CN102239256A - 利用共溶剂进行酶催化法过酸的制备 - Google Patents

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W·R·卡希尔
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Abstract

本文公开了双组分酶法过酸生成系统以及此类系统的使用方法，其中所述第一组分包含由至少一种具有过水解活性的酶催化剂、羧酸酯底物和共溶剂组成的制剂，并且其中所述第二组分包含在过氧源的水溶液。所述两种组分混合可生成可用作如消毒剂或漂白剂的含水过酸制剂。具体地讲，有机共溶剂用于控制含底物组分的粘度，并提高所述底物在含水反应制剂中的溶解度，而不会使所述酶催化剂实质上丧失过水解活性。

Description

利用共溶剂进行酶催化法过酸的制备
相关申请的交叉引用
本专利申请要求均于2008年10月3日提交的美国临时申请61/102,505、61/102,512、61/102,514、61/102,520、61/102,531和61/102,539的优先权，它们都以引用方式全文并入本文。
发明领域
下文涉及利用多组分系统进行酶催化法过酸合成和原位酶催化领域。具体地讲，提供了利用酶的过水解活性和多组分系统(即，在本发明的背景下，涉及利用至少两种在期望的反应时间前分开贮存的反应组分进行过氧羧酸制备的系统)进行过氧羧酸制备和有效递送的方法，其中酶在结构上归类为属于糖酯酶CE-7家族，而该家族包括先锋霉素乙酰基水解酶(CAH，E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE，E.C.3.1.1.72)。针对以下用途，能以足够有效的浓度制备至少一种过氧羧酸：表面消毒或卫生处理、医疗器械灭菌、食品加工设备灭菌，以及适用于衣物洗涤护理应用如消毒、漂白、脱色、除臭、和卫生处理。
发明背景
过酸组合物已报道是有效的抗微生物剂。针对不希望有的微生物生长，对硬质表面、肉制品、活植物组织和医疗设备进行清洁、消毒、和/或卫生处理的方法已有所描述(如美国专利6,545,047、美国专利6,183,807、美国专利6,518,307、美国专利5,683,724、和美国专利申请公布2003/0026846)。过酸可用于制备衣物洗涤剂所用的漂白组合物也有所报道(美国专利3,974,082、美国专利5,296,161、和美国专利5,364,554)。
过氧羧酸可通过羧酸烷基酯和过氧化物试剂，例如过氧化氢的化学反应制备(参见“Organic Peroxides”，Daniel Swern编辑，第1卷，第313-516页；Wiley Interscience，New York，1971)。然而，在弱碱性至酸性pH值(约8至约4)条件下，反应通常不能足够快地进行，以至于不能制备出适于许多商业消毒和/或漂白应用的过氧羧酸浓度。
克服过氧羧酸化学法制备缺点的一种方法是使用具有过水解活性的酶催化剂。美国专利申请11/638,635以及美国专利申请公布2008/0176783、2008/0176299、和2009/0005590(授予DiCosimo等人)公开了在结构上归类为糖酯酶CE-7家族的成员(如先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[AXE])的酶，它们的特征在于具有显著的过水解活性，可将羧酸酯转化(在合适的过氧源存在下，如过氧化氢)为过氧羧酸，浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂。已证实，糖酯酶CE-7家族的一些成员具有足够的过水解活性，一旦将反应组分混合后，能在1分钟内由一元醇、二醇和甘油的乙酰酯生成4000至5000ppm的过乙酸，并在5分钟至30分钟内生成高达9000ppm的过乙酸(DiCosimo等人，U.S.2009/0005590)。在各引用的专利申请公布中，DiCosimo等人描述的酶催化法过酸生成系统可基于多反应组分的使用，这些反应组分在需要形成过酸溶液前保持分离。
据观察，当使用包含第一酶催化剂/底物组分和第二组分(含有水性过氧源)的多组分系统时，一种或多种不溶于水或部分不溶于水底物的使用会在混合两种组分后导致至少以下三种情况，它们会影响有效地制备和递送过氧羧酸产物的能力：首先，酶催化剂/底物组分的粘度会过高，而不能与含有过氧源的第二组分有效地混合，这会降低过氧羧酸的生成速率；其次，酶催化剂/底物组分的粘度会过高，而不能以某些方式递送包含酶催化剂/底物组分与过氧源的混合物的产物，如不能通过喷雾方式递送；第三，与在水溶液中含有过氧源的第二组分混合后，酶/底物组分中底物的溶解速率过低，而不能获得令人满意的过氧羧酸生成速率。在需要按特定的比率使用含有水性过氧源的组分与含有酶催化剂/底物的组分时，这些问题也会变得明显。就此而论，涉及在进行所需时间的反应前对具有过水解活性的酶催化剂和底物与过氧源分开贮藏的商用多组分系统仍无法用于某些应用。
需要解决的问题是提供一种在使用多组分生成系统时通过酶催化法制备过酸的方法，该系统的特征在于具有至少一种第一组分，其包含羧酸酯底物和酶催化剂制剂，该酶催化剂包含具有过水解活性的CE-7糖酯酶，其中羧酸酯底物(1)部分或基本上不溶于含水基质，和/或(2)缓慢溶于含水反应基质和/或(3)具有不利于在某些商业应用(如使用双室喷雾瓶，其设计用于混合两种具有不同粘度和/或溶解度的液体组分)中实现方便混合的粘度；并且该系统的特征还在于具有至少一种第二组分，其包含具有过氧源的水溶液(如过氧化氢的含水制剂)。
发明概述
通过提供过酸的酶催化法制备方法和系统，上述问题已得到解决，该方法包括在两组分系统的第一组分中使用至少一种共溶剂，其中所述第一组分为羧酸酯和至少一种酶催化剂的基本上无水的制剂，所述至少一种酶催化剂包含具有过水解活性的CE-7糖酯，其中加入所述至少一种共溶剂可改善第一组分的粘度以便在两组分系统中递送和混合，并允许根据需要调整第一组分的体积，以便按所需的两组分比率与第二组分混合，以及在与含水第二组分(即提供过氧源的含水制剂)混合以形成含水过酸制剂时可提高第一组分的溶解度和/或溶解速率。
据发现，加入含log P小于约2的有机溶剂的共溶剂，按可通过常规的或换句话讲适于消费品、工业、和医疗背景的方法进行递送的形式，解决了前述会影响过氧羧酸产物有效制备和递送能力的情况，其中log P定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为log P＝log[[溶质]辛醇/[溶质]水]，。优选地，制剂中的共溶剂是惰性的、无反应性的，并可与羧酸酯底物混溶，其中共溶剂不是所述酶催化剂的底物。优选地，共溶剂是一种有机醇，其不含可发生酶催化过水解的酯基。如本文所用，“醇”是含有至少一个羟基部分的分子。优选地，在混合或接触多组分系统的组分后，共溶剂在其终浓度下也是可溶的。然而，据报道，在log P小于约2的有机溶剂中的生物催化通常会对酶的活性产生不利影响(例如，通过使酶组分失活(参见例如C.Laane等人，Biotechnol.Bioeng.30：81-87(1987)以及Cowan，D.A.和Plant，A.，Biocatalysis in Organic Phase Systems，Biocatalysis at  Extreme Temperatures第7章，Kelly，R.W.W.和Adams，M.编辑，Amer.Chem.Soc.Symposium Series，Oxford University Press，New York，NY，第86-107页(1992))。因此，通过加入包含醇的共溶剂，将带来出乎意料的积极效果。本发明方法和系统的这些和其他有益效果将在下文中更全面地讨论。
在一个实施方案中，提供了一种制备过氧羧酸的方法，包括
(a)提供第一组分，所述第一组分包含：
(i)羧酸酯底物；
(ii)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有糖酯酶家族7(CE-7)特征基序的酶，所述特征基序通过CLUSTALW与SEQ ID NO：2比对，并包含；
(1)与SEQ ID NO：2的118至120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；
(2)与SEQ ID NO：2的179至183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；和
(3)与SEQ ID NO：2的298至299对应的氨基酸位置处的HE基序；
所述酶包含与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性；以及
(iii)至少一种共溶剂，所述共溶剂包含log P小于约2的有机溶剂，其中log P定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P＝[溶质]辛醇/[溶质]水，并且其中所述至少一种共溶剂不是所述酶催化剂的底物；
其中所述第一组分为(i)至(iii)的基本上无水的混合物；
(b)提供第二组分，所述第二组分包含过氧源的水溶液；以及
(c)将所述第一组分和所述第二组分混合以形成含水的反应混合物，
其中所述共溶剂使含水反应混合物中的羧酸酯底物溶解，而不会使酶催化剂实质上丧失过水解活性，从而制备过氧羧酸。
在另一方面，提供了一种表面消毒的方法，其包括实施上述方法，还包括将所述含有过氧羧酸的含水反应混合物施用到表面上以进行消毒或漂白的步骤。
在另一方面，提供了一种处理衣物的方法，其包括实施上述方法，还包括将所述含有过氧羧酸的含水反应混合物施用于衣物以进行漂白、脱色、除臭、卫生处理、消毒、或其组合的步骤。
本发明的另一方面是一种用于制备过氧羧酸的多组分系统，包括
(a)提供第一组分，所述第一组分包含：
(i)羧酸酯底物；
(ii)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有CE-7特征基序的酶，所述特征基序通过CLUSTALW与SEQ ID NO：2比对，并包含；
(1)与SEQ ID NO：2的118至120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；
(2)与SEQ ID NO：2的179至183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；和
(3)与SEQ ID NO：2的298至299对应的氨基酸位置处的HE基序；
所述酶包含与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性；以及
(iii)至少一种共溶剂，所述共溶剂包含log P小于约2的有机溶剂，其中log P定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P＝[溶质]辛醇/[溶质]水，并且其中该共溶剂不是所述酶催化剂的底物；
其中所述第一组分为(i)至(iii)的基本上无水的混合物；以及
(b)提供第二组分，所述第二组分包含过氧源的水溶液；
其中混合所述第一组分和所述第二组分以制备包含过氧羧酸的含水反应混合物，并且其中所述共溶剂使含水反应混合物中的羧酸酯底物溶解，而不会使酶催化剂实质上丧失过水解活性。
用于分离和组合本文所述的第一和第二组分的多组分包装/递送系统的设计通常将取决于各反应组分的物理形式。在一个实施方案中，可使用任何适于液-液体系的递送系统。在另一个实施方案中，本发明的两组分过酸生成系统包括含有本发明的第一组分的第一容器和含有本发明的第二组分的第二容器。举例来说，容器和/或包装系统的典型实例可包括单独的瓶子、单独的瓶子包装成的单个套件、双室分配瓶(如挤压瓶、喷雾瓶等)、刚性或非刚性双室分配包、单独的包、以及可溶性或可降解性双室分配包(参见美国专利4,678,103、4,585,150、6,223,942、5,954,213、6,758,411、5,862,949、5,398,846、6,995,125、和6,391,840，已公布的美国专利申请2005/0139608和2002/0030063，以及PCT公开WO00/61713、WO02/22467、和WO2005/035705)。在一个实施方案中，递送系统为双室喷雾瓶。
在另一个实施方案中，酶催化剂包含选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、和SEQ ID NO：74的氨基酸序列或通过所述氨基酸序列一个或多个氨基酸的置换、删除、和增加得到的具有过水解酶活性的基本上类似的酶。
在另一个实施方案中，所述具有过水解酶活性的基本上类似的酶包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、和SEQ ID NO：74的一种或多种氨基酸序列至少30％、优选地至少33％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至还更优选地至少70％、甚至还更优选地至少80％，甚至还更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
在一个方面，用于本发明方法和多组分系统的羧酸酯底物选自：
(a)一种或多种具有下列结构的酯
[X]mR5
其中
X为由式R6C(O)O表示的酯基；
R6为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链、
支链或环状烃基部分，其中R6任选地包含一个或多个醚键，
其中R6为C2至C7；
R5为任选地由羟基取代的C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其中R5中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基，并且其中R5任选地包含一个或多个醚键；
m为1至R5中的碳原子数，
在25℃下，所述一种或多种酯在水中具有至少5ppm的溶解度；
(b)一种或多种具有下列结构的甘油酯
Figure BPA00001382618200071
其中R1为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；
(c)一种或多种由下式表示的酯
Figure BPA00001382618200072
其中R1为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R2为C1至C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2O)n、或(CH2CH(CH3)-O)nH，并且n为1至10；
(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；以及
(e)(a)至(d)的任意组合；
在一个实施方案中，羧酸酯底物选自：甘油一乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、三-O-乙酰基-葡萄烯糖、丙二醇二乙酸酯、乙二醇二乙酸酯，1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯，以及它们的混合物。在另一个实施方案中，底物选自丙二醇二乙酸酯、乙二醇二乙酸酯、以及它们的混合物。在另一个实施方案中，底物优选地包含甘油三乙酸酯。
除非另外指明，否则特定实施方案的公开内容同样适用于：本发明以多组分系统制备过氧羧酸的方法、本发明的表面消毒方法、本发明的多组分制剂组合物、以及本发明的过氧羧酸生成系统。
在另一方面，本发明的方法和系统也可用于衣物洗涤护理应用，以产生有益效果，包括但不限于漂白、脱色、除臭、和卫生处理。
附图简述
图1、表A至F示出了若干种酶的CLUSTALW比对(1.83版)结果，这些酶在结构上归类为糖酯酶家族7的成员，包括SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、54、60、64、68、72、73、和74。所有酶共有的保守基序(下划线)共同形成CE-7糖酯酶的特征基序(参见Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003)和授予DiCosimo等人的美国专利申请公布2008/0176783)。可用于进一步表征CE-7酶家族成员的附加基序以下划线和粗体标出(即LXD基序)。
生物序列简述
下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”)，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization，WIPO)标准ST.25(1998)、欧洲专利公约(European Patent Convention，EPC)序列表要求、专利合作条约(Patent Cooperation Treaty，PCT)细则5.2和49.5(a-bis)、以及行政指令(Administrative Instructions)第208节和附录C。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC
Figure BPA00001382618200081
31954TM先锋霉素C脱乙酰酶(cah)编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：2是枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200082
31954TM先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是枯草芽孢杆菌枯草亚种168(B.subtilis subsp.subtilis str.168)先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：4是枯草芽孢杆菌枯草亚种168先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列，并且与枯草芽孢杆菌BE1010先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列具有同一性。
SEQ ID NO：5是枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200091
6633TM先锋霉素乙酰酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：6是枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200092
6633TM先锋霉素乙酰酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC
Figure BPA00001382618200093
14580TM先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：8是地衣芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200094
14580TM先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是短小芽孢杆菌(B.pumilus)PS213乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：10是短小芽孢杆菌PS213乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC
Figure BPA00001382618200095
27405TM乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：12是热纤梭菌ATCC
Figure BPA00001382618200096
27405TM乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：14是那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：16是海栖热袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SL YS485乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：18是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SL YS485乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：19是编码芽孢杆菌属(Bacillus sp)NRRL B-14911先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列，如GENBANK
Figure BPA00001382618200101
登录号ZP_01168674中所报告。然而，该报告的序列似乎具有在N端增加的15个氨基酸，根据与其他先锋霉素C脱乙酰酶的序列比对，以及根据报告长度(340个氨基酸)与其他CAH酶的观测长度(通常为318至325个氨基酸)的比较，该序列可能不正确。
SEQ ID NO：20是芽孢杆菌属NRRL B-14911先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列，无GENBANK
Figure BPA00001382618200102
登录号ZP_01168674下报告的N-端的15个氨基酸。
SEQ ID NO：21是耐盐嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：22是耐盐嗜碱芽孢杆菌C-125先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：23是克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：24是克劳氏芽孢杆菌KSM-K16先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：25是克隆进pSW190的枯草芽孢杆菌ATCC 29233TM先锋霉素C脱乙酰酶(cah)基因的核酸序列。
SEQ ID NO：26是枯草芽孢杆菌ATCC29233TM先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：27和28是用于PCR扩增那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶编码区(GENBANK
Figure BPA00001382618200104
U58632)的引物，用以构建pSW196。
SEQ ID NO：29是质粒pSW196中密码子优化型那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO：30是卡那霉素抗性基因(kan)的核酸序列。
SEQ ID NO：31是质粒pKD13的核酸序列。
SEQ ID NO：32和33是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，该卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌(E.coli)MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。该产物用于破坏内源性katG基因。
SEQ ID NO：34是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，该卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。该产物用于破坏内源性katG基因。
SEQ ID NO：35是大肠杆菌MG1655中katG过氧化氢酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO：36是大肠杆菌MG1655中KatG过氧化氢酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：37是质粒pKD46的核酸序列。
SEQ ID NO：38和39是用于确认katG基因破坏的引物。
SEQ ID NO：40是质粒pCP20的核酸序列。
SEQ ID NO：41和42是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，该卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。该产物用于破坏内源性katE基因。
SEQ ID NO：43是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，该卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。该产物用于破坏内源性katE基因。
SEQ ID NO：44是大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO：45是大肠杆菌MG1655中的KatE过氧化氢酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：46和47是用于确认单敲除菌株大肠杆菌MG1655ΔkatE和双敲除菌株大肠杆菌MG1655ΔkatG ΔkatE(本文称为大肠杆菌KLP18)中katE基因破坏的引物。
SEQ ID NO：48是编码氨基酸序列SEQ ID NO：10的密码子优化型短小芽孢杆菌PS213的核酸序列。
SEQ ID NO：49是包含SEQ ID NO：2的第118至299位氨基酸残基的区域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：50是编码密码子优化型克劳氏芽孢杆菌KSM-K16先锋霉素-C脱乙酰酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：51是密码子优化的克劳氏芽孢杆菌KSM-K16先锋霉素-C脱乙酰酶编码序列的核酸序列。
SEQ ID NO：52是编码密码子优化型解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：53是密码子优化型解糖热厌氧杆菌乙酰木聚糖酯酶编码序列的核酸序列。
SEQ ID NO：54是解糖热厌氧杆菌乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列(GENBANK
Figure BPA00001382618200121
登录号S41858)。
SEQ ID NO：55是编码密码子优化型海栖热袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：56是编码密码子优化型海栖热袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶编码序列的核酸序列。
