CN102239255B

CN102239255B - 改善过水解酶用于酶促过酸生成

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Publication number: CN102239255B
Application number: CN200980148053.5A
Authority: CN
Inventors: R·迪科西莫; M·S·佩恩; T·殷
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2008-10-03
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2029-10-01
Also published as: US8148314B2; JP5665747B2; US20100087529A1; US20120276609A1; CN102264893A; CN102239256A; CN102264894A; DK2342324T3; ES2735230T3; US20100086510A1; US20130004479A1; AU2009298420B2; EP2342328A1; EP2342324B1; CN102239264A; US8367597B2; AU2009298420A1; WO2010039960A1; US8148316B2; US20120094342A1

Abstract

本文所公开的是在结构上归类为CE-7酶并具有过水解活性的变体酶。本文也公开了使用前述变体酶从羧酸酯中制备过氧羧酸的方法，以及包含该变体酶的方法和组合物。此外，提供了包含通过本文所述方法生产的过氧羧酸的消毒剂。

Description

改善过水解酶用于酶促过酸生成

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2008年10月3日的美国临时申请61/102,505；61/102,512；61/102,514；61/102,520；61/102,531；和61/102,539的优先权；上述文献均全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明涉及酶促过氧羧酸合成和原位酶催化领域。更具体地讲，本发明提供了涉及具有改善的过水解活性的多种酶催化剂的组合物和方法。生产至少一种过氧羧酸，其浓度足以有效地用于消毒或灭菌表面、消毒医疗设备、消毒食品加工设备、以及适用于纺织物和衣物护理应用如漂白、脱色、除臭、消毒或卫生处理。

发明背景

过氧羧酸组合物已被报道是有效的抗微生物剂。针对不希望有的微生物生长使硬质表面、肉制品、活植物组织和医疗器材清洁、消毒和/或卫生处理的方法已得到描述(例如美国专利6,545,047；美国专利6,183,807；美国专利6,518,307；美国专利申请公开5,683,724；和美国专利2003/0026846)。也已报道过氧羧酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物中是有用的(美国专利3,974,082；美国专利5,296,161；和美国专利5,364,554)。

过氧羧酸可以通过羧酸和过氧化氢的化学反应进行制备(参见OrganicPeroxides，DanielSwern，ed.，Vol.1，第313-516页；WileyInterscience，NewYork，1971)。该反应通常由强无机酸例如浓硫酸催化。过氧化氢与羧酸的反应是平衡反应，并且过氧羧酸的产生通过使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸，或通过去除水而得到促进。

一些基于过氧羧酸的消毒剂或漂白剂包括过氧羧酸、过氧化氢和相应羧酸的平衡混合物。这些商业过氧羧酸清洁系统的一个缺点是溶液中的过氧羧酸随时间常常是不稳定的。克服稳定性稳定的一个方法是使用前组合多个反应组分以生成过氧羧酸，所述反应组分在较长时间内分别是稳定的。优选地，单个反应组分易于贮存、处理相对安全、并且当混合时能够快速产生有效浓度的过氧羧酸。

近来已经报道了CE-7家族碳水化合物酯酶具有过水解酶活性。这些“过水解(perhydrolysis)”酶已经显示当与过氧源组合时对从多种羧酸酯底物中产生过氧羧酸尤其有效(参见授予DiCosimo等人的WO2007/070609和美国专利申请公开2008/0176299、2008/176783和2009/0005590；每个专利均全文以引用方式并入本文)。CE-7家族碳水化合物酯酶的一些成员已显示具有过水解活性，一旦反应组分混合，其活性足以在1分钟内从醇、二醇和甘油的乙酰基酯中产生4000-5000ppm过乙酸，以及在5分钟至30分钟内产生至多9000ppm过乙酸(DiCosimo等人，美国专利申请公开2009/0005590)。

基于酶过水解活性商业化多种漂白和/或消毒产品的能力可取决于生产酶催化剂的成本。使用具有过水解活性的酶催化剂可减少商业产品中的酶催化剂的量并且可显著降低生产成本。同样地，需要鉴定具有改善过水解活性的酶催化剂。

此外，通常使用含水反应条件进行酶促过水解。具有过水解活性的酶催化剂通常表现出水解活性，形成羧酸，这可降低反应混合物的pH。同样地，希望利用高选择性地将酯过水解成过氧羧酸而不是将相同酯水解成羧酸的过水解酶；“P/H”比率(过水解率/水解率)是一种表征用于过水解的过水解酶的选择性的方法。

需解决的问题是提供其特征在于改善的过水解活性的酶催化剂。改善可为当从羧酸酯中生产过氧羧酸时，过水解酶对羧酸酯比活性的提高和/或过水解对水解的选择性的改善。

发明内容

当从羧酸酯中生产过氧羧酸时，通过提供具有改善的过水解酶比活性和/或改善的过水解对水解的选择性的酶催化剂，已经解决了所述问题。更具体地讲，提供了具有改善的过水解酶比活性和/或改善的选择性(即，过水解/水解活性比率的改善)的CE-7过水解酶变体。还提供了包含本发明变体的组合物和方法。

一个方面是编码具有过水解酶活性的多肽的分离的多核苷酸，将所述多肽结构上归类为糖酯酶家族7酶，并且(a)与SEQIDNO：5、SEQIDNO：10、SEQIDNO：15、SEQIDNO：20、或SEQIDNO：25具有至少95％的氨基酸序列同一性，前提条件是对SEQIDNO：5、SEQIDNO：10、SEQIDNO：15、SEQIDNO：20、或SEQIDNO：25的氨基酸残基277的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸，或者(b)与SEQIDNO：30具有至少95％的氨基酸序列同一性，前提条件是对SEQIDNO：30的氨基酸残基278的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，多肽包含SEQIDNO：5、10、15、20、25、或30。在一些实施方案中，核苷酸序列包含SEQIDNO：1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14、16、17、18、19、21、22、23、24、26、27、28、或29。

另一方面是具有过水解酶活性的分离的多肽，将所述多肽结构上归类为糖酯酶家族7酶，所述多肽与以下序列具有至少95％的氨基酸序列同一性：(a)SEQIDNO：5、SEQIDNO：10、SEQIDNO：15、SEQIDNO：20、或SEQIDNO：25，前提条件是对SEQIDNO：5、SEQIDNO：10、SEQIDNO：15、SEQIDNO：20、或SEQIDNO：25的氨基酸277的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸；或者(b)SEQIDNO：30，前提条件是对SEQIDNO：30的氨基酸278的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，多肽包含SEQIDNO：5、10、15、20、25、或30。

在另一方面，提供了从羧酸酯中生产过氧羧酸的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包括：

(1)选自下列的羧酸酯：

(i)一种或多种酯，所述酯具有以下结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

R₆为C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R₆为C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅为C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；并且其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

(ii)一种或多种具有以下结构的甘油酯

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

(iii)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n，或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；

(iv)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；以及

(v)(i)至(iv)的任何组合；

(2)过氧源；和

(3)具有如上所述的过水解酶活性多肽；和

(b)在合适的含水反应条件下混合所述反应组分，从而产生过氧羧酸。

在另一方面，提供了使用酶促产生的过氧羧酸组合物消毒或灭菌硬质表面或无生命物体的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包括：

(1)选自下列的羧酸酯：

(i)一种或多种酯，所述酯具有以下结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

(ii)一种或多种具有以下结构的甘油酯

(iii)一种或多种下式的酯：

(v)(i)至(iv)的任何组合；

(2)过氧源；和

(3)具有如上所述的过水解酶活性多肽；

(b)在合适的含水反应条件下混合所述反应组分，从而形成过氧羧酸产物；

(c)任选将所述过氧羧酸产物稀释；以及

(d)使所述硬质表面或无生命物体与在步骤(b)或步骤(c)中所产生的过氧羧酸接触，从而将所述表面或所述无生命物体消毒。

另一方面为过氧羧酸生成系统，包含：

(a)选自下列的底物：

(i)一种或多种酯，所述酯具有以下结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

(ii)一种或多种具有以下结构的甘油酯

(iii)一种或多种下式的酯：

(v)(i)至(iv)的任何组合；

(b)过氧源；和

(c)具有如上所述的过水解酶活性的多肽。

另一方面是使用酶促产生的过氧羧酸组合物处理衣物或纺织物以漂白、脱色、除臭、卫生处理或消毒的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包括：

(1)选自下列的羧酸酯：

(i)一种或多种酯，所述酯具有以下结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

R₆为C1至C7的直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R₆为C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅为C1至C6的直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；并且其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

(ii)一种或多种具有以下结构的甘油酯

(iii)一种或多种下式的酯：

(v)(i)至(iv)的任何组合。

(2)过氧源；和

(3)具有如上所述的过水解酶活性多肽；

(c)任选将所述过氧羧酸产物稀释；以及

(d)将所述衣物或纺织物与步骤(b)或步骤(c)中制备的过氧羧酸接触；

将其中所述衣物或纺织物脱色、除臭、消毒、漂白、或它们的组合。

在另一方面，提供了包含以下组分的制剂：(a)包含酶催化剂和羧酸酯的第一混合物，所述酶催化剂包含具有上述过水解活性的多肽，所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、三乙酰甘油酯、以及它们的混合物；所述第一混合物任选地包含选自无机或有机缓冲液、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合的其他组分；和(b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选地还包含过氧化氢稳定剂。

在另一方面，提供了包含以下组分的制剂：(a)包含酶催化剂和乙酰化糖的第一混合物，所述酶催化剂包含具有上述过水解活性的多肽，所述乙酰化糖选自乙酰化单糖、乙酰化二糖、乙酰化多糖、以及它们组合；所述第一混合物任选地还包含无机或有机缓冲液、腐蚀抑制剂和润湿剂；和(b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选地包含过氧化氢稳定剂。

在另一方面，提供了编码栖热袍菌(Thermotoga)乙酰木聚糖酯酶多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有过水解活性，其中所述多肽包含SEQIDNO：31的C-末端保守区域，前提条件是该多肽具有对SEQIDNO：31的氨基酸93的取代，所述取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

在另一方面，提供了分离的栖热袍菌(Thermotoga)乙酰木聚糖酯酶多肽，所述多肽具有过水解活性，并且包含SEQIDNO：31的C-末端保守区域，前提条件是该多肽具有对SEQIDNO：31的氨基酸93的取代，所述取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

附图简述

图1是来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)(SEQIDNO：32)和海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8(SEQIDNO：36)的乙酰木聚糖酯酶的CLUSTALW序列比较。

图2是来自六个栖热袍菌(Thermotoga)菌种的乙酰木聚糖酯酶之间的CLUSTALW序列比较。

生物序列简述

下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“RequirementsforPatentApplicationsContainingNuceotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules”))，并且符合世界知识产权组织(WorldIntellectualPropertyOrganization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EuropeanPatentConvention(EPC)和PatentCooperationTreaty(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQIDNO：1、2、3和4是来源于那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)乙酰木聚糖酯酶野生型序列的乙酰木聚糖酯酶变体编码区的核酸序列。

SEQIDNO：5表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQIDNO：6、7、8和9是来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶野生型序列的乙酰木聚糖酯酶变体编码区的核酸序列。

SEQIDNO：10表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQIDNO：11、12、13和14是来源于Thermotogalettingae乙酰木聚糖酯酶野生型序列的乙酰木聚糖酯酶变体编码区的核酸序列。

SEQIDNO：15表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于Thermotogalettingae的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQIDNO：16、17、18和19是来源于Thermotogapetrophila乙酰木聚糖酯酶野生型序列的乙酰木聚糖酯酶变体编码区的核酸序列。

SEQIDNO：20表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于Thermotogapetrophila的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQIDNO：21、22、23和24是来源于本文所述栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2的乙酰木聚糖酯酶野生型序列的乙酰木聚糖酯酶变体编码区的核酸序列，称为“RQ2(a)”。

SEQIDNO：25表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于本文所述栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2(称为“RQ2(a)”)的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQIDNO：26、27、28和29是来源于栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2的乙酰木聚糖酯酶第二变体编码区的核酸序列。

SEQIDNO：30表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，本文称为“RQ2(b)”，其中在位点278的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQIDNO：31表示栖热袍菌(Thermotoga)乙酰木聚糖酯酶的C-末端保守区域。

SEQIDNO：32是来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)(GENBANK登录号#AAB70869)的乙酰木聚糖酯酶。

SEQIDNO：33和34是如实施例1所述的引物。

SEQIDNO：35是如实施例1所述的经扩增和密码子优化的那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)核酸产物。

SEQIDNO：36是来自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)(GENBANK登录号#NP_227893.1)的乙酰木聚糖酯酶。

SEQIDNO：37是如实施例10所述的经扩增的海栖热袍菌(Thermotogamaritima)核酸产物。

SEQIDNO：38和39是如实施例10所述的引物。

SEQIDNO：40是那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶的密码子优化序列。

SEQIDNO：41是海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶的密码子优化序列。

SEQIDNO：42-193是表1中的正向和反向引物。

SEQIDNO：194-201是表6中的正向和反向引物。

SEQIDNO：202是Thermotogalettingae的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQIDNO：203是Thermotogapetrophila的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQIDNO：204是来自栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2(本文称为“RQ2(a)”)的第一乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQIDNO：205是来自栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2(本文称为“RQ2(b)”)的第二乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQIDNO：206和207是如实施例10所述的正向和反向引物。

