CN102435591A - 侦测与辨别分子目标物之装置与方法 - Google Patents

侦测与辨别分子目标物之装置与方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102435591A
CN102435591A CN2011102651304A CN201110265130A CN102435591A CN 102435591 A CN102435591 A CN 102435591A CN 2011102651304 A CN2011102651304 A CN 2011102651304A CN 201110265130 A CN201110265130 A CN 201110265130A CN 102435591 A CN102435591 A CN 102435591A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detecting
optical
sequencing
nucleic acid
luminous power
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011102651304A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102435591B (zh
Inventor
陈鸿钧
李明家
曲昌盛
黎育腾
邱创汎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industrial Technology Research Institute ITRI
Original Assignee
Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Industrial Technology Research Institute ITRI filed Critical Industrial Technology Research Institute ITRI
Publication of CN102435591A publication Critical patent/CN102435591A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102435591B publication Critical patent/CN102435591B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/157—A reaction step characterised by the number of molecules incorporated or released
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1456—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G01N15/149—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1477—Multiparameters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Abstract

一种侦测一具发光能力目标物之装置。该装置包括一光侦测器，其包括至少两个具有测定光强度能力之光学传感器；以及一计算机，其处理由该等光学传感器所产生之输出讯号，并比较该处理之一结果与对应至(之)一已知类型的一已知结果以确定是否该目标物属于该已知类型。