SEQ ID NO：57是编码密码子优化型Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：58是编码密码子优化型Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：59是Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：60是Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：61是编码密码子优化型Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：62是编码密码子优化型Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：63是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO：64是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：65是编码密码子优化型栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2“RQ2(a)”乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：66是编码密码子优化型栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2“RQ2(a)”乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：67是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列，本文称为“RQ2(a)”。
SEQ ID NO：68是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶(GENBANK
Figure BPA00001382618200122
登录号ACB09222)的推导氨基酸序列，本文称为“RQ2(a)”。
SEQ ID NO：69是编码密码子优化型栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2“RQ2(b)”乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：70是编码密码子优化型栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2“RQ2(b)”乙酰木聚糖酯酶编码序列的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO：71是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列，本文称为“RQ2(b)”。
SEQ ID NO：72是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶(GENBANK
Figure BPA00001382618200131
登录号ACB08860)的推导氨基酸序列，本文称为“RQ2(b)”。
SEQ ID NO：73是那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，见代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请(全文以引用方式并入本文)，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser、或Thr。
SEQ ID NO：74是海栖热袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，见代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser、或Thr。
发明详述
在多组分原位过酸消毒剂制剂的某些应用中，期望第二组分(包含含水过氧源)与第一组分(包含酶和酶底物)的比率在1∶1至10∶1的范围内，其中将10份至1份(按重量计)第二组分与1份(按重量计)第一组分混合，以制备有效消毒浓度的过酸。
通过以下发现已解决了上述问题：在多组分方法和系统(即在本发明的背景下，涉及使用在所需时间的反应前分开贮存的至少两种反应组分制备过氧羧酸的方法和系统)中，通过共溶剂的加入，过水解酶的底物可与过氧源水溶液有效地混合并令人满意地递送至(例如)表面。如本文所述，向催化剂组合物(组分A，本文也称为“第一”组分)中加入有机溶剂并从含水过氧源(组分B，本文也称为“第二”组分)中除去等体积的水，使组分B与组分A的比例在1∶1至10∶1的范围内，可制得有效消毒浓度的过酸。优选地，有机溶剂在制剂中为惰性的、非反应性的。优选地，共溶剂还可与酶底物(如甘油三乙酸酯)完全混溶。优选地，在混合后，共溶剂也可以其终浓度溶于组分A和B的混合物中。依据本发明，结构相关酶的CE-7糖酯酶家族可用于多组分系统，以生成羧酸，其浓度能高效地用于消毒和/或漂白应用，并如下文全面地描述。含有机溶剂的共溶剂可出人意料地用于提高底物在含水反应制剂中的溶解度，而不会使酶催化剂实质上丧失过水解活性。在另一方面，本发明包括用于衣物洗涤护理应用的方法和多组分系统，其中将衣物或纺织物与过酸接触，该过酸的浓度适于漂白、脱色、除臭、卫生处理、消毒、或它们的组合。
参照与构成本发明一部分的附图、序列表、和实施例相结合的以下发明详述可以更容易地理解本发明。应当理解，本发明并不限于本文所述和/或所示的具体产品、方法、条件或参数，并且本文所用术语的目的仅在于以举例的方式描述特定实施方案，并非旨在限制受权利要求书保护的本发明。
在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另外特别说明，适用下述定义。
如本文所用，在本发明的元件或组分之前的词语“一个”、“一种”旨在表明元件或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤、或组分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由…组成”和“由…组成”涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由…组成”旨在包括由术语“由…组成”涵盖的实施方案。
如本文所用，用于修饰成分或反应物数量的术语“约”指数字数量的变化，它们可能发生在，例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等等。术语“约”还包括因特定起始混合物所产生的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。
当存在时，所有的范围都包括端值以及其中的组合。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等等。
如本文所用，术语“过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸(percarboxylic acid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。
如本文所用，术语“过乙酸”缩写为″PAA″，并与过氧乙酸、乙过氧酸(ethaneperoxoic acid)以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“底物”、“合适的底物”、以及“羧酸酯底物”可互换地专指：
(a)具有以下结构的一种或多种酯
[X]mR5
其中
X为由式R6C(O)O表示的酯基；
R6为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其中R6任选地包含一个或多个醚键，其中R6为C2至C7；
R5为任选地由羟基取代的C1至C6直链、支链、或环状烃基部分，其中R5中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基，并且其中R5任选地包含一个或多个醚键；
m为1至R5中的碳原子数，
在25℃下，所述一种或多种酯在水中具有至少5ppm的溶解度；或者
(b)具有以下结构的一种或多种甘油酯
其中R1为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；或者
(c)具有下式的一种或多种酯
Figure BPA00001382618200161
其中R1为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R2为C1至C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2O)n、或(CH2CH(CH3)-O)nH，并且n为1至10；或者
(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或者
(e)(a)至(d)的任意组合。
所述羧酸酯底物的实例可包括甘油一乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、三-O-乙酰基-葡萄烯糖、丙二醇二乙酸酯、乙二醇二乙酸酯，1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯、或它们的任何组合。
如本文所用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯、和甘油单醋酸酯同义。
如本文所用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯、甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯、以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯、甘油三醋酸酯、三醋酸甘油酯、1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。
如本文所用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。
如本文所用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。
如本文所用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。
如本文所用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“乙酸乙酯”与醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登记号141-78-6的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“乳酸乙酯”与乳酸乙基酯以及CAS登记号97-64-3的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化糖类”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。实例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。
如本文所用，术语“烃基”、“烃基基团”、和“烃基部分”意指直链、支链或环状排列的碳原子，其中碳原子通过碳-碳单键、双键、或三键和/或醚键连接并且氢原子被相应取代。此类烃基基团可以是脂族的和/或芳族的。烃基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基、和苯基。在一个优选的实施方案中，烃基部分为直链、支链或环状排列的碳原子，其中碳原子通过碳-碳单键和/或醚键连接且氢原子被相应取代。
如本文所用，术语1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的“单酯”和“二酯”以及它们的混合物是指所述化合物包含至少一个由式RC(O)O表示的酯基，其中R为C1至C7直链烃基部分。在一个实施方案中，羧酸酯底物包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二乙酸酯(EDGA)或它们的混合物。
如本文所用，术语“丙二醇二乙酸酯”与1，2-二乙酰氧基丙烷、丙二醇二醋酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯以及CAS登记号623-84-7的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“乙二醇二乙酸酯”与1，2-二乙酰氧基乙烷、乙二醇二醋酸酯、二醋酸乙二酯以及CAS登记号111-55-7的所有其他同义词同义。
如本文所用，术语“合适的酶催化反应混合物”、“适于原位生成过酸的组分”、“合适的反应组分”、“合适的含水反应混合物”、和“反应混合物”是指反应物和酶催化剂在其中发生接触的材料和水。本文提供了合适的含水反应混合物的组分，并且本领域技术人员应当理解适于本发明方法的组分变化范围。在一个实施方案中，合适的酶催化反应混合物在反应组分混合后原位生成过酸。就此而论，反应组分可以作为其中反应组分在使用前仍保持分开的多组分系统提供。用于使多种活性组分分开与混合的系统和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于各反应组分的物理形式。例如，多活性流体(液-液)系统通常使用多室分配瓶或两相系统(如美国专利申请公布2005/0139608、美国专利5,398,846、美国专利5,624,634、美国专利6,391,840、欧洲专利0807156B1、美国专利申请公布2005/0008526、和PCT公开WO 00/61713)，例如存在于某些漂白应用中，其中所需的漂白剂在将反应流体混合后制成。用于生成过酸的其他形式的多组分系统可包括但不限于，设计用于一种或多种固体组分或固-液组分组合的那些，例如粉末(如美国专利5,116,575)、多层片(如美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(如美国专利6,995,125)和在加水后反应的固体附聚物(如美国专利6,319,888)。
在多组分系统中，活性组分最初在一种或多种相应组分中彼此分开，然后进行组合以形成反应制剂。多组分系统会面临一些问题，例如活性组分不能令人满意地组合，一种或多种组分的活性被中和或减弱，和/或反应制剂的形成不能与递送要求相容。例如，在包含至少一种组分的下述多组分系统中，其中所述至少一种组分包含酶和此酶的底物，所述底物不溶于或部分不溶于含水第二组分，可能会出现以下至少三种情况，它们会影响有效地制备和递送过氧羧酸产物的能力：首先，酶/底物组分的粘度会过高，而不能与含有过氧源的第二组分有效地混合，这会降低过氧羧酸的生成速率；其次，酶/底物组分的粘度会过高，而不能以某些方式递送包含酶/底物组分与过氧源的混合物的产物，如不能通过喷雾方式递送；第三，与在水溶液中含有过氧源的第二组分混合后，酶/底物组分中底物的溶解速率过低，而不能获得令人满意的过氧羧酸生成速率。在需要按特定的比率使用含有水性过氧源的组分与含有酶/底物的组分时，这些问题也会变得明显。
本领域的技术人员熟知的是，无论将酶直接悬浮于有机溶剂中时，还是使用可混溶的有机/水单相溶剂时，有机溶剂都会对酶的活性有害。在两篇已发表的文献中综述了有机溶剂对酶活性和结构的影响，它们是：(a)C.Laane等人，上文和(b)D.A.Cowan和A.R.Plant，上文。Cowan和Plant指出(第87页)，本领域普遍认为，在有机相体系中使用log P≤2的有机溶剂来稳定胞内酶几乎没有意义，其中将log P定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P＝[溶质]辛醇/[溶质]水。log P介于2和4之间的有机溶剂可根据酶的稳定性视情况使用，而那些log P＞4的有机溶剂一般可用于有机相体系。
Cowan和Plant还指出(第91页)：溶于单相有机-水溶剂中的酶的直接暴露影响取决于溶剂浓度、溶剂/酶表面基团相互作用、以及溶剂/酶水化层相互作用。因为溶剂的log P值必须足够低，使得溶剂可完全与水相混溶以形成单相，因此，含有低log P值有机溶剂的单相有机-水溶剂通常会对酶的稳定性产生负面影响(在低有机溶剂浓度应用中除外)。因此，通常认为在除了不切实际的低浓度以外的任何条件下，具有低log P值的有机溶剂对酶的稳定性都是有害的。
据报道，甘油三乙酸酯的log P值为0.25(Y.M.Gunning等人，J.Agric.Food Chem.48：395-399(2000))，与乙醇(log P-0.26)和异丙醇(logP 0.15)的log P值类似(Cowan和Plant)；因此在甘油三乙酸酯中贮藏酶粉预计会导致不可接受的酶活性损失，使用log P＜2的附加共溶剂也一样，这些共溶剂如环己酮，log P＝0.94(Cowan和Plant)；1，2-丙二醇，log P＝-1.41(Gunning等人)；1，3-丙二醇，log P＝-1.3(S-J.Kuo等人，J.Am.Oil Chem.Soc.73：1427-1433(1996))；二乙二醇丁醚，logP＝0.56(N.Funasaki等人，J.Phys.Chem.88：5786-5790(1984))；三乙二醇，log P＝-1.75(L.Braeken等人，ChemPhysChem 6：1606-1612(2005))。根据上述Cowan和Plant的教导，预计上列具有低log P值的溶剂无法在使酶不失活的情况下包含在多组分系统的含酶第一组分中(无论是将第一组分与含过氧源水溶液的第二组分混合前还是混合后)。
然而，令人意外地发现了，加入含有log P小于约2的有机溶剂的共溶剂，可在帮助水溶性较差的酶底物溶解方面发挥作用和/或可作为组分A的稀释剂，以使得组分A和B按所需的比率混合。换句话讲，共溶剂按可通过消费、工业、和医疗背景常规的(或换句话讲适于的)方法进行递送的形式来解决影响有效制备和递送过氧羧酸产物能力的情况(如酶/底物组分不可接受的高粘度、该组分与过氧源水溶液难以混合
在本文所述的方法和系统中，含有log P小于约2的有机溶剂的共溶剂(其中log P定义为物质在辛醇与水之间分配系数的对数，所述分配系数表示为P＝[溶质]辛醇/[溶质]水)在酶催化剂的过水解活性无明显损失的情况下使底物溶于含水反应制剂中；其中共溶剂不是所述酶催化剂的底物。
在一些实施方案中，含有酶催化剂和羧酸酯底物制剂的第一组分任选地包含无机或有机缓冲剂、稳定剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、或它们的组合。在一些实施方案中，过氧源包含过氧化氢稳定剂。
如本文所用，将术语“过水解(perhydrolysis)”定义为所选底物与过氧化物形成过酸的反应。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以生成过酸。如本文所用，术语“化学过水解”包括其中将底物(即过酸前体)与过氧化氢源组合的过水解反应，其中过酸在无酶催化剂的条件下形成。
如本文所用，术语“过水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)的蛋白、细胞干重或固定化催化剂重量所具有的催化剂活性。
如本文所用，将“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或″U″定义为：在指定的温度下，每分钟产生1μmol过酸产物所需的过水解酶活性的量。
如本文所用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有过水解活性的酶的催化剂，并且其形式可以是完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯化的酶。酶催化剂也可被化学改性(如通过聚乙二醇化作用，或与交联试剂反应)。过水解酶催化剂也可通过本领域技术人员熟知的方法固定到可溶性或不溶性支持体上；参见例如，“Immobilization of Enzymes and Cells”；Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。如本文所述，具有过水解活性的本发明的所有酶在结构上都是酶的糖酯酶家族7(“CE-7”家族)的成员(参见Coutinho，P.M.、Henrissat，B.，“Recent Advances inCarbohydrate Bioengineering”中的“Carbohydrate-active enzymes：anintegrated database approach”，H.J.Gilbert、G.Davies、B.Henrissat和B.Svensson编辑，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，第3-12页)。当与过氧源组合时，已证实酶的CE-7家族尤其能有效地由多种羧酸酯底物制备过酸(参见授予DiCosimo等人的PCT公开WO2007/070609以及美国专利申请公布2008/0176299、2008/176783、和2009/0005590；它们均以引用方式并入本文)。
CE-7家族的成员包括先锋霉素C脱乙酰酶(CAH，E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE，E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共有一种保守的特征基序(Vincent等人，上文)。包含CE-7特征基序和/或基本上类似结构的过水解酶都适用于本发明。用于鉴定基本上类似的生物分子的方法在本领域为人们所熟知(如序列比对方案、核酸杂交、和/或保守特征基序的存在)。在一个方面，本发明方法和系统中的酶催化剂包含与本文所提供的序列具有以下氨基酸同一性的基本上类似的酶：至少30％、优选地至少33％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至还更优选地至少70％、甚至还更优选地至少80％，甚至还更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。本发明还提供了编码本发明的CE-7糖酯酶的核酸分子。在另一个实施方案中，可用于本发明方法和系统的过水解酶催化剂由核酸分子编码，该核酸分子可在高严格条件下与本发明的一种核酸分子杂交。
如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰基水解酶”是指催化先锋霉素类抗生素例如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸脱乙酰化的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，(1995)Appl.Env.Microbiol.61(6)：2224-2229)。如本文所述，提供了具有明显过水解活性的若干种先锋霉素C脱乙酰酶。
如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰化木聚糖和其他乙酰化糖类脱乙酰化的酶(E.C.3.1.1.72，AXE)。如本文所述，提供了具有明显过水解酶活性的归类为乙酰木聚糖酯酶的若干种酶。
如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200221
31954TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC
Figure BPA00001382618200222
)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC31954TM。据报道，枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200224
31954TM具有酯水解酶(″diacetinase″)活性，能够水解具有2个碳原子至8个碳原子酰基的甘油酯，特别是甘油二乙酸酯(美国专利4,444,886，全文以引用方式并入本文)。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌ATCC31954TM中分离出了具有明显过水解酶活性的酶，并以SEQ ID NO：2提供。分离出的酶的氨基酸序列具有与GENBANK
Figure BPA00001382618200226
登录号BAA01729.1(Mitsushima等人，上文)提供的先锋霉素C脱乙酰酶100％的氨基酸同一性。
如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌BE1010”是指枯草芽孢杆菌菌株，如Payne和Jackson所报道(J.Bacteriol.173：2278-2282(1991))。枯草芽孢杆菌BE1010衍生自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株BR151(ATCC
Figure BPA00001382618200227
33677TM)，在编码枯草杆菌蛋白酶和中性蛋白酶的基因中具有染色体缺失。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌BE1010中分离出了具有明显过水解酶活性的酶，并以SEQ ID NO：4提供。分离出的酶的氨基酸序列具有与在枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168中报道的先锋霉素C脱乙酰酶100％的氨基酸同一性(Kunst等人，Nature390：249-256(1997))。
如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200228
29233TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC
Figure BPA00001382618200229
)的枯草芽孢杆菌菌株，其国际保藏登录号为ATCC
Figure BPA000013826182002210
29233TM。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA000013826182002211
29233TM中分离出了具有明显过水解酶活性的酶并进行了测序，并且以SEQ IDNO：26提供。
如本文所用，术语“热纤梭菌ATCC
Figure BPA000013826182002212
27405TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的热纤梭菌菌株，其国际保藏登录号为ATCC
Figure BPA000013826182002214
27405TM。来自热纤梭菌ATCC
Figure BPA000013826182002215
27405TM并具有过水解酶活性的氨基酸序列以SEQ ID NO：12提供。
如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA000013826182002216