SEQNO：208是由用于制备质粒pSW207的SEQIDNO：206和207扩增的核酸产物的核酸序列。

发明详述

本文所公开的是结构上归类为CE-7酶并具有过水解活性的变体酶。本文也公开了使用前述变体酶从羧酸酯中生产过氧羧酸的方法，以及在消毒和衣物护理应用中使用变体的若干个方法。此外，提供了包含通过本文所述方法生产的过氧羧酸的消毒剂和/或衣物护理制剂。

在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另有具体说明，应用下述定义。

如本文所用，涉及元素或组分实例(即出现的事物)的数目在本发明元素或组分前的冠词“一个”、“一种”及“所述”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”、“一种”及“所述”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。术语“包含”意指包括术语“基本上由…组成”和“由…组成”涵盖的实施方案。同样地，术语“基本上由…组成”意指包括术语“由…组成”涵盖的实施方案。

如本文所用，术语“约”指本发明的成分或反应物的数量变化，或用于意指数字数量的变化，它们可能发生在，例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。

当存在时，所有范围是包括端值在内的和可以组合的。例如，当提及范围“1至5”时，应将提及的范围解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。

如本文所用，术语“底物”、“适用底物”和“羧酸酯底物”可互换地具体指：

(a)一种或多种酯，所述酯具有以下结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；或

(b)一种或多种具有以下结构的甘油酯

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或

(c)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n，或(CH₂CH(CH₃)-O)_n，并且n是1至10；或

(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或

(e)(a)至(d)的任何组合。

所述羧酸酯底物的实例可包括甘油一乙酸酯；三乙酰甘油酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸盐或酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-葡萄烯糖；丙二醇二乙酸酯；乙二醇二醋酸酯；1，2-乙二醇的单酯或二酯；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2-丁二醇；1，3-丁二醇；2，3-丁二醇；1，4-丁二醇；1，2-戊二醇；2，5-戊二醇；1，6-戊二醇、1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇；或者它们的任何组合。

如本文所用，术语“过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸(peroxycarboxylicacid)、过氧酸(peroxyacid)、过羧酸(percarboxylicacid)和过氧性酸(peroxoicacid)同义。

如本文所用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并且与过氧乙酸、乙过氧酸(ethaneperoxoicacid)以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯和甘油单醋酸酯同义。

如本文所用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯；甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯；三乙酸甘油酯；甘油三醋酸酯，1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酸乙酯”与醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登记号141-78-6的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乳酸乙酯”与乳酸乙基酯以及CAS登记号97-64-3的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化多糖”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。实例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。

如本文所用，术语“烃基”和“烃基部分”指直链、支链或环状碳原子排列，碳原子通过碳-碳单键、双键或三键和/或醚键连接，并且相应的被氢原子取代。此类烃基可为脂族和/或芳族。烃基实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个优选的实施方案中，烃基部分是直链、支链或环状碳原子排列，碳原子通过碳-碳单键和/或醚键连接，并且相应的被氢原子取得。

如本文所用，术语1，2-乙二醇；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2-丁二醇；1，3-丁二醇；2，3-丁二醇；1，4-丁二醇；1，2-戊二醇；2，5-戊二醇；1，6-戊二醇；1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇；以及它们的混合物的“单酯”和“二酯”，指包含式RC(O)O的至少一个酯基的所述化合物，其中R是C1至C7直链烃基部分。在一个实施方案中，羧酸酯底物选自丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二醋酸酯(EDGA)、以及它们的混合物。

如本文所用，术语“丙二醇二乙酸酯(propyleneglycoldiacetate)”与1，2-丙二醇二乙酸酯(1，2-diacetoxypropane)、丙二醇二乙酸酯(propylenediacetate)、1，2-丙二醇二乙酸酯(1，2-propanedioldiacetate)、以及CAS登记号623-84-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙二醇二醋酸酯(ethyleneglycoldiacetate)”与1，2-乙二醇二醋酸酯(1，2-diacetoxyethane)、乙二醇二乙酸酯(ethylenediacetate)、乙二醇二乙酸酯(glycoldiacetate)、以及CAS登记号111-55-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于原位生产过酸的成分”、“合适的反应组分”和“合适的含水反应混合物”是指其中反应物和酶催化剂发生接触的材料和水。本文提供了合适的含水反应混合物的成分，并且本领域技术人员应当理解适于这种方法的成分变化范围。在一个实施方案中，合适的酶促反应混合物在反应组分组合后原位生产过氧羧酸。像这样，反应组分可以作为其中一种或多种反应组分保持分离直至使用的多成分系统提供。在另一个实施方案中，反应组分首先组合以形成过氧羧酸水溶液，其随后接触待消毒和/或漂白的表面。用于使多种活性成分组合的系统和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于个别反应组分的物理形式。例如，多重活性流体(液体-液体)系统一般使用多室分配瓶或二相系统(例如美国专利申请公开2005/0139608；美国专利5,398,846；美国专利5,624,634；美国专利6,391,840；E.P.专利0807156B1；美国专利申请公开2005/0008526；和PCT公开WO00/61713A1)，例如在其中所需漂白剂在使反应性流体混合后产生的某些漂白应用中发现的。用于产生过氧羧酸的其他形式的多成分系统可以包括但不限于，设计用于一种或多种固体成分或固体-液体成分组合的那些，例如粉剂(例如，例如美国专利5,116,575)、多层片(例如美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(例如美国专利6,995,125)和在水添加后反应的固体凝聚物(例如美国专利6,319,888)。在一个实施方案中，提供了含有两种单独组分的多组分制剂，从而当组合两种组分时生成过氧羧酸消毒剂。在另一个实施方案中，提供了制剂，所述制剂包含：

a)第一组分，所述第一组分包含：

i)如本文所公开的酶粉末；和

ii)羧酸酯底物，所述第一组分任选包含选自下列的另外的成分：无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合；和

b)第二组分，所述第二组分包含过氧源和水，所述第二组分任选地包含过氧化氢稳定剂。

在另一个实施方案中，所述第一混合物中的羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的组合。在另一个实施方案中，所述第一混合物中的羧酸酯是乙酰化糖。在另一个实施方案中，所述第一混合物中的酶催化剂是固体颗粒。在另一个实施方案中，所述第一混合物是固体片或粉末。

如本文所用，术语“过水解”定义为所选底物与过氧化物的形成过氧羧酸的反应。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以生成过氧羧酸。如本文所用，术语“化学过水解”包括其中底物(过氧羧酸前体)与过氧化氢源组合的过水解反应，其中过氧羧酸在不存在酶催化剂的情况下形成。

如本文所用，术语“过水解酶比活性”或“过水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)蛋白、干细胞重量或固定的催化剂重量的催化剂活性。

如本文所用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为，在指定温度每分钟产生1μmol过氧羧酸产物所需的过水解酶活性的量。

如本文所用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有过水解活性的酶的催化剂，并且可以是完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。酶催化剂还可以是化学修饰的(例如通过聚乙二醇化(pegylation)或者通过与交联试剂反应来修饰)。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将过水解酶固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如ImmobilizationofEnzymesandCells；GordonF.Bickerstaff，Editor；HumanaPress，Totowa，NJ，USA；1997。如本文所述，具有过水解活性的所有本发明酶在结构上都是酶的糖家族酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-activeenzymes：anintegrateddatabaseapproach”inRecentAdvancesinCarbohydrateBioengineering，H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat和B.Svenssoneds.，(1999)TheRoyalSocietyofChemistry，Cambridge，第3-12页)。CE-7家族酶已经显示当与过氧源组合时对从多种羧酸酯底物中产生过氧羧酸尤其有效(参见授予DiCosimo等人的PCT公开WO2007/070609和美国专利申请公开2008/0176299、2008/176783和2009/0005590；每个专利均全文以引用方式并入本文)。CE-7酶家族包括先锋霉素C脱乙酰酶(CAH；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7酶家族的成员共享保守特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。

如本文所用，术语“特征基序”、“CE-7特征基序”和“诊断基序”指具有给定活性的酶家族中共有的保守结构。可使用特征基序定义和/或鉴定对给定底物家族具有相似酶活性的结构相关的酶家族。特征基序可为单个邻接氨基酸序列或不邻接的保守基序的集合，它们一起形成特征基序。保守基序通常用氨基酸序列表示。具有过水解活性的本发明变体酶(“过水解酶”)属于CE-7碳水化合物酯酶家族(即，所有本发明变体保留CE-7特征基序)。

如本文所用，“结构上归类为CE-7酶”、“结构上归类为糖酯酶家族7酶”、“结构上归类为CE-7碳水化合物酯酶”和“CE-7过水解酶”将用于指具有过水解活性的酶，该酶基于存在的CE-7特征基序结构上归类为CE-7碳水化合物酯酶(Vincent等人，同上)。CE-7酯酶的“特征基序”包含三个保守基序(相对于参考序列SEQIDNO：32进行残基位点编号)：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly186-Xaa187-Ser188-Gln189-Gly190；和

c)His303-Glu304。

在氨基酸残基位点187的Xaa通常是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的两个用粗体表示。在一个实施方案中，在氨基酸残基位点187的Xaa选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族中的保守基序的进一步分析指示存在附加的保守基序(在SEQIDNO：32的氨基酸位点272-274的LXD)，这可用于进一步确定CE-7糖酯酶家族成员。在另一个实施方案中，上文定义的特征基序包括第四保守基序，称为：

Leu272-Xaa273-Asp274。

在氨基酸残基位点273的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸。第四基序包括属于催化三联体(Ser188-Asp274-His303)的天冬氨酸残基(粗体)。

保守基序存在于来自若干个野生型栖热袍菌(Thermotoga)菌种的CE-7过水解酶。

表A：存在于CE-7酶中的保守基序具有过水解酶活性。

^a＝保守基序，该基序由Vincent等人定义，同上，用于定义特征基序。

^b＝附加基序可用于进一步定义特征基序，该基序由Vincent等人定义，同上。

如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰基水解酶”是指催化先锋霉素如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，(1995)Appl.Env.Microbiol.61(6)：2224-2229)。

如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰木聚糖以及其他乙酰化糖的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.72；AXE)。

如本文所用，术语“那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性(GENBANKAAB70869)的那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)菌株。具有过水解酶活性的酶来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)，其氨基酸序列称为SEQIDNO：32。

如本文所用，术语“海栖热袍菌(Thermotogamaritima)”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKNP_227893.1)。具有过水解酶活性的酶来自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)，其氨基酸序列称为SEQIDNO：36。

如本文所用，术语“Thermotogalettingae”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKCP000812)。具有过水解酶活性的酶来自Thermotogalettingae，其推导氨基酸序列称为SEQIDNO：202。

如本文所用，术语“Thermotogapetrophila”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKCP000702)。具有过水解酶活性的酶来自Thermotogalettingae，其推导氨基酸序列称为SEQIDNO：203。

如本文所用，术语“栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKCP000969)。两个不同的乙酰木聚糖酯酶已经从栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2中鉴定出来，并且本文称为“RQ2(a)”(推导的氨基酸序列称为SEQIDNO：204)和“RQ2(b)”(推导的氨基酸序列称为SEQIDNO：205)。

如本文所用的，“分离的核酸片段”和“分离的核酸分子”将可互换使用，并且指为单链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。在本文中使用下列缩写来表示具体氨基酸：

如本文所用，“基本上类似于”指核酸分子其中一个或多个核苷酸碱基上的改变导致增加、取代、或缺失一个或多个氨基酸，但是不影响DNA序列编码蛋白的功能特性(即，过水解活性)。如本文所用，“基本上类似于”也指酶的氨基酸序列与本文报道的序列具有至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％的同一性，其中所得酶保留本功能特性(即，过水解活性)。“基本上类似于”也可指具有过水解活性的酶，该酶由在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交的核酸分子编码。因此应当理解本发明涵盖的序列不限于特定的示例性序列。

例如，在本领域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸(但不影响所编码蛋白的功能特性)的基因改变是常见的。为了本发明目的，将置换定义为如下五组中的一组内的互换：

1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和

5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。

因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变蛋白的活性。

所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。此外，技术人员认识到本发明涵盖基本上类似的序列。在一个实施方案中，基本上类似的序列通过它们在严格条件下(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃，并且用2XSSC，0.1％SDS后接0.1XSSC，0.1％SDS在65℃洗涤)与本文例示序列杂交的能力来定义。

如本文所用，当第一个分子的单链能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其他分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于Sambrook，J.和Russell，D.，T.MolecularCloning：A LaboratoryManual，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor(2001)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的分子(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的分子(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤通常决定严格条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6XSSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2XSSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2XSSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组较优选的条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2XSSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的严格杂交条件是0.1XSSC，0.1％SDS，65℃与本文例示的序列杂交，并用2XSSC，0.1％SDS洗涤，随后用0.1XSSC，0.1％SDS，65℃进行最终洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(Sambrook和Russell，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度是至少约15个核苷酸，更优选至少约20个核苷酸，甚至更优选至少30个核苷酸，甚至更优选至少300个核苷酸，最优选至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。

