
GB2267033B (en) 1992-03-07 1996-01-24 David Garnett Lysophospholipid Animal Feed Supplement
DK42092D0 (zh) 1992-03-27 1992-03-27 Novo Nordisk As
DK73592D0 (da) * 1992-06-03 1992-06-03 Novo Nordisk As Nyt enzym
ATE222599T1 (de) * 1992-06-16 2002-09-15 Sankyo Co Phospholipase a1, verfahren zu seiner herstellung und anwendung
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
EP0580252A2 (en) 1992-07-20 1994-01-26 Quest International B.V. Improvements in or relating to pectin methyl esterase
ATE135163T1 (de) 1992-07-27 1996-03-15 Gist Brocades Nv Enzymprodukt und verfahren zur verbesserung der qualität von brot
DK104592D0 (da) 1992-08-21 1992-08-21 Novo Nordisk As Fremgangsmaade
JPH08504327A (ja) 1992-12-10 1996-05-14 ギスト ブロカデス ナムローゼ フェンノートシャップ 糸状菌における異種タンパクの生産
JP3507076B2 (ja) 1992-12-22 2004-03-15 ノボザイムス アクティーゼルスカブ アルカリリパーゼ
DK154292D0 (da) 1992-12-23 1992-12-23 Novo Nordisk As Nyt enzym
JP2937746B2 (ja) 1993-04-25 1999-08-23 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
CA2140530A1 (en) 1993-05-18 1994-11-24 Carl S. M. Andela Process for dust-free enzyme manufacture
ZA943640B (en) 1993-06-07 1995-01-26 Buckman Labor Inc Synergistically stabilized liquid enzymatic compositions
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
BR9407752A (pt) 1993-10-04 1997-03-04 Novo Nordisk As Preparaçao de enzima aditivo detergente composiçao detergente processo para o tratamento de fibras lignocelulósicas
ATE211621T1 (de) * 1993-10-29 2002-01-15 Dsm Nv Backverbesserende zusammensetzungen
EP0652289A1 (en) 1993-11-05 1995-05-10 Unilever Plc Random interesterification of triglyceride fats
DE4339556C1 (de) * 1993-11-19 1995-02-02 Metallgesellschaft Ag Verfahren zum Entschleimen von Pflanzenöl mittels Enzymen
ATE202674T1 (de) * 1993-12-24 2001-07-15 Dsm Nv Trockenhefe zusammensetzungen
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO1995022606A1 (en) 1994-02-21 1995-08-24 Novo Nordisk A/S Method for production of an immobilized enzyme preparation and use of the immobilized enzyme preparation
MX9603542A (es) 1994-02-22 1997-03-29 Novo Nordisk As Metodo para preparar una variante de una enzima lipolitica.
EP0758377A1 (en) 1994-05-03 1997-02-19 Novo Nordisk A/S Alkaline glucose oxidase
US5834280A (en) 1994-05-03 1998-11-10 Novo Nordisk A/S Glucose oxidases obtained from a cladosporium
DK0755442T3 (da) 1994-05-04 2003-04-14 Genencor Int Lipaser med forbedret resistens over for overfladeaktive midler
US5741665A (en) 1994-05-10 1998-04-21 University Of Hawaii Light-regulated promoters for production of heterologous proteins in filamentous fungi
DE69501228T2 (de) 1994-05-11 1998-05-07 Amano Pharma Co Ltd Ascorbatoxidase, dafür kodierendes Gen, Verfahren zu ihrer Herstellung und dieselbe verwendende Reagens-Zusammensetzung
HUT74965A (en) 1994-06-16 1997-03-28 Firmenich & Cie Flavouring composition and process
EP0687414B1 (en) 1994-06-17 2000-11-08 Dsm N.V. Bread improving composition
JPH10507911A (ja) 1994-09-21 1998-08-04 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 澱粉含有廃物の脱脂
US5830736A (en) 1994-10-26 1998-11-03 Novo Nordisk A/S Lipolytic enzyme
EP0785994A1 (en) 1994-10-26 1997-07-30 Novo Nordisk A/S An enzyme with lipolytic activity
JPH10507639A (ja) 1994-10-26 1998-07-28 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素界面活性剤組成物
GB2296011B (en) 1994-12-13 1999-06-16 Solvay Novel fusarium isolate and lipases, cutinases and enzyme compositions derived therefrom
