CN102458451B - 血红蛋白组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供组合物，其含有血红蛋白，特别聚乙二醇化的血红蛋白。聚乙二醇化的血红蛋白分子能将结合于其上的氧或一氧化碳转移到其所接近的组织。本发明的例示聚乙二醇化的血红蛋白制剂经病毒灭活。本发明的各种组合物包括脱氧的血红蛋白，其可缀合于1个或更多水溶性聚合物。聚乙二醇化的血红蛋白包括：血红蛋白分子的铁原子不结合于氧或任何其他物质的那些血红蛋白，及不是氧的物质，例如，一氧化碳，结合于铁原子的血红蛋白分子。本发明的组合物制成聚乙二醇化的血红蛋白的低渗、等渗或高渗溶液。组合物用于通过提供组织及/器官的氧合来治疗和/或改善疾病，损伤及损伤。

Description

血红蛋白组合物
【相关申请的交叉引用】
本申请要求2009年6月9日提交的美国暂时专利申请系列号61/185,547的优先权，将其通过引用整体并入本文。
【技术领域】
本发明在于血液代用品及复苏液领域，包括聚合物-修饰的蛋白，例如，血红蛋白，能将氧或一氧化碳递送到组织的制剂。
【背景技术】
创伤是在美国死亡的主导原因之一。高死亡率的主要原因是不能维持损伤时间和在医疗设备的手术时间之间的患者的组织氧合。氧合的缺乏导致组织损伤，器官衰竭和死亡。因此，治疗创伤性休克中的主要焦点是向患者的内部组织和器官施用提供尽可能多的氧的治疗剂。
维持氧合的明显的方法是输血。但是，在护理治疗方面使用血有显著实际问题，其使得用于在医疗设备之外使用的存储的人血的大面积常规使用变得不切实际。治疗创伤的标准方法主要涉及通过施用等渗剂，高渗剂或高度溶胀溶液来维持血管内循环血量。这些治疗不可均匀增加足以有效阻止缺血和器官衰竭的内部组织和器官的氧合。
结果，主要有开发基于血红蛋白的氧载体(HBOC)的努力，其能恢复创伤患者的氧携带容量。HBOC具有使用存储的人血的许多优势，包括降低的疾病传播机会，无免疫反应性，分型需求的缺乏，且最重要的是伴随降低的存储要求的改善的利用度。许多小组已开发HBOC，而几个公司已进行了开发它们的作为血液代用品的基于血红蛋白的产品的临床试验。血红蛋白(HGB)分离自人或动物血，或合成产生的氧载体，诸如全氟碳，是临床试验中2种类型的血液代用品。也已就在患者中使用开发及表征了其他红细胞代用品。(见，例如，Red Blood Cell Substitutes，1998，(Eds.)A.S.Rudolph，R.Rabinovici，and G.Z.Feuerstein，Dekker，New York，N.Y.)。该红细胞代用品可结合标准医疗治疗，诸如输注的血或血产品使用。作为特定例，Enzon，Inc.(Piscataway，N.J.)，已开发了聚乙二醇(PEG)-修饰的牛血红蛋白，缩写为PEG-HGB。PEG-HGB通过PEG链与HGB分子表面交联的方法产生，例如，如公开于U.S.专利No.5,386,014和5,234,903(Nho等人)。其他特定例包括HemopureTM和Oxyglobin(Biopure，Cambridge，Mass.)。但是这些产物中无一已建立产生显著增加组织氧合，及无一已获得FDA批准，因为它们无效或产生显著毒性。
适合的HBOC的缺乏已大大阻碍了对组织氧合的生理学的基础研究，且我们的关键机理的理解涉及休克和其跟着组织损伤发生。有关已经历临床测试及产生显著毒性的HBOC，对于这些毒性的成因罕有信息可利用。
由此，治疗创伤诱导的出血的方法目前不足。而输血可向组织恢复氧及补加失的循环血量，作为在医疗设备之外治疗出血的手段的血的使用具有显著实际问题。首先，有通常限制的量的血可利用，且对于各治疗的人，必需分型，以阻止通过免疫反应杀患者。但是，在医疗设备之外使用血来治疗创伤患者中最重要问题是使用此组织中固有的存储及包装约束。由此，输血不在创伤患者的护理治疗方面正常采用。
实际上，治疗创伤的标准方法主要涉及通过施用等渗剂，高渗剂或高度溶胀溶液来维持血管内循环血量。这些方法旨在提供循环血量的短期补充和也可增加血流和因此向组织的氧递送。但是，当出血严重时，这些治疗不可均匀增加足以有效阻止缺血和器官衰竭的内部组织和器官的氧合。结果，我们具有自经历严重的创伤的那些个体的高死亡率。
已进行多年尝试来开发基于血红蛋白的氧载体(HBOC)，其能 向创伤患者提供氧。HBOC具有使用存储的人血而无与使用血来治疗创伤关联的许多问题的许多优势。这些优势包括降低的疾病传播机会，无免疫反应性，无分型要求，且最重要的是有降低的存储要求的改善的利用度。理想地，HBOC应能结合氧及向需要的组织释放氧。应容易使用溶液，其为在多数环境条件下，尤其是创伤患者需要治疗的护理条件方面通常遇到的条件下稳定数月的形式。
数年来，已进行许多尝试来使用天然或重组人血红蛋白，修饰的形式的人血红蛋白或自其他物种的修饰的形式的血红蛋白来开发HBOC作为氧治疗剂。可将未修饰的血红蛋白用作氧治疗剂，但是其结合NOx，且导致严重的血管收缩及高血压。作为其分子量的结果，血红蛋白可导致显著毒性，尤其对肾，其中其阻塞血管球器官。结果，已将在人中测试的多数血红蛋白修饰为延长它们的半衰期及减少它们的毒性。
本发明的目的是提供可作为血液代用品和/或具有治疗性活性的新氧和一氧化碳携带及递送分子，及制备这些分子的方法。
本发明的另一目的是提供作为输注药物中的治疗剂有用的稳定的及病毒灭活的血红蛋白和与水溶性聚合物的血红蛋白缀合物，病毒灭活致使天然血红蛋白及导致血红蛋白制剂基本上是无传染性感染制剂。缀合物能将结合于血红蛋白的氧或一氧化碳递送到组织。
【发明概述】
在许多实施方式中，本发明提供PEG-血红蛋白(“PEG-Hb”)分子，其可在哺乳动物血管系统中携带及扩散氧或一氧化碳(CO)及将氧或一氧化碳(CO)携带及扩散到与血管系统接触和/或与血红蛋白接触的组织。本发明的组合物包括水溶性的、有功能的、脱氧的、天然血红蛋白。组合物包括水溶性血红蛋白级分，其包含有功能的、天然血红蛋白分子组。此血红蛋白分子组的各成员处于脱氧的状态，基本上无化学交联剂，且在例示实施方式中，具有约22mm Hg～约26mmHg的P50。组合物也包括水溶性稳定剂级分。稳定剂级分辅助将血红 蛋白分子组维持在脱氧的状态。在各种实施方式中，稳定剂级分包括稳定化剂。例示稳定化剂具有相比脱氧的血红蛋白分子与氧(或活性氧(ROS))更具有反应性的结构元件。组合物中任选地包括水性稀释剂级分。稀释剂级分包括可溶血红蛋白级分和稳定剂级分的药学可接受的稀释剂。在例示实施方式中，组合物包含少于10％高铁血红蛋白。在各种实施方式中，化合物经病毒灭活，致使组合物基本上无病毒活性。
在例示实施方式中，本发明提供血红蛋白缀合物能将氧或一氧化碳从血红蛋白分子体内转移到组织(例如，到组织)。组合物包括有功能的、脱氧的、天然血红蛋白分子和至少一个水溶性聚合物(例如，聚(乙二醇))部分之间的共价缀合物。血红蛋白缀合于水溶性聚合物，例如，聚乙二醇化的，因为此修饰延长天然的血红蛋白的半衰期。此克服天然血红蛋白本身的及之前开发的HBOC的一些的短体内半衰期的主要问题。此外，通过延长血红蛋白的半衰期，通过附接该聚合物，分子的物理尺寸增加。在例示实施方式中，缀合导致更少破断产物的形成，减少用天然血红蛋白以及用其他发现的肾毒性的机会，欠稳定的HBOC。聚乙二醇化减少血红蛋白的免疫识别。由此，自非-人物种的血红蛋白可在本发明的组合物和方法中利用。在例示实施方式中，血红蛋白是牛血红蛋白。在例示实施方式中，组合物是经病毒灭活的血红蛋白缀合物组合物。
在各种实施方式中，组合物包括水溶性血红蛋白级分，其包含血红蛋白分子组。血红蛋白分子组是脱氧的，且共价缀合于至少一个水溶性聚合物(例如，聚(乙二醇))部分。例示水溶性聚合物缀合物通过将水溶性聚合物与多肽通过氨基酸残基的胺部分共价结合来形成，尽管本发明的范围之内包括通过任何血红蛋白氨基酸残基形成缀合物。血红蛋白级分中的血红蛋白缀合物基本上无化学交联剂；且具有约9mm Hg～约12mm Hg的P50。例示组合物也包括水溶性稳定剂级分，其致使血红蛋白分子组抗氧化。稳定剂级分包括稳定化剂。例示稳定化剂包括阻止脱氧的血红蛋白再氧合的结构元件。在各种实施方 式中，稳定化剂相比血红蛋白分子组的成员与氧更具有反应性。在各种实施方式中，该组合物也包括稀释剂级分。例示稀释剂级分是可溶血红蛋白级分的药学可接受的稀释剂。在例示实施方式中，组合物基本上无病毒活性，且包括少于约10％高铁血红蛋白。
在各种实施方式中，本发明提供病毒灭活的血红蛋白组合物，其包含水溶性的、有功能的、脱氧的、天然血红蛋白。组合物通过包括如下步骤的方法制备：使脱氧的血红蛋白和稳定化剂的溶液经历热病毒灭活处理。热病毒灭活处理包括使溶液暴露于升高到足以灭活溶液中基本上全部病毒活性的温度。升高的温度处理持续足以达到溶液中基本上全部病毒活性灭活的时间。稳定化剂包括阻止脱氧的血红蛋白再氧合的结构元件。在例示实施方式中，此结构元件选择为相比脱氧的血红蛋白与氧或ROS更具有反应性。稳定化剂发挥最小化由脱氧的血红蛋白的氧结合的功能。在各种实施方式中，溶液包括一定量的稳定化剂，其足以在热病毒灭活处理期间阻止多于约10％高铁血红蛋白形成。
在例示实施方式中，本发明提供血红蛋白组合物，其包含水溶性的、有功能的、脱氧的、天然血红蛋白。此组合物包括少于10％高铁血红蛋白。当组合物经病毒灭活时，其任选地通过包括下列步骤的方法制备：将前体血红蛋白溶液加热到约60℃持续达约12小时(例如，约1～约4小时)。前体溶液包括稳定化剂。稳定化剂包括阻止脱氧的血红蛋白再氧合的结构元件。在例示实施方式中，此结构元件选择为相比脱氧的血红蛋白与氧更具有反应性。稳定化剂发挥最小化由脱氧的血红蛋白的氧结合的功能。
在例示实施方式中，本发明提供制备本发明的血红蛋白组合物的方法。组合物包括水溶性的、有功能的、脱氧的、天然血红蛋白。在例示实施方式中，组合物包括水溶性血红蛋白级分，其包含有功能的、天然血红蛋白分子组，其中血红蛋白分子组的各成员处于脱氧的状态；基本上无化学交联剂；且具有约22mm Hg～约26mm Hg的P50。在各种实施方式中，组合物包括水溶性稳定剂级分，其包括稳定化剂。 稳定化剂包括阻止脱氧的血红蛋白再氧合的结构元件。在例示实施方式中，此结构元件选择为相比脱氧的血红蛋白与氧更具有反应性。稳定化剂发挥最小化由脱氧的血红蛋白的氧结合的功能，由此将血红蛋白分子维持在脱氧的状态。在例示实施方式中，组合物包括稀释剂级分。在各种实施方式中，稀释剂级分包括可溶血红蛋白级分的药学可接受的稀释剂。各种组合物基本上无病毒活性，且包含少于10％高铁血红蛋白。在例示实施方式中，组合物经病毒灭活。例示制备病毒灭活的组合物的方法包括使包括血红蛋白级分和稳定剂级分的混合物经历热病毒灭活处理。例示热病毒灭活处理包括使混合物暴露于升高到足以灭活混合物中基本上全部病毒活性的温度。混合物处于升高的温度的时间足以达到所述混合物中的基本上全部病毒活性的灭活。
在以上所示的各组合物中，血红蛋白是任选地再氧合的。在一实施方式中，血红蛋白在病毒灭活后再氧合。或者，血红蛋白结合一氧化碳。结合于一氧化碳可在组合物制备期间或组合物制备之后的基本上任何点发生。在例示实施方式中，在脱氧的组合物中，血红蛋白的Fe(II)结合一氧化碳。
本发明也提供治疗创伤，休克，缺血和可通过增强组织或器官的氧或一氧化碳含量修正至改善的其他病的方法。本发明的组合物在至少50％的受试者正常死于出血性休克的严重的创伤性休克的动物模型中快速恢复组织氧合和完全偿还氧债。利用例示制剂，单个单位的本发明的组合物向全部主要器官偿还氧债，开放微血管系统及恢复平均动脉压力。本发明的各种组合物相比浓集红细胞在逆转氧债中更有效和更快。在例示实施方式中，在给受试者施用制剂后约60分钟～约160分钟内，本发明的制剂偿还受试者中至少85％，至少90％，至少95％或至少100％的氧债。或者，本发明的组合物增加组织中的一氧化碳浓度。在例示实施方式中，制剂偿还氧债，或增强组织一氧化碳含量，包括本发明的聚乙二醇化的血红蛋白缀合物。
由此，在例示实施方式中，本发明提供将氧或一氧化碳递送至选自需求该递送的受试者的组织和器官的成员的方法。在例示实施方式 中，方法包括给受试者施用足以实现将氧或一氧化碳递送至一种或更多组织和/或器官的量的本发明的任何组合物。
在各种实施方式中，本发明提供逆转选自患有出血性休克的受试者的组织和器官的成员中的氧债的方法。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以逆转氧债的量的本发明的任何组合物。提供类似方法用于增加组织的一氧化碳含量，无论是响应由于疾病，损伤，等的一氧化碳含量损失或作为从增加组织中的一氧化碳含量超过见于健康或疾病状态的组织的正常水平获得治疗剂受益的手段。
在各种实施方式中，本发明提供通过给受试者施用对于诱导血管发生有效的量的本发明的组合物来诱导受试者的组织中的血管发生的方法。在例示实施方式中，血管发生在患有氧缺乏的组织中诱导。在还例示实施方式中，诱导血管发生的组织或器官是患有氧缺乏的受试者的组织或器官。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以逆转氧缺乏的量的本发明的任何组合物。
在各种实施方式中，本发明提供增加向患有氧缺乏的组织的血流的方法。方法由以下步骤组成：给受试者施用对于增加向患有氧缺乏的组织的血流有效的量的本发明的组合物。在例示实施方式中，组织或器官是患有血流不良的受试者的组织或器官。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以逆转血流不良的量的本发明的任何组合物。
在各种实施方式中，本发明提供降低患有氧缺乏的组织中的神经学损伤和/或梗塞的组织的方法。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以降低患有氧缺乏的组织中的神经学损伤和/或梗塞的量的本发明的组合物。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以逆转梗塞的和/或神经学损伤的组织的量的本发明的任何组合物。
在以上所示的各实施方式中，制剂中的血红蛋白可结合氧，一氧化碳或两者皆不。而且，合并血红蛋白缀合物的制剂可为与受试者血张度关联的低渗剂，等渗剂或高渗剂。
本发明的其他实施方式，目的和优势自如下详述显而易见。
【附图说明】
图1是产生例示PEG-Hb的流程图。
图2是逆转创伤性休克的动物模型中的氧债的PEG-Hb/HS和其他治疗的图形比较。
图3显示动脉血压(A)和在侧顶叶皮质测量的及表示为基线的百分率的激光-多普勒通量(B)，它们是在2h的中脑动脉阻塞(MCAO)和最初30min的再灌注期间，在经历无输注或于20min的MCAO用10ml/kg的PEG-白蛋白或PEG-COHb输注的大鼠组中的值(平均值±SE；n＝10/组)。
图4显示在无输注或于20min的MCAO输注PEG-白蛋白或PEG-COHb的组中2h的MCAO之后1或24h的再灌注时以0～4级(0＝无缺陷)评分的神经学缺陷(平均值±SE；n＝10).＊PEG-COHb组对比无输注和PEG-白蛋白组之间P＜0.05。
图5是脑皮质(A)和纹状体(B)的各7个冠状切片中的梗塞体积，及脑皮质和纹状体的7个切片总计的总梗塞体积(C)的图形显示。值表示为对侧总结构的百分率(平均值±SE；n＝10).＊PEG-COHb组对比无输注和PEG-白蛋白组之间P＜0.05。
图6显示在用本发明的PEG-COHb输注的大鼠中(右图像)，相比未用本发明的PEG-COHb输注的对照大鼠(左图像)，有活力的脑组织量(着暗色)更大。
【发明详述】
【引言】
存在对氧转移制剂的需求来治疗或预防由疾病，损伤和损伤，例如，失血(例如，自急性出血或手术操作期间)所致的，由贫血(例如，恶性贫血或镰刀状细胞贫血)所致的，或由休克(例如，血量缺乏休克，过敏性休克，脓毒性休克或过敏性休克)所致的低氧。这些能力中全血或血级分的使用充满缺点。例如，全血的使用常常伴随任意数的病毒， 包括肝炎-产生病毒和AIDS-产生病毒传播的风险，其可使患者恢复变复杂或导致患者死亡。此外，全血的使用需要血-分型和交叉-匹配，以避免免疫血液学问题及供体间不相容性。
也存在能将氧或一氧化碳递送到受试者组织的治疗剂的需求。治疗剂用于治疗，特别，与失血及缺血关联的病情。
本发明通过供应血红蛋白结合氧，结合于一氧化碳或两者皆不结合的PEG-血红蛋白制剂来满足这些需要。血红蛋白缀合物配制进相对施用制剂的受试者血的张度而言是低渗剂，等渗剂或高渗剂的介质中。
人血红蛋白，作为氧递送剂，CO递送剂和/或血-代用品，具有渗透活性和运输及转移氧的能力，但其具有通过肾途径和通过血管壁从循环快速消除的缺点，导致器官损伤及非常短，由此，不令人满意的半衰期。而且，人血红蛋白也常被内毒素，细菌和/或病毒的毒性水平污染。
非-人血红蛋白与人血红蛋白具有相同的缺陷。此外，自非-人源的血红蛋白具有导致受者中免疫系统应答的潜力。