如本文所用，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类线性序列的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于下述的那些方法：ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M.，Ed.)OxfordUniversityPress，NY(1988)；Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects(Smith，D.W.，Ed.)AcademicPress，NY(1993)；ComputerAnalysisofSequenceData， PartI(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，Eds.)HumanaPress，NJ(1994)；SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G.，ed.)AcademicPress(1987)；以及SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.)StocktonPress，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算软件包的Megalign程序(DNASTARInc.，Madison，WI)、VectorNTIv.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSSOpenSoftwareSuite(EMBL-EBI；Rice等人，TrendsinGenetics16，(6)：276-277(2000))。序列多重比对可使用Clustal比对方法进行(即CLUSTALW；例如1.83版)(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，NucleicAcidsRes.22：4673-4680(1994)；以及Chenna等人，NucleicAcidsRes31(13)：3497-500(2003))，它们得自EuropeanMolecularBiologyLaboratoryviatheEuropeanBioinformaticsInstitute)，使用默认参数。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAPExistencepenalty＝15，空位延伸＝0.2，matrix＝Gonnet(例如Gonnet250)，proteinENDGAP＝-1，ProteinGAPDIST＝4，KTUPLE＝1。在一个实施方案中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优选慢速比对。作为另外一种选择，也可将使用CLUSTALW方法的参数(1.83版)修改成KTUPLE＝1，空位罚分＝10，空位延伸＝1，matrix＝BLOSUM(例如BLOSUM64)，窗口＝5，TOPDIAGONALSSAVED＝5。

在本发明的一个方面，合适的分离核酸分子(本发明的分离的多核苷酸)编码多肽，其氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列具有至少约50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。本发明的合适核酸分子不仅具有上述同源性，而且通常编码具有约300个至约340个氨基酸，更优选约310个至约330个氨基酸，最优选约325个氨基酸的多肽。

如本文所用，“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本发明涉及编码氨基酸序列全部或其主要部分的任何核酸分子，所述氨基酸序列编码本发明的微生物多肽。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

如本文所用，术语“经密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。

如本文所用，“合成基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。连接并退火这些构件以形成基因片段，然后将它们进行酶促装配以构建完整基因。当涉及DNA序列时，“化学合成的”意指体外装配组分核苷酸。可以采用完善建立的方法来完成DNA的手工化学合成，或者可使用许多种可商业获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。

如本文所用，“基因”指表达特定蛋白的核酸分子，包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此嵌合基因可包含得自不同来源的调节序列和编码序列，或者得自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调节序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物内。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

如本文所用，“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

如本文所用，“3′非编码序列”指位于编码序列下游并且包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列(通常限于真核生物)和其他序列编码调节信号的DNA序列。聚腺苷酸化信号通常特征在于影响将多腺苷酸片(通常限于真核生物)加到mRNA前体的3′末端。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上的核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。

如本文所用的，术语“表达”指源于本发明的核酸分子的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，“转化”指将核酸分子转移至宿主生物体的基因组内，导致在基因上稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

如本文所用的，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可为得自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经被接合或重组到特定构建体中，该构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3′非翻译序列一起导入细胞。“转化盒”指包含外源基因的特定载体，并且除了外源基因外，还具有有利于转化特定宿主细胞的其他元件。“表达盒”指包含外源基因并除该外源基因外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。

如本文所用，术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序软件包(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.ParkSt.Madison，WI53715USA)、CLUSTALW(例如1.83版；Thompson等人，NucleicAcidsResearch，22(22)：4673-4680(1994)，以及包含Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，MeetingDate1992，111-20.作者：Suhai，Sandor.Publisher：Plenum，NewYork，NY)、VectorNTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencherv.4.05。在本专利申请的背景下，应当理解除非另外指明，其中序列分析软件用于分析，分析结果将基于所用程序的“预设值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的、由软件制造商设置的任何值或参数集。

如本文所用，术语“生物污染物”指一种或多种有害的和/或病原生物体，包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒、以及它们的混合物。本文公开的方法生产有效浓度的至少一种过羧酸，用于降低和/或消除存在的活体生物污染物。在一个优选的实施方案中，生物污染物是活体病原微生物。

如本文所用，术语“消毒”指破坏或防止生物污染物生长的方法。如本文所用，术语“消毒剂”指通过破坏/中和、或抑制生物污染物生长来进行消毒的制剂。消毒剂通常用于处理无生命的物体或表面。如本文所用，术语“消毒”指消毒的行为或过程。如本文所用，术语“防腐败剂”指抑制传播疾病的微生物生长的化学试剂。在一个方面，生物污染物是病原微生物。

如本文所用，术语“卫生”指或涉及通常通过移除、阻止或控制可能危害健康的剂来恢复或保持健康。如本文所用，术语“卫生处理”指采取卫生措施保持卫生。如本文所用，术语“杀菌消毒剂”指消毒剂。如本文所用，术语“卫生处理”指卫生处理的行为或过程。

如本文所用，术语“杀病毒剂”指抑制或破坏病毒的制剂，并且与“病毒杀灭剂”同义。将表现出抑制或破坏病毒能力的制剂描述为具有“杀病毒”活性。过酸可具有杀病毒活性。可适用于本发明使用的本领域已知的典型备选杀病毒剂包括例如醇、醚、氯仿、甲醛、苯酚、β丙内酯、碘、氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和洗涤剂。

如本文所用，术语“生物杀灭剂”指通常广谱的化学试剂，它灭活或破坏微生物。将表现出灭活或破坏微生物能力的化学试剂描述为具有“生物杀灭”活性。过酸可具有生物杀灭活性。可适用于本发明使用的本领域已知的典型备选生物杀灭剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸盐、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯化酚醛树脂、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。

如本文所用，短语“最低生物杀灭浓度”指生物杀灭剂在特定接触时间内的最低浓度，其将产生期望的杀灭效果，不可逆的减少目标微生物的活体数量。可通过处理后的活体微生物的log₁₀减少测量效果。在一个方面，处理后活体微生物的目标减少为至少3-log的减少，更优选至少4-log的减少，最优选至少5-log的减少。在另一方面，最低生物杀灭浓度为减少活体微生物细胞至少6-log。

如本文所用，术语“过氧源”和“过氧来源”指当在水溶液中时能够提供浓度为1mM或更高浓度过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如脲-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。如本文所述，当与反应组分组合时，在含水反应制剂中通过过氧化氢化合物提供的过氧化氢浓度为初始至少1mM或更高浓度。在一个实施方案中，在含水反应制剂中的过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施方案中，在含水反应制剂中的过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施方案中，在含水反应制剂中的过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施方案中，在含水反应制剂中的过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施方案中，在含水反应制剂中的过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应制剂中过氧化氢对酶底物如甘油三酯的摩尔比(H₂O₂∶底物)可为约0.002至20，优选地约0.1至10，最优选地约0.5至5。

具有过水解活性并且结构上归类为CE-7酶的多肽变体

本发明的一个目标是提供相对于其来源的野生型酶具有改善活性的过水解酶，该酶用于生产有效浓度的过羧酸以进行消毒(例如灭活细菌、病毒和孢子)。本发明的第二目标是提供在具有活性的整个pH范围内相对于野生型酶具有改善活性的过水解酶，其中比活性的改善导致生产有效浓度过氧羧酸所需的酶量降低(以及伴随的制剂中酶成本的降低)。本发明的第三目标是提供相对野生型酶具有改善过水解/水解比率(P/H比率)的过水解酶。

已经公布了海栖热袍菌(T.maritima)CE-7乙酰木聚糖酯酶的X射线晶体结构(参见ResearchCollaboratoryforStructuralBioinformatics(RCSB)蛋白数据库)。那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)CE-7过水解酶的氨基酸序列与海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶具有91％的同一性，使得能够描绘海栖热袍菌(T.maritima)X射线晶体结构。除了典型的催化三联体(H303、S188和D274)外，还有若干个残基也位于那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)的活性位点内，并且选择对这些位点的取代以确定是否所得变体酶的活性位点pKa、底物总K_cat和K_m、以及过水解/水解比率(P/H比率)相对于野生型酶具有有益的改变。基于观察到的过水解活性，制备了一系列变体CE-7酶，它们相对于野生型CE-7酶具有提高的过乙酸生产活性。

改善过水解酶活性的方法涉及构建具有编码结构上归类为CE-7酶的多肽的核苷酸序列的表达载体、诱变酶编码序列、以及最终分离具有提高的过乙酸生产活性的变体。该方法通常涉及制备和分离在存在乙酸酯、三乙酰甘油酯和过氧化氢的情况下提高过乙酸生产活性的变体酶。随后的几轮诱变，如果需要，使得酶编码序列发生进化。

能够使用编码结构上归类为CE-7酶的多肽的任何野生型(或基本上类似的)核苷酸序列作为诱变原料制备突变体酶文库。突变序列的方法是在文献中被确认的。例如，体外诱变和选择、定点诱变、易错PCR(Melnikov等人，NucleicAcidsRes.27(4)：1056-62(1999))、“基因改组(geneshuffling)”法或其它手段可用于获得酶序列的突变。这能够产生相对于野生型酶在例如酸性pH下、在具有活性的整个pH范围内具有改善活性的多肽和/或相对于野生型酶具有改善的P/H比率的多肽，该多肽用于生产过羧酸进行消毒。

如果需要，可以通过常规定点诱变、所得突变多肽表达及其活性测定来测定酶对酶活性重要的区域。突变可包括缺失、插入和点突变、或它们的组合。

如下文实施例所讨论的那样，已经鉴定了在栖热袍菌(Thermotoga)乙酰木聚糖酯酶中的关键半胱氨酸残基，所述残基当变成丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、或苏氨酸时，与未发生所述特定氨基酸取代的野生型乙酰木聚糖酯酶相比意外地提高了变体多肽的过水解活性。因为栖热袍菌(Thermotoga)属的乙酰木聚糖酯酶之间的高同源性，期望在任何栖热袍菌(Thermotoga)属中用丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、或苏氨酸取代该半胱氨酸将产生与工作实例中所述的结果相似的结果。因此，在一些实施方案中，变体多肽和编码此类多肽的多核苷酸来源于具有过水解活性的野生型栖热袍菌(Thermotoga)乙酰木聚糖酯酶，其中栖热袍菌(Thermotoga)乙酰木聚糖酯酶包含如SEQIDNO：31所示的C末端区域，变体多肽在SEQIDNO：31氨基酸位点93上的半胱氨酸残基被丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、或苏氨酸残基取代。如SEQIDNO：31所示的C末端区域在栖热袍菌(Thermotoga)乙酰木聚糖酯酶中是高度保守的(参见图2，在六个乙酰木聚糖酯酶间的比对)，因此能够用作发生本文所公开的关键半胱氨酸残基突变的乙酰木聚糖酯酶的标识。

甚至即使将SEQIDNO：31中的若干个残基注明为“任何”残基，存在在许多这些残基中出现的典型氨基酸。例如，在SEQIDNO：31中标记为Xaa的位点上的典型氨基酸是位点2上的甘氨酸，位点13上的丝氨酸，位点18上的赖氨酸，位点20上的赖氨酸，位点23上的亮氨酸，位点24上的半胱氨酸，位点25上的天冬氨酸，位点32上的苯丙氨酸，位点33上的精氨酸，位点38上的亮氨酸，位点39上的缬氨酸或苏氨酸，位点41上的苏氨酸，位点42上的组氨酸，位点45上的丙氨酸，位点48上的苏氨酸，位点49上的天冬酰胺，位点50上的苯丙氨酸或酪氨酸，位点51上的亮氨酸，位点53上的苏氨酸，位点55上的精氨酸，位点58上的谷氨酸，位点60上的异亮氨酸，位点75上的丙氨酸或缬氨酸，位点79上的异亮氨酸，位点86上的甘氨酸，位点90上的精氨酸，位点91上的异亮氨酸，位点104上的组氨酸或酪氨酸，位点108上的脯氨酸，位点110上的谷氨酸，位点112上的精氨酸，位点113上的异亮氨酸，位点116上的酪氨酸，位点118上的精氨酸，位点123上的甘氨酸，位点126上的谷氨酰胺，位点127上的丙氨酸，位点128上的异亮氨酸，位点130上的谷氨酰胺，位点131上的缬氨酸或亮氨酸，位点132上的赖氨酸，位点134上的亮氨酸，以及位点136上的精氨酸或赖氨酸。

允许在栖热袍菌(Thermotoga)乙酰木聚糖酯酶C末端区域中增加和/或去除一个或多个氨基酸，只要此类增加和/或去除不影响酶的功能特性。

在更具体的实施方案中，本文公开的变体多肽基于例如Clustal比对方法在与以下序列进行比较时，具有至少95％的氨基酸序列同一性(或者在不同实施方案中，96％、97％、98％、或99％的序列同一性)，所述比对使用成对比对默认参数KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5和DIAGONALSSAVED＝5，

(a)SEQIDNO：5、10、15、20、或25，前提条件是对SEQIDNO：5、10、15、20、或25的氨基酸277的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸；或者

(b)SEQIDNO：30，前提条件是对SEQIDNO：30的氨基酸278的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

甚至更具体地讲，具有改善的过水解活性(过水解活性和/或P/H比率的提高)的变体多肽包含SEQIDNO：5、10、15、20、25、或30。在另一个实施方案中，变体多肽包含选自SEQIDNO：5、10、15、20、25和30的氨基酸序列，其中在每个相应序列中的Xaa选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。在另一个实施方案中、变体多肽包含选自SEQIDNO：5和10的氨基酸序列，其中在每个相应序列中的Xaa选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。

