CN102458420A - 脂质-聚合物共轭物及其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供低分子量脂质-GAG和磷脂-GAG共轭物和使用其遏止、抑制、预防或治疗细胞上的尤其包括由细胞内病原体感染的病原效应的方法。

Description

脂质-聚合物共轭物及其制备和用途
技术领域
本发明提供低分子量脂质-GAG共轭物和使用其遏止、抑制、预防或治疗细胞上的尤其包括由细胞内病原体感染的病原效应的方法。
背景技术
具有抑制酶磷脂酶A2(PLA2、EC 3.1.1.4)的药理学活性的脂质-共轭物在现有技术中是已知的。磷脂酶A2催化磷脂在sn-2位置的分解，从而产生脂肪酸和溶血磷脂。这些酶的活性与各种细胞功能相关，特别与诸如类二十烷酸(前列腺素、血栓素和白三烯)、血小板活化因子和溶血磷脂的脂质介体的产生相关。脂质-共轭物可提供保护细胞和有机体避开有害物剂和病原过程的较宽范围，包括预防和治疗微生物感染。脂质-共轭物可提供使细胞和有机体避开有害物剂和病原过程的较宽保护范围，包括预防和治疗微生物感染。
已对脂质-共轭物进行了深入的实验室研究以便获得使细胞和有机体避开有害物剂、病原过程和炎症过程的较宽保护范围。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提一种供包含与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)的脂质-聚合物共轭物，其中所述共轭物是通过使所述GAG与所述PL分别以约0.25∶15至约5∶15的质量PL与质量GAG的比率反应来制备。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含经由酰胺键或酯键与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的分子量介于5至20kD之间。
在一个实施方案中，本发明提供一种由通式(A)的结构表示的脂质-聚合物共轭物：
Figure BPA00001496789400021
其中
L是脂质或磷脂；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱、磷酸酯或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，L、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键；所述糖胺聚糖的分子量介于5kD与20kD之间。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备由通式(I)的结构表示的化合物的方法：
Figure BPA00001496789400022
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中如果Y不存在，则磷脂酰乙醇胺是经由酰胺键与X直接连接，且如果Y是间隔基，则所述间隔基是经由酰胺键或酯键与X直接连接并经由酰胺键与所述磷脂酰乙醇胺连接；
所述方法包括以下步骤：
b.使磷脂(PL)与糖胺聚糖(GAG)和偶联剂反应，其中质量PL与质量GAG的比率分别为约0.25∶15至约5∶15；
c.过滤来自(a)的反应混合物以产生滤液；和
d.从滤液萃取产物。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的炎性病症的方法，所述方法包括向患有炎性病症的受试者施用包含脂质-聚合物共轭物的组合物，所述脂质-聚合物共轭物包含与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)，其中所述共轭物是通过使所述GAG与所述PL分别以约0.25∶15至约5∶15的质量PL与质量GAG的比率反应来制备。在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低促炎趋化因子、细胞因子或其组合的表达的方法，其包括以下步骤：向具有高水平的促炎趋化因子、细胞因子或其组合的受试者施用由通式(A)的结构表示的化合物：
Figure BPA00001496789400031
其中
L是脂质或磷脂；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，L、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在一个实施方案中，本发明提供一种活化人类气道上皮细胞系中的NF-κB、IL-6、IL-8或其组合的方法，其包括以下步骤：向受试者施用由通式(A)的结构表示的化合物：
Figure BPA00001496789400041
其中
L是脂质或磷脂；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，L、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
附图说明
在本说明书的结论部分特别指出并清楚地要求保护视为本发明的主题。然而，关于结构和操作方法连同其目标、特征和优点，通过在阅读附图时参考以下详细描述可以最好地理解本发明，附图中：
图1描绘实施本发明方法所需的反应容器特征的示意图。
图2描绘根据实施例5制备的透明质酸-磷脂酰乙醇胺共轭物(HyPE)的NMR光谱。
图3是根据实施例5制备的HyPE的HPLC色谱图。
图4描绘RAW 264.7细胞的体外刺激的示意图。
图5描绘在缺少LPS时通过RAW 264.7细胞的平均XTT减低(OD450)。误差柱条表示标准偏差。
图6描绘通过LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均XTT减低(OD450)。误差柱条表示标准偏差。
图7描绘在缺少LPS时从RAW 264.7细胞的平均TNF-α释放。误差柱条表示标准偏差。
图8描绘从LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均TNF-释放。误差柱条表示标准偏差。
图9描绘在缺少LPS时从RAW264.7细胞的平均IL-6释放。误差柱条表示标准偏差。
图10描绘从LPS-刺激的RAW264.7细胞的平均IL-6释放。误差柱条表示标准偏差。
图11描绘在缺少LPS时从RAW 264.7细胞的平均IP-10释放。误差柱条表示标准偏差。
图12描绘从LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均IP-10释放。误差柱条表示标准偏差。
图13描绘在缺少LPS时从RAW 264.7细胞的平均PGE2释放。误差柱条表示标准偏差。
图14描绘从LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均PGE2释放。误差柱条表示标准偏差。
图15描绘TNF-α产生(+LPS)的剂量反应曲线。使用Prism 4S形剂量反应曲线(可变斜率)：Y＝底值+(顶值+底值)/(1+10^((LOGIC50-X)*HillSlope))来进行数据拟合。X是测试物品浓度的对数值，Y是反应。限制，底值＝0，顶值＝100。
图16描绘IL-6产生(+LPS)的剂量反应曲线。使用Prism 4S形剂量反应曲线(可变斜率)：Y＝底值+(顶值+底值)/(1+10^((LOGIC50-X)*HillSlope))来进行数据拟合。X是测试物品浓度的对数值，Y是反应。限制，底值＝0，顶值＝100。
图17描绘IP-10产生(+LPS)的剂量反应曲线。使用Prism 4S形剂量反应曲线(可变斜率)：Y＝底值+(顶值+底值)/(1+10^((LOGIC50-X)*HillSlope))来进行数据拟合。X是测试物品浓度的对数值，Y是反应。限制，底值＝0，顶值＝100。
图18描绘PGE2产生(+LPS)的剂量反应曲线。使用Prism 4S形剂量反应曲线(可变斜率)：Y＝底值+(顶值+底值)/(1+10^((LOGIC50-X)*HillSlope))来进行数据拟合。X是测试物品浓度的对数值，Y是反应。限制，底值＝0，顶值＝100。
图19是来自低分子量透明质酸钠的SEC-MALS分子量分析的色谱图。红线是关于光散射信号。蓝线指的是折射率信号。
图20是低分子量透明质酸钠的SEC-MALS测定的分子量分布。
图21是样品208-088(低分子量透明质酸钠)的UV光谱。
图22描绘在缺少LPS时通过RAW 264.7细胞的平均XTT减低(OD450)。误差柱条表示标准偏差。
图23描绘通过LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均XTT减低(OD450)。误差柱条表示标准偏差。
图24描绘在缺少LPS时从RAW 264.7细胞的平均TNF-α释放。误差柱条表示标准偏差。
图25描绘从LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均TNF-α释放。误差柱条表示标准偏差。
图26描绘在缺少LPS时从RAW 264.7细胞的平均IL-6释放。误差柱条表示标准偏差。
图27描绘从LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均IL-6释放。误差柱条表示标准偏差。
图28描绘在缺少LPS时从RAW 264.7细胞的平均IP-10释放。误差柱条表示标准偏差。
图29描绘从LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均IP-10释放。误差柱条表示标准偏差。
图30描绘在缺少LPS时从RAW 264.7细胞的平均PGE2释放。误差柱条表示标准偏差。
图31描绘从LPS-刺激的RAW 264.7细胞的平均PGE2释放。误差柱条表示标准偏差。
图32描绘TNF-α产生(+LPS)的剂量反应曲线。使用Prism 4S形剂量反应曲线(可变斜率)：Y＝底值+(顶值+底值)/(1+10^((LOGIC50-X)*HillSlope))来进行数据拟合。X是测试物品浓度的对数值，Y是反应。限制，底值＝0，顶值＝100。
图33描绘IL-6产生(+LPS)的剂量反应曲线。使用Prism 4S形剂量反应曲线(可变斜率)：Y＝底值+(顶值+底值)/(1+10^((LOGIC50-X)*HillSlope))来进行数据拟合。X是测试物品浓度的对数值，Y是反应。限制，底值＝0，顶值＝100。