本发明提供血红蛋白制剂和使用此制剂来治疗及改善由于疾病，损伤和损伤的低氧，或将CO递送到这些状态的组织的方法。例示制剂经病毒灭活，且在某些实施方式中，血红蛋白缀合于水溶性聚合物，例如，聚乙二醇化的。例示本发明的血红蛋白制剂包括具有不同于天然存在的人血红蛋白的P50的血红蛋白分子。本发明的血红蛋白制剂逆转创伤中的氧债，如严重创伤的动物模型展示，指示其具有相比其他产品更优的体内氧携带能力。例示本发明的制剂能快速恢复组织氧合和完全偿还创伤中的氧债，如在至少50％的受试者正常死于出血性休克的严重的创伤性休克的动物模型中展示。单个单位的例示本发明的制剂向全部主要器官偿还氧债，开放微血管系统及恢复平均动脉压力。例示制剂也提供相比任何其他HBOC更优的稳定性和存储能力。例示制剂足够稳定，以至于于45℃(113°F)(确证例示本发明的制剂在护理紧急情况方面有用的极端环境条件)存储至少4周之后在动 物模型中保持完全有效。
用于临床应用的各种本发明的制剂包括聚乙二醇化的血红蛋白，例如，牛血红蛋白，及等渗或高渗盐水(PEG-Hb/HS)和有或无高盐浓度(即，等渗剂或高渗剂)的CO形式(PEG-Hb-CO)的聚乙二醇化的血红蛋白。例示这些实施方式的制剂经其血红蛋白含量增加血的氧携带能力，及通过扩张血管系统(通过其高渗-溶胀作用或CO的效应)和通过作为红细胞和组织之间的氧转移制剂来增强将氧递送到组织。例示本发明的制剂也用来治疗由于糖尿病的镰刀状细胞贫血，中风或外周缺血。例示制剂包括PEG-Hb-CO，且高度稳定且具有期望的药理学性质。在各种实施方式中，PEG-Hb-CO具有舒血管性质。在各种实施方式中，PEG-Hb-CO具有抗氧化性质。在各种实施方式中，本发明的PEG-Hb制剂不以足以导致组织损伤的量产生活性氧。此制剂可用于治疗本文讨论的任何疾病，损伤或损伤。在例示实施方式中，制剂用于治疗缺血。可通过此组合物治疗的例示类型的缺血包括脑缺血和糖尿病性缺血。因此，本发明提供治疗，改善及预防自缺血性事件的下游损伤的方法。可通过本发明的组合物治疗的例示类型的缺血是外周缺血，例如，外周糖尿病性缺血。
【定义】
“CO”指一氧化碳。
“HS”指高盐，高渗制剂。
本文所用的“SanguinateTM”指本发明的PEG-HbCO组合物。
术语“血代用品，”“复苏液，”“PEG-Hb，”PEG-CO-Hb，”“基于血红蛋白的氧载体”(HBOC)和“PEG-Hb/HS”指本发明的聚乙二醇化的Hb组合物和合并这些组合物的制剂。术语也随着它们公开组合物和其制剂的例示用途。例如，“血代用品”在例如，创伤，中风，缺血/再灌注损伤，手术，贫血或可指出输血的其他损伤，损伤和疾病的背景中用于取代血。本文所用的这些术语也指能将氧或一氧化碳递送到组织的Hb制剂。这些制剂用于表征为受试者具有充足的血量，血仍不具有充足的携带和/或将氧或一氧化碳递送到组织的能力的损伤，损 伤和疾病。PEG-血红蛋白衍生物配制进低渗，等渗或高渗盐溶液。由此，例示Fe(II)未结合或结合于CO的脱氧的PEG-Hb组合物可配制进等渗或高渗溶液。类似地，例示氧合的PEG-Hb可配制进等渗或高渗载体。
术语“氨基酸”指天然存在的，例如，半胱氨酸和合成氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及经后期修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，结合于氢的α碳，羧基，氨基和R基，例如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍。该类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但与天然存在的氨基酸保留相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于通用的氨基酸的化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的化合物。
″肽″和“多肽”指单体是氨基酸且通过酰胺键连接在一起的聚合物，替代性地指称为多肽。此外，也包括非天然的氨基酸，例如，β-丙氨酸，苯基甘氨酸及高精氨酸。不是基因-编码的氨基酸也可用于本发明。此外，被修饰为包括反应性基团，糖基化位点，聚合物，治疗性部分，生物分子等的氨基酸也可用于本发明。本发明中使用的全部氨基酸可为d-或l-异构体。l-异构体是通常优选的。此外，其他拟肽也在本发明中有用。本文所用的，“肽”指糖基化的及未糖基化的肽。也包括通过表达肽的系统不完全糖基化的肽。作为一般综述，见，Spatola，A.F.，in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINOACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。例示肽是血红蛋白。
术语“肽缀合物，”和“血红蛋白缀合物”指血红蛋白多肽缀合于水溶性聚合物，例如，本文所述的聚(乙二醇)(PEG)的本发明的缀合物。
本文所用的“血红蛋白”指不是通过用化学交联剂，例如，二醛， 等处理而化学交联的氧-结合(或CO-结合)，活跃的多肽。例示血红蛋白是除了缀合1个或更多PEG(例如，m-PEG)部分之外无修饰的天然蛋白。本文所用的“基本上无化学交联剂”指不是特意地与化学交联剂交联的血红蛋白分子。这些血红蛋白制备物包括少于5％，少于3％或少于1％交联的血红蛋白。
术语“水溶性”指在水中具有一些可检测的程度的溶解度的部分。本领域熟知检测和/或定量水溶解度的方法。例示水溶性聚合物包括肽，糖，聚(醚)，聚(胺)，聚(羧酸)等。肽可具有由单氨基酸组成的混合的序列，例如，聚(赖氨酸)。例示多糖是聚(唾液酸)。例示聚(醚)是聚(乙二醇)。聚(乙烯亚胺)是例示聚胺，及聚(丙烯酸)酸是代表性聚(羧酸)。术语″水溶性″如在″水溶性聚合物″中是聚合物于室温在水中是可溶性的。一般而言，水溶性聚合物的溶液会发射至少约75％，更优选至少约95％的过滤之后由相同的溶液发射的光。以重量计，水溶性聚合物或其段会优选是在水中至少约35％(以重量计)可溶性的，更优选在水中至少约50％(以重量计)可溶性的，再更优选在水中约70％(以重量计)可溶性的，及再更优选在水中约85％(以重量计)可溶性的。但是，最优选是，水溶性聚合物或段是在水中约95％(以重量计)可溶性或在水中完全可溶性的。
本文所用的术语″水溶性聚合物″包括是生物相容性及非免疫原性的那些水溶性聚合物，且特别排除任何不是生物相容性及非免疫原性的水溶性聚合物段。有关生物相容性，如果与物质单独使用或与另一物质(例如，活性剂)结合活组织(例如，施用于患者)使用关联的有益效应重于由临床医师，例如，医师评价的任何有害的效应，则物质被认为是生物相容性的。有关非-免疫原性，如果物质的体内预期用途不产生不期望的免疫应答(例如，形成抗体)，或如果产生免疫应答，该应答由临床医师评价而不被认为是临床显著或重要，物质被认为是非免疫原性的。特别优选的是，本文所述的水溶性聚合物段以及缀合物是生物相容性且非免疫原性的。
水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)(即，PEG)。但是， 应理解其他相关的聚合物也适于在本发明的实践中使用，且术语PEG或聚(乙二醇)的使用旨在是包括性的，而非排他性的。术语PEG包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG，双官能PEG，多臂的PEG，叉状的PEG，分支的PEG，悬垂的PEG(即，具有悬垂于聚合物主链的1个或更多官能团的PEG或相关的聚合物)，或其中有可降解的连接的PEG。
聚合物主链可为线性或分支的。分支的聚合物主链是本领域通常知道的。一般而言，分支的聚合物具有中心分支核心部分和连接到中心分支核心的一组线性聚合物链。PEG通常以分支的形式使用，其可通过将环氧乙烷添加到各种多元醇，诸如甘油，季戊四醇和山梨糖醇来制备。中心分支部分也可源于几种氨基酸，诸如赖氨酸。分支的聚(乙二醇)可以R(-PEG-OH)m的通式呈现，其中R代表核心部分，诸如甘油或季戊四醇，且m代表臂的数。多臂的PEG分子，诸如U.S.专利No.5,932,462中描述的那些，其通过引用整体并入本文，也可用作聚合物主链。
许多其他聚合物也适于本发明。具有2～约300个末端的非-肽和水溶性聚合物主链在本发明中特别有用。适合的聚合物的例包括，但不限于，其他聚(亚烷基二醇)，诸如聚(丙二醇)(″PPG″)，乙二醇和丙二醇等的共聚物，聚(氧乙基化的多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)，聚(α-羟基酸)，聚(乙烯基醇)，聚膦腈，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，诸如描述于U.S.专利No.5,629,384，其通过引用整体并入本文，及共聚物，三聚物和其混合物。尽管聚合物主链的各链的分子量可变化，一般在约100Da～约100,000Da，常常约6,000Da～约80,000Da的范围。
尽管水溶性聚合物(以及用于形成缀合物的聚合物剂)的分子量可变化，分子量会满足一个或更多下列值：大于100Da；大于200Da；大于400Da；大于500Da，大于750Da；大于900Da；大于1,000Da，大于1,400Da；大于1,500Da，大于1,900Da；大于2,000Da；大于2,200Da；大于2,500Da；大于3,000Da；大于4,000Da；大于4,900Da； 大于5,000Da；大于6,000Da；大于7,000Da；大于7,500Da，大于9,000Da；大于10,000Da；大于11,000Da；大于14,000Da，大于15,000Da；大于16,000Da；大于19,000Da；大于20,000Da；大于21,000Da；大于22,000Da，大于25,000Da；及大于30,000Da。应理解，本文有用的对于任何给定水溶性聚合物段的分子量的最大限是约300,000Da。
水溶性聚合物(以及用于形成缀合物的整个聚合物剂)的分子量也可表示为一系列分子量之内的值。例示范围包括：约100Da～约100,000Da；约500Da～约80,000Da；约1,000Da～约60,000Da；约2,000Da～约50,000Da；及约5,000Da～约40,000Da。
聚合物剂之内的任何给定水溶性聚合物(以及整个聚合物剂)的例示分子量包括：约100Da，约200Da，约300Da，约400Da，约500Da，约600Da，约700Da，约750Da，约800Da，约900Da，约1,000Da，约2,000Da，约2,200Da，约2,500Da，约3,000Da，约4,000Da，约4,400Da，约5,000Da，约6,000Da，约7,000Da，约7,500Da，约8,000Da，约9,000Da，约10,000Da，约11,000Da，约12,000Da，约13,000Da，约14,000Da，约15,000Da，约20,000Da，约22,500Da，约25,000Da，约30,000Da，约40,000Da，约50,000Da，约60,000Da，约75,000Da，及约80,000Da。
本领域普通技术人员会认可，有关基本上水溶性聚合物的上述讨论绝不是穷尽的且仅是例证性的，且考虑具有上述质量的全部聚合物物质。本文所用的，术语″聚合物剂″通常指整个分子，其可包括水溶性聚合物和官能团。术语″水溶性聚合物″通常致力于在讨论更大分子结构的一部分，诸如聚合物剂，前体分子，缀合物等等中使用。
本文所述的聚合物剂和其他结构的各部分(例如，官能团，活性剂，水溶性聚合物等等)可经直接共价键直接彼此附接。但是，更典型地，各部分通过包含用于将各部分栓系在一起成为统一的全体的一个或更多原子的间隔物部分附接。
连接本文所述的聚合物剂和其他结构的各部分的优选间隔物部分 包括由碳，氮，氧和/或硫原子组成的原子链。附接于此原子链，可为1个或更多其他原子，诸如碳，氮，氧，硫和氢。链可短且包含少至2～5个原子的链。更长链，例如，也涵盖10，15个原子或更长的链。此外，间隔物部分可包含可饱和的，不饱和的，以及是芳族的原子环。当存在时，间隔物部分优选包含约1～20个原子(排除任何分支原子)的序列。优选地，构成间隔物部分(包括任何分支原子)的原子包含氧，碳，氮，硫和氢原子的一些组合。间隔物部分可为任何有用的形式。
本文在给患者施用药物的背景中所用的术语″半衰期″或″t1/2″定义为患者中药物的血浆浓度降低1/2需要的时间。“半衰期”的更多解释见于药物生物技术(1997，DFA Crommelin and RD Sindelar，eds.，Harwood Publishers，Amsterdam，pp 101-120)。在例示实施方式中，本发明的PEG缀合物的半衰期是约12和约22小时之间，其相比非-聚乙二醇化的血红蛋白显著更长。
本文所用的″药学可接受的载体″包括当与缀合物组合时，保留缀合物的活性且与受试者的免疫系统是非-反应性的任何物质。例包括，但不限于，任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲液溶液，水，乳剂，诸如油/水乳剂，及各种类型的润湿剂。其他载体也可包括无菌溶液，片剂，包括包被的片剂和胶囊。一般该载体含有赋形剂，诸如淀粉，乳，糖，某些类型的粘土，明胶，硬脂酸或其盐，硬酯酸镁或钙，滑石粉，植物脂肪或油，胶，二醇或其他知道的赋形剂。该载体也可包括香料和色彩添加剂或其他成分。包含该载体的组合物通过熟知的常规方法配制。例示载体是高渗氯化钠和等渗氯化钠(例如，磷酸盐缓冲液)。高渗和等渗载体用于配制本发明的脱氧的聚乙二醇化的血红蛋白(例如，结合一氧化碳的铁，及未结合一氧化碳的铁)和铁原子结合氧的本发明的聚乙二醇化的血红蛋白。
本文所用的″施用″是指静脉内，腹膜内，肌内，伤口内或皮下施用。肠胃外施用包括，例如，静脉内，肌内，微动脉内，真皮内，皮下，腹膜内，心室内和颅内。
术语″改善(ameliorating)″或″改善(ameliorate)″指治疗病理学或病情，包括任何客观或主观参数的任何成功标志，诸如症状的减轻，缓解或渐小或患者的身体或心理健康的改善。症状的改善可基于客观或主观参数；包括身体检查和/或精神病学评估的结果。
术语疾病或病情的“治疗(therapy)”指″治疗(treating)″或″治疗(treatment)″包括提供自疾病的症状或副作用缓解(包括减轻性治疗)，及解除疾病(导致疾病退去)。这些术语也指治疗损伤，包括出血性休克，中风，缺血/再灌注损伤，创伤等。在各种实施方式中，这些术语也指预防可易感于疾病但尚未经历或呈现疾病的症状的受试者中疾病或病情发生(预防性治疗)，抑制疾病(减缓或拦阻其发展)。
术语“有效量”或“对于...有效的量”或″治疗有效量″或任何语法上相当的术语是指当施用给用于治疗疾病，病情或损伤的受试者时，足以实现该疾病的治疗的量。在例示实施方式中，此术语指足以偿还可归因于疾病，损伤或损伤的至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或达约100％的组织或器官氧债的本发明的缀合物(或包括本发明的缀合物的制剂)的任何量。当在将CO递送到组织的背景使用时，此术语指足以从将CO递送到组织产生可检测的治疗效果的施用的量。
例示本发明的血红蛋白组合物指“能将选自结合的氧和一氧化碳的成员转移到组织”。此短语指具有将结合于血红蛋白的铁原子的氧或一氧化碳转移到组织的能力的血红蛋白组合物。在例示组合物中，转移可通过组织参数(例如，血管舒张，组织氧合)改变测量或通过可临床关联端点(例如，坏死性过程的终止，降低的缺血/再灌注损伤)的改变检测。在例示实施方式中，一氧化碳或氧转移到组织根据通过给具有氧债的受试者(或组织)施用选择的体积的本发明的组合物来“偿还的”氧债的量来测量。在另一例示实施方式中，递送到组织的氧或一氧化碳的量根据通过施用预选择的剂量的本发明的组合物来转移到预选择的质量的组织(例如，1g)的氧或CO的质量来测量。将氧或CO转移 到组织的能力也可功能性地体内测量，及通过与知道的基于血红蛋白的血液代用品比较。在例示实施方式中，血红蛋白与向其递送氧或一氧化碳的组织“接触”或“手术接触”。所谓手术接触，是指血红蛋白足够接近通过中间载体或通过扩散到组织直接转移氧或一氧化碳的组织。
本文所用的“天然血红蛋白”指不是有意地化学交联或缀合到另一物质的血红蛋白。天然血红蛋白包括铁原子未结合，结合氧或结合一氧化碳的血红蛋白分子。根据本发明，天然血红蛋白可形成本发明的PEG-Hb缀合物的血红蛋白核心。
“脱氧的”指Fe(II)原子结合于不是氧的物质(例如，一氧化碳)或不结合于氧或任何其他物质的血红蛋白。