蛋白工程

本发明的CE-7酯酶变体通过诱变产生。预期本发明的核苷酸可用于制备具有增强或改变活性的基因产物。用于突变天然基因序列以制备具有改变或增强活性的基因产物的多种方法是已知的，包括但不限于1)随机诱变，2)结构域交换(使用锌指结构域或限制性酶，3)易错PCR(Melnikov等人，NucleicAcidsResearch27(4)：1056-1062(1999))；4)定点诱变(Coombs等人，Proteins(1998)，第259-311页，1plate.Angeletti，RuthHogue，Ed.，Academic：SanDiego，Calif.)；和5)“基因改组”(美国专利5,605,793；5,811,238；5,830,721；和5,837,458，它们以引用方式并入本文)。

可使用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA片段，同时通过核苷酸的错误掺入，产生多个突变。这可通过改变PCR条件来完成，例如改变反应中的dNTP比率或增加不同量的氯化锰(Fromant等人，AnalBiochem，224(1)：347-53(1995)；Lin-Goerke等人，Biotechniques，23(3)：409-12(1997))。然后能够克隆合并的突变DNA片段以生成突变质粒的文库，随后能通过在宿主如大肠杆菌中表达对其进行筛选。

基因改组方法尤其具有吸引力，因为它实施方便、诱变率高并且易于筛选。基因改组方法涉及在存在附加组的DNA区域(其与受关注的基因具有相似性和/或差异)的情况下，将受关注的基因用限制性内切核酸酶裂解成特定大小的片段。然后将该合并片段变性并再退火以制备突变基因。然后筛选具有改变活性的突变基因。

可通过这一方法突变并筛选本发明的所述序列，其具有改变的或增强的活性。该序列应为双链的，并且长度可能介于50bp至10kB之间。可使用本领域熟知的限制性核酸内切酶将该序列随机消化成约10bp至1000bp的片段(Sambrook，J.和Russell，同上)。除了本发明的微生物序列之外，还可加上与全部或部分所述序列杂交的片段组。类似地，也可加上不与本发明序列杂交的一组片段。通常加入的这些附加片段组按重量计比总核酸多约10至20倍。一般来讲，如果按照这一方法，混合物中的不同特异性核酸片段的数量将为约100至约1000。变性混合组的随机核酸片段以形成单链核酸片段，然后再退火。仅仅那些与其他单链核酸片段具有同源性区域的单链核酸片段将进行再退火。可通过加热变性随机核酸片段。本领域的技术人员能够确定完全变性双链核酸所必需的条件。优选地，温度为约80℃至100℃。核酸片段可通过冷却进行退火。优选地，温度为约20℃至75℃。可通过加入聚乙二醇(“PEG”)或盐加速复性。合适的盐浓度可为0mM至200mM。然后在存在核酸聚合酶和dNTP(即，dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的情况下孵育退火的核酸片段。核酸聚合酶可为Klenow片段、Taq聚合酶或本领域已知的任何其他DNA聚合酶。可在退火前、进行退火时、或退火后将聚合酶加到随机核酸片段中。在存在聚合酶的情况下重复变性、复性和孵育的循环期望的次数。该循环优选地重复约2至50次，更优选地该循环重复10至40次。所得核酸是较大的双链多核苷酸，大小为约50bp至约100kB，并且可通过链克隆和表达规程进行筛选用于表达和活性改变(Sambrook，J.和Russell，同上)。

此外，能够通过基因改组融合功能结构域装配杂交蛋白(例如Nixon等人，PNAS，94：1069-1073(1997))。本发明的基因的功能结构域可与其他基因的功能结构域组合以制备具有期望催化功能的新酶。可使用PCR重叠延伸方法构建杂交酶，并且使用本领域技术人员熟知的技术将其克隆到多个表达载体中。

从羧酸酯和过氧化氢中酶催化制备过氧羧酸的合适反应条件

在本发明的一个方面，提供了在存在至少一种具有过水解活性的本发明酶催化剂的情况下，通过反应羧酸酯和过氧源制备包含过氧羧酸的含水制剂的方法，所述过氧源包括但不限于过氧化氢、过硼酸钠和过碳酸钠。在一个实施方案中，本发明的酶催化剂包含至少一种具有过水解活性的本发明酶变体，其中所述酶结构上归类为CE-7糖酯酶家族的成员。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂是先锋霉素C脱乙酰酶。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂是乙酰木聚糖酯酶。

在一个实施方案中，过水解酶催化剂包含至少一种本发明的CE-7变体多肽，该多肽具有本文所公开的过水解活性。

合适的羧酸酯底物可包括下式所示的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R6C(O)O的酯基

R₆＝C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R6＝C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅＝C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中的碳原子数目；并且

其中所述酯具有在25℃下在水中至少5ppm的溶解度。

在其它实施方案中，合适的底物也可包括下式的酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂-O)_nH或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n＝1至10。

在其它实施方案中，合适的羧酸酯底物可包括下式的甘油酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)。

在其他实施方案中，R₆为任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链的烃基部分，任选地包含一个或多个醚键。在其他优选实施方案中，R₆为任选地被羟基取代的C2至C7直链的烃基部分，和/或任选地包含一个或多个醚键。

在其它实施方案中，合适的羧酸酯底物也可包括选自乙酰化单糖、二糖和多糖的乙酰化糖。在附加实施方案中，乙酰化糖包括乙酰化单糖、二糖和多糖。在其他实施方案中，乙酰化糖类选自乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)；乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；和三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖；以及乙酰化纤维素。在另一个实施方案中，乙酰化糖选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸盐或酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖；以及乙酰化纤维素。同样地，乙酰化碳水化合物可为使用本发明的方法和体系生成过羧酸的合适底物(即，在存在过氧源的情况下)。

在附加实施方案中，羧酸酯底物的实例选自甘油一乙酸酯；三乙酰甘油酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸盐或酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-葡萄烯糖；丙二醇二乙酸酯；乙二醇二醋酸酯；1，2-乙二醇5的单酯或二酯；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2-丁二醇；1，3-丁二醇；2，3-丁二醇；1，4-丁二醇；1，2-戊二醇；2，5-戊二醇；1，6-戊二醇；1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇；以及它们的混合物。在本发明方法和体系的优选实施方案中，底物包含；三乙酰甘油酯。

羧酸酯在反应制剂中存在的浓度当酶催化过水解时足以产生期望浓度的过氧羧酸。羧酸酯不需要在反应制剂中完全溶解，但是其溶解度足以通过过水解酶催化剂将酯转化成相应的过氧羧酸。羧酸酯可在反应制剂中存在浓度为0.0005wt％至40wt％的反应制剂，优选地浓度为0.1wt％至20wt％的反应制剂，更优选地浓度为0.5wt％至10wt％的反应制剂。

过氧源可包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如脲-过氧化氢加合物(过氧化脲))过硼酸盐和过碳酸盐。反应制剂中的过氧化合物的浓度可介于0.0033wt％至约50wt％，优选地0.033wt％至约40wt％，更优选地0.33wt％至约30wt％的范围内。

已经报道多种过水解酶催化剂(全细胞、透化的全细胞、以及部分纯化的全细胞提取物)具有过氧化氢酶活性(EC1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢转化成氧和水。在一个方面，过水解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一方面，将过氧化氢酶抑制剂加到反应制剂中。过氧化氢酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠和羟胺硫酸盐。本领域的技术人员能够按需调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。在一个实施方案中，过氧化氢酶抑制剂的浓度通常在约0.1mM至约1M的范围内；优选地在约1mM至约50mM的范围内；更优选地在约1mM至约20mM的范围内。在一个方面，叠氮化钠浓度通常在约20mM至约60mM的范围内，而羟胺硫酸盐的浓度通常在约0.5mM至约30mM的范围内，优选地约10mM。

在另一个实施方案中，酶催化剂缺乏显著的过氧化氢酶活性或者经工程化以降低或消除过氧化氢酶活性。宿主细胞中的过氧化氢酶活性能够通过使用熟知的技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、定向诱变和随机诱变，破坏负责过氧化氢酶活性的基因而被下调或消除。在一个优选的实施方案中，编码内源过氧化氢酶活性的基因被下调或破坏(即，敲除)。如本文所用，“被破坏的”基因是其中不再存在由改性基因编码的蛋白的活性和/或功能的基因。破坏基因的方法是本领域熟知的，并且可包括但不限于基因插入、缺失、或突变，只要对应蛋白的活性和/或功能不再存在。在另一个优选实施方案中，生产宿主是大肠杆菌生产宿主，它包含破坏的过氧化氢酶基因，该基因选自katG和katE。在另一个实施方案中，生产宿主是大肠杆菌菌株，它包含下调和/或破坏的katG和katE过氧化氢酶基因。本文所述的包含katG和katE双敲除的大肠杆菌菌株是大肠杆菌菌株KLP18(参见公布的美国专利公开申请2008/0176299)。

含水反应制剂中的催化剂浓度取决于催化剂的催化比活性，并且经选择以获取期望的反应速率。过水解反应中的催化剂的重量通常在每mL总反应体积0.0001mg至10mg，优选地每mL总反应体积0.001mg至2.0mg的范围内。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将催化剂固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如Immobilization ofEnzymesandCells；GordonF.Bickerstaff，Editor；HumanaPress，Totowa，NJ，USA；1997。使用固载化催化剂允许在随后的反应中回收并再利用该催化剂。酶催化剂可为以下形式：全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的或纯化的酶、以及它们的混合物。

在一个方面，通过组合化学过水解和酶促过水解羧酸酯生成的过氧羧酸浓度足以提供有效浓度的过氧羧酸用于在期望pH消毒、漂白、卫生处理、除臭或脱色。在另一方面，本发明的方法提供酶和酶底物的组合以生产期望有效浓度的过氧羧酸，其中在不加入酶的情况下，产生的过氧羧酸浓度显著更低。虽然在一些情况下通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应可基本上化学过水解酶底物，但生成的过氧羧酸浓度可能不足以在期望应用中提供有效的过氧羧酸浓度，并且加入合适的过水解酶催化剂到反应制剂中显著提高总过氧羧酸浓度。

通过过水解至少一种羧酸酯生成的过氧羧酸(例如过乙酸)浓度在开始过水解反应10分钟内，优选地在5分钟内，最优选地在1分钟内为至少约20ppm，优选地至少100ppm，更优选地至少约200ppm过氧羧酸，更优选地至少300ppm，更优选地至少500ppm，更优选地至少700ppm，更优选地至少约1000ppm过氧羧酸，更优选地至少2000ppm，甚至更优选地至少3000ppm，最优选地至少4000ppm过氧羧酸(即，测量到的从组合反应组分到形成反应制剂的时间)。包含过氧羧酸的产物制剂可任选地用水或主要包含水的溶液稀释以制备具有期望的较低浓度过氧羧酸的制剂。在一个方面，生产期望浓度过氧羧酸的反应时间不大于约两小时，优选地不大于约30分钟，更优选地不大于约10分钟，最优选地在约5分钟或更短时间内。被一定浓度的生物污染物污染过的硬质表面或无生命物体与根据本文所述方法形成的过氧羧酸接触。在一个实施方案中，硬质表面或无生命物体与根据所述方法在组合所述反应组分约5分钟至约168小时内，或者在约5分钟至约48小时内，或者在组合所述反应组分约5分钟至2小时内，或者在本文任何此类时间间隔内形成的过酸接触。

在另一方面，根据本文所述方法形成的过氧羧酸用于衣物洗涤护理应用，其中过氧羧酸与纺织物接触以提供有益效果，如消毒、漂白、脱色、除臭和/或它们的组合。过氧羧酸可用于多种衣物洗涤护理产品，包括但不限于纺织物预洗涤处理剂、衣物洗涤剂、污渍移除剂、漂白组合物、除臭组合物、以及漂洗剂。在一个实施方案中，本发明制备过氧羧酸用于目标表面的方法在原位进行。

在衣物洗涤护理应用的情况下，术语“接触衣物或纺织物”指将衣物或纺织物暴露于本文所公开的制剂。为此，有多种制剂形式可用于处理衣物或纺织物，包括但不限于液体、固体、凝胶、糊料、巴、片剂、喷剂、泡沫、粉末、或颗粒，并且能够经由手动给料、单位给料、从底物给料、从衣物洗涤或干燥机中喷洒并自动给料进行递送。颗粒状组合物也可为压实的形式；液体组合物也可为浓缩形式。

当本文所公开的制剂用于洗衣机时，所述制剂还可包含对衣物洗涤剂来说典型的组分。例如，典型的组分包括但不限于表面活性剂、漂白剂、漂白活化剂、附加酶、抑泡剂、分散剂、酸橙-皂分散剂、垢悬浮和抗再沉淀剂、软化剂、腐蚀抑制剂、玷污抑制剂、杀菌剂、pH调节剂、非助洗剂碱度来源、螯合剂、有机和/或无机填料、溶剂、水溶助长剂、光学增白剂、染料和香料。

本文所公开的制剂也可用作固体或液体形式的洗涤剂助剂产品。此类助剂产品旨在补充或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且在清洁过程的任何阶段加入。

与本发明用于衣物洗涤护理的体系和方法有关，其中生成过酸用于一种或多种漂白、脱色和除臭，通过过水解至少一种羧酸酯生成的过酸浓度(例如过乙酸)可为至少约2ppm，优选地至少20ppm，优选地至少100ppm，更优选地至少约200ppm过酸。与本发明用于衣物洗涤护理的体系和方法有关，其中生成过酸用于消毒或卫生处理，通过过水解至少一种羧酸酯生成的过酸浓度(例如peraceticacid)在开始过水解反应的10分钟内、优选地在5分钟内、最优选地在1分钟内可为至少约2ppm，更优选地至少20ppm，更优选地至少200ppm，更优选地至少500ppm，更优选地至少700ppm，更优选地至少约1000ppm过酸，最优选地至少2000ppm过酸。包含过酸的产物制剂可任选地用水或主要由水构成的溶液稀释以制备具有期望较低浓度过酸的制剂。在本发明方法和体现的一个方面，生产期望浓度过酸的反应时间不大于约两小时，优选地不大于约30分钟，更优选地不大于约10分钟，甚至更优选地不大于约5分钟，最优选地在约1分钟或更短时间内。