Description

侦测与辨别分子目标物之装置与方法
本申请是申请日为2010年3月10日、申请号为201080006477.0、发明名称为“侦测与辨别分子目标物之装置与方法”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
本发明系关于一种侦测装置，与使用此装置以侦测及/或辨别一目标物的方法。此外，系关于一侦测装置，其可侦测及/或辨别一发射低强度光之目标物。
【现有技术】
人类基因体计划(The Human Genome Project，HGP)刺激定序处理量的大量增加且导致定序成本相对降低，其与每个基因体13年及近三十亿美元之成本相比，定序成本已显著降低一确切地，两个独立之基因体最近已被完成(McGuire et al.，Science 317：1687(2007))。个人基因体代表对于病患与健康照护提供者两者之医学治疗中的典范转移(paradigm shift)。藉由管理疾病之基因风险因子，健康照护提供者可更立即实施预防性药物与提供订做治疗。由于具有经完成之基因体大银行，药物设计与投药可更加有效，将药物基因学(pharmacogenetics)的初期领域往前推进。
许多常见的DNA定序技术执行光电子技术为藉由侦测发射自目标物的光来侦测及/或辨别目标物的方法。而使用于这些技术的侦测装置通常昂贵且效率不高。
常见方法通常基于在一特定波长波段中的测量，其中发射自要被侦测之目标物的光具有最高强度。之后将测量之强度用以计算目标物的浓度或量。近来，侦测发射自一单一目标物的光变为热门。例如，可能需要侦测发射自一单一染料分子之荧光以例如辨别此分子。此类荧光的强度通常非常低，以致常见侦测装置与方法不适合来侦测此类弱光。再者，分析程序，例如流式细胞技术(flow cytometry)或类流式细胞技术微流实验室芯片(flow-cytometry-like microfluidic lab-on-a-chip)装置的灵敏度可能被光侦测器的灵敏度所限制。增加此程序之灵敏度以允许其可侦测于相对低程度存在之物质，而此物质仍被感兴趣于，例如诊断或研究应用中。
此外，在许多常见装置中，常使用彩色滤光片，以允许一特定波长波段中之发射光的一部份通过并阻挡此发射光的其它部分。因此，此装置为复杂的且需要更多空间。此外，由于发射光的部分被彩色滤光片所阻挡，所以到达光侦测器之光子的数目减少。这使此类装置与方法更不适合用来侦测及/或辨别，具微弱发射的目标物。
因此，需要侦测及/或辨别一目标物，特别是发射低强度发射光的目标物，例如一单一染料分子的装置与方法。
【发明内容】
依照本发明之一实施方案，其提供一种侦测一具发光能力目标物之装置。该装置包括一光侦测器，包括至少一第一光学传感器与一第二光学传感器，其具有测定光强度之能力；以及一计算机，其处理由该等光学传感器所产生之输出讯号，并比较该处理之一结果与对应至(之)一已知类型的一已知结果以确定是否该目标物属于该已知类型。
又依照本发明之一实施方案，其提供一种侦测具发光能力目标物之方法。该方法包括提供一光侦测器，包括至少一第一光学传感器与一第二光学传感器，其中该光侦测器吸收发射自至少一目标物的光；处理由该至少两个光学传感器所产生之输出讯号；以及比较该处理之至少一结果与对应于至少一已知类型的至少一已知结果以确定是否该至少一目标物属于该至少一已知类型。
又依照本发明之一实施方案，其提供一种非短暂计算机可读取媒体，其以一计算机程序产品编码。该计算机程序产品当被一计算机所执行时，其指示该计算机处理由至少一第一光学传感器与一第二光学传感器所产生之输出讯号，其中该输出讯号可反应第一光学传感器与第二光学传感器吸收发射自目标物之光的情形；以及比较该处理的一结果与对应至一已知类型的一已知结果以确定是否一目标物属于该已知类型。
又依照本发明之一实施方案，其提供一种核酸定序的方法，包括下列步骤：(a)执行至少一核酸分子之单一分子核酸定序，其中该单一分子核酸定序导致光的发射，该光与该核酸所包括之至少一碱基的身份相关；(b)以至少一光侦测器侦测该光，该光侦测器包括至少一第一光学传感器与一第二光学传感器；(c)处理来自该至少两个光学传感器的输出讯号；以及(d)比较该处理之至少一结果与对应于至少一已知类型的至少一已知结果以测定该核酸所包括之至少一碱基的一身份。
可以了解的是，前方大体叙述与下列详细叙述仅为示范与说明，不限制本发明主张。
本说明书中并组成此说明书之部分的所附图式说明一(一些)本发明实施例，并且连同说明，用来解释本发明原理。
【附图说明】
图1为一曲线图其显示硅之吸收系数(absorption coefficient)。
图2为一图，其显示与本发明实施例一致之一侦测装置。
图3为一图，其显示与本发明实施例一致之一光侦测器。
图4为一图，其显示与本发明实施例一致之一光侦测器。
图5为一图，其显示使用于与本发明实施例一致之一侦测装置中的一光栅。
图6为一曲线图，其显示两个量子点(quantum dot)的发射光谱(emissionspectra)。
图7显示一曲线图，其显示与与本发明实施例一致之两个光二极管的响应曲线(responsivity curve)。
图8显示一曲线图，其显示两个量子点的光谱与两个光二极管的响应曲线(responsivity curve)于一图中。
图9为一流程图，其说明根据本发明一实施例之一侦测方法。
图10为一流程图，其说明根据本发明另一实施例之一侦测方法。
图11为一流程图，其说明根据本发明又另一实施例之一侦测方法。
图12为一流程图，其说明根据本发明一另外实施例之一侦测方法。
图13为一流程图，其说明根据本发明再一实施例之一侦测方法。
图14为一流程图，其说明根据本发明再一另外实施例之一侦测方法。
图15为一流程图，其说明根据本发明又一另外实施例之一侦测方法。
图16为一图，其显示与本发明实施例一致之一示范侦测装置。
图17为一图，其显示一多接面光二极管作为与本发明实施例一致之光侦测器。
图18为一曲线图，其显示于图11之多接面光二极管中之一光二极管的响应曲线。
图19为一曲线图，其显示于图11中多接面光二极管中之另一光二极管的响应曲线。
图20为一曲线图，其显示于本发明一例子中之三个被测试目标物的吸收光谱。
图21为一曲线图，其显示于本发明一例子中之三个被测试目标物的发射光谱。
【主要组件符号说明】
11～光侦测器；
12～计算机；
111～第一光学传感器；
112～第二光学传感器；
J1～第一讯号；
J2～第二讯号；
121～处理单元；
122～输出单元。
601、603～p型层；
602、604～n型层；
201、202、203、204、205、303、304、305、403、404、405、504、505～步骤；
PD-1～第一光学传感器；
PD-2～第二光学传感器。
【实施方式】
与本发明一致之实施方案包括侦测及/或辨别一目标物之一侦测装置。侦测装置具有侦测发射自一目标物之弱光的能力。
与本发明一致之实施方案将于以下伴随参考图式被详细叙述。尽可能于全部图式中使用相同之标号代表相同或类似的部分。
1.本发明一实施方案之装置
可使用与本发明实施方案一致之侦测装置来侦测及/或辨别一具发光能力之目标物。目标物可为一发光(luminescence)来源，例如一荧光染料分子、一磷光染料分子、一量子点或生物发光(bioluminescent)或化学发光(chemiluminescent)系统之一发光产物(例如一激发态反应产物，如单态氧(singlet oxygen)或经激发的腔肠荧光物质(excited coelenteramide))。一本发明之装置可或可不包括至少一激发光(excitatory light)的来源，例如至少一雷射。例如，对于一可经由生物发光(bioluminescent)或化学发光(chemiluminescent)产生光的侦测目标物而言，可不倚靠吸收激发光而产生发射光，所以不需要一激发光的来源。目标物也可为一无光发射能力之标的分子，但可附着至一具有发射光能力的标记目标物(例如，一荧光染料分子、一磷光染料分子或一量子点)。一特定标记目标物可具有被附着至一专一标的分子的能力。因此经由标记目标物可确认标的分子。可将大于一个的标记目标物附着至一标的分子。也可使用此装置来监测大量目标物。
与本发明实施方案一致之侦测装置可包括一光侦测器侦测发射自目标物的光。光侦测器具有至少部分吸收入射于其上的光并产生响应此光的输出讯号。光侦测器可包括用以控制光侦测器之操作的控制电路。控制电路可包括一讯号放大器之电路、A/D转换器、积算器、比较器、逻辑电路、读出电路、内存、微处理器、时钟震荡器(clock)及/或地址(address)。
侦测装置可包括用以处理来自光侦测器的输出讯号及产生测定结果的计算机。侦测装置可更包括具一针孔(pinhole)之遮蔽薄板(blind sheet)。侦测装置也可包括一连结位(linker site)，而目标物可附着至连结位。连结位可形成于针孔中或形成于外侧但接近于针孔。装置可更包括一激发光源。目标物可吸收发射自激发光源的光且之后发射要被侦测装置侦测之另一光。发射自目标物的光与发射自激发光源的光相较可具有不同波长。
1.1光学传感器
与本发明实施方案一致之光侦测器可包括多数个光学传感器。与本发明实施例一致之光学传感器可为，例如一光二极管、一累崩光二极管(avalanchephotodiode，APD)、一光敏晶体管(phototransistor)、一光闸(photogate)、一量子井红外线光侦测器(quantum-well infrared photodetector，QWIP)、一特定应用集成电路上薄膜(thin-film on ASIC，TFA)、一金属-半导体-金属(metal-semiconductor-metal，MSM)光侦测器或其组合。在本发明一实施例中，光学传感器可为一光二极管。
光二极管为一固态装置其将光转变成电流或电压。光二极管通常由半导体材料制成，例如硅。光二极管的基础结构包括藉由连结一p型半导体与一n型半导体所形成的一p-n接面。光二极管可仅具有一p-n接面且仅提供一输出讯号，因此被视为一个光学传感器；一多接面光二极管具有大于一个的p-n接面且可提供大于一个的输出讯号，其中每个p-n接面可被视为一个光学传感器。
或者，光二极管可为一p-i-n光二极管。p-i-n二极管为一p-n接面光二极管的特别形式，其具有夹设于n型层与p型层间的一本质层(intrinsic layer)、或一轻掺杂n型层、或一轻掺杂p型层。在一p-i-n二极管中，可修改几乎为整个本质层之空乏区(depletion region)的厚度以使量子效率(quantumefficiency)与频率响应(frequency response)最佳化(S.M.Sze，Physics ofSemiconductor Devices，pp.674-675，Wiley，2007)。
藉由将p型杂质与n型杂质分别掺杂进入一半导体基底可形成p型半导体与n型半导体。例如，于硅中，磷或砷可作为n型杂质，而硼与铟可作为p型杂质。一般而言，可使用两种方法来将杂质引入一半导体基底中：扩散与离子植入。藉由将p型杂质扩散或植入于n型半导体中，可将n型半导体基底的部分转变成p型半导体。因此，可形成一p-n接面。或者，藉由将n型杂质扩散或植入于p型半导体中，可将p型半导体基底的部分转变成n型半导体，且因此形成一p-n接面。除了扩散与植入，也可使用磊晶成长(epitaxial growth)来制造n型半导体或p型半导体，磊晶成长为一制程，其将一薄的、单晶层(single crystal layer)成长于一单晶基底的表面上(D.A.Neamen，Semiconductor Physics & Devices，pp.17-18，McGrawHill，1997)。当光为入射于一光二极管上时，可产生电子-电洞对(electron-hole pair)于光二极管中。若一电子-电洞对被产生于光二极管之空乏区中时，于空乏区中之内建电位(built-in potential)可将电子与电洞分离并因此产生光电流(photocurrent)或电压。
不同之光二极管可具有不同之吸收一入射光的能力。藉由构成光二极管的材料的吸收系数α可描述此能力。图1显示硅于不同波长之吸收系数。入射光之光通量(photon flux)Φ随着光穿透进入光二极管的深度以指数方式减少。于光二极管内一深度x的光通量可被表示为：
Φ(λ，x)＝Φ0(λ)·e-αx；
其中λ为入射光之波长而Φ0为于光二极管之表面的光通量。因此，于空乏区中被吸收之光通量可被假定为：
ΔΦ(λ)＝Φ0(λ)·(e-αxu-e-αxl)；
其中xu与xl分别为空乏区之上与下边界的深度。
可将于空乏区中被吸收之光通量转变成一光电流作为光二极管的一输出讯号。光电流可被表示为：
IPD(λ)＝1.98x10-16·A·[Φ0(λ)·R(λ)/λ]；
其中A为光学窗(optical window)的面积，且R(λ)为一光二极管之响应(responsivity)，其被定义为由入射光之一单位能量所产生之光电流的量。
1.2用于讯号处理之计算机
与本发明实施方案一致，提供一计算机，其可处理由光侦测器产生之输出讯号，藉由于输出讯号上执行一数学或逻辑操作，并测定目标物之存在与确定目标物之类型。用于处理来自一光学传感器之输出讯号的计算机可为，例如，一个人计算机、一微处理器或可程序化消费电子(programmableconsumer electronic)、一逻辑电路或其类似物。
计算机可包括一或多个暂时或永久储存数据的储存装置及含有表现一算法之软件码(software codes)的计算机程序。计算机可根据算法来执行处理。储存装置可为一只读存储器(read-only memory，ROM)、随机存取内存(randomaccess memory，RAM)、或一具有其它存取选项(access option)的内存。藉由计算机可读媒体，如，例如(a)磁性媒体(magnetic media)，如一硬盘(hard disk)、一软盘片(floppy disk)或其它磁性碟，一磁带(tape)、一卡式磁带(cassette tape)；(b)光学媒体(optical media)，如光盘(optical disk)(CD-ROM、数字多功能光盘(digital versatile disk-DVD))；(c)半导体媒体，如动态随机存取内存(dynamic random access memory，DRAM)、静态随机存取内存(static randomaccess memory，SRAM)、可抹除可编程只读存储器(erasable programmableread only memory，EPROM)、电子可抹除可编程只读存储器(electricallyerasable，programmable，read-only memory，EEPROM)、记忆卡(memory stick)，或藉由任何其它媒体，如纸，可将储存装置实际植入。
计算机可包括一或多个接口(interface)用以接收来自光侦测器的输出讯号。计算机可包括一或多个用以处理这些讯号的处理器。
此外，计算机可包括一或多个用以接收来自一使用者指示之输入装置，且可包括一或多个用以输出处理结果的输出装置。输入装置可为，例如一鼠标、一键盘或具有多数个按钮的控制板。输出装置可为，例如一显示器或一打印机。
1.3示范之侦测装置
参见图2，其显示与本发明实施方案一致之侦测装置1。侦测装置1可包括一光侦测器11与一计算机12。
光侦测器11可包括一第一光学传感器111与一第二光学传感器112。在一些实施例中，光侦测器11可包括大于两个的光学传感器。例如，在一些实施例中，光侦测器11可包括三个光学传感器或四个光学传感器。第一光学传感器111与第二光学传感器112可为被堆叠的。于堆叠之结构中，发射自一目标物的光通过第一光学传感器111，且之后通过第二光学传感器112。在一些实施例中，光学传感器可为垂直或实质上垂直堆叠。在其它实施例中，对于垂直方向而言，光学传感器可以一方向于一特定角度(例如，10°、30°、45°、60°等)被倾斜地堆叠。在一些实施例中，光侦测器11可为多接面光二极管，其包括多数个p-n接面形成于其中。于一多接面光二极管中，每个p-n接面可形成一个别之光学传感器的基础结构。第一光学传感器111与第二光学传感器112的各个可分别包括，例如于多接面光二极管中之一p-n接面，如于图3中所示。
在一些实施例中，于光侦测器11中之不同的光学传感器可由相同之半导体材料，例如硅、锗、GaAs、AlGaAs、InGaAs、InGaAsN、InGaP、CdTe或CdS所制成。在一些实施例中，于光侦测器11中之不同的光学传感器可由不同之半导体材料所制成。例如，图4显示一光侦测器由两个垂直堆叠之光学传感器PD-1与PD-2所形成。光学传感器PD-1由材料-1与材料-2所制成，而光学传感器PD-2由材料-2与材料-3所制成。材料-1、材料-2与材料-3可为上述半导体材料之组合。此外，这些光学传感器的厚度也可为不同。
如图2所示，发射自一目标物，例如一量子点(quantum dot，QD)而入射于光侦测器11上的光可被第一光学传感器111部分吸收，而产生一第一讯号J1。未被吸收之光通过第一光学传感器111且之后可被第二光学传感器112部分吸收，而产生一第二讯号J2。可将这些讯号送至计算机12来处理。
在一些实施例中，发射自一目标物的光可入射至光侦测器11上而不通过另一光学组件，例如一光学滤光片、一棱镜或一透镜(即，可直接入射至光侦测器上)。在一些实施例中，装置可更包括一光收集光学结构以收集发射自目标物的光。
在一些实施例中，光侦测器11可包括两个或更多个光学传感器水平排列(未显示)。在这些实施例中，侦测装置1可更包括一光学结构置于目标物与光侦测器11之间。发射自目标物的光可藉由光学结构将其引导至一或多个光学传感器并被一或多个光学传感器所吸收。对于不同波长的光而言，在通过光学结构后，光的方向可为不同。因此，以水平排列之于光侦测器中不同的光学传感器可侦测具有不同波长的光。
在一些实施例中，光学结构可包括一棱镜。在一些实施例中，光学结构可包括一透镜。在一些实施例中，光学结构可包括一棱镜与一透镜。棱镜可为，例如一三角棱镜、一阿贝棱镜(Abbe prism)、一贝林-布洛卡棱镜(Pellin-Broca prism)、一阿米其棱镜(Amici prism)或其组合。透镜可为，例如一会聚透镜(converging lens)、一发散透镜(diverging lens)或其组合。光学结构可由，例如玻璃、塑料或对于所感兴趣之波长而言为可穿透的其它材料。光学结构的穿透度可为够高以允许大部分的光通过光学结构。
或者，在一些实施例中，光学结构可包括一光栅。光栅可为，例如一二元光栅(binary grating)、一闪耀光栅(blaze grating)、一正弦光栅(sinusoidalgrating)、一多阶式光栅(multi-level grating)、一体积光栅(volume grating)或其组合。图5显示为与本发明实施例一致之侦测装置。于此侦测装置中，光侦测器包括多数个光学传感器水平排列于不同位置。可使用光栅以将来自目标物之不同波长的光引导至光侦测器的不同位置以便由不同光学传感器所吸收。
与本发明实施例一致，可提供一侦测系统，其包括与本发明实施例一致之侦测装置数组。与本发明实施例一致，也可提供一侦测系统，其包括与本发明实施例一致之光侦测器数组与一计算机，计算机用以处理来自光侦测器之数组的输出讯号并根据处理结果执行侦测及/或辨别。上述侦测系统可一次侦测及/或辨别多数个目标物，且因此适合，例如核酸之大规模平行定序。
计算机可包括一处理单元121与一输出单元122。处理单元121处理来自光侦测器11的输出讯号并测定目标物之存在与确定目标物之类型。输出单元122输出测定结果。在一些实施例中，计算机12也可包括一储存装置(未显示)，储存一计算机程序。计算机程序可包含用以指示计算机以处理讯号之软件码。
可将光侦测器11与计算机12整合成一单片的半导体芯片。可将光侦测器11与计算机12形成于分开的半导体芯片上。
2.侦测方法
发射自不同目标物的光可具有不同光谱。例如，图6显示作为两目标物之两个量子点(QDs)(QD-1与QD-2)的发射光谱。于此例子中，此两发射光谱的波峰于不同之波长。于其它例子中，不同目标物之发射光谱也可具有不同的形状。
第一光学传感器111与第二光学传感器112可具有不同之响应特性。图7显示，作为一例子之第一光学传感器111与第二光学传感器112的响应曲线。第一光学传感器111与第二光学传感器112的响应率(responsivity)可彼此互相不同，其中它们具有不同的形状及/或它们可在不同波长到达高峰。
为了更清楚解释，图8显示两个光学传感器的响应曲线与两个量子点的发射光谱于一个图中。于此例子中，发射自QD-1的光可在两个光学传感器上产生相似强度的讯号。另一方面，发射自QD-2的光在第二光学传感器112上产生的讯号强于在第一光学传感器111上产生的讯号。
在一些实施例中，如于图2中所示，发射自一目标物的光可入射至光侦测器11且被第一光学传感器111与第二光学传感器112所部分吸收，其依序分别产生讯号J1与J2。计算机12处理讯号J1与J2，并辨别目标物。
图9显示根据本发明一实施例之辨别一目标物方法的流程图。于步骤201，发射自一目标物的光入射至光侦测器11上。于步骤202，分别由第一光学传感器与第二光学传感器产生两个输出讯号J1与J2，并将讯号J1与J2送至计算机12。于步骤203，计算机12处理讯号J1与J2。于步骤204，计算机12比较处理结果与对应至一目标物之已知类型的已知结果。于步骤205，计算机12确定是否目标物属于此已知类型。
在一实施例中，处理讯号J1与J2可包括计算J1与J2的比值。若计算出之比值为在对应至目标物之已知类型的特定范围中，则可确定被侦测之目标物属于此已知类型。例如，一量子点QD-1之已知类型可具有0.7＜J2/J1＜1.2的对应范围。若一被侦测之目标物计算出的比值为0.9，则目标物被确定为一QD-1类型目标物。
图10显示根据本发明另一实施例之辨别一目标物方法的流程图。于此实施例中，可测定一目标物属于，例如三种目标物的已知类型之一，即，类型1、类型2与类型3。此实施例之最先的两个步骤可与上述实施例所述之那些相同。于步骤303，计算机12测定介于此两讯号J1与J2之间的关连性。于步骤304，计算机12比较此关连性与对应至目标物之已知类型的已知结果。于步骤305，计算机12根据比较结果确定出目标物属于何种类型。
在此实施例中，例如，若J1＞J2，则于是可确定目标物为一类型1目标物。若J1≈J2，则于是可确定目标物为一类型2目标物。若J1＜J2，则于是可确定目标物为一类型3目标物。
图11显示根据本发明又一实施例之辨别一目标物方法的流程图。在此实施例中，可确定目标物属于多数个目标物之已知类型之一，而多数个已知类型之目标物，即类型1至类型n。此实施例之最先的两个步骤可与上述实施例中的那些相同。于步骤403，计算机计算J1与J2之比值。于步骤404，计算机12比较计算出之比值与对应至目标物已知类型之已知比值。于步骤405，计算机12根据比较结果确定目标物属于何种类型。
于此实施例中，例如，若在所有已知类型之已知比值中，类型i之已知比值(1≤i≤n)为最接近计算出之比值，则于是可确定目标物属于一类型i目标物。
图12显示根据本发明一另外实施例之辨别一目标物方法的流程图。于此实施例中，可确定一目标物属于多数个目标物之已知类型之一，而多数个已知类型之目标物，即类型1至类型n。此实施例之最先的两个步骤可与上述实施例中的那些相同。于步骤504，计算机12比较计算出之比值与对应至目标物已知类型之已知比值范围。于步骤505，计算机12根据比较结果确定出目标物属于何种类型。