图34描绘IP-10产生(+LPS)的剂量反应曲线。使用Prism 4S形剂量反应曲线(可变斜率)：Y＝底值+(顶值+底值)/(1+10^((LOGIC50-X)*HillSlope))来进行数据拟合。X是测试物品浓度的对数值，Y是反应。限制，底值＝0，顶值＝100。
图35描绘PGE2产生(+LPS)的剂量反应曲线。使用Prism 4S形剂量反应曲线(可变斜率)：Y＝底值+(顶值+底值)/(1+10^((LOGIC50-X)*HillSlope))来进行数据拟合。X是测试物品浓度的对数值，Y是反应。限制，底值＝0，顶值＝100。
图36描绘用于制备HyPE的实际反应容器的照片。冷却器位于反应容器后方，隔音容器的门敞开以便露出超声流式细胞仪。
图37描绘实施例11的HyPE反应2小时后的色谱图。
图38描绘实施例11的HyPE反应6小时后的色谱图。
图39描绘从实施例11分离的最终HyPE的GPC分析。
图40描绘从实施例11分离的并用1滴4％NaOD处理的最终HyPE的NMR光谱。
应了解，为简单和清楚说明，图中显示的要素未必按比例绘图。例如，为了清楚，一些要素的尺寸可以相对于其它的要素放大。另外，在认为适当的情况下，附图标号可以在附图间重复用来指示相应或相似的要素。
具体实施方式
在下文详细描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明的充分理解。然而，本领域的技术人员应理解，可以在没有这些特定细节的情况下实施本发明。在其它情况下，并未对熟知的方法、程序和组分并进行详细描述，以免模糊本发明。
本领域的技术人员易于确认用于指定本文所述方法中使用的化学品和试剂的缩写。出于本发明的目的，应理解DCC指的是二环己基碳二亚胺，EDAC指的是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，BOP指的是苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)-磷六氟磷酸盐，PyBOP指的是苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸盐，HATU指的是O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐，TSTU指的是O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐，HOBT指的是羟基苯并三唑且HOAT指的是1-羟基-7-氮杂-苯并三唑。
本文中，术语“脂质”指的是所有类型的脂质，包括磷脂、甘油脂、鞘脂、固醇脂质、异戊烯醇脂质、糖脂质和类似脂质。
在一个实施方案中，本发明提供一种脂质-聚合物共轭物，在一些实施方案中其适用于治疗炎性病症。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备本发明的脂质-聚合物共轭物的方法。在一些实施方案中，本发明提供一种使用本发明的脂质-聚合物共轭物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)的脂质-聚合物共轭物，其中所述共轭物是通过使所述GAG与所述PL分别以约0.25∶15至约5∶15的质量PL与质量GAG的比率反应来制备。
在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约0.25∶15。在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约0.5∶15。在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约1∶15。在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约2∶15。在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约5∶15。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含经由酰胺键或酯键与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的分子量介于5至20kD之间。
在另一实施方案中，本发明的脂质-共轭物化合物的所述GAG是透明质酸、肝素、硫酸肝素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素或硫酸角质素。在另一实施方案中，所述GAG是透明质酸。在另一实施方案中，所述GAG是肝素。在另一实施方案中，所述GAG是软骨素。在另一实施方案中，所述GAG是硫酸软骨素。在另一实施方案中，所述GAG是硫酸皮肤素，在另一实施方案中，所述GAG是硫酸角质素。
在另一实施方案中，所述硫酸软骨素是6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素或其衍生物。在另一实施方案中，所述硫酸皮肤素是6-硫酸皮肤素、4-硫酸皮肤素或其衍生物。
在另一实施方案中，本发明的脂质-共轭物化合物的所述PL是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酸或磷脂酰甘油。在另一实施方案中，所述PL包含棕榈酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或二十二碳六烯酸的残基。在另一实施方案中，所述PL是二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺。在另一实施方案中，所述PL是二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。
在另一实施方案中，所述GAG的多分散性是约1至1.75。在另一实施方案中，所述GAG的多分散性是约1.25至1.5。
在一个实施方案中，本发明的脂质-聚合物共轭物包含GAG，其中所述GAG的平均分子量介于5kD至90kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至60kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至40kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至15kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至20kD之间。
在一个实施方案中，诸如透明质酸钠的低分子量GAG是通过透明质酸钠的酸水解来制备，如实施例9中所述。在另一实施方案中，所述酸水解包含盐酸。在另一实施方案中，所述酸水解包含硫酸。在另一实施方案中，所述酸水解包含三氟乙酸。在另一实施方案中，所述酸水解包含氢溴酸。在另一实施方案中，所述酸水解包含乙酸。在另一实施方案中，所述酸水解中的酸的浓度是约0.1至12摩尔。在另一实施方案中，所述酸水解中的酸的浓度是约1至6摩尔。在另一实施方案中，所述酸水解中的酸的浓度是约6至12摩尔。在另一实施方案中，所述酸水解是在25摄氏度至100摄氏度之间的温度下进行。在另一实施方案中，所述酸水解是在25摄氏度至50摄氏度之间的温度下进行。在另一实施方案中，所述酸水解是在50摄氏度至100摄氏度之间的温度下进行。
在一实施方案中，透明质酸和衍生物的分子量是由体积排阻层析和多角度光散射(SEC-MALS)来测定，如实施例10所述。图19和图20中说明色谱图和分布图，而红线是关于光散射信号且蓝线是关于折射率信号。图21示出UV光谱。
在与诸如折射率检测器的浓度敏感型检测器串联使用时并且在已知dn/dc(示差折光率增量)的值的情况下，光散射测量可提供摩尔量的绝对测量。实质上，光散射测量自动地提供每个样品的柱状校准曲线，免除了耗时的、构象依赖性校准程序。
在一个实施方案中，用于SEC-MALS分子量测定的透明质酸样品是通过将称量的样品溶于磷酸盐缓冲液中来制备。在另一实施方案中，用于SEC-MALS分子量测定的透明质酸样品是通过将称量的样品溶于乙酸盐缓冲液中来制备。在另一实施方案中，用于SEC-MALS分子量测定的透明质酸样品是通过将称量的样品溶于tris缓冲液中来制备。在另一实施方案中，用于SEC-MALS分子量测定的透明质酸样品是通过将称量的样品溶于MES缓冲液中来制备。
在另一实施方案中，本发明提供一种包含脂质-聚合物共轭物的药物组合物，所述脂质-聚合物共轭物包含与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)的药物组合物，其中所述共轭物是通过使所述GAG与所述PL分别以约0.25∶15至约5∶15的质量PL与质量GAG的比率反应来制备。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至90kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至20kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量大于10kD。
在一个实施方案中，本发明提供由通式(A)的结构表示的脂质-聚合物共轭物：
其中
L是脂质或磷脂；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱、磷酸酯或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，L、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键；所述糖胺聚糖的分子量介于5kD与20kD之间。
在一实施方案中，L是脂质。在另一实施方案中，L是磷脂。在另一实施方案中，L是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酸或磷脂酰甘油。在另一实施方案中，L包含棕榈酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或二十二碳六烯酸的残基。在另一实施方案中，L是二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺。在另一实施方案中，所述L是二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。