US6093562A (en) * 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
WO1996025858A1 (en) 1995-02-22 1996-08-29 Chris Ritter Process for reducing sterols and free fatty acids from animal fat
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
JP3359777B2 (ja) * 1995-03-06 2002-12-24 日清製粉株式会社 油揚げ即席麺およびその製造方法
DE69632630T2 (de) 1995-03-16 2005-05-25 Novozymes A/S Enzym mit aminopeptidaseactivität
US5919746A (en) * 1995-03-30 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
DE69628642T2 (de) 1995-03-30 2004-05-13 Novozymes A/S Alkalisches lypolitsches enzym
AU5333396A (en) 1995-04-11 1996-10-30 Novo Nordisk A/S Bread-improving additive comprising a xylanolytic enzyme
US5989599A (en) 1995-04-24 1999-11-23 Nestec S.A. Process for the interesterification of phospholipids
EP0743017B1 (en) 1995-05-15 2004-09-29 DSM IP Assets B.V. Application of phospholipases in animal feed
GB2301103B (en) 1995-05-23 1999-12-22 Danisco An enzyme system comprising ferulic acid esterase
GB0211975D0 (en) * 2002-05-24 2002-07-03 Danisco Method
US6936289B2 (en) * 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
GB0112226D0 (en) 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
CA2224143C (en) 1995-06-07 2009-10-27 Bioteknologisk Institut Recombinant hexose oxidase, a method of producing same and use of such enzyme
WO1996039851A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Danisco A/S A method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
US6495357B1 (en) 1995-07-14 2002-12-17 Novozyme A/S Lipolytic enzymes
DE69633825T2 (de) 1995-07-14 2005-11-10 Novozymes A/S Modifiziertes enzym mit lipolytischer aktivität
DE19527274A1 (de) 1995-07-26 1997-01-30 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase
EP0851913B1 (en) 1995-08-11 2004-05-19 Novozymes A/S Novel lipolytic enzymes
DE69620766T2 (de) 1995-08-11 2004-11-18 Novozymes A/S Verfahren zur herstellung von polypeptidabkömmlingen
EP0866796B1 (en) 1995-09-22 2000-11-29 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Improvements in or relating to mutagenesis of nucleic acids
FR2739860B1 (fr) 1995-10-17 1998-01-02 Coletica Complexes amphiphiles, procede pour leur preparation et compositions en renfermant
EP0776604B1 (en) 1995-12-01 2002-01-23 Unilever N.V. Microwavable crispy bread-rolls
US6344328B1 (en) 1995-12-07 2002-02-05 Diversa Corporation Method for screening for enzyme activity
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US5756328A (en) * 1995-12-20 1998-05-26 Cornell Research Foundation, Inc. Acyltransferase and cDNA encoding acyltransferase
JP3233286B2 (ja) 1996-01-22 2001-11-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 環状オリゴマーの酵素加水分解
CN1209842A (zh) 1996-01-24 1999-03-03 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 编码具有犁头霉属脂酶活性的多肽的核酸
US5942430A (en) 1996-02-16 1999-08-24 Diversa Corporation Esterases
US6001586A (en) 1996-03-29 1999-12-14 Genencor International, Inc. Compartmentalization method for screening microorganisms
DE69731195T2 (de) * 1996-04-25 2006-03-09 Novozymes A/S Alkalisches, lipolytisches enzym
WO1997041735A1 (en) 1996-05-02 1997-11-13 Novo Nordisk A/S Use of a dextrin glycosyl transferase in baking
EP0915659A1 (en) 1996-05-02 1999-05-19 Novo Nordisk A/S Use of a branching enzyme in baking
DE19620649A1 (de) 1996-05-22 1997-11-27 Roehm Gmbh Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus
JP2000513231A (ja) 1996-07-01 2000-10-10 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ ベーキングにおけるデアミダーゼの利用