于此实施例中，例如，若计算出之比值落入对应至类型i的比值范围(1≤i≤n)中，则于是可确定目标物为一类型i目标物。若计算出之比值不落入任何范围中，则其可被报导为信心程度低且无法确定要被侦测之目标物的类型。例如，假定类型1目标物具有0.7＜J2/J1＜1.2之对应比值范围，而类型2目标物具有J2/J1＞2之对应比值范围，若要被侦测之目标物之计算出的比值为1，则可确定目标物为一类型1目标物。另一方面，若要被侦测之目标物之计算出的比值为1.5，其可被报导为信心程度低且无法确定要被侦测之目标物的类型。
在一实施例中，J1与J2的比值可为J2/J1。于一实施例中，J1与J2的比值可为J1/J2。在一些实施例中，J1与J2的比值可为J2/(c x J1)或J1/(c x J2)，其中“c”为一系数。
于一些实施例中，在将讯号送至计算机12后，计算机12可额外执行一测定是否一目标物存在于一样本中的步骤。在一些实施例中，藉由比较所有或一些讯号的总和与一临界值可执行此测定。在一些实施例中，例如，若总和等于或大于此临界值，则可测定一目标物为存在。另一方面，若总和小于此临界值，则可测定一目标物为不存在。在其它实施例中，若总和小于此临界值，则可测定一目标物为存在。若总和等于或大于此临界值，则可测定一目标物为不存在。在一些实施例中，藉由直接比较讯号与临界值可执行此测定以测定一目标物的存在。例如，若任何讯号为，或特定数目之讯号为等于或大于临界值，则可测定一目标物为存在。另一方面，若所有讯号小于此临界值，则可测定一目标物为不存在。
在一些实施例中，光侦测器11可包括三个或更多个光学传感器，根据发射自一目标物入设于光侦测器11上的光，各产生一输出讯号。在一些实施例中，藉由计算机12可处理两个所产生之输出讯号以辨别目标物。在其它实施例中，藉由计算机12可处理更多或所有产生之输出讯号以辨别目标物。
图13显示根据本发明再一实施例之辨别一目标物方法的流程图。于此实施例中，光侦测器11包括三个光学传感器PD1、PD2与PD3。可侦测并确定于一样本中之一目标物属于例如，四种类型之一，例如染料1、染料2、染料3与染料4。将由这三个光学传感器所产生之输出讯号分别以IPD1、IPD2与IPD3来表示，并将其送至计算机12以进行处理。于以下描述此方法。
首先，可使用一激发光源来激发样本。之后光学传感器PD1、PD2与PD3可产生输出讯号IPD1、IPD2与IPD3。根据接收输出讯号，计算机12可计算这些讯号的总和。若总和小于一临界值Vth，则计算机12会产生一没有荧光发生的报告。否则，计算机则会继续进行至下个步骤。
当测定出荧光的确发生而目标物存在时，计算机12首先可执行一原始辨别步骤。于此步骤中，计算机12可计算于IPD3与所有讯号之总和间的一第一比值，并比较此比值与第一组临界值，例如Vth1、Vth2、Vth3与Vth4以测定是否计算出之第一比值落入介于0与Vth1、介于Vth1与Vth2、介于Vth2与Vth3或介于Vth3与Vth4之间的任何范围中。然而，若计算出之第一比值不落入任何上述之范围中，计算机12可产生一发生缺陷之发射的报告。
之后，执行一确认步骤。在确认步骤中，计算于IPD2与IPD3间的一第二比值，并比较此比值与第二组临界值，例如Vth1’、Vth2’、Vth3’与Vth4’以测定是否计算出之第二比值落入介于0与Vth1’、介于Vth1’与Vth2’、介于Vth2’与Vth3’或介于Vth3’与Vth4’之间的任何范围中。
例如，若于原始辨别步骤中，计算出之第一比值落入介于Vth1与Vth2之间的范围中，则可确定目标物可能属于类型染料2。之后计算机12继续进行至确认步骤以测定是否计算出之第二比值落入介于Vth1’与Vth2’之间的范围中。若是，则可确定目标物属于类型染料2。否则，计算机会产生一发生缺陷之发射的报告。
需注意的是，可独立执行上述原始辨别步骤与确认步骤之任何一个以辨别一目标物。然而，于一辨别程序中执行两个步骤可改善准确性。
图14显示根据本发明再一另外实施例之辨别一目标物方法的流程图。于此实施例中，光侦测器包括多数个光学传感器PD1、PD2、...PDn，其中n为大于1且可等于或小于6。此外，n可等于3。可使用此实施例之装置与方法来侦测并辨别q个不同之目标物，例如q个不同之染料，表示为D1、D2、...Dq。
于此实施例中使用的激发光源可具有k个不同之激发光波段，L1、L2、...Lk，其中k可等于或大于1及等于或小于3。根据一组指令，激发光源可开启及关闭，而产生一组m个不同之激发状态Cj，其中1≤j≤m。各激发状态可为不同激发光波段的组合。在相同之激发状态下，对于不同之染料由一特定光学传感器所产生的输出讯号可为不同。
在一特定染料Ds之j-th激发状态Cj下(其中1≤s≤q)，在i□th光学传感器PDi(其中，1≤i≤n)所产生之输出讯号可表示为Ds{J{PDi:Cj}}。PDi与Cj之不同组合可产生不同的Ds{J{PDi:Cj}}。因此，在使用此装置以侦测并辨别一未知染料之前，在染料Ds之标准环境下，藉由使用PDi与Cj之不同组合来执行校正读取，可获得输出讯号之矩阵。此矩阵可为一染料Ds所特有的，且可称为染料Ds之标准读取矩阵，M{dye Ds}，如下所示：
Ds{J{PD1:C1}}，Ds{J{PD2:C1}}，...Ds{J{PDn:C1}}
Ds{J{PD1:C2}}，Ds{J{PD2:C2}}，...Ds{J{PDn:C2}}
...
Ds{J{PD1:Cm}}，Ds{J{PD2:Cm}}，...Ds{J{PDn:Cm}}
对于各染料而言，可重复校正读取，而产生q个标准读取矩阵M{dyeD1}、M{dye D2}、...M{dye Dq}。
为了使背景的影响最小化，当没有染料存在时，藉由记录来自光学传感器的输出讯号，也可获得一背景读数，背景读数可产生一背景读取矩阵M{background}：
B{J{PD1:C1}}，B{J{PD2:C1}}，...B{J{PDn:C1}}
B{J{PD1:C2}}，B{J{PD2:C2}}，...B{J{PDn:C2}}
...
B{J{PD1:Cm}}，B{J{PD2:Cm}}，...B{J{PDn:Cm}}
当将一未知样本提供至侦测装置时，测量在不同激发状态下由光学传感器产生之输出讯号，并获得一样本读取矩阵M{sample}：
J{PD1:C1}，J{PD2:C1}，...J{PDn:C1}
J{PD1:C2}，J{PD2:C2}，...J{PDn:C2}
...
J{PD1:Cm}，J{PD2:Cm}，...J{PDn:Cm}
之后可比较样本读取矩阵与标准读取矩阵以确定样本含有何种类型之染料。为了使背景对结果的影响最小化，在比较前可自标准读取矩阵与样本读取矩阵两者减去背景读取矩阵。
比较可藉由计算染料Ds之各种形式的排序(rank)Rs来执行。当计算Rs时，可实施加权系数(weight factor)与统计方法。例如，可使用最小平方法(leastsquared method)或最大概似法(most likelihood method)以得到最佳配对。可将加权系数应用于各光学感测或激发光模式以增加分析准确性。
在计算出Rs之后，计算机12会根据排序(rank)Rs报导出最可能之染料、第二可能之染料及诸如此类。
于合成方法之定序中，藉由鉴定对应于模版新加入至合成中的股(strand)之核苷酸来测定DNA序列。藉由发射自附着于核苷酸的荧光团来侦测核苷酸加入步骤。可将核苷酸合并反应(nucleotide incorporation reaction)分成许多步骤：核苷酸接至由聚合酶与模板形成之活化位，打断磷酸键与形成对于糖的新键结。一些核苷酸只是扩散于活化位而进进出出，并无实际的合并发生。为了于实时监测合并反应，侦测装置需要可侦测荧光团到达、反应之时间与荧光团之类型。测量保留时间的理由为与那些被合并之核苷酸相较，扩散之核苷酸会停留较短的时间。藉由设定保留时间临界值，可侦测一实际合并的情况。可用于情况侦测之根据本发明又一另外实施例的方法的流程图显示于图15中。此方法基本上与前述相似，而再多加入一步骤以测定是否可声称一状态。因此，此方法之详细叙述被省略。图16显示可用于此实施例之示范侦测装置的块状图。
在一些实施例中，光侦测器11可包括两个或更多个水平排列之光学传感器。可将由水平排列之光学传感器产生的讯号输入至计算机12并以相似于前述方法之一的方式处理以测定目标物的存在及/或辨别目标物之类型。
3.应用
可将与本发明实施例一致之侦测装置与系统及其使用方法应用于，例如核酸侦测、DNA定序、生物标记鉴定或流式细胞技术。侦测装置可侦测并处理低强度光讯号，其使单一分子目标物的辨别变为可能。
在本发明方法之一些实施例中，将标签附着于分析物(即，要被侦测之物质)、探针，例如引子、抗体或其它与分析物反应之试剂，或其它试剂，例如核苷酸(包括核苷酸类似物)。可使用任何标签于分析物或探针上，其在讯号与分析物的量或存在的关系中为有用的。
例如，可使用于本发明实施例之多种荧光分子包括小分子、荧光蛋白质与量子点。有用的荧光分子(荧光团)包括，但不限于：1、5 IAEDANS；1、8-ANS；4-甲基伞形酮(4-Methylumbelliferone)；5-羧基-2，7-二氯荧光黄(5-carboxy-2，7-dichlorofluorescein)；5-羧基荧光素(5-Carboxyfluorescein，5-FAM)；5-羧基萘基荧光素(5-Carboxynapthofluorescein)；5-羧基四甲基罗丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine、5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素(5-Carboxyfluorescein))；5-HAT(羟色胺(Hydroxy Tryptamine))；5-羟色胺(5-Hydroxy Tryptamine、HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明(carboxy-X-rhodamine))；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine))；6-羧基罗丹明(6-Carboxyrhodamine)6G；6-CR 6G；6-JOE；7-胺基-4-甲基香豆素(7-Amino-4-methylcoumarin)；7-氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素(7-Hydroxy-4-methylcoumarin)；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)；ABQ；Acid Fuchsin；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine))；吖啶橘(Acridine Orange)；吖啶红(Acridine Red)；吖啶黄(Acridine Yellow)；吖啶黄(Acriflavin)；吖啶黄佛尔根SITSA(Acriflavin Feulgen SITSA)；自发荧光蛋白质(AFPs-AutoFluorescent Protein-)(Quantum Biotechnologies)；Texas Red；Texas Red-X conjugate；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；噻嗪红R(Thiazine RedR)；噻唑橘(Thiazole Orange)；硫代黄素5(Thioflavin 5)；硫代黄素S(ThioflavinS)；硫代黄素TCN(Thioflavin TCN)；Thiolyte；噻唑橘(Thiozole Orange)；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；True Blue；TruRed；Ultralite；Uranine B；Uvitex SFC；WW 781；X-Rhodamine；XRITC；Xylene Orange；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；螯合染料(interchelating dyes)，例如YOYO-3、Sybr Green、Thiazole orange；AlexaFluor染料系列(来自Molecular Probes/Invitrogen)之成员，其覆盖广泛的光谱且并符合一般激发源的主要输出波长，例如Alexa Fluor 350、Alexa Fluor405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700与750；Cy染料荧光团系列(GE Healthcare)的成员，也覆盖一宽的光谱，例如Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；Oyster染料荧光团(Denovo Biolabels)的成员，例如Oyster-500、-550、-556、645、650、656；DY-标记系列(Dyomics)的成员，例如，具有自(DY-415)至844nm(DY-831)的最大吸收范围，例如DY-415、-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-631、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XL；ATTO系列之荧光标记(ATTO-TEC GmbH)的成员，例如ATTO390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740；CAL Fluor系列或Quasar系列之染料(Biosearch Technologies)的成员，例如CAL FluorGold 540、CAL Fluor Orange 560、Quasar 570、CAL Fluor Red 590、CALFluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Quasar 670；量子点，例如EviTags系列(Evident Technologies)之量子点或Qdot系列(Invitrogen)之量子点，例如Qdot525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705、Qdot 800；荧光素(fluorescein)；罗丹明(rhodamine)；及/或藻红蛋白(phycoerythrin)；或其组合。
在一些实施例中，提供至少一个生物发光或化学发光系统，而生物发光或化学发光系统于一实体，例如分析物、试剂或反应产物存在下产生光。例如，可使用生物发光或化学发光系统来侦测产生于使用合成反应之定序中的焦磷酸盐(pyrophosphate)(于下方更详细讨论)；来侦测金属例如铁或铜，藉由它们之光产生反应的催化；或来测量结合至分析物之试剂的量，其中试剂包括至少一个生物或化学发光系统的组成。
本技术领域中已知之生物发光系统的例子包括含有至少一个冷光酵素(luciferase)的系统，例如萤火虫冷光酵素，包括北美萤火虫(Photinus pyralis)冷光酵素。可使用生物发光系统，例如藉由提供冷光酵素、ATP硫化酶、冷光素(luciferin)与腺苷-5′-磷酸硫酸酐(adenosine 5’phosphosulfate)连同合成反应之定序的成分(于其中可以类似物，如dATPαS来取代dATP以避免起因于冷光酵素消耗dATP之非专一的光)来侦测焦磷酸盐。当焦磷酸盐系藉由核苷酸合并状况产生时，ATP硫化酶在腺苷-5′-磷酸硫酸酐依赖方式下产生ATP。藉由冷光酵素，ATP驱动冷光素转变为氧化冷光素加上光。其它发光系统包括根据发光蛋白质(photoprotein)，例如埃奎林(aequorin)的系统，发光蛋白质使coelenterazine氧化成激发态之coelenteramide，而使其发射光线。
化学发光系统的例子包括鲁米诺(luminol)加上过氧化氢，其可在金属催化剂或辅助氧化剂存在下经历一光发射反应；草酸二苯酯(diphenyl oxalate)加上过氧化氢与一适合之染料，其可在产生二氧化碳的多步骤反应中经历激发与光放射(适合之染料的例子包括，苯代蒽衍生物(phenylated anthracenederivatives)，例如9，10-二苯基蒽(9，10-diphenylanthracene)、9，10-双苯乙炔基蒽(9，10-Bis(phenylethynyl)anthracene)与1-氯-9，10-二苯乙炔基蒽(1-Chloro-9，10-bis(phenylethynyl)anthracene)，与罗丹明(rhodamines)，例如罗丹明6G与罗丹明B)；单态氧(singlet oxygen)产生系统，例如过氧化氢加上次氯酸钠(sodium hypochlorite)；以及包含酵素，例如山葵过氧化酵素(horseradish peroxidase)的系统，酵素作用于鲁米诺或其它市售可得受质。
在本发明之一些实施例中，其方法包括，例如在试剂或分析物与表面或标签之间形成共价附着。例如，在单一分子定序程序中，可将一核酸分子或一酵素，例如聚合酶附着至一表面，例如一玻璃载片。此种附着可允许在多复位序循环期间之数据的获得。在一些实施例中，形成例如，试剂至表面或标签之共价附着的许多方法，为本技术领域所已知。也可使用非共价附着方法。也可使用一些不同的化学修饰剂(chemical modifier)以促进附着形成。化学修饰剂的例子包括N-羟基丁二硫亚氨(N-hydroxy succinimide，NHS)基团、胺(amine)、醛类(aldehyde)、环氧树脂化合物(epoxide)、羧基(carboxyl)基团、羟基(hydroxyl)基团、醯肼(hydrazides)、疏水(hydrophobic)基团、薄膜(membranes)、马林醯亚胺(maleimide)、生物素(biotin)、链抗生物素蛋白(streptavidin)、硫醇(thiol)基团、镍螫合物(nickel chelate)、光反应性(photoreactive)基团、硼(boron)基团、硫酯(thioester)、半胱氨酸(cysteine)、双硫(disulfide)基团、烷基(alkyl)与酰基(acyl)卤化物(halide)基团、麸胱甘肽(glutathione)、麦芽糖(maltose)、叠氮化物(azide)、磷酸盐(phosphate)与磷化氢(phosphines)。一些具有修饰的表面，例如具有化学修饰表面之玻璃载片为市售可得。具有其它修饰的表面可以使用标准方法来制备(Microarray BiochipTechnologies，Mark Schena，Editor，March 2000，Biotechniques Books)。在一些实施例中，藉由使用一适合之修饰剂的组合(例如，亲电子修饰剂(electrophilic modifier)与亲核修饰剂(nucleophilic modifier))可于两个实体间形成附着，其中各实体包括至少一个修饰剂。
在一实施例中，藉由使用存在于实体与其它实体之自然发生基团之一上的化学修饰剂，于两实体间形成附着，自然发生基团，例如胺或硫氢基(sulfhydryl)。在一些实施例中，使用与胺反应的修饰剂。此反应的优点为其可为快速并避免毒性副产品的产生。此类修饰剂的例子包括NHS-酯(NHS-ester)、醛类、环氧树脂化合物、卤化酰基与硫酯。大多数蛋白质、胜肽、糖肽(glycopeptides)等具有自由胺基团，其可与此类修饰剂反应以将它们共价连结至这些修饰剂。也可合成具有内部或末端胺基团的核酸探针，且其为市售可得(例如来自IDT或Operon)。因此，使用相似之化学成分，可将生物分子结合(例如共价或非共价)至标签、表面或其它的试剂。
可使用一些其它多官能基交联试剂来将一种修饰剂的化学反应性转变为另一种。这些基团可为双官能基、三官能基、四官能基等。它们也可为同官能基(homo-functional)或异官能基(hetero-functional)。一双官能基交联剂为X-Y-Z，其中X与Z为两个反应基团，且Y为一连接器(linker)。此外，若X与Z为相同基团，例如NHS-酯，所产生之交联剂，NHS-Y-NHS，为一同-双-官能基交联剂，且可连结各包括一胺的两个实体。若X为NHS-酯且Z为马来酰亚胺(maleimide)基团，所产生之交联剂，NHS-Y-马来酰亚胺，为一异-双-官能基交联剂且可连结一包括一胺的实体及一包括一硫基的实体。具有一些不同官能基的交联剂为广泛可得。此类官能基的例子包括NHS-酯、硫酯、烷基卤化物、酰基卤化物(例如，碘乙酰胺(iodoacetamide))、硫醇、胺、半胱氨酸、组胺酸、双硫、马来酰亚胺、顺二醇(cis-diols)、硼酸(boronicacid)、氢氧胺酸(hydroxamic acid)、叠氮化物、联氨(hydrazine)、磷化氢、光反应性基团(例如，蒽醌(anthraquinone)、二苯甲酮(benzophenone))、丙烯酰胺(acrylamide)(例如，acrydite)、亲合基团(例如，生物素、链抗生物素蛋白、麦芽糖、麦芽糖结合蛋白质、麸胱甘肽、麸胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase))、醛类、酮类、羧酸(carboxylic acid)、磷酸盐、疏水基团(例如，苯基(phenyl)、胆固醇(cholesterol))等。
其它修饰剂的选择(例如光交联与热交联)为本技术领域人士所知。市售可得的技术包括，例如来自Mosiac Technologies(Waltham，MA)，EXIQONTM(Vedbaek，Denmark)，Schleicher and Schuell(Keene，N.H.)，Surmodics TM(St.Paul，MN)，XENOPORE TM(Hawthorne，N.J.)，Pamgene(Netherlands)，Eppendorf(Germany)，Prolinx(Bothell，WA)，Spectral Genomics(Houston，TX)，and COMBIMATRIXTM(Bothell，WA)的那些。
在一些实施例中，提供除了玻璃以外之表面。例如，也可使用金属表面，如金、硅、铜、钛、铝、金属氧化物(如氧化硅、氧化钛、氧化铁)或塑料(如聚苯乙烯(polystyrene)与聚乙烯(polyethylene))、沸石(zeolite)或其它材料。在一些实施例中，为了允许光的传送，这些材料层可以是薄的，例如小于约100nm。
3.1核酸侦测
可使用与本发明实施例一致之侦测装置成为一部份系统用在分子侦测或分子侦测之方法或制程中，而分子侦测，例如核酸定序。此装置及利用其之方法与制程对于，例如分析与诊断应用为有用的。这些应用可为个人的、公众的、商业的或工业的。
可以广泛变化之定序形式来使用与本发明实施例一致之侦测装置，且与本发明实施例一致之侦测装置可适合将单一分子进行定序。另外，与现行生物芯片组件相较，与本发明一致之侦测装置具有经简化之设计、装配及制造。例如，可将要被定序之核酸附着于数组上之随机的连结位，避免对于在预定位置沈积或合成核酸之时间消耗与昂贵机器的使用。
可使用与本发明实施例一致之侦测装置为在生物分子侦测之方法与程序中之一系统的部分，包括核酸杂合或对于，例如整个基因体定序之定序、转录表现(transcriptional profiling)、竞争转录表现或基因鉴定。生物分子侦测也可包括结合相互作用，例如蛋白质/蛋白质、抗体/抗原、受器/配体及核酸/蛋白质之侦测及/或测量。这些应用对于分析与诊断程序与方法为有用的。
适合于本发明实施例提供之装置所侦测之核酸，于一些实施例中，为连结分子之一部分，其将一适合于分析结合相互作用之分子，例如蛋白质、其它核酸、碳水化合物部分或小分子附着至本发明实施例所提供之组件上的连结位。在一些实施例中，连结分子可更包括一捕获分子，其由于结合之相互作用与要被分析之分子结合。在一连结分子中之核酸，藉由，例如直接定序或杂合，作为连结分子之捕获分子的一鉴定标签。