在另一实施方案中，X是透明质酸、肝素、硫酸肝素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素或硫酸角质素。在另一实施方案中，X是透明质酸。在另一实施方案中，X是肝素。在另一实施方案中，X是软骨素。在另一实施方案中，X是硫酸软骨素。在另一实施方案中，X是硫酸皮肤素，在另一实施方案中，X是硫酸角质素。
在另一实施方案中，所述硫酸软骨素是6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素或其衍生物。在另一实施方案中，所述硫酸皮肤素是6-硫酸皮肤素、4-硫酸皮肤素或其衍生物。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(I)的结构表示：
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖(GAG)；并且
n是1至70的数；
其中如果Y不存在，则磷脂酰丝氨酸是经由酰胺键与X直接连接，且如果Y是间隔基，则所述间隔基是经由酰胺键或酯键与X直接连接并经由酰胺键与所述磷脂酰乙醇胺连接。
在另一实施方案中，所述GAG的分子量介于5kD至20kD之间。
磷脂酰乙醇胺(PE)部分的实例是磷脂的类似物，其中连接到磷脂的甘油主链的两个脂肪酸基团的链长的长度在2-30个碳原子间变化，且其中这些脂肪酸链含有饱和和/或不饱和的碳原子。代替脂肪酸链，将直接连接到磷脂的甘油主链或经由醚连接接到磷脂的甘油主链的烷基链作为PE的类似物并入。在一个实施方案中，PE部分是二棕榈酰基-磷脂酰基-乙醇胺。在另一实施方案中，PE部分是二肉豆蔻酰基-磷脂酰基-乙醇胺。
磷脂酰基-乙醇胺及其类似物可以来自各种来源，包括天然的、合成的和半合成的衍生物及其异构体。
可用于代替PE部分的磷脂是经由N-甲基-PE的氨基通过共价键连接的N-甲基-PE衍生物及其类似物；经由N，N-二甲基-PE的氨基通过共价键连接的N，N-二甲基-PE衍生物及其类似物；磷脂酰丝氨酸(PS)和它的类似物，诸如棕榈酰基-硬脂酰基-PS、来自各种的来源的天然的PS、半合成的PS、合成的、天然的和人工PS以及它们的异构体。适于用作本发明的共轭部分的其它磷脂是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸和磷脂酰甘油(PG)以及其衍生物，包含磷脂、溶血磷脂、磷脂酸、鞘磷脂、溶源性鞘磷脂、神经酰胺和鞘胺醇。
对PE-共轭物和PS-共轭物而言，磷脂是经由磷脂极性头部基团的氮原子直接或经由间隔基连接到共轭单体或聚合物部分。对PE、PI和PG共轭物而言，磷脂是经由极性头部基团的氮或氧原子之一直接或经由间隔基连接到共轭单体或聚合物部分。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(II)的结构表示：
Figure BPA00001496789400131
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中如果Y不存在，则磷脂酰丝氨酸是经由酰胺键与X直接连接，且如果Y是间隔基，则所述间隔基是经由酰胺键或酯键与X直接连接并经由酰胺键与所述磷脂酰乙醇胺连接。
在一个实施方案中，磷脂酰丝氨酸可经由磷脂酰丝氨酸的COO-部分与Y键合，如果Y不存在，则与X键合。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(III)的结构表示：
Figure BPA00001496789400141
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂酰基、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(IV)的结构表示：
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(V)的结构表示：
Figure BPA00001496789400152
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(VI)的结构表示：
Figure BPA00001496789400161
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(VII)的结构表示：
Figure BPA00001496789400162
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(VIII)的结构表示：
Figure BPA00001496789400171
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(IX)的结构表示：
Figure BPA00001496789400172
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(IXa)的结构表示：
Figure BPA00001496789400181
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(IXb)的结构表示：
Figure BPA00001496789400182
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，磷脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(X)的结构表示：
Figure BPA00001496789400191
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，神经酰胺磷酰基、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，用于本发明的化合物由通式(Xa)的结构表示：
Figure BPA00001496789400201
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，神经酰胺磷酰基、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XI)的结构表示：
Figure BPA00001496789400202
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中如果Y不存在，鞘氨醇是经由酰胺键与X直接连接，且如果Y是间隔基，则间隔基是与X直接连接且经由酰胺键与鞘氨醇连接，并经由酰胺键或酯键与X连接。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XII)的结构表示：
Figure BPA00001496789400211
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，神经酰胺、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，用于本发明的化合物由通式(XIIa)的结构表示：
Figure BPA00001496789400212
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，神经酰胺、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XIII)的结构表示：
Figure BPA00001496789400221
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、胆碱、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，双甘油基、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XIV)的结构表示：
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，甘油脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XV)的结构表示：
Figure BPA00001496789400231
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，甘油脂、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XVI)的结构表示：
Figure BPA00001496789400232
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，脂质、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XVII)的结构表示：
Figure BPA00001496789400241
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，脂质、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XVIII)的结构表示：
Figure BPA00001496789400242
(XVIII)
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，脂质、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XIX)的结构表示：
Figure BPA00001496789400251
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，脂质、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XX)的结构表示：
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，脂质、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，所述脂质-聚合物共轭物由通式(XXI)的结构表示：
Figure BPA00001496789400262
其中