选择反应温度以控制反应速率和酶催化活性的稳定性。反应温度可在正好高于反应制剂凝固点(大约0℃)至约95℃的范围内，优选地在约5℃至约55℃的范围内。

包含过氧羧酸的最终反应制剂的pH范围可为约2至约9，优选地约3至约8，更优选地约5至约8，甚至更优选地约6至约8，甚至更优选地约6.5至约7.5。在另一个实施方案中，反应制剂的pH可为酸性(pH＜7)。反应pH以及最终反应制剂的pH可任选地通过加入合适缓冲液进行控制，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、甲基膦酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、或柠檬酸盐、以及它们的组合。当使用时，缓冲液浓度通常为0.1mM至1.0M，优选地1mM至300mM，最优选地10mM至100mM。

在另一方面，酶过水解反应制剂可包含有机溶剂，其作为分散剂提高反应制剂中的羧酸酯的溶解速率。此类溶剂包括但不限于丙二醇甲醚、丙酮、环己酮、二甘醇丁醚、三丙二醇甲醚、二甘醇甲醚、丙二醇丁醚、双丙二醇甲醚、环己醇、苄醇、异丙醇、乙醇、丙二醇、以及它们的混合物。

在另一方面，酶促过水解产物可包含提供期望功能的附加组分。这些附加组分包括但不限于缓冲液、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、腐蚀抑制剂(例如苯并三唑)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(例如金属离子螯合剂)。许多附加组分是洗涤剂工业中熟知的(参见例如美国专利公开5,932,532；以引用方式并入本文)。乳化剂的实例包括但不限于聚乙烯基醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于LAPONITERD、玉米淀粉、PVP、CARBOWAX、CARBOPOL、CABOSIL、聚山梨酸酯20、PVA和卵磷脂。缓冲体系的实例包括但不限于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠；氨基磺酸/三乙醇胺；柠檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇胺；琥珀酸/三乙醇胺；和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于：a)非离子表面活性剂如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化的或丙氧基化的直链和支链伯醇和仲醇、以及脂族氧化膦b)阳离子表面活性剂如季铵化合物、尤其是具有结合氮原子、附加地结合三个C1-C2烷基的C8-C20烷基的季铵化合物；c)阴离子表面活性剂如烷烃羧酸(例如C8-C20脂肪酸)、膦酸烷基酯、烷基磺酸盐(例如十二烷基磺酸钠“SDS”)或直链或支链烷基苯磺酸盐、烯基磺酸盐；和d)两性和两性离子表面活性剂如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱、以及它们的混合物。附加组分可包括芳香剂、染料、过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(DEQUEST2010，SolutiaInc.，St.Louis，MO和乙二胺四乙酸(EDTA))、TURPINALSL(CAS#2809-21-4)、DEQUEST0520、DEQUEST0531、酶活性稳定剂(例如聚乙二醇(PEG))、以及洗涤剂助剂。

使用过水解酶催化剂原位生产过氧羧酸

先锋霉素C脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41；系统化命名为先锋霉素C乙酰水解酶；CAH)是具有水解先锋霉素的乙酰酯键能力的酶，所述先锋霉素如先锋霉素C、7-氨基头孢烷酸和7-(噻吩-2-乙酰氨基)头孢烷酸(Abbott，B和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975))。CAH属于结构上相关的酶的较大家族，称为糖酯酶家族七(“CE-7”；参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.，同上)。如本文所用，术语“CE-7”、“CE-7酯酶”、“CE-7碳水化合物酯酶”、“CE-7过水解酶”和“CE-7酶”将互换使用，指结构上归类为糖酯酶家族7成员的酶。

CE-7酶家族成员可存在于植物、真菌(例如顶头孢霉(Cephalosporidiumacremonium))、酵母(例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、粘红酵母(Rhodotorulaglutinis))和细菌如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacteriumsp.)；耐内酰胺诺卡氏菌(Norcardialactamdurans)、以及芽孢杆菌属的多个成员中(Politino等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(12)：4807-4811(1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng.85：53-57(1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol179：5436-5441(1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54(3)：406-412(2000)；Mitsushima等人，(1995)Appl.Env.Microbiol.61(6)：2224-2229；Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975)；Vincent等人，同上，Takami等人，NAR，28(21)：4317-4331(2000)；Rey等人，GenomeBiol.，5(10)：article77(2004)；Degrassi等人，Microbiology.，146：1585-1591(2000)；美国专利公开6,645,233；美国专利公开5,281,525；美国专利公开5,338,676；和WO99/03984。授予DiCosimo等人的WO2007/070609和美国专利公开申请公布2008/0176299、2008/176783和2009/0005590公开了结构上归类为CE-7酶的多个酶，所述酶具有过水解活性，适于当与过氧源组合时，从多种羧酸酯底物中生产有效浓度的过氧羧酸。

CE-7家族包括CAH和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7家族成员具有共有的结构基序并且通常表现出对乙酰化低聚木糖和先锋霉素C的酯水解活性，表明CE-7家族提供对小范围底物具有多功能脱乙酰酶活性的单独一类蛋白(Vincent等人，同上)。

Vincent等人分析该家族成员间的结构相似性并定义CE-7家族的特征基序特征。特征基序是如下图所示至少3个高度保守基序的组合。所有序列编号是相对于参考序列的编号进行(在这种情况下，野生型那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)过水解酶；SEQIDNO：32)。

按照参考序列SEQIDNO：32的氨基酸残基编号，CE-7特征基序包含3个保守基序，称为：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和

c)His298-Glu299。

在氨基酸残基位点180的Xaa通常是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的两个用粗体表示。在一个实施方案中，在氨基酸残基位点180的Xaa选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族中的保守基序的进一步分析指示存在附加的保守基序(在SEQIDNO：32的氨基酸位点267-269的LXD)，这可进一步确定过水解酶属于CE-7糖酯酶家族(图1和2)。在另一个实施方案中，上文定义的特征基序包括第四保守基序，称为：

Leu267-Xaa268-Asp269。

在氨基酸残基位点268的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸。第四基序包括天冬氨酸残基(粗体)，它是催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的第三个成员。

可使用任意数量的熟知的全序列比对算法(即序列分析软件)比对两个或更多个氨基酸序列(表示具有过水解活性的酶)以测定本发明的特征基序是否存在(例如CLUSTALW或Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48：443-453(1970))。比对序列与参考序列(SEQIDNO：32)进行比较。在一个实施方案中，CLUSTAL比对(CLUSTALW)使用参考氨基酸序列(本文使用来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的CAH序列(SEQIDNO：32))，该比对用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过水解酶。如表A所示，保守氨基酸残基的相对编号基于参考氨基酸序列的残基编号计算比对序列内的小插入或缺失(通常5至6个或更少的氨基酸)。

表A：存在于CE-7酶中的保守基序具有过水解酶活性

具有过水解活性的每个本发明的CE-7变体来源于表A中的其中一个野生型过水解酶序列。每个本发明的变体保留CE-7特征基序(即，导入野生型序列的改变不包括表A中提供的保守基序的改变)。更具体地讲，具有改善活性的本发明过水解酶的氨基酸残基277发生取代，其中野生型半胱氨酸被丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸取代(按照SEQIDNO：32、36、202、203和204的编号)。SEQIDNO：205中的氨基酸残基278发生相同取代(即，SEQIDNO：205包含单个氨基酸插入，其将相对残基编号改变了1)。

每个本发明的变体包含以下改善：过水解酶比活性[U/mg蛋白]、反应混合物中的酶体积活性[U/mL]和/或过水解活性对水解活性的比率改善(即，“P/H比率”)。在一个实施方案中，活性改善用反应混合物中的活性相对于其来源的野生型序列的成倍提高(过水解酶比活性[U/mg蛋白]、反应混合物中的酶体积活性[U/mL]和/或P/H比率)来衡量。在另一个实施方案中，与SEQIDNO：5具有至少95％的氨基酸序列同一性的变体CE-7酶活性的成倍改善(过水解比活性、过水解体积活性和/或P/H比率的提高)是相对于测量到的SEQIDNO：32的活性；与SEQIDNO：10具有至少95％的氨基酸序列同一性的变体CE-7酶活性的成倍改善是相对于测量到的SEQIDNO：36的活性；与SEQIDNO：15具有至少95％的氨基酸序列同一性的变体CE-7酶活性的成倍改善是相对于测量到的SEQIDNO：202的活性；与SEQIDNO：20具有至少95％的氨基酸序列同一性的变体CE-7酶活性的成倍改善是相对于测量到的SEQIDNO：203的活性；与SEQIDNO：25具有至少95％的氨基酸序列同一性的变体CE-7酶活性的成倍改善是相对于测量到的SEQIDNO：204的活性；并且与SEQIDNO：30具有至少95％的氨基酸序列同一性的变体CE-7酶活性的成倍改善是相对于测量到的SEQIDNO：205的活性。

在一个实施方案中，本发明变体的过水解酶比活性的成倍提高为在基本上类似的条件下与野生型序列活性进行比较时至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、或13倍的提高。

在另一个实施方案中，本发明变体的P/H比率的成倍提高为在基本上类似的条件下与野生型序列进行比较时至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10倍的提高。

本发明的方法在含水反应条件下利用属于CE-7碳水化合物酯酶家族的变体酶的过水解活性生产工业上有用的、有效浓度的过氧羧酸。在一个实施方案中，本发明的方法原位生产有效浓度的一种或多种过氧羧酸。

用于测定过酸和过氧化氢浓度的HPLC检测分析法

本发明的方法能够使用多种分析方法分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、毛细管电泳(CE)、由U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))、以及2，2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)检测分析法(S.Minning，等人，AnalyticaChimicaActa378：293-298(1999)和WO2004/058961A1)，如本发明实施例所述。

测定过酸的最低生物杀灭浓度

如J.Gabrielson，等人(J.Microbiol.Methods50：63-73(2002))所述的方法可用于测定过酸或者过氧化氢和酶底物的最低生物杀灭浓度(MBC)。该检测分析法基于XTT还原抑制，其中XTT((2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑翁内盐，单钠盐)是氧还染料，该染料通过在490nm或450nm测量的光密度(OD)变化指示微生物呼吸活性。然而，有多种其他方法可用于测量消毒剂和防腐败剂的活性，包括但不限于活体平板计数、直接显微镜计数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见例如Brock，SemourS.，Disinfection，Sterilization，andPreservation，第5版，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。

使用酶促制备的过氧羧酸组合物

根据本发明的方法用酶催化剂生成的过氧羧酸生产可用于多种硬质表面/无生命物体以减少生物污染，例如消毒医疗设备(如内窥镜)、纺织物(如衣服、地毯)、食品制备表面、食品贮藏和食品包装设备、用于食物产品包装的材料、鸡孵卵和生长设施、畜栏、以及具有微生物和/或病毒活性的水处理过程。酶促生产的过氧羧酸可用于设计灭活朊病毒的制剂(例如某些蛋白酶)以附加地提供生物杀灭活性。在一个优选的方面，本发明的过氧羧酸组合物部分用作消毒剂，用于无法高温高压消毒的医疗设备和食品包装设备。因为包含过氧羧酸的制剂可使用GRAS或食品级组分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲液)制备，酶促生产的过酸也可用于净化动物尸体、肉类、水果和蔬菜、或者用于净化制备的食物。可将酶促生产的过氧羧酸掺入最终形式是粉末、液体、薄膜、固体或气溶胶的产品。可将酶促生产的过氧羧酸稀释到仍提供有效净化效果的浓度。

包含有效浓度过氧羧酸的组合物可用于消毒被生物污染物污染的(或怀疑被污染的)表面和/或物体，所述消毒通过用本发明方法生产的产物接触表面或物体进行。如本文所用，“接触”指将包含有效浓度过氧羧酸的消毒组合物与怀疑被病原体污染的表面或无生命物体接触足以清洁并消毒的一段时间。接触包括将过氧羧酸溶液或包含有效浓度过氧羧酸的组合物、或者形成有效浓度过氧羧酸的溶液或组合物喷洒、处理、浸没、冲洗、灌注到其上或其中、混合、组合、涂刷、涂覆、施用、粘贴及其他方式递送到怀疑被一定浓度的生物污染物污染的表面或无生命物体上。消毒剂组合物可与清洁组合物组合提供清洁和消毒效果。作为另外一种选择，可将清洁剂(例如表面活性剂或洗涤剂)掺入制剂以在单一组合物中提供清洁和消毒效果。