AU3938697A (en) 1996-08-27 1998-03-19 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
EP0956346A1 (en) 1996-09-26 1999-11-17 Novo Nordisk A/S An enzyme with cyclomaltodextrin glucanotransferase (cgtase) activity
CN101139612A (zh) 1996-09-30 2008-03-12 金克克国际有限公司 分离编码具有酯酶活性的蛋白的dna的方法
JPH10155493A (ja) 1996-10-04 1998-06-16 Sankyo Co Ltd アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子
WO1998016112A1 (en) 1996-10-11 1998-04-23 Novo Nordisk A/S Use of a carbohydrate binding domain in baking
JP3182381B2 (ja) 1996-10-25 2001-07-03 日清製粉株式会社 麺類の機械製麺法
EP0948608A1 (en) 1996-10-31 1999-10-13 Novo Nordisk A/S Novel phospholipase, production and use thereof
DE19648343C1 (de) * 1996-11-22 1998-02-12 Roehm Gmbh Verfahren zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung
JP3582265B2 (ja) 1996-11-28 2004-10-27 味の素株式会社 改質穀粉及びこれを使用した穀粉加工食品
US6103505A (en) 1996-12-09 2000-08-15 Novo Nordisk A/S Method for reducing phosphorus content of edible oils
AU5187898A (en) 1996-12-09 1998-07-03 Novo Nordisk A/S Reduction of phosphorus containing components in edible oils comprising a high amount of non-hydratable phosphorus by use of a phospholipase, a phospholipase from a filamentous fungus having phospholipase a and/or b activity
DE19701348A1 (de) * 1997-01-16 1998-07-23 Roehm Gmbh Protein mit Phospholipaseaktivität
US5821102A (en) 1997-01-21 1998-10-13 Novo Nordisk Biotech Inc. Nucleic acids encoding polyeptides having absidia lipase activity
JP4018769B2 (ja) 1997-01-28 2007-12-05 日本ケミテック株式会社 膵リパーゼ活性阻害剤、機能性食品及び食品添加物
ATE468394T1 (de) 1997-03-18 2010-06-15 Novozymes As Vermischen von heterologen dns-sequenzen
DE69806586T2 (de) 1997-04-09 2003-03-27 Danisco As Kopenhagen Koebenha Verbessertes verfahren zur herstellung von mehlteigwaren sowie produkte hergestellt aus solchen teigwaren unter verwendung von glyzerinoxidase
GB9709161D0 (en) 1997-05-06 1997-06-25 Danisco A process of preparing an anti-oxidant
US6465209B1 (en) 1997-05-16 2002-10-15 Novozymes Biotech, Inc. Methods of producing protein hydrolysates
EP0882797B1 (en) 1997-06-04 2003-07-16 Loders Croklaan B.V. Preparation of symmetrical triglycerides aba
RU2140751C1 (ru) 1997-06-11 1999-11-10 Ассоциация "Ассоя" Пищевая добавка для производства хлеба и хлебобулочных изделий
JP4121186B2 (ja) 1997-06-16 2008-07-23 株式会社日立製作所 セラミックス管の検査方法及びその装置
WO1998059028A1 (en) 1997-06-23 1998-12-30 The Procter & Gamble Company Enzymatic detergent compositions
EP0913468A3 (en) 1997-07-22 2001-06-13 Dsm N.V. Bread improving comüposition
DK0897667T4 (da) 1997-07-31 2009-02-16 Dsm Ip Assets Bv Brödforbedrende sammensætning
US6355282B1 (en) 1997-10-31 2002-03-12 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Dough composition and preparation thereof
DE69819782T2 (de) 1997-12-23 2004-09-30 Novozymes A/S Verfahren zur immobilisierung von enzymen
US6156548A (en) * 1997-12-23 2000-12-05 Novo Nordisk A/S Immobilization of enzymes with a fluidized bed for use in an organic medium
EP1042501B2 (en) 1997-12-24 2011-03-30 Genencor International, Inc. Method for assaying the wash performance of an enzyme.
GB9801408D0 (en) 1998-01-22 1998-03-18 Unilever Plc Frozen food product
JPH11228986A (ja) 1998-02-10 1999-08-24 Agency Of Ind Science & Technol 固定化ホスホリパーゼによる脱ガム法
AU3247699A (en) 1998-02-17 1999-09-06 Novo Nordisk A/S Lipase variant
ES2241267T3 (es) 1998-04-01 2005-10-16 Danisco A/S Exoamilasas no maltogenicas y su utilizacion en el retraso de la retrogradacion del almidon.