R1是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是氢或长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Z不存在，或是胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是生理学可用单体、二聚体、寡聚物或聚合物，其中X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，脂质、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在另一实施方案中，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(IXa)、(IXb)、(X)、(Xa)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)和(XXII)的R1是棕榈酸的残基或肉豆蔻酸的残基。
在另一实施方案中，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(IXa)、(IXb)、(X)、(Xa)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)和(XXII)的R2是棕榈酸的残基或肉豆蔻酸的残基。
在一些实施方案中，上文提出的化合物(A)、(B)(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(IXa)、(IXb)、(X)、(Xa)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)和(XXII)包含Z基团。在一个实施方案中，Z不存在。在另一实施方案中，Z是肌醇。在另一实施方案中，Z是胆碱。在另一实施方案中，Z是甘油。在另一实施方案中，Z是乙醇胺。在另一实施方案中，Z是丝氨酸。
对上文由通式(A)、(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(IXa)、(IXb)、(X)、(Xa)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)和(XXII)的结构表示的任何或所有化合物而言：在一个实施方案中，X是糖胺聚糖。根据这个方面且在一个实施方案中，糖胺聚糖可尤其是透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、角蛋白、硫酸角质素、硫酸皮肤素或其衍生物。在一个实施方案中，硫酸软骨素可尤其是6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素或其衍生物。在另一实施方案中，X不是糖胺聚糖。在另一实施方案中，X是多糖，在一实施方案中，是杂多糖，且在另一实施方案中，是同多糖。在另一实施方案中，X是多聚吡喃糖。
在另一实施方案中，糖胺聚糖是二糖单位的聚合物。在另一实施方案中，聚合物中二糖单位的数目是m。在另一实施方案中，m是2-10,000之间的一个数。在另一实施方案中，m是2-500之间的一个数。在另一实施方案中，m是2-1000之间的一个数。在另一实施方案中，m是50-500之间的一个数。在另一实施方案中，m是2-2000之间的一个数。在另一实施方案中，m是500-2000之间的一个数。在另一实施方案中，m是1000-2000之间的一个数。在另一实施方案中，m是2000-5000之间的一个数。在另一实施方案中，m是3000-7000之间的一个数。在另一实施方案中，m是5000-10,000之间的一个数。在另一实施方案中，糖胺聚糖的二糖单位可与1个脂质或磷脂部分结合。在另一实施方案中，糖胺聚糖的每个二糖单位可与0或1个脂质或磷脂部分结合。在另一实施方案中，脂质或磷脂部分是与二糖单位的-COOH基团结合。在另一实施方案中，脂质或磷脂部分与二糖单位之间的键是酰胺键。
在一个实施方案中，本发明提供脂质-GAG共轭物或磷脂-GAG共轭物，和其使用方法，其中所述共轭物由以下通式的结构表示：(A)、(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(IXa)、(IXb)、(X)、(Xa)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)和(XXII)。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至90kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至60kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至40kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至15kD之间。在另一实施方案中，所述GAG的平均分子量介于5kD至20kD之间。在另一实施方案中，脂质-GAG共轭物是磷脂-GAG共轭物。
在本发明的一个实施方案中，Y不存在。根据本发明的实施方案，形成任选的桥连基团(在一个实施方案中，称为间隔基)Y的合适的二价基团的非限制性实施例，是例如具有2个或更多个，优选4至30个碳原子的直链或支链亚烷基、-CO-亚烷基-CO、-NH-亚烷基-NH-、-CO-亚烷基-NH-、-NH-亚烷基-NH、CO-亚烷基-NH-、氨基酸、环亚烷基，其中在每种情况中的亚烷基均是直链或支链，并在-(-O-CH(CH3)CH2-)x-链中含有2个或更多个，优选2至30个原子，其中x是1或更大的整数。
在本发明的一个实施方案中，糖胺聚糖的糖环是完整的。在另一实施方案中，完整指的是闭合的。在另一实施方案中，完整指的是天然的。在另一实施方案中，完整指的是未断裂的。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的任何化合物的脂质或磷脂的结构是完整的。在另一实施方案中，根据本发明的任何化合物的脂质或磷脂的天然结构被保留。
在一个实施方案中，用于本发明的化合物是生物可降解的。
在一些实施方案中，使用的化合物列在下文表1中。
表1
Figure BPA00001496789400291
Figure BPA00001496789400311
在一个实施方案中，本发明提供由通式(B)的结构表示的脂质-聚合物共轭物：
Figure BPA00001496789400312
其中
L是脂质或磷脂；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱、磷酸酯或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至10的数；
其中，L、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在一个实施方案中，本发明提供由通式(XXII)的结构表示的脂质-聚合物共轭物：
Figure BPA00001496789400313
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至10的数；
其中如果Y不存在，则磷脂酰乙醇胺是经由酰胺键与X有直接连接，且如果Y是间隔基，则所述间隔基是经由酰胺键或酯键与X直接连接并经由酰胺键与所述磷脂酰乙醇胺连接。
在一个实施方案中，式(B)和式(XXII)的n是1-10，在另一实施方案中，n是1。在另一实施方案中，n是2。在另一实施方案中，n是3。在另一实施方案中，n是4。在另一实施方案中，n是5。在另一实施方案中，n是6。在另一实施方案中，n是7。在另一实施方案中，n是8。在另一实施方案中，n是9。在另一实施方案中，n是10。
在一个实施方案中，本发明提供用于制备由通式(I)的结构表示的化合物的方法：
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中如果Y不存在，则磷脂酰乙醇胺是经由酰胺键与X直接连接，且如果Y是间隔基，则所述间隔基是经由酰胺键或酯键与X直接连接并经由酰胺键与所述磷脂酰乙醇胺连接；
包括
使磷脂(PL)与糖胺聚糖(GAG)和偶联剂反应，其中质量PL与质量GAG的比率分别为约0.25∶15至约5∶15；
在一个实施方案中，本发明提供用于制备由通式(I)的结构表示的化合物的方法：
Figure BPA00001496789400331
其中
R1是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
R2是长度范围在2至30个碳原子的直链、饱和、单不饱或多不饱和烷基链；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中如果Y不存在，则磷脂酰乙醇胺是经由酰胺键与X直接连接，且如果Y是间隔基，则所述间隔基是经由酰胺键或酯键与X直接连接并经由酰胺键与所述磷脂酰乙醇胺连接；
包括以下步骤：
a.使磷脂(PL)与糖胺聚糖(GAG)和偶联剂反应，其中质量PL与质量GAG的比率分别为约0.25∶15至约5∶15；
b.过滤来自(a)的反应混合物以产生滤液；和
c.从滤液萃取产物。
在另一实施方案中，所述偶联剂是DCC、EDAC、BOP、PyBOP、HATU、TSTU或任何其它的酰胺偶联剂。在另一实施方案中，所述偶联剂是EDAC。在另一实施方案中，所述偶联剂还包括HOBT或HOAT。
在另一实施方案中，所述过滤步骤包括10kD centrasette膜。
在另一实施方案中，R1是棕榈酸的残基或肉豆蔻酸的残基。
在另一实施方案中，R2是棕榈酸的残基或肉豆蔻酸的残基。
在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于5kD至90kD之间。在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于5kD至20kD之间。在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于5kD至10kD之间。在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于10kD至20kD之间。在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于20kD至50kD之间。在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于30kD至60kD之间。在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于40kD至70kD之间。在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于50kD至80kD之间。在另一实施方案中，糖胺聚糖的平均分子量介于60kD至90kD之间。