包含有效浓度过氧羧酸的组合物也可包含至少一种附加的抗微生物剂、朊病毒降解蛋白酶、杀病毒剂、杀孢子剂、或生物杀灭剂的组合。这些试剂与通过本发明方法生产的过氧羧酸的组合当用于清洁并消毒被生物污染物如微生物、孢子、病毒、真菌和/或朊病毒污染的(或怀疑被污染的)表面和/或物体时能够提供提高的和/或协同的效应。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(例如对-羟基烷基苯甲酸盐和烷基肉桂酸酯)；磺酸(例如十二烷基苯磺酸)；碘代化合物或活性卤素化合物(例如卤素单质；卤素氧化物(如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO₂)、碘、卤间化合物(例如一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、一氯化溴、一溴化碘、或二溴化碘)；多卤化物；次氯酸盐；次氯酸；次溴酸盐；次溴酸；氯代-和溴代-乙内酰脲；二氧化氯；以及亚氯酸钠)；有机过氧化物包括过氧化苯甲酰、烷基过氧化苯甲酰、臭氧、单重态氧发生器、以及它们的混合物、苯酚衍生物(例如邻-苯基苯酚、邻-苯甲基-对-氯酚、叔-戊醇酚和C₁-C₆烷基羟基苯甲酸盐)、季铵盐化合物(例如烷基苄基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵以及它们的混合物)、以及此类抗微生物剂的混合物，其量足以提供期望的微生物防护程度。有效量的抗微生物剂包括约0.001wt％至约60wt％的抗微生物剂，约0.01wt％至约15wt％的抗微生物剂，或约0.08wt％至约2.5wt％的抗微生物剂。

在一个方面，当施用于场所上和/或场所中时，能够使用通过本发明方法形成的过氧羧酸能够降低活体生物污染物(例如活体微生物种群)的浓度。如本文所用，“场所”包括适于进行消毒或漂白的部分或全部目标表面。目标表面包括可能潜在地被生物污染物污染的所有表面。非限制性实例包括存在于食品或饮料工业中的设备表面(例如罐、传送机、地面、排水沟、冷却器、冷冻机、设备表面、墙面、阀门、束带、管道、排水沟、接头、裂缝、以及它们的组合等)；建筑表面(例如墙面、地面和窗户)；非食品工业相关的管道和排水沟，包括水处理设施、水池和矿泉池、以及发酵罐；医院或兽医院表面(如墙面、地面、床、设备(例如内窥镜)、医院/兽医院或其他保健机构中穿着的衣服，包括衣服、洗擦布、鞋子和其他医院或兽医院表面)；餐馆表面；浴室表面；盥洗室；衣服和鞋子；谷仓或畜栏表面，例如家禽、牛、乳牛、山羊、马和猪的畜栏；家禽或虾的孵卵处；以及药物或生物药物表面(例如药物或生物药物制造设备、药物或生物药物成分、药物或生物药物赋形剂)。附加的硬质表面也包括食物产品，例如牛肉、禽肉、猪肉、蔬菜、水果、海产品、它们的组合等。场所也可包括水吸收材料如感染的亚麻布或其他纺织物。场所也包括收获的植物或植物产品，包括种子、球茎、块茎、果实和蔬菜、生长的植物、尤其是作物生长植物、包括谷类食物、叶片蔬菜和色拉作物、根用蔬菜、豆类、浆果果实、柑橘类水果和坚果。

硬质表面材料的非限制性实例是金属(例如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、铝、以及它们的合金)、矿物质(例如混凝土)、聚合物和塑料(例如聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚(丙烯腈、丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯；和聚酰胺如尼龙)。附加表面包括砖块、瓷砖、陶瓷、瓷器、木质(地板)、聚乙烯树脂(地板)、油毡和地毯。

可使用通过本发明方法形成的过氧羧酸向衣物或纺织物提供有益效果，包括但不限于消毒、卫生处理、漂白、脱色和除臭。通过本发明方法形成的过氧羧酸可用于任何数量的衣物洗涤护理产品，包括但不限于纺织物预洗涤处理剂、衣物洗涤剂、污渍移除剂、漂白组合物、除臭组合物和漂洗剂。

重组微生物的表达

本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞尤其是微生物宿主细胞中生产。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真菌可为表达本发明核酸分子的合适宿主。过水解酶可在细胞内、细胞外、或细胞内和细胞外组合表达，其中细胞外表达细胞外表达比细胞内表达能够从发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白生物合成设备相对于用于生成细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何将表达功能基因。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)物种。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属、克鲁维酵母属和假单胞菌属。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌。

大规模的微生物生长和功能基因表达可使用广范围的简单或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃如甲烷或二氧化碳(在光合或化学自养宿主情况下)、不同形式和量的氮、磷、硫、氧、碳或任何痕量营养素包括(小无机离子)。可通过加入或不加入特定调节分子到培养物中调节生长速率，并且通常不认为该调节分子是营养物质或能源。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源和/或对生产宿主是天然的基因，尽管此类控制区域不需要是类似来源的。

可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且是本领域技术人员熟悉的。实际上能够驱动这些基因的任何启动子都适用于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；和lac、araB、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及amy、apr、npr启动子，和多种用于在芽孢杆菌属中表达的噬菌体启动子。

终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，包含的终止控制区是任选的。在另一个实施方案中，嵌合基因包括来源于优选宿主细胞的终止控制区。

工业生产

可应用多种培养方法以制备本发明的过水解酶催化剂。例如，从重组微生物宿主中大规模生产特定基因产物可通过分批、分批补料和连续培养方法进行。

分批和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：ThomasD.BrockinBiotechnology：ATextbook ofIndustrialMicrobiology，第二版，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1989))，以及Deshpande，MukundV.，(Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227-234(1992)。

期望过水解酶催化剂的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由天然材料和/或合成材料组成。

从分批发酵、分批补料发酵、或连续培养中回收期望的过水解酶催化剂可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内生产酶催化剂时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆液，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使其匀化，生产出包含期望酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地滤过合适的助滤剂如硅藻土或二氧化硅以在热处理步骤前除去细胞碎片，所述热处理步骤用于从酶催化剂溶液中沉淀非期望的蛋白。包含期望的酶催化剂的溶液然后可通过膜过滤或离心与沉淀的细胞碎片和蛋白分离，并且所得部分纯化的酶催化剂溶液通过附加地膜过滤进行富集，然后任选地与合适赋形剂混合(例如麦芽糖糊精、海藻糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘露糖醇磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、或它们的混合物)并喷雾干燥的以制备包含期望酶催化剂的固体粉末。

当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不希望范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

提供以下实施例以展示优选实施方案。本领域的技术人员应认识到下文实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本文公开方法的实施中功能良好的技术，因此可认为其构成实施的优选模式。然而，按照本公开，本领域的技术人员将认识到在公开的具体实施方案中能进行不脱离本文公开方法的实质和范围的许多改变，并且仍然获得同样的或类似的结果。

所有试剂和材料获取自DIFCOLaboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCIAmerica(Portland，OR)、RocheDiagnosticsCorporation(Indianapolis，IN)或Sigma-AldrichChemicalCompany(St.Louis，MO)。

说明书中的以下缩写对应的测量、技术、性能、或化合物单位如下：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分之一或几，“wt”指重量，“wt％”指重量百分比，“g”指克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指重力，“HPLC”指高效液相色谱，“ddH₂O”指蒸馏并去离子水，“dcw”指干细胞重量，“ATCC”或“ATCC”指美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，Manassas，VA)，“U”指过水解酶活性，“rpm”指每分钟转数，“EDTA”指乙二胺四乙酸。

实施例1

克隆并表达来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的乙酰木聚糖酯酶

使用优化用于在大肠杆菌中表达的密码子合成编码来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的乙酰木聚糖酯酶的编码区(GENBANK登录号#AAB70869，SEQIDNO：32)(DNA2.0，MenloPark，CA)。随后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQIDNO：33和SEQIDNO：34扩增编码区。将所得核酸产物(SEQIDNO：35)克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以生成质粒pSW196。使用质粒pSW196转化大肠杆菌KLP18以生成菌株KLP18/pSW196(参见授予DiCosimo等人的公布的美国专利公开申请2008/0176299，其全文以引用方式并入本文)。KLP18/pSW196在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认过水解酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例2

发酵表达那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶的大肠杆菌KLP18转化体

通过向一个2L摇瓶加料0.5L种子培养基制备发酵罐种子培养物，该种子培养基包含酵母提取物(Amberex695，5.0g/L)，K₂HPO₄(10.0g/L)，KH₂PO₄(7.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.0g/L)，(NH₄)₂SO₄(4.0g/L)，MgSO₄七水合物(1.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。将培养基的pH调节到6.8，并且该瓶中的培养基进行灭菌。灭菌后加入葡萄糖(50wt％，10.0mL)和1mL氨苄青霉素(25mg/mL)储备液。种子培养基用在20％甘油中的1-mL大肠杆菌KLP18/pSW196(实施例1)培养物接种，并且在35℃和300rpm下培养。将种子培养物在ca.1-2OD₅₅₀时转移到14L发酵罐中(BraunBiotech，Allentown，PA)，该发酵罐装有8L培养基，温度为35℃，该培养基包含KH₂PO₄(3.50g/L)，FeSO₄七水合物(0.05g/L)，MgSO₄七水合物(2.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.90g/L)，酵母提取物(Amberex695，5.0g/L)，Biospumex153K消泡剂(0.25mL/L，CognisCorporation，Monheim，Germany)，NaCl(1.0g/L)，CaCl₂二水合物(10g/L)，和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液包含一水合柠檬酸(10g/L)，MnSO₄水合物(2g/L)，NaCl(2g/L)，FeSO₄七水合物(0.5g/L)，ZnSO₄七水合物(0.2g/L)，CuSO₄五水合物(0.02g/L)和NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。在灭菌后加入葡萄糖溶液(50％w/w，80.0g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(16.00mL)。葡萄糖溶液(50％w/w)用于分批补料。当葡萄糖浓度下降到0.5g/L时给料葡萄糖，开始为0.31g给料/分钟，逐渐提高到每小时分别为0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41和1.63g/分钟；随后速率保持恒定。监控培养基中的葡萄糖浓度，如果该浓度超过0.1g/L，降低给料速率或暂时中止给料。针对不同菌株在OD₅₅₀＝56和OD₅₅₀＝80之间加入16mLIPTG(0.5M)开始诱导。控制溶解氧(DO)浓度为25％的空气饱和度。首先通过叶轮搅拌速率(400至1400rpm)、随后通过透气速率(2至10slpm)控制DO。将pH控制在6.8。NH₄OH(29％w/w)和H₂SO₄(20％w/v)用于pH控制。顶部压力为0.5巴。在加入IPTG后离心16小时收获细胞。

实施例3

那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)乙酰木聚糖酯酶建模

来自那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)(SEQIDNO：32)和海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8(SEQIDNO：36)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列使用CLUSTALW进行比对(图1)。海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶(1VLQ)的X射线晶体结构获取自ResearchCollaboratoryforStructuralBioinformatics(RCSB)蛋白数据库(PDP)(参见H.M.Berman，J.Westbrook，Z.Feng，G.Gilliland，T.N.Bhat，H.Weissig，I.N.Shindyalov，P.E.Bourne：TheProteinDataBank.NucleicAcidsResearch，28pp.235-242(2000)和H.M.Berman，K.Henrick，H.Nakamura，AnnouncingtheworldwideProteinDataBank.，NatureStructuralBiology10(12)，p.980(2003)。与相应的那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)氨基酸不同的所有海栖热袍菌(T.maritima)氨基酸被那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)氨基酸取代，该取代使用AccelrysDISCOVERYSTUDIO2.0软件(Protocols＞ProteinModeling＞Buildmutants；AccelrysSoftwareInc.，SanDiego，CA)。此外，用甲硫氨酸取代硒代蛋氨酸。选择用于输出的模型编号为3，将最佳水平设置为“高(high)”并将UseDOPE方法设置为“真(true)”。使用PyMol^TM0.99版完成结构覆盖和可视化(DeLanoScientificLLC，PaloAlto，CA)。基于是否该催化三联体(H303、S188和D274)保持在正确位置以及是否相对于初始模型保留总体结构来判断模型质量。

实施例4

鉴定那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)乙酰木聚糖酯酶中的氨基酸残基用于饱和诱变

除了典型的催化三联体(H303、S188和D274)外，基于该模型在乙酰木聚糖酯酶活性位点中还存在若干个残基。可期望用备选氨基酸取代一个或多个这些残基以改变酶功能。然而，此类取代的特异性效应是先验未知的。选择SEQIDNO：32的残基F213(Phe213)、I276(Ile276)、C277(Cys277)和N93(Asn93)用于位点饱和诱变。不选择残基Y92(Tyr92)，这是因为该残基在CE-7家族中的高保守水平。

实施例5

那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸残基位点F213、I276、C277和N93上的饱和诱变

为了分别将四个选择残基(F213、I276、C277、N93)中的每一个变成任一个其他可能的19个氨基酸，基于那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶密码子优化的序列设计引物对(表1)(质粒pSW196中的SEQIDNO：35(参见上文实施例1和美国专利公开申请2008/0176299))。

表1：用于改变那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)中的氨基酸残基277、276、213和93的寡核苷酸。

使用QUIKCHANGE(Stratagene，LaJolla，CA)试剂盒，根据制造商的说明书制造突变。用1UDpnl在37℃处理扩增质粒1小时。使用处理后的质粒转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)(残基213、276和277)或化学感受态大肠杆菌TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)(残基93)。将转化体置于加入0.1mg氨苄青霉素/mL的LB-琼脂平板上并在37℃生长过夜。采集至多五个个体菌落并对质粒DNA测序以确认期望的突变。