6633TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC
Figure BPA00001382618200231
)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC
Figure BPA00001382618200232
6633TM。据报道，枯草芽孢杆菌ATCC6633TM具有先锋霉素乙酰水解酶活性(美国专利6,465,233)。来自枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200234
6633TM并具有过水解酶活性的氨基酸序列以SEQ ID NO：5提供。
如本文所用，术语“地衣芽孢杆菌ATCC14580TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC
Figure BPA00001382618200236
)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC
Figure BPA00001382618200237
14580TM。据报道，地衣芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200238
14580TM具有先锋霉素乙酰水解酶活性(GENBANKYP_077621)。来自地衣芽孢杆菌ATCC
Figure BPA000013826182002310
14580TM并具有过水解活性酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：8提供。
如本文所用，术语“短小芽孢杆菌PS213”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK
Figure BPA000013826182002311
AJ249957)。来自短小芽孢杆菌PS213并具有过水解酶活性的氨基酸序列以SEQ ID NO：10提供。
如本文所用，术语“那不勒斯栖热袍菌”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的那不勒斯栖热袍菌菌株(GENBANK
Figure BPA000013826182002312
AAB70869)。来自那不勒斯栖热袍菌并具有过水解活性酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：14提供。最近报道，衍生自SEQ ID NO：14的变体酶具有改善的过水解活性，其以SEQ ID NO：73提供(参见代理人档案号为CL4392 USNA、名称为“IMPROVED PERHYDROLASES FOR ENZYMATICPERACID GENERATION”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请；全文以引用方式并入本文)，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser、或Thr。
如本文所用，术语“海栖热袍菌MSB8”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的海栖热袍菌菌株(GENBANKNP_227893.1)。来自海栖热袍菌并具有过水解酶活性的氨基酸序列以SEQ ID NO：16提供。最近报道，衍生自SEQ ID NO：16的变体酶具有改善的过水解活性，其以SEQ ID NO：74提供(参见代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请)，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser、或Thr。
如本文所用，术语“克劳氏芽孢杆菌KSM-K16”是指据报道具有先锋霉素-C脱乙酰酶活性的一种细菌细胞(GENBANKYP_175265)。来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16并具有过水解酶活性的氨基酸序列以SEQ ID NO：24提供。
如本文所用，术语“解糖热厌氧杆菌”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌菌株(GENBANK
Figure BPA00001382618200241
S41858)。来自解糖热厌氧杆菌并具有过水解酶活性的氨基酸序列以SEQ ID NO：54提供。
如本文所用，术语“Thermotoga lettingae”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANKCP000812)。来自Thermotoga lettingae并具有过水解酶活性的推导氨基酸序列以SEQ IDNO：60提供。
如本文所用，术语“Thermotoga petrophila”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK
Figure BPA00001382618200243
CP000702)。来自Thermotoga lettingae并具有过水解酶活性的推导氨基酸序列以SEQ IDNO：64提供。
如本文所用，术语“栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK
Figure BPA00001382618200244
CP000969)。
已从栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2中鉴定出了两种不同的乙酰木聚糖酯酶，本文称之为“RQ2(a)”(以SEQ ID NO：68提供的推导氨基酸序列)和“RQ2(b)”(以SEQ ID NO：72提供的推导氨基酸序列)。
如本文所用，“分离的核酸分子”和“分离的核酸片段”将可以互换使用，并指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离型核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示特定的氨基酸：
Figure BPA00001382618200245
Figure BPA00001382618200251
如本文所用，“基本上类似”是指下述核酸分子，其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸的增加、置换、或缺失，但不影响DNA序列编码蛋白的功能性质(即过水解活性)。如本文所用，“基本上类似”也指下述酶，其具有的氨基酸序列至少30％、优选地至少33％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％，甚至还更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与本文报道的序列具有同一性，其中所得的酶保留了本发明的功能性质(即过水解活性)。“基本上类似”还可以指核酸分子编码的具有过水解活性的酶，所述核酸分子能在高严格条件下与本文报道的核酸分子杂交。因此，应当理解，本发明不仅仅涵盖特定的示例性序列。
例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸但不影响编码蛋白的功能性质的基因改变是常见的。出于本发明的目的，将置换定义为以下五组之一中的互换：
1.小脂族、非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；
2.极性、带负电的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
3.极性、带正电的残基：His、Arg、Lys；
4.大脂族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及
5.大芳族残基：Phe、Tyr、和Trp。
因此，氨基酸中丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基置换为另一个带负电的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电的残基置换为另一个带正电的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变预计也可以产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化也预计不会改变蛋白的活性。
所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。此外，技术人员将认识到本发明涵盖了基本上类似的序列。在一个实施方案中，将基本上类似的序列定义为它们在高严格条件下(0.1X SSC、0.1％SDS、65℃处理，再用2X SSC、0.1％SDS洗涤，最后用0.1X SSC、0.1％SDS、65℃处理)能够与本文的示例性序列杂交。在一些实施方案中，本发明的方法和系统可包含具有过水解酶活性的酶，该酶由分离的核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下可与本文报道的核酸分子杂交。在优选的实施方案中，本发明的方法和系统使用具有过水解酶活性的酶，该酶由分离的核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下可与具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、和SEQ ID NO：71的核酸序列的核酸分子杂交。
如本文所用，一个核酸分子可与另一个核酸分子(例如cDNA、基因组DNA、或RNA)杂交是指在适当的温度和溶液离子强度条件下，第一分子的单链可与其他分子退火。杂交和洗涤条件为人们所熟知，并在Sambrook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor(2001)中有所示例。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可调整严格条件来筛选中度类似的分子，例如来自远缘生物的同源序列；与高度类似的分子，例如来自近缘生物的复制功能酶的基因。杂交后洗涤通常决定了严格条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。一组更优选的条件使用更高的温度，其中洗涤步骤与上述步骤相同，不同的是将最后两次用0.2X SSC、0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到了60℃。另一组优选的严格杂交条件为：用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下处理，然后用2X SSC、0.1％SDS洗涤，最后用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤本文的示例性序列。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域中熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm值)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导出了用于计算Tm的公式(Sambrook和Russell，上文)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，而且寡核苷酸的长度确定了其特异性(Sambrook和Russell，上文)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸，更优选地为至少约20个核苷酸，甚至更优选地为至少30个核苷酸，甚至更优选地为至少300个核苷酸，最优选地为至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
如本文所用，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较而确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类序列串之间的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知的方法容易地计算，包括但不限于以下文献中所述的方法：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing： Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic Press，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data第I部分(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in  Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)StocktonPress，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可通过LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics第16卷第6期，第276-277页(2000))进行。多重序列比对可通过CLUSTAL比对法(例如CLUSTALW；如1.83版)使用默认参数进行(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，NucleicAcids Res.22：4673-4680(1994)；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res 31(13)：3497-500(2003)，可通过European Bioinformatics Institute得自European Molecular Biology Laboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAP Existence penalty＝15、GAP extension＝0.2、matrix＝Gonnet(如Gonnet250)、protein ENDGAP＝-1、Protein GAPDIST＝4、和KTUPLE＝1。在一个实施方案中，以默认设置使用快速或慢速比对，其中慢速比对是优选的。作为另外一种选择，可将使用CLUSTALW法(1.83版)的参数修改为也使用KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝10、GAPextension＝1、matrix＝BLOSUM(如BLOSUM64)、WINDOW＝5、和TOP DIAGONALS SAVED＝5。
在本发明方法和系统的一个方面，合适的分离型核酸分子(本发明的分离型多核苷酸)编码下述多肽，其具有的氨基酸序列至少约30％、优选地至少33％、优选地至少40％、优选地至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％与本文报道的氨基酸序列具有同一性。本发明的合适的核酸分子不仅具有上述同源性，而且还通常编码具有约300至约340个氨基酸、更优选约310至约330个氨基酸、并且最优选约318至约325个氨基酸长度的多肽。
如本文所用，术语“特征基序”和“标签基序”是指具有定义活性的酶家族共有的保守结构。特征基序可用于定义和/或鉴定对限定的底物家族具有类似酶活性的、在结构上相关的酶家族。特征基序可以是单个邻接的氨基酸序列，或者可以是一起形成所述特征基序的非邻接保守基序的集合。通常，保守基序以氨基酸序列表示。如本文所述，本发明的过水解酶属于CE-7糖酯酶家族。该酶家族可通过CE-7“特征基序”的存在而定义(Vincent等人，上文)。
如本文所用，“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本发明涉及编码全部或大部分氨基酸序列的任何核酸分子，其中所述氨基酸序列编码本发明的微生物多肽。技术人员非常了解特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
如本文所用，术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体典型的密码子使用情况。
如本文所用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。将这些基本单位连接、退火以形成基因片段，然后进行酶催化法组装以构建整个基因。“化学合成”涉及DNA序列时是指将核苷酸组分在体外组装。可以采用完善建立的方法来完成DNA的人工化学合成，或者可使用许多可商购获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于核苷酸序列的优化以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。
如本文所用，“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指天然基因之外的任何基因，其包含非天然一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含得自不同来源的调控序列和编码序列，或者得自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物内。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。
如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
如本文所用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。在大部分时间下都可导致基因表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
如本文所用，“3′非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括多腺苷酸化识别序列(通常限于真核细胞)以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多腺苷酸化信号的特征通常在于影响多腺苷酸片(通常限于真核细胞)往mRNA前体3′端的添加。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“表达”是指源于本文描述的核酸分子的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，“转化”是指将核酸分子转移至宿主生物的基因组内，导致基因稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。
如本文所用的，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带有不属于细胞中央代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是任何来源的自主复制的序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中将许多核苷酸序列连接或重组成独特的构造，该构造能将选定基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3′未翻译序列一起引入细胞。“转化盒”是指包含外源基因并且除外源基因外还具有可促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”是指包含外源基因并且除外源基因外还具有可增强该基因在外源宿主中表达的元件的特定载体。
如本文所用，术语“序列分析软件”是指可用于核苷酸或氨基酸序列分析的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)、和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI 53715USA)、CLUSTALW(例如，1.83版；Thompson等人，Nucleic Acids Research，22(22)：4673-4680(1994))、以及包括Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，会议日期1992年，111-20。编辑：Suhai、Sandor。出版商：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本专利申请的背景下，应当理解，将序列分析软件用于分析时，分析的结果将基于提及程序的“默认值”，除非另外指明。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最初加载的任何值或参数集。
如本文所用，术语“生物污染物”是指一种或多种不需要的和/或病原性的生物实体，包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒、以及它们的混合物。本发明的方法可制备有效浓度的至少一种过氧羧酸，用于减少和/或消除活体生物污染物的存在。在一个优选的实施方案中，生物污染物为活体病原性微生物。
如本文所用，术语“消毒”是指破坏或防止生物污染物生长的方法。如本文所用，术语“消毒剂”是指通过破坏、中和、或抑制生物污染物的生长而消毒的试剂。如本文所用，术语“消毒处理”是指消毒的行为或过程。通常，将消毒剂用于处理无生命的物体或表面。如本文所用，术语“防腐剂”是指抑制带病生物污染物(例如微生物)生长的化学试剂。在本发明方法和系统的一个方面，生物污染物为病原性微生物。
如本文所用，术语“卫生的”意指或涉及通常通过除去、预防或控制可能对健康有害的药剂而恢复或维持健康。如本文所用，术语“对…作卫生处理”是指清洁卫生。如本文所用，术语“卫生处理剂”是指卫生处理用试剂。如本文所用，术语“卫生处理”是指搞卫生的行为或过程。
如本文所用，术语“杀病毒剂”是指抑制或破坏病毒的药剂，并与“病毒杀灭剂”同义。将表现出抑制或破坏病毒能力的药剂称为具有“杀病毒”活性。过酸具有杀病毒活性。本领域已知的可适用于本发明的典型备选杀病毒剂包括例如醇、醚、氯仿、甲醛、苯酚、β-丙内酯、碘、氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶、以及洗涤剂。
如本文所用，术语“生物杀灭剂”是指灭活或破坏微生物的通常为广谱的化学试剂。将表现出灭活或破坏微生物能力的化学试剂称为具有“生物杀灭”活性。过酸具有生物杀灭活性。本领域已知的可适用于本发明的典型备选生物杀灭剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸盐、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯酚、铜盐、有机硫化合物、和季铵盐。
如本文所用，短语“最低生物杀灭浓度”是指在特定的接触时间内，生物杀灭剂导致目标微生物活体种群数发生所需的致死、不可逆转性减少的最低浓度。效力可通过处理后活体微生物减少的数量级来度量。在一个方面，处理后活体微生物的目标减少值为至少3个数量级、更优选地为至少4个数量级、以及最优选地为至少5个数量级。在另一方面，最低生物杀灭浓度为活体微生物细胞减少至少6个数量级。
如本文所用，术语“有益剂”是指促进或增强有用优点或有利效应的某些试剂。在一个实施方案中，提供了方法和系统，借此将有益剂(例如包含过氧羧酸的组合物)应用于衣物或纺织物以达到期望的有益效果，例如消毒、卫生处理、漂白、脱色、除臭/减少异味、以及它们的任意组合。
如本文所用，术语“过氧源”和“过氧的来源”是指当在水溶液中时能够提供约1mM或更高浓度过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐、以及过碳酸盐。如本文所述，在将反应组分组合后，通过含水反应制剂中的过氧化合物提供的过氧化氢初始浓度为至少1mM或更高。在一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应制剂中过氧化氢与酶底物(如甘油三酯)的摩尔比(H2O2∶底物)可从约0.002至20、优选从约0.1至10、以及最优选从约0.5至5。
在本发明方法和系统的一些实施方案中，酶催化剂包含在结构上属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂在结构上被归类为先锋霉素C脱乙酰酶。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂在结构上被归类为乙酰木聚糖酯酶。术语“酶催化剂”、“具有过水解活性的酶催化剂”、和“过水解酶催化剂”在本文中可互换使用。
在本发明方法和系统的一些实施方案中，过水解酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶，所述特征基序使用CLUSTALW与参考序列SEQID NO：2比对，并包含：
i)与SEQ ID NO：2的118至120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；
ii)与SEQ ID NO：2的179至183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；以及
iii)与SEQ ID NO：2的298至299对应的氨基酸位置处的HE基序；
其中所述酶还包含与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，该特征基序还包含第四保守基序，其被定义为当用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对时在第267至269位氨基酸残基位置的LXD基序。