术语“分离的”指基本上或基本上无天然地伴随该物质的组分的物质，用于产生物质或自产生该物质的副产物或降解产物。对于本发明的肽缀合物，术语“分离的”指基本上或基本上无在用于制备肽缀合物的混合物中正常伴随该物质的组分的物质。“分离的”和“纯”互换使用。一般而言，本发明的分离的肽缀合物具有优选表示为范围的纯度水平。肽缀合物的纯度范围的下端是约60％，约70％或约80％，而纯度范围的上端是约70％，约80％，约90％或多于约90％。本发明的病毒加热灭活的血红蛋白组合物通常在与水溶性聚合物缀合之前分离。在例示实施方式中，分离用于制造缀合物的血红蛋白。在各种实施方式中，分离血红蛋白PEG缀合物。在例示实施方式中，除了存在稳定化剂或其他赋形剂之外分离血红蛋白或PEG血红蛋白缀合物。在各种实施方式中，从其他蛋白和特别选自血红蛋白二聚体或寡聚体和其他氧携带蛋白的蛋白分离血红蛋白或PEG血红蛋白缀合物。
当肽缀合物高于约90％纯，它们的纯度也优选表示为范围。纯度范围的下端是约90％，约92％，约94％，约96％或约98％。纯度范围的上端是约92％，约94％，约96％，约98％或约100％纯度。为本发明的目的，“纯”缀合物或纯缀合物的溶液可包括稳定化剂。
纯度通过任何领域认识的分析方法测定(例如，银染色的凝胶上 的条带强度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，HPLC或类似手段)。
当结合特定官能团使用时，术语″反应性″或″活化的″指容易与另一分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。此与需要强催化剂或高度不切实际的反应条件以便反应的那些基团(即，″非反应性″或″惰性″基团)形成对比。
表述“基团各成员”用于指具有特定特征的本发明的制剂中的一个亚群的成员。由此，说道本发明的制剂的级分中的血红蛋白分子组的各成员，不必然暗示制剂中的每个血红蛋白分子具有叙述的特征，但指具有叙述的特征的制剂中的一组(亚群)血红蛋白分子。
术语“稳定剂，”指阻止或延缓脱氧的血红蛋白再氧合的物质。例示稳定化剂是含有胺的化合物，便利地，尽管不完全，氨基酸。任何含有胺的化合物可作为本发明的制剂中的稳定化剂。额外的例示稳定化剂具有一种或更多相比血红蛋白反应与氧的反应优先与氧反应的结构元件。见于本发明的稳定化剂的例示结构元件是巯基部分。用作稳定化剂的例示巯基化合物包括，但不限于，N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)D，L-半胱氨酸，γ-谷氨酰-半胱氨酸，谷胱甘肽，2，3-二巯基-1-丙醇，1，4-丁二硫醇和其他生物学相容的巯基化合物。通常优选的是，稳定化剂以其包括在本发明的组合物和制剂中的量是生物-相容的且非-毒性的。在例示实施方式中，PEG本身是稳定化剂。由此，在各种实施方式中，缀合于Hb的PEG避免了对独立的稳定化剂或独立的水溶性稳定化级分的需求。因此，本发明提供相当于本文所示的那些包括水溶性稳定化级分的制剂，其实际上，不包括此级分。
本文所用的术语诸如″受试者″，″患者″和″哺乳动物″互换使用，且以人为例。
本文所用的″氧化氮供体″或″NO供体″指下列化合物，其提供，释放和/或直接或间接转移氧化氮物质，和/或体内刺激氧化氮或源于内皮的松弛因子(EDRF)内源性产生和/或体内提高氧化氮或EDRF的内源性水平和/或氧化成产生氧化氮和/或是氧化氮合酶和/或细胞色素P450的底物。″NO供体″也包括是L-精氨酸的前体的化合物，酶 精氨酸酶的抑制剂及氧化氮介质。
术语″氧化氮″包括不带电的氧化氮(NO)及带电的一氧化氮种，优选带电的一氧化氮种，诸如亚硝鎓离子(NO+)和硝酰离子(NO-)。氧化氮的反应性形式可由气体氧化氮提供。释放，递送或转移一氧化氮的化合物具有结构F-NO，其中F是释放，递送或转移一氧化氮的部分，且包括将一氧化氮以对其期望的目的活跃的形式提供到其期望的作用位点的任何和全部该化合物。
术语″NO加合物”，“NO前体”和“NO-释放剂”互换使用。
在例示实施方式中，术语“高渗”指具有约3％～约7％盐的聚乙二醇化的Hb溶液。
【实施方式】
以下所示的讨论密切相关于本文以下所示的以及以上所示的和权利要求中随附的实施方式。旨在以任何方式并入实施方式的因素，及本文呈现的讨论是例示组合的例证而不是限制。
在例示实施方式中，本发明提供组合物，其包含水溶性的、有功能的、脱氧的、天然血红蛋白。例示组合物经病毒灭活。组合物包括水溶性血红蛋白级分，其包含有功能的、天然血红蛋白分子组。此血红蛋白分子组的各成员处于脱氧的状态，无化学交联剂，且具有约22mm Hg～约26mm Hg的P50。或者，在各种实施方式中，血红蛋白的P50是约9mm Hg～约12mm Hg。组合物也任选地包括水溶性稳定剂级分。稳定剂级分辅助将血红蛋白分子组维持在脱氧的状态。在各种实施方式中，稳定剂级分包括稳定化剂。例示稳定化剂具有相比脱氧的血红蛋白与氧更具有反应性分子的结构元件。组合物中也包括水性稀释剂级分。稀释剂级分包括可溶血红蛋白级分和稳定剂级分的药学可接受的稀释剂。在各种实施方式中，组合物基本上无病毒活性。在例示实施方式中，组合物包含少于10％高铁血红蛋白。
本发明的任何物质的脱氧的血红蛋白的Fe(II)可结合于CO或其可基本上未结合于氧或CO。在各种实施方式中，脱氧的血红蛋白 分子的Fe(II)既不结合氧也不结合一氧化碳。在各种实施方式中，血红蛋白分子是血红蛋白分子群的成员。在此实施方式中，例示血红蛋白分子群包括少于15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或少于1％处于氧合的状态的血红蛋白分子。
组合物的稳定化级分包括阻止或延缓脱氧的血红蛋白的氧化的制剂。可使用任何方便的和有效稳定化剂。在各种实施方式中，稳定化剂是在生物学系统中良好-耐受的稳定化剂，且可安全地施用于哺乳动物。稳定化级分中的例示稳定化剂是胺，诸如氨基酸，或巯基化合物。例示稳定化剂是含有巯基的氨基酸，氨基酸类似物或氨基酸模拟物。在各种实施方式中，氨基酸选自天然存在的和非-天然存在的氨基酸，例如，半胱氨酸。
在各种实施方式中，组合物包括药学可接受的载体，诸如包含盐的稀释剂级分。盐可选自基本上任何盐，尽管目前优选的那些盐是用于递送到哺乳动物的药学可接受的盐。在各种实施方式中，组合物包括氯化钠。本发明的组合物是等渗剂，高渗剂或低渗剂。在各种实施方式中，组合物是高渗剂。在例示实施方式中，组合物包括足够的氯化钠以致使其高渗。在其他实施方式中，稀释剂是张度磷酸盐缓冲液。
在例示实施方式中，本发明提供基本上无共价接合2个或更多血红蛋白分子的合成交联基的血红蛋白级分。尽管在产生或存储本发明的组合物期间可形成血红蛋白分子之间的小百分率的交联，这些交联的物质代表小百分率的总血红蛋白，且在纯化期间不特意地制备或选择。因此，例示本发明的组合物一般包括血红蛋白分子群，其中少于10％，少于5％，少于4％，少于3％，少于2％或少于1％的总血红蛋白含量为2个或更多血红蛋白分子处于交联的状态的形式。
本发明中使用的血红蛋白源于基本上任何哺乳动物源。例示血红蛋白源包括常见的家畜动物，例如，牛，猪，绵羊等。本发明不限于血红蛋白源。在各种实施方式中，血红蛋白是牛血红蛋白。
本发明的血红蛋白组合物包括最小量的高铁血红蛋白。在各种组 合物中，高铁血红蛋白的量少于10％，少于9％，少于8％，少于7％，少于6％，少于5％，少于4％，少于3％，少于2％或少于1％。
在例示实施方式中，在与稳定化级分组合之前将血红蛋白分离。
本发明提供与水溶性聚合物的血红蛋白共价缀合物。本领域技术人员已知许多水溶性聚合物，且其在实践本发明中有用。术语水溶性聚合物包括物质，诸如糖(例如，葡聚糖，直链淀粉，透明质酸，聚(唾液酸)，乙酰肝素，肝素，等)；聚(氨基酸)，例如，聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(例如，聚(丙烯酸)，聚(醚)，例如，聚(乙二醇))；肽，蛋白等。本发明可用任何水溶性聚合物实践，只有一个限制，聚合物必需包括缀合物的其余部分可附接的点。
由此在例示实施方式中，本发明病毒灭活的血红蛋白组合物，其包含在有功能的、脱氧的、天然血红蛋白分子和至少一个水溶性聚合物部分之间的共价缀合物。组合物包括包括血红蛋白分子组的水溶性血红蛋白级分。血红蛋白分子组的各成员是脱氧的。在例示实施方式中，水溶性聚合物通过氨基酸残基的胺部分共价缀合于血红蛋白。血红蛋白基本上无引导的，化学交联剂。在各种实施方式中，血红蛋白具有约22mm Hg～约26mm Hg的P50。在各种实施方式中，P50为约9mm Hg～约12mm Hg。组合物也包括水溶性稳定剂级分，其致使血红蛋白分子组抗氧化。稳定剂级分包括稳定化剂。例示稳定化剂包括至少一种结构元件，其相比血红蛋白分子组与氧更具有反应性。各种制剂也包括稀释剂级分，其包含可溶血红蛋白级分的药学可接受的稀释剂。例示制剂基本上无病毒活性，且包含少于约10％高铁血红蛋白。
聚合物的活化方法也可见于WO 94/17039，U.S.专利No.5,324,844，WO 94/18247，WO 94/04193，U.S.专利No.5,219,564，U.S.专利No.5,122,614，WO 90/13540，U.S.专利No.5,281,698，及更多WO 93/15189，且对于活化的聚合物和肽之间的缀合物而言，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)，血红蛋白(WO 94/09027)，氧携带分子(U.S.专利No.4,412,989)，核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese at al.，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。
在本发明的组合物中使用的水溶性聚合物(诸如PEG)的背景中的分子重量可表示为数平均分子量或重量平均分子量。除非另外指示的，本文中分子量全部指重量平均分子量。两种分子量确定，数平均和重量平均，可使用凝胶渗透层析或其他液相层析技术测量。也可使用测量分子量值的其他方法，诸如使用端基分析或测量依数性性质(例如，冰点降低，沸点升高或渗透压)来测定数平均分子量或使用光散射技术，超速离心或粘度测定法来测定重量平均分子量。本发明的聚合物剂一般是多分散(即，聚合物的数平均分子量和重量平均分子量不等同)，具有低多分散性值，优选少于约1.2，更优选少于约1.15，再更优选少于约1.10，又更优选少于约1.05，及最优选少于约1.03。例示水溶性聚合物是聚合物样品中聚合物分子的实质性比例是大致相同的分子量的那些；该聚合物是“均相分散”。
本发明还通过参考聚(乙二醇)缀合物来例证。可利用对于PEG的官能化和缀合的几个综述及专著。见，例如，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong et al.，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)；和Bhadra，et al.，Pharmazie，57：5-29(2002)。本领域已知制备反应性PEG分子及使用反应性分子形成缀合物的途径。例如，美国专利No.5,672,662公开聚合物酸的活性酯的水溶性和可分离的缀合物，其选自线性或分支的聚(环氧烷烃)，聚(氧乙基化的多元醇)，聚(烯醇)，及聚(丙烯酰吗啉)。
美国专利No.6,376,604提供通过聚合物的末端羟基与二(1-苯并三唑基)碳酸酯在有机溶剂中反应来制备水溶性和非-肽聚合物的水溶性1-苯并三唑基碳酸酯的方法。活性酯用于与生物学活性剂诸如蛋白或肽形成缀合物。
WO 99/45964描述缀合物，其包含生物学活性剂及活化的水溶性聚合物，所述活化的水溶性聚合物包含具有至少一个通过稳定的连接 连接到聚合物主链的末端的聚合物主链，其中至少一个末端包含具有连接到分支部分的近端反应性基团的分支部分，其中生物学活性剂连接到至少一个近端反应性基团。其他分支的聚(乙二醇)描述于WO96/21469，美国专利No.5,932,462描述与包括包含反应性官能团的分支的末端的分支的PEG分子形成的缀合物。游离的反应性基团可用于与生物学活性物质，诸如蛋白或肽反应而形成聚(乙二醇)和生物学活性物质之间的缀合物。美国专利No.5,446,090描述双官能PEG接头，和其用于形成在各PEG接头末端具有肽的缀合物。
包括可降解的PEG连接的缀合物描述于WO 99/34833；及WO99/14259，以及在美国专利No.6,348,558中。该可降解的连接在本发明中可应用。
以上所示的聚合物活化的本领域-认可的方法在本发明的背景中用于形成本文所示的分支的聚合物及也用于将这些分支的聚合物缀合于其他物质，例如，糖，糖核苷酸等。
例示水溶性聚合物是聚(乙二醇)，例如，甲氧基-聚(乙二醇)。本发明中使用的聚(乙二醇)不局限于任何特定形式或分子量范围。对于直链聚(乙二醇)分子而言，分子量优选在500和100,000之间。优选使用2000～60,000的分子量，且优选为约5,000～约40,000。在例示实施方式中，使用的PEG是甲氧基-PEG，具有约5,000的平均分子量。
在另一实施方式中，聚(乙二醇)是具有多于一个附接的PEG部分的分支的PEG。分支的PEG的例描述于U.S.专利No.5,932,462；U.S.专利No.5,342,940；U.S.专利No.5,643,575；U.S.专利No.5,919,455；U.S.专利No.6,113,906；U.S.专利No.5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5：283-288(1994)；及Yamasaki et al.，Agric.Biol.Chem.，52：2125-2127，1998。在优选的实施方式中，分支的PEG的各聚(乙二醇)的分子量小于或等同40,000Da。
在各种实施方式中，本发明提供具有结合其上的一个或更多PEG部分的血红蛋白缀合物。PEG-血红蛋白处于CO形式。在例示实施方式中，此缀合物配制进磷酸盐缓冲液。
在各种实施方式中，本发明提供具有结合其上的1个或更多PEG部分的血红蛋白缀合物。在各种实施方式中，PEG-血红蛋白是脱氧的，且不是CO形式。在其他实施方式中，PEG-血红蛋白是CO形式。在例示实施方式中，此缀合物，无论PEG-Hb是氧合的，CO或未结合的形式，配制进高渗盐水(高盐)。这些高渗制剂中使用的例示盐(例如，NaCl)浓度为约4％～约8％，约4.5％～约7.5％或约5％～约7％。例示制剂包括约4％，约5％，约6％，约7％或约8％盐。在一种制盐中，浓度是7.5％。在各种实施方式中，盐是NaCl。在例示实施方式中，制剂的同渗质量摩尔浓度为约300～400，或约325～375，或约340～360mOsmol。在例示实施方式中盐是NaCl。
在例示实施方式中，本发明提供基于PEG-Hb的复苏液，其在修正凝血病中具有等同于新鲜冷冻的血浆的至少75％，至少80％，至少85％，至少90％至少95％或约100％的功效。根据此实施方式的例示制剂还包括凝血因子，血小板或其他已知辅助缓和凝血病的物质。
在各种实施方式中，本发明提供具有约450mL的总流体体积的PEG-Hb复苏液，且其具有相当于一个单位的浓集红细胞，优选人红细胞的氧携带和/或氧扩散能力。
在各种实施方式中，本发明提供能携带CO及将其扩散到组织的PEG-Hb制剂(例如，复苏液)。例示制剂具有约450mL的总流体体积，且其具有足以将治疗关联量的CO转移到组织的CO携带和/或CO扩散能力。
在例示实施方式中，本发明提供存在凝血因子的PEG-Hb复苏液。在各种实施方式中，凝血因子以不少于60％，不少于70％，不少于80％或不少于90％的新鲜冷冻的血浆的量存在。
在例示实施方式中，复苏液包括血小板。通常优选是，包括血小板的本发明的复苏液具有不少于60％，不少于70％，不少于80％，不少于90％或大致等同于单成分输血单位的细胞计数和活性。
存储稳定性是本发明的重要目的。在各种实施方式中，本发明提供在环境温度(～25℃)稳定至少4个月，至少6个月，至少9个月 或至少12个月的PEG-Hb复苏液。
在各种实施方式中，本发明也提供相比当前的库血产品不是更免疫原性的PEG-Hb复苏液。也提供相比当前库血产品不是更血栓形成性的PEG-Hb复苏液。
根据本发明的例示制剂包括以任何组合的一种或更多这些特征：约4.0～4.6wt％Hb，约1.0～5.0wt％Met，约0.0～5.0％的HbO2，约95.0～100.0％的HbCO，约8.10～8.20的pH，约325～370mOsmol的同渗质量摩尔浓度，约10.00～14.00的P50(mm Hg)，及在538nm和568nm处具有主要峰、分别具有约1.4和1.9的吸光度的光谱，2.5～3.0的在568nm/500nm处的峰比。在其他例示制剂中，制剂具有在541和576nm处具有主要峰的光谱。