在一个实施方案中，透明质酸(HA)是以溶液形式使用。在另一实施方案中，HA溶液是根据实施例1来制备。
在一个实施方案中，用于制备分馏的透明质酸的方法包括超滤。在另一实施方案中，透明质酸的超滤分馏是按照实施例2所述进行。
在一个实施方案中，磷脂酰乙醇胺-透明质酸共轭物(HyPE)是通过使用偶联剂使GAG与PL反应来制备。在另一实施方案中，HyPE是使用图1中描绘的装置，根据实施例3来制备。
在一个实施方案中，分馏的HA是用于制备HyPE。在另一实施方案中，分馏的HA是根据实施例3来制备。在另一实施方案中，HyPE是根据实施例11来制备。
在一个实施方案中，将偶联试剂用于根据实施例3的HyPE制备中。在另一实施方案中，将EDAC用作偶联试剂。在另一实施方案中，将DCC用作偶联剂。在另一实施方案中，将BOP用作偶联剂。在另一实施方案中，将PyBOP用作偶联剂。在另一实施方案中，将HATU用作偶联剂。在另一实施方案中，将TSTU用作偶联剂。
在一个实施方案中，用于根据实施例3的HyPE制备中的偶联剂包括HOBT。在另一实施方案中，偶联剂包括HOAT。
在一个实施方案中，粗的HyPE是通过超滤步骤来处理。在另一实施方案中，使HyPE经历实施例4所描述的碱性超滤。
在一个实施方案中，过滤的HyPE是通过萃取来分离。在另一实施方案中，HyPE是根据实施例5所描述的方法来萃取。在另一实施方案中，所述萃取包括二氯甲烷、乙醇和甲醇。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的炎性病症的方法，所述方法包括对患有炎性病症的受试者施用包含脂质-聚合物共轭物的组合物，所述脂质-聚合物共轭物包含与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)，其中所述共轭物是通过使所述GAG与所述PL分别以约0.25∶15至约5∶15的质量PL与质量GAG的比率反应来制备。
在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约0.25∶15。在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约0.5∶15。在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约1∶15。在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约2∶15。在另一实施方案中，所述质量PL与质量GAG的比率是约5∶15。
在另一实施方案中，所述炎性病症是类风湿性关节炎、骨关节炎、伤口愈合、皮肤炎、再狭窄、囊性纤维化、多发性硬化或败血症。
在一个实施方案中，体外试验用于测量HyPE和HyPE类似物降低促炎细胞因子的表达的能力。在另一实施方案中，基于细胞的试验是根据实施例6、实施例7和实施例8来使用。在另一实施方案中，测量IL-6的表达。在另一实施方案中，测量TNF-α的表达。在另一实施方案中，测量IP-10的表达。在另一实施方案中，测量PGE2的表达。
在另一实施方案中，静脉内施用所述组合物。在另一实施方案中，局部施用所述组合物。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于降低促炎趋化因子、细胞因子或其组合的表达的方法，其包括以下步骤：向具有高水平的促炎趋化因子、细胞因子或其组合的受试者施用由通式(A)的结构表示的化合物：
Figure BPA00001496789400361
其中
L是脂质或磷脂；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，L、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
在一个实施方案中，本发明提供一种活化人类气道上皮细胞系中的NF-κB、IL-6、IL-8或其组合的方法，其包括以下步骤：向受试者施用由通式(A)的结构表示的化合物：
Figure BPA00001496789400362
其中
L是脂质或磷脂；
Z不存在，或是乙醇胺、丝氨酸、肌醇、胆碱或甘油；
Y不存在或是长度范围在2至30个原子的间隔基；
X是糖胺聚糖；并且
n是1至70的数；
其中，L、Z、Y与X之间的任何键是酰胺键或酯键。
施用剂量和途径
本发明的方法可适于使用治疗组合物，所述治疗组合物包含与常规赋形剂混合的脂质-共轭物，所述常规赋形剂也就是下述的的可药用的有机或无机载体物质，其适用于肠胃外、肠道内(例如口服)或局部施用，并且与活性化合物无有害反应。合适的可药用载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、诸如乳糖、直链淀粉或淀粉的碳水化合物、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、白石蜡、甘油、海藻酸盐、透明质酸、胶原、芳香油、脂肪酸单酸甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。药物制剂可予以杀菌并在需要时与助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、调味物质和/或芳香物质和类似助剂，这些助剂与活性化合物无有害反应。在需要的情况下，它们还可以与其它活化剂组合，所述活化剂例如维生素、支气管扩张剂、类固醇、消炎化合物、基因治疗剂即编码野生型囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)受体的序列、表面活性剂蛋白质等，如本领域技术人员所理解。
在一个实施方案中，本发明也提供如本文所述的化合物的盐的施用。在一个实施方案中，盐是可药用的盐，所述盐又可以指化合物(通常通过使游离酸与合适的有机或无机碱反应而制备的化合物)的无毒盐并包括但不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、钙盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、半乳糖二酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、丁二酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘和戊酸盐以及这些盐的混合物。
在一个实施方案中，施用途径可以是肠胃外、肠道内或其组合。在另一实施方案中，途径可以是眼内的、结膜的、局部的、透皮的、皮内的、皮下的、腹膜内的、静脉内的、动脉内的、阴道的、直肠的、瘤内、傍癌的、透粘膜的、肌肉内的、血管内的、心室内的、颅内的、吸入式、鼻吸入式(喷雾)、舌下的、口服的、气溶胶式或栓剂式或其组合。在一个实施方案中，给药方案是由熟练的临床医师基于如下因素来确定：要治疗的病状的确切性质、病状的严重性、患者的年龄和一般身体状况等等。
通常，用于上文所述目的的剂量可以变化，但是应呈发挥所要抗疾病效果的有效量。本文所使用的术语“可药用有效量”指的是式(I)化合物产生的患者症状或疾病征象的所要减轻的量。用于任何上文所述目的的剂量通常为每公斤体重1至约1000毫克(mg/kg)，每天施用1至4次，或通过连续的IV输注施用。当组合物局部用药时，组合物的浓度范围通常是0.1至约10％w/v，每天施用1-4次。
在一个实施方案中，具有有效抗氧化、膜稳定化、抗增殖、抗趋化、抗迁移和抗炎活性的单一化学实体的使用提供了对患有炎性病症的受试者的所需保护作用，或在另一实施方案中，本发明的方法提供所述化合物的组合的用途。在另一实施方案中，用于本发明的化合物可提供于单一制剂/组合物中，或在另一实施方案中，可使用多种制剂。在一个实施方案中，用于本发明的制剂可同时施用，或在另一实施方案中，以不同时间间隔来施用，所述时间间隔可以在几分钟、几小时、几天、几星期或几个月之间变化。
在一实施方案中，包含用于本发明的化合物的组合物可经由不同途径施用，在一个实施方案中，可适合在不同部位提供不同化合物，例如，一些化合物可以肠胃外方式给予来提供遍及肺和淋巴系统的良好灌注，且在另一实施方案中，一些制剂/化合物/组合物可经由气溶胶来提供，或在另一实施方案中，以鼻内方式提供以便提供较高的肺粘膜浓度。
在一个实施方案中，用于本发明的化合物可用于临时病状的急性治疗，或按需要可长期施用。在本发明的一个实施方案中，化合物的浓度取决于各种因素，包括要治疗的病状的性质、患者的病状、施用途径和个体对组合物的耐受性。
在一个实施方案中，本发明的方法提供了在受试者生命早期施用所述化合物，或在另一实施方案中，在受试者生命全程期间施用所述化合物，或在另一实施方案中，根据症状阶段的严重性或持续性的反应偶尔施用所述化合物。在另一实施方案中，应施用脂质或PL共轭物的患者是正经历疾病症状或具有感染疾病的风险或经历疾病复发或恶化、或其相关的病理学病症的的那些患者。
本文所使用的术语“可药用载体”指的是安全的并为有效量的本发明的至少一种化合物的所需施用途径提供适当递送的任何制剂。因而，所有上文所述的本发明制剂在此称为“可药用载体”。这个术语也涉及缓冲制剂的使用，其中根据化合物的稳定性和施用途径，将pH维持在特定的希望值，范围为pH 4.0至pH 9.0。
对于肠胃外施用而言，尤其合适的是无菌溶液，优选油性溶液或水溶液以及混悬液或乳液。也可能冷冻干燥新的化合物并使用获得的冷冻干燥物(例如)来制备用于注射的产品。
在一个实施方案中，植入剂或栓剂可用于施用本发明的脂质-GAG共轭物。
对于吸入应用而言，尤其在用于治疗呼吸道阻塞或充血时，化合物的溶液或混悬液在适当载体存在下混合和雾化或成喷雾。
对于局部应用而言，尤其在用于治疗诸如接触性皮肤炎或牛皮癣的皮肤疾病时，化合物与常规乳剂或缓释片的混合物是可接受的。
对于肠道内应用而言，尤其合适的是片剂、糖衣丸、液剂、滴剂、栓剂或胶囊。当使用增甜媒介物时，可使用糖浆、酏剂或类似物。在有指示时，栓剂或灌肠制剂可能是推荐的施用途径。
可(例如)通过微囊包封、多重包衣等来配制缓释或直接释放组合物，(例如)脂质体或其中活性化合物由不同的可降解包衣保护的那些脂质体。
应了解，活性化合物在特定状况下的实际优选量会根据要使用的特定化合物、配制的特定组合物、应用模式和要治疗的特定部位和有机体而变化。对于给定宿主的剂量可使用常规的考虑方法来确定，例如，借助于适当的常规药理学方案，通过常规对比主题化合物与已知药剂的活性的不同来确定。