在本发明方法和系统的附加实施方案中，过水解酶催化剂可包含：选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、和SEQ ID NO：74的具有过水解酶活性的酶，或通过所述氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代、删除或添加而获得的具有过水解酶活性的基本上类似的酶。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，具有过水解酶活性的基本上类似的酶与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、和SEQ ID NO：74的一个或多个氨基酸序列具有至少30％、优选地至少33％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至还更优选地至少70％、甚至还更优选地至少80％，甚至还更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，过水解酶催化剂包含具有核酸分子编码的氨基酸序列的酶，该核酸分子在严格杂交条件下可与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、和SEQ IDNO：71的核酸序列杂交。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，过水解酶催化剂包含具有选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：73(即野生型那不勒斯栖热袍菌和在第277位氨基酸残基具有氨基酸取代的那不勒斯栖热袍菌变体)的氨基酸序列的酶。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，过水解酶催化剂包含具有选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：74(即野生型海栖热袍菌和在第277位氨基酸残基具有氨基酸取代的海栖热袍菌变体)的氨基酸序列的酶。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，过水解酶催化剂包含与定义为SEQ ID NO：49的邻接特征基序具有至少30％、优选地至少36％的氨基酸同一性的酶，其中保留了上述保守基序(即RGQ、GXSQG、和HE，以及任选地LXD)。
针对本发明的方法和系统，合适的羧酸酯底物包括由下式提供的酯：
[X]mR5
其中X为由式R6C(O)O表示的酯基
R6为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其中R6为C2至C7时R6任选地包含一个或多个醚键；
R5为任选地由羟基取代的C1至C6直链、支链、或环状烃基部分，其中R5中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R5任选地包含一个或多个醚键；
m为1至R5中的碳原子数；并且
其中在25℃下所述酯在水中的溶解度为至少5ppm。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，合适的底物还包括由下式表示的酯：
Figure BPA00001382618200361
其中R1为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R2为C1至C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2O)nH、或(CH2CH(CH3)O)nH，并且n为1至10。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，合适的羧酸酯底物包括由下式表示的甘油酯：
Figure BPA00001382618200362
其中R1为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；
在本发明方法和系统的其他实施方案中，R6为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代，任选地包含一个或多个醚键的C1至C7直链烃基部分。在另一个优选的实施方案中，R6为任选地由羟基取代和/或任选地包含一个或多个醚键的C2至C7直链烃基部分。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，合适的羧酸酯底物还包括选自乙酰化单糖、乙酰化二糖、和乙酰化多糖的乙酰化糖类。在优选的实施方案中，乙酰化糖类包括乙酰化单糖、乙酰化二糖、和乙酰化多糖。在其他实施方案中，乙酰化糖类选自乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、三-O-乙酰基-D-葡萄烯糖、和乙酰化纤维素。在优选的实施方案中，乙酰化糖类选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、三-O-乙酰基-D-葡萄烯糖、和乙酰化纤维素。因此，乙酰化碳水化合物可以是利用本发明方法和系统(即在过氧源的存在下)制备过羧酸的合适底物。
在本发明方法和系统的附加实施方案中，羧酸酯底物可以是甘油一乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、三-O-乙酰基-葡萄烯糖、丙二醇二乙酸酯、乙二醇二乙酸酯、1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯、以及它们的混合物。在本发明方法和系统的优选实施方案中，底物包含甘油三乙酸酯。
优选地，用于本发明方法和系统的底物在水中的溶解度小于约100mg/mL。在本发明方法和系统的一些实施方案中，底物在含水反应混合物中的重量百分比超过底物在水中的溶解极限。
在本发明公开的方法和系统的其他实施方案中，底物可以是乙酸乙酯，乳酸甲酯，乳酸乙酯，乙醇酸甲酯，乙醇酸乙酯，甲氧基乙酸甲酯，甲氧基乙酸乙酯，3-羟基丁酸甲酯，3-羟基丁酸乙酯，2-乙酰基柠檬酸三乙酯，葡萄糖五乙酸酯，葡糖酸内酯，甘油酯(甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯)例如甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油基酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3-三丙酰基甘油)、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯(二丁酸甘油基酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁酰基甘油)，乙酰化糖类，以及它们的混合物。
在本发明方法和系统的另一优选方面，羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯、和乳酸乙酯。在又一方面，羧酸酯底物选自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯、和乳酸乙酯。在优选方面，羧酸酯为选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物的甘油酯。
在多组分生成系统中使用共溶剂。
在本发明公开的方法和系统中使用的共溶剂包括log P小于约2的有机溶剂。在一些实施方案中，共溶剂优选地为醇。共溶剂优选地可包括三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1，3-丙二醇、以及它们的任意组合。在本发明方法和系统的一些实施方案中，共溶剂包括三丙二醇甲醚。
在本发明的多组分系统制备过氧羧酸的方法中，多组分系统可包括：含有催化剂组合物的第一组分，该组合物包含共溶剂；以及含有过氧源和水的第二组分。第二组分可包含任选的稳定剂，以延长过氧化氢的储存寿命。在第一组分与第二组分组合前，可将催化剂、底物、和共溶剂组合形成第一组分。同样地，针对本发明公开的表面消毒方法，组合催化剂组合物和过氧源的步骤可包括将含有催化剂组合物和共溶剂的第一组分与含有过氧源和水的第二组分组合。
在本发明方法和系统的实施方案中，其中多组分系统包括含催化剂组合物的第一组分，该组合物包含共溶剂，以及含过氧源和水的第二组分，第一组分可与第二组分以约1∶1至约1∶10的重量比组合。在一个实施方案中，第一组分与第二组分以约1∶9的重量比组合。
在如上所述第一和第二组分的1∶1至1∶10混合比范围内，也对第一组分中酶底物(“活化剂”)的浓度和第二组分与第一组分的比例进行选择，使底物溶于第一组分和第二组分的最终混合物中。例如，据报道，甘油三乙酸酯在水中的溶解度为71.7g/L(Seelig，ChemischeBerichte；24：3466(1891))，1，2-丙二醇二乙酸酯的溶解度为每10份水溶1份(Wurtz，Annales de Chimie；55：443(1859)；Justus Liebigs Annalender Chemie；105：206(1858))，甘油三丁酸酯在水中的溶解度为0.015％(体积比)(Loskit，Zeitschrift fuer Physikalische Chemie，Stoechiometrieund Verwandtschaftslehre；134：137(1928))。鉴于本发明的酶底物具有宽范围的溶解度，其中酶底物在下文中进行描述，因此加入本发明第一组分中的共溶剂除了在第一组分中作为稀释剂，以使第一组分与第二组分以期望的比例混合之外，还可帮助水溶性较差的酶底物溶解。在本发明的一个实施方案中，底物可以至少25％(重量比)的浓度溶于第一组分和第二组分的所得制剂中。在本文明的第二实施方案中，底物可以至少10％(重量比)的浓度溶于第一组分和第二组分的所得制剂中。在本文明的第三实施方案中，底物可以至少5％(重量比)的浓度溶于第一组分和第二组分的所得制剂中。在本文明的第四实施方案中，底物可以至少2％(重量比)的浓度溶于第一组分和第二组分的所得制剂中。
在一个实施方案中，共溶剂可按约20重量％至约80重量％的量存在于第一组分中。底物可以按约10重量％至约60重量％的量存在于第一组分中。在一些实施方案中，第一组分可包含约55重量％的底物、约40重量％的共溶剂、约0.3重量％的酶催化剂、以及约2.5重量％的填料，而第二组分可包含约95重量％的水、约1.5重量％的碳酸氢钠、以及约1重量％的过氧源。在其他情况下，第一组分可包含约55.5重量％的甘油三乙酸酯、约41重量％的三丙二醇甲醚、约0.9重量％的碳酸氢钠、约0.3重量％的喷雾干燥酶粉(包含那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌过水解酶或具有一个或多个点突变以提高过水解活性的那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌过水解酶的变体衍生物)、以及约2.5重量％的热解法二氧化硅，而第二组分可包含约96重量％的水、约0.2重量％的过氧化氢稳定剂(如(1-羟基亚乙基)二膦酸)、以及约3.2重量％的含30％过氧化氢的溶液。
针对本发明的方法和系统，羧酸酯底物可以足够的浓度用于通过酶催化的过水解反应制备所需浓度的过酸。羧酸酯不必完全溶于反应制剂，但优选地具有足够的溶解度，以便通过过水解酶催化剂将酯转化成相应的过酸。羧酸酯按以下浓度存在于含水反应制剂中：占反应制剂的约0.0005重量％至约40重量％，优选地占含水反应制剂的0.1重量％至20重量％，并且更优选地占含水反应制剂的0.5重量％至10重量％。羧酸酯的重量％可大于羧酸酯的溶解极限。并非所有加入的羧酸酯都必须立即溶于含水反应制剂中，并且在所有反应组分的初始混合后，任选地进行附加的连续或非连续混合。
在本发明的方法和系统中，过氧源可包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐以及过碳酸盐。过氧化合物在含水反应制剂中的浓度可在0.0033重量％至约50重量％的范围内，优选地在0.033重量％至约40重量％的范围内，更优选地在0.33重量％至约30重量％的范围内。
本发明方法和系统的反应制剂可包含约5mM至约250mM的底物，约5mM至约250mM的过氧源，以及约0.0001mg/mL至约10mg/mL、优选地约0.01mg/mL至约2.0mg/mL的酶催化剂。在此类情况下，底物可包含甘油三乙酸酯，过氧源可包含过氧化氢，并且酶催化剂可包含那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌过水解酶。在另一个实施方案中，酶催化剂可包含如SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：74所定义的那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌变体，其中第277位氨基酸残基位置的野生型半胱氨酸被丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、或苏氨酸替换。
据报道，许多过水解酶催化剂(例如全细胞、透化的全细胞、和部分纯化的全细胞提取物)都具有过氧化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶可催化过氧化氢向氧和水的转化。在本发明公开的方法和系统的一个方面，过水解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一方面，将过氧化氢酶抑制剂加入反应制剂中。过氧化氢酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠和硫酸羟胺。本领域的技术人员可以根据需要调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度范围通常为0.1mM至约1M、优选地为约1mM至约50mM、更优选地为约1mM至约20mM。在一个方面，叠氮化钠的浓度通常在约20mM至约60mM的范围内，而硫酸羟胺的浓度通常为约0.5mM至约30mM，优选地为约10mM。
在本发明方法和系统的其他实施方案中，酶催化剂缺乏显著的过氧化氢酶活性或经过修饰降低或消除了过氧化氢酶活性。可以用熟知的技术通过破坏负责过氧化氢酶活性的基因的表达来下调或消除宿主细胞中的过氧化氢酶活性，这些技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、定向诱变、和随机诱变。在本发明方法和系统的一些实施方案中，编码内源过氧化氢酶活性的基因被下调或破坏(即“敲除”)。如本文所用，“破坏的”基因是指由修饰基因编码的蛋白不再具有活性和/或功能的基因。破坏基因的方法是本领域熟知的，包括但不限于插入、缺失、或突变，只要相应蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在另一个优选实施方案中，生产宿主为大肠杆菌生产宿主，其包含破坏的过氧化氢酶基因，该基因选自katG(SEQ ID NO：35)和katE(SEQ IDNO：44)。在其他实施方案中，生产宿主为大肠杆菌菌株，其包括katg1和katE过氧化氢酶基因两者的下调和/或破坏。本文提供包含katG和katE双敲除的大肠杆菌菌株(大肠杆菌菌株KLP18)。
本文所述的过氧化氢酶阴性大肠杆菌菌株KLP18与过氧化氢酶阴性菌株UM2(大肠杆菌遗传库存中心#7156，Yale University，New HavenCT)相比已显示为大规模(10L及更大)生产过水解酶的优异宿主，如在发酵罐条件下的生长所确定的。虽然KLP18和UM2两者都是过氧化氢酶阴性菌株，但已知UM2具有许多营养缺陷，因此需要富含酵母提取物和蛋白胨的培养基。即使当采用加富培养基进行发酵时，UM2也生长不良并达到最大限值的细胞密度(OD)。相比之下，KLP18没有特殊的营养要求并且在单一矿物培养基或添加有酵母提取物的矿物培养基上就可生长到高的细胞密度。
本发明方法和系统的含水反应制剂中催化剂的浓度取决于催化剂的特定催化活性，对该浓度进行选择以获得所需的反应速率。过水解反应中催化剂的重量通常在每毫升总反应体积中具有0.0001mg至10mg，优选0.010mg至2.0mg。催化剂也可使用本领域技术人员熟知的方法固定于可溶解或不溶解支持体上；参见例如：Immobilization of  Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff(编辑)；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂的形式可以是完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶、或它们的混合物。
在本发明方法和系统的一个方面，通过羧酸酯的化学过水解和酶过水解相结合生成的过酸的浓度足够以所需的pH值提供用于漂白、卫生处理或消毒的过酸有效浓度。在另一方面，本发明的方法和系统提供酶和酶底物的组合，以制备所需有效浓度的过酸，其中在未添加酶的情况下，制备的过酸的浓度明显更低。虽然在某些情况下，通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应，酶底物可发生显著的化学过水解，但生成的过酸浓度可能不足以在所需的应用中提供有效浓度的过酸，而通过在反应制剂中加入合适的过水解酶催化剂可以显著提高过酸的总浓度。
关于本发明的系统和方法，在过水解反应开始的10分钟内、优选5分钟内、最优选1分钟内，通过至少一种羧酸酯的过水解而生成的过酸(如过乙酸)的浓度可以为至少约2ppm，优选至少约20ppm，优选至少100ppm，更优选至少200ppm过酸，更优选至少300ppm，更优选至少500ppm，更优选至少700ppm，更优选至少1000ppm过酸，最优选至少2000ppm过酸。含有过酸的产品制剂可任选地用水稀释或主要由水构成的溶液稀释，以制备具有所需较低过酸浓度的制剂。在本发明方法和系统的一个方面，制备所需浓度过酸所需的反应时间不超过约2小时，优选地不超过约30分钟，更优选地不超过约10分钟，甚至更优选地不超过约5分钟，最优选地在约1分钟或更短的时间内。在本发明的表面消毒方法的其他方面，将受生物污染物污染的包括硬质表面或无生命物体的表面与根据本文所述的方法在以下时间内形成的过酸接触：混合所述反应组分后约1分钟至约168小时内、或混合所述反应组分后约1分钟至约48小时内、或约1分钟至2小时内、或其中任何这样的时间间隔。
对反应温度进行选择，以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度范围可以从仅高于反应制剂的凝固点(约0℃)至约95℃，优选的范围为5℃至约75℃，更优选的反应温度范围为约5℃至约55℃。
含有过酸的最终反应制剂的pH为约2至约9，优选约3至约8，更优选约5至约8，甚至更优选约6至约8，以及甚至更优选约6.5至约7.5。在另一个实施方案中，反应制剂的pH为酸性(pH＜7)。反应的pH以及最终反应制剂的pH可任选地通过加入合适的缓冲剂来控制，缓冲剂包括但不限于碳酸氢盐、柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐或马来酸盐。使用缓冲剂时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选1mM至300mM，最优选10mM至100mM。
在本发明方法和系统的另一个方面，酶过水解产物可含有提供所需功能的附加组分。在另一个方面，本发明的方法和系统可用于衣物洗涤护理应用，对衣物进行处理。附加组分的实例包括但不限于缓冲剂、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、腐蚀抑制剂(例如苯并三唑)、酶稳定剂以及过氧化氢稳定剂(例如金属离子螯合剂)。许多附加组分为洗涤剂行业所熟知(例如美国专利5,932,532所述的那些；据此以引用方式并入)。乳化剂的实例包括但不限于聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于LAPONITE
Figure BPA00001382618200421
RD、玉米淀粉、PVP、CARBOWAX
Figure BPA00001382618200422
、CARBOPOL
Figure BPA00001382618200423
、CABOSIL
Figure BPA00001382618200424
、聚山梨酸酯20、聚乙烯醇、和卵磷脂。缓冲体系的实例包括但不限于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠；氨基磺酸/三乙醇胺；柠檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇胺；琥珀酸/三乙醇胺；和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于(a)非离子表面活性剂，例如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化或丙氧基化直链和支链一级和二级醇、以及脂族氧化膦；(b)阳离子表面活性剂，例如季铵化合物，尤其是具有与氮原子连接的C8-C20烷基的季铵化合物，所述氮原子还与3个C1-C2烷基连接；(c)阴离子表面活性剂，例如烷烃羧酸(如C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸酯、烷烃磺酸盐(如十二烷基磺酸钠“SDS”)或者直链或支链烷基苯磺酸盐、烯烃磺酸盐；以及(d)两性表面活性剂和两性离子表面活性剂，例如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱以及它们的混合物。附加组分可以包括芳香剂、染料、过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂，如羟基乙叉二膦酸(DEQUEST
Figure BPA00001382618200431
2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO)和乙二胺四乙酸(EDTA))、TURPINAL
Figure BPA00001382618200432
SL(CAS#2809-21-4)、DEQUEST
Figure BPA00001382618200433
0520、DEQUEST
Figure BPA00001382618200434
0531、酶活性稳定剂(如聚乙二醇(PEG))，以及洗涤剂助剂。
在消毒表面的本发明方法的另一方面，可预混酶过水解产物以在接触需要消毒的表面之前产生所需浓度的过氧羧酸。在消毒表面的本发明方法的另一方面，不预混酶过水解产物，不在接触需要消毒的表面(例如硬质表面或无生命物体)之前产生所需浓度的过氧羧酸，而是，产生所需浓度过氧羧酸的反应制剂的组分与需要消毒、卫生处理、漂白、脱色、除臭或它们的任何组合的表面接触而产生所需浓度的过氧羧酸。在一些实施方案中，反应制剂的组分在某场所组合或混合。在一些实施方案中，将反应组分递送或施用到某场所上并随后混合或组合以产生所需浓度的过氧羧酸。
在消毒表面或赋予衣物或纺织物有益效果(脱色、减少异味、漂白、卫生处理和/或消毒)的本发明方法的任一实施方案中，可通过喷雾、浇注、喷雾、擦涂或任何其他合适的技术(其中许多其他的实例将为本领域的技术人员所理解)将含水反应制剂施用到表面。
使用过水解酶催化剂原位产生过酸
先锋霉素C脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41；系统名先锋霉素C乙酰水解酶；CAH)是能够水解键合在如先锋霉素C、7-氨基头孢烷酸和7-(噻吩-2-乙酰氨基)头孢酸等先锋霉素上的乙酰基酯的酶(Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975))。CAH属于一个较大的结构相关酶家族，称为糖酯酶家族7(CE-7；参见Coutinho，P.M.和Henrissat，B.发表在Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering上的“Carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach”，H.J.Gilbert、G.Davies、B.Henrissat和B.Svensson编辑，(1999)The RoyalSociety of Chemistry，Cambridge，第3-12页)。
CE-7家族包括CAH和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7家族成员共有一种结构基序，它们的非常独特之处在于通常对乙酰化低聚木糖和先锋霉素C都表现出酯水解活性，从而表明CE-7家族代表对一系列小底物具有多官能脱乙酰基酶活性的单类蛋白(Vincent等人，上文)。Vincent等人描述了这个家族的成员之间的结构相似性并定义了CE-7家族特征性的特征序列基序(“CE-7特征基序”)。
CE-7家族的成员存在于植物、真菌(如顶头孢霉(Cephalosporidiumacremonium))、酵母(如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis))、和细菌(如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)、耐内酰胺诺卡氏菌(Norcardialactamdurans)、以及芽孢杆菌属的许多成员)中(Politino等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(12)：4807-4811(1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng.85：53-57(1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol179：5436-5441(1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54(3)：406-412(2000)；Mitsushima等人，上文，Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975)；Vincent等人，上文，Takami等人，NAR，28(21)：4317-433l(2000)；Rey等人，Genome Biol.，5(10)：第77章(2004)；Degrassi等人，Microbiology，146：1585-1591(2000)；美国专利6,645,233；美国专利5,281,525；美国专利5,338,676；和WO99/03984。具有与SEQ ID NO：2显著同源性的CE-7糖酯酶家族成员的不完全名单示于表1。
表1
具有与SEQ ID NO：2显著同源性的CE-7酶的实例。
Figure BPA00001382618200451
Figure BPA00001382618200461
用于本发明的方法和系统中的过水解酶优选为CE-7糖酯酶家族的所有成员。酶催化剂可包括限定为SEQ ID NO：14的那不勒斯栖热袍菌过水解酶。在本发明的方法和系统的其他实施方案中，酶催化剂可包括限定为SEQ ID NO：16的海栖热袍菌过水解酶。如Vincent等人(上文)所述，该家族的成员共用该家族特有的特征基序。本发明的过水解酶的CLUSTALW比对表明所有成员均属于CE-7糖酯酶家族(图1，表A-F)。几个CE-7过水解酶之间的总体氨基酸同一性百分比的比较示于表2中。
表2
过水解酶之间的氨基酸同一性百分比 1
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15
  1   100
  2   99   100
  3   99   99   100
  4   96   96   97   100
  5   77   76   77   76   100
  6   76   76   76   76   68   100
  7   57   57   57   56   56   56   100
  8   42   43   43   43   43   42   41   100