甚至更特别，例示本发明的制剂包括以任何组合的一种或更多这些特征：约4.5wt％Hb，约1.1wt％Met，约1.2％HbO2，约99.4％HbCO，约8.14的pH，约356mOsmol的同渗质量摩尔浓度，约12.2的P50(mm Hg)，及在538nm和568nm处具有主要峰、具有分别约1,493和约1,465的吸光度的光谱，和约2.6的在568nm/500nm处的峰比。
【制备缀合物】
【病毒去活化的血红蛋白的制备】
制备本发明的缀合物中使用的前体血红蛋白可从红细胞(RBC)分离。适合的RBC源包括人血，牛血，绵羊血，猪血，自其他受试者的血及转基因地-产生的血红蛋白，诸如描述于BIO/TECHNOLOGY，12：55-59(1994)的转基因Hb。
血可收集自活或新鲜处死的供体。收集牛全血的一种方法描述于Rausch等人的U.S.专利No.5,084,558和5,296,465。优选血以卫生方式收集。
在分离和纯化血红蛋白领域已知许多方法；这些方法通常可应用于当前发明的组合物。下文讨论是例证性的而不是限制性的。
在各种实施方式中，在收集之后当时或不久，使血任选地与至少 一种抗凝剂混合来阻止血显著凝固。本领域常规地知道适合的血抗凝剂，且包括，例如，柠檬酸钠，乙二胺四乙酸和肝素。当与血混合时，抗凝剂可为固体形式，诸如粉末，或为水溶液。
血溶液可在抗凝步骤之前或期间粗滤，例如通过粗滤，以移出大聚集物及粒子。600网孔筛选是适合的粗滤器的例。
然后将血溶液中的RBC通过适合的方法，诸如通过渗滤或通过用至少一种溶液，诸如等渗溶液的不连续稀释和浓缩步骤的组合任选地洗涤，以从细胞外血浆蛋白，诸如血清白蛋白或抗体(例如，免疫球蛋白(IgG))分离RBC。应理解，RBC可以批或连续供料模式洗涤。
本领域也知道可接受的等渗溶液，且一般用于制备本发明的制剂。例示等渗溶液具有中性pH和约285～315mOsm之间的渗透性。等渗溶液的非限制性例包括溶液，诸如柠檬酸盐/盐溶液，其具有不破裂RBC细胞膜且替换全血的血浆部分的pH和渗透性。例示等渗溶液由柠檬酸钠二水合物(6.0g/L)及氯化钠(8.0g/L)的水溶液组成。
本发明的方法中有用的水包括蒸馏水，去离子水，注射用水(WFI)和/或低热源水(LPW)。WFI，其优选是去离子化的，蒸馏水符合对注射用水的U.S.Pharmacological Specifications。WFI还描述于Pharmaceutical Engineering，11，15-23(1991)。LPW，其优选为含有少于0.002EU/ml的去离子水。
血溶液中的RBC可通过渗滤洗涤。适合的透析过滤器包括具有会从基本上更小血溶液组分分离RBC的孔径的微孔膜，诸如0.1μm～0.5μm滤器(例如，0.2μm滤器)。同时，以等同于经过透析过滤器液失的滤出液的速度(或体积)的速度作为补充连续(或以批)添加过滤的等渗溶液。在RBC洗涤期间，直径相比RBC显著更小，或流体诸如血浆，的血溶液组分经过透析过滤器的壁到滤出液。RBC，血小板和更大尺寸的稀释的血溶液，诸如白细胞，保留且与等渗溶液混合，将其连续或分批添加，以形式透析的血溶液。
RBC也可通过一系列连续(或反向连续)稀释和浓缩步骤洗涤， 其中血溶液通过添加至少一种等渗溶液稀释，及通过流过滤器浓缩，由此形成透析的血溶液。
当污染RBC的血浆蛋白水平已基本上降低(一般至少约90％)时，RBC洗涤完全。额外的RBC洗涤还可从RBC分离细胞外血浆蛋白。例如，用6体积的等渗溶液渗滤可从血溶液移出至少约99％的IgG。
然后使透析的血溶液任选地暴露于在透析的血溶液中从白细胞和血小板分离RBC的方法，诸如通过离心。
应理解，可采用其他本领域通常知道的从其他血组分分离RBC的方法。例如，从其他血组分分离RBC之前沉积，其中分离方法不破裂显著量的RBC细胞膜，诸如少于约30％的RBC。
分离RBC之后，从RBC提取血红蛋白来形成含有血红蛋白的溶液。提取可通过各种方法进行，包括RBC的裂解和低-渗透溶胀。裂解手段可使用各种裂解方法，诸如机械裂解，化学裂解，低渗裂解或不显著损伤Hb运输及释放氧的能力地释放血红蛋白的其他知道的裂解方法。
替代性地，可在本发明的方法中代替RBC处理重组产生的血红蛋白，诸如描述于Nature，356：258-260(1992)的重组产生的血红蛋白。如上所述自污染物洗涤及分离含有血红蛋白的细菌细胞。然后将这些细菌细胞通过本领域知道的方法，诸如球磨机，机械地破裂来从细胞释放血红蛋白和形成裂解的细胞相。然后将此裂解的细胞相如裂解的RBC相处理。
裂解后，然后将裂解的RBC相任选地超滤来移出更大细胞碎片，诸如具有约100,000Da以上分子量的蛋白。一般而言，细胞碎片包括全部全及片段化的细胞组分，除了Hb之外，更小细胞蛋白，电解质，辅酶和有机代谢中间体。可接受的超滤器包括，例如，100,000Da滤器。
可采用从裂解的RBC相分离Hb的其他方法，包括沉积，离心或微过滤。然后可将Hb滤出液超滤以从Hb超滤液移出更小细胞碎片， 电解质，辅酶，代谢中间体和分子量少于约30,000Da的蛋白，及水。适合的超滤器包括30,000Da超滤器。
然后可使浓缩的Hb溶液经历一个或更多并行层析柱，以通过高效液相层析从其他污染物诸如抗体，内毒素，磷脂和酶和病毒进一步分离血红蛋白。适合的介质的例包括阴离子交换介质，阳离子交换介质，疏水相互作用介质和亲和性介质。在一实施方式中，层析柱含有适合于从非-血红蛋白分离Hb的阴离子交换介质。适合的阴离子交换介质包括，例如，氧化硅，矾土，二氧化钛凝胶，交联的葡聚糖，琼脂糖或衍生的部分，诸如聚丙烯酰胺，聚羟乙基甲基丙烯酸酯或苯乙烯二乙烯基苯，其已用阳离子化学官能性衍生，诸如二乙基氨基乙基或季氨基乙基。用于相比其他蛋白和污染物(其可能在裂解的RBC相中)的Hb的选择性吸收和解吸的适合的阴离子交换介质及对应洗脱液可由本领域技术人员容易测定。
通过不显著降低Hb洗出液中的Hb运输及释放氧的能力(诸如会从氧化的血红蛋白(metHb)形成的变性而发生)地基本上脱氧Hb的方法使Hb溶液任选地脱氧而形成脱氧的Hb溶液(以下称之为脱氧-Hb)。
Hb洗出液可通过惰性气体的气体转移过相膜来脱氧。该惰性气体包括，例如，氮，氩和氦。应理解，本领域已知的其他使血红蛋白溶液脱氧的方法可用于Hb洗出液的脱氧。该其他方法可包括，例如，Hb洗出液的氮喷洒，用还原剂诸如N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，半胱氨酸，连二亚硫酸钠或抗坏血酸盐的化学清除，或通过光的光解。可将脱氧的血红蛋白转化为CO形式。
脱氧持续直到Hb溶液的pO2降至期望的水平，例如，其中Hb溶液中氧合的Hb(氧合血红蛋白或HbO2)含量是约20％或更少，10％或更少，5％或更少3％或更少或1％或更少。
脱氧期间，Hb溶液的温度一般保持在会平衡相对高铁血红蛋白形成速度的脱氧速度的水平。维持温度以限高铁血红蛋白含量少于20％。最佳温度会导致少于约5％高铁血红蛋白含量，及优选少于约 2.5％高铁血红蛋白含量，而仍使Hb溶液脱氧。一般而言，脱氧期间，Hb溶液的温度维持在约15℃和约35℃之间。脱氧期间，及随后贯穿本发明的方法的余下步骤，Hb维持在低氧环境，以最小化由Hb的氧吸收。
将脱氧的-Hb任选地用低氧含量存储缓冲液，含有稳定化剂，例如，巯基化合物，平衡来形成氧化-稳定的脱氧-Hb。适合的巯基化合物包括非-毒性剂，诸如N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，D，L-半胱氨酸，γ-谷氨酰-半胱氨酸，谷胱甘肽，2，3-二巯基-1-丙醇，1，4-丁二硫醇和其他生物学相容的巯基化合物。加入一定量的巯基化合物来建立会在存储时期清除氧而维持高铁血红蛋白含量少于约15％，少于约10％，或少于约5％的巯基浓度。一般而言，添加的巯基化合物的量是足以建立以重量计约0.05％和约0.2％之间的巯基浓度的量。
在各种实施方式中，本发明提供病毒灭活的血红蛋白组合物，其包含水溶性的、有功能的、脱氧的、天然血红蛋白。组合物通过包括如下步骤的方法制备：使脱氧的血红蛋白和稳定化剂的溶液经历热病毒灭活处理。在例示实施方式中，热病毒灭活处理包括使溶液暴露于升高到足以灭活所述溶液中的基本上全部病毒活性的温度；加热持续足以达到溶液中基本上全部病毒活性灭活的时间。例示稳定化剂包括相比脱氧的血红蛋白在溶液中与氧更具有反应性的结构元件，由此最小化由脱氧的血红蛋白的氧结合。溶液包括足以阻止热病毒灭活处理中形成多于约10％，8％，6％，4％或2％高铁血红蛋白的量的稳定化剂。在各种实施方式中，稳定化剂选择为和以足以维持高铁血红蛋白浓度在约5％或更低的量存在。
在各种实施方式中，组合物包括血红蛋白和结合于血红蛋白的至少至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，或至少约10个水溶性聚合物部分之间的共价缀合物。水溶性聚合物结合于血红蛋白上的任何适当的残基。在本发明的例示缀合物中，一个或更多水溶性聚合物部分结合于氨基酸侧链，例如，赖氨酸残基的ε-胺部分。在例示实施方式中，本发明提供以上所示的PEG-Hb缀合物，其中各 Hb分子缀合于7，8，9或10个PEG部分。在各种实施方式中，本发明提供PEG-Hb缀合物群，其中PEG部分/Hb分子的平均数为约7～约10，或约8和约9。在例示实施方式中，PEG部分是PEG 5000部分。
【缀合物的合成】
在各种实施方式中，本发明提供1个或更多水溶性聚合物部分和血红蛋白多肽之间的缀合物。在例示实施方式中，前体血红蛋白是经病毒灭活的血红蛋白组合物，其包含水溶性的、有功能的、脱氧的、天然血红蛋白。组合物通过包括如下步骤的方法制备：使脱氧的血红蛋白和稳定化剂的溶液经历热病毒灭活处理。在例示实施方式中，热病毒灭活处理包括使溶液暴露于升高到足以灭活所述溶液中的基本上全部病毒活性的温度；加热持续足以达到溶液中基本上全部病毒活性灭活的时间。例示稳定化剂包括在溶液中相比脱氧的血红蛋白与氧更具有反应性的结构元件，由此最小化由脱氧的血红蛋白的氧结合。溶液包括足以阻止在热病毒灭活处理中多于约10％，8％，6％，4％或2％高铁血红蛋白形成的的量的稳定化剂。在各种实施方式中，稳定化剂选择为和以足以维持约5％或更低高铁血红蛋白浓度的量存在。
在各种实施方式中，前体血红蛋白多肽经病毒灭活血红蛋白组合物，其包含水溶性的、有功能的、脱氧的、天然血红蛋白。组合物包含少于约10％高铁血红蛋白及通过包括如下步骤的方法制备：将前体血红蛋白溶液加热到约60℃持续达约12小时，例如，约1小时～约4小时。前体溶液任选地包括稳定化剂。稳定化剂包括相比溶液中的血红蛋白分子更容易与氧或活性氧反应的结构，由此最小化由脱氧的血红蛋白的氧结合，且由此形成所述组合物。
水溶性聚合物和病毒灭活的血红蛋白肽之间的缀合物可通过水溶性聚合物的活化的衍生物和血红蛋白在适合的条件下反应来形成。在各种实施方式中，将水溶性聚合物通过氨基酸残基的侧链，例如，赖氨酸残基的ε-胺部分缀合于血红蛋白。例示本发明的缀合物包括结合于血红蛋白的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少 9或至少10个水溶性聚合物部分。
在形成本发明的缀合物的例示方法中，前体病毒灭活的血红蛋白组合物是氧合的，且将氧合的血红蛋白和反应性与血红蛋白的氨基酸残基互补的活化的水溶性聚合物分子接触，由此在水溶性聚合物和氧合的血红蛋白溶液中的氧合的血红蛋白分子之间形成共价缀合物。在例示实施方式中，共价缀合物的血红蛋白是脱氧的或结合于CO。脱氧可为机械或化学脱氧，提供铁未结合或结合于CO的血红蛋白分子。
一般而言，水溶性聚合物(例如，PEG)部分和多肽通过使用反应性基团连接在一起，其一般被连接处理转化为在生理学关联条件下非活性的新有机官能团或物质。反应性官能团位于肽和水溶性聚合物的任何位置。实践本发明中有用的反应性基团及反应类通常是生物共轭化学领域熟知的那些。反应性氨基酸部分可利用的目前受到优待的反应类是在相对弱条件下进行的那些。这些包括，但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤，活性酯的反应)，亲电子取代(例如，烯胺反应)和加成到碳-碳和碳-杂原子多键(例如，Michael反应，Diels-Alder加成)。这些和其他有用的反应在例如以下文献中讨论，March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；and Feeney et al.，MODIFICATIONOF PROTEINS；Advances in Chemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
悬垂于血红蛋白多肽或水溶性聚合物的有用的反应性官能团包括，但不限于：
(a)羧基和各种其衍生物包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-羟基苯并三唑酯，酰卤，酰基咪唑，硫酯，p-硝基苯基酯，烷基，烯基，炔基和芳族酯；
(b)羟基，其可将转化为，例如，酯，醚，醛，等。
(c)卤代烷基，其中卤化物可后替换为亲核基团诸如，例如，胺，羧酸根阴离子，巯基阴离子，碳负离子或烷氧化物离子，由此导致新 基团在卤素原子的官能团处共价连接；
(d)亲二烯体基，其能参与Diels-Alder反应诸如，例如，马来酰亚胺基；
(e)醛或酮基，使得可能经羰基衍生物诸如，例如，亚胺，腙，半卡巴腙或肟的形成，或经如Grignard加成或烷基锂添加的机理而随后衍生化；
(f)磺酰卤基，其用于随后与胺反应，例如，而形成磺酰胺；
(g)巯基，其可，例如，转变为二硫化物或与酰基卤反应，或转变为硫醚，例如，通过与马来酰亚胺反应；
(h)胺或巯基，其可经，例如，酰化，烷基化或氧化；
(i)烯，其可经历，例如，环加成，酰化，Michael加成，等；
(j)环氧化物，其可与，例如，胺和羟基化合物反应；以及
(k)马来酰亚胺，其可与，例如，胺和巯基反应。
反应性官能团可选择为使得它们不参与或干扰对组装反应性聚合物修饰基团(例如，PEG)必需的反应。或者，反应性官能团可被保护而免于参与由保护基的存在而反应。本领域技术人员明白如何保护特定官能团，使得其不干扰选择的组的反应条件。如有用的保护基的例，见，例如，Greene et al.，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS，John Wiley & Sons，New York，1991。
适合的缀合条件是足以实现聚合物剂和活性剂之间的缀合的时间，温度，pH，试剂浓度，试剂官能团，活性剂上可利用的官能团，溶剂等的那些条件。如本领域已知，特定条件依赖于，尤其是，活性剂，期望的缀合类型，反应混合物中其他物质的存在，等等。对于在任何特定情况中实现缀合足够的条件可由本领域普通技术人员读过本公开，参照关联文献，和/或通过常规实验后确定。
例如，当聚合物剂含有N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(例如，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯，琥珀酰亚胺基碳酸酯，琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯)，且活性剂含有胺基(例如，多肽上的末端胺基和/或含有赖氨酸的多肽的ε胺)，缀合可在约7.5～约9.5的pH于室温实现。 此外，当聚合物剂含有乙烯基砜反应性基团或马来酰亚胺基，且药理学活性剂含有巯基(例如，含有半胱氨酸的或含有甲硫氨酸的多肽的巯基)时，缀合可在约7～约8.5的pH于室温实现。而且，当与聚合物剂关联的反应性基团是醛或酮，且药理学活性剂含有伯胺时，缀合可通过还原性胺化实现，其中药理学活性剂的伯胺与聚合物的醛或酮反应。在约6～约9.5的pH发生，还原性胺化起初导致缀合，其中药理学活性剂和聚合物经亚胺键连接。随后用适合的还原剂诸如NaCNBH3处理含有亚胺的缀合物而将亚胺还原成仲胺。
例示缀合条件包括在约4～约10的pH，及在，例如，约4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5或10.0的pH进行缀合反应。使反应进行约5分钟～约72小时，例如，约30分钟～约48小时，例如，约4小时～约24小时。可发生缀合该温度一般，尽管不必然，在约0℃～约40℃的范围内，且常常于室温或更低。缀合反应常常使用磷酸盐缓冲溶液，乙酸钠或类似系统进行。
有关试剂浓度，一般将过量聚合物剂与血红蛋白组合。聚合物剂和血红蛋白的例示比率包括约1∶1(聚合物剂∶血红蛋白)，5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1或30∶1的摩尔比。在各种实施方式中，使缀合反应进行直到基本上无还缀合发生，其可通常通过经时监控反应进展来确定。