BR9909502A (pt) 1998-04-08 2000-12-12 Novo Nordisk As Processo para redução do teor de componentes contendo fósforo em um óleo edìvel
JPH11290078A (ja) 1998-04-09 1999-10-26 Kansai Kagaku Kikai Seisaku Kk 細胞表層にリパーゼを有する酵母並びにその利用
US6815190B1 (en) 1998-04-12 2004-11-09 Novozymes A/S Cutinase variants
US6365204B1 (en) * 1998-04-20 2002-04-02 Novozymes Preparation of dough and baked products
EP1073339B2 (en) 1998-04-20 2008-04-16 Novozymes A/S Preparation of dough and baked products
WO1999055883A2 (en) 1998-04-30 1999-11-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Triacylglycerol lipases
US6866837B2 (en) * 1998-06-05 2005-03-15 Mallinckrodt Inc. Radiolabeled peptides for the diagnosis and treatment of breast and prostate tumors and metastases of such tumors
US20030074695A1 (en) * 1998-06-24 2003-04-17 Farese Robert V. Plant diacylglycerol O-acyltransferase and uses thereof
BR9911800A (pt) * 1998-07-02 2001-02-28 Calgene Llc Proteìnas de diacil glicerol acil transferase
SE510497C2 (sv) 1998-07-15 1999-05-31 Biofeed Thailand Co Ltd Funktionellt födoämne innehållande mikroorganismer
ES2188190T5 (es) * 1998-07-21 2007-11-16 Danisco A/S Producto alimentario.
JP3414652B2 (ja) 1998-10-12 2003-06-09 敷島製パン株式会社 小麦粉焼成品、その製造方法および品質改良剤
FI115527B (fi) 1998-10-16 2005-05-31 Upm Kymmene Oyj Kasvisterolijohdannaisten käyttö ja niitä sisältäviä tuotteita
DE69930955T2 (de) 1998-11-10 2006-12-21 Novozymes, Inc., Davis Polypeptide mit lysophospholipaseaktivität und nukleinesäuren die sie kodieren
RU2235775C2 (ru) 1998-11-27 2004-09-10 Новозимс А/С Способ получения варианта липолитического фермента и липолитический фермент (варианты)
WO2000032758A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
US7312062B2 (en) * 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
JP4615723B2 (ja) 1998-12-04 2011-01-19 ノボザイムス アクティーゼルスカブ クチナーゼ変異体
JP2000226335A (ja) 1998-12-04 2000-08-15 Amano Pharmaceut Co Ltd 経口用酵素製剤、酵素含有食材及び酵素製剤の服用方法
TR200101551T2 (tr) 1998-12-04 2001-10-22 Novozymes A/S Farklı kütinaz şekilleri.
ATE340861T1 (de) 1998-12-17 2006-10-15 Ca Nat Research Council Diacylglyzerin-acyltransferase gen aus pflanzen
CA2360065A1 (en) 1999-01-22 2000-07-27 Hunza Di Maria Carmela Marazzita S.A.S. Lipoprotein complexes and compositions containing them
NZ514123A (en) 1999-02-16 2003-10-31 Senesco Inc DNA encoding a plant lipase, transgenic plants and a method for controlling senescence in plants
US6399121B1 (en) 1999-03-16 2002-06-04 Novozymes A/S Process for producing cheese
ES2237410T3 (es) 1999-03-16 2005-08-01 Novozymes A/S Proceso de produccion de queso.
CA2329122A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
WO2000059307A1 (en) 1999-03-30 2000-10-12 Novozymes A/S Preparation of dough and baked products
WO2000060063A1 (en) 1999-03-31 2000-10-12 Novozymes A/S Lipase variant
ATE446370T1 (de) 1999-04-12 2009-11-15 Monsanto Technology Llc Öl, das brassicastanol enthält
US6162260A (en) 1999-05-24 2000-12-19 Novo Nordisk Biochem North America, Inc. Single-bath biopreparation and dyeing of textiles
AU5060900A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Novozymes A/S Chemically modified lipolytic enzyme
EP1057415A1 (en) 1999-06-04 2000-12-06 Societe Des Produits Nestle S.A. Lipase-treated pasta and manufacturing process
US6254645B1 (en) * 1999-08-20 2001-07-03 Genencor International, Inc. Enzymatic modification of the surface of a polyester fiber or article
KR20080049150A (ko) * 1999-08-30 2008-06-03 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물 스테롤 아실전달효소
US6337187B1 (en) 1999-11-05 2002-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18891, a novel human lipase
DE10030529A1 (de) * 1999-09-30 2001-04-19 Biotechnolog Forschung Gmbh DNA-Sequenzen, die Estergruppen spaltende Enzyme kodieren
DK1224267T3 (da) * 1999-10-14 2011-04-26 Novozymes As Lysophospholipase
US6146869A (en) 1999-10-21 2000-11-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having phospholipase B activity and nucleic acids encoding same
DE19953854C2 (de) 1999-11-09 2002-01-17 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften
FI108204B (fi) 1999-11-25 2001-11-30 Kari Johannes Kirjavainen Kalvo energioiden muuntamiseksi
JP2003515332A (ja) 1999-12-03 2003-05-07 ダニスコ アクティーゼルスカブ 生地およびパンの品質を改良する方法
GB2358784B (en) 1999-12-03 2004-06-30 Danisco Method of improving dough and bread quality
GB9928968D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Danisco Enzyme
AU2367401A (en) 1999-12-23 2001-07-09 Dsm N.V. Bread improver comprising bile salt and phospholipase a
US7078205B2 (en) * 2000-02-17 2006-07-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding melanoma associated antigen molecules, aminotransferase molecules, atpase molecules, acyltransferase molecules, pyridoxal-phosphate dependent enzyme molecules and uses therefor
MXPA02008817A (es) 2000-03-08 2003-02-12 Danisco Variantes de xilanasa que tiene sensiblidad alterada a inhibidores de xilanasa.