本发明实施例所提供之方法可包括将要被侦测之分子附着于本发明实施例所提供之侦测系统一地址数组(address array)的一步骤。在一些实施例中，地址数组可包括具有多数个针孔之遮蔽薄板，与可形成在针孔中或环绕针孔之连接位。若各片段为，例如1000碱基长，一单一组件可获得数千兆位(bit)之序列资料，而使整个基因体之定序与再定序(resequencing)成为可能。
3.1.1要被侦测之分子
适合以本发明实施例所提供之方法来侦测之核酸可包括任何核酸，包括，例如DNA、RNA或PNA(peptide nucleic acid(胜肽核酸))，且可含有任何序列-已知与未知，包括自然发生或人工序列。核酸可被自然取得、重组产生或化学合成。核酸可包括自然发生核苷酸、不存在于自然之核苷酸类似物或经修饰之核苷酸。基于实际应用，被侦测之核酸长度可多样化。在一些实施例中，核酸包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000个碱基或更多。在一些实施例中，核酸可为自10至20、自10至50、自10至100、自50至100、自50至500、自50至1000、自50至5000、自500至2000、自500至5000，或自1000至5000个碱基。
用以侦测之核酸可为单股。单股核酸模板可来自一双股核酸模板，藉由本技术领域所知的方法，例如加热或碱或其它化学处理。藉由例如化学或invitro合成，也可产生单股核酸模板。
在一些实施例中，要被侦测之核酸于其5’或3’端附着一连结位。在一些实施例中，核酸可更包括一或多个与核酸之5’端、3’端或5’端与3’端两者结合之末端连结引子。在特别的实施例中，一末端连结引子附着至核酸之3’端。可使用末端连结引子来将要被侦测之核酸附着于在组件上之连结位，并提供一对于一或多个侦测之引子之互补序列，例如一定序引子。
3.1.1.1末端连结引子
末端连结引子为短的核酸分子，通常由少于100个核苷酸所组成。在一些实施例中，末端连结引子之长度为至少5、10、15、20、25、30、50、75、90个核苷酸或更多。在特定实施例中，末端连结引子之长度为自8至25、自10至20、自10至30，或自10至50个核苷酸。在一些实施例中，末端连结引子为未经分支的，然而，在其它实施例中，其可为经分支的。
可使用末端连结引子来将要被侦测之核酸附着至于位置数组上之连结位。在一些实施例中，末端连结引子可将核酸直接地连结至数组表面，例如藉由共价连结(例如酯(ester)或硫醇(thiol)连结)或非共价连结，例如抗原/抗体或生物素(biotin)/抗生物素蛋白(avidin)结合。在一些实施例中，末端连结引子可将核酸非直接地连结至数组表面，例如藉由与一居中分子(intermediate molecule)结合，而居中分子，例如一聚合酶。因此，末端连结引子可包含经修饰之核酸或以其它方式修饰以协助附着至一连结位，藉由本技术领域已知的方法，例如，双硫、硫酯、酰胺、磷酸二酯或酯连结；或藉由，例如抗体/抗原，或生物素/抗生物素蛋白结合，例如末端连结引子可包含一包括一抗原区域之核苷酸或一经生物素化(biotinylated)之核苷酸。在特别的实施例中，一经修饰之核苷酸可位于一末端连结引子之3’端上。在一些实施例中，一末端连结引子之5’端可包含一经修饰之核苷酸。
末端连结引子也可做为一用以侦测核酸之一或多个引子的互补物(complement)，例如，一定序序列。在一些实施例中，引子系可藉由杂合来侦测核酸，例如，引子包含一可侦测之标记，例如一荧光标记。在一些实施例中，末端连结引子的5’端可包括与一定序引子互补之序列。在一些实施例中，与定序引子互补之末端连结引子系可被定位以使定序引子之3’端直接与要被定序之核酸中的第一个核苷酸邻接。
在一些实施例中，藉由一连接酶(ligase)，例如一DNA连接酶可将末端连结引子加至要被侦测之核酸的末端。在一些实施例中，在连接(ligation)前，末端连结引子与要被侦测之核酸两者皆为单股。在其它实施例中，两者皆为双股。在另外其它实施例中，一者可为单股，而另一者可为双股。连接为本技术领域所熟知。例如，在聚合群落定序方法(polony sequencing method)中，Shendure et al.(Science，309：1728-1732(2005))以新英格兰生物实验室(NewEngland Biolab’，NEB)快速连接套组(Quick Ligation kit)将一T30末端连结引子(32bp)连结至一样本DNA片段。其中，连结反应溶液包括0.26pMole之DNA、0.8pMole之T30末端连结引子、4.0μl T4 DNA连接酶于1×快速连接缓冲溶液(Quick Ligation buffer)中。于混合后，于室温培养反应溶液约10分钟，且之后置于冰上。藉由将样本加热至65℃，10分钟来停止连接反应。
在其它实施例中，可将末端连结引子合成于要被侦测之核酸上。例如，末端连结引子可为一藉由例如末端转移酶(terminal transferase)所加入之均聚物(homopolymer)。例如，Harris et al.(Science，320：106-109(2008))将一多腺嘌呤尾巴(poly A tail)加至DNA模板，其做为于一病毒基因体之单一分子定序中之一多胸腺嘧啶(poly T)定序引子的互补物。
3.1.1.2定序引子
一定序引子为一与要被侦测之核酸片段或其连结的末端连结引子互补之单股寡核苷酸。在一些实施例中，定序引子的长度为至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸或更多。在特定实施例中，定序引子之长度可为自8至25、自10至20、自10至30，或自10至50个核苷酸。定序引子可由任何形式之核苷酸所形成，包括自然发生核苷酸、不存在于自然之核苷酸类似物或经修饰之核苷酸。在特定实施例中，在一定序引子与包括一或多个末端连结分子之要被定序的核酸杂合后，可修饰定序引子之5’端，以促进其与位置数组上之一连结位结合。
在一些实施例中，一定序引子可包含经修饰之核苷酸，例如锁核酸(locked nucleic acid，LNA)(经修饰之核糖核甘酸，其在一聚核酸(polynucleic acid)中提供增强之碱基堆叠相互作用(base stacking interaction))。如锁核酸之效用解说，Levin et al.(Nucleic Acid Research 34(20)：142(2006))显示一含锁核酸之引子具有经改善之专一性及显示较强之结合相对于对应之未锁引子(unlocked primer)。制造MCP1引子(5’-cttaaattttcttgaat-3’)之三种变化，包含3个锁核酸核苷酸(于盖(cap)中)于引子中之不同位置：MCP1-LAN-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’)；MCP1-LAN-5’(5’-CtTaAattttcttgaat-3’)；与MCP1-LAN-even(5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)。所有经锁核酸取代之引子具有提高之熔解温度(melting temperature，Tm)，而MCP1-LNA-5’引子显示特别提高之定序准确度(Phred Q30 counts)。因此，在特别的实施例中，定序引子可包含至少一锁核苷酸于其5’端区域，即，定序引子之5’端一半、三分之一或四分之一。
在被提供至与本发明实施例一致之侦测装置前，可将定序引子与单股样本核酸(即，一包括至少一末端连结引子之要被侦测的核酸)杂合。可将定序引子与样本核酸杂合，藉由将样本核酸与一莫耳过剩(molar excess)之定序引子混合于一含盐溶液中，例如5×SSC(或5×SSPE)、0.1％Tween 20(或0.1％SDS)与0.1％BSA缓冲溶液。可将混合物加热65℃至少5分钟且缓慢冷却至室温以允许引子/模板黏合。藉由适合之方法可将残余之引子去除，例如一分子筛(molecular sieve)。
藉由适合的方法，包括序列之视觉检阅或计算机协助之引子设计，可设计引子，包括末端连结与定序引子两者。许多软件套组为可用来协助引子设计，包括DNAStarTM(DNAstar，Inc.，Madison，WI)、OLIGO 4.0(NationalBiosciences，Inc.)、Vectoe
Figure BDA0000089882200000231
(Invitrogen)、Primer Premier 5(Premierbiosoft)与Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。引子设计，考虑到例如，要被定序之分子、专一性、长度、所需的熔解温度、二级结构、引子二聚体、GC含量、缓冲溶液的pH与离子强度及所使用之酵素(即，聚合酶或连接酶)。参见，例如Joseph Sambrook and David Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，3rd edition(2001)。
3.1.1.3结合至数组表面
在将定序引子与包括一或多个末端连结引子之要被定序的核酸黏合后，制备此复合物于一合适的缓冲溶液中、将其提供至一位置数组的表面并允许其结合。在一些实施例中，可将样本核酸(要被侦测之核酸与一或多个末端连结引子)附着至连结位，且之后可提供定序或侦测引子。在其它实施例中，在被提供至一组件之前，可先将复合物进行杂合。只有一个核酸样本结合之连结位被了解为有效位置。在特定实施例中，提供复合物至侦测系统且样本核酸附着至在位置数组上之随机的连结位。在其它实施例中，可提供样本核酸至在位置数组上之预定的连结位，藉由适合的方法，例如藉由机器或液体处理系统。
将核酸附着至一固体支持物之适合的方法为本技术领域所熟知。在一些实施例中，可将样本核酸直接附着至一连结位，藉由共价连结，例如双硫、硫酯、酰胺、磷酸二酯或酯连结；或藉由非共价连结，例如抗体/抗原，或生物素/抗生物素蛋白结合。在一些实施例中，藉由一介于中间的分子可将样本核酸附着至一连结位。在一些实施例中，介于中间的分子可为一聚合酶，例如一DNA聚合酶。
如一直接、共价之核酸附着的说明例子，Adeesi et al.(Nucleic AcidResearch，28：87(2000))修饰一引子的5’端以包括一SH官能基。根据Adeesi etal.之方法，可制备一核酸于50μM磷酸缓冲盐(PBS)(NaPi：0.1M NaH2PO4pH 6.5，0.1M NaCl)中。之后可将1-5μl之引子溶液提供至一经盐化之玻璃载片，且将其培养于一湿度控制盒于室温中约5小时以使引子结合至芯片表面。在结合反应完成后，以PBS溶液于室温震动清洗两次，每次5分钟，以移除未结合之DNA。在清洁后，将10mMβ-硫氢乙醇(β-mercaptoethanol)加至一PBS溶液且于室温下用来冲洗位置数组，以将未结合之DNA的硫醇基去活化。再来，清洗数组表面，例如一次以5×SSC、0.1％ Tween与一次以5×SSC缓冲溶液。因此，在一些实施例中，Adeesi et al.所使用之方法可使用于本发明所提供之方法中以将样本核酸复合物，例如经由一定序引子或样本核酸之5’端附着至一连结位。
在一替代实施例中，样本核酸可包括，例如一经生物素化之核苷酸，且可与在连结位表面上之抗生物素蛋白结合。在另一实施例中，样本核酸可包括一抗原部分，例如BrdU或洋地黄毒(digoxigenin)，其藉由一抗体(或其片段)被结合于连结位上。藉由“抗体”，可以了解的是，此措辞包括免疫球蛋白分子之片段，包括，例如一或多个CDR区；或可变之重或可变之轻片段。抗体可为自然发生、重组或合成。抗体也可包括，例如多株(polyclone)与单株(monoclone)变形。在一些实施例中，抗体以至少106、107、108、109M或更高之结合常数(association constant)结合至其抗原。抗体之结构、功能与产生为本技术领域所熟知。参见，例如Gary Howard and Matthew Kasser，Making and Using Antibodies：A Practical Handbook CRC Press；1st edition(2006)。
在又另一实施例中，藉由一聚合酶，例如DNA聚合酶，可将样本核酸附着至连结位。熟悉此技艺人士可理解，为了保留酵素功能，可得之信息，例如酵素之一级、二级与三级结构应被考虑。例如，Taq与Phi29聚合酶之结构为本技术领域所知，分别参见：Kim et al.，Nature，376：612-616(1995)与Kamtekar et al.，Mol.Cell，16：609-618(2004)。将一聚合酶固定至一表面，而保持活性之方法为本技术领域所知，且叙述于，例如美国专利公开号2008/0199932，公开于2008年8月21日与Korlach et al.PNAS105：1176-1181(2008)。
在一些实施例中，一连结位之经乙醛(aldehyde)修饰之表面系以含乙醛之硅烷(silane)试剂处理。乙醛很快地与在蛋白质上之一级胺反应以形成一Schiff’s碱基连结。由于除了一般于NH2端之更加反应性的α-胺外，很多蛋白质显露离胺酸于其表面上，所以其可以各种之方向附着至载片，以允许蛋白质之不同侧与于溶液中之其它蛋白质或小分子反应。在另一实施例中，藉由UV光活化(photoactivation)，一光NHS(photoNHS)(一N-羟基琥珀酰亚胺羧酸盐分子(N-hydroxy succimido carboxylate)以一碳链连结器(linker)，连结至一叠氮硝基苯(azidonitrobenzene))可附着至一于组件上之经胺修饰之表面。在这些实施例中，藉由消除氮，UV光激起一叠氮硝基苯部分以产生高反应性氮烯(nitrene)。氮烯立即与组件表面上之NH2反应以形成一联氨(hydrazine)键。连结器之另一端为NHS羧酸盐，其与聚合酶表面上之离胺酸反应以产生一酰胺共价键。在另一实施例中，于缓冲环境下，NHS羧酸盐部分可与组件表面上之一级胺反应。UV光用来活化一叠氮硝基苯部分且形成一高反应性氮烯为一电子不足基团(electron deficient group)且立即与聚合酶表面上之离胺酸残基的一级胺反应。
3.1.2定序形式
本发明一实施例所提供之侦测装置与方法可用来侦测与定序核酸，藉由本技术领域已知的方法，如回顾于，例如美国专利号6,946,249与Shendure etal.，Nat.Rev.Genet.5：335-44(2004)。定序形式可选自本技术领域已知之单一分子定序方法。在一些实施例中，定序方法可依靠DNA聚合酶或DNA连接酶的专一性，且包括，例如碱基延伸定序(base extension sequencing)(单一碱基逐步延伸(single base stepwise extension))、藉由合成之多碱基定序(包括，例如以经末端标记之核苷酸来定序)与摆动定序(wobble sequencing)，其为根据连结。此方法一般包括提供一样本核酸，其可包括至少一末端连结引子。可将核酸附着至一基质(substrate)(直接或间接)，例如于一连结位。核酸可被以单股形式提供，或藉由例如化学或热变性使其成为单股。之后定序开始实施于一定序引子(连接酶定序一般指锚定引子(anchor primer)，其对定序引子提供类似物用途)。
对于单一分子定序形式而言，可提供再定序单一分子的优点。例如，于定序读取完成后，可将定序引子与经延伸之核苷酸自样本核酸删除、清洗组件并重复定序。在各种实施例中，藉由相同或不同方法可重新执行再定序。藉由将相同分子再定序，预期定序错误会下降成定序读取次数之次方。例如，若单次读取每个碱基之错误为10-3，之后在两次读取后，其下降成(10-3)2，即，10-6。此为单一分子定序之特别的优点，由于用以定序之经修饰的核苷酸可失去其标记或阻碍基团产生，例如假的删除。
一般而言，于单一分子定序中，将要被定序之附着至一基板，且与引子接触。例如，藉由执行至少一酵素催化聚合或连接反应来修饰引子。至少一反应引起光的发射，光的发射与核酸所包括之至少一碱基之特性相关。可理解“引起”光的发射系指至少一反应导致至少一情况，于此情况下，发生了与核酸所包括之至少一碱基之特性相关的光发射；此发生可经由与激发光、一化学或生物发光系统等交互作用。至少一情况可为，例如，荧光团与至少一反应的产物的合并，或焦磷酸盐的释放。因此，光可藉由或不藉由外部激发来产生。例如，可藉由包括共价连结侦测标签与一阻碍基团之可逆终止物碱基类似物来执行单分子定序，以避免任何二次延伸，其中在已将类似物加至引子后，激发类似物，且在加入后移除标签与阻碍基团以允许另一循环之延伸，而共价连结侦测卷标，例如一荧光卷标。或者，可藉由提供一化学或生物发光系统而不以外部激发来侦测一延伸步骤之产物，例如焦磷酸盐，而化学或生物发光系统以焦磷酸盐依赖方式发射光。这些与其它形式于以下被更详细讨论。
发射之光与核酸所包括之至少一碱基的特性相关。在一些实施例中，关连性可为暂时的，例如光的发射时间指出至少一碱基的特性，例如为当提供不同碱基类似物于在不同次之聚合反应中使用的例子。在一些实施例中，关连性可为光谱的，例如发射光之光谱指至少一碱基的特性，例如为当提供包括不同荧光团之不同的碱基类似物在一聚合反应中使用的例子。
在一些实施例中，单一分子核酸定序包括多复位序循环。可以理解一定序循环意指，为了在第一碱基被鉴定后鉴定核酸所包括之至少一第二个碱基，将引起与至少一碱基特性相关之光的发射的状况重复。因此，在根据本发明之包括单一分子核酸定序的方法中，单一分子核酸定序可包括至少一特定数目之定序循环，其引起至少一特定数目之光的发射，光共同关于核酸所包括之至少特定数目的碱基的特性，且方法包括鉴定由核酸所包括之至少一特定数目之碱基。在一些实施例中，特定数目可为，例如2、3、4、5、10、20、50、100、200或500。
定序方法可包括测定由核酸所包括之一或多个碱基的特性。在根据本发明之一些实施例中，于其中执行单一分子核酸定序引起光之发射，光系以包括至少一第一光学传感器与一第二光学传感器的至少一个光侦测器来侦测，且来自至少两个光学传感器的输出讯号被处理，可藉由比较该处理之至少一结果与对应至至少一已知类型之至少一已知结果来测定由一核酸所包括之至少一碱基的特性。
例如，处理之一结果可指出一反应所发生的时间点；当发射之光暂时与由核酸所包括之至少一碱基的特性相关时，可使用此时间点来鉴定由核酸所包括之至少一碱基。
在另一实施例中，处理之结果可为一荧光团与一反应之产物合并的测定；当发射之光与核酸所包括之至少一碱基的特性光谱相关时，可使用此测定以鉴定核酸所包括之至少一碱基。
3.1.2.1碱基延伸定序：逐步延伸
在一些实施例中所提供之侦测装置可用来侦测在碱基延伸定序时所产生的。在一些实施例中，藉由将包括一要被定序之单股核酸、一与要被定序之单股核酸之3’端结合之末端连结引子与黏合至其之一定序引子的一部份双重复样本核酸附着至一连结位来开始碱基延伸定序，如图6中所示。在一些实施例中，聚合酶与经修饰之核苷酸之后可被提供至光侦测组件于适合之缓冲溶液中。在一些实施例中，藉由在连结位之聚合酶，可将样本核酸复合物附着至连结位。在一些实施例中，核苷酸可包括一共价连结之可侦测标记，例如一荧光标记，与一阻碍基团以避免任何二次延伸。因此，在一单一核苷酸加入至定序引子之3’端之后，定序中断。
一碱基延伸反应之一实施例的第一步骤中，可将具有荧光阻碍基团之核苷酸藉由DNA聚合酶加至定序引子之3’端。在一些实施例中，荧光标记可扮演阻碍基团。在其它实施例中，它们可为分开之部分。一单一核苷酸可合并于定序引子之3’端，且藉由其之标记以对应之光侦测器来鉴定。之后移除荧光标记与阻碍基团，例如，藉由化学或酵素分解，以允许碱基延伸之额外循环。在特定实施例中，可同时或连续地与在任何顺序中移除标记与阻碍基团。藉由编辑碱基加入顺序，于3’至5’方向，一次一个碱基推论出样本核酸之序列。
一般而言，在逐步延伸时有两个方式来辨认所加入之核苷酸。于一第一例子中，四种核苷酸可皆具有相同之可侦测标记，但以一预定之顺序一次加入一个。经延伸之核苷酸的鉴定藉由于延伸反应中所加入之核苷酸的顺序来确认。在于延伸时辨认经整合之碱基的第二模式中，四种不同之核苷酸同时加入，且各与一有区别可侦测之标记结合。在不同实施例中，标记之激发或散发光谱及/或强度可不同。藉由可侦测标记之强度及/或波长(即，激发或散发光谱)来确认于延伸中加入之核苷酸强度。
3.1.2.2藉由合成之定序：多步骤延伸(multi-step extension)
在一些实施例中，藉由合成之定序可藉由多重不中断延伸(multipleuninterrupted extension)，例如没有使用阻碍基团来执行。在这些实施例中，可藉由侦测在核三磷酸(nucleoside triphosphates)水解后之焦磷酸(pyrophosphate)释放，即，β与γ磷酸盐复合物之释放，来监测聚合反应。如上述，可直接侦测复合物，例如藉由在复合物上之荧光部分，或间接侦测复合物，例如，藉由将焦磷酸与一化学或生物冷光侦测系统结合。
在一些实施例中，可藉由使用经末端-磷酸盐标记之核苷酸(terminal-phosphate-labeled nucleotide)将核酸样本实际连续定序。经末端-磷酸盐标记之核苷酸与其使用方法之示范实施例叙述于，例如美国专利号7,361,466与美国专利公开号2007/0141598，公开于2007年6月21日。简单地说，将核苷酸提供至本发明实施例所提供之系统，当于聚合期间水解时，藉由对应之光侦测器可侦测经标记之磷酸盐。在一些实施例中，所有之四种核苷酸包括有区别之标记且可被同时加入。在一些实施例中，核苷酸可包括无法区别，即，相同之标记，且被以预定之顺序连续地加入。连续、循环的加入具有无法区别之标记之核苷酸，依然允许多重、不中断聚合步骤，例如于均聚体序列中。
3.1.2.3连接酶定序(Ligase-Based Sequencing)
在其它实施例中，藉由连接酶定序，可将一样本核酸于本发明实施例所提供之装置上进行定序。连接酶定序方法叙述于，例如美国专利号5,750,341、PCT公开WO 06/073504与Shendure et al.Science，309：1728-1732(2005)中。在Shendure et al.的方法中，例如，一未知单股DNA样本可位于两个末端连结引子的侧面，且固定于一固体支持物上。于未知序列之一特定位置(即，接近于一特定末端连结引子之nth碱基)，可藉由将一所谓锚定引子(其为一定序引子之类似物)与末端连结引子黏合，且之后将4个退化之九聚体的联合提供至混合物来检视。四个九聚体皆具有可区别之荧光标记，且除了质问位置(query position)其在所有位置皆为退化的，在质问位置各九聚体以一可区别之碱基-A、C、G或T来质问。将样本清洗、荧光扫瞄且鉴定质问之碱基。之后自样本核酸去除锚定引子与经连结之九聚体、清洗组件且重复步骤，以质问一不同位置。有利地，此方法为非渐次的，即，碱基不需依次被质问。因此，错误不会累计。此外，此方法可自不是5’就是3’方向来质问核苷酸，即，不需标准之5’→3’DNA合成。藉由此方法，可通常将总共约13个碱基之一样本核酸进行定序。
3.1.2.4第三代定序(Third-generation sequencing)