使用方法
在本发明的一个实施方案中，本发明的方法利用如本文所述的共轭物来治疗患有炎性病症的受试者，减少或延缓患有炎性病症的受试者的死亡，或改善与炎性病症相关的症状。
在一个实施方案中，用于本发明的化合物包含二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和肝素。在一个实施方案中，用于本发明的化合物包含二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和硫酸软骨素。在一个实施方案中，用于本发明的化合物包含二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和透明质酸。在一个实施方案中，用于本发明的化合物包含二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和羧甲基纤维素。在一个实施方案中，用于本发明的化合物包含二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺和透明质酸。
在一个实施方案中，用于本发明的化合物是经由酰胺键或酯键与糖胺聚糖共轭的二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。在一个实施方案中，用于本发明的化合物是经由酰胺键或酯键与硫酸软骨素共轭的二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺，所述硫酸软骨素是6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素或其衍生物。在另一实施方案中，用于本发明的化合物是经由酰胺键或酯键与肝素共轭的二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。在另一实施方案中，用于本发明的化合物是经由酰胺键或酯键与透明质酸共轭的二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。在另一实施方案中，用于本发明的化合物是经由酰胺键或酯键与透明质酸共轭的二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺。
在一个实施方案中，本发明的共轭物显示适用于本发明的细胞保护药理学活性的广范围组合。在一个实施方案中，化合物可由于其抗炎效果而适用。细胞因子和趋化因子的细胞细化在健康状态中发挥着重要的调节功能；然而，在触发对应激或疾病的过强应答，这些化合物可能过量存在并损伤组织，从而迫使疾病病况进一步恶化。在一个实施方案中，用于本发明的方法的脂质化合物拥有多重和有效药理学效果的组合，尤其包括抑制酶磷脂酶A2的胞外形式的能力。
治疗CF的方法
在一个实施方案中，本发明的共轭物适用于在患有炎性病症的受试者中对炎症施加影响，其中在疾病出现症状之前对受试者施用脂质-共轭物。CF肺的炎症的特征是大量中性粒细胞持续渗入气道中。虽然中性粒细胞有助于控制感染，但其在过量存在时可能是有害的。在CF肺炎症过程的理解上，主要的进展在于使用支气管镜检查和支气管肺泡灌洗(BAL)来分析相对没有症状的和/或不定期产生痰液的患者的炎症过程。近来的BAL研究暗示中性粒细胞富集的炎症开始得非常早，甚至在婴儿时期开始，而并无明显的临床肺部疾病。因此，在一个实施方案中，本发明的脂质/磷脂共轭物可适用于治疗CF，即使在疾病的症状前的阶段也适用。
因此，在一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有囊性纤维化的受试者，降低或延缓患有囊性纤维化的受试者的死亡率、或改善与囊性纤维化相关的症状的方法，且在一个实施方案中，化合物/组合物/制剂减轻或消除所述受试者的有害炎症反应，或在另一实施方案中，在CF受试者中预防、治疗、降低感染的发生率，减轻感染的严重性，延缓感染的发作或减轻感染的发病机理。在另一实施方案中，本发明提供用于降低促炎趋化因子、细胞因子或其组合的表达的方法，而在另一实施方案中，本发明提供活化人类气道上皮细胞系中NF-κB、IL-6、IL-8或其组合的方法。
治疗伤口的方法
在另一实施方案中，本文提供一种用于促进伤口愈合的方法，其包括对受试者的要治疗的伤口部位应用或施用有效量的包含如本文所述的任何共轭物的组合物。在另一实施方案中，本文提供一种用于促进伤口愈合的方法，其包括对受试者的要治疗的伤口部位应用或施用包含由通式(A)的结构表示的任何化合物的组合物。
在另一实施方案中，促进伤口愈合包括诱导伤口愈合。在另一实施方案中，促进伤口愈合包括加速伤口愈合。在另一实施方案中，促进伤口愈合包括降低病毒和/或细菌传染的风险。在另一实施方案中，促进伤口愈合包括减轻伤口部位内或附近的炎症。
在另一实施方案中，如本文所述的共轭物增大了慢性和急性伤口愈合的速率。在另一实施方案中，如本文所述的共轭物反作用于延缓或影响伤口愈合的机理。在另一实施方案中，如本文所述的化合物反作用于延缓或影响伤口愈合的外部因素。在另一实施方案中，如本文所述的共轭物反作用于延缓或影响伤口愈合的内在因素。在另一实施方案中，因素包括：感染、尤其由于糖尿病的溃疡、与血管疾病相关的循环问题、营养不良、紧张、癌症放射疗法和/或化学疗法、免疫系统的损害或完全归因于自然老化过程的因素。在另一实施方案中，本文所述的方法提供促进伤口愈合过程的治疗性和美容性方法。
在另一实施方案中，伤口包括但不限于以下：手术伤口；咬伤；烧伤；酸和碱烧伤；冷燃烧(冻伤)、日光灼伤、轻微割伤、严重割伤、擦伤、撕裂伤、由枪击或刀伤害引起的伤口；由先天性病症引起的伤口；口腔外科手术后的伤口；牙周疾病伤；外伤后的伤口；与肿瘤相关的伤口，可分类为涉及原发肿瘤或转移的恶性皮肤溃疡；溃疡、腿溃疡；足溃疡；褥疮和角膜伤口。
治疗关节炎的方法
在本发明的另一实施方案中，本发明的方法利用如本文所述的共轭物来治疗患有关节炎的受试者，减少或延缓对患有关节炎的受试者的关节的损伤，或改善与关节炎相关的症状。在本发明的另一实施方案中，本发明的方法利用包含如本文所述的共轭物的制剂来治疗患有关节炎的受试者，减少或延缓对患有关节炎的受试者的关节的损伤，或改善与关节炎相关的症状。
在另一实施方案中，本文提供一种治疗患有关节疼痛、关节内肿胀、关节内炎症或其组合的受试者的方法，其包括向受试者施用包含本发明的共轭物的组合物的步骤。在另一实施方案中，本文提供一种治疗患有关节疼痛、关节内肿胀、关节内炎症或其组合的受试者的方法，其包括将包含本发明的共轭物的组合物注射到肿胀/炎症的关节中的步骤。
应理解，本领域的技术人员了解术语“关节炎”指的是类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)。
在另一实施方案中，如本文所述的化合物抑制IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB或它们组合的产生，从而减少或延缓对患有关节炎的受试者的关节的损伤。在另一实施方案中，本文所述的化合物抑制IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB或其组合的产生，从而改善与关节炎相关的症状。在另一实施方案中，方法包括施用如本文所述的共轭物来通过抑制IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB或它们组合的产生而治疗患有关节疼痛、关节内肿胀、关节内炎症或其组合的受试者。在另一实施方案中，通过关节内注射来局部施用包含如本文所述的共轭物的组合物抑制了关节细胞内的IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB或其组合的产生。在另一实施方案中，通过关节内注射来局部施用包含如本文所述的共轭物的组合物抑制了关节内的炎症。
治疗其它炎性病症的方法
本领域的技术人员应了解，炎性病症包括但不限于由免疫系统的活化而产生的病症。因此，自体免疫病症应理解为炎性病症。这类病症包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、伤口愈合、皮肤炎、再狭窄、囊性纤维化、中枢神经系统组织损伤、多发性硬化、梗阻性呼吸道疾病、克罗恩病(Crohn’sdisease)、心血管疾病、动脉粥样硬化、接触性皮肤炎、牛皮癣、ARDS或败血症。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有梗阻性呼吸道疾病的受试者的方法，尤其包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有梗阻性呼吸道疾病的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有结肠炎、克罗恩病或肠粘膜损伤的另一形式的受试者的方法，尤其包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有包括结肠炎或克罗恩病的肠粘膜损伤的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有心血管疾病的受试者的方法，尤其包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有心血管疾病的受试者。
本发明提供一种治疗患有动脉粥样硬化的受试者的方法，尤其包括的步骤是：施用本发明的共轭物，从而治疗患有动脉粥样硬化的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有中枢神经系统组织损伤的受试者的方法，尤其包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有中枢神经系统损伤的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有多发性硬化的受试者的方法，尤其包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有多发性硬化的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有接触性皮肤炎的受试者的方法，尤其包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有接触性皮肤炎的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有牛皮癣的受试者的方法，尤其包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有牛皮癣的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有败血症的受试者的方法，尤其包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有败血症的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有ARDS的受试者的方法，包括的步骤是：向受试者施用有效量的本发明的共轭物，从而治疗患有ARDS的受试者。