  9   42   43   42   43   43   42   42   72   100
  10   42   43   43   43   44   42   43   71   91   100
  11   41   43   43   43   45   42   43   71   97   91   100
  12   41   42   42   42   43   41   42   71   98   91   97   100
  13   37   37   37   36   39   38   38   64   65   67   66   65   100
  14   34   36   35   36   35   36   33   36   32   34   34   33   36   100
  15   33   34   33   33   32   34   32   30   30   32   31   31   32   34   100
1＝使用BLOSUM62的blast2seq算法测定的同一性百分比，空位罚分＝11，空位延伸罚分＝1，x_drop＝0，预期值＝10，以及给定序列长度＝3。Tatiana A.Tatusova，ThomasL.Madden(1999)，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250
1.枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200471
31954TM
2.枯草芽孢杆菌BE1010
3.枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200472
29233TM
4.枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200473
6633TM
5.地衣芽孢杆菌14580
6.短小芽孢杆菌PS213
7.热纤梭菌ATCC27405TM
8.热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2(b)
9.热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2(a)
10.那不勒斯栖热袍菌
11.海栖热袍菌
12.T.petrophila
13.T.lettingae
14.解糖热厌氧杆菌
15.克劳氏芽孢杆菌
虽然在总体氨基酸同一性百分比上观察到有差异(即，热纤梭菌ATCC27405TM过水解酶(SEQ ID NO：12)与枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200482
31954TM过水解酶(SEQ ID NO：2)只有57％的氨基酸同一性；而克劳氏芽孢杆菌过水解酶(SEQ ID NO：24)与SEQ ID NO：2只有33％的同一性)，但本发明的每个过水解酶都共用CE-7特征基序。因此，本发明的过水解酶催化剂从结构上分类为属于CE-7糖酯酶家族的酶。本发明的每个过水解酶都包含CE-7特征基序。
在本发明方法和系统的一个实施方案中，可通过CE-7特征基序的存在来鉴定合适的过水解酶(Vincent等人，上文)。在优选的实施方案中，使用CLUSTALW将含有CE-7特征基序的过水解酶与枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200483
31954TM过水解酶(SEQ ID NO：2；用于相对氨基酸位置编号的参考序列)比对来鉴别含有CE-7特征基序的过水解酶。按照SEQ IDNO：2的氨基酸残基编号，CE-7特征基序含有3个保守基序，其定义为：a)Arg118-Gly119-Gln120；b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和c)His298-Glu299。因此，用于本发明的系统和方法中的酶催化剂可包含3个序列基序，其定义为Arg118-Gly119-Gln120；Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和His298-Glu299(相对于SEQ ID NO：2)。相应的特征基序的比对示于表3中。通常，第180氨基酸残基位置的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、或苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的其中两个以粗体表示。在一个实施方案中，第180氨基酸残基位置的Xaa选自：甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、和苏氨酸。
对CE-7糖酯酶家族中保守基序的进一步分析表明存在额外的基序(在SEQ ID NO：2第267至269氨基酸位置的LXD)，该基序可用于进一步定义属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶。在本发明方法和系统的另一个实施方案中，以上定义的特征基序可包括定义为Leu267-Xaa268-Asp269(相对于参考SEQ ID NO：2)的第四个保守基序。第268氨基酸残基位置的Xaa通常为异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸。第四个基序包含天冬氨酸残基，其为催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的第三个成员。
多种熟知的全局比对算法可用来比对两个或更多个氨基酸序列(代表具有过水解酶活性的酶)以确定本发明的特征基序的存在(例如，CLUSTALW或Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48：443-453(1970))。将比对的序列与参考序列(SEQ ID NO：2)相比较。在一个实施方案中，通过采用参考氨基酸序列(如本文所用的得自枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200491
31954TM的CAH序列(SEQ ID NO：2))的CLUSTAL比对(例如CLUSTALW；如1.83版)来鉴别属于CE-7酯酶家族的过水解酶。保守氨基酸残基的相对编号基于参考氨基酸序列的残基编号，用以说明在比对序列中的小插入或缺失(通常5个氨基酸或更少)。
在本文示例的过水解酶之间对总体同一性百分比的比较表明，包含与SEQ ID NO：2少至33％同一性的酶(但保留了特征基序)表现出显著的过水解酶活性，并且在结构上归为CE-7糖酯酶。在本发明方法和系统的一些实施方案中，本发明的过水解酶包括含有本发明的特征基序并包含与SEQ ID NO：2以下氨基酸同一性的酶：至少30％，优选至少33％，更优选至少40％，甚至更优选至少42％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，以及最优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。
含有上述特征基序的CE-7酶的实例示于表3中。
表3
来自几个CE-7糖酯酶的保守基序。
Figure BPA00001382618200501
a＝Vincent等人上大定义的保守基序，用来定义特征基序。
b＝额外基序，可用来进一步定义Vincent等人上文所定义的特征基序。
作为另外一种选择，含有Vincent等人上文鉴别的3个保守基序(RGQ、GXSQG和HE；SEQ ID NO：2的第118至299位氨基酸残基；任选的第4基序LXD也加有下划线)的邻接特征基序(SEQ ID NO：49)也可用作鉴别CE-7糖酯酶的邻接特征基序(图1，组图A-F)。因此，也可将预期具有过水解酶活性的合适的酶鉴别为包含与SEQ ID NO：49至少30％氨基酸同一性，优选至少36％，更优选至少40％，甚至更优选至少50％，还更优选至少60％，还甚至更优选至少70％，还甚至更优选至少80％，还甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性(存在于CE-7糖酯酶中的4个保守基序也加有下划线)。
RGQQSSEDTSISLHGHALGWMTKGILDKDTYYYRGVYLDAVRALEVISSFDEVDETRIGVTGGSQGGGLTIAAAALSDIPKAAVADYPYLSNFERAIDVALEQPYLEINSFFRRNGSPETEVQAMKTLSYFDIMNLADRVKVPVLMSIGLIDKVTPPSTVFAAYNHLETEKELKVYRYFGHE(SEQID NO：49)。
使用邻接特征序列与几个具有过氧化酶水解活性的CE-7酯酶进行的比较示于表4中。使用BLASTP时，采用默认参数。
表4
具有过水解活性的各种CE-7糖酯酶相对邻接特征序列(SEQ ID NO：49) 的氨基酸同一性百分比。
Figure BPA00001382618200511
作为另外一种选择，也可使用与用于本发明的方法和系统中的一个或多个过水解酶的全长序列具有的氨基酸同一性百分比。因此，具有过水解酶活性的合适的酶具有与SEQ ID NO：2至少30％，优选至少33％，优选至少40％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还甚至更优选至少90％，以及最优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性。在本发明的方法和系统的另一个实施方案中，合适的过水解酶催化剂含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74的氨基酸序列。在另一个实施方案中，位于SEQ ID NO：73或SEQ IDNO：74的第277位的氨基酸残基选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸。在优选的实施方案中，可使用具有过水解酶活性的合适的酶，其具有与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸同一性。在另一个优选的实施方案中，具有过水解酶活性的合适的酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。
用于本发明的方法和系统中的具有过水解酶活性的合适的糖酯酶家族7(CE-7)酶也可包括这样的酶，其含有本发明的其中一个过水解酶(例如SEQ ID NO.14或16)的一个或多个缺失、取代和/或插入。如表2中所示，具有过水解酶活性的CE-7糖酯酶具有少至31％的总体氨基酸同一性。具有过水解酶活性并从结构上归为属于CE-7糖酯酶家族的附加的酶可具有甚至更低的同一性百分比，只要该酶保留保守的特征基序。因此，缺失、取代和/或插入的数目可变化，只要保守的特征基序(参见表3)存在于该酶内的相对位置。
另外，为本领域技术人员所熟知的是根据存在于相应的核酸序列中的结构相似性来鉴别合适的酶。可使用杂交技术来鉴别相似的基因序列。相应地，本发明的合适的过水解酶催化剂含有核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在高度严格条件下与具有选自以下的核酸序列的核酸分子杂交：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71。
最近鉴别出来几个CE-7酶的变体，其相对于这些变体来源的对应野生型酶而言具有增强的过水解活性(参见共同拥有、共同提交和共同未决的代理人档案号为CL4392 US NA的美国专利申请；所述专利申请以引用方式并入本文)。具体地讲，对几个来自热袍菌属的野生型CE-7酶进行修饰以产生具有增强的过水解活性的几种变体。变体的序列以SEQ ID NO：73和74示出，其中SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：74的第277位的氨基酸残基选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
酶的多组分过酸生成系统
本发明的方法和系统可用于在含水反应条件下使用属于糖酯酶家族7的酶的过水解酶活性原位生成工业上有用的、有效浓度的过酸。在一些实施方案中，具有过水解酶活性的酶也从结构上和功能上归类为先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)。在其他实施方案中，具有过水解酶活性的酶从结构上和功能上归类为乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
按照本发明的方法和系统产生的过酸具有较强活性，并且随着时间延长，浓度可能会降低，这取决于这样的变量，包括但不限于温度和pH。因此，将各种反应组分分开，尤其对于液体制剂是可取的。在一个方面，将过氧化氢源与底物或过水解酶催化剂分开，优选将过氧化氢源与两者分开。这可通过使用各种技术包括但不限于多隔室分配器(例如美国专利4,585,150)，并在使用时将过水解酶催化剂与无机过氧化物和本发明的底物物理混合来引发含水酶过水解反应而实现。过水解酶催化剂在接触用于处理的表面和/或物体之前可任选地固定于反应室中或与含有过酸的反应产物分离(例如过滤)。过水解酶催化剂可以在液体基质中或为固体形式(例如粉末或片剂)或嵌入固体基质中，可随后将其与底物混合来引发酶过水解反应。在另一方面，过水解酶催化剂可包含于可溶解的或多孔的小袋中，可将小袋加入含水底物基质中来引发酶过水解。在另一方面，将含有酶催化剂的粉末悬浮于羧酸酯底物(例如甘油三乙酸酯)中并在使用时与溶于过氧源的水溶液混合。在一些实施方案中，使用双隔室喷雾瓶例如双液固定比率喷雾器(型号DLS100，Take 5 Corp.，Rogue River，OR)或双液可变比率喷雾器(型号DLS200，Take；5 Corp.)(美国专利5,152,461和美国专利5,532,157；所述专利以引用方式并入本文)。在另一个实施方案中，采用含有两个分离的隔室(用易碎密封件分离)的单个瓶。在一些实施方案中，两个分离的隔室的体积比为1∶1、或5∶1、或10∶1。多组分递送系统的实例也可在共同拥有、共同提交和共同未决的代理人档案号为CL4400 US NA的美国专利申请(全文以引用方式并入本文)中找到。
本发明公开的用来产生过氧羧酸的系统可包括含有酶催化剂(例如酶粉)、羧酸酯底物(基本上不含水)和共溶剂的第一组分以及含有过氧源和水源的第二组分。第一组分中过量水的存在会导致储存的不稳定性。因此，短语“基本上不含水”是指当水存在于第一组分中时，水在含有羧酸酯底物/酶/共溶剂的组分中的浓度不会不利地影响酶的储存稳定性。在一个实施方案中，“基本上不含水”可指包含羧酸酯底物的组分中水含量小于2000ppm，优选小于1000ppm，更优选小于500ppm，甚至更优选小于250ppm。在此类实施方案中，该系统还可包括用来储存第一组分的第一器皿/容器和用来储存第二组分的第二器皿/容器。如本文所用，术语“容器”可一般地用来描述器皿、隔室、瓶、包以及其他适于容纳和/或传输本发明材料的包装系统。本发明的系统也可包括混合隔室，其用于接纳来自第一容器的至少一些第一组分和来自第二容器的至少一些第二组分，从而允许形成含有至少一些第一组分和至少一些第二组分的制剂。在此种情况下，系统还包括将制剂从混合隔室中分配的喷嘴。
在本发明系统的其他实施方案中，包括第一和第二器皿的系统还可包括用来接纳来自第一器皿的至少一些第一组分和来自第二器皿的至少一些第二组分并同时分配至少一些第一组分和至少一些第二组分的喷嘴。如本文所用，“同时”是指在至少一部分时间期间至少一些第一组分被分配，至少一些第二组分也被分配。因此，在一些第一组分分配持续1秒的总时间的情况下，在分配第一组分后分配第二组分1秒以及在分配第一组分期间分配第二组分0.1秒将被视为与第一组分同时分配。
测定过酸和过氧化氢浓度的方法。
在本发明的方法中，可采用多种分析方法来分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、毛细管电泳(CE)、U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))、以及本发明实施例中描述的2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸盐(ABTS)测定法(S.Minning等人，AnalyticaChimica Acta 378：293-298(1999)和WO 2004/058961 A1)。
过酸最低生物杀灭浓度的测定
可以用J.Gabrielson等人(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))所述的方法来测定过酸或过氧化氢和酶底物的最低生物杀灭浓度(MBC)。测定方法基于XTT还原抑制，其中XTT((2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑
Figure BPA00001382618200551
内盐，单钠盐)为氧化还原染料，通过在490nm或450nm处测得的光密度(OD)的变化来指示微生物呼吸活性。然而，还有许多其他方法可用于测试消毒剂和防腐剂的活性，方法包括但不限于平板活菌计数、直接镜检计数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见，例如Brock、Semour S.，“Disinfection，Sterilization，and Preservation”，第5版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。
酶法制备的过酸组合物的用途
根据本发明方法制备的酶催化剂生成的过氧羧酸可用于许多硬质表面/无生命物体应用，以降低生物污染物的浓度，例如用于医疗器械(如内窥镜)、纺织物(如衣服、地毯)、食品制备表面、食品贮存和食品包装设备、食品包装材料、鸡孵化和养成场所、动物笼舍、以及具有微生物和/或抗病毒活性的工艺废水的消毒。酶法生成的过氧羧酸可用于旨在使朊病毒(如某些蛋白酶)失活以进一步提供生物杀灭活性的制剂。在一个优选的方面，本发明的过氧羧酸组合物尤其适合用作非高压灭菌医疗器械和食品包装设备的消毒剂。由于含过氧羧酸的制剂可以用GRAS或食品级组分(酶、酶底物、过氧化氢、和缓冲剂)制备而得，因此酶法生成的过氧羧酸也可用于动物尸体、肉、水果和蔬菜的消毒，或用于预制食品的消毒。可以将酶法生成的过氧羧酸掺入最终形式为粉末、液体、凝胶、薄膜、固体或气溶胶的产品中。可以将酶法生成的过氧羧酸稀释至仍能实现有效消毒的浓度。
可以使用包含有效浓度的过氧羧酸的组合物，通过使表面或物体与通过本发明方法制备的产品接触，对受生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行消毒。如本文所用，“接触”是指使包含有效浓度过氧羧酸的消毒组合物与怀疑被生物污染物污染的表面或无生命物体接触一段足以达到清洁和消毒效果的时间。接触包括喷雾、处理、浸入、冲洗、倾注、混合、组合、涂抹、涂覆、施加、粘附以及其他方式，使包含有效浓度过氧羧酸的过氧羧酸溶液或组合物，或者可形成有效浓度过氧羧酸的溶液或组合物与怀疑被一定浓度的生物污染物污染的表面或无生命物体相连。可以将消毒组合物与清洁组合物结合在一起，以同时提供清洁和消毒功能。作为另外一种选择，可以将清洁剂(如表面活性剂或脱色剂)掺入制剂中，以通过单一组合物同时提供清洁和消毒功能。
包含有效浓度过氧羧酸的组合物还可以含有至少一种附加的抗微生物剂、朊病毒降解蛋白酶的组合、杀病毒剂、杀孢子剂、或生物杀灭剂。当将这些药剂与通过受权利要求书保护的方法制备的过氧羧酸的组合用于对被生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行清洁和消毒时，可以提供增强和/或协同效应。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(如，对羟基烷基苯甲酸酯和烷基肉桂酸酯)；磺酸(如，十二烷基苯磺酸)；碘化合物或活性卤素化合物(如，卤素单质、卤素氧化物(如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO2)、碘、卤素间卤化物(interhalide)(如，一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、氯化溴、一溴化碘或二溴化碘)、多卤化物、次氯酸盐、次氯酸、次溴酸盐、次溴酸、氯代-和溴代-乙内酰脲、二氧化氯和亚氯酸钠)；有机过氧化物，包括过氧化苯甲酰、烷基过氧化苯甲酰、臭氧、单重态氧发生器、以及它们的混合物；酚类衍生物(如邻苯基苯酚、4-氯-2-苄基苯酚、叔戊基酚和C1-C6烷基羟基苯甲酸酯)；季铵化合物(如烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、以及它们的混合物)；以及此类抗微生物剂的混合物，它们的量应足以提供所需的微生物防护水平。抗微生物剂的有效量包括约0.001重量％至约60重量％的抗微生物剂，约0.01重量％至约15重量％的抗微生物剂，或约0.08重量％至约2.5重量％的抗微生物剂。
在一个方面，当将用本发明方法形成的过氧羧酸施用到某场所上和/或某场所处时，可用于降低活生物污染物(如活微生物群体)的浓度。如本文所用，“场所”包括适于消毒或漂白的部分或全部目标表面。目标表面包括有可能被生物污染物污染的所有表面。非限制性实例包括存在于食品或饮料行业中的设备表面(如槽罐、运送装置、地板、排水系统、冷却器、冷冻机、设备表面、壁、阀门、束带、管道、排水系统、接头、裂缝、它们的组合等)；建筑物表面(如墙壁、地板和窗户)；与非食品行业相关的管道和排水系统，包括水处理设施、水池和温泉浴场、以及发酵罐；与医院或兽医相关的表面(如墙壁、地板、床、设备(如内窥镜)、在医院/兽医或其他医疗保健场所穿着的衣物，包括衣服、手术服、鞋和其他医院或兽医相关表面)；餐厅表面；浴室表面；盥洗室；衣服和鞋；牲口(如家禽、牛、奶牛、山羊、马和猪)棚舍表面；家禽或虾的孵卵场；以及药物或生物药物相关表面(如药物或生物药物制造设备、药物或生物药物成分、药物或生物药物赋形剂)。其他硬质表面还包括食品，如牛肉、家禽肉、猪肉、蔬菜、水果、海产品、它们的组合等。场所还可以包括吸水材料，如被污染的亚麻布或其他纺织物。场所还包括收获的植物或植物产品，包括种子、球茎、块茎、水果、和蔬菜；正在生长的植物，尤其是农作物生长植物，包括谷类食物、叶菜和色拉作物、根菜、豆类、浆果、柑橘类水果和硬果。
硬质表面材料的非限制性实例为金属(如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、铝及其合金)、矿物质(如混凝土)、聚合物和塑料(例如聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)、聚(丙烯腈-丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯；以及聚酰胺，例如尼龙)。其他表面包括砖块、瓦、陶瓷、瓷器、木材、聚乙烯树脂、油毡、和地毯。
用本发明方法形成的过氧羧酸可用来为纺织物提供有益效果，包括但不限于漂白、脱色、卫生处理、消毒和除臭。用本发明方法形成的过氧羧酸可用于许多衣物洗涤护理产品，包括但不限于纺织物预洗处理剂、衣物洗涤剂、脱色剂、漂白组合物、除臭组合物、和清洗剂。
重组微生物表达
对于本发明的方法和系统而言，本文所述序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞中生成，特别是在微生物宿主细胞中。用于表达基因和核酸分子的优选异源宿主细胞为微生物宿主，所述微生物宿主可在真菌或细菌家族中找到并且其可在广泛的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、酵母和丝状真菌中任何一种均适于作为表达本发明核酸分子的宿主。过水解酶可在细胞内、细胞外、或细胞内和细胞外两者组合的形式表达，其中细胞外表达使得从发酵产物回收所需的蛋白质比回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法更简便。转录、翻译和蛋白质生物合成仪器相对于用来产生细胞生物质的细胞原料而言保持不变；无论如何，功能基因将被表达。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母(Phaffia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括克鲁维酵母属、埃希氏菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。
大规模微生物的生长和功能基因的表达可利用各种单一碳水化合物或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃(对于光合自养宿主或化能自养宿主而言，例如甲烷或二氧化碳)，并可利用各种形式和数量的氮、磷、硫、氧、碳或任何微量营养素(包括小无机离子)。可通过向培养物中加入或不加入特定的调节分子(通常不将其视为营养物质或能源)来影响生长速率的调节。
可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源的基因和/或对生产宿主是天然的基因，尽管它们无需来源于此。
用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。实际上能够驱动这些基因的任何启动子都适用于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及amy、apr、npr启动子和多种用于在芽孢杆菌属中表达的噬菌体启动子。
终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，可任选包括终止控制区。在另一个实施方案中，嵌合基因包括源于优选宿主细胞的终止控制区。
工业生产
可根据本发明的方法和系统采用多种培养方法生产本发明的过水解酶催化剂。例如，可通过分批和连续培养两种方法大规模生产在重组微生物宿主中过表达的特定基因产物。
经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程中不进行人为改变。因此，在培养过程起始阶段，在培养基中接种所需的一种或多种生物，生长或代谢活性便可出现，无需再添加任何物质到系统中。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，系统的代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生成。在其他系统中可以获得稳定或指数后期生成。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批培养工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着培养进程递增地添加底物。当分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难于测量，可根据一些可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO2的分压进行评估。分批培养和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial  Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)和Deshpande、Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227-234(1992)。