在一些实施例中，使用第三代定序，可将一样本核酸于本发明实施例所提供之装置上进行定序。于第三代定序中，将一具有含有许多小(～50nm)孔洞之铝涂膜的载片作为零模式波导(waveguide)(参见，例如Levene et al.，Science 299，682-686(2003))。藉由聚磷酸酯化学(polyphosphonatechemistry)，例如聚乙烯基磷酸酯化学(polyvinylphosphonate chemistry)来使铝表面免于DNA聚合酶的附着(参见，例如Korlach et al.，Proc Natl Acad SciUSA 105，1176-1181(2008))。此导致DNA聚合酶分子优先附着至于铝涂层之孔洞中露出的硅。此设置允许将衰减波现象(evanescent wave phenomenon)用来减少荧光背景，允许较高浓度之荧光标记dNTP的使用。荧光团系附着至dNTP之末端磷酸盐，以使荧光在dNTP合并时释放，但荧光团不维持附着于新被合并之核苷酸，意指复合物立即准备好至另一循环之合并。藉由此方法，可侦测到dNTP合并至存在于铝涂膜之孔洞中的独立引子-模板复合物。参见，例如Eid et al.，Science 323，133-138(2009)。与本发明实施例一致之侦测系统的使用可提供高灵敏度、允许经合并之dNTP可更有效的侦测，产生相对低的错误率及/或较长之可解释序列数据的读取。
3.1.3额外应用
与本发明实施例一致之侦测系统可同时侦测数百万之核酸片段。若各片段为，例如1000个碱基长，一单一组件一次可获得超过数十亿个碱基序列。此处所提供之装置的额外应用与方法将于以下讨论。
3.1.3.1整个基因体定序
与本发明实施例一致之侦测系统可用来执行，例如病毒、细菌、真菌、真核生物或脊椎动物，例如哺乳动物，例如人类，之整个或部分基因体定序。
为了定序，可将基因体DNA切割成至少20、50、100、200、300、500、800、1200、1500个核苷酸或更长之片段。在一些实施例中，经切割之基因体DNA可为自20至50、自20至100、自20至500、自20至1000、自500至1200或自500至1500个核苷酸长。在一些实施例中，为了如上述之定序，具有经结合之末端连结引子之要被定序的核酸，可被制成单股，其与定序引子黏合且被提供至本发明实施例所提供之系统。
3.1.3.2基因表现研究(Gene Expression Profiling)
在其它实施例中，为了基因表现研究，与本发明实施例一致之侦测系统可用来将cDNA定序。例如，藉由测量于组件上被侦测之特定序列的相关频率，可将mRNA程度进行定量。可将数百万cDNA分子平行定序于实施例所提供之一组件上。若一细胞平均包含350,000个mRNA分子，于一百万个定序反应中，预期将存在于正好每个细胞一复制的一转录物(transcript)定序三次。因此，本发明实施例所提供之组件适合具有单一数目灵敏度之单一分子定序。
cDNA合成为本技术领域所熟知，且一般包括总RNA萃取与视需要而定之mRNA丰富。藉由步骤，包括，例如：为了第一股合成之反转录；RNAse处理以移除残余RNA；第一股之随机六聚体起始(priming)与藉由DNA聚合酶之第二股合成，来由mRNA产生cDNA。合成之cDNA适合在本发明所提供之组件上进行定序。分离与制备DNA与RNA两者之方法为本技术领域所熟知。参见，Joseph Sambrook and David Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，3rd edition(2001)。
在一些实施例中，可将cDNA与接合物(adapter)聚核酸，以专一限制酵素来处理接合物，且最后经处理之核酸与附着于本发明实施例所提供装置之连结位的互补寡核苷酸结合。在特别的实施例中，接合物分子可为末端连结引子。
在与本发明一致之一些实施例中，mRNA之多腺嘌呤尾巴(poly A tail)可做为一适合之末端连结引子，其与一多胸腺嘧啶(poly T tail)定序引子互补。
3.1.3.3侦测及/或测量结合之相互作用
在其它实施例中，侦测装置可用来侦测各种结合相互作用，包括，例如DNA/DNA、RNA/RNA或DNA/RNA碱基配对、核酸/蛋白质相互作用、抗原/抗体、受器/配体结合与酵素/受质结合。一般而言，一样本分子附着于包括一鉴定核酸标签(identifying nucleic acid tag，ID)之连结分子。在一些实施例中，连结分子可更包括一与样本分子结合之捕获分子。连结分子也包括用以与连结位结合之工具，例如一促进共价化学连结之部份，例如，双硫、硫酯、酰胺、磷酸二酯或酯连结；或藉由非共价连结，例如抗体/抗原或生物素/抗生物素蛋白结合。在一些实施例中，可藉由ID标签将连结分子附着至数组。
可将一样本分子提供至与本发明实施例一致之一系统，且藉由其之连结分子将其附着于一随机连结位，例如藉由与一位于连结分子上之捕获分子结合。在一些实施例中，将样本分子与连结分子混合、允许其结合、且之后提供至本发明实施例所提供之一组件。在一些实施例中，连结分子先被提供至组件，允许其附着至一连结位，而之后可提供样本分子。再来，藉由鉴定经结合之样本分子的方法来侦测ID(例如，藉由杂合或定序)。多数个样本分子种类可附着至相同之数组，且可藉由其之标记来区分，而使用与其结合之捕获分子独特的ID，可以其之结合相互作用为特征。因此，在一些实施例中，侦测一经标记之样本分子的方法可包括，藉由包括一核酸标签(ID)之连结分子，来连结一样本分子至与本发明实施例一致之系统的连结位、执行ID之核酸定序与侦测经标记之样本分子的步骤。在特别的实施例中，核酸定序可为碱基延伸定序。在一些实施例中，核酸定序系可择自连接酶定序或经末端-磷酸盐标记之核苷酸定序。
藉由使用核苷酸“小段(bits)”，上至4n个具区别之捕获分子可被附着及鉴定于与本发明实施例一致之侦测系统上，其中n为一自然数字显示被定序之ID的长度。例如，5个核苷酸可提供超过一千个独特ID，而12个核苷酸提供超过一千六百万个组合。例如，连结分子可附着至与本发明实施例一致之系统而其位置藉由侦测其对应之ID标签来确认。之后连结分子作为探针以，例如调查与一或多个经标记之样本分子的结合相互作用。即，具有一或多个连结分子附着至其的一组件可作为一探针数组。
在特定实施例中，一经标记之样本分子可为荧光标记的。当与连结分子之捕获分子结合时，可藉由对应于被连结分子附着之连结位的光侦测器，来侦测经标记之样本分子。因此，在一些与本发明实施例一致之方法，可更包括提供一经标记之样本分子至与本发明实施例一致之系统及侦测经标记之样本分子的步骤。在特别的实施例中，系统可具有附着至连结位之连结分子，而连结分子包括一附着至连结位之核酸标签(ID)。可将多重标记样本分子同时提供至一探针数组且可藉由其标记来区分，例如藉由其荧光标记之强度及/或波长。在一经标记质问分子之所给予的浓度下，基于动力学(例如，接合(docking)/与未接合(undocking))与统计学(例如，在任何给予之时间，样本分子之部分为结合或为结合之状态)两者可干扰介于样本分子与经标记质问分子之间的结合相互作用的分离常数。
在一些实施例中，一连结分子之ID为至少5、10、15、20、25、30、40、50、75、90、100、150、200或更多个核苷酸长。在一些实施例中，ID为自5至10、20、40、80或160；或自10至20或50；或自20至35个核苷酸长。ID包含一独特之核酸序列，即，一要被侦测之核酸。在特别的实施例中，独特之核酸序列可为至少1、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、30或更多个核苷酸长。在一些实施例中，独特之核酸序列为自4至10、12、15或20；或自10至20个核苷酸长。ID包括至少一末端连结引子，即，ID可包含一序列其与一定序引子互补，此序列在一些实施例中，可为经修饰的，以附着至一连结位，例如藉由包含一经生物素化之核苷酸。在一些实施例中，ID之末端连结引子部分为3’端至独特核酸序列。在一些实施例中，其可为5’端至独特核酸序列。在又另一实施例中，末端连结引子可出现于独特之核酸列的3’与5’端两者。
在特定实施例中，样本分子与捕获分子可包括系择自一碳水化合物、脂质、蛋白质、胜肽、抗原、核酸、荷尔蒙、小有机分子(例如药学上的)或维他命部分或其组合之部分。这些部分可为自然发生(例如经生物化学纯化)或合成(例如经化学合成或重组产生)。此外，这些基质可没有包含、包含一些或全部非天然成分(例如非天然胺基酸、阻碍或保护基团等)。在特别的实施例中，一样本分子或捕获分子为蛋白质，例如生长因子、胜肽抗原、抗体或受器。
许多结合核酸至连结分子或连结位的方法为本技术领域所知，如回顾于，例如美国专利公开号2004/0038331中。‘331公开揭露形成蛋白质寡核苷酸结合物于一固态支持物上。美国专利号4,748,111提供结合蛋白质至一核酸之3’端的一实施例。其中，末端转移酶首先用来将核糖残基加至一分子之3’部分。一过碘酸氧化(periodate oxidation)反应之后产生一3’乙醛基团于一核酸上，3’乙醛基团之后与蛋白质之酰胺基团形成共价键结。当蛋白质结合至ID之3’端时，系经由ID之5’端附着至连结位。
在一些实施例中，一捕获分子，例如一蛋白质，连结至一ID之5’端。在这些实施例中，ID之3’端或一定序引子之5’端系可用来将捕获分子附着至一连结位。美国专利号6,013,434，例如揭露寡核苷酸-聚酰胺结合物，其中连接系藉由寡核苷酸之5’端。美国专利号6,197,513揭露PNA与DNA两者经由核酸之5’端结合至一具有羧酸部分之分子，例如蛋白质。PNA与DNA分子包含芳香胺(arylamine)或氮氧乙酰(aminooxyacetyl)部分。美国专利号6,153,737揭露包含至少一2’经官能化之核苷的寡核苷酸，适合与多种分子结合。
3.1.3.4额外之侦测方法
(a)FRET
在一些于本发明实施例所提供之侦测装置上侦测一分子，藉由Forster共振能量转移(Forster resonance energy transfer，FRET)，有时亦可为荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)。如本技术领域所知，当一经激发之提供者分子非放射性转移能量至一接受者分子时，其散发能量，一般为光时，FRET发生。FRET可帮助减低背景光线，藉由，例如提供对于要侦测分子之介于有效激发与散发波长之间的较大光谱间隔。FRET常用来侦测接近之分子相互作用，由于其功效衰败随着介于提供者与接受者分子间之距离的第六能量。例如，Zhang et al.(Nature Materials，4：826-31(2005))藉由FRET侦测核酸杂合。其中，一经生物素化之核酸标的与一覆盖抗生物素蛋白之量子点(quantum dot)提供者结合，其之后激发一经Cy5结合之DNA探针。在本发明一些实施例中，一经标记之捕获分子与经标记之样本分子可形成一用以藉由FRET来侦测之提供者/接受者(或反之亦然)配对。
在本发明所提供之核酸定序的一些实施例中，对于一附着至一聚合酶或连接酶之提供者带色团(chromophore)，荧光标记核苷酸扮演一接受者带色团。因此，于这些实施例中，位于聚合酶或连接酶上之提供者带色团激发一核酸上之的接受者带色团，而核酸要被聚合于或连接至样本核酸上。由于在FRET功效中之快速下降，不接近聚合酶之核苷酸可不被激发。在一些实施例中，提供者分子为，例如另一荧光团，例如一量子点。量子点，例如，半导体量子点为本技术领域所知且叙述于，例如国际公开号WO 03/003015。结合量子点至，例如生物分子的方法为本技术领所知，如回顾于，例如Mednitz et al.(Nature Materials，4：235-46(2005))与美国专利公开号2006/0068506与2008/0087843分别公开于2006年3月20日与2008年4月17日。在一些实施例中，量子点与一DNA聚合酶分子结合。如先前所讨论，为了将酵素与连结位结合，熟悉此技艺人士可毫无疑问地理解，当将荧光团结合至，例如一DNA聚合酶或连接酶时必需小心，以藉由减轻结合荧光团至酵素之一级、二级与三级结构上的任何影响来保持酵素功能。
(b)多光子激发
在一些实施例中，可由两个或更多之光子激发一带色团。例如，在一些实施例中，于FRET中，不是提供者就是接受者带色团之激发系经由两个或更多之光子。两个光子与多光子激发更进一步叙述于，例如美国专利号6,344,653与5,034,613中。
(c)时间解析侦测(Time Resolved Detection)
可调整本发明实施例所提供之装置的激发光源与光侦测器以具有一特征相移(characteristic phase shift)。使用本技术领域已知的方法，例如，如于美国专利公开号2008/0037008公开于2008年2月14日，揭露了，散发自本发明实施例所提供之装置上被侦测分子的光，可藉由一对应光侦测器来测量，而无来自激发光源的干扰。
(d)流式细胞技术(Flow cytometry)
可使用本发明实施例所提供之装置的激发光源与光侦测器来获得流式细胞技术数据。流式细胞技术一般包括在一液体悬浮液中之一群体目标物的光学分析。可使悬浮液流经一侦测器，藉此允许来自群体中许多目标物的光之连续侦测。目标物系可择自，例如细胞、微珠或其它相似尺寸的颗粒，例如颗粒于至少一尺寸中(长度、宽度、高度、直径等，随着适合之颗粒形状)大于0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μm或5μm及/或于至少一尺寸或所有尺寸中小于5mm、2mm、1mm、500μm、200μm、100μm、50μm、20μm或10μm。可单一档案(single-file)传递目标物于一或多个激发光源与侦测器之间，并可获得荧光及/或光散射(light scattering)数据。在一些实施例中，目标物可包括至少一、至少二、至少三或至少四种荧光团。在一些实施例中，由目标物之至少一子群所发射的光被侦测。
荧光团系可择自，例如由细胞所内生表现之荧光团，例如荧光蛋白质(GFP、BFP、CFP、YFP、RFP等)，除了上方所讨论之荧光团外，还有包括对于一类生物分子或细胞结构具有专一活性之荧光团(例如，DAPI，其专一于DNA，或伊凡氏蓝(Evans Blue)，其将质膜(plasma membrane)染色)、与核苷酸类似物结合之荧光团，例如花青染料(cyanine-dye)结合之dUTP、与一专一结合对(specific binding partner)结合之合成荧光团，例如一抗体、卵白素(avidin)或一核酸探针。存在于颗粒中及/或结合至颗粒之荧光团的量，及当由适合之波长的光激发时因而产生荧光团发射的量，可与一生物分子之存在及/或量相关，此生物分子，可以是DNA、质膜，或一特定核酸、蛋白质、其它生物分子或于颗粒中或上的代谢物。
流式细胞技术可包括分析一群组织颗粒以产生一荧光强度之频率分布，例如一频率的分布图(histogram)。当使用大于一个之荧光团及/或并获得光散射数据时，或数据获得为时间解析时，频率分布可为多面的。例如，藉由允许以高灵敏度及/或高讯号对噪声比获得数据，使用本发明实施例所提供之装置之激发光源与光侦测装置可产生高品质的数据。
在一些实施例中，包括执行流式细胞技术之方法可更包括经活化荧光之分类。在此类实施例中，颗粒藉由流式细胞技术来实时分析并根据使用者所定义之参数来分类。例如，具有来自一特定荧光团之可侦测荧光的颗粒，或具有于此类特定范围中之荧光的颗粒，可与不符合此标准的颗粒分离。为了更进一步之分析可收集这些颗粒。在一些实施例中，以此方式被分类的颗粒为活细胞。根据本发明之侦测装置的灵敏度可允许将具低程度活性之细胞，除了与具无侦测活性之细胞分离外，也与具高活性的细胞分离，程度活性例如一酵素活性或启动子活性。因此，本发明实施例之方法与装置可允许对于先前不易增强之具特别低启动子或酵素活性之细胞群组的存取。
(e)其它荧光侦测装置与方法
在一些实施例之方法，关于由一生物细胞所包括之至少一目标物所发射之光的侦测，生物细胞可为活细胞或经固定之细胞。在一些实施例中，至少一目标物系择自包括至少一量子点的至少一目标物、包括至少一荧光蛋白质之至少一目标物与包括一至少一荧光的小的化学官能基(moiety)的至少一目标物。在一些实施例中，至少一目标物为经荧光标记且包括至少一寡核苷酸、多核苷酸、寡胜肽、多胜肽、寡糖、多糖或脂质。
在一些实施例中，至少一目标物包括一经固定与限制数目之荧光团，例如最多20、10、5或2个荧光团，其可择自量子点、荧光蛋白质与荧光的小的化学官能基。在一些实施例中，至少一目标物包括择自量子点、荧光蛋白质与荧光的小的化学官能基之一单一荧光团。荧光的小的化学官能基的许多例子为前述所讨论。在一些实施例中，荧光的小的化学官能基可具有介于300与800nm之间的发射波峰及/或至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的量子效率(quantum yield)(发射光子数与吸收波长为吸收光谱波峰之波长光子数的比值)。
3.2生物分子分析服务
本发明实施例也提供一藉由使用与本发明一致之实施例的侦测装置来提供生物分子分析服务的方法。在一些实施例中，方法包括自一服务请求者提供一包括一要被分析之生物分子的样本至一服务提供者，与服务请求者接受来自服务提供者之分析结果的步骤，其中藉由使用本发明所提供之装置可产生结果。在一些实施例中，可为了报酬之考量来执行方法，例如服务费用或契约服务协议。此外，样本可被直接运送于服务请求者与服务提供者之间，或藉由一卖主(vendor)居中运送。在一些实施例中，服务提供者或卖主可地理性位于美国之外的领土，例如于另一国家。
4.实施例
实施例1
于此实施例中，使用如图1中所示之装置来侦测并辨别目标物之三种类型。于此实施例中使用之光侦测器可为如图17所示具有一P-N-P-N-P结构之多接面光二极管。p型层601与n型层602构成第一光学传感器。p型层603与n型层604构成第二光学传感器。所有三个p型层为连接至接地。为了输出讯号J1与J2，n型层602与604为分别连接至电极。
将具有407nm之中央波长的6.5mW雷射二极管使用为激发源用以激发要被侦测之目标物。发射自目标物的光为入射至光侦测器上且连续地被第一光学传感器与第二光学传感器所部分吸收。第18与19图分别显示第一光学传感器与第二光学传感器之响应曲线。
将多接面二极管封入一黑色盒子内以使来自环境之光的影响最小化。于光二极管上之盒子表面开启一个小洞。将要被侦测之目标物经由孔洞插入至侦测区，其中将目标物暴露于发射自激发源的激发光。可将一长通(long-pass)接口薄膜光学滤光片置于侦测区与光二极管之间以部分阻绝散射之激发光。
使用三个目标物来测试此侦测系统。目标物1为一第一染料溶液，其包括以5.0 x 10-5M的浓度溶于去离子水中之Pyranine，目标物2为一第二染料溶液，其包括以5.0 x 10-5M的浓度溶于去离子水中之罗丹明6G(Rhodamine 6G，R6G)，及目标物3为一第三量子点溶液，其包括具有以6.25 x 10-4M的浓度溶于甲苯中之CdxZn1-xSe成分的量子点。第20与21图分别显示三个目标物的吸收光谱与发射光谱。
于此实施例中，也测试一包括水而无染料或量子点的参考样本。每次测试一个目标物与参考样本。每5.12毫-秒记录来自第一光学传感器的输出讯号J1与来自第二光学传感器的输出讯号J2。
来自各目标物之10个结果读取的记录与来自参考样本之10个结果读取的记录为显示于表1中。
表1、来自光侦测器的输出讯号
Figure BDA0000089882200000381
Figure BDA0000089882200000391
在此实施例中，选择0.2之值为测定是否一目标物存在的临界值。若输出讯号J1与J2任何之一高于0.2，则测定该目标物为存在。
在测定目标物的存在后，计算一比值R＝J2/(2 x J1)。若0.5＜R＜1.5，测定被侦测之目标物为目标物1。若2.0＜R＜3.0，测定被侦测之目标物为目标物2。若3.5＜R＜4.5，测定被侦测之目标物为目标物3。表2显示侦测结果的一些例子。
表2、侦测结果的例子
Figure BDA0000089882200000392
实施例2
最近研究显示，于于细胞激素活化中之缺陷可发生于C型肝炎病毒(HCV)/人类免疫缺陷病毒(HIV)共感染的人，其限制自肝脏有效清除HCV(J.Med.Virol.78：202-207，2006)。使用分子信标(molecular beacon)方法与实施例1之侦测器可将HCV单一感染与HCV/HIV共感染的人的HCV与HIV病毒RNA进行定量。
RNA萃取
使用高纯度RNA组织套组(High Pure RNA Tissue kit)(Roche Diagnostics；Meylan，France)自HCV单一感染与HCV/HIV共感染的人的肝脏切片萃取总RNA，且将总RNA冲提于100ul之无RNase水中。
cDNA合成
以Thermoscript Reverse Transcriptase kit分别使用对于HCV之RC21引子(5’-CTC CCG GGG CAC TCG CAA GC-3’(序列辨识号：1))与对于HIV之gagR引子(5′-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATG-3′(序列辨识号：2))来反转录肝脏切片之经萃取的总RNA。于样本中任何HCV或/及HIV的存在遭受到反转录并产生互补单股之DNA。之后将RNA自样本中移除。
分子信标探针
为了HCV或HIV的侦测，合成不同颜色的分子信标。HCV：(5’-FAM-GCTAGCATTTGGGCGTGCCCCCGCIAGAGCTAGC-DABCYL-3’(序列辨识号：3)).HIV：(5’-HEX-GCTAGCATTTGGGCGTGCCCCCGCIAGAGCTAGC-DABCYL-3’(序列辨识号：4))。使用分子信标探针(Molecular Beacon，MB)来执行于溶液中之cDNA的侦测，分子信标探针藉由变性步骤于95℃，10分钟，接着黏附于55℃，4小时，而与其互补序列杂合。
目标之侦测
将经杂合之cDNA样本运送至一电子包埋微流反应器(electrodeembedded microfluidic reactor)(Wang，TH et al.，2005)，于其中植入一单一分子追踪之雷射聚焦侦测区。将样本溶液引入微信道之入口且之后藉由水力帮浦来驱动通过。当分子进入电极区时，它们的运输藉由电极控制之电动力(electrokinetic forces)来控制，其引导它们朝向最小能量区域，位于中间电极的中央。共轭荧光显微镜之聚焦雷射束位于能量最小区域的下游末端，其中以实施例1之一侦测器侦测发射自独立分子之荧光突发(bursts)。使用如于实施例1中之一方法自标记于信标探针上之染料来侦测并辨别于样本中之HCV与HIV的存在。根据藉由侦测装置所报导之侦测数目来将于样本中之HCV与HIV病毒RNA的量进行定量。
对于此处所提之所有专利、申请案或参考文献而言，应了解的是为了所有目的与所提及之主张将其全文引入以供参考。其中任何抵触存在于被引入以供参考之文件与本申请案间之时，以本申请案为主。
依照于说明书中所提之参考文献的教示，可完全了解说明书。于说明书中之实施例提供本发明之实施例的说明，且不应被解释来限制本发明之精神。熟悉此技艺人士轻易了解本发明包含许多其它实施例。所有于揭露中所提之出版品与专利以其全文被引入以供参考。被引入以供参考之数据范围与本说明书抵触或不符时本说明书将取代任何此类资料。于此任何参考文献之引用并非承认此类参考文献为本发明的先前技术。
除非以其它方式指出，使用于说明书，包括申请专利范围中之成分、反应条件等的所有数字表现量，可被理解为在所有情况下藉由措辞“约”来修饰。因此，除非以其它方式指出反对，数字的参数为近似值，且可根据要被本发明获得所搜寻之所需特性而改变。在最小，且不为限制对于申请专利范围均等论的申请的企图，根据显著数字与一般圆形方法可建立各数字参数。
除非以其它方式指出，在一系列要素之前的措辞“至少”可被了解为意指于系列中之每一要素。仅使用例行实验，熟悉此技艺人士会认定或可确认，一些对于此处所述本发明特定实施例的许多等同物。此类等同物包含于下列申请专利范围中。
Figure IDA0000089882260000011