虽然本文所述的脂质-共轭物的药理学活性可能部分归因于脂质部分的性质，但对脂质-共轭物观察到的药理学特性的多种和各样的组合可以在其它实施方案中表示共轭物在一个化学实体中作为若干不同药物起作用的能力。因此，例如在CF中可发生的肺粘膜或肺实质损伤可以通过任一或所有药物活性而减弱，所述活性是免疫抑制、抗炎作用、抗氧化、抑制氧化氮产生或膜稳定化。
在一个实施方案中，本发明提供“治疗”炎性病症或相关疾病或病症的方法，在一个实施方案中，所述方法指的是治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目的是预防或减轻如上文所述靶向的病理性病状。在一个实施方案中，治疗指的是延缓症状的发作、降低症状的严重性、降低急性发病的严重性、减少症状的数量、降低疾病相关症状的发病率、缩短症状的潜伏期、改善症状、减少继发症状、减少继发感染、延长患者存活期、预防疾病复发、减少疾病复发的次数或频率、延长症状发病之间的潜伏期、延长持续进展的时间、加快症状缓解、诱导症状缓解、加强症状缓解、加速复原或提高替代疗法的效力或降低其抗性。
在一个实施方案中，所述方法适用于治疗受试者的感染，其中病原体是病毒或在另一实施方案中，病原体是细菌。在一个实施方案中，感染是感染呼吸系统的病原体感染，所述病原体如分枝杆菌、假单胞菌、隐球菌、链球菌、呼肠孤病毒、流感病毒，或是本领域的技术人员已知的其它感染。
无需进一步详述，确信本领域的技术人员可通过前文描述而在最大程度上利用本发明。因此，以下实施例和优选的特定实施方案应仅理解为为说明性的，而不是以任何方式限定公开内容的剩余部分。
实施例1
透明质酸(HA)溶液的制备
将4g氯甲酚溶于4L去离子(DI)水(0.1％溶液)中。在机械搅拌下，将HA UL 15溶于4L的0.1％氯甲酚溶液中。为防止超滤膜堵塞，将HA溶液经由100μm过滤器，接着50μm过滤器，接着10μm过滤器来过滤，所有过滤器之前全部用10％过氧化氢消毒并用大量DI水洗涤以确保过氧化氢被除去(用过氧化物检测条来检验)。
实施例2
透明质酸(HA)的超滤分馏
将实施例1的HA溶液装入Centramate系统中，所述Centramate系统之前已用10％过氧化氢消毒并用大量DI水洗涤以确保过氧化氢被除去(用过氧化物检测条来检验)。
借助于通过70kDa Omega TFF膜的恒定容积渗滤，将如实施例1所述制备的20L的0.1％氯甲酚溶液超滤，在酸瓶中收集滤液(小于70kDa的馏份)，所述酸瓶之前已用10％过氧化氢消毒。泵速度和阀门应设定为使得滞留物流量是滤液流量的10倍，且进料压力小于40PSI。
用30kDa膜代替70kDa膜，且用10％过氧化氢消毒Centramate系统。
将5L滤液(小于70kDa的馏份)装入储存器并借助于恒定容积渗滤，将具有小于70kDa的馏份的酸瓶酸瓶中的剩余35L超滤。使储存器体积减少为2L，并将额外的10L的DI水超滤以便除去氯甲酚(通过适当的GC试验确认)。将储存器体积进一步减少为1L，必要时减小泵速度，以便保持进料压力低于40PSI。然后，将储存器直接排空到高压消毒的Lyoguard容器中，关闭，冷冻并冷冻干燥以产生HA UF 70/30。进行GPC分析来确保这批HA UF 70/30与早前批次的一致。进行生物负载试验和用于氯甲酚的适当GC试验。进行KarlFischer分析来测定HA UF 70/30的水含量。
实施例3
HyPE合成反应
使用图36中描绘的装置，将24g的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)溶于125mL的DI水中且通过加入4N NaOH将pH调节至pH 6.4。
将2.5g二棕榈酰基磷酯酰乙醇胺(DPPE)和25g羟基苯并三唑(HOBT)在搅拌下溶于940mL的叔丁醇和80mL的水中，并在45℃下，在12圆底烧瓶中加热(用泵和超声波仪形成闭合系统，它们全部在之前经过高压处理和/或用70％异丙醇消毒)。向这个圆底烧瓶加入850mL的水和115mL的MES溶液。通过加入2.5N NaOH将这种溶液的pH调节至pH 6.4。然后，将25g实施例2的HA UF 70/30在搅拌下溶解并在45℃下加热。然后加入25g的1-乙基-3-(3-二甲基氨乙基)碳二亚胺(EDAC)，将泵和超声波仪启动，并将系统保持在40℃与50℃之间3小时。进行GPC分析来监测反应的过程。3小时后，将超声波仪和泵关闭，并在室温下将溶液搅拌过夜。次日，加入750mL乙腈以沉淀HyPE。使其静置30分钟，之后除去上清液。向其加入7.5L的2％Na2CO3，所述Na2CO3之前是通过将150g Na2CO3溶于7.5L DI水中来制备。有力地机械搅拌至少2小时，以便水解尿素相关的副产物。用6N HCl中和溶液，同时通过使溶液通过冷却的、备有夹套的流式细胞仪而将温度保持在约20-25℃。
实施例4
HyPE的碱性超滤
将2.25kg的NaHCO3溶于150L的0.1％氯甲酚溶液中，所述氯甲酚溶液是通过将150g的氯甲酚溶于150L的DI水中来制备。借助于阀门，转移闭合的反应体系以便从圆底烧瓶将实施例3的消化的中和HyPE溶液抽入centrasette系统中。借助于用10kDa Omega TFF膜的恒定容积渗滤，将150L的溶于0.1％氯甲酚溶液中的1.5％NaHCO3超滤，清除滤液，即，小于10kDa的馏份。泵速度和阀门被设定以使得滞留物流量是滤液流量的10倍，且进料压力小于40PSI。进行GPC分析来确保在约13.2分钟处的尿素相关峰和在约17.2分钟处的HOBT峰的消失。用6N HCl中和溶液，同时通过使溶液通过冷却的、备有夹套的的流式细胞仪将温度保持在约20-25℃。
实施例5
HyPE的萃取
通过将3L的二氯甲烷、3L的乙醇和2.25L的甲醇混合来制得萃取溶液。将7.5L萃取溶液加入含有3的实施例4的粗HyPE溶液的圆底烧瓶中。将其有力地搅拌15分钟，此时间之后使其静置45min。除去下方的二氯甲烷层。借助于恒定容积渗滤，用100L的DI水洗涤溶液以除去甲醇和乙醇。进行GPC分析来确保在约14分钟处的峰的消失。将体积减小到3L且直接排空到2个高压消毒的lyoguard容器中，关闭，冷冻并冷冻干燥以产生HyPE。图2和图3显示了分离的HyPE的NMR和HPLC数据。
实施例6
RAW 264.7细胞的体外刺激
根据图4描绘的示意图来进行RAW 364.7细胞的体外刺激。以10mg/ml在DMEM(不含FBS)中制备各测试物品(根据水分含量来校正所有测试物品浓度)，涡旋，在50℃下加热5分钟，超声处理5分钟并经由0.2微米注射器过滤器来过滤。通过在CM中稀释10mg/ml储备溶液来制备0.6mg/ml、0.2mg/ml和0.06mg/ml的2X测试物品工作溶液。将在乙醇中制备地塞米松的2.55mM溶液在CM中稀释至2μM(2X工作溶液)。载体对照溶液是CM。在CM中将LPS的1mg/ml溶液(在1×PBS中制得)稀释至10μg/ml。在37℃下，使用5％CO2，使RAW 264.7细胞在CM中生长XX继代(每3-4天次培养)。将0.5ml的细胞以1×106细胞/ml涂覆在24孔组织培养板中。在处理之前，在37℃下，使用5％CO2使细胞粘附30分钟。将适当的测试物品、地塞米松或载体对照工作溶液加入细胞。在LPS处理之前，在37℃下，使用5％CO2将细胞培育1小时。110μlof将CM加入-LPS培养板中。将110μl的10μg/ml LPS加入+1μg/ml LPS培养板中。在37℃下，使用5％CO2将培养板培育24小时。
实施例7
上清液收获/XTT试验
用LPS处理24小时后，收集细胞培养上清液并在-30℃下储存直到试验。各细胞培养孔中留下400μl的培养基以便进行XTT试验。将400μl的培养基加入不含细胞的培养孔中以用作XTT试验中的空白。将200μl的活化XTT试剂加入各孔中。在37℃下，使用5％CO2将培养板培育1小时。从各孔除去100μl并使用ThermoMax微板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，在450nm(630nm校正值)下读数。图5和图6中显示了关于高分子量HyPE组合物的XTT数据。图22和图23中显示了关于低分子量HyPE组合物的XTT数据。
实施例8
细胞因子/趋化因子试验
使用Luminexbased试验，根据制造商的说明书来分析细胞培养上清液的IL-6、TNF-α和IP-10。使用Luminex 100(Luminex Corporation，Austin，TX)来收集数据。使用加权1/y的5-参数逻辑曲线拟合方程式(StarStation V 2.0；Applied Cytometry Systems，Sacramento，CA)来产生标准曲线。对各样品读数的适当标准曲线进行内插。必要时，将计算的浓度乘以适当的稀释因子。图7、图8和图15显示了关于高分子量HyPE组合物的TNF-α数据。图24、图25和图32显示了关于低分子量HyPE组合物的TNF-α数据。图9、图10和图16显示了关于高分子量HyPE组合物的IL-6数据。图26、图27和图33显示了关于低分子量HyPE组合物的IL-6数据。图11、图12和图17显示了关于高分子量HyPE组合物的IL-10数据。图28、图29和图34显示了关于低分子量HyPE组合物的IL-10数据。
按照制造商的说明书，通过ELISA来分析细胞培养上清液的PGE2。使用ThermoMax微板读数器(Molecular Devices)来检测吸光度读数。使用4-参数逻辑曲线拟合方程式(SoftMax Pro 4.7.1；Molecular Devices)来产生标准曲线。对各样品读数的适当标准曲线进行内插。对两次内插的样品值取平均值，并计算标准偏差。将计算的浓度乘以适当的稀释因子。图13、图14和图18中显示了关于高分子量HyPE组合物的PGE2数据。图30、图31和图35中显示了关于低分子量HyPE组合物的PGE2数据。