反应进展可通过在各时间点从反应混合物取出等分来监控，及通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质量光谱法或任何其他适合的分析方法分析反应混合物。一旦达到有关形成的缀合物量或未缀合的聚合物剂余下的量的平台期，反应推定为完全。一般而言，缀合反应耗时从几分钟到几小时(例如，5分钟～24小时或更久)。得到的产物混合物优选但不必然经纯化而分离出过量的聚合物剂，未缀合的反应物(例如，活性剂)及不期望的多-缀合的物质。得到缀合物可然后还使用分析方法诸如MALDI，毛细管电泳，凝胶电泳，和/或层析表征。
可纯化聚合物-血红蛋白缀合物而获得/分离不同缀合的物质。或者，且更优选对于更低分子量(例如，少于约20,000Da，更优选少于约 10,000Da)，利用聚合物剂形成缀合物，可纯化产物混合物而获得水溶性聚合物段/活性剂的分布。例如，可纯化产物混合物而获得平均期望的数的聚合物剂/Hb分子的附接，一般平均约7，8，9或10附接/Hb分子。纯化最终缀合反应混合物的策略会依赖于许多因素，包括，例如，采用的聚合物剂的分子量，特定Hb制剂，期望的施剂方案，及个体缀合物的残留的活性和体内性质。
如果需要，具有不同分子量的缀合物可使用凝胶过滤层析分离。就是说，将凝胶过滤层析用于基于它们的不同分子量(其中差异基本上对应于水溶性聚合物段的平均分子量)分级不同数的聚合物剂-对比-活性剂比率(例如，1聚体，2聚体，3聚体等等，其中″1聚体″指示对活性剂1聚合物剂，″2聚体″指示对活性剂2聚合物剂，等等)。例如，在例示反应中，其中100,000Da蛋白随机缀合于具有约20,000Da的总分子量的分支的PEG(其中分支的PEG的各聚合物″臂″具有约10,000Da的分子量)，得到的反应混合物可含有未修饰的蛋白(具有约100,000Da的分子量)，单聚乙二醇化的蛋白(具有约120,000Da的分子量)，二聚乙二醇化的蛋白(具有约140,000Da的分子量)，等等。
而此方法可用于分离具有不同分子量的PEG和其他聚合物-活性剂缀合物，此方法通常对于分离蛋白之内具有不同聚合物附接位点的位置异构体无效。例如，凝胶过滤层析可用于彼此分离PEG 1聚体，2聚体，3聚体等等的混合物，尽管各恢复的PEG-聚体组合物可含有附接于活性剂之内的不同反应性氨基(例如，赖氨酸残基)的PEG。
适于进行此类型的分离的凝胶过滤柱包括可从Amersham Biosciences得到的SuperdexTM和SephadexTM柱(Piscataway，N.J.)。特定柱的选择会依赖于期望的分级分离范围。洗脱通常使用适合的缓冲液，诸如磷酸盐，乙酸盐等进行。收集的级分可通过许多不同方法分析，例如，(i)在280nm处就蛋白含量的光密度(OD)，(ii)牛血清白蛋白(BSA)蛋白分析，(iii)就PEG含量的碘测试(Sims et al.(1980)Anal.Biochem，107：60-63)和(iv)十二烷基硫酸钠聚丙 烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，然后是用碘化钡染色。
在各种实施方式中，水溶性聚合物是PEG，且期具有约1kD，5kD，10kD，15kD，20kD，30kD或40kD的分子量。PEG部分是线性或分支的PEG物质。PEG部分的末端，其不附接于多肽(或附接于多肽的接头)，可为OH或另一部分，例如，O-(C1-C4)取代的或未经取代的烷基。目前优选OMe(其中Me是甲基)。
在例示实施方式中，水溶性聚合物是线性或分支的PEG。在各种实施方式中，缀合物包括1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个PEG部分/肽。在例示实施方式中，水溶性聚合物是线性PEG和缀合物包括约6，7，8，9或10个PEG部分/肽分子。在另一例示实施方式中，水溶性聚合物是分支的PEG和缀合物包括约1，2，3，4或5个PEG部分/肽分子。
在例示实施方式中，其中PEG是线性物质，PEG部分具有为约200D～约20kD的分子量。在各种实施方式中，其中PEG部分是线性PEG部分，线性PEG的分子量是至少约200D，至少约500D，至少约1kD，至少约2kD，至少约5kD，至少约10kD，至少约20kD，至少约30kD或至少约40kD。
本发明中使用的例示PEG物质是具有2个或更多PEG臂的分支的PEG。此实施方式的范例基于侧链氨基酸，例如，丝氨酸，半胱氨酸或赖氨酸和由这些氨基酸个别或组合形成的二肽，三肽和四肽。
在其他例示实施方式中，其中PEG物质是分支的，分支的PEG包括2～6个线性PEG臂。例示PEG臂具有约200D～约30kD的分子量。在各种实施方式中，各臂具有至少约2kD，至少约5kD，至少约10kD，至少约15kD，至少约20kD，至少约30kD或至少约40kD的个别选择的分子量。
在各种实施方式中，至少1个聚(乙二醇)部分通过血红蛋白分子的氨基酸残基的胺部分共价缀合。在例示实施方式中，氨基酸残基是赖氨酸残基和至少1个聚(乙二醇)部分共价缀合于赖氨酸残基的ε-胺部分。例示缀合基序是通过选自酰胺和氨基甲酸酯的键。
【缀合物的稳定性】
在各种实施方式中，本发明提供高度稳定的PEG-血红蛋白缀合物，如通过它们对形成高铁血红蛋白的抗性测量。在一实施方式中，本发明提供于45℃存储持续至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约7天，至少约8天，至少约9天，至少约10天，至少约11天，至少约12天，至少约13天，至少约14天，或至少约15天之后包括少于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％或3％高铁血红蛋白的缀合物。
在各种实施方式中，本发明提供高度稳定的PEG-血红蛋白缀合物，如通过它们对形成高铁血红蛋白的抗性测量。在一实施方式中，本发明提供于4℃存储持续至少约5周，至少约6周，至少约7周，至少约8周，至少约9周，至少约10周，至少约11周，至少约12周，至少约13周，至少约14周，至少约15周，或至少约16周之后包括少于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％或3％高铁血红蛋白的缀合物。
在各种实施方式中，本发明提供一氧化碳(CO)形式的PEG-血红蛋白缀合物。此形式呈现为在如显示于表3保持％MET-Hb形成低的方面特别稳定。例如，CO形式于37℃存储持续16周之后仅显示4.0％％MET-Hb。此相比机械地脱氧的形式更稳定。
例示本发明的缀合物于45℃存储持续至少约3周，至少约4周或至少约5周之后在低血容量休克的动物模型中完全有效。
在根据各以上描述的例示制剂中，缀合物的血红蛋白是CO形式。在各种实施方式中，本发明提供于4℃持续稳定至少约3个月，至少约6个月，至少约9个月或至少约12个月的PEG-Hb-CO缀合物。
【组合制剂】
在各种例示实施方式中，本发明提供包括1个或更多PEG-Hb缀合物的组合制剂或与另一治疗剂或增强，补充或增加制剂中PEG-Hb缀合物的活性的制剂组合的本发明的制剂。例示制剂包括，但不限于，促凝剂或促凝剂前体，抗氧化酶和提供预防或治疗缺血/再灌注损伤的 制剂。根据这些例的例示物质如以下所示。
在例示实施方式中，本发明提供制剂，其包括1个或更多本发明的PEG-Hb组合物联合血小板。
血小板是通过粘附到血管损伤的位点和通过促进血浆纤维蛋白凝块形成来保护损伤的哺乳动物免于失血的源于无核骨髓的血细胞。通过骨髓衰竭耗竭循环血小板的人患有威胁生命的自发出血，及创伤或手术后贡献于出血并发症的血小板的欠严重的缺乏。
有关人血小板细胞已知许多。描述存储血小板的技术，材料和方法的一般公开描述于Murphy et al.，Blood 60(1)：194-200(1982)；Murphy in″The Preparation and Storage of Platelets for Transfusion″，Mammon，Barnhart，Lusher，and Walsh，PJDPublications，Ltd.，Westbury，N.Y.(1980)；Murphy in″Platelet Transfusion″，Progress in Hemostasis and Thrombosis，Vol.III，Ed.by T.Spaet，Grune and Stratton，Inc.(1976)；Murphy et al.，Blood46(2)：209-218(1975)；Kilkson et al.，Blood 64(2)：406-414(1984)；Murphy in″Platelet Storage for Transfusion″，Seminars in Hematology 22(3)：165-177(1985)；Simon et al.，Transfusion23：207-212(1983)；Cesar et al.，Transfusion 27(5)：434-437(1987)。
减少循环血小板数到～70,000/μL以下据说导致标准化的皮肤出血时间测试延长，及出血间隔延长，外推到接近无限大，由于血小板计数下落到0。具有少于20,000/μL的血小板计数的患者被认为对从粘膜表面的自发出血高度敏感。
本发明的血小板PEG-Hb制剂用于治疗患有骨髓衰竭的受试者，所述骨髓衰竭例如，再生障碍性贫血，急性和慢性白血病，转移性癌，但尤其由用电离辐射和化学治疗的癌治疗所致。而且，制剂用于治疗和改善与大手术，损伤(例如，创伤)和脓毒症关联的血小板减少症。
血小板及PEG-Hb制剂可以任何实践和有效方式组合。由此，在例示实施方式中，在将得到的组合物施用于受试者之前不久将血小板和PEG-Hb组合。在其他例示实施方式中，制备血小板-PEG-Hb制剂 及存储适当的时间。
在各种实施方式中，单独或与PEG-Hb制剂组合的血小板通过稳定化剂稳定化。本领域已知本发明中使用的例示稳定化剂。见，例如，U.S.专利No.7,241,282和5,466,573。血小板的来源也任选地是富含血小板和纤维蛋白原的血组合物，诸如公开于U.S.专利No.6,649,072。
在例示实施方式中，本发明提供试剂盒，其中存在2种(或更)组分及在它们的组合之前独立地存储。例如，在各种实施方式中，本发明提供用于组合血小板和PEG-Hb制剂的装置。装置包括：第1容器，其用于收集或存储因子；及至少1个卫星容器，其与保存PEG-Hb制剂的第1容器流通连接。在使用中，断裂密封屏障插入到第1和卫星容器之间，使得密封破裂后，制剂的2种组分可混合及随后施用于有需求的受试者。如本领域技术人员会同意，可利用描述的装置的相当体且其落到本公开的精神和范围之内。例如，试剂盒可包括2个或更多安瓿，各含有液体或干形式的本发明的组合制剂的元件。在给有需求的受试者施用组合制剂之前，可将安瓿的内容物在适当的时间和以适当的方式混合。
在其他例示实施方式中，本发明提供本发明的PEG-Hb制剂与一种或更多种凝血因子组合的制剂。该制剂在诸多其他用途中尤其用于治疗某些凝血障碍(例如，血凝固中的遗传性或获得性缺陷)，急性出血及手术前出血预防。
在例示实施方式中，本发明提供组合制剂，其包括本发明的PEG-Hb制剂和凝血因子，其为选自下列的成员：因子II，V，VII，VIII，IX，X，XI和XII及其组合。在各种例示实施方式中，因子选自因子VII，因子VIII和因子IX或其组合。
血凝固是需要大量的组分(其中几乎全部是蛋白)连续相互作用的复杂过程。这些组分包括纤维蛋白原和因子II，V，VII，VIII，IX，X，XI和XII。任何这些组分的缺乏，或无功能组分，可导致当需要时血不能凝块，给患者带来过量的和威胁生命的失血。
本领域充斥着已建立的制备凝血因子浓缩物各种吸着剂的方法。 例如，因子VIII复合物的纯化产生因子VIII制剂，其具有约90％或更大纯度水平，且其就以冷冻干燥的形式长时间存储而言足够稳定。见，例如，U.S.专利No.4,650,858；及U.S.专利No.5,399,670。因子VIII制剂也可利用。这些包括：人因子VIII(如HumateTM，MonoclateTM，lmmunateTM和HemofilTM的有效成分)，重组人因子VIII(如r-VIIISQ，其描述于PCT专利申请WO 91/09122(ReFactoTM的有效成分)或KogenateTM或RecombinateTM的有效成分)，猪因子VIII(其为产品Hyate：CTM的有效成分)(由Ipsen，Inc.，USA出售)或重组猪因子VIII(例如猪因子VIII的修饰的无B-结构域形式，如公开于专利申请WO 01/68109及鉴定为″POL1212″的)。
本发明中使用的额外的因子VIII制剂包括公开于U.S.专利No.5,565,427，U.S.专利No.5,605,884，U.S.专利No.5,763,401U.S.专利No.5,874,408，U.S.专利No.5,962,650，U.S.专利No.5,972,885，WO89/09784和WO 94/07510的那些。
其他因子在本发明中类似地可利用及使用。在例示实施方式中，将因子VII掺入本发明的PEG-Hb制剂。因子VII是分泌到血的406个氨基酸的单链糖蛋白(mol.wt.50,000)，在血中其以酶原形式循环。体外，FVII可通过活化的凝血因子因子X(FXa)，因子IX(FIXa)，因子XII(FXIIa)或因子II(FIIa)的作用蛋白水解地活化为活化的因子FVII，或FVIIa。FVIIa不独自促进凝固，但可与暴露在损伤位点的组织因子(TF)复合。FVIIa/TF复合物可将FX转变为FXa，由此诱导在损伤位点的局部止血。FVII到FVIIa的活化涉及Arg-152和Ile-153之间的单肽键处的蛋白水解切割，产生由通过单二硫键把持在一起的152个氨基酸残基的轻链和254个氨基酸残基的重链组成的2-链分子。
本领域已知产生及纯化因子VII的方法。见，例如，U.S.专利No.6,329,176。FVII的一些蛋白-加工的变体已有报道。见，例如，Dickinson et al.，J.Bio.Chem.272：19875-19879(1997)，Kemball-Cook et al.，J.Biol.Chem.273：8516-8521(1998)，Bharadwaj et al.，J.Biol.Chem. 271：30685-30691(1996)，Ruf et al.，Biochemistry，38：1957-1966(1999)；WO 99/20767；WO 00/11416；WO 02/22776；WO 02/38162；WO 01/83725；WO 01/58935；及U.S.专利No.5,580,560。FVII已在BHK和其他哺乳动物细胞中表达(WO 92/15686，WO 91/11514和WO88/10295)且FVII和kex2内切蛋白酶在真核细胞中共-表达(WO00/28065)。人重组FVIIa的商业制剂售为NovoSevenTM。NovoSevenTM被指出用于治疗血友病A或B患者中的出血发作。
血友病B由影响血的凝固性质的称之为因子IX的血浆蛋白的缺乏导致。病症由遗传的X-连接的隐性特性导致，缺陷基因位于X染色体。由此，病症发生主要在雄性。人因子IX是维生素K-依赖性酶原，其在血凝固中起到重要作用。因子IX作为具有55,000Da的分子质量的415个氨基酸单链酶原循环，且在正常血浆中以约5μg/ml存在。
几种商业形式的因子IX浓缩物可用于提供为患有血友病B的患者的取代治疗。例如，源于血的因子IX复合物产品(含其他因素)以Bebulin VHTM(Baxter Healthcare，Vienna，Austria)，konyne 80TM(Bayer Corporation，Elkhart Ind.)，Profilnine SDTM(Alpha Therapeutic Corporation，Los Angeles Calif.)，及ProplexTM(Baxter Healthcare，Glendale Calif.)品牌出售。多少更纯化的形式的因子IX产品以Alphanine SDTM(Alpha Therapeutic Corporation，Los Angeles Calif.)和MononineTM(Aventis Behring，Kankakee Ill.)品牌出售。有关重组制备的因子IX浓缩物，一种产品，其目前以Benefix.TM(Wyeth/Genetics Institute，Cambridge Mass.)可利用。
其他凝血因子的重组合成和纯化和这些因子并合到本发明的制剂在本领域技术人员的能力之内。