实施例6

那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)乙酰木聚糖酯酶突变体的过水解酶活性测定

采集突变体的单个克隆，将其置于包含0.1mLLB和0.1mg氨苄青霉素/mL的96孔平板中，并且在37℃不振荡生长过夜。将过夜培养物(0.003mL)转移到包含0.3mLLB、0.5mMIPTG和0.1mg氨苄青霉素/mL的“诱导平板”(96深孔板)中。诱导平板在37℃振荡生长过夜。将0.01mL诱导培养物转移到“裂解平板”(96孔)中，所述平板包含0.09mL56mg/mLCELYTIC^TMExpress(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。在25℃培养30分钟前首先轻轻搅动平板。将大约0.01mL裂解培养物转移到“检测平板”(96孔)中，所述平板包含0.09mL“pH5.0的检测溶液”(100mM三乙酰甘油酯，100mM过氧化氢，50mMpH5.0的乙酸)。也将大约0.01mL裂解培养物转移到“pH7.5的检测平板”(96孔)中，所述平板包含0.09mL“pH7.5的检测溶液”(100mM三乙酰甘油酯，100mM过氧化氢，50mMpH7.5的磷酸钠)。在将平板在环境温度下培养10分钟前轻轻搅动平板30秒。加入0.1mL“终止缓冲液”(100mM邻苯二胺(OPD)，500mMNaH₂PO₄，pH2.0)终止检测。在将平板在25℃培养30分钟前轻轻搅动平板30秒。使用无盖的SPECTRAMAXPlus³⁸⁴(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)读出458nm的吸光度。结果分析指示四个突变体显示出比天然酶显著更高的过水解活性(表2和3)。所有四个在残基277(C277A、C277V、C277S和C277T；参见SEQIDNO：5)上的半胱氨酸改变提高了过水解活性。

表2：那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶突变体在pH5.0的过水解酶活性(U/mL)。

表3：那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶突变体在pH7.5的过水解酶活性。

实施例7

在大肠杆菌KLP18中表达那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶变体

使用具有确认的乙酰木聚糖酯酶突变的质粒转化大肠杆菌KLP18(实施例1)。将转化体置于LB-氨苄青霉素(100μg/mL)平板上并在37℃过夜培养。从平板上收获细胞，所述平板使用2.5mLLB培养基，其中补充有20％(v/v)甘油和1.0mL冷冻在-80℃的所得细胞悬浮液的等分试样。将一mL解冻细胞悬浮液转化到具有0.7L培养基的1-LAPPLIKONBioreactor(ApplikonBiotechnology，FosterCity，CA)中，所述培养基包含KH₂PO₄(5.0g/L)，FeSO₄七水合物(0.05g/L)，MgSO₄七水合物(1.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.90g/L)，酵母提取物(Amberex695，5.0g/L)，Biospumex153K消泡剂(0.25mL/L，CognisCorporation)，NaCl(1.0g/L)，CaCl₂二水合物(0.1g/L)，和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液包含一水合柠檬酸(10g/L)，MnSO₄水合物(2g/L)，NaCl(2g/L)，FeSO₄七水合物(0.5g/L)，ZnSO₄七水合物(0.2g/L)，CuSO₄五水合物(0.02g/L)和NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。在灭菌后加入葡萄糖溶液(50％w/w，6.5g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(2.8mL)。葡萄糖溶液(50％w/w)也用于分批补料。在葡萄糖浓度下降到低于0.5g/L40分钟后开始给料葡萄糖，开始为0.03g给料/分钟，逐渐提高到每小时分别为0.04、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.12和0.14g/分钟；随后速率保持恒定。监控培养基中的葡萄糖浓度，如果该浓度超过0.1g/L，降低给料速率或暂时中止给料。在OD₅₅₀＝50时，加入0.8mLIPTG(0.05M)开始诱导。控制溶解氧(DO)浓度为25％的空气饱和度，首先通过搅拌(400-1000rpm)、随后通过透气(0.5-2slpm)进行控制。将温度控制在37℃，pH控制在6.8；使用NH₄OH(29％w/w)和H₂SO₄(20％w/v)进行pH控制。在加入IPTG后20小时离心(5,000×g，15分钟)收获细胞。

实施例8

制备包含半纯化那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶或那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)变体乙酰木聚糖酯酶的细胞裂解物

大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)野生型过水解酶)的细胞培养物如实施例2所述生长。所得细胞浆液重悬(20％w/v)在pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液中，该缓冲液补充有1.0mMDTT。使得重悬细胞两次通过French细胞压榨机以确保＞95％的细胞裂解。裂解细胞在12,000×g离心30分钟，并且将上清液在75℃加热20分钟，随后在冰浴中终止2分钟。在11,000×g离心10分钟以移除沉淀蛋白。SDS-PAGE指示CE-7酶在热处理对提取上清液中包含大约85-90％的总蛋白。

大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277S过水解酶变体)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277V(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277V过水解酶变体)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277A(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277A过水解酶变体)和大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277T过水解酶变体)的细胞培养物各自如实施例7所述生长。将所得细胞浆液重悬(20％w/v)在pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液中，该缓冲液补充有1.0mMDTT。使得重悬细胞两次通过French细胞压榨机以确保＞95％的细胞裂解。裂解细胞在12,000×g离心30分钟，并且将上清液在75℃加热20分钟，随后在冰浴中终止2分钟。在11,000×g离心10分钟以移除沉淀蛋白。SDS-PAGE指示CE-7酶在热处理对的提取上清液中包含大约85-90％的总蛋白。

实施例9

那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖野生型酯酶和 C277酯酶变体的比活性和过水解/水解比率

反应(40mL总体积)在25℃的磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.2)中进行，所述缓冲液包含三乙酰甘油酯(100mM)，过氧化氢(100mM)和其中一种以下乙酰木聚糖酯酶突变体：那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)C277S过水解酶变体(0.010mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S的热处理提取总蛋白)、那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)C277T过水解酶变体(0.010mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T的热处理提取总蛋白)、那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)C277A过水解酶变体(0.0125mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277A的的热处理提取总蛋白)和那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)C277V过水解酶变体(0.0125mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277V的热处理提取总蛋白)(如实施例8所述制备)。仅仅在反应头30秒搅动反应物以初始混合反应物和酶。

也在与上述反应相同的条件下进行反应，使用分离自大肠杆菌KLP18/pSW196(表达那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)野生型乙酰木聚糖酯酶(实施例1))的0.050mg/mL热处理提取总蛋白，其中根据实施例8的方法制备热处理的提取物上清液。

在每个反应的第一分钟后、以及在随后的十五分钟内每隔两分钟同时回收来自上述每种反应混合物的两个样品，其中分析两个样品中的其中一个的过乙酸，并且分析第二个样品从三乙酰甘油酯酶水解生成的总乙酸，以及随后从样品中的过乙酸通过与甲基-对-甲苯硫醚(MTS，参见下文)的反应转化成的乙酸。

使用如Karst等人，同上所述方法的改进方法进行反应混合物中过乙酸生产速率的测量。在预定时间移除反应混合物的样品(0.040mL)并立即与0.960mL5mM磷酸水溶液混合，通过将稀释样品的pH调节至小于pH4以终止反应。所得溶液使用ULTRAFREEMC-过滤单位(30,000NormalMolecularWeightLimit(NMWL)，MilliporeCorp.，Billerica，MA；cat#UFC3LKT00)，通过在12,000rpm离心2分钟进行过滤。将所得滤液的等分试样(0.100mL)转移到1.5-mL螺帽HPLC小瓶(AgilentTechnologies，PaloAlto，CA；#5182-0715)中，瓶中包含0.300mL去离子水，然后加入0.100mL在乙腈中的20mMMTS(甲基-对-甲苯硫醚)，给小瓶拧上螺帽，将内容物短暂混合，然后在ca.25℃避光孵育10分钟。然后给小瓶加入0.400mL的乙腈和在乙腈中的0.100mL三苯基膦溶液(TPP，40mM)，给小瓶再拧上螺帽，将所得溶液混合并在ca.25℃避光孵育30分钟。然后给每个小瓶加入0.100mL10mMN，N-二甲基-间-甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外部标准品)，并且如下所述通过HPLC分析所得溶液的MTSO(甲基-对-甲苯硫醚)、通过MTS与过乙酸反应产生的化学计量的氧化产物。在缺少加入的提取蛋白或三乙酰甘油酯的情况下进行对照反应以测定检测混合物中过氧化氢对MTS的氧化速率，该反应用于修正背景MTS氧化生产过乙酸的速率。HPLC方法：SupelcoDiscoveryC8柱(10-cmX4.0-mm，5mm)(catalog#569422-U)，带SupelcoSupelguardDiscoveryC8预柱(Sigma-Aldrich；catalog#59590-U)；10微升注射体积；用CH₃CN(Sigma-Aldrich；catalog#270717)的梯度方法，以及1.0mL/分钟的去离子水和环境温度(表4)。

表4：HPLC梯度分析过乙酸。

时间(分钟:秒)	(％CH₃CN)
		0:00	40
3:00	40
		3:10	100
4:00	100
		4:10	40
7:00(终止)	40

为了测定反应中过水解酶催化的乙酸生产的速率，在预定时间移除反应混合物的样品(0.900mL)并立即加到1.5mL微离心管中，所述微离心管包含0.040mL0.75MH₃PO₄，并且所得溶液短暂混合以在pH3.0-4.0终止反应。然后向管中加入在50mMpH(7.2)磷酸盐缓冲液中的0.020mL10mg/mL的黑曲霉过氧化氢酶(Sigma-Aldrich；C3515)溶液)，混合所得溶液并在环境温度下反应15分钟以不成比例地将过氧化氢分解成水和氧气。然后向管中加入0.040mL0.75MH₃PO₄，混合所得溶液并使用ULTRAFREEMC过滤单位(30,000NormalMolecularWeightLimit(NMWL)，MilliporeCorp.，cat#UFC3LKT00)，在12,000rpm离心2分钟进行过滤。将所得滤液的等分试样(0.100mL)与在乙腈中的0.150mL20mMMTS(甲基-对-甲苯硫醚)混合，并且将所得溶液在ca.25℃避光孵育10分钟。样本中的乙酸通过酶促水解三乙酰甘油酯和通过与MTS的反应将过乙酸转化成乙酸而生成，其浓度使用气相色谱仪(GC)进行测定，GC配有火焰离子化检测器(FID)和DB-FFAP柱(长度15m；ID，0.530mM；薄膜厚度1.00μm)；每个速率测定使用新的进样端口衬垫(总计八个分析样品)以避免进样端口衬垫中随时间积累磷酸。

那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)乙酰木聚糖酯酶变体具有比野生型酯酶显著更高的三乙酰甘油酯过水解比活性(表5)。那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶变体的过水解/水解比率通过以下方法测定：用PAA生产速率(过水解速率)除以三乙酰甘油酯水解成乙酸的速率(水解速率)(用测定方法中来自PAA和乙酸的总乙酸生产速率进行计算，并且用过乙酸生产速率校正)；那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶变体的P/H比率ca。等于或大于那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)野生型乙酰木聚糖酯酶的P/H比率(表5)。

表5：

实施例10

克隆并表达来自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的乙酰木聚糖酯酶

合成如GENBANK(登录号#NP_227893.1)报道的编码来自海栖热袍菌(T.maritima)的乙酰木聚糖酯酶的基因(DNA2.0，MenloParkCA)。随后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQIDNO：206和SEQIDNO：207扩增基因。将所得核酸产物(SEQIDNO：208)用限制性酶PstI和XbaI酶切并亚克隆到pUC19的PstI和XbaI位点之间以生成质粒pSW207。使用经优化以在大肠杆菌中表达的密码子(DNA2.0，MenloParkCA)合成编码来自海栖热袍菌(T.maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶(如GENBANK(登录号NP_227893.1；SEQIDNO：36)所报道)的基因。随后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQIDNO：38和SEQIDNO：39扩增基因。将所得核酸产物(SEQIDNO：37)用限制性酶EcoRI和PstI酶切并亚克隆到pTrc99A(GENBANK登录号M22744)中的EcoRI和PstI位点以生成质粒pSW228(包含密码子优化的海栖热袍菌(T.maritima)编码序列SEQIDNO：41)。使用质粒pSW207和pSW228转化大肠杆菌KLP18(美国专利申请公开2008/0176299)以分别生成菌株KLP18/pSW207和KLP18/pSW228。KLP18/pSW207和KLP18/pSW228在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认过水解酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例11

构建在残基C277上的海栖热袍菌(Thermotogamaritima)乙酰木聚糖酯酶变体

使用寡核苷酸引物对(表6)将海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶的C277(Cys277)位点各自变为Val、Ala、Ser和Thr，所述引物对基于质粒pSW228中海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶(SEQIDNO：41)的经密码子优化的序列进行设计。使用QUIKCHANGE(Stratagene)，按照制造商的说明书制造突变。用1UDpnl在37℃处理扩增质粒1小时。处理后的质粒用于转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)。将转化体置于加入0.1mg氨苄青霉素/mL的LB-琼脂平板上并在37℃生长过夜。采集至多五个个体菌落并对质粒DNA测序以确认期望的突变。

表6：用于改变海栖热袍菌(T.maritima)中的残基277的寡核苷酸。

实施例12

在大肠杆菌KLP18中表达海栖热袍菌(Thermotogamaritima)乙酰木聚糖酯酶变体

使用具有确认的乙酰木聚糖酯酶突变的质粒转化大肠杆菌KLP18(实施例1)。转化体在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认乙酰木聚糖酯酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例13