Claims (18)

1.一种侦测一具发光能力目标物之装置，包括：
(a)一光侦测器，包括至少一第一光学传感器与一第二光学传感器，其具有测定光强度之能力，该第一光学传感器与该第二光学传感器为堆叠的；以及
(b)一计算机，其处理由该等光学传感器所产生之输出讯号，并比较该处理之一结果与对应至一已知类型的一已知结果以确定是否该目标物属于该已知类型。
2.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，更包括：
(c)一光学结构，其收集与引导一发射自该目标物的光至光学传感器。
3.根据权利要求2所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该光学结构包括一透镜。
4.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该光学传感器为光二极管。
5.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该至少两个光学传感器系藉由于一装置中之至少两个堆叠的p-n接面来形成。
6.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该光侦测器包括一讯号放大器之电路、A/D转换器、积算器、比较器、逻辑电路、读出电路、内存、微处理器、时钟震荡器及/或地址。
7.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中处理该讯号包括：
计算该等讯号之一总和；
比较该总和与一临界值以测定一目标物的存在，其中
当该总和等于或大于该临界值时，测定一目标物为存在，以及
当该总和小于该临界值时，测定一目标物为不存在。
8.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中处理该讯号包括：
计算该等讯号之一总和；
比较该总和与一临界值以测定一目标物的存在，其中
当该总和小于该临界值时，测定一目标物为不存在，以及
当该总和等于或大于该临界值时，测定一目标物为存在。
9.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中：
处理该等讯号包括计算该等讯号之一比值；
比较该结果与该已知结果包括比较该计算出之比值与对应至一已知类型之一已知比值，以及
当介于该计算出之比值与该已知比值的差异为于一特定范围中时，确定该目标物为属于该已知类型。
10.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该计算机更比较该处理之结果与对应至多数个已知类型的多数个已知结果以确定该目标物属于何种类型。
11.根据权利要求9所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中处理该等讯号更比较该计算出之比值与对应至多数个已知类型的多数个已知比值以确定该目标物属于何种类型。
12.根据权利要求11所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中一已知类型，其具有在该多数个已知比值中对该计算出之比值具有最小差异的一已知比值，被确定为该目标物所属于的类型。
13.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该目标物包括至少一量子点、至少一荧光蛋白质或至少一荧光的小的化学官能基。
14.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该目标物为被荧光标记且包括至少一寡核苷酸、多核苷酸、寡胜肽、多胜肽、寡醣、多糖或脂质。
15.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该目标物包括一无光发射能力之标的目标物或一具有光发射能力之标记目标物。
16.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该目标物包括无光发射能力之标的目标物或一具有光发射能力之标记目标物群组。
17.根据权利要求1所述之侦测一具发光能力目标物之装置，其中该光侦测器为至少一用以侦测多数个目标物之光侦测器之一，该多数个目标物被一液体悬浮液所包括，且该悬浮液流经该至少一光侦测器。
18.一种侦测多数个目标物的系统，该系统包括根据权利要求1所述之装置的一数组。
CN201110265130.4A 2009-03-11 2010-03-10 侦测与辨别分子目标物之装置与方法 Active CN102435591B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15931009P 2009-03-11 2009-03-11
US61/159,310 2009-03-11
US12/720,352 US9778188B2 (en) 2009-03-11 2010-03-09 Apparatus and method for detection and discrimination molecular object
US12/720,352 2010-03-09
CN2010800064770A CN102308198A (zh) 2009-03-11 2010-03-10 侦测与辨别分子目标物之装置与方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800064770A Division CN102308198A (zh) 2009-03-11 2010-03-10 侦测与辨别分子目标物之装置与方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102435591A true CN102435591A (zh) 2012-05-02
CN102435591B CN102435591B (zh) 2018-01-16