因子和PEG-Hb制剂可以任何实践和有效方式并入。由此，在例示实施方式中，因子和PEG-Hb在将得到的组合物施用于受试者之前不久合并。在其他例示实施方式中，因子-PEG-Hb制剂制备及存储适当的时间。
在例示实施方式中，本发明提供存在2种(或更多)组分且在它 们组合之前独立地存储的试剂盒。例如，在各种实施方式中本发明提供用于组合因子和PEG-Hb制剂的装置。装置包括第1容器，其用于收集或存储因子；及至少一个卫星容器，其与保存PEG-Hb制剂的第1容器流通连接。在使用中，断裂密封屏障被插入第1和卫星容器之间，使得密封破裂后，制剂的2种组分可混合及随后施用于有需求的受试者。如本领域技术人员会同意，可利用描述的装置的相当体且其落到本公开的精神和范围之内。例如，试剂盒可包括2个或更多安瓿，各含有液体或干形式的本发明的组合制剂的元件。在给有需求的受试者施用组合制剂之前，可将安瓿的内容物在适当的时间和以适当的方式混合。
在另一例示实施方式中，本发明提供NO源和本发明的PEG-Hb制剂之间的组合制剂。但是，本发明的此实施方式通过参考各种NO-供体分子阐释，本领域技术人员会容易同意，NO源不限于这些例示例证及可将其他NO源掺入本发明的组合制剂。
氧化氮(NO)是在抗-血小板聚集和抗-血小板活化，血管松弛，神经传递和免疫应答中起到重要生理学作用的重要的细胞内及细胞间信使分子。NO(氧化氮)是在诸多功能中尤其降低血压及抑制血小板功能的生物学″信使分子″。NO自由地从内皮相血管平滑肌和血小板扩散，且扩散穿过神经元突触而引发生物学应答。
剥夺血和氧的组织经历缺血性坏死或梗塞，有可能的不可逆器官损伤。一旦向器官或组织的血和氧流恢复(再灌注)，器官不立即返回正常局部缺血前状态。缺血后功能障碍可由于各种因素。氧自由基可起到作用，如已展示在挫抑的心肌中自由基的产生，且自由基清除剂已显示衰减收缩性功能障碍。早期再灌注期间的损伤的细胞内钙操作及钙过载可贡献于缺血后功能障碍。
已良好建立，由于自由基的过量的氧化应激可损伤生物学组织。细胞和组织的天然的防御运转已进化为保护细胞和组织抵御高水平的氧化应激的抗氧化剂机理。在我们的富氧气氛中，在应激的某些时间氧的存在可有害；此被称为缺氧后意识障碍及涉及氧在产生及参与自 由基处理中的作用。在与向组织的局限的血流时期关联的某些疾病状态(诸如心脏病，中风及向绝境的局限的流)中，无流的间歇性发作，然后是血的再流构成缺血/再灌注(I/R)氧化应激。
本文所用的术语NO供体包括任何释放，递送或转移一氧化氮的化合物，包括，例如，S-亚硝基硫醇，亚硝酸盐，硝酸盐，S-硝基硫醇，斯得酮亚胺(sydnonimine)，2-羟基-2-亚硝基肼，(NONOate)，(E)-烷基-2-((E)-肟基)-5-硝基-3-己烯酰胺(FK-409)，(E)-烯丙基-2-((E)-肟基)-5-硝基-3-己烯胺，N-((2Z，3E)-4-乙基-2-(肟基)-6-甲基-5-硝基-3-庚烯基)-3-吡啶羧酰胺(FR 146801)，N-亚硝基胺，N-羟基亚硝基胺，亚硝基亚胺，二氮杂环丁烯二氧化物，噁三唑5-亚胺，肟，羟胺，N-羟基胍，羟基脲，苯并呋喃唑酮，呋喃唑酮以及合成氧化氮的内源性酶的底物。
适合的NONOate包括，但不限于，(Z)-1-(N-甲基-N-(6-(N-甲基-铵基己基)氨基))二氮烯-1-鎓-1，2-二油酸酯(″MAHMA/NO″)，(Z)-1-(N-(3-铵基丙基)-N-(n-丙基)氨基)二氮烯-1-鎓-1，2-二油酸酯(″PAPA/NO″)，(Z)-1-(N-(3-氨基丙基)-N-(4-(3-氨丙基铵基)丁基)-氨基)二氮烯-1-鎓-1，2-二油酸酯(精胺NONOate或″SPER/NO″)和钠(Z)-1-(N，N-二乙基氨基)二氮烯鎓-1，2-二油酸酯(二乙基胺NONOate或″DEA/NO″)和其衍生物。NONOate也描述于U.S.专利No.6,232,336，5,910,316和5,650,447，其公开内容通过引用整体并入本文。″NO加合物″可为在各种天然地敏感的或人工提供的结合位点对于生物学活跃的形式的一氧化氮单-亚硝基化的，聚-亚硝基化的，单-亚硝化的和/或聚-亚硝化的。
适合的呋喃唑酮包括，但不限于，CAS 1609，C93-4759，C92-4678，S35b，CHF 2206，CHF 2363，等。
适合的斯得酮亚胺包括，但不限于，吗多明(N-乙氧基羰基-3-吗啉代斯得酮亚胺)，SIN-1(3-吗啉代斯得酮亚胺)CAS 936(3-(顺式-2，6-二甲基哌啶基)-N-(4-甲氧基苯甲酰)-斯得酮亚胺，哌多明)，C87-3754(3-(顺式-2，6-二甲基哌啶基)斯得酮亚胺，林西多明，C4144 (3-(3，3-二甲基-1，4-噻嗪烷-4-基)斯得酮亚胺盐酸盐)，C89-4095(3-(3，3-二甲基-1，1-二氧杂-1，4-噻嗪烷-4-基)斯得酮亚胺盐酸盐，等。
适合的肟，包括但不限于，NOR-1，NOR-3，NOR-4等。
一组NO加合物是S-亚硝基硫醇，其为包括至少一个SNO基团的化合物。这些化合物包括S-亚硝基-多肽(术语″多肽″包括不具有查明的生物学功能的蛋白和聚氨基酸，及其衍生物)；S-亚硝基化的氨基酸(包括天然的和合成氨基酸和它们的立体异构体和外消旋混合物和其衍生物)；S-亚硝基化的糖；S-亚硝基化的，修饰的及未修饰的，寡核苷酸(优选至少5，及更优选5～200个核苷酸)；直链或分支的，饱和的或不饱和的，脂肪族或芳族，取代的或未经取代的S-亚硝基化的烃；及S-亚硝基杂环化合物。S-亚硝基硫醇和制备它们的方法描述于U.S.专利No.5,380,758和5,703,073；WO 97/27749；WO98/19672；及Oae et al，Org.Prep.Proc.Int.，15(3)：165-198(1983)，公开内容各通过引用整体并入本文。
另一适合的NO供体类是S-亚硝基氨基酸，其中亚硝基被连接到含有硫的氨基酸或其衍生物的硫基。该化合物包括，例如，S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸，S-亚硝基-卡托普利，S-亚硝基-N-乙酰青霉胺，S-亚硝基-高半胱氨酸，S-亚硝基-半胱氨酸，S-亚硝基-谷胱甘肽，S-亚硝基-半胱氨酰-甘氨酸等。
适合的S-亚硝基化的蛋白包括来自各种功能类的含有巯基的蛋白(其中NO基团附接于氨基酸或其氨基酸衍生物上的1个或更多硫基)，包括酶，诸如组织-类型纤溶酶原活化物(TPA)和组织蛋白酶B；运输蛋白，诸如脂蛋白；血红素蛋白，诸如血红蛋白和血清白蛋白；及生物学保护性蛋白，诸如免疫球蛋白，抗体和细胞因子。该亚硝基化的蛋白描述于WO 93/09806，其公开内容通过引用整体并入本文。例包括聚亚硝基化的白蛋白，其中蛋白中的1个或更多巯基或其他亲核中心被修饰。
本发明中使用的另一组NO加合物，其中NO加合物是提供，转移或释放氧化氮的化合物，包括化合物，其包含至少一个ONO或ON- N基团。包括至少一个ONO-或ONN基团的化合物优选为ONO或ONN-多肽(术语″多肽″包括不具有查明的生物学功能的蛋白和聚氨基酸，及其衍生物)；ONO或ONN-氨基酸(包括天然的和合成氨基酸和它们的立体异构体和外消旋混合物)；ONO-或ONN-糖；ONO或ONN修饰的或未修饰的寡核苷酸(包含至少5个核苷酸，优选5～200个核苷酸)；ONO或ON直链或分支的，饱和的或不饱和的，脂肪族或芳族，取代的或未经取代的烃；及ONO，ONN或ONC-杂环化合物。包含至少一个ON-O或ON-N基团的化合物的优选的例包括亚硝酸丁酯，异丁基亚硝酸酯，亚硝酸叔-丁酯，亚硝酸戊酯，异戊基亚硝酸酯，N-亚硝基胺，N-亚硝基酰胺，N-亚硝基脲，N-亚硝基胍，N-亚硝基氨基甲酸酯，N-酰基-N-亚硝基化合物(诸如，N-甲基-N-亚硝基脲)；N-羟基-N-亚硝基胺，铜铁试剂，阿拉诺新，抑多巴素，1，3-二取代的亚硝基亚氨基苯并咪唑，1，3，4-噻二唑-2-亚硝基亚胺，苯并噻唑-2(3H)-亚硝基亚胺，噻唑-2-亚硝基亚胺，寡亚硝基斯得酮亚胺，3-烷基-N-亚硝基-斯得酮亚胺，2H-1，3，4-噻二嗪亚硝基亚胺。
本发明中使用的另一组NO加合物包括提供，转移或释放氧化氮的硝酸根，诸如包含至少一个O2NO，O2NN或O2NS基的化合物。这些化合物中优选：O2NO，O2NN-或O2NS多肽(术语″多肽″包括不具有查明的生物学功能的蛋白和聚氨基酸，及其衍生物)；O2NO，O2NN或O2NS氨基酸(包括天然的和合成氨基酸和它们的立体异构体和外消旋混合物)；ONO，O2NN或O2NS糖；O2NO-，O2NN或O2NS修饰的及未修饰的寡核苷酸(包含至少5个核苷酸，优选5～200个核苷酸)；O2NO，O2NN或O2NS直链或分支的，饱和的或不饱和的，脂肪族或芳族，取代的或未经取代的烃；及O2NO，O2NN或O2NS杂环化合物。包含至少一个O2NO，O2NN或O2NS基的化合物的优选的例包括：二硝酸异山梨酯，单硝酸异山梨酯，氯硝甘油，丁四硝酯，甘露糖醇六硝酸酯，硝酸甘油，五赤藓酮糖醇四硝酸酯，戊硝醇，丙帕硝酯和与含有巯基的氨基酸的有机硝酸酯诸如，例如SPM 3672，SPM5185，SPM 5186和公开于U.S.专利No.5,284,872，5,428,061， 5,661,129，5,807,847和5,883,122和WO 97/46521，WO 00/54756和WO 03/013432的那些，各公开内容通过引用整体并入本文。
另一组NO加合物是提供，转移或释放氧化氮的N-氧代-N-亚硝基胺，及以下式表示：R1″R2″NN(OM+)NO，其中R1″和R2″各独立地是多肽，氨基酸，糖，修饰的或未修饰的寡核苷酸，直链或分支的，饱和的或不饱和的，脂肪族或芳族，取代的或未经取代的烃，或杂环基，且其中M+是有机或无机阳离子，诸如，例如，烷基取代的铵阳离子或组I金属阳离子。
与NO供体组合，可给受试者施用治疗有效量的增强NO的治疗效果的第2化合物。第2化合物可为，例如，磷酸二酯酶抑制剂(例如，2-o-丙氧基苯基-8-氮杂嘌呤-6-酮[扎普司特TM]，双嘧达莫，茶碱，西地那非[ViagraTM]，或1，3-二甲基-6-[2-丙氧基-5-甲磺酰氨基苯基]-吡唑基[3，4-D]嘧啶-4-[5H]-酮)或超氧化物歧化酶。第2化合物可替代性地为抗血栓剂，诸如噻氯匹定，链激酶，尿激酶，t-PA或其类似物(例如，met-t-PA，RetevaseTM或FE1X)，肝素，水蛭素或其类似物(例如，Hurulog.TM.)，非-甾体抗-炎性制剂(例如，吲哚美辛或阿司匹林)，糖皮质类固醇(例如，泼尼松)或细胞毒性剂(例如，甲氨喋呤)；或抗-白细胞制剂诸如抗-白细胞抗体。
氧化氮的施用已用于预防和治疗缺血/再灌注损伤。见，例如，U.S.专利No.6,656,452和该文引用的参考文献。因此，本发明的另一目的是提供基于血红蛋白的血液代用品制剂，其包括用于治疗缺血-再灌注损伤的NO源。在例示实施方式中，将本发明的血液代用品与NO-供体分子组合。可在生产血液代用品的时间或在最初生产随后的任何点组合。例如本发明提供2-隔室装置或2个分离的容器。在一个隔室或容器中保存血液代用品，且在第2隔室或容器中供给NO-供体分子。给有需求的受试者施用之前，将2个隔室或容器的内容物混合及将得到制剂施用于受试者。
在各种实施方式中，本发明的制剂还包括超氧化物歧化酶或过氧化氢酶。这些蛋白本身任选地缀合于水溶性聚合物，例如，PEG。
在例示实施方式中，本发明提供制剂，其用于治疗，改善，防止或减少对施用制剂的受试者的一种或更多组织的缺血/再灌注损伤和/或氧化应激。
在例示实施方式中，本发明提供存在2种(或更多)组分且在它们组合之前独立地存储的试剂盒。例如，在各种实施方式中本发明提供用于组合NO供体和PEG-Hb制剂的装置。装置包括第1容器，其用于收集或存储NO供体；及至少一个卫星容器，其与保存PEG-Hb制剂的第1容器流通连接。在使用中，断裂密封屏障被插入第1和卫星容器之间，使得密封破裂后，制剂的2种组分可混合及随后施用于有需求的受试者。如本领域技术人员会同意，可利用描述的装置的相当体且其落到本公开的精神和范围之内。例如，试剂盒可包括2个或更多安瓿，各含有液体或干形式的本发明的组合制剂的元件。在给有需求的受试者施用组合制剂之前，可将安瓿的内容物在适当的时间和以适当的方式混合。
在以上所示的各组合制剂中，PEG-Hb可结合氧，一氧化碳或两者皆不。PEG-Hb本身或整个制剂可配制成相对受试者的血张度的低渗剂，等渗剂或高渗剂。
【使用方法】
存在对治疗或预防由失血(例如，来自急性出血或在手术操作期间)所致，由贫血(例如，恶性贫血或镰刀状细胞贫血)所致，或由休克(例如，血量缺乏休克，过敏性休克，脓毒性休克或过敏性休克)，心肌梗塞，中风或创伤性脑损伤所致的低氧的氧转移制剂的需求。额外地需要高氧合肿瘤，以改善放射治疗或化学治疗的治疗效果。本发明提供化合物和方法，如以上例示的，对于治疗及预防这些和与失血，缺血或低氧，例如关联的其他病情有用。
本文所示的各制剂用于治疗和预防与休克，出血，贫血或血的氧携带功能的其他功能障碍关联的病情的各种方法。本发明的方法用于治疗或预防缺血-再灌注损伤，包括由手术(例如，移植手术(尤其肾或心脏移植手术)或心转流手术)，血栓溶解，中风，创伤-诱导的临 时低血压，或血管介入过程诸如斑块切除术或血管成形术(包括使用激光，气球或支架)导致的那些。方法可用于治疗或预防经皮经腔冠状血管成形术之后的缺血-再灌注损伤。治疗或预防的损伤可在任何非-肺部组织，包括肾，心脏或脑发生。
低血容量休克是特定形式的休克，其中心脏不能向身体供给足够的血由于失血或不充足的血量。大致1/5或更多正常血量的损失产生低血容量休克。损失可来自任何成因，包括外部出血(来自切割或损伤)，消化道出血，其他内部出血，或来自由其他体液的过量损失所致的减小的血量(诸如可随着腹泻，呕吐，烧伤等等发生)。一般而言，更大和更快速血量损失导致更严重的休克症状。一般而言，患更弱程度的休克的患者倾向于相比患有更严重的休克的那些更佳。但是，在严重的低血容量休克的情况中，即使立即医疗照护，仍可能死亡。老人处于具有来自休克的不良结果的增加的风险中。
在战斗中，子弹及自爆炸弹药的穿透碎片常导致威胁生命的出血。The Life Science Research Office估计，放血性出血是达50％的受伤的士兵冲突后死亡的死亡机理，且被认为是潜在地可救助的战场伤亡中死亡的主要原因。自受伤的肢的出血单独已占全部战斗死亡的几乎1/10，其部分被认为是提供适当的院前护理而可阻止的。
贫血是当血缺乏健康红细胞时发展的任何病情的一般术语。或者，可有足够的红细胞，但它们缺乏血红蛋白。贫血是美国最常见的血病情，影响约3.5百万美国人。患有慢性疾病的女性和人处于所述病情的增加的风险中。有多于400种类型的贫血，其可广泛地分类为3个类别：(1)通过失血导致的贫血，(2)通过降低的或错误红细胞产生导致的贫血，或(3)通过红细胞破坏导致的贫血。
无论成因，有显著的数的个体患有一些形式的临床氧缺乏，其可通过使用PEG-Hb制剂改善。对该产品的需求和商业机会几乎无止境。例如，镰刀状细胞贫血在美国是最常见的遗传的血病症，影响约72,000美国人。危机期间，其特别疼痛及衰弱。可想象每月用单个单位的PEG-Hb治疗这些患者来阻止危机及氧合组织。对此单独适应症，此 会需要864,000U的PEG-Hb。
当毛细管或更大动脉阻塞时，诸如通过血管收缩或阻断或部分阻断血管的固体栓塞，对于就氧依赖于那些血管的组织，氧供给变得缓和。从未能运输足够的氧，常常由于不充足的血流即缺血产生组织低氧。低氧可产生自内部出血(例如，产生脑低氧的脑内出血)，贫血或创伤。缺血是由于血管的功能收缩或实际梗阻导致的向组织的氧供给缺乏。例如，心肌缺血是由于冠状动脉的梗阻或收缩所致的向心脏肌肉的氧供给缺乏。如果缺血持续多于几秒钟，组织损伤可自一系列与缺血-诱导的组织低氧关联的复杂的生物化学事件产生。
由栓塞产生的低氧或缺血性条件可导致特别削弱性的组织损伤，如果损伤的组织是心脏组织或中枢神经系统(CNS)的神经组织。栓塞的2种最严重的结果是由心脏肌肉缺血所致的心脏病(急性心肌梗塞或AMI)，及由脑组织缺血所致的中风。不导致AMI或中风的缺血可，虽然如此，产生严重的个体症状，诸如胸疼痛(心绞痛)，部分麻痹，意识错乱，定向障碍和/或记忆丧失。
患有血管疾病，特别动脉粥样硬化的个体特别处于可导致AMI或中风的发展栓塞的风险。缺血性心脏病在全世界影响百万人，常常导致由AMI突然死亡。当由移动及运动通过循环系统的噬斑部分产生的固体栓塞安置在毛细管中或附接于血管中的另一噬斑沉淀物时可得缺血，由此完全或部分阻塞血管或毛细管。在操作或搅乱任何动脉粥样硬化性血管(例如，颈动脉，冠状，主动脉，股或腘容器)的血管和心脏手术过程期间(例如套管插入术，夹紧)也可产生粥样硬化性噬斑粒子。
因此，本发明提供将氧递送到选自需求该递送的受试者的组织和器官的成员的方法。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以实现将氧递送到一种或更多组织和/或器官的量的本发明的任何组合物。在例示实施方式中，方法用于治疗病情，诸如低氧，缺血，贫血及镰刀状细胞贫血。