制备包含半纯化海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶突变体的细胞溶解产物

使用类似于实施例7所述的发酵规程，以1L规模(Applikon)培养细胞培养物(如实施例12所述制备)。在5,000×g离心15分钟收获细胞，然后重悬在(20％w/v)在pH7.0、具有1.0mMDTT的50mM磷酸盐缓冲液中。使得重悬细胞两次通过French细胞压榨机以确保＞95％的细胞裂解。裂解细胞在12,000×g离心30分钟，并且将上清液在75℃加热20分钟，随后在冰浴中终止2分钟。在11,000×g离心10分钟以移除沉淀蛋白。SDS-PAGE指示CE-7酶在制剂中包含大约85-90％的总蛋白。

实施例14

海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖野生型酯酶和C277酯酶变体的比活性和过水解/水解比率

反应(40mL总体积)在25℃的磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.2)中进行，所述缓冲液包含三乙酰甘油酯(100mM)，过氧化氢(100mM)和其中一种以下乙酰木聚糖酯酶变体：海栖热袍菌(T.maritima)C277S过水解酶变体(0.010mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S的热处理提取总蛋白)、海栖热袍菌(T.maritima)C277T过水解酶变体(0.010mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T的热处理提取总蛋白)、海栖热袍菌(T.maritima)C277A过水解酶变体(0.0125mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277A的的热处理提取总蛋白)和海栖热袍菌(T.maritima)C277V过水解酶变体(0.0125mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277V的热处理提取总蛋白)(如实施例13所述制备)。仅仅在反应头30秒搅动反应物以初始混合反应物和酶。

也在与上述反应相同的条件下进行反应，使用分离自大肠杆菌KLP18/pSW228(表达海栖热袍菌(T.maritima)野生型乙酰木聚糖酯酶(实施例10))的0.050mg/mL热处理提取总蛋白，其中根据实施例13的方法制备热处理的提取物上清液。

在每个反应的第一分钟后、以及在随后的十五分钟内每隔两分钟同时回收来自上述每种反应混合物的两个样品，其中使用如Karst等人(同上)所述方法的改进方法分析两个样品中的其中一个的过乙酸，并且分析第二个样品从三乙酰甘油酯酶水解生成的总乙酸，以及随后从样品中的过乙酸通过与甲基-对-甲苯硫醚(MTS)(参见实施例9)的反应转化成的乙酸。

海栖热袍菌(Thermotogamaritima)乙酰木聚糖酯酶突变体具有比野生型酯酶显著更高的三乙酰甘油酯过水解比活性(表7)。海栖热袍菌(T.maritima)乙酰木聚糖酯酶变体的过水解/水解比率通过以下方法测定：用PAA生产速率(过水解速率)除以三乙酰甘油酯水解成乙酸的速率(水解速率)(用测定方法中来自PAA和乙酸的总乙酸生产速率进行计算，并且用过乙酸生产速率校正)；那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)乙酰木聚糖酯酶变体的P/H比率ca。等于或大于海栖热袍菌(T.maritima)野生型乙酰木聚糖酯酶的P/H比率(表7)。

表7：

实施例15

使用过水解酶生产过乙酸

反应(100mL总体积)包含三乙酰甘油酯(2mM)、过氧化氢(10mM)和0.1μg/mL至2.0μg/mL的热处理细胞提取蛋白(如上所述制备，其中热处理在85℃进行20分钟)，该反应在20℃的10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH8.1)中进行。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在1分钟、5分钟、20分钟、40分钟和60分钟生产的过乙酸浓度在表8中列出。

表8：反应中的过乙酸(PAA)浓度与过水解酶浓度的相关性，所述反应在20℃下，在碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH8.1)中包含三乙酰甘油酯(2mM)和过氧化氢(10mM)，使用来自大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)野生型过水解酶)或大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)C277S变体过水解酶)的热处理提取蛋白(重复反应)进行。

实施例16

使用过水解酶生产过乙酸

反应(100mL总体积)包含三乙酰甘油酯(20mM)、过氧化氢(10mM)和0.1μg/mL至2.0μg/mL的热处理细胞提取蛋白(如上所述制备，其中热处理在85℃进行20分钟)，该反应在20℃的10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH8.1)中进行。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在1分钟、5分钟、20分钟、40分钟和60分钟生产的过乙酸浓度在表9中列出。

表9：反应中的过乙酸(PAA)浓度与过水解酶浓度的相关性，所述反应在20℃下，在碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH8.1)中包含三乙酰甘油酯(20mM)和过氧化氢(10mM)，使用来自大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)野生型过水解酶)或大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)C277S变体过水解酶)的热处理提取蛋白(重复反应)进行。

实施例17

使用过水解酶生产过乙酸

反应(40mL总体积)在25℃磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.2)中进行，其包含三乙酰甘油酯(100mM)、过氧化氢(100mM)和10μg/mL至50μg/mL热处理那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)或海栖热袍菌(T.maritima)野生型或C277变体过水解酶(如上所述制备热处理细胞提取蛋白，其中热处理在75℃进行20分钟)。仅仅在反应头30秒搅动反应物以初始混合反应物和酶。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在1分钟、5分钟和30分钟生产的过乙酸浓度在表10中列出。

表10：反应中的过乙酸(PAA)生产，所述反应在25℃磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.2)中包含三乙酰甘油酯(100mM)和过氧化氢(100mM)，使用热处理的那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)或海栖热袍菌(T.maritima)野生型或C277突变体过水解酶进行。

实施例18

使用过水解酶生产过乙酸

反应(10mL总体积)在25℃的碳酸氢钠缓冲液(1mM，初始pH6.0)中进行，其包含三乙酰甘油酯(100mM或150mM)、过氧化氢(100mM、250mM或420mM)和热处理那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)或海栖热袍菌(T.maritima)野生型、C277S或C277T变体过水解酶(如上所述制备热处理细胞提取蛋白，其中热处理在75℃进行20分钟；浓度在表11中列出)。使用附加包含500ppmTURPINALSL的420mM过氧化氢进行反应。仅仅在反应头30秒搅动反应物以初始混合反应物和酶。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在1分钟、5分钟和30分钟生产的过乙酸浓度在表11中列出。

表11：反应中的过乙酸(PAA)生产，所述反应在25℃碳酸氢盐缓冲液(1mM，pH6.0或100mM，pH8.1)或去离子水(pH5.0)中包含三乙酰甘油酯和过氧化氢，使用热处理的海栖热袍菌(T.maritima)野生型C277S或C277T变体过水解酶进行。

实施例19

使用海栖热袍菌(T.maritima)和那不勒斯栖热袍菌(T. neapolitana)野生型及变体过水解过水解丙二醇二乙酸酯或乙二醇二醋酸酯

表达那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)野生型过水解酶(KLP18/pSW196)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277S过水解酶变体(KLP18/pSW196/C277S)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277T过水解酶变体(KLP18/pSW196/C277T)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)野生型过水解酶(KLP18/pSW228)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)C277S过水解酶变体(KLP18/pSW228/C277S)和海栖热袍菌(Thermotogamaritima)C277T过水解酶变体(KLP18/pSW228/C277T)的转化体的细胞提取物分别通过将在包含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的细胞浆液(20wt％湿细胞重量)悬浮液两次递送通过工作压力16,000psi(～110MPa)的French压榨机进行制备。裂解细胞在12,000×g离心30分钟，制备澄清的细胞提取物用于总可溶蛋白测定(Bradford检测分析法)。将上清液在75℃加热20分钟，随后在冰浴中终止2分钟。在11,000×g离心10分钟以移除沉淀蛋白。所得热处理提取蛋白上清液的SDS-PAGE指示CE-7酶占制剂中大约85-90％的总蛋白。上清液中的热处理提取蛋白在干冰中冷冻，并贮藏在-80℃备用。

第一组反应(10mL总体积)在20℃的10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH8.1)中进行，其包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二醋酸酯(EGDA)(100mM)、过氧化氢(100mM)和25μg/mL的热处理提取蛋白，所述提取蛋白来自大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277S过水解酶变体)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277T过水解酶变体)、大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)C277S过水解酶变体)和大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)C277T过水解酶变体)的其中一个(如上所述制备)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过水解三乙酰甘油酯制备的过乙酸的浓度。反应在1、5和30分钟采样，并且使用Karst衍生规程(Karst等人，同上)和HPLC分析方法(同上)分析样品的过乙酸。在1分钟、5分钟和30分钟生产的过乙酸浓度在表12中列出。

表12：利用反应中的海栖热袍菌(T.maritima)和那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)野生型和过水解酶变体生产的过乙酸(PAA)浓度，反应在20℃的碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH8.1)中包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)(100mM)或乙二醇二醋酸酯(EGDA)(100mM)、过氧化氢(100mM)和25μg/mL热处理提取蛋白。

第二组反应(10mL总体积)在20℃的10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH8.1)中进行，其包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二醋酸酯(EGDA)(2mM)、过氧化氢(10mM)和10μg/mL的热处理提取蛋白，所述提取蛋白来自大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277S过水解酶变体)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)C277T过水解酶变体)、大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)C277S过水解酶变体)和大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T(海栖热袍菌(Thermotogamaritima)C277T过水解酶变体)的其中一个(如上所述制备)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过水解三乙酰甘油酯制备的过乙酸的浓度。反应在5分钟采样，并且使用Karst衍生规程(Karst等人，同上)和HPLC分析方法(同上)分析样品的过乙酸。在第5分钟生产的过乙酸浓度在表13中列出。

表13：利用反应中的海栖热袍菌(T.maritima)和那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)野生型和过水解酶变体生产的过乙酸(PAA)浓度，反应在20℃的碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH8.1)中包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)(2mM)或乙二醇二醋酸酯(EGDA)(2mM)、过氧化氢(10mM)和10μg/mL热处理提取蛋白。

Claims

1.编码具有过水解活性的多肽的分离的多核苷酸，所述多肽结构上归类为糖酯酶家族7酶，并且由SEQIDNO：5或SEQIDNO：10所示的氨基酸序列组成，前提条件是对SEQIDNO：5或SEQIDNO：10的氨基酸残基277的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNO：9的核酸序列组成。

3.载体，所述载体包含权利要求1或权利要求2的多核苷酸。

4.包含权利要求1或权利要求2的多核苷酸的重组DNA构建体，所述多核苷酸可操作地连接至调控序列。

5.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4的重组DNA构建体。

6.转化细胞的方法，所述方法包括用权利要求1或权利要求2的多核苷酸转化细胞。

7.具有过水解活性并且结构上归类为糖酯酶家族7酶的分离的多肽，所述多肽由SEQIDNO：5或SEQIDNO：10所示的氨基酸序列组成，前提条件是对SEQIDNO：5或SEQIDNO：10的氨基酸277的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

8.由羧酸酯制备过氧羧酸的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)选自下列的羧酸酯：

(i)一种或多种酯，所述酯具有以下结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

(ii)一种或多种具有以下结构的甘油酯

(iii)一种或多种下式的酯：

(v)(i)至(iv)的任何组合；

(2)过氧源；和

(3)权利要求7的多肽；以及

(b)在合适的含水反应条件下混合所述反应组分，从而制备过氧羧酸。

9.使用酶促产生的过氧羧酸组合物对硬质表面或无生命物体进行消毒或卫生处理的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)选自下列的羧酸酯：

(i)一种或多种酯，所述酯具有以下结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

(ii)一种或多种具有以下结构的甘油酯

(iii)一种或多种下式的酯：

(v)(i)至(iv)的任何组合；

(2)过氧源；和

(3)权利要求7的多肽；

(c)任选地将所述过氧羧酸产物稀释；以及

(d)使所述硬质表面或无生命物体与在步骤(b)或步骤(c)中所产生的过氧羧酸接触，从而对所述表面或所述无生命物体消毒或卫生处理。

10.使用酶促产生的过氧羧酸组合物来处理衣物或纺织物以进行漂白、脱色、除臭、卫生处理或消毒的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)选自下列的羧酸酯：

(i)一种或多种酯，所述酯具有所述结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

(ii)一种或多种具有以下结构的甘油酯

(iii)一种或多种下式的酯：

(v)(i)至(iv)的任何组合；

(2)过氧源；和

(3)权利要求7的多肽；

(c)任选地将所述过氧羧酸产物稀释；以及

(d)将所述衣物或纺织物与步骤(b)或步骤(c)中制备的所述过氧羧酸接触；

其中对所述衣物或纺织物脱色、除臭、消毒、漂白、或它们的组合。

11.过氧羧酸生成系统，所述系统包括：

(a)选自下列的底物：

(i)一种或多种酯，所述酯具有以下结构

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数目；

所述一种或多种酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

(ii)一种或多种具有以下结构的甘油酯

(iii)一种或多种下式的酯：

(v)(i)至(iv)的任何组合；

(b)过氧源；和

(c)权利要求7的多肽。

12.制剂，所述制剂包含：

(a)包含酶催化剂和羧酸酯的第一混合物，所述酶催化剂包含权利要求7的多肽，所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、三乙酰甘油酯、以及它们的混合物；所述第一混合物任选地包含无机或有机缓冲液、腐蚀抑制剂、润湿剂、或它们的组合；和

(b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选地还包含过氧化氢稳定剂。

13.制剂，所述制剂包含：

(a)包含酶催化剂和乙酰化糖的第一混合物，所述酶催化剂包含权利要求7的多肽，所述乙酰化糖选自乙酰化单糖、乙酰化二糖、乙酰化多糖、以及它们的组合，所述第一混合物任选还包含无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂和润湿剂、或者它们的组合；和

(b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选地包含过氧化氢稳定剂。