IL135466A (en) 2000-04-04 2006-07-05 Sobhi Basheer A process for the selective alcoholization of free sterols in a fatty product using a non-solvent lipase complex fixed on a matrix
AU2001255392A1 (en) 2000-04-14 2001-10-30 Novo Nordisk Biotech, Inc. Enzymatic treatment of potato products
DE10018787A1 (de) 2000-04-15 2001-05-03 Nikolaus Weber Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern
US7226770B2 (en) 2000-04-28 2007-06-05 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variant
DE60112928T2 (de) 2000-06-02 2006-06-14 Novozymes As Cutinase-varianten
US6432898B1 (en) * 2000-10-31 2002-08-13 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having lipase activity and nucleic acids encoding same
US6558715B1 (en) * 2000-10-31 2003-05-06 Novozymes Biotech, Inc. Methods for using lipases in baking
US6511837B2 (en) * 2000-06-26 2003-01-28 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
US6506588B2 (en) * 2000-06-26 2003-01-14 Novozymes, A/S Lipolytic enzymes
US6509182B2 (en) * 2000-06-26 2003-01-21 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
EP2119773A1 (en) * 2000-06-26 2009-11-18 Novozymes A/S Lipolytic enzymes from strains of fusarium and acremonium
EP1298205A4 (en) 2000-07-03 2004-06-16 Mochida Pharm Co Ltd NEW LIPASE
EP1301080B1 (en) * 2000-07-06 2011-09-14 Novozymes A/S Method of preparing a dough, or a baked product made from a dough, with addition of lipolytic enzymes
WO2002006457A2 (en) 2000-07-13 2002-01-24 Maxygen, Inc. Novel lipase genes
AU2001272373A1 (en) 2000-07-19 2002-01-30 Novozymes A/S Cgtase and dna sequence encoding same
DK1309677T4 (da) 2000-08-11 2012-06-25 Genencor Int Bacillustransformation, transformanter og mutantbiblioteker
DE10042636C1 (de) * 2000-08-30 2002-04-11 Epcos Ag Elektrisches Bauelement und Verfahren zu dessen Herstellung
KR100380804B1 (ko) * 2000-09-15 2003-04-18 한국과학기술원 내열성을 갖는 포스포리파제 ａ1의 돌연변이체 및 그의제조방법
AU2001289588A1 (en) 2000-09-25 2002-04-02 Novozymes A/S Phospholipase from zygoascus hellenicus
CA2421820A1 (en) 2000-09-25 2002-01-03 Novozymes A/S Methods for processing crustacean material
AU2001293684A1 (en) 2000-10-12 2002-04-22 Novozymes A/S Preparation of baked product from dough
JP3739274B2 (ja) 2000-10-31 2006-01-25 Ｋｄｄｉ株式会社 ２系統映像の位置ずれ補正装置
AU1942202A (en) 2000-11-17 2002-05-27 Danisco Method
US6660491B2 (en) * 2000-11-24 2003-12-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. Process for producing dietary sterol fatty acid esters
AU2002219020B2 (en) 2001-01-10 2007-05-24 Novozymes A/S Thermostable lipolytic enzyme variant
CA2432329C (en) 2001-02-07 2012-04-10 Novozymes A/S Lipase variants
KR20030078065A (ko) 2001-02-21 2003-10-04 노보자임스 에이/에스 녹말 식품의 제법
CN1526013A (zh) 2001-02-23 2004-09-01 诺维信公司 脂解酶基因
ES2284897T3 (es) 2001-05-18 2007-11-16 Danisco A/S Procedimiento para la preparacion de una masa con una enzima.