Family

ID=42727801

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110265130.4A Active CN102435591B (zh) 2009-03-11 2010-03-10 侦测与辨别分子目标物之装置与方法
CN2010800064770A Pending CN102308198A (zh) 2009-03-11 2010-03-10 侦测与辨别分子目标物之装置与方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800064770A Pending CN102308198A (zh) 2009-03-11 2010-03-10 侦测与辨别分子目标物之装置与方法

Country Status (10)

Country Link
US (2) US9778188B2 (zh)
EP (3) EP2362209B1 (zh)
JP (3) JP2012519861A (zh)
KR (2) KR20110067021A (zh)
CN (2) CN102435591B (zh)
AU (2) AU2010223733B2 (zh)
DK (1) DK2362209T3 (zh)
ES (1) ES2559004T3 (zh)
TW (1) TWI439685B (zh)
WO (1) WO2010102567A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI756433B (zh) * 2017-05-31 2022-03-01 日商住友重機械離子科技股份有限公司 離子植入裝置及離子植入方法

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9778188B2 (en) 2009-03-11 2017-10-03 Industrial Technology Research Institute Apparatus and method for detection and discrimination molecular object
CN102333473A (zh) * 2009-03-24 2012-01-25 奥林巴斯医疗株式会社 荧光观察装置
AU2011217862B9 (en) 2010-02-19 2014-07-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated analytical system and method
US8994946B2 (en) 2010-02-19 2015-03-31 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated analytical system and method
US9482615B2 (en) 2010-03-15 2016-11-01 Industrial Technology Research Institute Single-molecule detection system and methods
US9670243B2 (en) 2010-06-02 2017-06-06 Industrial Technology Research Institute Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US8865078B2 (en) 2010-06-11 2014-10-21 Industrial Technology Research Institute Apparatus for single-molecule detection
US8865077B2 (en) 2010-06-11 2014-10-21 Industrial Technology Research Institute Apparatus for single-molecule detection
CN103119440B (zh) * 2010-09-05 2014-12-24 新港公司 基于微处理器的多结检测器系统及使用方法
US9522396B2 (en) 2010-12-29 2016-12-20 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Apparatus and method for automatic detection of pathogens
US9466747B1 (en) * 2011-10-25 2016-10-11 Radiation Monitoring Devices, Inc. Avalanche photodiode and methods of forming the same
TWI432766B (zh) 2011-12-28 2014-04-01 Pixart Imaging Inc 光源辨識裝置、光源辨識方法以及光學追蹤裝置
CN106840812B (zh) 2011-12-29 2019-12-17 思迪赛特诊断有限公司 用于检测生物样品中病原体的方法和系统
CN103196874A (zh) * 2012-01-09 2013-07-10 纳米及先进材料研发院有限公司 用于监控人健康的基于聚集诱导发光性发光物(aie)的尿蛋白检测装置
US9372308B1 (en) 2012-06-17 2016-06-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of integrated analytical devices and methods for production
US9223084B2 (en) 2012-12-18 2015-12-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Illumination of optical analytical devices
WO2014130900A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated illumination of optical analytical devices
WO2014188405A1 (en) 2013-05-23 2014-11-27 Parasight Ltd. Method and system for imaging a cell sample
IL227276A0 (en) * 2013-07-01 2014-03-06 Parasight Ltd A method and system for obtaining a monolayer of cells, for use specifically for diagnosis
US10831013B2 (en) 2013-08-26 2020-11-10 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Digital microscopy systems, methods and computer program products
CA2959518A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of integrated analytical devices
EP3186778B1 (en) 2014-08-27 2023-01-11 S.D. Sight Diagnostics Ltd. System and method for calculating focus variation for a digital microscope
EP4220256A1 (en) 2015-03-16 2023-08-02 Pacific Biosciences of California, Inc. Analytical system comprising integrated devices and systems for free-space optical coupling
WO2016201387A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated target waveguide devices and systems for optical coupling
CN106404727B (zh) * 2015-07-27 2020-02-28 Pgi股份有限公司 感测模块及感测方法
EP3859425B1 (en) 2015-09-17 2024-04-17 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Methods and apparatus for detecting an entity in a bodily sample
CA3018536A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 S.D. Sight Diagnostics Ltd Distinguishing between blood sample components
US11307196B2 (en) 2016-05-11 2022-04-19 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Sample carrier for optical measurements
WO2017195208A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 S.D. Sight Diagnostics Ltd Performing optical measurements on a sample
AU2018369859B2 (en) 2017-11-14 2024-01-25 S.D. Sight Diagnostics Ltd Sample carrier for optical measurements
WO2019113075A2 (en) 2017-12-04 2019-06-13 Trustees Of Boston University Microbial-based biosensors
CN112964686B (zh) * 2021-02-07 2022-05-10 中国科学院新疆理化技术研究所 一种基于碳点荧光内滤效应的过氧化物荧光比色双模检测方法
WO2022181735A1 (ja) 2021-02-25 2022-09-01 株式会社エヌ・クラフト 物品取得システム

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5717602A (en) * 1996-02-05 1998-02-10 Kenning; Gregory G. Automated electrophoresis and analysis system
US6210973B1 (en) * 1994-12-05 2001-04-03 John W. Pettit Method for automated flourescent tagged sample detecting
US20050275839A1 (en) * 2004-04-08 2005-12-15 Robinson Joseph P Multi-spectral detector and analysis system
CN1711469A (zh) * 2002-11-14 2005-12-21 爱科来株式会社 测量装置及荧光测量方法
US7316930B1 (en) * 2003-04-21 2008-01-08 National Semiconductor Corporation Use of vertically stacked photodiodes in a gene chip system
US20090015831A1 (en) * 2001-02-23 2009-01-15 Juan Yguerabide Methods for providing extended dynamic range in analyte assays
CN101351736A (zh) * 2005-12-27 2009-01-21 奥林巴斯株式会社 发光测量装置及发光测量方法