在各种实施方式中，本发明提供逆转选自患有出血性休克的受试者的组织和器官的成员中的氧债的方法。在例示实施方式中，方法包 括给受试者施用足以逆转氧债的量的本发明的任何组合物。
在各种实施方式中，本发明提供诱导受试者的组织中的血管发生的方法，包括给受试者施用对于诱导血管发生有效的量的本发明的组合物。在例示实施方式中，血管发生在患有氧缺乏的组织中诱导。在还例示实施方式中，诱导血管发生的组织或器官是患有氧缺乏的受试者的组织或器官。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以逆转氧缺乏的量的本发明的任何组合物。
在各种实施方式中，本发明提供增加向患有氧缺乏的组织的血流的方法。方法由以下步骤组成：给受试者施用对于增加向患有氧缺乏的组织的血流有效的量的本发明的组合物。在例示实施方式中，组织或器官是患有血流不良的受试者的组织或器官。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以逆转血流不良的量的本发明的任何组合物。
在各种实施方式中，本发明提供降低患有氧缺乏的组织中的神经学损伤和/或梗塞的组织的方法。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以降低患有氧缺乏的组织中的神经学损伤和/或梗塞的量的本发明的组合物。在例示实施方式中，方法包括给受试者施用足以逆转梗塞的和/或神经学损伤的组织的量的本发明的任何组合物。
可接收通过本发明的方法形成的氧转移制剂的受试者，包括哺乳动物，诸如人，非-人灵长类动物，狗，猫，大鼠，马或绵羊。而且，可接收氧转移制剂的受试者包括胎儿(出生前受试者)，出生后受试者或出生时的受试者。
可将本发明的组合物通过一种或更多注射方法通过直接和/或间接将组合物注射进受试者的循环系统来施用进循环系统。直接注射方法的例包括血管内注射，诸如静脉内和动脉内注射，及心内注射。间接注射方法的例包括腹膜内注射，皮下注射，使得氧转移制剂会通过淋巴系统运输到循环系统或利用套针或导管注射进骨髓。优选地，将氧转移制剂静脉内施用。
被治疗的受试者可在输注本发明的组合物之前，期间和/或之后是 血容量正常，血容量过多或低血容量的。组合物可通过方法诸如顶部装载及通过交换方法导入循环系统。
本发明的组合物可治疗性地施用，以治疗由许多不同成因包括部分或全体循环系统中RBC流减少，贫血和休克所致的受试者中的低氧组织。而且，氧转移制剂可预防性地施用以阻止受试者中组织的氧-耗尽，其可产生自向受试者组织或贯穿循环系统的RBC流的可能的或预期的减小。本发明的组合物用于治疗或预防性地治疗低氧。
在例示实施方式中，本发明提供通过给受试者施用足以提供治疗的量的本发明的制剂来治疗病，损伤或损伤。血红蛋白为CO形式。在例示实施方式中，此缀合物配制进磷酸盐缓冲液。
在各种实施方式中，本发明的PEG-Hb-CO制剂用于治疗缺血。可通过此制剂治疗的例示类型的缺血是外周缺血，诸如外周糖尿病性缺血，及缺血的下游效应。如本领域技术人员会同意，本发明的组合物也用于治疗其他形式的缺血。
在各种实施方式中，本发明提供通过给受试者施用足以提供治疗的量的本发明的制剂来用于治疗病，损伤或损伤。血红蛋白是脱氧的或可为CO形式及配制进高渗盐溶液。这些制剂中使用的例示盐浓度为约4％～约8％，约4.5％～约7.5％或约5％～约7％。例示制剂包括约4％，约5％，约6％，约7％或约8％盐。在一种制剂中，盐浓度是7.5％。在各种实施方式中，盐是NaCl。在各种实施方式中，此制剂用于处理镰刀状细胞贫血，中风，心肌梗塞或创伤性脑损伤。
在例示实施方式中，本发明的PEG-Hb-CO用于增加血管发生，增加血管舒张，保护心脏和肾免于缺血，活化线粒体KATP通道，降低内皮白细胞粘接和浸润，降低巨噬细胞及小胶质细胞活化，和/或保护脑血管血管反应性免于发作-诱导的功能障碍。因此，本发明提供使用本发明的组合物来达到该结果的方法。
一般，本发明的氧转移制剂的适合的剂量，或剂量的组合是当在血浆中含有时，会导致受试者的血浆中的总血红蛋白浓度在约0.1～约10g Hb/dl之间，或约1～约4g Hb/dl或更适合范围的量，如果需要弥 补大量失血。
可将本发明的组合物以任何有用的方式施用于受试者。例如，在一实施方式中，组合物施用是以预定的速度连续输注预定的时期。在例示实施方式中，将本发明的组合物的负荷剂量施用合理的短时期。此初始“猝发”之后是经至少约6小时，至少约12小时，至少约18小时或至少约24小时施用第2量的制剂。在各种实施方式中，第2量是初始“猝发”的至少约60％，至少约80％，至少约100％或至少约120％的剂量。
例示本发明的组合物包括约3％～约6％的量的PEG-Hb缀合物。例示组合物包括约4％的量的PEG-Hb缀合物。
广义上，本发明也提供基于合成血红蛋白-水溶性聚合物缀合物的氧转移制剂用于生产用于低氧组织再氧合的药物的用途。低氧可由于任何损伤，损伤或疾病，包括但不限于手术创伤，缺血，贫血，心肌梗塞，中风，休克，糖尿病和创伤性脑损伤，其中氧携带药物全身施用到具有或怀疑具有一个或更多具有氧缺陷的组织的个体。
在以上所示的各方法中，PEG-Hb可结合氧，一氧化碳或两者皆不。PEG-Hb本身或整个制剂可配制成相对于受试者的血张度是低渗剂，等渗剂或高渗剂。
提供以下实施例来例证本发明的选定的实施方式，且不解释为限制其范围。
【实施例】
【实施例1】
【血红蛋白的纯化】
此第1步骤涉及洗涤血细胞无血浆。在桌面规模，此通过重复的洗涤，离心及滗析实现。此处理相比垂直连续流离心显得更有效。
将红细胞用缓冲液(1.2％NaCl，及10mM磷酸盐，pH7.8)洗涤4×。然后通过经2小时时期慢添加1.5体积的WFI来将红细胞裂解(无真细胞裂解地提取血红蛋白)。通过采样导电性监控裂解状态(再次， 血红蛋白提取)直到其在5.50～7.00μS范围内。使用放射计OSM3血氧计测定％Hb。也测试同渗质量摩尔浓度，且在130～150mOsmol的范围。一旦血红蛋白提取完成，将内容物通过1μm基于纤维素的厚度过滤器，然后是0.45/0.2μm无菌的基于聚砜的过滤器来加压过滤到作为用于下一步的贮器的第2箱。然后将血红蛋白溶液于10℃通过300Kd超滤器泵出到套箱，其作为初始病毒移出步骤及移出高分子量蛋白。
将血红蛋白使用10KD MWCO系统浓缩，然后通过经过中空纤维膜接触器再循环来脱氧，直到血红蛋白溶液具有少于10％Hb02。在接近氧移出期端添加稳定化剂，半胱氨酸至5mM的终浓度。稳定化剂辅助保持氧水平至少于10％，且也作用以在热灭活期期间保护血红蛋白。
【血红蛋白产生期间病毒灭活/移出步骤的发展】
在牛血红蛋白可用于用于人的产品之前，需要过程来灭活任何潜在病毒污染物，同时维持功能性地活跃的生物学蛋白。FDA要求动物产品来源的蛋白的病毒灭活。此通过暴露于60℃直到达到病毒灭活来实现，在此情况持续4小时。然后将溶液冷却，及0.45/0.2μ过滤到把持箱。这是纯化的血红蛋白。产品通过FPLC经历QC分析(单峰)，可见光谱分析(在540nm和577nm处的峰)，SDS凝胶电泳，％Hb，％HbO2，％MetHb，pH，同渗质量摩尔浓度，内毒素，脂质及游离的铁。
如描述于图1，机械地脱氧的血红蛋白经病毒热灭活，且此热灭活的牛血红蛋白是纯的。机械地脱氧的血红蛋白的热灭活处理，以及添加还原剂维持低水平的MET-Hb(少于10％)，而保持其完整性，如通过下表(表1)证明。相关于％tHb和％METHb，暴露于60℃持续10小时对脱氧的(脱氧)形式的产品(添加5mM半胱氨酸)无影响。此不是不用半胱氨酸的脱氧的形式的牛血红蛋白的情况，其中约40％的蛋白损失。
表1：血红蛋白的脱氧使产物对于热灭活稳定
【血红蛋白的聚乙二醇化】
添加稀释缓冲液(25mM磷酸钠，120mM碳酸氢钠和4.5％NaCl，pH8.0)，以使得血红蛋白溶液达到4～5％浓度。血红蛋白使用17∶1摩尔比的PEG对血红蛋白来聚乙二醇化。反应维持在pH7.6～7.8，和使反应进行1小时。在此点，可使用2种处理之一。
【处理A】
加入15mM半胱氨酸以停止反应。存储之后，使溶液于4℃过夜，将溶液对20体积的缓冲液(5.0mM碳酸氢钠，1.0mM磷酸钠，150mM氯化钠，4.7mM氯化钾，2.5mM硫酸镁，0.5mM氯化钙，pH8.1)使用50Kd截止值膜透析。然后将PEG-Hb稀释至4％Hb，添加右旋糖(5mg/mL)和半胱氨酸(5mM)，及将溶液通过中空纤维膜接触器循环，直到％HbO2在10％以下。然后将溶液无菌地过滤进血袋。产物会通过FPLC经历QC分析(单峰)，可见光谱分析(在540nm和577nm处的峰)，SDS凝胶电泳，％Hb，％HbO2，％MetHb，pH，同渗质量摩尔浓度，内毒素，脂质及游离的铁。
【处理B】
加入15mM半胱氨酸以停止反应。存储之后于4℃过夜，使溶液对20体积的缓冲液(5.0mM碳酸氢钠，1.0mM磷酸钠，150mM氯化钠，4.7mM氯化钾，2.5mM硫酸镁，0.5mM氯化钙，pH8.1)使用50Kd截止值膜透析。然后将PEG-Hb稀释成4％Hb，添加右旋糖(5mg/mL) 和L-半胱氨酸(5mM)，及将溶液通过伴随恒定混合缓慢鼓入一氧化碳通过溶液来放入一氧化碳形式，直到％氧少于‘0’和一氧化碳(CO)在95％或更高。然后将溶液无菌地过滤进血袋。产物通过FPLC经历QC分析(单峰)，可见光谱分析(峰在540nm处和577nm)，SDS凝胶电泳，％Hb，％HbO2，％MetHb，pH，同渗质量摩尔浓度，内毒素，脂质及游离的铁。
此外，热灭活的血红蛋白是聚乙二醇化的，且得到的PEG-Hb是纯和活跃的。
图1：PEG-Hb于37℃的稳定性
经过120天的时期，于37℃存储的样品中％总Hb，％MET-Hb，％HbCO和％HbO2无变化(图1)。
【一氧化碳形式的PEG-Hb的开发】
这些研究的目标是开发一氧化碳(CO)形式的PEG-血红蛋白。此形式呈现为特别稳定，被认为保持％MET-Hb形成低，如显示于图1。此相比机械地脱氧的形式更稳定。
此外，将CO形式的PEG-Hb于4℃保存和在8周存储之后仅1.0％转化为MET-Hb。此相同批次的CO形式的PEG-Hb于4℃持续12周之后具有1.3％MET-Hb。此外，于18℃保存持续6周的CO形式的PEG-Hb发现包括7.9％MET-Hb，于18℃持续10周结束时其上升到16.7％MET-Hb。
【PEG-Hb/HS逆转氧债的功效】
在测试我们的PEG-Hb/HS在氧合组织中的活性的初步研究中，测试其在严重的创伤性休克的猪模型中增加向组织的氧递送及逆转氧债的能力。
氧债是低于维持耗氧代谢需要的水平的全身氧消费的程度的量度。其为已展示关联及预测存活，及创伤诱导的出血性休克之后器官衰竭的并发症的一种生理学变量。在模型中，使动物出血到预定的氧债，以减少动物之间的变异性，因此效应不依赖于失血或内源性血红蛋白的量。允许模型连续测量氧消费(VO2)，二氧化碳产生(VCO2)，混合的静脉血红蛋白氧饱和度(SvO2)，动脉血红蛋白氧饱和度(SaO2)，氧提取比(OER)，氧债，心律，血压，脑组织血红蛋白氧饱和度(StO2脑)，肩骨骼肌组织血红蛋白氧饱和度(StO2肩)，心脏输出(CO)以及测量骨骼肌，肝，肠粘膜，口腔粘膜，及肾中的PO2。
在模型中，出血伴随双侧后肢骨骼肌损伤和股骨断裂，以产生对抗关联组织损伤。此类型的组织损伤展示独立地影响组织氧递送及导致相比单独出血，在内脏血流中更大减小。使用撞击器将骨骼肌损伤和股骨损伤之后，使动物出血至80mL/kg的预定的氧债。出血至均一的氧债确保全部动物在它们的最终预处理损伤中具有有限的变异性，和与压力驱动的出血不同地，大大减少移出的体积的变动性。在这些动物中，连续及累积监控氧债。氧债基于骨骼肌损伤之前取的基线值以下的VO2的偏差，及每10s测量一次。
损伤后，动物的氧债在出血期间攀升。在当损伤的动物中的达到100％的靶标的氧债(80mL/kg)时，动物经15min时间(复苏时期)接收500cc的PEG-Hb(4％的PEG-Hb浓度和5～7.5％的高渗盐溶液)的输注。施用PEG-Hb之后，氧债快速逆转(4个损伤的动物的平均的结果)。在复苏时期期间组织氧合增加与氧债的变化平行，然后稳定3小时时期。
与PEG-Hb形成对比，用500mL的羟乙基淀粉(Hespan)治疗2个动物，创伤患者的标准治疗，不产生氧债逆转，也非Oxyglobin， 由Biopure作为血液代用品开发了HBOC产品。这些发现是重要的，因为首先它们显示目前用于创伤的治疗在氧合组织中无效，由此可能在经历出血性休克的患者中产生有限效应。其次，它们显示，已在人中广泛地测试且在临床试验中失效的产物之一，Oxyglobin，无法氧合组织。本发明的组合物逆转氧债的事实明显表明，本发明的组合物和Biopure非常不同，且PEG-Hb/HS在治疗创伤中的潜力不应基于其他HBOC的失败来判断。
此外，用500cc的浓集红细胞治疗的2个损伤的动物具有预期的氧债减小。但是，逆转的量值不呈现入通过PEG-Hb诱导的大。重要的是，即便浓集红细胞治疗与PEG-Hb产生相同的效应，这些结果会支持PEG-Hb作为血液代用品的用途，由于HBOC的目标是如输血一样有效。
除了测试氧债及向组织的氧递送的变化之外，我们也测量了出血的动物中的舌下微循环，作为出血之后组织的再灌注测量。也定性地测量了功能毛细管密度，作为观察区上全部血管的总长度，作为组织灌注的测量。出血期间观察到，毛细管密度显著降低。相反，PEG-Hb治疗使密度在研究快结束时回到接近于基线正常水平。此发生，尽管末尾血红蛋白水平从12.3g/dl的基线落下到7.1g/dl。如所注意的，相比羟乙基淀粉或浓集红细胞，PEG-Hb输注增强功能毛细管密度至更大程度。
【实施例2】
原理：在通过股动脉结扎诱导的后肢缺血鼠模型中，相比非-糖尿病性动物，患糖尿病的小鼠显示显著损伤的血流恢复和血管发生应答。在此研究中，我们测试了施用Sanguinate会辅助恢复血流和血管发生的假说。
方法和结果：用链脲霉素(stz)致使6周龄的C57BL/6小鼠成为糖尿病，且使12周龄的C57BL/6小鼠经历FA结扎然后是经腹膜内(i.p.)注射每天施用Sanguinate(20ml/kg/天)持续4周。媒质处理 的糖尿病性小鼠每天接收用等同体积的1×PBS的i.p.注射。相比媒质处理的组，用Sanguinate治疗的糖尿病性小鼠在FA结扎之后第28天通过激光多普勒分析在显示显著改善的血流比率(缺血/假)(63.36±5.83对比44.39±4.13BFR(％)，n≥9，p＝0.019)。相比媒质处理的组，在FA结扎之后第28天用SanguinateTM治疗的糖尿病性小鼠中，在肌肉组织上用CD31的免疫组织化学染色展示显著增加的微血管密度(663.86±57.78对比461.44±36.19毛细管/mm2，p＜0.0001)。总之，这些数据揭示Sanguinate在小鼠模型中糖尿病性肢缺血中的显著治疗效果，且可提供使用此制剂在长期糖尿病中作为互补血管-救助治疗的基础。
流程：用链脲霉素致使C57BL/6小鼠成为1型糖尿病(多个低-剂量注射)。糖尿病诱导之后1个月，使小鼠经历单侧后肢缺血。在此研究中监控血流和血管发生。
过程：在小鼠上股上制造皮肤切口。使左腿经历手术过程，且右腿经历同一过程，除了未进行股之外动脉结扎。暴露腹股沟韧带和股动脉的上半部。用2个无菌8/0非-可吸附的丝缝线连接维管束，在近端在腹股沟韧带以下，及在远侧恰在分岔以上到浅表和深股动脉内。将连接到股血管的分离的段的全部动脉和静脉分支用8/0非可吸附的缝线打结。最终，在近端和远端绷带之间切静脉和动脉。用无菌5/0尼龙缝合线闭合皮肤切口。
小鼠#s和组：基于我们的初步研究，我们以＞15小鼠/组开始，以确保在研究末尾具有足够的小鼠，且具有足够的分析用组织。
使实验交错，以便进行额外的媒质处理的小鼠。
组#1-糖尿病性WT小鼠+20ml/kg/天Sanguinate(IP)，股动脉结扎之后立即开始
组#2-糖尿病性WT小鼠+PBS(20ml/kg/天IP)
【端点】
激光多普勒血流成像(第28天)注意到，在左(损伤的)和右腿(假)检查血流，然后报道为左/右比。报道糖尿病/Sanguinate和糖 尿病/PBS的值的平均值。
-使用染色至CD31和定量成像程序的血管发生的定量评定(第28天)(左腿)
【数据】
【端点#1：血管发生的定量评定】
在第28天，处死小鼠及回收股动脉结扎的分布中的后肢骨骼肌，及使用抗-cD31 IgG经历免疫组织化学。检索系列图像及进行图像分析，以测定Sanguinate对血管发生的效应：
组/处理 毛细管/mm 2
假腿/媒质 805.60±55.60
假腿/药物 763.40±9.39
缺血性腿/媒质 461.44±36.19＊
缺血性腿/药物 663.86±57.78 ＊＊
＊＊表示p＜0.001缺血性腿/媒质
＊表示p＜0.001对比假腿/媒质
【端点#2：血流恢复】
使用激光多普勒成像评定比较连接的股动脉肢/对侧(假)肢的％血流恢复。在这些研究中，报道损伤的腿和其对侧假腿之间的比，从而考虑基础血管功能障碍。数据如下：
组/处理 ％血流恢复
缺血性腿/假媒质 44.38±12.38
缺血腿/假药物 63.36±18.43 ＊
＊表示p＝0.0187
【结论】
相比使用媒质中的发现，向经历通过股动脉结扎诱导的后肢缺血的糖尿病性小鼠施用Sanguinate导致血管发生定量的显著改善。相比媒质(PBS)处理，向经历通过股动脉结扎诱导的后肢缺血的糖尿病性小鼠施用Sanguinate显著改善血流恢复，如通过激光多普勒成像测量。
【实施例3】
在麻醉的经历2小时的病灶脑缺血和1天的再灌注的大鼠中评价 聚乙二醇化的CO-血红蛋白(PEG-COHb)的输注效应。在羧基状态(PEG-COHb)保存PEG-Hb，以提供CO源，及减少自体氧化及增加货价期。在缺血的20分钟输注10ml/kg的PEG-COHb不改变动脉血压或增加缺血性核心中的红细胞通量。血浆血红蛋白仅增加到0.6g/dL，梗塞体积仍显著降低及神经学缺陷改善。PEG-COHb的早期顶部输注保护脑免于缺血性中风。
【手术准备】
全部过程获得Johns Hopkins大学Animal Care and Use Committee的批准。在雄性威斯塔大鼠(250～350g)中用5％异氟烷诱导麻醉，及在手术期间用约2％异氟烷经鼻锥伴随自发通气维持。异氟烷浓度在手术之后降低到约1.5％。吸入的O2是约25～30％。将导管插入股静脉用于输注和插入股动脉用于测量动脉血压及采样动脉血。在缺血和早期再灌注期间使用加热灯维持直肠温度。在头皮制备小切口和在侧顶骨制备小钻孔，直到仅薄量的骨余下。针对稀疏的骨固定1mm直径纤维光学探针。将探针连接于激光-多普勒流量计，其发射及接收近-红外光，及计算红细胞通量的相对变化。激光-多普勒通量信号用于评定缺血性时期期间血管阻塞的适当性。
由管腔内丝技术诱导瞬时病灶脑缺血来阻塞血流进入中脑动脉。通过侧切口暴露右颈总动脉及阻塞。将右颈外动脉解剖及结扎及分离及凝集颈外动脉的枕动脉分支。将右颈内动脉的近端翼腭动脉分支结扎，及将4-0单丝尼龙缝合线(有圆端)推进约2cm到颈内动脉。将丝位置调至产生激光-多普勒通量信号至少60％减小。在2小时阻塞之后，通过撤回管腔内缝合线开始再灌注。监控首个30min的再灌注之后，除去导管，用缝合线闭合切口，及中止麻醉。
【实验设计】
在Prolong Pharmaceuticals(South Plainfield，New Jersey)合成PEG-白蛋白和PEG-COHb。将纯化的牛Hb上的表面赖氨酸残基与5000分子量PEG缀合。将CO鼓入PEG-Hb溶液，以在存储之前将＞80％的PEG-Hb转变成PEG-COHb。含有4～6％蛋白的溶液在 2～10℃保存在无菌血袋中。研究3组的10只大鼠的组：(1)无输注，(2)牛PEG-白蛋白输注，及(3)牛PEG-COHb输注。在实验日，对等份的溶液加温及作为相当于10ml/kg体重的尖峰负荷输注。输注开始于20min的MCAO。静脉内输注速度是0.5ml/min及发生约5～7min。在2h的MCAO和30min的再灌注期间以15min间隔记录平均动脉压和激光-多普勒流的百分率变化。通过1h的再灌注监控直肠温度，如从麻醉恢复的动物在温环境中。对动脉血(～0.7ml)在基线，1h的MCAO，及30min的再灌注采样。在放射计血气分析仪(ABL80)上测量动脉血pH，PCO2，PO2和电解质。在放射计血氧计(OSM3)上测量动脉Hb浓度，O2饱和度，MetHb和COHb。分析来自样品的血浆的Hb浓度。以0～4计量评定大鼠的1和24h的再灌注时的神经学缺陷(0＝无缺陷，1＝放置期间无法伸展前肢，2＝圆形化，3＝单侧虚弱，及4＝无自发运动活性)。在24h，收获脑来测量梗塞体积。脑分为7个冠状切片(2mm厚)。将切片用1％溶液的三苯基四唑鎓氯化物染色，其将有活力的区染为红色。在各切片的前及后表面测量脑皮质的苍白，不能生活的区和纹状体。由前及后表面上切片厚度和梗塞区的平均值的产物计算各切片的梗塞体积。通过总和来自各切片的体积得到皮质和纹状体的总梗塞体积。值表示为整个结构的百分率。在3组通过ANOVA和Newman-Keuls多范围测试，以0.05显著性水平比较测量。数据表示为平均值±SE。
【结果】
在全部大鼠组中在MCAO和早期再灌注期间动脉pH，PCO2和PO2保持稳定的和在生理学范围内(表1)。在20min的MCAO输注的组之间无显著差异。电解质浓度在输注之后在组中保持类似(表2)。如用尖峰负荷蛋白输注所预期，发生血细胞比容的小幅降低(表3)。
表1.无输注或以20min的MCAO输注的组中2h的中脑动脉阻塞(MCAO)期间和之后的动脉pH和血气(平均值±SE；n＝10)
基线60min MCAO 30min再灌注
pH 基线 60min MCAO 30min再灌注
无输注 7.40±0.01 7.41±0.01 7.41±0.01
PEG-白蛋白 7.41±0.01 7.41±0.01 7.39±0.01
PEG-COHb 7.39±0.01 7.40±0.01 7.39±0.01
PCO2(mm Hg)
无输注 45.0±0.9 43.0±1.0 43.6±1.1
PEG-白蛋白 42.0±1.1 42.5±0.7 45.4±0.5
PEG-COHb 43.7±0.8 44.3±1.4 44.3±2.0
PO2(mm Hg)
无输注 120±3 123±5 124±3
PEG-白蛋白 124±2 123±3 119±4
PEG-COHb 128±4 122±6 125±7
碱过量
无输注 1.6±0.5 1.5±0.6 1.7±0.4
PEG-白蛋白 1.4±0.3 2.1±0.4 1.9±0.3
PEG-COHb 0.3±0.6 1.4±0.4 1.3±0.3
表2.无输注或以20min的MCAO输注的组中2h的MCAO期间和之后的动脉血电解质(平均值±SE；n＝10)
表3.无输注或以20min的MCAO输注的组中2h的MCAO期间和之后的全血血红蛋白分析(平均值±SE；n＝10)
＊P＜0.05，自PEG-白蛋白
但是，相比PEG-白蛋白-输注的组，在PEG-COHb-输注的组中血细胞比容或全血Hb浓度无显著差异。PEG-COHb输注之后，全血中MetHb和COHb的百分率稍微升高(表3)。在60min的MCAO(在完成PEG-COHb输注之后约35min)时血浆Hb的分析表明0.6±0.1g/dL的浓度(±SE)，及水平在30min的再灌注时保持相对未变化。血浆Hb中COHb的百分率在60min的MCAO时在11±4％内，和在30min的再灌注时在6±1％内。平均动脉血压值显示于图3A。尽管在PEG-COHb组中在延长的MCAO期间有压力稍微增加的趋势，值在任何时间点在组之中不显著不同。在缺血最密的侧皮质上监控激光-多普勒流。值显示于图3B。在全部组中，起初流降低到基线的约25％及经时稍微增加到基线的约30％。用再灌注，在全部组中流恢复到基线的约80％。在任何时间点组之中无显著差异。缺血和将大鼠从麻醉唤醒之后1h的再灌注期间直肠温度维持在36.5～37.0℃的范围。 而且，在24h时大鼠不显示发热。从麻醉唤醒之后，组之中神经学缺陷评分类似(图4)。但是，在24h再测试后，神经学缺陷评分在PEG-COHb组中选择性地改善。以各冠水平的梗塞体积和总梗塞体积的值显示于图5。梗塞体积在无输注的组和用PEG-白蛋白输注的组中类似。相比非-输注的或PEG-白蛋白组，用PEGCOHb输注的组中梗塞体积显著减小。在PEG-COHb组中，相对于PEG-白蛋白组，梗塞体积在皮质中降低82％和在纹状体中降低56％(图6)。在各5个最前片中存在梗塞体积的减小，由此表明组织拯救扩散到整个中脑动脉分布区。
【讨论】
在瞬时病灶脑缺血期间通过PEG-COHb尖峰负荷输注的组织拯救程度基本上大于用αα-交联的Hb(在大鼠中)或聚合物Hb(在小鼠中)血容量过多交换输注时报道的。此发现是显著的，因为用10ml/kg尖峰负荷达到的血浆Hb浓度是0.6g/dL，其显著少于用含有6g/dL的Hb的流体30～40％交换输注一般达到的2～2.5g/dL。而且，进一步通过将输注流体中的Hb浓度从10g/dL增加到20g/dL来增加αα-交联的Hb的血浆浓度产生梗塞体积的额外的减小。这些比较提示，在从中风拯救脑中，PEG-COHb可相比αα-交联的Hb和聚合物Hb而每摩尔的血红素更优。结果表明，不需要大血浆浓度的聚乙二醇化的COHb来拯救脑。交换输注的理论优势是全血粘度可通过降低血细胞比容来降低和由此促进侧血流。尖峰负荷相比交换输注的优势是此流程在临床中风中会更容易实施和10ml/kg体积容易耐受，而不产生标记的血容量过多-诱导的高血压。本研究中未观察到显著高血压。通过PEG-COHb拯救不呈现与皮质的缺血性核心中血流的增加相关，如在单位点通过激光-多普勒流量学评定。但是，可能是，侧血流在足以拯救组织的缺血性边缘区改善。聚乙二醇化的Hb溶液的粘度相比交联的及聚合物Hb溶液更接近于全血，由此可更佳维持内皮剪切应力及关联的NO产生，其可辅助维持副动脉扩张。
PEG-白蛋白和PEG-COHb的10ml/kg尖峰负荷输注产生血细胞 比容的约8～10％降低。此血细胞比容的相对小幅降低会对血粘度具有仅小效应，且不可能改善足以通过减少血粘度减少脑损伤的灌注。在此研究及用更大血液稀释的之前研究中用PEG-白蛋白输注的组和无输注的组之间的梗塞体积的差异缺乏支持此前提。而且，PEG-COHb尖峰负荷之后血浆[Hb]增加到0.6g/dL不足以抵消血细胞比容的降低。由此，全血[Hb]和动脉O2含量不通过PEG-COHb输注增加。但是，甚至在动脉O2含量或血流增加缺失下，由于几种原因血浆中的O2载体可能增强O2递送到缺血性组织。首先，血浆中的氧溶解度低且代表组织中红细胞和线粒体之间的O2扩散抗性的主要位点。通过血浆中携带大量的O2，辅助O2从红细胞膜运输到内皮。在这点上，当溶液主要含有分子量大于14MDa的聚合物时，MCAO期间Hb聚合物的输注功效损失。具有约8～10个5000分子量PEG的侧链的当前牛PEG-Hb呈现为代表良好的小到足以具有辅助血浆中的O2运输的高运动性，但大到足以限制外渗的平衡。其次，在不完全的缺血期间，通过个体微血管的红细胞通量是异源的，且此异质性在低灌注压力的条件下扩大。通过递送O2通过毛细管中的血浆流，红细胞被剥夺，O2递送可变得在毛细管之中更同质。第3，红细胞是粒子，且在任何一个实例中它们的表面积不覆盖毛细管内皮的整个表面积。血浆中的O2载体增加用于O2扩散的有效表面积。因此，无细胞的Hb的尖峰负荷输注可调用几种独立于本体动脉O2含量和宏观血流的O2递送机理。
本申请中引用的全部出版物和专利文献以全部目的，以如各个体出版物或专利文献所个别表示的相同的程度通过引用整体并入本文。至于此文中它们的各种参考文献的引用，申请人不承认任何特定参考文献是其发明的“现有技术”。

Claims (28)

1.组合物，其包含有功能的、天然血红蛋白分子和至少1个聚乙二醇分子之间的共价缀合物，所述组合物包含：
(a)水溶性血红蛋白级分，其包含血红蛋白分子组，其中所述血红蛋白分子组的各成员：
(i)是脱氧的；
(ii)通过氨基酸残基的胺部分共价缀合于所述聚乙二醇的至少1个分子；
(iii)无化学交联剂并且包含小于5％的交联的血红蛋白；以及
(iv)具有9mm Hg～14mm Hg的P50；
(b)水溶性稳定剂级分，其致使所述血红蛋白分子组抗氧化，所述级分包含稳定化剂，所述稳定化剂包含相比所述血红蛋白分子组与氧更具有反应性的结构元件；以及
(c)稀释剂级分，其包含可溶所述血红蛋白级分的药学可接受的稀释剂，
所述组合物无病毒活性，且稳定地包含少于5％高铁血红蛋白。
2.权利要求1的组合物，其中所述血红蛋白分子组的各成员通过5个或更多所述氨基酸残基的所述胺部分共价缀合于5个或更多所述聚乙二醇部分。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述氨基酸残基的所述胺部分是赖氨酸残基的ε-胺部分。
4.权利要求1或2的组合物，其中所述血红蛋白分子结合于选自氧和一氧化碳的成员。
5.权利要求4的组合物，其中所述血红蛋白分子能将选自所述结合的氧和所述结合的一氧化碳的成员转移到所述血红蛋白所接触的组织。
6.权利要求1的组合物，所述组合物通过包括如下步骤的方法制备：
(a)使脱氧的血红蛋白和稳定化剂的溶液经历热病毒灭活处理，包括：使所述溶液暴露于升高到足以灭活所述溶液中的全部病毒活性的温度，所述暴露持续足以达到灭活所述溶液中的全部病毒活性的时间，
所述稳定化剂包含相比所述溶液中的所述脱氧的血红蛋白与氧更具有反应性的结构元件，由此最小化由所述脱氧的血红蛋白的氧结合，
所述溶液包含足以阻止所述热病毒灭活处理中多于5％高铁血红蛋白形成的量的所述稳定化剂并且然后再氧合所述血红蛋白；以及
(b)使步骤(a)的所述再氧合的病毒灭活的血红蛋白溶液和反应性与所述血红蛋白的氨基酸残基互补的活化的聚乙二醇分子接触，由此在聚乙二醇和所述溶液中的血红蛋白分子之间形成共价缀合物。
7.权利要求6的组合物，其通过所述方法制备，还在步骤(a)之前包括(c)，使氧合的血红蛋白溶液脱氧，由此形成所述脱氧的血红蛋白的溶液。
8.权利要求7的组合物，其通过所述方法制备，还在步骤(a)之前包括(d)，用所述稳定化剂形成所述脱氧的血红蛋白的溶液。
9.权利要求6～8中任一项的组合物，其通过所述方法制备，其中所述稳定化剂在步骤(a)中以足以阻止多于5％高铁血红蛋白形成的量存在。
10.权利要求6～8中任一项的组合物，其通过所述方法制备，其中所述温度是60℃。
11.权利要求6～8中任一项的组合物，其通过所述方法制备，其中所述时间是10小时。
12.权利要求6～8中任一项的组合物，所述脱氧产生既不结合氧也不结合一氧化碳的脱氧的血红蛋白分子。
13.权利要求6～8中任一项的组合物，所述脱氧产生结合一氧化碳的脱氧的血红蛋白分子。
14.权利要求6～8中任一项的组合物，其中所述血红蛋白分子结合于选自氧和一氧化碳的成员。
15.权利要求14的组合物，其中所述血红蛋白分子能将选自所述结合的氧和所述结合的一氧化碳的成员转移到组织。
16.权利要求1的组合物，所述组合物通过包括如下步骤的方法制备：
(a)将前体血红蛋白溶液加热到60℃持续10小时，所述前体溶液包含稳定化剂，所述稳定化剂包含相比所述溶液中的所述血红蛋白分子与氧更具有反应性的结构，由此病毒灭活所述溶液的同时最小化由所述脱氧的血红蛋白的氧结合；以及
(b)使步骤(a)的所述病毒灭活的血红蛋白溶液和反应性与所述血红蛋白的氨基酸残基互补的活化的聚乙二醇分子接触，由此在聚乙二醇和所述溶液中的血红蛋白分子之间形成共价缀合物。
17.权利要求16的组合物，其中所述稳定化剂是氨基酸。
18.权利要求17的组合物，其中所述稳定化剂是半胱氨酸。
19.权利要求16～18中任一项的组合物，其通过所述方法制备，还在步骤(b)之前包括(c)，使步骤(a)的所述病毒灭活的血红蛋白溶液氧合。
20.制备权利要求1的组合物的方法，所述方法包括：
(i)使脱氧的血红蛋白和所述稳定化剂的溶液经历热病毒灭活处理，包括：使所述溶液暴露于升高到足以灭活混合物中的全部病毒活性的温度，所述暴露持续足以达到灭活混合物中的全部病毒活性的时间；以及
(ii)使步骤(i)的所述病毒灭活的血红蛋白溶液和反应性与所述血红蛋白的氨基酸残基互补的活化的聚乙二醇分子接触，由此在聚乙二醇和所述溶液中的血红蛋白分子之间形成共价缀合物。
21.权利要求20的方法，所述方法还包括：
(iii)在步骤(ii)之前，氧合步骤(i)的所述病毒灭活的血红蛋白溶液。
22.根据权利要求1的组合物，其中所述脱氧的血红蛋白分子结合CO，并且稀释剂级分包含磷酸盐缓冲液稀释剂。
23.根据权利要求1的组合物，其中所述脱氧的血红蛋白分子不结合CO，并且稀释剂级分包含高渗盐水稀释剂。
24.权利要求23的组合物，其中所述高渗盐水稀释剂包括3％～7％的浓度的NaCl。
25.权利要求1～19或权利要求22～24中任一项的组合物用于生产将氧或一氧化碳递送到组织的输注药物的用途。
26.权利要求1～19或权利要求22～24中任一项的组合物用于生产治疗创伤，出血性休克，缺血，再灌注损伤或镰刀状细胞贫血，在各情况中同时维持副动脉扩张的输注药物的用途。
27.权利要求1～19或权利要求22～24中任一项的组合物用于生产诱导血管发生或增加向组织的血流的输注药物的用途。
28.权利要求1～19或权利要求22～24中任一项的组合物用于生产治疗或预防由失血，贫血，休克，心肌梗塞，中风或创伤性脑损伤所致的低氧，或使肿瘤氧合过度以改善放射治疗或化学治疗的治疗效果的输注药物的用途。
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