US6645749B2 (en) * 2001-05-25 2003-11-11 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
US7630836B2 (en) 2001-05-30 2009-12-08 The Kitasato Institute Polynucleotides
US7419658B2 (en) 2001-07-09 2008-09-02 Euroscreen S.A. Isolated ligand of ChemerinR
EP1275711B1 (de) 2001-07-11 2010-05-12 Cognis IP Management GmbH Lipase/Acyltransferase aus Candida parapsilosis
ATE342374T1 (de) 2001-08-22 2006-11-15 Haerting Thomas Francis Verfahren zur herstellung von sterol- und stanolestern mittels enzymatischer transesterifikation in lösungsmittel- und wasserfreien medien
DE10142014B4 (de) 2001-08-28 2004-11-11 Degussa Bioactives Deutschland Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin
GB0121387D0 (en) 2001-09-04 2001-10-24 Danisco Modified hydrolases
WO2003040091A2 (en) 2001-11-05 2003-05-15 Novozymes A/S Fat splitting process
WO2003060112A1 (en) 2002-01-16 2003-07-24 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants and method for their production
AU2003205559A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Novozymes A/S Process for producing cheese
US7010968B2 (en) 2002-04-18 2006-03-14 Schrader Bridgeport International, Inc. Determination of wheel sensor position using a wireless solution
US7226771B2 (en) * 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN1659276A (zh) 2002-04-19 2005-08-24 戴弗萨公司 磷脂酶,编码磷脂酶的核酸以及制备和应用磷脂酶的方法
WO2003097835A2 (en) 2002-05-16 2003-11-27 Molecular Engines Laboratories Pharmaceutical compositions for the treatment of cancer
WO2003097825A2 (en) 2002-05-21 2003-11-27 Dsm Ip Assets B.V. Novel phospholipases and uses thereof
SE0201581D0 (sv) * 2002-05-29 2002-05-29 Scandinavian Biotechnology Res New improved acyltransferase
WO2003102118A2 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the pre-treatment of vegetable oils for physical refining
AU2003277844A1 (en) 2002-06-24 2004-01-06 Campbell Soup Company Dispensing system and method
US20040203791A1 (en) 2002-06-26 2004-10-14 Pan Shaowei Method and apparatus for implementing bi-directional soft handovers between wireless networks via mobile station control
JP2004024199A (ja) * 2002-06-28 2004-01-29 National Food Research Institute マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチド
CA2490944C (en) 2002-07-03 2012-05-15 Novozymes A/S Treatment of dough with a lipoxygenase and a lipolytic enzyme
MXPA05001978A (es) 2002-08-19 2005-04-28 Dsm Ip Assets Bv Nuevas lipasas y usos de las mismas.
CA2403025A1 (en) * 2002-10-08 2004-04-08 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Enzymes with lipase/acyltransferase activity
US6773731B2 (en) * 2002-10-18 2004-08-10 James S. Campbell Liquid egg yolk product comprising lysophospholipoprotein
GB2379165A (en) 2002-10-22 2003-03-05 Dsm Nv Animal feed
JP4300839B2 (ja) 2002-11-14 2009-07-22 セイコーエプソン株式会社 画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラム
AU2003302905A1 (en) 2002-12-11 2004-06-30 Novozymes A/S Detergent composition comprising endo-glucanase
US8309147B2 (en) 2002-12-12 2012-11-13 Novozymes A/S Method for selecting lipolytic enzyme
JP2006511725A (ja) 2002-12-23 2006-04-06 ノボザイムス ノース アメリカ，インコーポレイティド ポリエステル布の処理方法
US7955814B2 (en) * 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
DE602004030000D1 (de) * 2003-01-17 2010-12-23 Danisco Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel
JP4804340B2 (ja) * 2003-01-17 2011-11-02 ダニスコ エイ／エス 脂質アシルトランスフェラーゼの使用
ES2215482B1 (es) 2003-03-28 2005-12-16 Consejo Sup. De Invest. Cientificas Composicion mejoradora de masas para panaderia y pasteleria.