还可用连续培养的方法实现所需过水解酶催化剂的商业生产。连续培养是一种开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养物质，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用由天然材料和/或合成材料组成的许多固体支持体进行。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续式系统努力维持稳态生长条件，因此由于培养基取出而带来的细胞损失必须针对培养基中的细胞生长速率进行平衡。在连续培养过程中调节营养物质和生长因子的方法以及用于使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域众所周知的，并且许多方法由上文的Brock进行了详细描述。
本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于：单糖，例如葡萄糖和果糖；二糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜及大麦麦芽。此外，碳底物还可以是一碳底物，例如二氧化碳、甲烷或甲醇(例如，当宿主细胞为甲基营养微生物时)。类似地，假丝酵母属的多种物种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.，153：485-489(1990))。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
可通过本领域技术人员已知的任何方法实现从分批发酵、分批补料发酵、或连续培养中回收所需的过水解酶催化剂。例如，当酶催化剂在细胞内产生时，可通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞沉淀物(cell paste)，任选地可用水或所需pH值的含水缓冲液洗涤，然后将所需pH值的含水缓冲液中的细胞沉淀物悬液混匀以产生含有所需酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地通过合适的助滤剂例如硅藻土或二氧化硅过滤来去除细胞残片，然后进行热处理步骤，将不需要的蛋白质从酶催化剂溶液中沉淀出。然后通过膜过滤或离心将含有所需酶催化剂的溶液与沉淀的细胞残片和蛋白质分离，并将所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过附加的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、或其混合物)混合并喷雾干燥以产生含有所需酶催化剂的固体粉末。
申请人特别将所有被引用的参考文献的全部内容引入本公开中。此外，当量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围、或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。
一般方法
为展示本发明的优选方面，本文提供了以下实施例。本领域的技术人员应理解的是实施例中公开的技术遵循本发明人开发的能够有效实施本发明的实践的代表性技术，因此可将这些技术视为适合其实践的优选模式。然而，本领域的技术人员应依据本发明理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。
所有试剂和材料均得自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、RocheDiagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma/Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)，除非另外说明。
说明书中的以下缩写对应于如下度量单位、技术、性能或化合物：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔每升，“M”指摩尔每升，“mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分率，“wt”指重量，“wt％”指重量百分比，“g”指克，“mg”指毫克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指重力，“HPLC”指高效液相色谱法，“dd H2O”指蒸馏和去离子水，“dcw”指细胞干重，“ATCC”或“ATCC
Figure BPA00001382618200621
”指于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“U”指过水解酶活性的单位，“rpm”指每分钟的转速，以及“EDTA”指乙二胺四乙酸。
实施例1
katG过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株的构建
通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：31)扩增卡那霉素抗性基因(kan，SEQ ID NO：30)的编码区，以产生标识为SEQ ID NO：34的PCR产物。katG核酸序列表示为SEQ ID NO：35，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：36。大肠杆菌MG1655(ATCC47076TM)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：37)进行转化并于30℃下在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因(Datsenko和Wanner，2000，PNAS USA97：6640-6645)。MG1655/pKD46采用50至500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃下在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENE
Figure BPA00001382618200623
DNA纯化系统(Gentra Systems，Minneapolis，MN)分离几个菌落的基因组DNA，并采用标识为SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39的引物通过PCR检查来确定katG基因的缺失。几个katG缺失的菌株采用温敏质粒pCP20(SEQID NO：40)进行转化，并于37℃下在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有FLP重组酶，用来切除kan基因。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将这两个菌落称为MG1655KatG1和MG1655 KatG2。
实施例2
katE过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株的构建
通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：31)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：30)，以产生标识为SEQ ID NO：43的PCR产物。katE核酸序列表示为SEQ ID NO：44，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：45。大肠杆菌MG1655(ATCC 
Figure BPA00001382618200631
47076TM)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：37)进行转化并于30℃下在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因。MG1655/pKD46采用50-500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad GenePulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃下在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENE
Figure BPA00001382618200632
DNA纯化系统分离几个菌落的基因组DNA，并采用标识为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47的引物通过PCR检查来确定katE基因的缺失。几个katE缺失的菌株采用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：40)进行转化，并于37℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有FLP重组酶，用来切除kan基因。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将这两个菌落命名为MG1655 KatE1和MG1655 KatE2。
实施例3
katG过氧化氢酶和katE过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株(KLP18)的构 建
通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：31)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：30)，以产生标识为SEQ ID NO：43的PCR产物。大肠杆菌MG1655 KatG1采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：37)进行转化并于30℃下在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因。MG1655KatG1/pKD46采用50-500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃下在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENE
Figure BPA00001382618200641
DNA纯化系统分离几个菌落的基因组DNA，并采用标识为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47的引物通过PCR检查来确定katE基因的缺失。几个katE缺失的菌株(ΔkatE)采用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：40)进行转化，并于37℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有FLP重组酶，用来切除kan基因。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将这两个菌落命名为MG1655 KatG1KatE18.1和MG1655 KatG1KatE23。将MG1655 KatG1KatE18.1指定为大肠杆菌KLP18。
实施例4
那不勒斯栖热袍菌过水解酶的克隆和表达
如在GENBANK(登录号AAB70869)中报道的编码那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的基因的编码区采用在大肠杆菌中最优表达的密码子合成(DNA 2.0，Menlo Park，CA)。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的引物扩增该基因的编码区。将所得的核酸产物(SEQ ID NO：29)亚克隆进pTrcHis2-TOPO
Figure BPA00001382618200643
以产生标识为pSW196的质粒。质粒pSW196用来转化大肠杆菌KLP18以产生菌株KLP18/pSW196。将KLP18/pSW196在37℃下振摇培养于LB培养基中直到OD600nm＝0.4至0.5，达到该OD时加入终浓度为1mM的IPTG，并继续培养2至3小时。离心收集细胞并进行SDS-PAGE，确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的20％至40％。
实施例5
表达过水解酶的大肠杆菌KLP18的发酵
通过向2L摇瓶中加料0.5L种子培养基来制备发酵罐种子培养物，0.5L种子培养基含有酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)、K2HPO4(10.0g/L)、KH2PO4(7.0g/L)、二水合柠檬酸钠(1.0g/L)、(NH4)2SO4(4.0g/L)、MgSO4七水合物(1.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。将培养基的pH值调至6.8，将培养基封装于烧瓶中，然后进行灭菌。灭菌后加入的添加剂包括葡萄糖(50重量％，10.0mL)和1mL的氨苄青霉素(25mg/mL)储备液。在种子培养基上接种1mL大肠杆菌KLP18/pSW196的培养物(含20％甘油)，并在35℃和300rpm下培养。在大约1至2OD550时，将种子培养物转移到14L发酵罐(Braun)中，该发酵罐温度为35℃，并装有8L培养基，该培养基含有KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水合物(0.05g/L)、MgSO4七水合物(2.0g/L)、二水合柠檬酸钠(1.90g/L)、酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡剂(0.25mL/L，Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水合物(10g/L)、和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液含有一水合柠檬酸(10g/L)、MnSO4水化物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水合物(0.5g/L)、ZnSO4七水合物(0.2g/L)、CuSO4五水合物(0.02g/L)和NaMoO4二水合物(0.02g/L)。灭菌后加入的添加剂包括葡萄糖溶液(50％重量比，80.0g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(16.00mL)。葡萄糖溶液(50％重量比)用于分批补料。在葡萄糖浓度降低到0.5g/L时，开始补加葡萄糖，起始进料速率为0.31g/min，随后每小时分别逐渐增加至0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41、1.63g/min；之后进料速率保持不变。监测培养基中的葡萄糖浓度，如果浓度超过0.1g/L，则降低进料速率或暂时停止进料。在OD550＝56和OD550＝80之间时开始诱导，向各种菌株加入16mL的IPTG(0.5M)。溶解氧(DO)浓度控制在25％的空气饱和度。DO开始时通过叶轮搅拌速率(400至1400rpm)控制，然后通过通气速率(2至10slpm)控制。将pH值控制在6.8。用NH4OH(29％重量比)和H2SO4(20％重量体积比)控制pH值。封头压力为0.5巴。IPTG加入16小时后离心收集细胞。
实施例6
喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶的制备
将按照实施例5所述制备的那不勒斯栖热袍菌细胞沉淀物以200g细胞湿重/L的终浓度悬浮于50mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液中。将细胞悬浮液单次通过以12,000psi(约82.74MPa)入口压力运行的APV1000匀化器，从而将悬浮液中的细胞裂解。将所得裂解物在65℃下热处理大约30分钟，将匀浆冷却至室温，然后离心去除所得固体。使用0.1微米过滤器过滤离心所得的上清液，使用30K NMWCO过滤器将所得的含有过水解酶的滤液浓缩至34mg蛋白/mL的蛋白终浓度。向该蛋白溶液中加入大约3倍(按重量计)于蛋白浓度的麦芽糖糊精，并采用225℃的入口温度和76℃的干燥机出口温度将所得溶液喷雾干燥。所得粉末中的蛋白浓度为20.3重量％，干燥固体含量为93.2重量％。
实施例7
加入的溶剂对那不勒斯栖热袍菌过水解酶产生过乙酸的影响
用50％的氢氧化钠水溶液将由90.0g去离子水、0.350g TURPINAL
Figure BPA00001382618200661
SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International，Hague，Netherlands)、和3.20g 30重量％过氧化氢水溶液组成的第一混合物调至pH 7.2，并用去离子水将混合物的最终重量调至100.0g。制备由如下物质组成的第二混合物：55.76g甘油三乙酸酯，4.20g碳酸氢钠，2.50g CAB-O-SILM5热解法二氧化硅(Cabot，Boston，Massachusetts)，0.270g喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例6)，和37.43g选自以下的一种有机溶剂：三丙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200663
TPM；Dow Chemical Corporation，Midland，MI)、二丙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200664
DPM)、丙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200665
PM)、二乙二醇丁醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200666
DB)、二丙二醇(DOWANOL
Figure BPA00001382618200667
DPG)、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯、和1，3-丙二醇。取1.0g第二混合物的等分试样，同时快速搅拌(以悬浮未溶解的固体)，再与9.00mL过氧化氢的第一混合物混合，然后在25℃下一边搅拌一边向其中加入TURPINAL
Figure BPA00001382618200668
SL水溶液(pH 7.2)；所得的混合物含有255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。还进行每种溶剂的对照反应，以测定在没有加入蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。
反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据上文Karst等人描述的方法进行。在预定的时间取出反应混合物的等分试样(0.040mL)，并与0.960mL 5mM的磷酸水溶液混合；通过将稀释样品的pH值调至低于4而立即终止反应。使用ULTRAFREE
Figure BPA00001382618200669
MC过滤装置(30,000标称分子量限(NMWL)，Millipore Corp.，Billerica，MA；目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心2分钟来过滤所得溶液。将所得滤液的等分试样(0.100mL)转入含有0.300mL去离子水的1.5mL HPLC螺旋盖小瓶(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)中，然后加入溶于乙腈的0.100mL 20mM MTS(甲基对甲苯硫醚)，盖上小瓶，短暂混合内容物，然后在大约25℃下避光孵育10分钟。然后向每个小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)乙腈溶液，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃下避光孵育30分钟。然后向每个小瓶中加入0.100mL 10mM N，N-二乙基间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，用如下所述的HPLC法分析所得的溶液。
HPLC方法：
Supelco Discovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(目录号569422-U)，配有Supelco Supelguard Discovery C8前置柱(Sigma-Aldrich；目录号59590-U)；10微升进样体积；CH3CN(Sigma-Aldrich；目录号270717)和去离子水梯度洗脱，速率1.0mL/min，环境温度：
Figure BPA00001382618200671
上述反应进行0.5min、1min、2min、5min和10min产生的过乙酸浓度在下表5中列出。
表5
采用甘油三乙酸酯(255mM)、过氧化氢(254mM)和0.055mg/mL的喷雾 干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶时过乙酸(PAA)浓度对溶剂加入的 依赖性。
Figure BPA00001382618200681
为了证实在甘油三乙酸酯和有机溶剂的混合物中喷雾干燥的酶的稳定性，将甘油三乙酸酯、碳酸氢钠、CAB-O-SILM5(Cabot)、喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例6)以及三丙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200683
TPM)或如上所述的1，2-丙二醇形成的混合物在环境温度下保存24小时，然后从这些混合物中各取1.0g等分试样，同时快速搅拌(以悬浮未溶解的固体)，并与9.0mL新鲜配制(如上所述)的过氧化氢和TURPINAL
Figure BPA00001382618200691
SL在水中形成的混合物(pH 7.2)在25℃下搅拌混合；所得的混合物含有255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。还进行每种溶剂的对照反应，以测定在没有加入蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据Karst等人描述的方法进行。(表6)。
表6
在含有甘油三乙酸酯(255mM)和过氧化氢(254mM)的反应物中测定的 甘油三乙酸酯/溶剂悬浮液中过水解酶的稳定性。
实施例8
在存在或不存在所加溶剂的情况下对那不勒斯栖热袍菌过水解酶产生 过乙酸的比较
用50％的氢氧化钠水溶液将由40.0g去离子水、0.1575gTURPINAL
Figure BPA00001382618200693
SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International)和1.44g 30重量％过氧化氢水溶液组成的第一混合物调至pH 7.2，并用去离子水将混合物的最终重量调至46.87g。制备由2.78g甘油三乙酸酯、0.210g碳酸氢钠、0.125g CAB-O-SIL
Figure BPA00001382618200694
M5(Cabot)和0.0135g喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例6)组成的第二混合物，并将过氧化氢与TURPINAL
Figure BPA00001382618200695
SL在水中形成的第一混合物(pH 7.2)在25℃下搅拌加入第二混合物中；所得的混合物包含255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。反应混合物中过乙酸浓度的测定根据上文Karst等人描述的方法进行。还进行对照反应，以测定在没有加入过水解酶的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。
重复如上所述反应，其中将反应混合物中1.872g的丙二醇单甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200701
PM)或二丙二醇单甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200702
DPM)用等量的水代替。用50％氢氧化钠水溶液将40.0g的去离子水、0.175g的TURPINAL
Figure BPA00001382618200703
SL、和1.60g 30重量％溶于水中的过氧化氢组成的第一混合物调至pH7.2，并用去离子水将混合物最终重量调至50.0g。制备由2.78g甘油三乙酸酯、1.872g丙二醇单甲醚(DOWANOLPM)或二丙二醇单甲醚(DOWANOLDPM)、0.210g碳酸氢钠、0.125g CAB-O-SIL
Figure BPA00001382618200706
M5(Cabot)和0.0135g喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例6)组成的第二混合物，并将45.0g的过氧化氢与TURPINAL
Figure BPA00001382618200707
SL在水中形成的第一混合物(pH 7.2)在25℃下搅拌加入第二混合物中；所得的混合物(pH 6.5)包含255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。还进行对照反应，以测定在没有加入提取蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。上述三个反应进行0.5min、1min、2min、5min和10min产生的过乙酸浓度在下表7中列出。
表7
采用甘油三乙酸酯(255mM)、过氧化氢(254mM)和55μg/mL的喷雾干燥 的那不勒斯栖热袍菌过水解酶得出的过乙酸(PAA)浓度对溶剂加入的 依赖性。
Figure BPA00001382618200708
实施例9
使用双隔室喷雾瓶利用溶剂原位生成过酸与搅拌反应的比较
用50％氢氧化钠水溶液将由包含2000ppm TURPINAL
Figure BPA00001382618200709
SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液，Thermphos International)的100g0.20M柠檬酸钠缓冲液、280g去离子水和5.20g 30重量％过氧化氢水溶液组成的第一混合物调至pH 7.2，并用去离子水将混合物的最终重量调至400g。单独制备第二混合物，其包含83.4g甘油三乙酸酯、3.75gCAB-O-SIL
Figure BPA00001382618200711
M5(Cabot)、0.750g喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例6)和62.1g选自下列的单一溶剂：丙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200712
PM)、三丙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200713
TPM)、二乙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200714
DM)、丙二醇正丁醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200715
PNB)、丙二醇正丙醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200716
PnP)、丙二醇单甲醚乙酸酯(DOWANOL
Figure BPA00001382618200717
PMA)、二丙二醇、乙醇、异丙醇和1，2-丙二醇。在25℃下进行的第一反应中，将1.0g第一混合物与9.0g第二混合物搅拌反应最初的30至60秒(反应pH 6.5至6.0)，取出样品，分析过乙酸生成情况；所得反应混合物包含255mM甘油三乙酸酯、103mM过氧化氢和100μg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。反应混合物中过乙酸的浓度(下表8)的测定根据上文Karst等人描述的方法进行。还进行对照反应，以测定在没有加入过水解酶的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。
将如上所述制备的第一混合物和第二混合物分别装载到双隔室喷雾瓶(定制的双液可变比率喷雾器，型号DLS 200，由Take5(RogueRiver，OR)制造)的两个隔室之一中，其中将喷雾瓶设置为可喷出9重量份的第一混合物与1重量份的第二混合物的混合物。将该两种混合物喷入12.5cm直径的结晶皿中，所得反应混合物(反应pH为6.5至6.0)含有255mM甘油三乙酸酯、100mM过氧化氢和0.100mg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。在预定的时间取样喷雾的反应混合物并根据上文Karst等人所述的方法分析过乙酸(下表8)。
表8
在分批搅拌反应中和在喷雾的双组分混合物中采用甘油三乙酸酯 (255mM)、过氧化氢(103mM)和0.100mg/mL喷雾干燥的那不勒斯栖热 袍菌过水解酶得出的过乙酸(PAA)浓度对溶剂加入的依赖性。
实施例10
用海栖热袍菌过水解酶作为酶催化剂制备过氧羧酸
根据前面的实施例1至4中所述的方法完成海栖热袍菌过水解酶的克隆和表达。根据前面的实施例5进行表达海栖热袍菌过水解酶的细菌转化体的发酵，并用实施例6中所述的方法制备喷雾干燥的海栖热袍菌过水解酶。关于海栖热袍菌过水解酶的克隆、表达和制备技术的其他信息可参见公布的美国专利申请2009/0005590；其以引用方式并入本文。
在存在和不存在所加溶剂的情况下对海栖热袍菌过水解酶产生过乙酸的比较。用50％的氢氧化钠水溶液将由40.0g去离子水、0.1575gTURPINAL
Figure BPA00001382618200741
SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International)和1.44g 30重量％过氧化氢水溶液组成的第一混合物调至pH7.2，并用去离子水将混合物的最终重量调至46.87g。制备由2.78g甘油三乙酸酯、0.210g碳酸氢钠、0.125g CAB-O-SIL
Figure BPA00001382618200742
M5(Cabot)和0.0135g喷雾干燥的海栖热袍菌过水解酶组成的第二混合物，并将过氧化氢与TURPINAL
Figure BPA00001382618200743
SL在水中形成的第一混合物(pH 7.2)在25℃下搅拌加入第二混合物中；所得混合物包含255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。根据上文Karst等人所述的方法测定反应混合物中过乙酸的浓度。还进行对照反应，以测定在没有加入过水解酶的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。
重复如上所述反应，其中反应混合物中1.872g的丙二醇单甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200744
PM)或二丙二醇单甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200745
DPM)用等量的水代替。用50％氢氧化钠水溶液将40.0g的去离子水、0.175g的TURPINAL
Figure BPA00001382618200746
SL、和1.60g 30重量％的过氧化氢水溶液组成的第一混合物调至pH7.2，并用去离子水将混合物的最终重量调至50.0g。制备由2.78g甘油三乙酸酯、1.872g丙二醇单甲醚(DOWANOLPM)或二丙二醇单甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200748
DPM)、0.210g碳酸氢钠、0.125g CAB-O-SIL
Figure BPA00001382618200749
M5(Cabot)和0.0135g喷雾干燥的海栖热袍菌过水解酶组成的第二混合物，并将45.0g的过氧化氢与TURPINAL
Figure BPA000013826182007410
SL在水中形成的第一混合物(pH 7.2)在25℃搅拌加入第二混合物中；所得混合物(pH 6.5)包含255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。还进行对照反应，以测定在没有加入提取蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。测量并记录上述三个反应进行0.5min、1min、2min、5min和10min产生的过乙酸浓度。
实施例11
使用双隔室喷雾装置利用溶剂原位生成过酸与使用海栖热袍菌过水解 酶的搅拌反应的比较
用50％氢氧化钠水溶液将由包含2000ppm TURPINAL
Figure BPA00001382618200751
SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International)的100g0.20M柠檬酸钠缓冲液、280g去离子水和5.20g 30重量％过氧化氢水溶液组成的第一混合物调至pH 7.2，并用去离子水将混合物的最终浓度调至400g。单独制备第二混合物，其包含83.4g甘油三乙酸酯、3.75gCAB-O-SIL
Figure BPA00001382618200752
M5(Cabot)、0.750g喷雾干燥的海栖热袍菌过水解酶(实施例10)和62.1g选自下列的单一溶剂：丙二醇甲醚(DOWANOLPM)、三丙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200754
TPM)、二乙二醇甲醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200755
DM)、丙二醇正丁醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200756
PNB)、丙二醇正丙醚(DOWANOL
Figure BPA00001382618200757
PnP)、丙二醇单甲醚乙酸酯(DOWANOL
Figure BPA00001382618200758
PMA)、二丙二醇、乙醇、异丙醇和1，2-丙二醇。在25℃下进行的第一反应中，将1.0g第一混合物与9.0g第二混合物搅拌反应最初的30至60秒(反应pH 6.5至6.0)，取出样品并分析过乙酸生成情况；所得反应混合物包含255mM甘油三乙酸酯、103mM过氧化氢和100μg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。根据上文Karst等人所述的方法测定反应混合物中过乙酸的浓度。还进行对照反应，以测定在没有加入过水解酶的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。
将如上所述制备的第一混合物和第二混合物分别装载到双隔室喷雾瓶(定制的双液可变比率喷雾器，型号DLS 200，由Take5(RogueRiver，OR)制造)的两个隔室之一中，其中将喷雾瓶设置为可喷出9重量份的第一混合物与1重量份的第二混合物的混合物。将该两种混合物喷入12.5cm直径的结晶皿中，所得反应混合物(反应pH为6.5至6.0)含有255mM甘油三乙酸酯、100mM过氧化氢和0.100mg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。在预定的时间取样喷雾的反应混合物并根据上文Karst等人所述的方法分析过乙酸。
实施例12
示例性的双组分系统
下文描述了双组分原位过酸消毒制剂的一个实例。
Figure BPA00001382618200761
对于上述双组分原位过酸消毒制剂而言，组分A占组分A和B合并重量的约2.6重量％，组分B与组分A的重量比为约38∶1。在双组分原位过酸消毒制剂的某些应用中，期望组分B与组分A的比率在1∶1至10∶1范围内，其中10份至1份(按重量计)组分B与1份(按重量计)组分A混合可制备具有有效消毒浓度的过酸。例如，在第一种应用中，使用双隔室喷雾瓶，如双液固定比率喷雾器(型号DLS100，Take5)或双液可变比率喷雾器(型号DLS200，Take5)，其中采用的组分B与组分A的最大比率为10∶1。在第二种应用中，使用包含两个被易碎密封件隔开的单独隔室的单个瓶子，其中两个单独隔室的体积比为1∶1、或5∶1、或10∶1。在这些应用的每一个中，双组分制剂都不能以组分A与组分B的所需比率混合，从而不能提供所需浓度的反应物和所需终浓度的产物。
实施例13
Figure BPA00001382618200762
二醇二乙酸酯的过水解
用细胞沉淀物(20重量％的细胞湿重)在包含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的悬浮液制备表达野生型枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200763
31954TM(KLP18/pSW194)过水解酶的转化体的匀浆。通过对粗匀浆进行离心移除细胞碎片，在65℃下进行30分钟的热处理，制备净化的细胞提取物。对所得混合物进行离心，热处理的上清液在30KMWCO(截留分子量)薄膜上浓缩至32mg/mL总溶解固体的浓度；净化的、热处理的细胞提取物的SDS-PAGE显示过水解酶的纯度为至少85至90％。然后向该浓缩液中加入2.06g NaH2PO4，并将1.17gNa2HPO4/g固体加入该浓缩液中，制备比率(重量比)为大约3∶1的磷酸盐缓冲液和热处理的细胞提取蛋白质。用去离子水将该溶液稀释30重量％，然后用Buchi B-290实验室喷雾干燥器进行喷雾干燥(入口温度180℃，出口温度70℃)；所得喷雾干燥粉末包含25.5重量％的蛋白质(Bradford蛋白质测定法)，并为94.3重量％的干燥固体。
在23℃下在50mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 7.2)中进行反应(10mL总体积)，反应物包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)、过氧化氢(100mM)和123μg/mL来自喷雾干燥的大肠杆菌KLP18/pSW194(表达枯草芽孢杆菌ATCC
Figure BPA00001382618200771
31954TM野生型过水解酶)(如上文所述制备)的热处理的提取蛋白质。进行每种反应条件下的对照反应，以测定在不添加热处理的提取蛋白质的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。在1、5和30分钟时从反应混合物中取样，用Karst衍生方案(上文Karst等人)对样品中的过乙酸进行分析；取出等分试样(0.040mL)的反应混合物并将其与0.960mL 5mM磷酸水溶液混合；立即通过将稀释样品的pH调至小于pH 4来终止反应。使用ULTRAFREEMC-过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心2分钟来过滤所得溶液。将一份等分(0.100mL)的所得滤液转入含有0.300mL去离子水的1.5mL HPLC螺旋盖小瓶中(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)，然后加入溶于乙腈中的0.100mL 20mM的MTS(甲基对甲苯硫醚)，盖上小瓶，短暂混合内容物，然后在大约25℃避光孵育10分钟。然后向每个小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)乙腈溶液，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃避光孵育30分钟。然后向每个小瓶中加入0.100mL 10mM N，N-二乙基间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，用HPLC分析所得的溶液。表9中列出了在1min、5min和30min内产生的过乙酸的浓度。
表9：在使用碳酸氢钠缓冲液(50mM，初始pH 7.2)中的丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)和过氧化氢(100mM)的反应中，在23℃下用123μg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW194(枯草芽孢杆菌ATCC31954TM过水解酶)的热处理的提取蛋白质产生的过乙酸(PAA)浓度。
Figure BPA00001382618200781
实施例14
使用海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌野生型及变异过水解酶进行的丙 二醇二乙酸酯或乙二醇二乙酸酯的过水解
将细胞沉淀物(20重量％细胞湿重)在包含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的悬浮液两次通过工作压力为16,000psi(约110MPa)的弗氏压碎器，从而分别制备表达那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶(KLP18/pSW196)、那不勒斯栖热袍菌C277S变异过水解酶(KLP18/pSW196/C277S)、那不勒斯栖热袍菌C277T变异过水解酶(KLP18/pSW196/C277T)、海栖热袍菌野生型过水解酶(KLP18/pSW228)、海栖热袍菌C277S变异过水解酶(KLP18/pSW228/C277S)和海栖热袍菌C277T变异过水解酶(KLP18/pSW228/C277T)的转化体的细胞提取物。将裂解的细胞以12,000×g离心30分钟，制备净化的细胞提取物，测定其可溶性总蛋白(Bradford测定法)。将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中冷却2分钟。通过11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。所得的热处理的提取蛋白质上清液的SDS-PAGE显示，CE-7酶占制剂中总蛋白质的大约85至90％。用干冰冷冻热处理的提取蛋白质上清液，保存于-80℃备用。
在20℃下在包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)(100mM)、过氧化氢(100mM)和25μg/mL热处理的提取蛋白质的10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 8.1)中进行第一组反应(10mL总体积)，所述热处理的提取蛋白质来自以下的一种：大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌C277S变异过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌C277T变异过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌C277S变异过水解酶)和大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T(海栖热袍菌C277T变异过水解酶)(如上文所述制备)。进行每种反应条件下的对照反应，以测定在不添加提取蛋白质的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。在1、5和30分钟时从反应混合物中取样，用Karst衍生方案(上文Karst等人)和HPLC分析方法(上文)对样品进行过乙酸分析。表10中列出了1min、5min和30min内产生的过乙酸的浓度。
表10：在20℃下在包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)(100mM)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)(100mM)、过氧化氢(100mM)和25μg/mL热处理的提取蛋白质的碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH 8.1)中用海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌野生型和变异过水解酶所产生的过乙酸(PAA)浓度。
Figure BPA00001382618200791
在20℃下在包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)(2mM)、过氧化氢(10mM)和10μg/mL热处理的提取蛋白质的10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 8.1)中进行第二组反应(10mL总体积)，所述热处理的提取蛋白质来自以下的一种：大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌C277S变异过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌C277T变异过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌C277S变异过水解酶)和大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T(海栖热袍菌C277T变异过水解酶)(如上文所述制备)。进行每种反应条件下的对照反应，以测定在不添加提取蛋白质的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。在5分钟时从反应混合物中取样，用Karst衍生方案(上文Karst等人)和HPLC分析方法(上文)对样品进行过乙酸分析。表11列出了5min内产生的过乙酸浓度。
表11：在20℃下在包含丙二醇二乙酸酯(PGDA)(2mM)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)(2mM)、过氧化氢(10mM)和10μg/mL热处理的提取蛋白质的碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH 8.1)中用海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌野生型和变异过水解酶所产生的过乙酸(PAA)浓度。
Figure BPA00001382618200801
实施例15
那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体在大肠杆菌KLP18中的表达
用野生型那不勒斯栖热袍菌过水解酶(SEQ ID NO：14)通过在第277氨基酸残基位处取代Ala、Val、Ser或Thr(SEQ ID NO：73)制备代理人档案号为CL4392US NA的共同拥有、共同提交和共同未决的美国专利申请中所述的含有乙酰木聚糖酯酶突变的质粒。质粒用于转化大肠杆菌KLP18(实施例3)。将转化体涂布到LB-氨苄青霉素(100μg/mL)板上，在37℃下孵育过夜。用2.5mL补加有20％(体积比)甘油的LB培养基从板上获得细胞，并将1.0mL等分试样的所得细胞悬浮液在-80℃下冷冻。将1mL解冻的细胞悬浮液转移到含有0.7L培养基的1LAPPLIKON
Figure BPA00001382618200811
生物反应器(Applikon
Figure BPA00001382618200812
Biotechnology，Foster City，CA)中，其中培养基包含KH2PO4(5.0g/L)、FeSO4七水合物(0.05g/L)、MgSO4七水合物(1.0g/L)、二水合柠檬酸钠(1.90g/L)、酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)、Biospumex 153K消泡剂(0.25mL/L，Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水合物(0.1g/L)和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液含有一水合柠檬酸(10g/L)、MnSO4水化物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水合物(0.5g/L)、ZnSO4七水合物(0.2g/L)、CuSO4五水合物(0.02g/L)和NaMoO4二水合物(0.02g/L)。灭菌后加入的添加剂包括葡萄糖溶液(50％重量比，6.5g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(2.8mL)。葡萄糖溶液(50％重量比)也用于分批补料。在葡萄糖浓度降低到低于0.5g/L后40min，开始补加葡萄糖，起始进料速率为0.03g/min，随后每小时分别逐渐增加至0.04、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.12和0.14g/min；之后进料速率保持不变。监测培养基中的葡萄糖浓度，如果浓度超过0.1g/L，则降低进料速率或暂时停止进料。在OD550＝50时，添加0.8mL IPTG(0.05M)开始诱导。首先通过搅拌(400至1000rpm)，然后通过通气(0.5至2slpm)将溶解氧(DO)浓度控制在25％的空气饱和度。将温度控制在37℃，将pH控制在6.8；用NH4OH(29％重量比)和H2SO4(20％重量体积比)进行pH控制。在添加IPTG后20小时通过离心(5,000×g15分钟)收获细胞。如实施例2所述培养大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶)的细胞培养物。
实施例16
包含半纯化的野生型那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶或那不勒斯栖 热袍菌变异乙酰木聚糖酯酶
的细胞裂解物的制备如实施例5所述培养大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶)的细胞培养物。将所得的细胞沉淀物(以20％重量体积比)重悬于pH 7.0、补加有1.0mMDTT的50mM磷酸盐缓冲液中。将重悬的细胞两次通过弗氏压碎器，以确保＞95％的细胞裂解。将裂解的细胞以12,000×g离心30分钟，将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中冷却2分钟。通过11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。SDS-PAGE显示，在热处理的提取上清液中，CE-7酶占全部蛋白质的大约85至90％。
如实施例15所述分别培养大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌C277S变异过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277V(那不勒斯栖热袍菌C277V变异过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277A(那不勒斯栖热袍菌C277A变异过水解酶)和大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌C277T变异过水解酶)的细胞培养物。将所得的细胞沉淀物(以20％重量体积比)重悬于pH 7.0、补加有1.0mM DTT的50mM磷酸盐缓冲液中。将重悬的细胞两次通过弗氏压碎器，以确保＞95％的细胞裂解。将裂解的细胞以12,000×g离心30分钟，将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中冷却2分钟。通过11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。SDS-PAGE显示，在热处理的提取上清液中，CE-7酶占全部蛋白质的大约85至90％。
实施例17
那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖野生型酯酶和C277酯酶变体的比活性和 过水解/水解比率
在25℃下在磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)中进行反应(40mL总体积)，反应物包含甘油三乙酸酯(100mM)、过氧化氢(100mM)和以下乙酰木聚糖酯酶变体之一：那不勒斯栖热袍菌C277S变异过水解酶(0.010mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S的热处理的提取总蛋白质)、那不勒斯栖热袍菌C277T变异过水解酶(0.010mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T的热处理的提取总蛋白质)、那不勒斯栖热袍菌C277A变异过水解酶(0.0125mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277A的热处理的提取总蛋白质)和那不勒斯栖热袍菌C277V变异过水解酶(0.0125mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277V的热处理的提取总蛋白质)(如实施例16所述制备)。只在反应的最初30秒搅拌反应混合物，以初步混合反应物和酶。