实施例9
低分子量透明质酸钠的制备
通过酸性水解来降解透明质酸钠的原料(1.32MDa)。降解后立即将样品溶液超滤。针对上述样品的情况，使用喷雾干燥器来制备最终产物。另外，在干燥之前用0.2μm过滤器(PALL)将其过滤以实现微生物纯度。
实施例10
分子量的SEC-MALS测定
色谱系统(Agilent，1100系列)由HPLC泵(G1310A)、自动喷射器(G1313A)和以下柱系统组成：串联连接并在环境温度下恒温的PL水凝胶-OH混合管柱和PL水凝胶-OH 30(300×7.5mm，8μm；Agilent Technologies)管柱。注射体积是100μl。使用DAWN-EOS多角激光散射光度计(18-角，Wyatt TechnologiesCorporation)和折射率检测器rEX Optilab(Wyatt Technologies Corporation)来监测洗脱剂(0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.5)。使用ASTRA V软件，5.3.2.15版来执行数据获取和分子量计算。将流动相的流动速率维持在0.8ml/min。将0.155mg/ml的特定折射率增量(dn/dc)用于透明质酸钠。
通过将称量的样品溶解在磷酸盐缓冲液(浓度20.0mg/ml)中来制备透明质酸样品。将所有样品搅拌数小时。经由注射器过滤器(0.2μm，25毫米直径，Whatman)过滤溶液，且通过HPLC系统分析。
在与诸如折射率检测器的浓度敏感型检测器串联使用时并且在已知dn/dc(示差折光率增量)的值的情况下，光散射测量可提供摩尔量的绝对测量。
实质上，光散射测量自动地提供每个样品的柱状校准曲线，免除了耗时的、构象依赖性校准程序。
使用已知的dn/dc和已知的折射率检测器的校准常数来作为计算方法。通过使用Wyatt Optilab折射计来测定示差折光率增量(以mL/g计)。
通过测量葡聚糖标准来检验透明质酸的重量平均分子量。
低分子量透明质酸的测定的分子量和多分散性值分别是7.86×103g/mol和1.32Mw/Mn。图19和图20中说明色谱图和分布图，而红线是关于光散射信号且蓝线是关于折射率信号。图21示出UV光谱。
实施例11
从9.54kD透明质酸制备HyPE
通过将14.5g的MES溶于75mL的DI-H2O中来制备MES缓冲液，且用4N NaOH来调节pH至6.4。使用与图1中描绘相似装置，将10.0g HOBT溶于225mL的DI-H2O、60mL MES缓冲液、12mL的叔丁醇中。用4N NaOH将pH调节至6.4。将15.1g的HA溶于350mL的DI-H2O中。将1.25g的DPPE溶于440mL的叔丁醇和90mL的DI-H2O中，同时加热至55℃。将HA和HOBT的溶液升温至35℃且混合。然后在50℃下，加入DPPE溶液以得到澄清溶液。将加入烧瓶时，使这个溶液冷却至43℃，且经由声学反应器系统(图36)来循环。反应混合物的一些组分从溶液溢出，且必要时，在超声处理下将反应混合物加热至49℃以形成澄清溶液。在45℃温度下，将呈粉末的12.5g的EDAC加入反应混合物中。用180瓦特的电力启动超声处理。如图37-38所示，通过GPC监测反应，且因为根据对第一峰的面积与第二峰的面积的比率的观察，烧结程度增大，所以使反应继续进行超过正常的3h并继续进行到次日。关闭超声处理，且将反应混合物经由0.45mm过滤器过滤以从定子上除去明显的少量橡胶碎片。用600mLDCM和600mL MeOH来萃取溶液(1200mL)。将所得乳液快速分解，并再次用500mL DCM和500mL EtOH来萃取水层。最后，用250mL DCM和250mL EtOH萃取水层，且保留经过周末。通过在35℃和200托下旋转蒸发来除去残余的DCM。然后，将溶液转移到之前清洗的具有10kDa膜的centrasette超滤系统，并通过恒定容积渗滤，用5L的1.5％NaHCO3来洗涤以除去残余的有机溶剂。然后，通过缓慢添加2％Na2CO3将pH增加至pH 9.2。在室温下，将溶液搅拌1小时。在用30L的1.5％NaHCO3进一步洗涤后，在约12.5分钟处的峰消失，且用30L的DI-H2O洗涤溶液直到pH 7。为除去诸如游离棕榈酸的任何消化/超滤副产物，然后用1L DCM、1L MeOH和0.75L EtOH再次萃取溶液。用400mL DCM和50mL EtOH再次萃取水层，且最后用400mL DCM和50mL EtOH进行第三次萃取。通过在30℃和200托下旋转蒸发来除去残余的DCM。通过恒定容积渗滤，通过用15L DI-H2O洗涤来除去残余的MeOH和EtOH。将溶液浓缩至1L且经由0.2mm过滤器过滤到lyoguard容器中，并放入冷冻干燥器中。通过将搁板温度降低至-70℃来将其冷冻。在冷冻时，施加真空(14mT)且使搁板温度升高至30℃。5天后，用的水校正重量来回收6.134g的HyPE，以12.5g(水校正)的HA计算，所述5.2g水校正重量对应于42％的产率。实验测得总的磷是0.28％(干重)。通过LC/MS试验，发现1.456ppm的游离EDU，且在暴露于NaOH后，发现总计12.557ppm的EDU。未检测到HOBT，且MES是小于80ppm。图39显示了最终产物的GPC，且图40显示了NMR数据。
虽然本发明的某些特征已在本文说明并描述，但是本领域的普通技术人员将思及许多修改、替换、改变和等效方案。因此，应理解，所附权利要求旨在涵盖落在本发明的真实精神范围内的所有此类修改和改变。

Claims (23)

1.一种包含与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)的脂质-聚合物共轭物，其中所述共轭物是通过使所述GAG与所述PL分别以约0.25∶15至约5∶15的质量PL与质量GAG的比率反应来制备。
2.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述质量PL与质量GAG的比率是约0.25∶15。
3.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述质量PL与质量GAG的比率是约0.5∶15。
4.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述质量PL与质量GAG的比率是约1∶15。
5.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述质量PL与质量GAG的比率是约2∶15。
6.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述质量PL与质量GAG的比率是约5∶15。
7.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG是透明质酸、肝素、硫酸肝素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素或硫酸角质素。
8.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述PL是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酸或磷脂酰甘油。
9.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述PL包含棕榈酸或肉豆蔻酸的残基。
10.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述PL是二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。
11.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的多分散性是约1至1.75。
12.根据权利要求11所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的多分散性是约1.25至1.5。
13.根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的平均分子量介于5kD至90kD之间。
14.根据权利要求13所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的平均分子量介于5kD至20kD之间。
15.一种包含经由酰胺键或酯键与磷脂(PL)共轭的糖胺聚糖(GAG)的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的分子量介于5至20kD之间。
16.根据权利要求15所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG是透明质酸、肝素、硫酸肝素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素或硫酸角质素。
17.根据权利要求15所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述PL是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酸或磷脂酰甘油。
18.根据权利要求15所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述PL包含棕榈酸或肉豆蔻酸的残基。
19.根据权利要求15所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述PL是二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺或二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。
20.根据权利要求15所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的多分散性是约1至1.75。
21.根据权利要求20所述的脂质-聚合物共轭物，其中所述GAG的多分散性是约1.25至1.5。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的脂质-聚合物共轭物。
23.一种药物组合物，其包含根据权利要求15所述的脂质-聚合物共轭物。
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