BRPI0409599B1 (pt) 2003-04-28 2014-09-16 Novozymes As Sequência de ácido nucléico, construto de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, micro-organismo recombinante, composição de massa, métodos de produzir uma fosfolipase, de preparar uma massa ou um produto assado feito da massa, processos para reduzir o conteúdo de fósforo em um óleo vegetal e para produzir queijo
EP1639102A2 (en) 2003-06-19 2006-03-29 Novozymes A/S Phospholipase variants
WO2005005977A2 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Applera Corporation Fluorescent phospholipase assays and compositions
CA2536376A1 (en) 2003-07-07 2005-01-27 Genencor International, Inc. Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof
JP4327536B2 (ja) 2003-09-01 2009-09-09 レシップ株式会社 券硬貨投入口及びそれを備えた券硬貨分離装置
CA2547709C (en) 2003-12-03 2017-02-07 Genencor International, Inc. Perhydrolase
GB0716126D0 (en) 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
CA2550800A1 (en) * 2003-12-24 2005-07-21 Danisco A/S Methods to produce variant glycolipid acyltransferases and variant glycolipid acyltransferases with enhanced activity towards glycolipids.
US7718408B2 (en) * 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
US7906307B2 (en) * 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
DK1704240T3 (da) 2003-12-24 2008-02-25 Danisco Enzymatisk behandling af olier
DE602005009330D1 (de) 2004-02-24 2008-10-09 Novozymes As Enzymstabilisierung in flüssigen waschmitteln
GB0405637D0 (en) * 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
BRPI0509671A (pt) 2004-04-08 2007-10-30 Genencor Internation Inc alfa-amilases mutante
DK1791933T3 (da) * 2004-07-16 2011-09-05 Danisco Fremgangsmåde til enzymatisk afkogning af olie
ATE342951T1 (de) 2004-08-06 2006-11-15 Smet Engineering N V De Verfahren zum rückgewinnen von öl
WO2006031699A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Diversa Corporation Compositions and methods for making and modifying oils
ATE499439T1 (de) 2004-09-21 2011-03-15 Novozymes As Subtilasen
DE602005027093D1 (de) * 2004-09-30 2011-05-05 Novozymes Inc Polypeptide mit lipase-aktivität und diese kodierende polynukleotide
PL1649756T3 (pl) 2004-10-25 2011-03-31 Nestec Sa Modyfikowany produkt kakaowy i sposób jego wytwarzania
ATE499010T1 (de) 2004-12-21 2011-03-15 Novozymes As Verfahren zur herstellung von fraktionen einer milchzusammensetzung
DE102005039836A1 (de) 2005-08-23 2007-03-01 Cognis Ip Management Gmbh Sterolesterpulver
EP1788080A1 (en) 2005-11-22 2007-05-23 Süd-Chemie Ag Use of a thermostable phospholipase in the degumming of an oil or fat, and a method for obtaining a thermostable phopholipase
EP1876222A1 (en) 2006-07-06 2008-01-09 Cognis IP Management GmbH Process for production of fatty acids, fatty acid esters and sterolesters from soapstock
CA2663001A1 (en) 2006-09-21 2008-03-27 Verenium Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2673954C (en) 2007-01-25 2015-09-15 Danisco A/S Production of a lipid acyltransferase from transformed bacillus licheniformis cells
MX2009007919A (es) 2007-01-30 2009-08-27 Bunge Oils Inc Desgomado enzimatico que utiliza una mezcla de fosfolipasas pla y plc.
WO2009002480A2 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Danisco Us, Inc., Genencor Division Acyl transferase having altered substrate specificity
CN101200754B (zh) 2007-12-07 2010-06-02 中国农业科学院油料作物研究所 无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法
NZ585870A (en) 2007-12-21 2012-04-27 Danisco Process for edible oil refining using a lipid acyltransferase
JP5211852B2 (ja) 2008-05-23 2013-06-12 株式会社Ｉｈｉ 加圧浮上装置及び加圧浮上方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1331742A (zh) * 1998-11-27 2002-01-16 诺维信公司 脂解酶变体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JP昭63-219373A 1988.09.13

Also Published As

Publication number Publication date
AU2005264077A1 (en) 2006-01-26
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PL1776455T3 (pl) 2015-09-30
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