还在与上文所述相同的条件下用从大肠杆菌KLP18/pSW196(表达那不勒斯栖热袍菌野生型乙酰木聚糖酯酶(实施例1))分离的0.050mg/mL热处理的提取总蛋白质进行反应，其中按照实施例16的步骤制备热处理的提取上清液。
在每个反应1分钟后同时从上文所述的每种反应混合物中取出两个样品，之后每2分钟取一次，共进行15分钟，其中两个样品中的一个用于过乙酸分析，第二个样品用于分析通过甘油三乙酸酯的酶法水解以及后续样品中的过乙酸通过与甲基对甲苯硫醚(MTS，参见下文)的反应向乙酸的转化所产生的总乙酸。
采用改进的上文Karst等人所述的方法测量反应混合物中过乙酸的产生速率。在预定的时间取出反应混合物样品(0.040mL)，并立即与0.960mL 5mM磷酸水溶液混合，通过将稀释样品的pH调至小于pH 4而终止反应。使用ULTRAFREE
Figure BPA00001382618200831
MC过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore CorpBillerica，MA；目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心2分钟来过滤所得溶液。将一份等分(0.100mL)的所得滤液转入含有0.300mL去离子水的1.5mL HPLC螺旋盖小瓶(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)中，然后加入溶于乙腈中的0.100mL 20mM MTS(甲基对甲苯硫醚)，盖上小瓶，短暂混合内容物，然后在大约25℃避光孵育10分钟。然后向小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)乙腈溶液，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃避光孵育30分钟。然后向小瓶中加入0.100mL10mM N，N-二乙基间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，用HPLC分析所得溶液的MTSO(甲基对甲苯亚砜)，其为MTS与过乙酸反应产生的化学计量氧化产物。对照反应在没有加入提取蛋白或甘油三乙酸酯的情况下进行，以确定测试混合物中MTS被过氧化氢氧化的速率，用来校正背景MTS氧化下过乙酸的产生速率。HPLC方法：SupelcoDiscovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(目录号569422-U)，配有SupelcoSupelguard Discovery C8前置柱(Sigma-Aldrich；目录号59590-U)；10微升进样体积；梯度法，CH3CN(Sigma-Aldrich；目录号270717)和去离子水，速率1.0mL/min，环境温度(表4)。
表12.HPLC梯度法分析过乙酸。
  时间(分钟：秒)   (％CH3CN)
  0:00   40
  3:00   40
  3:10   100
  4:00   100
  4:10   40
  7:00(停止)   40
为了确定反应中过水解酶催化的乙酸产生的速率，可在预定的时间取出反应混合物样品(0.900mL)，并立即将其加入包含0.040mL0.75M H3PO4的1.5mL微量离心管中，短暂混合所得溶液，在pH 3.0至4.0时终止反应。然后向管中加入10mg/mL黑曲霉(Aspergillus niger)过氧化氢酶(Sigma-Aldrich；C3515)在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的0.020mL溶液，混合所得溶液，使其在环境温度下反应15分钟，使未反应的过氧化氢发生歧化反应生成水和氧。然后向管中加入0.040mL0.75M H3PO4，混合所得溶液，并用ULTRAFREE
Figure BPA00001382618200841
MC过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore Corp.，目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心2分钟来过滤所得溶液。将一份等分(0.100mL)的所得滤液与0.150mL 20mM的溶于乙腈中的MTS(甲基对甲苯硫醚)混合，然后在大约25℃避光孵育所得溶液10分钟。用配有火焰离子化检测器(FID)和DB-FFAP柱(长15m；内径0.530mm；薄膜厚度1.00μm)的气相色谱仪(GC)确定通过甘油三乙酸酯的酶水解和通过过乙酸与MTS反应向乙酸的转化而制备的样品中的乙酸浓度；用新进样口衬管进行每次速率测定(共8次样品分析)，以避免随着时间推移磷酸积聚在进样口衬管上。
那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体具有比野生型酯酶显著更高的甘油三乙酸酯过水解比活性(表13)。通过用PAA产生速率(过水解速率)除以甘油三乙酸酯水解成乙酸的速率(水解速率)确定那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的过水解/水解比率(用测定方法中PAA和乙酸的总乙酸产生速率计算，并校正过乙酸产生速率)；那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的P/H比率大约等于或大于那不勒斯栖热袍菌野生型乙酰木聚糖酯酶的P/H比率(表13)。
表13
Figure BPA00001382618200851
实施例18
海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体在大肠杆菌KLP18中的表达
用野生型海栖热袍菌(SEQ ID NO：16)通过在第277氨基酸残基位处取代Ala、Val、Ser或Thr(SEQ ID NO：74)制备代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交和共同未决的美国专利申请中所述的含有乙酰木聚糖酯酶突变的质粒。质粒用于转化大肠杆菌KLP18(实施例3)。将转化体在37℃下振摇培养于LB培养基中直到OD600nm＝0.4-0.5，达到该OD时加入终浓度为1mM的IPTG，并继续培养2-3h。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定乙酰木聚糖酯酶的表达量占可溶性总蛋白的20％至40％。
实施例19
包含半纯化海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的细胞裂解物的制备
用与实施例15中所述相似的发酵方案以1L的规模(Applikon)培育细胞培养物(如实施例16所述制备)。通过以5,000×g离心15分钟收获细胞，然后将细胞(以20％重量体积比)重悬于补加有1.0mM DTT的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中。将重悬的细胞两次通过弗氏压碎器，以确保＞95％的细胞裂解。将裂解的细胞以12,000×g离心30分钟，将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中冷却2分钟。通过11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。SDS-PAGE显示，CE-7酶包含制剂中大约85至90％的总蛋白质。
实施例20
海栖热袍菌乙酰木聚糖野生型酯酶和C277酯酶变体的比活性和过水解 /水解比率
在25℃下在磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)中进行反应(40mL总体积)，反应物包含甘油三乙酸酯(100mM)、过氧化氢(100mM)和以下乙酰木聚糖酯酶变体之一：海栖热袍菌C277S变异过水解酶(0.010mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S的热处理的提取总蛋白质)、海栖热袍菌C277T变异过水解酶(0.010mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T的热处理的提取总蛋白质)、海栖热袍菌C277A变异过水解酶(0.0125mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277A的热处理的提取总蛋白质)和海栖热袍菌C277V变异过水解酶(0.0125mg/mL来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277V的热处理的提取总蛋白质)(如实施例19所述制备)。只在反应的最初30秒搅拌反应混合物，以初步混合反应物和酶。
还在与上文所述相同的条件下用从大肠杆菌KLP18/pSW228(表达海栖热袍菌野生型乙酰木聚糖酯酶)分离的0.050mg/mL热处理的提取总蛋白质进行反应，其中按照实施例19的步骤制备热处理的提取上清液。
在每个反应1分钟后同时从上文所述的每种反应混合物中取出两个样品，之后每两分钟取一次，共进行15分钟，其中通过改进的上文Karst等人所述的方法对两个样品中的一个进行过乙酸分析，第二个样品用于分析通过甘油三乙酸酯的酶法水解以及后续样品中的过乙酸通过与甲基对甲苯硫醚(MTS)的反应向乙酸的转化所产生的总乙酸。
海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体具有比野生型酯酶显著更高的甘油三乙酸酯过水解比活性(表14)。通过用PAA产生速率(过水解速率)除以甘油三乙酸酯水解成乙酸的速率(水解速率)确定海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的过水解/水解比率(用测定方法中PAA和乙酸的总乙酸产生速率计算，并校正过乙酸产生速率)；海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的P/H比率大约等于或大于那不勒斯栖热袍菌野生型乙酰木聚糖酯酶的P/H比率(表14)。
表14
Figure BPA00001382618200871
实施例21
用过水解酶产生过乙酸
在10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 8.1)中，在20℃下进行反应，反应物(100mL总体积)包含甘油三乙酸酯(2mM)、过氧化氢(10mM)和0.1μg/mL至2.0μg/mL热处理的细胞提取蛋白质(如上文所述制备，其中在85℃下进行20分钟的热处理)。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据上文Karst等人描述的方法进行。表15中列出了在1min、5min、20min、40min和60min内产生的过乙酸浓度。
表15：过乙酸(PAA)浓度对反应物中过水解酶浓度的依赖性，其中反应物包含碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH 8.1)中的甘油三乙酸酯(2mM)和过氧化氢(10mM)，反应温度20℃，使用来自大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌野生型过水解酶)或大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌C277S变异过水解酶)的热处理的提取蛋白质进行反应(双重反应)。
Figure BPA00001382618200881
实施例22
用过水解酶产生过乙酸
在10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 8.1)中，在20℃下进行反应，反应物(100mL总体积)包含甘油三乙酸酯(20mM)、过氧化氢(10mM)和0.1μg/mL至2.0μg/mL热处理的细胞提取蛋白质(如上文所述制备，其中在85℃下进行20分钟的热处理)。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据上文Karst等人描述的方法进行。表16中列出了在1min、5min、20min、40min和60min内产生的过乙酸浓度。
表16：过乙酸(PAA)浓度对反应物中过水解酶浓度的依赖性，其中反应物包含碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH 8.1)中的甘油三乙酸酯(20mM)和过氧化氢(10mM)，反应温度20℃，使用来自大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌野生型过水解酶)或大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌C277S变异过水解酶)的热处理的提取蛋白质进行反应(双重反应)。
Figure BPA00001382618200891
实施例23
用过水解酶产生过乙酸
在25℃下在磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)中进行反应(40mL总体积)，反应物包含甘油三乙酸酯(100mM)、过氧化氢(100mM)和10μg/mL至50μg/mL热处理的那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌野生型或C277变异过水解酶(如上文所述制备热处理的细胞提取蛋白质，其中在75℃下进行20分钟的热处理)。只在反应的最初30秒搅拌反应混合物，以初步混合反应物和酶。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据上文Karst等人描述的方法进行。表17中列出了1min、5min和30min内产生的过乙酸浓度。
表17：在磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)中，在25℃下，用热处理的那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌野生型或C277变异过水解酶在包含甘油三乙酸酯(100mM)和过氧化氢(100mM)的反应物中制备过乙酸(PAA)。
Figure BPA00001382618200901
实施例24
用过水解酶产生过乙酸
在25℃下，在碳酸氢钠缓冲液(1mM，初始pH 6.0)中进行反应(10mL总体积)，反应物包含甘油三乙酸酯(100mM或150mM)、过氧化氢(100mM、250mM或420mM)和热处理的那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌野生型C277S或C277T变异过水解酶。用420mM过氧化氢(还另外包含500ppm TURPINAL
Figure BPA00001382618200902
SL)进行反应。只在反应的最初30秒搅拌反应混合物，以初步混合反应物和酶。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据Karst等人描述的方法进行。表18中列出了1min、5min和30min内产生的过乙酸浓度。
表18：在碳酸氢盐缓冲液(pH 6.0时1mM或pH 8.1时100mM)或去离子水(pH 5.0)中，在25℃下，用热处理的海栖热袍菌野生型、C277S或C277T变异过水解酶在包含甘油三乙酸酯和过氧化氢的反应物中制备过乙酸(PAA)。
Figure BPA00001382618200911
Figure IPA00001382617600011
Figure IPA00001382617600021
Figure IPA00001382617600031
Figure IPA00001382617600041
Figure IPA00001382617600051
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Figure IPA00001382617600101
Figure IPA00001382617600111
Figure IPA00001382617600121
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Figure IPA00001382617600141
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Figure IPA00001382617600201
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Figure IPA00001382617600401
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Figure IPA00001382617600431
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Figure IPA00001382617600531
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Figure IPA00001382617600831
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Claims (29)

1.制备过氧羧酸的方法，所述方法包括：
(a)提供第一组分，所述第一组分包含：
(i)羧酸酯底物；
(ii)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有糖酯酶家族7(CE-7)特征基序的酶，所述特征基序通过CLUSTALW与SEQ ID NO：2比对并包含：
(1)与SEQ ID NO：2的118-120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；
(2)与SEQ ID NO：2的179-183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；以及
(3)与SEQ ID NO：2的298-299对应的氨基酸位置处的HE基序；
所述酶包含与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性；以及
(iii)至少一种共溶剂，所述共溶剂包括log P小于约2的有机溶剂，其中log P被定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P＝[溶质]辛醇/[溶质]水，并且其中所述至少一种共溶剂不是所述酶催化剂的底物；
其中所述第一组分是(i)-(iii)的基本上无水的制剂；
(b)提供第二组分，所述第二组分包含过氧源的水溶液；以及
(c)将所述第一组分与所述第二组分混合以形成含水的反应制剂，
其中所述共溶剂使所述含水反应制剂中的所述羧酸酯底物溶解，而不会使所述酶催化剂实质上丧失过水解活性，从而制备过氧羧酸。
2.对表面进行消毒的方法，所述方法包括将在权利要求1的步骤(c)中形成的所述含水反应制剂施用到所述表面上的步骤。
3.处理衣物或纺织物的方法，所述方法包括将在权利要求1的步骤(c)中形成的所述含水反应制剂施用到所述衣物或纺织物上以进行漂白、脱色、除臭、卫生处理、消毒或它们的组合的步骤。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中通过喷雾将所述含水反应制剂施用到所述表面或所述衣物上。
5.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述第一组分与所述第二组分以约1∶1至约1∶10的重量比混合。
6.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述共溶剂以约20重量％至约80重量％的量存在于所述第一组分中。
7.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述底物以所述第一组分的约10重量％至约60重量％的量存在于该组分中。
8.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述第一组分包含约55重量％的羧酸酯底物、约40重量％的共溶剂、约0.3重量％的酶催化剂和约2.5重量％的填料，并且其中所述第二组分包含约95重量％的水、约1.5重量％的碳酸氢钠和约1重量％的过氧源。
9.根据权利要求8的方法，其中所述第一组分包含约55.5重量％的甘油三乙酸酯、约41重量％的三丙二醇甲醚、约0.3重量％喷雾干燥的酶粉、以及约2.5重量％的热解法二氧化硅，其中所述酶粉包含那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌过水解酶或者那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌过水解酶的变异衍生物，所述变异衍生物具有一个或多个提高所述过水解活性的点突变，并且其中所述第二组分包含约96重量％的水、约0.2重量％的过氧化氢稳定剂、以及约3.2重量％的包含30％过氧化氢的溶液。
10.根据权利要求1或2的方法，其中在混合所述第一组分和所述第二组分以形成含水反应制剂时，所述羧酸酯底物的初始浓度为约100mM，所述过氧源的初始浓度为约100mM，并且所述酶催化剂的初始浓度为约0.1mg/mL。
11.根据权利要求1或3的方法，其中在混合所述第一组分和所述第二组分以形成含水反应制剂时，所述羧酸酯底物的初始浓度为约10mM，所述过氧源的初始浓度为约10mM，并且所述酶催化剂的初始浓度为约0.01mg/mL。
12.根据权利要求7的方法，其中所述羧酸酯底物包含甘油三乙酸酯，所述过氧源包含过氧化氢，并且所述酶催化剂包含选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：74的氨基酸序列。
13.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述羧酸酯底物在水中具有小于约100mg/mL的溶解度。
14.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述酶还包含在与SEQ IDNO：2的179-183对应的氨基酸位置处的LXD基序。
15.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化剂包含选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
16.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述共溶剂包括三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1，3-丙二醇、或它们的任何组合。
17.根据权利要求16的方法，其中所述共溶剂包括三丙二醇甲醚。
18.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述过氧羧酸为C3-C10过氧羧酸。
19.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述过氧羧酸包括过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过β-羟基丁酸、或它们的任何组合。
20.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化剂以微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶的形式提供。
21.权利要求20的方法，其中所述酶催化剂被固定在可溶或不溶解的支持体之中或之上。
22.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化剂没有过氧化氢酶活性。
23.用于制备过氧羧酸的多组分系统，所述多组分系统包括：
(a)提供第一组分，所述第一组分包含：
(i)羧酸酯底物；
(ii)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有CE-7特征基序的酶，所述特征基序通过CLUSTALW与SEQ ID NO：2比对并包含：
(1)与SEQ ID NO：2的118-120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；
(2)与SEQ ID NO：2的179-183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；以及
(3)与SEQ ID NO：2的298-299对应的氨基酸位置处的HE基序；
所述酶包含与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性；以及
(iii)至少一种共溶剂，所述共溶剂包括log P小于约2的有机溶剂，其中log P被定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，所述分配系数表示为P＝[溶质]辛醇/[溶质]水，并且其中所述共溶剂不是所述酶催化剂的底物；
其中所述第一组分是(i)-(iii)的基本上无水的制剂；以及
(b)提供第二组分，所述第二组分包含过氧源的水溶液；
其中混合所述第一组分和所述第二组分以制备包含过氧羧酸的含水反应制剂，并且其中所述共溶剂使所述含水反应制剂中的所述羧酸酯底物溶解，而不会使所述酶催化剂实质上丧失过水解活性。
24.根据权利要求23的系统，所述系统还包括用于储存所述第一组分的第一隔室和用于储存所述第二组分的第二隔室。
25.根据权利要求24的系统，所述系统还包括混合隔室，其用于接纳来自所述第一隔室的所述第一组分中的至少一些和来自所述第二隔室的所述第二组分中的至少一些，从而允许形成包含所述第一组分中的至少一些和所述第二组分中的至少一些的混合物。
26.根据权利要求25的系统，其中所述第一组分中的所述至少一些与所述第二组分中的所述至少一些以约1∶1至约1∶10的重量比混合。
27.根据权利要求26的系统，所述系统还包括用于从所述混合隔室分配所述含水反应制剂的喷嘴。
28.根据权利要求27的系统，所述系统还包括喷嘴，所述喷嘴用于接纳来自所述第一隔室的所述第一组分中的至少一些和来自所述第二隔室的所述第二组分中的至少一些，并用于同时分配所述第一组分中的至少一些和所述第二组分中的至少一些。
29.根据权利要求23的系统，其中用喷嘴将所述第一组分和所述第二组分递送到表面上，从而允许所述第一组分与所述第二组分在所述表面上混合。
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