Family Cites Families (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US575341A (en) 1897-01-19 Half to ernest tinger
US4748111A (en) * 1984-03-12 1988-05-31 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay
US4790614A (en) 1985-11-21 1988-12-13 Hitachi, Ltd. Optical filter and optical device using same
JP2771532B2 (ja) 1986-01-16 1998-07-02 三洋電機株式会社 光センサ
US4962037A (en) 1987-10-07 1990-10-09 United States Of America Method for rapid base sequencing in DNA and RNA
US5162887A (en) * 1988-10-31 1992-11-10 Texas Instruments Incorporated Buried junction photodiode
AU5358990A (en) * 1989-03-21 1990-10-22 Collaborative Research Inc. Multiplex dna diagnostic test
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
US5034613A (en) * 1989-11-14 1991-07-23 Cornell Research Foundation, Inc. Two-photon laser microscopy
US6013434A (en) * 1989-12-22 2000-01-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
US6153737A (en) * 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
DE4013307A1 (de) * 1990-04-26 1991-10-31 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung eines optischen kopplers fuer polymerlichtwellenleiter
DE4103167A1 (de) 1991-02-02 1992-08-06 Boehringer Mannheim Gmbh Diphenylmethanderivate, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur verdraengung von jodthyroninen von diesen bindenden proteinen
JPH04303972A (ja) 1991-03-30 1992-10-27 Kobe Steel Ltd 受光素子
JPH05198739A (ja) * 1991-09-10 1993-08-06 Mitsubishi Electric Corp 積層型半導体装置およびその製造方法
US5405747A (en) * 1991-09-25 1995-04-11 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer Method for rapid base sequencing in DNA and RNA with two base labeling
JPH05118991A (ja) 1991-10-29 1993-05-14 Hitachi Ltd 塩基配列決定方法およびその装置
JPH08506664A (ja) * 1993-02-01 1996-07-16 セック，リミテッド Ｄｎａ配列決定の方法および装置
US6362002B1 (en) 1995-03-17 2002-03-26 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5795782A (en) 1995-03-17 1998-08-18 President & Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5750341A (en) * 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
DE852716T1 (de) * 1995-09-19 2001-07-19 Cornell Res Foundation Inc Multiphoton lasermikroskopie
US6984491B2 (en) * 1996-07-29 2006-01-10 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
NL1006323C2 (nl) 1997-06-16 1998-12-17 Mierij Meteo Bv Geintegreerd optisch golfgeleider systeem.
JPH1138241A (ja) * 1997-07-14 1999-02-12 Tomoegawa Paper Co Ltd フレキシブル光導波路素子及びその製造方法
US6123819A (en) * 1997-11-12 2000-09-26 Protiveris, Inc. Nanoelectrode arrays
US6049380A (en) * 1997-11-12 2000-04-11 Regents Of The University Of California Single molecule identification using selected fluorescence characteristics
US6322968B1 (en) * 1997-11-21 2001-11-27 Orchid Biosciences, Inc. De novo or “universal” sequencing array
CA2320390C (en) * 1998-02-11 2010-06-08 Perkin-Elmer Corporation Pna and dna conjugates and methods for preparation thereof
US5965875A (en) * 1998-04-24 1999-10-12 Foveon, Inc. Color separation in an active pixel cell imaging array using a triple-well structure
SE520951C2 (sv) * 1998-06-17 2003-09-16 Ericsson Telefon Ab L M Multivåglängdsselektiv switch för switchning och omdirigering av optiska våglängder
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
JP2000173093A (ja) 1998-12-07 2000-06-23 Hitachi Ltd 光学素子および情報記録再生装置
DE69930310T3 (de) 1998-12-14 2009-12-17 Pacific Biosciences of California, Inc. (n. d. Ges. d. Staates Delaware), Menlo Park Kit und methode zur nukleinsäuresequenzierung einzelner moleküle durch polymerase synthese
FR2790005B1 (fr) 1999-02-22 2004-01-30 Commissariat Energie Atomique Procede de fabrication de morpholino-nucleotides, et utilisation de ceux-ci pour l'analyse et le marquage de sequences d'acides nucleiques
US7123844B2 (en) * 1999-04-06 2006-10-17 Myrick Michael L Optical computational system
US6680377B1 (en) * 1999-05-14 2004-01-20 Brandeis University Nucleic acid-based detection
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
WO2000077861A1 (en) 1999-06-14 2000-12-21 Augusto Carlos J R P Stacked wavelength-selective opto-electronic device
MXPA02002163A (es) * 1999-09-01 2004-04-21 Yeda Res & Dev Polimerizacion de acido nucleico dependiente de molde usando bloques de construccion de oligonucleotidos trifosfato.
JP4245787B2 (ja) 1999-09-29 2009-04-02 富士フイルム株式会社 蛍光画像取得方法および装置
EP1089067B1 (en) 1999-09-29 2004-12-08 Fuji Photo Film Co., Ltd. Apparatus for obtaining a fluorescence image
GB9928849D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Secr Defence Brit Surface plasmon resonance
US6510263B1 (en) 2000-01-27 2003-01-21 Unaxis Balzers Aktiengesellschaft Waveguide plate and process for its production and microtitre plate
US6413792B1 (en) 2000-04-24 2002-07-02 Eagle Research Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US7175811B2 (en) * 2000-04-28 2007-02-13 Edgelight Biosciences Micro-array evanescent wave fluorescence detection device
US6917726B2 (en) * 2001-09-27 2005-07-12 Cornell Research Foundation, Inc. Zero-mode clad waveguides for performing spectroscopy with confined effective observation volumes
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
CN101525660A (zh) 2000-07-07 2009-09-09 维西根生物技术公司 实时序列测定
US20070172866A1 (en) 2000-07-07 2007-07-26 Susan Hardin Methods for sequence determination using depolymerizing agent
AU2001282908A1 (en) 2000-08-14 2002-02-25 University Of Maryland Biotechnology Institute Bioreactor and bioprocessing technique
FR2813121A1 (fr) 2000-08-21 2002-02-22 Claude Weisbuch Dispositif perfectionne de support d'elements chromophores
US7384797B1 (en) * 2000-10-12 2008-06-10 University Of Utah Research Foundation Resonant optical cavities for high-sensitivity high-throughput biological sensors and methods
JP3690271B2 (ja) * 2000-11-29 2005-08-31 株式会社島津製作所 核酸の塩基配列決定のためのマトリックス値を得る方法
EP1750129B1 (en) 2001-02-07 2011-04-20 Massachusetts Institute of Technology Optoelectronic detection system
ES2441412T3 (es) 2001-03-09 2014-02-04 Trovagene, Inc. Sondas conjugadas y detección óptica de analitos
CA2440754A1 (en) 2001-03-12 2002-09-19 Stephen Quake Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences by asynchronous base extension
US6892002B2 (en) * 2001-03-29 2005-05-10 Ibsen Photonics A/S Stacked planar integrated optics and tool for fabricating same
WO2003003015A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Methods of preparing multicolor quantum dot tagged beads and conjugates thereof
JP4061057B2 (ja) * 2001-12-04 2008-03-12 Ｎｔｔエレクトロニクス株式会社 フォトダイオード
AU2003209361A1 (en) 2002-01-25 2003-09-02 Large Scale Proteomics Corporation Microarrays produced by cross-sectioning multi-sample plates
US7157229B2 (en) * 2002-01-31 2007-01-02 Nimblegen Systems, Inc. Prepatterned substrate for optical synthesis of DNA probes
JP4280720B2 (ja) 2002-02-14 2009-06-17 日本碍子株式会社 試料解析装置および試料解析方法
JP2003270131A (ja) * 2002-03-19 2003-09-25 Matsushita Electric Ind Co Ltd 特定成分の濃度測定方法
JP4156856B2 (ja) 2002-03-29 2008-09-24 オリンパス株式会社 レーザ走査型顕微鏡システム、システム制御方法およびシステム制御をコンピュータに実行させる制御プログラム
WO2003100301A1 (fr) 2002-05-29 2003-12-04 Nok Corporation Bague d'etancheite
JP2004029205A (ja) * 2002-06-24 2004-01-29 Olympus Corp レーザ走査型顕微鏡
EP2264155A1 (en) 2002-07-25 2010-12-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Hybrid polymerase methods and compositions
US20040038331A1 (en) * 2002-08-23 2004-02-26 Reddy M. Parameswara Solid phase synthesis of biomolecule conjugates
US7666645B2 (en) 2002-10-23 2010-02-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sso7-polymerase conjugate proteins
FR2846745B1 (fr) * 2002-10-30 2004-12-24 Genewave Dispositif de support d'elements chromophores.
JP3968425B2 (ja) 2002-11-13 2007-08-29 独立行政法人産業技術総合研究所 光導波路への光導入方法及びそれを用いた光導波路分光測定装置
JP3848623B2 (ja) 2003-01-16 2006-11-22 松下電器産業株式会社 蛍光測定装置
AU2004211920B2 (en) 2003-02-05 2009-05-14 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Solid phase sequencing
EP1496362B1 (en) 2003-07-09 2006-12-13 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Turbidimetric immunoassay and an apparatus therefor
WO2005019419A2 (en) 2003-07-31 2005-03-03 Singulex, Inc. Co-detection of single polypeptide and polynucleotide molecules
JP2005127795A (ja) 2003-10-22 2005-05-19 Toyo Glass Co Ltd ウエルプレート及びその製造方法
US7218812B2 (en) * 2003-10-27 2007-05-15 Rpo Pty Limited Planar waveguide with patterned cladding and method for producing the same
JP4498082B2 (ja) 2003-10-30 2010-07-07 パナソニック株式会社 光学分析装置およびその粒子カウント方法
JP2005165256A (ja) 2003-11-11 2005-06-23 Nitto Denko Corp 保護層付き光導波路
EP2248911A1 (en) 2004-02-19 2010-11-10 Helicos Biosciences Corporation Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
EP1740711A2 (en) 2004-04-01 2007-01-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Quantitative amplification with a labeled probe and 3' to 5' exonuclease activity
US20080026380A1 (en) 2006-07-31 2008-01-31 Siddiqi Suhaib M Nucleotide analogs
US7384497B2 (en) 2004-06-29 2008-06-10 Weyerhaeuser Company Process for encapsulation of cellulose based substrates using electromagnetic radiation heating
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
JP2008513782A (ja) * 2004-09-17 2008-05-01 パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド 分子解析のための装置及び方法
US7170050B2 (en) * 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
JP2006090718A (ja) 2004-09-21 2006-04-06 Fuji Photo Film Co Ltd 全反射減衰を利用した測定装置
US7361516B2 (en) * 2004-09-24 2008-04-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Field of modular multifunctional ligands
EP1797606A1 (en) * 2004-09-27 2007-06-20 Philips Intellectual Property & Standards GmbH Illumination system
CA2588122A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Helicos Biosciences Corporation Tirf single molecule analysis and method of sequencing nucleic acids
US20070273290A1 (en) * 2004-11-29 2007-11-29 Ian Ashdown Integrated Modular Light Unit
JP4514675B2 (ja) 2005-01-14 2010-07-28 株式会社イノアックコーポレーション 診断用容器
US20070141598A1 (en) * 2005-02-09 2007-06-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nucleotide Compositions and Uses Thereof
US7682816B2 (en) 2005-04-07 2010-03-23 454 Life Sciences Corporation Thin film coated microwell arrays and methods of using same
US7738086B2 (en) * 2005-05-09 2010-06-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Active CMOS biosensor chip for fluorescent-based detection
US9012207B2 (en) * 2005-08-02 2015-04-21 University Of Utah Research Foundation Biosensors including metallic nanocavities
US7805081B2 (en) * 2005-08-11 2010-09-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source
US20100304358A1 (en) * 2005-08-15 2010-12-02 Shuming Nie Methods of identifying biological targets and instrumentation to identify biological targets
CN1940529B (zh) 2005-09-29 2010-09-01 株式会社东芝 光波导型生物化学传感器芯片及其制造方法
US7986989B2 (en) * 2005-09-29 2011-07-26 The Research Foundation Of The City University Of New York Phosphorescence and fluorescence spectroscopy for detection of cancer and pre-cancer from normal/benign regions
US7558446B2 (en) 2005-10-12 2009-07-07 Koninklijke Philips Electronics N.V. All polymer optical waveguide sensor
ATE518010T1 (de) * 2005-12-22 2011-08-15 Pacific Biosciences California Aktive oberflächengekoppelte polymerasen
WO2007091280A1 (en) 2006-02-06 2007-08-16 Stmicroelectronics S.R.L. Optical apparatus and method for the inspection of nucleic acid probes by polarized radiation
EP1989925A1 (en) * 2006-02-23 2008-11-12 TIR Technology LP System and method for light source identification
US7858386B2 (en) * 2006-03-07 2010-12-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method of controlling quantum dot photoluminescence and other intrinsic properties through biological specificity
US20080050747A1 (en) * 2006-03-30 2008-02-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing and using same
US8975216B2 (en) 2006-03-30 2015-03-10 Pacific Biosciences Of California Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same
US7282337B1 (en) * 2006-04-14 2007-10-16 Helicos Biosciences Corporation Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing
WO2007119067A1 (en) 2006-04-19 2007-10-25 It-Is International Ltd Reaction monitoring
EP2027442A2 (en) 2006-05-16 2009-02-25 Applied Biosystems, Inc. Systems, methods, and apparatus for single molecule sequencing
CA2657970A1 (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Luminex Corporation Chip-based flow cytometer type systems for analyzing fluorescently tagged particles
US8637436B2 (en) * 2006-08-24 2014-01-28 California Institute Of Technology Integrated semiconductor bioarray
EP2857829B1 (en) * 2006-06-12 2017-08-09 Pacific Biosciences of California, Inc. Zero mode waveguide substrates for performing analytical reactions
JP2007333497A (ja) * 2006-06-14 2007-12-27 Hitachi High-Technologies Corp 蛍光検出デバイスおよび装置
KR100796985B1 (ko) 2006-06-30 2008-01-22 연세대학교 산학협력단 금박막이 부분 증착된 다기능성 나노입자
WO2008032096A2 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Oxford Gene Technology Ip Limited Apparatus for imaging single molecules
US7652767B2 (en) * 2006-10-19 2010-01-26 Sporian Microsystems, Inc. Optical sensor with chemically reactive surface
US8343746B2 (en) 2006-10-23 2013-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
CA2675619C (en) * 2007-01-19 2016-08-16 Sunnybrook Health Sciences Centre Scanning mechanisms for imaging probe
CA2677833C (en) 2007-01-22 2016-05-03 Wafergen, Inc. Apparatus for high throughput chemical reactions
WO2008096296A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Biosensor with evanescent waveguide and integrated sensor
US20100035268A1 (en) * 2007-02-21 2010-02-11 Joseph Beechem Materials and methods for single molecule nucleic acid sequencing
JP2010534474A (ja) 2007-07-26 2010-11-11 パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド 分子冗長配列決定
JP5057377B2 (ja) * 2007-08-30 2012-10-24 国立大学法人埼玉大学 生体成分又はその機能の測定方法及び装置
US7960116B2 (en) * 2007-09-28 2011-06-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nucleic acid sequencing methods and systems
CN101168773B (zh) 2007-10-16 2010-06-02 东南大学 一种基于荧光淬灭的核酸测序方法
US7767441B2 (en) * 2007-10-25 2010-08-03 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
JP2009109402A (ja) * 2007-10-31 2009-05-21 Canon Inc 画像情報処理装置
US8017338B2 (en) 2007-11-20 2011-09-13 Life Technologies Corporation Reversible di-nucleotide terminator sequencing
JP4498409B2 (ja) 2007-12-28 2010-07-07 株式会社エスグランツ データベースのインデックスキー更新方法及びプログラム
US20110165652A1 (en) * 2008-01-14 2011-07-07 Life Technologies Corporation Compositions, methods and systems for single molecule sequencing
EP2286217B1 (en) * 2008-03-31 2015-02-18 Pacific Biosciences of California, Inc. Single molecule loading methods and compositions
EP2274446B1 (en) 2008-03-31 2015-09-09 Pacific Biosciences of California, Inc. Two slow-step polymerase enzyme systems and methods
US7893468B2 (en) * 2008-05-30 2011-02-22 International Business Machines Corporation Optical sensor including stacked photodiodes
GB2461026B (en) 2008-06-16 2011-03-09 Plc Diagnostics Inc System and method for nucleic acids sequencing by phased synthesis
EP4325209A2 (en) 2008-09-16 2024-02-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated optical device
US8481264B2 (en) * 2008-09-19 2013-07-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Immobilized nucleic acid complexes for sequence analysis
US8486630B2 (en) 2008-11-07 2013-07-16 Industrial Technology Research Institute Methods for accurate sequence data and modified base position determination
WO2010141105A2 (en) 2009-01-23 2010-12-09 Bae Systems Information And Electronic Systems Integration Inc. Quantum dot-sensory array for biological recognition
US9778188B2 (en) 2009-03-11 2017-10-03 Industrial Technology Research Institute Apparatus and method for detection and discrimination molecular object
WO2010111691A2 (en) * 2009-03-27 2010-09-30 Life Technologies Corp Conjugates of biomolecules to nanoparticles
US8367159B2 (en) * 2009-09-11 2013-02-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for producing ZMWs with islands of functionality
CN101654712A (zh) 2009-10-10 2010-02-24 上海交通大学 核酸单分子测序方法
EP2504103A2 (en) 2009-11-23 2012-10-03 3M Innovative Properties Company Microwell array articles and methods of use
US8603741B2 (en) 2010-02-18 2013-12-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single molecule sequencing with two distinct chemistry steps
US9482615B2 (en) 2010-03-15 2016-11-01 Industrial Technology Research Institute Single-molecule detection system and methods
US9670243B2 (en) 2010-06-02 2017-06-06 Industrial Technology Research Institute Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US8865077B2 (en) 2010-06-11 2014-10-21 Industrial Technology Research Institute Apparatus for single-molecule detection
US8865078B2 (en) 2010-06-11 2014-10-21 Industrial Technology Research Institute Apparatus for single-molecule detection

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6210973B1 (en) * 1994-12-05 2001-04-03 John W. Pettit Method for automated flourescent tagged sample detecting
US5717602A (en) * 1996-02-05 1998-02-10 Kenning; Gregory G. Automated electrophoresis and analysis system
US20090015831A1 (en) * 2001-02-23 2009-01-15 Juan Yguerabide Methods for providing extended dynamic range in analyte assays
CN1711469A (zh) * 2002-11-14 2005-12-21 爱科来株式会社 测量装置及荧光测量方法
US7316930B1 (en) * 2003-04-21 2008-01-08 National Semiconductor Corporation Use of vertically stacked photodiodes in a gene chip system
US20050275839A1 (en) * 2004-04-08 2005-12-15 Robinson Joseph P Multi-spectral detector and analysis system
CN101351736A (zh) * 2005-12-27 2009-01-21 奥林巴斯株式会社 发光测量装置及发光测量方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI756433B (zh) * 2017-05-31 2022-03-01 日商住友重機械離子科技股份有限公司 離子植入裝置及離子植入方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012112967A (ja) 2012-06-14
EP2362209A2 (en) 2011-08-31
US9778188B2 (en) 2017-10-03
JP2012519861A (ja) 2012-08-30
JP5934817B2 (ja) 2016-06-15
US20100256918A1 (en) 2010-10-07
EP2362209A3 (en) 2011-09-14
KR20110067021A (ko) 2011-06-20
DK2362209T3 (en) 2016-01-25
EP2300801A1 (en) 2011-03-30
US10996166B2 (en) 2021-05-04
AU2010249264A1 (en) 2011-01-06
CN102435591B (zh) 2018-01-16
JP5667040B2 (ja) 2015-02-12
AU2010249264B2 (en) 2012-09-13
ES2559004T3 (es) 2016-02-10
EP3159678B1 (en) 2019-05-15
AU2010223733B2 (en) 2012-01-12
KR20110065473A (ko) 2011-06-15
EP2300801A4 (en) 2011-09-14
US20180067050A1 (en) 2018-03-08
JP2015132615A (ja) 2015-07-23
TWI439685B (zh) 2014-06-01
EP2362209B1 (en) 2015-10-21
EP3159678A1 (en) 2017-04-26
EP2300801B1 (en) 2016-11-02
CN102308198A (zh) 2012-01-04
AU2010223733A1 (en) 2010-09-16
WO2010102567A1 (en) 2010-09-16
TW201111768A (en) 2011-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102435591B (zh) 侦测与辨别分子目标物之装置与方法
EP2580576B1 (en) Apparatus for single-molecule detection
EP2430428B1 (en) Single-molecule detection system and methods
US8865077B2 (en) Apparatus for single-molecule detection
CN1791681A (zh) 通过拉曼散射增强核苷酸信号的方法
US20130338010A1 (en) Filter architecture for analytical devices
US20040023229A1 (en) Direct detection of individual molecules

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant