CN102481304A

CN102481304A - 疾病的治疗方法

Info

Publication number: CN102481304A
Application number: CN2010800372358A
Authority: CN
Inventors: D.巴-奥
Original assignee: DMI Acquisition Corp
Current assignee: Ampio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2012-05-30
Also published as: NZ615941A; DE202010017530U1; PT2326332E; PL2554172T3; US20120035147A1; US8227457B2; EP2554171A1; DK2554171T3; US20100324005A1; SG2014009799A; KR20120102574A; EA027524B1; WO2010151530A1; CA2781771A1; PL2554174T3; JP5833549B2; SG2014009807A; CN107050036A; HK1176870A1; SG2014008171A

Abstract

本发明提供在有需要的动物中抑制血管通透性过高的方法。该方法包括向所述动物给药血管-通透性过高-抑制量的达那唑化合物。本发明还提供调节动物中内皮细胞细胞骨架的方法。所述方法包括向动物给药有效量的达那唑化合物。

Description

疾病的治疗方法

本发明要求2009年6月22日提交的临时申请61/219,185和2010年3月18日提交的临时申请61/315,350的优先权，并且在此将它们的全部公开内容引入作为参考。

发明领域

本发明涉及抑制血管通透性过高(vascular hyperpermeability)以及由其导致的水肿(其它不良作用的方法。本发明还涉及调节内皮细胞的细胞骨架的方法。两种方法包括向动物给药达那唑(Danazo1)化合物。

背景技术

血管内皮位于所有血管内部。其作为血液与组织和器官的界面。内皮形成半渗透屏障其保持血液隔室的完整性，但是允许水、离子、小分子、大分子和细胞以经调节的方式通过。该过程的失调将导致血管渗漏到皮下组织中。渗漏到组织中的液体会引起水肿，其在多种疾病中可以引起严重且危及生命的后果。因此，非常需要用于减少水肿，尤其是在水肿的最早期阶段减少水肿，以及生理学上恢复内皮屏障的方法。

发明内容

本发明提供这样的方法。具体地，本发明提供抑制血管通透性过高以及由其导致的水肿和其它不良作用的方法。本方法包括向有此需要的动物给药血管-通透性过高-抑制量的达那唑化合物。本发明的抑制血管通透性过高包括抑制细胞旁途径-引起的通透性过高以及转胞吞作用-引起的通透性过高。近期的证据显示转胞吞作用-引起的通透性过高是多种疾病和病况中最终导致组织和器官的损害过程中的第一步。因此，本发明提供这些疾病和病况中的早期介入手段，其可以减少、延迟或甚至最终阻止在这些疾病和病况中组织和器官的损害。

本发明还提供调节动物中内皮细胞的细胞骨架的方法。本方法包括向动物给药有效量的达那唑化合物。

在本文中使用的“血管通透性过高”表示与基础水平相比，血管内皮的通透性升高。在本文中使用的“血管通透性过高”包括细胞旁途径-引起的通透性过高和转胞吞作用-引起的通透性过高。

在本文中使用的“细胞旁途径-引起的通透性过高”表示由细胞旁途径运输引起的与基础水平相比升高的血管通透性过高。”细胞旁途径-引起的通透性过高”的其它特征如下文所述。

在本文中使用的“细胞旁途径运输(paracellular transport)”表示离子、分子和液体通过内皮的内皮细胞之间的内皮细胞间连接(IEJ)而移动。

在本文中使用的“转胞吞作用-引起的通透性过高”表示由转胞吞作用引起的与基础水平相比升高的血管通透性过高。

在本文中使用的“转胞吞作用(transcytosis)”表示大分子以及相伴的液相血浆成分跨越内皮的内皮细胞的主动转运。“转胞吞作用”的其它特征如下文所述。

在本文中使用的“基础水平”是指在正常组织或器官中发现的水平。

在本文中使用的“抑制”及类似术语表示减少、延迟或阻止。

当动物目前具有由血管通透性过高介导的疾病或病症、显示出这类疾病或病症的早期症状、或者具有发展这类疾病或病症的倾向时，该动物“需要”本发明的治疗。

在本文中使用的“介导(mediated)”及类似术语表示由血管通透性过高引起、引起血管通透性过高、涉及血管通透性过高、或者因血管通透性过高而加重。

附图说明

图1显示在HUVEC细胞与达那唑保温之后检测的OD水平，其作为达那唑抑制内皮细胞初期增殖能力的量度标准。

图2显示在与达那唑保温之后HUVEC细胞的照片，其作为达那唑阻止内皮细胞的管形成(tube formation)能力的量度标准。A＝对照；B＝1μM达那唑、C＝10μM达那唑、D＝50μM达那唑、及E＝50μM LY294002。

图3显示在用达那唑处理HUVEC细胞之后检测的荧光，其作为达那唑阻止内皮细胞入侵的能力的量度标准。

本发明目前优选的实施方式的具体描述

内皮是控制从血液到组织实质的分子交换的重要看门人。其在很大程度上控制具体的血管床到血源性分子(blood-borne molecule)的渗透。内皮细胞屏障的渗透性和选择性主要取决于不同血管床中的微脉管系统内的内皮的结构和类型。不同器官的微血管床内的内皮细胞显示出结构上的分化，其可以被分成三个主要的形态学类型：窦状型(sinusoidal)、开窗型(fenestrated)和连续型。

窦状内皮(也称为“不连续内皮”)具有大的细胞间和细胞内间隙(gap)并且无基底膜，其允许受到最小限度限制的从毛细血管腔到组织及从组织到毛细血管腔的分子运输。在肝脏、脾脏和骨髓中发现了窦状内皮。

开窗内皮(fenestrated endothelium)的特征在于存在大量60～80nm直径的被称为窗的圆形的跨细胞的开口。在需要小分子快速交换的组织和器官中发现开窗内皮，包括肾脏(肾小球、肾小管周围毛细血管和上行直小血管(ascending vasa recta))、胰脏、肾上腺、内分泌腺和肠。这些窗被细小的膈覆盖，除了在发育成熟的、健康的肾小球中的那些。参考Ichimura等人，J.Am.Soc.Nephrol.，19：1463-1471(2008)。

连续性内皮不含有窗或大的间隙。相反地，连续性内皮的特征在于未被中断的内皮细胞单层。体内的大部分内皮为连续性内皮，且连续性内皮被发现位于或围绕脑(血脑屏障)、膈、十二指肠、脂肪、心脏、肾脏的一些区域(乳突微脉管系统、下行直小血管)、大血管、肺部、肠系膜、神经、视网膜(血视网膜屏障)、骨骼肌、睾丸和身体的其它组织和器官。

连续性内皮中的内皮运输随细胞旁途径和跨细胞的途径出现被认为是一种常识。细胞旁途径是在内皮细胞之间，通过内皮细胞间连接(IEJ)的途径。在未受干扰的连续性内皮中，通过扩散和对流来实现水、离子和小分子的细胞旁途径运输。大量水(最多40％)也通过被称为水通道的水-运输膜通道跨细胞地跨越内皮细胞屏障。大量刺激可以破坏IEJ组织，从而打开内皮屏障中的间隙。这些细胞间间隙的形成允许液体、离子、大分子(例如蛋白质)和其它血浆成分以不受限制的方式通过内皮细胞之间。这种细胞旁途径-引起的通透性过高产生的水肿和其它不良作用能够最终导致组织和器官的损害。

跨细胞途径负责大分子跨过内皮细胞的主动转运，所述大分子例如白蛋白和其它血浆蛋白质，是被称作“转胞吞作用”的过程。大分子的运输出现在被称作为细胞膜穴样凹陷的小泡中。几乎所有的连续性内皮具有丰富的细胞膜穴样凹陷，除了位于脑和睾丸中的连续性内皮具有很少的细胞膜穴样凹陷。转胞吞作用是多步过程，其涉及连续的来自质膜的细胞膜穴样凹陷芽殖和裂变和跨细胞的易位，以及随后的与相对质膜(opposite plasmalemma)的对接和融合，在此细胞膜穴样凹陷通过胞吐作用向间质中释放它们的成分。在正常的生理学条件下，转胞吞作用是选择性的并且受到了严密的调控。

对于跨细胞途径的基础重要性的认识正在逐步深入。血浆蛋白质的转胞吞作用，尤其是白蛋白(其代表65％的血浆蛋白质)的转胞吞作用受到格外的关注因为其调节经血管的血液渗透压梯度的能力。可以认识到，随着增加的白蛋白和其它血浆蛋白质的转胞吞作用高于基础水平，会增加它们的组织蛋白质浓度，随后会导致水移动跨过内皮屏障，从而产生水肿。

通过转胞吞作用也会运输低密度脂蛋白(LDL)跨过内皮细胞。在高脂血症中，已经通过检测LDL转胞吞作用的显著增加来作为动脉粥样硬化形成的初期事件。LDL在内皮下空间聚集，并陷入在扩张的基底膜(basal lamina)的细胞外基质中。在高脂血症中内皮下脂蛋白聚集，随后的一连串事件会导致粥样斑块的形成。已有报道称早期的粥样硬化病变有时会伴随IEJ的打开以及LDL和白蛋白大量不受控制的通过。

血管并发症是糖尿病的特点。在大血管水平，动脉粥样硬化过程的加速往往表现为疾病。关于微血管病，视网膜、肾小球以及神经的微脉管系统的变化导致最多种的临床并发症，但是，随着研究数量的持续增加，显示糖尿病也会影响其它器官的微脉管系统，例如肠系膜、皮肤、骨骼肌、心脏、脑、以及肺部，导致另外的临床并发症。在所有这些血管床中，血管通透性的改变可能代表了糖尿病内皮功能障碍的特点。

在连续性内皮中，在糖尿病的早期，对于血浆大分子毛细管的通透性过高被解释为跨内皮的囊泡运输的强化(即，由增强转胞吞作用引起)而不是IEJ的脱稳定化。此外，已有报道称糖尿病患者的内皮细胞包括脑的那些，含有与正常相比数量增加的细胞膜穴样凹陷，以及糖化的蛋白质、尤其是糖化的白蛋白会被内皮细胞吸收，并且以比它们天然形式明显更快的速度进行胞转作用。此外，增强的大分子转胞吞作用是会持续到超过糖尿病早期阶段的过程，并且如果不对该疾病进行治疗，可能是导致糖尿病患者组织和器官水肿的原因。该水肿随后导致组织和器官的损害。在高血压中也已经报道了大分子跨细胞运输的类似的增加。

细胞旁途径-引起的通透性过高也是糖尿病和糖尿病血管并发症的原因。细胞旁途径的IEJ包括粘着连接(AJ)和紧密连接(TJ)。糖尿病改变在AJ和TJ两者中的特定蛋白质的含量、磷酸化和局限化，从而促进增加的内皮屏障通透性。

为了支持上述讨论以及获得更多的信息，参考Frank等人，Cell TissueRes.，335：41-47(2009)；Simionescu等人，Cell Tissue Res.，335：27-40(2009)；van den Berg等人，J.Cyst.Fibros.，7(6)：515-519(2008)；Viazzi等人，Hypertens.Res.，31：873-879(2008)；Antonetti等人，Chapter 14，pages 340-342，in DiabeticRetinopathy(由Elia J.Duh编辑，Humana Press，2008)；Felinski等人，CurrentEye Research，30：949-957(2005)；Pascariu等人，Journal of Histochemistry&Cytochemistry，52(1)：65-76(2004)；Bouchard等人，Diabetologia，45：1017-1025(2002)；Arshi等人，Laboratory Investigation，80(8)：1171-1184(2000)；Vinores等人，Documenta Ophthalmologica，97：217-228(1999)；Oomen等人，EuropeanJournal of Clinical Investigation，29：1035-1040(1999)；Vinores等人，Pathol.Res.Pract.，194：497-505(1998)；Antonetti等人，Diabetes，47：1953-1959(1998)；Popov等人，Acta Diabetol.，34：285-293(1997)；Yamaji等人，CirculationResearch，72：947-957(1993)；Vinores等人，Histochemical Journal，25：648-663(1993)；Beals等人，Microvascular Research，45：11-19(1993)；Caldwell等人，Investigative Ophthalmol.Visual Sci.，33(5)：16101619(1992)。

通过转胞吞作用和细胞旁途径，也会发生开窗内皮中的内皮运输。此外，借由窗发生内皮运输。开窗内皮对于水和小亲水溶解物具有显著高的通透性，这是因为窗的存在。

窗可能会或可能不会被膈所覆盖。具有带膈的窗(diaphragmed fenestrae)的内皮的位置包括内分泌组织(例如胰岛和肾上腺皮质)、胃肠粘膜以及肾脏的肾小管周围毛细血管。具有带膈的窗的开窗内皮的血浆蛋白质的通透性不会超过连续性内皮的血浆蛋白质的通透性。

具有不带膈的窗的内皮的位置包括肾的肾小球。血管小球的开窗内皮被延伸到窗内的多糖包被覆盖(形成所谓的“可捕捉的塞子(seive plug)”)以及被更为松散关联的糖蛋白的内皮细胞表面层覆盖。功能的选择通透性研究的数学分析已经确定血管小球的内皮细胞多糖包被(包括存在于窗中的)，以及与其关联的表面层占据循环中血浆白蛋白的最多95％的固位(retention)。

已经发现血管小球内皮中的窗的损失与一些疾病中的蛋白尿相关，这些疾病包括糖尿病性肾病、移植肾肾小球病、先兆子痫、糖尿病、肾功能衰竭、环孢霉素A肾病、血清性肾炎以及Thy-1肾炎。已经发现肌动蛋白重排，以及尤其是张力丝(stress fiber)的解聚对于窗的形成和保持是重要的。

为了支持上述关于开窗内皮的讨论以及获得额外的信息，参考Satchell等人，Am.J.Physiol.Renal Physiol.，296：F947-F956(2009)；Haraldsson等人，Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.，18：331-335(2009)；Ichimura等人，J.Am.Soc.Nephrol.，19：1463-1471(2008)；Ballermann，Nephron Physiol.，106：19-25(2007)；Toyoda等人，Diabetes，56：2155-2160(2007)；Stan，“EndothelialStructures Involved In Vascular Permeability，”，679-688页，EndothelialBiomedicine(编辑，Aird，Cambridge University出版，Cambridge，2007)；Simionescu和Antohe，“Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium：Changes in Various Pathologies，”42-69页，The Vascular Endothelium I(编辑，Moncada和Higgs，Springer-Verlag，Berlin，2006)。

通过转胞吞作用，发生窦状内皮中的内皮运输，且通过细胞间间隙(内皮之间的狭缝)和细胞内间隙(窗)。用肌动蛋白丝-断裂药物治疗窦状内皮可以引起间隙数量的显著和快速的增加，显示为对肌动蛋白细胞骨架内的内皮的孔隙率的调节。已经报道了其它细胞骨架改变药物会改变窗的直径。因此，窗-关联细胞骨架可能会控制在窦状内皮中内皮过滤的重要功能。在肝脏中，窗的减少(defenestration)(窗的损失)导致内皮通透性的降低，且已经与一些疾病和病症的发病相关，这些疾病和病症包括老化、动脉粥样硬化生成、动脉粥样硬化、肝硬化、纤维化、肝衰竭、原发性肝癌和转移性肝癌。为了支持上述讨论以及获得更多的信息，参考Yokomori，Med.Mol.Morphol.，41：1-4(2008)；Stan，“Endothelial Structures Involved In Vascular Permeability，”679-688页，Endothelial Biomedicine(编辑，Aird，Cambridge University出版，Cambridge，2007)；DeLeve，“The Hepatic Sinusoidal Endothelial Cell，”1226-1238页，Endothelial Biomedicine(编辑，Aird，Cambridge University出版，Cambridge，2007)；Pries和Kuebler，“Normal Endothelium，”1-40页，The VascularEndothelium I(编辑，Moncada和Higgs，Springer-Verlag，Berlin，2006)；Simionescu和Antohe，“Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium：Changes in Various Pathologies，”42-69页，The Vascular Endothelium I(编辑，Moncada和Higgs，Springer-Verlag，Berlin，2006)；Braet和Wisse，ComparativeHepatology，1：1-17(2002)；Kanai等人，Anat.Rec.，244：175-181(1996)；Kempka等人，Exp.Cell Res.，176：38-48(1988)；Kishimoto等人，Am.J.Anat.，178：241-249(1987)。

本发明提供抑制存在于含有连续性内皮或被连续性内皮围绕的任何组合或器官中的血管通透性过高。如上所述，连续性内皮存在于或围绕脑(血脑屏障)、膈、十二指肠、脂肪、心脏、肾脏的一些区域(乳突微脉管系统、下行直小血管)、大血管、肺部、肠系膜、神经、视网膜(血视网膜屏障)、骨骼肌、皮肤、睾丸、脐静脉和身体的其它组织和器官。优选地，连续性内皮是发现存在于脑、心脏、肺部、神经或视网膜中或周围的连续性内皮。

本发明还提供抑制存在于含有开窗内皮或被开窗内皮围绕的任何组织和器官中的血管通透性过高。如上所述，开窗内皮存在于或围绕肾(肾小球、肾小管周围毛细血管和上行直小血管)、胰脏、肾上腺、内分泌腺和肠。优选，开窗内皮是发现存在于肾中，尤其是在于肾的肾小球中的开窗内皮。

此外，通过血管通透性过高引起的任何疾病或病症可以通过本发明的方法来治疗。这样的疾病和病症包括糖尿病、高血压和动脉粥样硬化。

尤其是糖尿病的血管并发症，包括含有连续性内皮或开窗内皮的脑、心脏、肾脏、肺部、肠系膜、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤以及其它组织和器官的血管并发症可以通过本发明来治疗。这些血管并发症包括水肿、LDL在内皮下空间聚集、加速的动脉粥样硬化、以及下述并发症：脑(血管壁的加速老化)、心脏(心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍、糖尿病性心肌病)、肾脏(糖尿病性肾病)、肺部(在患糖尿病的母亲中胎儿肺部发育的滞后、一些肺部生理学参数的变化和感染敏感性的增加)、肠系膜(血管增生)、神经(糖尿病性神经病变)、视网膜(黄斑水肿和糖尿病性视网膜病)和皮肤(发红、变色、干燥和溃疡)。

糖尿病性视网膜病是导致失明的主要原因，其影响估计二千一百万患有糖尿病的美国人中的约25％。尽管其发病率和发展可以通过加强血糖和血压控制来降低，但几乎所有患有1型糖尿病的患者和超过60％患有2型糖尿病的患者最终会发展成糖尿病性视网膜病。糖尿病性视网膜病存在两个阶段。第一，非增生性视网膜病变，是该疾病的较早阶段且其特征在于增加的血管通透性、小动脉瘤、水肿以及最终的血管闭塞。新生血管不是非增生性阶段的成分。在这个阶段的大部分视觉丧失是由于黄斑(视网膜的中心区域)中的液体积累。这种液体积累被称为黄斑水肿并且可以导致暂时或永久的视力降低。糖尿病性视网膜病的第二阶段被称为增生性视网膜病变，且其特征在于异常新血管的形成。不幸地是，这种异常新生血管可以是非常严重的损伤，这是因为其可以引起眼部的出血、视网膜瘢痕组织、糖尿病患者的视网膜剥离或青光眼，这些中的任何均可以导致视力降低或失明。黄斑水肿也会出现在增殖阶段。

糖尿病性神经病变是糖尿病常见的严重的并发症。存在四种主要类型的糖尿病性神经病变：周围神经病变、自主神经病变、神经根神经丛病变(radiculoplexus neuropathy)以及单一神经病变。周围神经病变(最常见的糖尿病性神经病变类型)的表现和症状包括：麻木或感觉疼痛的能力降低、或温度的变化(尤其是脚部和脚趾)、麻刺感或发烫感觉、锐痛、走路时的疼痛、对于非常轻的接触极其敏感、肌无力、走路困难、以及严重的脚部问题(例如溃烂、感染、变形以及骨和关节疼痛)。自主神经病变影响自主神经系统，自主神经系统控制心脏、膀胱、肺部、胃、肠、性器官以及眼部，这些区域中的任何部分均可能出现问题。神经根神经丛病变(也称为糖尿病肌萎缩、股神经病或近端神经病变(proximal neuropathy))通常影响臀部、肩部或腹部的神经，通常影响身体的一侧。单一神经病变是指仅损害一个神经，通常是胳膊、腿或面部的神经。糖尿病性神经病变的常规并发症包括四肢的丧失(例如，脚趾、脚步或腿)、沙尔科关节(charcot joint)、尿路感染、尿失禁、无知觉性低血糖(甚至可能是致死的)、低血压、消化问题(例如，便秘、腹泻、恶心以及呕吐)、性功能障碍(例如，勃起功能障碍)、以及出汗增加或减少。可以看出，症状可以从轻微到疼痛、到失去能力以及甚至是致死的。

糖尿病性肾病是在美国引起末期肾脏疾病的最普遍的原因。其是糖尿病的血管并发症，影响肾脏的肾小球毛细血管并且降低肾脏的过滤能力。首先显示患有肾病的是超过滤的出现，以及随后的微量白蛋白尿。严重的蛋白尿和持续衰退的肾功能出现在末期肾脏疾病之前。通常，在肾病的任何表现出现之间，通常忽视视网膜病变。对于由糖尿病引起的末期肾脏疾病患者通常建议进行肾移植。接受移植的患者5年存活率为约60％，相比地，进行透析的患者5年存活率仅为2％。

高血压通常发展很多年，并且其最终会影响几乎每个人。未受控制的高血压会增加严重健康问题的风险，所述严重健康问题包括：心力衰竭、充血性心力衰竭、中风、周围动脉疾病、肾衰竭、动脉瘤、眼部损伤、以及在记忆或认知方面出现问题。

动脉粥样硬化也是逐渐发展的。动脉粥样硬化能够影响冠状动脉、颈动脉、周围动脉或微脉管系统，动脉粥样硬化的并发症包括：冠心病(其可以引起心绞痛或心力衰竭)、冠状微血管疾病、颈动脉疾病(其可以引起短暂性脑缺血发作或中风)、周围动脉疾病(其可以引起对于热和冷的敏感度的丧失或甚至是组织死亡)、以及动脉瘤。

根据本发明可以治疗的其它疾病和病症包括：急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、老化相关性黄斑变性、脑水肿、脉络膜水肿、脉络膜炎、冠状微血管疾病、脑微血管疾病、伊尔斯氏病(Eals disease)，由损伤(例如，创伤或烧伤)引起的水肿、与高血压相关的水肿、血管小球的血管泄露、失血性休克、欧文-加斯综合征(Irvine Gass Syndrome)、缺血、黄斑水肿(例如，由血管闭塞、眼内手术后(例如，白内障手术)、葡萄膜炎或视网膜色素变性引起，以及由糖尿病引起的其它疾病)、肾炎(例如，肾小球肾炎、血清病性肾炎以及Thy-1肾炎)、肾病、肾病水肿、肾病综合征、神经病、组织水肿引起的器官衰竭(例如，在败血病中或由创伤引起)、先兆子痫、肺水肿、肺高血压、肾功能衰竭、视网膜水肿、视网膜出血、视网膜静脉阻塞(例如，分支或中心静脉阻塞)、视网膜炎、视网膜病变(例如，动脉硬化性视网膜病变、高血压性视网膜病变、放射性视网膜病变、镰状红细胞性视网膜病变以及早熟性视网膜病变，以及其它糖尿病性视网膜病)、无症状性脑梗死、全身炎症反应综合征(SIRS)、移植肾肾小球病、葡萄膜炎、血管泄露综合征、玻璃体出血以及Von Hipple Lindau病。此外，已知一些药物(包括那些用于治疗多发性硬化的药物)会引起血管通透性过高，并且达那唑可以用来减少在使用这些药物时的上述不期望的副作用。遗传性和获得性血管性水肿可以明确地与那些可以通过本发明治疗的疾病和病症区分。

在本文中使用的“治疗”表示减少(全部或部分地)症状、减少疾病或病症的持续时间或严重程度，包括治愈疾病，或预防疾病或病症。

近期的证据显示转胞吞作用-引起的通透性过高是在多种疾病和病症中最终导致组织和器官损害的过程的第一步。因此，本发明提供在这些疾病和病症中的早期介入手段，其能够减少、延迟或甚至潜在地预防在这些疾病和病症中组合和器官的损伤。例如，基于对于能够通过本发明治疗的疾病或病症(上述的那些疾病和病症)中的一种的诊断，可以对动物立即进行治疗。备选地，优选对于下述动物的治疗，所述动物在存在症状之前具有发展为这样的疾病或症状的表现或倾向。糖尿病、高血压以及动脉粥样硬化的早期表现以及危险度因子是众所周知的，并且对于显示这些早期表现或危险度因子的动物的治疗可以在疾病或病症的症状存在之前开始(即预防地)。

例如，根据诊断，对于被确诊为患有糖尿病的患者的治疗可以立即开始。具体地，糖尿病患者应当优选在出现血管并发症的任何症状之前，用达那唑化合物来治疗，尽管这经常是不可能的，因此大多数糖尿病患者在其确诊时已显示这些症状(参见下文)。备选的，糖尿病患者应当在非增生性糖尿病性视网膜病较为轻微(即，小动脉瘤和视网膜内出血的轻微水平)时接受治疗。参见Diabetic Retinopathy，第9页(编辑Elia Duh，M.D.，Human Press，2008)。这样的早期治疗可以提供预防黄斑水肿和从视网膜病变发展为增生性糖尿病性视网膜病的最佳机会。此外，糖尿病性视网膜病的存在被认为是其它糖尿病的微血管并发症存在或将会发展的表现(参见Id.，474-477页)，并且早期的治疗还可以预防或减少这些其它的并发症。当然，糖尿病血管并发症的更为发展的疾病和病症也可以利用有益结果来治疗。

但是，如上文所述，在糖尿病被确诊时，血管并发症通常已经存在。相应地，优选对于具有发展为糖尿病的早期表现或倾向的病人进行预防性治疗。这些早期表现和危险度因子包括空腹血糖高但是还未足够确定为糖尿病(“糖尿病前期”)、高胰岛素血症、高血压、血脂障碍(高胆固醇、高甘油三酯、高低密度脂蛋白、和/或低水平高密度脂蛋白)、肥胖(体重指数高于25)、不活泼、超过45岁、睡眠不足、家族糖尿病史、少数种族、妊娠糖尿病史、以及多囊卵巢综合征史。

相似地，根据诊断，对于被确诊为患有高血压的患者的治疗可以立即开始。高血压通常不会引起任何症状，但是对于具有发展为高血压的倾向的患者可以开始预防性治疗。高血压的危险度因子包括年龄、种族(在黑人中高血压更为常见)、家族史(高血压在家族中延续)、超重或肥胖、缺乏活力、吸烟、饮食中盐分过多、饮食中钾过少、饮食中维生素D过少、饮酒过多、压力水平高、一定的慢性条件(例如，高胆固醇、糖尿病、肾脏疾病以及睡眠性呼吸暂停)以及使用某些药物(例如，口服避孕药、苯丙胺、减肥药丸、以及其它冷和过敏药物(allergy medications))。

对于被确诊为动脉粥样硬化的患者可以在诊断后立即开始治疗。但是，优选对于具有发展为动脉粥样硬化的早期表现或倾向的患者进行预防性治疗。动脉粥样硬化的早期表现和危险度因子包括年龄、动脉瘤或早期心脏疾病的家族史、高血压、高胆固醇、高甘油三酯、胰岛素耐受性、肥胖、吸烟、缺乏体力活动、不健康饮食、以及高C-反应蛋白水平。

用来抑制血管通透性过高的本发明的方法包括向有此需要的动物给药有效量的达那唑化合物以抑制血管通透性过高。在此使用的“达那唑化合物”是指达那唑、达那唑的前药以及达那唑和其前药药学上可接受的盐。

达那唑(17α-孕甾-2，4-二烯-20-炔并[2，3-d]-异噁唑-17β-醇)是已知的合成类固醇激素。其结构为：

制备达那唑的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利No.3,135,743和英国专利No.905,844。此外，达那唑可以从多个来源商购，包括Barr Pharmaceuticals，Inc.，Lannett Co.，Inc.、sanofi-aventis Canada、Sigma-Aldrich以及Parchem Trading Ltd。

“前药”表示当向动物给药这类前药时，在体内释放活性母体药物(在本案中为达那唑)的任何化合物。达那唑的前药包括如下：达那唑中的羟基与任何基团键合并且可以在体内被切断从而产生自由的羟基的物质。达那唑前药的实例包括达那唑的酯(例如，乙酸酯、甲酸酯、以及苯甲酸酯衍生物)。

达那唑和其前药药学上可接受的盐包括传统的非毒性盐、例如来自于无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)的盐、来自于有机酸(例如，乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、抗坏血酸等)的盐、或来自于碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或来自于N，N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺、或乙二胺的有机阳离子)的盐。这些盐可以通过常规方式制备，例如用酸来中和化合物的游离碱形式。具体地，异噁唑例如达那唑是弱碱性物质并且在加入强酸的条件下会形成酸加成盐，以及在加入强酸的酯(例如，强无机或有机磺酸的酯，优选低级烷基、低级烯基或低级芳烷基酯，例如甲基碘、乙基碘、乙基溴、丙基溴、丁基溴、烯丙基溴、硫酸甲酯、苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯、苄基氯等)的条件下会形成季铵盐。参见美国专利No.3,135,743。

如上所述，达那唑化合物可以用来抑制血管通透性过高以及治疗由血管通透性过高引起的疾病或病症。为了实现上述，向需要此治疗的动物给药达那唑化合物。优选地，所述动物为哺乳动物，例如兔子、山羊、狗、猫、马或人。最优选所述动物为人。

本发明化合物(即达那唑、达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐)的有效地用药形式、给药方式以及用药量可以利用在此给出的指导根据经验来确定。本领域技术人员理解的是针对待治疗的具体的疾病或病症、疾病或病症的严重程度、给药途径(一个或多个)、治疗的持续时间、对动物给药任何其它药物的鉴别、动物的年龄、大小以及物种、以及在医学和兽医学领域已知的类似因素，用药量会发生变化。通常来说，本发明化合物的合适的每天的剂量是对于产生治疗效果有效的最低剂量的化合物量。但是，每天的用药将在足够医学判断的范围内由参加的医师或兽医来确定。如果需要，有效的每天的剂量可以分成两次、三次、四次、五次、六次或更多次分次给药(sub-dose)来给药，在每天合适的时间间隔单独给药。该化合物的给药应当持续直到取得可接受的反应。

之前已经有报道称达那唑化合物可以抑制血管发生。参见PCT申请WO2007/009087。令人吃惊以及相当意外的是，已经发现可以用来在最佳剂量实现本发明的达那唑化合物低于之前报道的用于抑制血管发生的达那唑化合物约100-1000倍，并且显著低于目前对患者给药以治疗其它疾病和病症的那些量(通常地，对于成年人为200-800mg/天)。使用这些较低剂量的达那唑化合物会避免任何显著的副作用，可能会避免所有的副作用，这对于根据本发明的疾病以及病症的早期或预防性治疗是非常有利的。

具体来说，抑制血管通透性过高的达那唑化合物的有效剂量可以为0.1ng/kg/天～35mg/kg/天，优选为40ng/kg/天～5.0mg/kg/天，最优选100ng/kg/天～1.5mg/kg/天。有效的剂量也可以是如下剂量：可以在相关液体(例如血液)中产生0.0001μM～5μM，优选0.1μM～1.0μM，更优选0.1μM～0.5μM，最优选约0.1μM的浓度。有效剂量也可以是如下剂量：可以在待治疗的组织或器官中产生约0.17％(重量/重量)或更少，优选0.00034％～0.17％，最优选0.0034％～0.017％的浓度。当局部地或部分地给药时，优选以0.0001μM～5μM，优选以0.1μM～1.0μM，更优选以0.1μM～0.5μM，最优选以约0.1μM的浓度给药达那唑化合物，或优选以约0.17％(重量/重量)或更少，优选以0.00034％～0.17％，最优选以0.0034％～0.017％的浓度给药达那唑化合物。当口服给药成年人时，优选剂量为约1ng/天～约100mg/天，更优选剂量为约1mg/天～约100mg/天，最优选剂量为约10mg/天～约90mg/天，优选以每天两次相同的剂量给药。此外，由于期待达那唑在细胞和组织中积累，因此在一段时间之后(例如，2-4周)可以将初始(上样)剂量(例如，每天100mg)降低至更低的保持剂量(例如，每天1mg)，这可能会导致不确定的副作用而不是显著的副作用，也可能将会没有任何副作用。定义在本文中使用的达那唑化合物的“血管-通透性过高-抑制剂量”是指上述在本段落中描述的那些量。

本发明还提供调节动物中内皮细胞细胞骨架的方法。本发明的该实施方式是基于如下发现：达那唑抑制F-肌动蛋白张力丝的形成、引起皮质肌动蛋白环(cortical actin ring)的形成、通过磷酸鞘氨醇(S1P)促进以及延长皮质肌动蛋白环的形成、抑制RhoA、增加VE-钙粘蛋白的磷酸化、可能会激活屏障-稳定化GTPase以及可能会稳定微管。细胞骨架的调节可以降低血管通透性过高以及提高血管通透性过低(例如，通透性低于基础水平)，由此使内皮重新为内环境稳定。相应地，由血管通透性过高引起的这些疾病和病症可以被治疗(参见上文)并且由血管通透性过低引起的那些疾病和病症也可以被治疗。后一类型的疾病和病症包括肝脏老化、动脉粥样硬化生成、动脉粥样硬化、肝硬化、肝脏纤维化、肝功能衰竭、以及原发性肝癌和转移性肝癌。

调节内皮细胞细胞骨架的方法包括向动物给药有效量的达那唑化合物。“达那唑化合物”和“动物”具有与上述相同的含义。

用于调节细胞骨架的本发明化合物(即达那唑、达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐)的有效地用药形式、给药方式以及用药量可以利用在此给出的指导根据经验来确定。本领域技术人员理解的是针对待治疗的具体的疾病或病症、疾病或病症的严重程度、给药途径(一个或多个)、治疗的持续时间、对动物给药任何其它药物的鉴别、动物的年龄、大小以及物种、以及在医学和兽医学领域已知的类似因素，用药量会发生变化。通常来说，本发明化合物的合适的每天的剂量是对于产生治疗效果有效的最低剂量的化合物量。但是，每天的用药将在足够医学判断的范围内由参加的医师或兽医来确定。如果需要，有效的每天的剂量可以分成两次、三次、四次、五次、六次或更多次分次给药(sub-dose)来给药，在每天合适的时间间隔单独给药。该化合物的给药应当持续直到取得可接受的反应。

具体来说，用于调节内皮细胞细胞骨架的达那唑化合物的有效剂量可以为0.1ng/kg/天～35mg/kg/天，优选为40ng/kg/天～5.0mg/kg/天，最优选100ng/kg/天～1.5mg/kg/天。有效的剂量也可以是如下剂量：可以在相关液体(例如血液)中产生0.0001μM～5μM，优选0.1μM～1.0μM，更优选0.1μM～0.5μM，最优选约0.1μM的浓度。有效剂量也可以是如下剂量：可以在待治疗的组织或器官中产生约0.17％(重量/重量)或更少，优选0.00034％～0.17％，最优选0.0034％～0.017％的浓度。当局部地或部分地给药时，优选以0.0001μM～5μM，优选以0.1μM～1.0μM，更优选以0.1μM～0.5μM，最优选以约0.1μM的浓度给药达那唑化合物，或优选以约0.17％(重量/重量)或更少，优选以0.00034％～0.17％，最优选以0.0034％～0.017％的浓度给药达那唑化合物。当口服给药成年人时，优选剂量为约1ng/天～约100mg/天，更优选剂量为约1mg/天～约100mg/天，最优选剂量为约10mg/天～约90mg/天，优选以每天两次相同的剂量给药。此外，由于期待达那唑在细胞和组织中积累，因此在一段时间之后(例如，2-4周)可以将初始(上样)剂量(例如，每天100mg)降低至更低的保持剂量(例如，每天1mg)，这可能会导致不确定的副作用而不是显著的副作用，也可能将会没有任何副作用。

本发明化合物(即达那唑、达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐)可以通过任何合适的给药途径给药治疗的动物患者，所述给药途径包括口服、经鼻、非经肠道(例如，静脉、腹膜内、皮下或肌内)途径。根据本发明可以治疗的任何疾病或病症通常优选口服给药。用来治疗眼部的疾病和病症的优选的给药方式为口服、眼内和局部给药。最优选的为口服。相当意外以及令人惊奇的是，眼部的疾病可以通过口服达那唑化合物来治疗，这是因为之前还没有报道称通过口服药物成功地治疗这类疾病和病症。治疗脑的疾病和病症优选的给药方式是口服和非经肠道给药。优选口服给药。

尽管可以单独给药本发明的化合物，但优选作为药物制剂(组合物)给药。本发明的药物组合物包括本发明的化合物(一个或多个)作为活性成分，其与一种或多种药学上可接受的载体混合，以及任选与一种或多种其它化合物、药物和其它材料混合。每种载体在与制剂的其它成分的相容性方面必须是“可以接受的”并且对于动物是无害的。在本领域中药学上可接受的载体是已知的。与所选择的给药途径无关，可以通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物配制成药学上可接受的剂型。参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences。

适合口服给药的本发明的制剂可以是如下形式：胶囊、扁囊剂、药丸、片剂、粉末、颗粒或作为含水或不含水液体中的溶液或悬浮液、或水包油或油包水液体乳剂，或酏剂、糖浆、锭剂(使用不活性基底，例如明胶和甘油，或蔗糖以及阿拉伯胶)等，每种均含有特定量的本发明的化合物(一种或多种)作为活性成分。本发明的化合物(一种或多种)还可以以推注、药糖剂以及糊状形式给药。

在用于口服给药的本发明固体制剂形式(胶囊、片剂、药丸、糖衣丸、粉末、颗粒等)中，活性成分(即达那唑、达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐，或上述物质的组合物)与一种或多种药学上可接受的载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或下述中的任何：(1)填料或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖和/或硅酸；(2)粘合剂例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、特定的硅酸盐、以及碳酸钠；(5)阻溶液剂(solution retarding agent)，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、以及它们的混合物；以及(10)着色剂。在为胶囊、片剂和药丸的情况下，药物组合物还可以含有缓冲剂。相似类型的固体组合物可以以如下形式利用：作为在利用赋形剂例如乳糖、和高分子量聚乙二醇等的、在软和硬-填充的明胶胶囊中的填料。

片剂可以通过任选与一种或多种辅助成分压缩或模塑来制备。压缩片剂可以通过使用粘合剂(例如，明胶或或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂(例如，羧甲淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性或分散剂来制备。模制片剂可以通过在适当的机械中模塑通过惰性液体稀释剂润湿的成粉末状的化合物来制备。

片剂，以及本发明药物组合物的其它固体剂型，例如糖衣丸、胶囊、药丸和颗粒剂可以任选利用涂层或壳(例如肠溶性涂层和在药剂学领域中已知的其它涂层)来获得或制备。也可以使用如下物质来制备从而可以提供其中的活性成分的缓慢或受控释放，所述物质例如，变化比例的羟丙基甲基纤维素从而提供所期望的释放曲线，其它聚合物基体，脂质体和/或微球。可以利用例如通过细菌滤器(bacteria-retaining filter)来过滤以对其进行灭菌。这些组合物还可以任选含有遮光剂，以及可以为如下的组合物，该组合物可以在胃肠道的特定部位仅释放或优选释放活性成分，任选地以延迟的方式释放。可以使用的包埋组合物的实例包括多聚物质和蜡。活性成分也可以为微囊化形式。

用于本发明化合物的口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以含有通常用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(尤其是棉花子油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇以及山梨糖醇酐的脂肪酸酯、以及它们的混合物。

除了惰性稀释剂，口服组合物还可以包括例如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜化剂、调味剂、着色剂、芳香剂以及防腐剂。

除了活性成分之外，悬浮液还可以含有悬浮剂例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨糖醇酐酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、膨润土、琼脂以及黄蓍树胶，以及它们的混合物。

本发明还提供适合用于眼部治疗的药物产品。这样的药物产品包括药物组合物、装置和植入物(其可以是组合物或装置)。

用于向眼球中眼内注射本发明的化合物(一种或多种)的药物制剂(组合物)包括：溶液、乳剂、悬浮液、颗粒、胶囊、微球、脂质体、基体等。参见，例如，美国专利No.6,060,463，美国专利申请公开No.2005/0101582和PCT申请WO 2004/043480，在此将它们完整的公开内容引入作为参考。例如，用于眼内注射的药物制剂可以包括一种或多种本发明的化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗的含水或不含水溶液、悬浮液或乳剂，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、悬浮剂、增稠剂或增粘剂(例如透明质酸聚合物)。合适的含水和不含水载体的实例包括：水、盐水(优选0.9％)、含葡聚糖的水(优选5％)、缓冲液、二甲基亚砜、醇类和多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)。这些组合物还可以包含辅助剂，例如润湿剂和乳化剂，以及分散剂。此外，可注射药物型的延长吸收可以通过包含在延迟吸收的试剂中来实现，所述试剂例如聚合物和明胶。可注射积存型(injectable depot form)可以通过将药物结合到微胶囊或微球中来制备，所述微胶囊或微球由生物可降解聚合物例如聚乳酸-聚羟基乙酸制备。其它生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯和聚酸酐(poly(anhydrides))。积存注射制剂(depot injectable formulation)也可以通过使药物陷入到与眼部组织相容的脂质体(由常用组分形成，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱)或微乳剂中来制备。根据药物和聚合物或脂质的比例，具体的聚合物或脂质成分的性质，所使用的脂质体的类型，以及微胶囊或微球被是否被包覆，可以控制药物从微胶囊、微球和脂质体中释放的速率。

本发明化合物也可以通过外科手术作为眼部植入物的形式给药。例如，可以将具有聚乙烯醇或聚乙酸乙烯酯扩散壁以及含有本发明化合物(一种或多种)储存容器(reservoir container)移植到巩膜中或移植到巩膜上。另外的例子，可以将本发明的化合物(一种或多种)结合到由聚合物制备的聚合物基体中，所述聚合物例如聚己内酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚酸酐或脂质(例如癸二酸)，并将其移植到巩膜上或眼部内。上述方法通常通过下述过程来完成：针对接受局部或部分麻醉的动物并且利用在角膜后的小切口。然后，通过切口插入该基体并且与巩膜缝合。

本发明的化合物还可以局部给药到眼部，本发明优选的实施方式为适用于眼部的局部的药物组合物。适用于眼部的局部的药物组合物包括溶液、悬浮液、分散液、滴剂、凝胶、水凝胶以及软膏剂。参见，例如美国专利No.5,407,926和PCT申请WO 2004/058289、WO 01/30337和WO 01/68053，在此将它们完整的公开内容引入作为参考。

适用于眼部的局部的制剂包括在含水或不含水基底中的一种或多种本发明的化合物。局部的制剂还可以包括吸收促进剂、渗透促进剂、增稠剂、粘度提高剂、用于调节和/或保持pH的试剂、用于调节渗透压的试剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲液、盐(优选氯化钠)、助悬剂、分散剂、增溶剂、稳定剂和/或张度剂。适用于眼部的局部的制剂优选包括吸收或渗透促进剂以促进本发明化合物(一种或多种的)吸收或渗透到眼部中，和/或包括可以提高本发明的化合物(一种或多种)在眼部的停留时间的增稠剂或粘度提高剂。参见PCT申请WO 2004/058289、WO 01/30337和WO 01/68053。吸收/渗透促进剂的例子包括单独的二甲基砜或与二甲基亚砜结合的二甲基砜、羧酸和表面活性剂。增稠剂和粘度提高剂的例子包括葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、

纤维素类聚合物(例如羟丙基甲基纤维素)、含羧基的聚合物(例如丙烯酸的聚合物或共聚物)、聚乙烯醇和透明质酸或其盐。

适合用于眼部治疗的液体剂型(例如，溶液、悬浮液、分散液以及滴剂)可以通过例如如下方法来制备：将本发明的化合物(一种或多种)溶解、分散、悬浮等在载体中，所述载体例如水、盐水、含水葡聚糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液、分散液或悬浮液。如果需要，该药物制剂还可以含有微量无毒性的辅助物质，例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂等，例如，乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠(triethanolamine sodium acetate)、三乙醇胺油酸酯等。

适合用于眼部治疗的含水的溶液和悬浮液除了本发明的化合物(一种或多种)之外，可以包括防腐剂、表面活性剂、缓冲液、盐(优选氯化钠)、张度剂以及水。如果使用悬浮液，颗粒大小应当小于10μm以最小化对眼部的刺激。如果使用溶液或悬浮液，传递到眼部的量应当不超过50μl以防止过量的溶液或悬浮液从眼部漏出。

适合用于眼部治疗的胶体悬浮液通常通过微粒(即，微球、纳米球、微胶囊或纳米胶囊，其中微球和纳米球通常为其中陷入有、吸附有或以其它方式含有制剂的聚合物的整体颗粒，而针对微胶囊和纳米胶囊，制剂通常装入在胶囊中)来形成。这些微粒的大小的上限为约5μ～约10μ。

适合用于眼部治疗的眼部的软膏剂包括在合适的基底中的本发明的化合物(一种或多种)，所述基底例如矿物油、液态羊毛脂、白凡士林、上述物质的两种或全部三种的混合物，或聚乙烯-矿物油凝胶(polyethylene-mineraloil gel)。可以任选包括防腐剂。

适合用于眼部治疗的眼部的凝胶包括悬浮在亲水基底中的本发明化合物(一种或多种)，所述亲水基底例如Carpobol-940或乙醇、水和丙二醇的混合物(例如，以40∶40∶20的比例)。使用了胶凝剂，例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或甘草酸铵(ammoniated glycyrrhizinate)。可以任选包括防腐剂和/或张度剂。

适合用于眼部治疗的水凝胶通过与可膨胀的、形成凝胶的聚合物混合来形成，所述聚合物例如上述列出的作为增稠剂或粘度提高剂的那些，除了在本领域中被称作“水凝胶”的通常与被称作“增稠的”溶液或悬浮液的制剂相比具有更高粘度的那些制剂之外。与上述预先制成的水凝胶不同，也可以制备制剂，使得在将其给药到眼部后原位地形成水凝胶。这样的凝胶在室温下为液体但是在更高的温度下为凝胶状(因此将其称为“热可逆”水凝胶)，所述更高的温度例如当放置使其与体液接触时。提供上述性质的可生物相容的聚合物包括丙烯酸聚合物和共聚物、N-异丙基丙烯酰胺衍生物和环氧乙烷和环氧丙烷的ABA嵌段共聚物(通常被称作“泊洛沙姆(poloxamer)”，并且以

商品名可以从BASF-Wayndotte商购)。

优选的分散液为脂质体型，在这种情况下，制剂被包围在脂质体(由交替的含水隔室(compartment)和脂质双分子层构成的微囊泡)中。

可以利用含水或不含水的基底制备眼部滴剂还含有一种多种分散剂、增溶剂或助悬剂。可以借助于简单的眼部带盖的点滴瓶或借助于适合用于滴加地传递液体成分(借助于特殊形状的闭合物)的塑料瓶来传递滴剂。

还可以借助插入到眼部的浸渍有药物的固体载体来局部地施加本发明的化合物。通常通过聚合物的溶出或生物侵蚀，渗透或它们的组合来影响药物的释放。可以使用一些基体型传输(matrix-type delivery)系统。这样的系统包括用所期望的本发明的化合物浸渍或浸泡的亲水的软性隐形眼镜，以及在放入到眼部后不需要将其拿出的其它生物可降解或可溶的部件。这些可溶的眼部植入物可以由眼部能够忍受的并且与待给药的本发明化合物相容的任何可降解物质形成。这样的物质包括但不限于：聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、丙烯酸乙酯以及乙烯基吡咯烷酮的聚合物和共聚物，以及交联的多肽或多糖(例如甲壳质)。

用于其它类型局部给药(即，不是针对眼部)或用于经皮肤给药本发明化合物的剂型包括粉末、喷雾、软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴片(patch)、滴剂以及吸入剂。可以在无菌条件下，将活性成分与药学上可接受的载体，与任何缓冲剂，或者根据需要与抛射剂(propellant)混合。软膏剂、糊剂、乳膏和凝胶除了含有活性成分之外，可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、膨润土、硅酸、滑石、氧化锌或它们的混合物。粉末和喷雾除了含有活性成分之外，可以含有赋形剂例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾还任选含有常用的抛射剂例如氯氟烃以及可挥发的未取代烃(例如丁烷和丙烷)。经皮贴片具有附加的优点，即提供本发明化合物到身体的可控传递。这样的剂型可以通过将本发明的一种或多种化合物溶解、分散或以其它方式结合到合适的介质中来制备，所述介质例如弹性体基体材料。吸收促进剂也可以用于增加化合物跨皮肤的流动。这样的流动的速率可以通过提供速度可控膜或将化合物分散到聚合物基体或凝胶中来控制。浸渍有药物的固体载体(例如，包扎(dressing))也可以用于局部给药。

药物制剂包括合适用于通过吸入或鼻吸入法或用于鼻部给药的那些药物制剂。对于通过吸入法给药到上(鼻部)或下呼吸道，通常通过吸入器、喷雾器或加压包(pressurized pack)或传递喷雾剂的其它方便装置来传递本发明的化合物。加压包可以包括合适的抛射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供用来传递已测定的量的阀来确定。

备选地，对于通过吸入法或鼻吸入法给药，组合物可以采取干燥粉末的形式，例如一种或多种本发明化合物，以及合适的粉末基底的粉末混合物，所述粉末基底例如乳糖或淀粉。粉末组合物可以以在例如胶囊或药筒，或者在例如明胶或泡罩包装(blister pack)中的单位剂量形式呈现，在气雾吸入器、吸入器或测定剂量的吸入器的帮助下可以从上述单元中给药粉末。

对于鼻内给药，可以借助于鼻滴剂或液体喷雾的形式给药本发明化合物，例如借助于塑料瓶喷雾器或测定剂量的吸入器。液体喷雾通常由加压包传递。喷雾器的典型例子为Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。

可以利用含水或不含水的基底制备的鼻滴剂还含有一种或多种分散剂、增溶剂或助悬剂。可以借助于简单的眼部带盖的点滴瓶或借助于适合用于滴加地传递液体成分(借助于特殊形状的闭合物)的塑料瓶来传递滴剂。

适合用于非消化道给药的本发明药物组合物包括一种或多种本发明的化合物和一种和多种药学上可接受的无菌的等渗含水或不含水溶液、分散液或乳剂、或可以在即将使用前重新形成无菌可注射溶液或分散液的粉末，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、将制剂与待受试者血液等渗的溶质，或助悬剂或增稠剂。此外，可以使用药物包覆的支架(stent)。

可以用于本发明药物组合物的合适的含水和不含水的载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及它们的适当的混合物、植物油(例如橄榄油)、以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。通过使用包覆材料(例如卵磷脂)，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。

这些组合物还可以含有辅助剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。在组合物中还期望包含等渗试剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物型的延长吸收可以通过包含在延迟吸收的试剂中来实现，所述试剂例如单硬脂酸铝和明胶。

在一些情况中，为了延长药物的效果，期望可以放慢从皮下或肌内注射中吸收药物。这可以通过使用晶体或具有较差水溶液性的无定形材料的液体悬浮液来实现。药物吸收的速率取决于其溶解的速率，其溶解的速率可能取决于晶体的大小和晶型。备选地，非消化道给药药物的延迟吸收可以通过在油媒介物中溶解或悬浮该药物来实现。

可注射积存形式可以通过在可生物降解的聚合物(例如聚乳酸-聚羟基乙酸)中形成所述药物的微胶囊型基体来制备。根据药物和聚合物的比例，使用的具体的聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚原酸酯和聚酸酐。积存注射制剂也可以通过使药物陷入到与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。可以对注射材料进行灭菌，例如利用细菌滤器来过滤。

可以将制剂放置在单位剂量或多剂量经密封的容器中，例如安瓿和药水瓶，以及可以在冻干的条件下保存并且仅需要在即将使用前，添加灭菌的液体载体，例如用于注射的水。临时的注射溶液以及悬浮液可以通过上述无菌粉末、颗粒剂和片剂类型来制备。

可以单独提供达那唑化合物以治疗涉及血管通透性过高或细胞骨架的功能障碍的疾病或病症。备选的，达那唑化合物可以与一种或多种其它适合用于治疗上述疾病或病症的治疗或药物结合提供。例如，可以在其它治疗或药物之前，结合其它治疗或药物(包括同时)，或者在其它治疗或药物之后给药该达那唑化合物。在使用另外药物的情况下，该药物和达那唑化合物可以以单独的药物组合物的形式给药或作为相同的药物组合物的部分给药。合适的药物例如描述在美国申请12/820,325号中，将其全部内容在此引用作为参考。

在本文中使用的不定冠词“a”或“an”表示一个或多个。

通过考虑下述非限制性实施例，本发明另外的主题、优点和新特征对于本领域技术人员来说是显然的。

实施例

实施例1：达那唑对于血管发生的影响(比较的)

A.HUVEC细胞增殖

步骤：

从Cambrex(Walkersville，MD)获得了初始的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和EGM-2生长培养基。在组织培养瓶中，细胞被传代到补充有2％胎牛血清(FCS)的培养基中，于37℃和5％CO₂中。当由供给人指出60-80％会合时，利用胰蛋白酶进行次代培养。

将2次传代的HUVEC的冷藏保存的安瓿解冻并以5000细胞/cm²的浓度放置在96孔组织培养板中。在乙醇中配制50mM达那唑的储存液，并且将培养基中的FCS提高至5％以保持达那唑在溶液中。利用含有达那唑终浓度在0.1～100μM范围的培养基处理细胞，重复三次。进行培养24、48和72小时，并用Promega(Madison，WI)的Celltiter 96 Aqueous One Solution CellProliferation Assay(Celltiter 96 Aqueous单细胞细胞增殖分析)测定细胞增殖。简单来说，从每个孔中吸出培养基并且利用200μl Cambrex的Hepes缓冲盐溶液(HBSS)清洗并升温至37℃。向每个孔中加入100μl经稀释的celltiter溶液(15μl原液+85μl含EGM-2的0.1％FCS)，并且再继续温育4小时。利用酶标仪使用530nm过滤片并减去空白值后测定光密度，并且利用OD±标准偏差的形式显示出数据。在每个孔中的乙醇的终浓度小于0.2％并且对于细胞增殖或生存力没有影响。

作为典型实验中呈现的所有数据均重复三次。每个亚组之间的差异利用标准t-检测在Microsoft Excel软件中进行分析。P＜0.05被认为是统计学上的显著。

结果，观察和讨论：

在一段时间，在达那唑存在时培养的初始的HUVEC减少了利用Promega celltiter增殖分析获得的OD，并且具有剂量依赖趋势(图1)。Celltiter分析基于由于脱氢酶引起的分析溶液形成的甲月替染料的减少，其直接与细胞数量关联。

在24小时时，只有在非常高的剂量下，达那唑处理似乎是有效的。在10μM或更高浓度的达那唑时观察到OD分析中的显著的降低(p值＜0.05)。在无达那唑的孔中检测到的OD为0.414±0.06，以及利用10μM达那唑处理使OD降低至0.288+0.037，而利用100μM达那唑处理使得OD降低至0.162+0.017，分别相当于30％和65％的抑制率。

在48小时时，甚至在1μM的水平时也可以观察到显著地抑制。48小时后在培养物中得到的无达那唑的读数增加至0.629±0.095，以及利用1μM时降低至0.378±0.037，利用10μM时降低至0.241±0.012，以及利用100μM时降低至0.19±0.033(或抑制率分别为40％、61％和70％)。

在72小时后，所有的达那唑处理检测显示在HUVEC增殖上显著的减少。在无达那唑的孔中得到的OD为1.113±0.054，以及在0.1μM处理后降低至0.798±0.037，在1μM处理后降低至0.484±0.022，在10μM降至0.229+0.016，以及100μM降至0.156±0.018(抑制率分别为28％、57％、80％和86％)。

在所有时间点，全部100μM达那唑剂量得到的检测结果是一致的，显示在该浓度可以完全阻止细胞增殖。

总体上，达那唑显示对内皮细胞增殖的较强的抑制。

B.HUVEC管的形成(Tube Formation)

步骤：

为了研究由HUVEC形成的毛细管样结构，从BD Biosciences(San Jose，CA)购买的血管发生系统：内皮细胞管形成分析(Endothelial Cell TubeFormation Assay)，并且根据制造商的说明书使用。简单来说，在96孔组织培养板中的再水合基质胶(rehydrated materigel plug)上接种100000HUVEC，在5％FCS的存在下，以引发管形成。添加达那唑使得终浓度为1μM、10μM或50μM，并添加50μM LY294002(阳性对照)。在18小时后，利用Kodak DCSPro SLR/N数码相机(Rochester，NY)对孔拍照，并利用倒置显微镜计数。包括经乙醇处理的孔以确定该媒介(vehicle)对于细胞分化的任何影响。

结果，观察和讨论：

为了说明达那唑能否阻止由HUVEC形成管样结构，使用了含有基质胶的96孔板。在生成血管的物质的存在下，并且提供了细胞外基质结构(extracellular matrix scaffold)培养内皮细胞，内皮细胞会分化成结构松散的类毛细血管。在达那唑存在下生长的HUVEC与对照相比，显示为具有较细和较少确定的关联的更为不组织化的结构(参见图2，其中A＝对照，B＝1μM达那唑，C＝10μM达那唑，D＝50μM达那唑，以及E＝50μM LY294002)。利用50μM达那唑处理导致位于基质胶上的分离的HUVEC群落，其具有非常少的、细的联系或血管内腔空间。达那唑的影响与阳性对照化合物LY294002非常相似。为了确定所使用的媒介没有影响，利用相当于所使用的最高剂量的达那唑的乙醇处理孔，并且观察到对于管形成没有影响(数据未示出)。这些数据显示在50μM，达那唑是管形成的有效抑制剂。在1μM或10μM，达那唑对于管形成没有影响。

C.HUVEC侵入(invasion)

步骤：

从BD Biosciences(San Jose，CA)购买BioCoat基质胶侵入室(MatrigelInvasion Chamber)。在用于增湿的培养箱之前，在37℃利用500μl HBSS对植入物进行再水合2小时。利用含有0.1％FCS的温EGM-2清洗经胰蛋白酶作用的HUVEC两次，并且将其添加到侵入植入物(invasion insert)的上部的室内，使得在总体积250μl中有100000个细胞。将达那唑和对照化合物添加到上部的储存室内使得终浓度为10μM和100μM。将补充有5％FCS的750μl EGM-2添加到底部的室内以引发侵入，并将温育平板24小时。利用润湿的棉刷从上部的室中移出非侵入性细胞(non-invasive cell)，然后用HBSS清洗植入物两次。然后将植入物浸没在HBSS中制备的10μM钙黄绿素AM中，并温育4小时。利用在485nm激发和在595nm发射的酶标仪测定荧光。LY294002以及结构上相似但非活性的化合物LY303511分别作为该实验的阳性和阴性对照。

结果：

图3示出的结果。作为典型实验中呈现的所有数据均重复三次。每个亚组之间的差异利用标准t-检测在Microsoft Excel软件中进行分析。P＜0.05被认为是统计学上的显著。

使用多孔的、基质胶包覆的植入物确定达那唑是否可以影响内皮细胞的侵入或迁移(图3)。在用于本研究的系统中，在将FCS加入到与内皮细胞相反的室内之后，通过荧光染色检测到细胞的显著增加(从5674FU±77增加至7143±516)。10μM和100μM浓度的达那唑没有影响，但LY294002显示几乎完全弱化了细胞侵入(5814±153)。这些数据显示FCS中存在的因素引发了由HUVEC生产的蛋白酶，该蛋白酶降解了细胞外基质，然后沿趋化梯度迁移。达那唑对于本模型中的HUVEC的侵入和迁移没有明显地抑制效果。

D.HUVEC迁移

步骤：

在划痕迁移分析(scratch migration assay)中进行分析以确定达那唑对于HUVEC的迁移的影响。将传代8次的HUVEC，批号8750(由Lonza获得)，放置到6孔板(ICS BioExpress)的内皮生长培养基-2(EGM-2)完全培养基(由Lonza获得)中。在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养48-72小时以获得会合的单层。然后用微量移液枪头“刮下”该单层并且用温EGM-2培养基清洗其两次。抽吸最终清洗培养基并且用新鲜的EGM-2培养基或含有一定范围浓度的达那唑(Sigma，#D8399)的新鲜的EGM-2培养基来替代最终清洗培养基。拍摄已受损的单层的照片并且将该平板放置在37℃培养箱，在5％CO₂中继续温育24小时。对孔再次拍照。利用Adobe Photoshop软件测量每张照片中的间隙，间隙的测量值通过在间隙中的像素数量来示出。

结果：

下表1中列出了三次单独实验的结果。根据表1可以看出，在该分析中发现50μM、75μM和100μM的达那唑显著地抑制HUVEC迁移。用于该分析的EGM-2培养培养基与在上述C部分描述的基质胶模型(Matrigel model)中的FCS相比，含有生长因子的混合物(cocktail)。在生长因子方面的不同可能会导致使用这两个模型得到的结果不同。

表1

化合物(一种或多种)	达那唑浓度	平均像素	平均％抑制	STD	SEM
						稀释剂对照(乙醇)		1264.00
达那唑	10μM	1004.00	21.14	14.87	8.59
						达那唑	25μM	1184.00	5.50	8.80	5.08
达那唑	50μM	895.33	27.64	17.63	10.18
						达那唑	75μM	317.33	74.62	6.80	3.93
达那唑	100μM	178.67	85.90	0.92	0.53

实施例2：达那唑对于HUVEC单层的血管通透性的影响

步骤：

进行分析以确定达那唑对于HUVEC单层的渗透性的影响。将传代5～10次的HUVEC，批号7016(由Lonza获得)接种到位于24孔板的孔中的1微米孔径植入物(Greiner BioOne 24-well Thincert细胞培养植入物，#662610或ISCBioExpress，#T-3300-15)上，使用内皮生长培养基-2(EGM-2)(由Lonza获得)。在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养48-72小时以获得会合并且形成的紧密单层。然后用新鲜的EGM-2培养基或含有一定范围浓度的达那唑(Sigma，#D8399)的新鲜的EGM-2培养基来除去上述培养基。将肿瘤坏死因子α(TNFα；Pierce Biotechnology，#RTNFAI)和白细胞介素-1β(IL-1β；Sigma，#I-9401)添加到适当的孔中，使得每一种物质的终浓度为10ng/ml。TNFα和IL-1β引发渗透性；它们可以引起渗透性增加最高10倍。最终，以最终的稀释率为1∶250，将轭合至辣根过氧化物酶(HRP)(PierceBiotechnology，#N100，1.25mg/ml)的链霉抗生物素蛋白添加到每个孔中。HRP是具有约44000分子量的大分子。在每个孔上部的室中最终体积为300μl，以及在每个孔的下部的室中最终体积为700μl。该平板在37℃培养箱，在5％CO₂中继续温育24小时。在上述温育后，移出植入物并丢弃。通过对植入物上的细胞的视觉观察显示所有的单层仍是完整的。

为了评估HRP流过液，将15μl位于下部的室中的得到的溶液转移到96孔ELISA板中(每个反应进行三次)。接下来，将100μl四甲基联苯胺(TMB)溶液(Pierce)添加到每个孔中，然后在室温下显色5分钟。通过加入100μl的0.18N酸性溶液终止显色。使用设定为450nm减530nm(450nm minus530nm)的酶标仪测定每个孔的OD。与对照比较计算渗透性的抑制比例，并且将三组单独实验的平均值列在表2中。

根据表2可以看出，在25.0μM或更高的达那唑浓度实际上增加了血管通透性。10.0μM浓度对于血管通透性的影响非常小或没有影响。在达那唑浓度为0.1μM～5.0μM，其中0.1μM～0.5μM为最佳时，达那唑降低了血管通透性。该剂量响应曲线非常有意思，因为其在0.001μM(或可能更低)～0.005μM的浓度时存在抑制的第二峰值。因此达那唑针对血管通透性显示了非常有意思并且出乎意料的剂量响应曲线。

如实施例1所示，需要达那唑的浓度为50μM～100μM使得在达那唑温育18～24小时后实现对HUVEC增殖、迁移和管形成的抑制。如实施例2所示，在24小时后，抑制血管发生的这些最佳浓度可能显著地增加血管通透性(参见表2)。相反地，用于抑制血管通透性的最佳浓度(0.1μM～0.5μM)在24小时会显著影响血管发生。

表2

化合物(s)	达那唑浓度	平均％抑制	STD	SEM
					达那唑	0.001μM	19.35	5.39	3.11
达那唑	0.005μM	16.37	8.04	4.64
					达那唑	0.01μM	-2.74	14.56	8.40
达那唑	0.05μM	7.67	8.83	5.10
					达那唑	0.1μM	35.59	23.08	11.54
达那唑	0.5μM	30.95	12.01	6.01
					达那唑	1.0μM	21.20	31.13	13.92
达那唑	5.0μM	14.63	15.30	7.65
					达那唑	10.0μM	14.29	36.85	13.03
达那唑	25.0μM	-1.06	22.60	11.30
					达那唑	50.0μM	-377.36	384.50	171.95
TNFα+IL-1β+达那唑	0.1μM	31.30	25.26	12.63
					TNFα+IL-1β+达那唑	1.0μM	29.22	16.17	7.23
TNFα+IL-1β+达那唑	10.0μM	8.47	20.45	9.14
					TNFα+IL-1β+达那唑	25.0μM	-39.93	15.53	7.76
TNFα+IL-1β+达那唑	50.0μM	-117.16	29.20	14.60

实施例3：达那唑对于血管通透性的影响

将传代9次的人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell BiologyResearch Institute，Kirkland，WA)传代至EGM-2培养基(Lonza，Walkersville，MD)中直到得到80％的会合。然后使用胰蛋白酶-EDTA使细胞从传代瓶中释放，并且对在得到的悬浮液中的细胞进行计数以确定生存力和细胞数量。在本实验中细胞悬浮液的存活力高于90％。

然后将细胞接种位于24孔板的孔中的植入物(1微米孔径)(GreinerBioOne 24-well Thincert细胞培养植入物，#662610)上，在300μl EGM-2完全培养基中(由Lonza获得)。然后将700μl EGM-2放入到下部的室中，在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养48小时以获得会合的单层。针对所有的植入物，使用附着在EVOM²伏欧表上的STX 100电极(两者均来自于World Precision Instruments)进行跨内皮电阻(TER)检测以确认半渗透屏障的建立。为了进行测量，每个探针放置在每个孔中，其中一个电极位于上部的室中一个电极位于下部的室中。

然后，按照下述步骤重复地处理细胞两次。缓慢的从植入物中倾倒出EGM-2培养基，并替换为含有0.5％胎牛血清和除了VEGF和氢化可的松之外的EGM-2添加物(均来自Lonza)。在一些孔中，IMDM培养基含有以10倍逐级稀释的一系列达那唑(Sigma，#D8399)。在向每个孔的上部的室中加入30μl含有4％荧光标记的人血清白蛋白之前，在5％CO₂下，将该平板在37℃培养箱中温育4小时。在37℃培养箱中在5％CO₂存在下，再温育该平板18小时。

在上述温育之后，移出植入物并丢弃，并将200μl培养基从下部的室转移到96孔黑色荧光-板(Falcon)中，重复三份。然后在340nm的激发波长和470nm的发射波长检测每个孔的荧光。然后计算每个植入物的平均荧光单位(Mean fluorescence unit)(FU)，对两次重复读数取平均。结果列在表3中。

表3

达那唑浓度	平均FU	STD
			无	767.13	8.38
0.01μM	688.50	14.94
			0.1μM	743.90	8.95
1.0μM	783.39	14.59
			10.0μM	768.99	18.85

可以看出，达那唑的最低浓度(0.01μM)提供最大的抑制(约10％)。在下部的室中没有细胞的对照孔显示超过4000FU，说明视网膜内皮单层是选择性渗透的。

实施例4：达那唑对于三种不同内皮细胞单层的TER的影响

进行分析以确定达那唑对人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied CellBiology Research Institute，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(transendothelialelectrical resistance，TER)的影响。为了进行，将150000个传代14次的人视网膜内皮细胞接种到位于24孔板的孔中的植入物(1微米孔径)(GreinerBioOne 24-well Thincert细胞培养植入物，#662610)上，在300μl EGM-2完全培养基(由Lonza获得)中。然后，在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养24小时。在温育之后，缓慢的从植入物中倾倒出培养培养基，并替换为新鲜的EGM-2或含有终浓度为1μM的达那唑的EGM-2。将该平板重新放回到培养箱中并再培养144小时。分析也以同样的方式利用传代8次的人脑内皮细胞和传代8次的人脐静脉内皮细胞进行。

使用与STX 100电极连接的EVOM²伏欧表(两者均来自于WorldPrecision Instruments)对每个植入物进行初始TER检测。在24、48、72和144小时也进行检测。结果列出在下表4、5和6中。所有的数据均以植入物的TER测量值/cm²减去空白植入物的TER的形式示出。

表4

人视网膜内皮细胞

达那唑浓度	0小时	24小时	48小时	72小时	144小时
						无	32.3	96.0	144.4	148.0	219.7
1.0μM	21.7	132.3	182.3	217.7	234.8

表5

人脑内皮细胞

达那唑浓度	0小时	24小时	48小时	72小时	144小时
						无	41.4	115.7	176.3	154.0	151.5
1.0μM	32.3	139.9	188.4	149.5	125.8

表6

人脐静脉内皮细胞

达那唑浓度	0小时	24小时	48小时	72小时	144小时
						无	82.3	217.2	276.3	226.8	227.3

1.0μM

70.2

246.0

364.1

270.7

286.4

可以看出，在视网膜和脐静脉内皮细胞单层中，达那唑提高了TER测量值(离子渗透性降低)。除了在较早的时间点之外，达那唑对于脑内皮细胞单层的TER没有太多影响。TER是跨细胞单层的电阻的测量值。其是屏障完整性的指标与离子渗透性相关联。

实施例5：达那唑对于Akt磷酸化的影响

进行分析以确定达那唑对于人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，AppliedCell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的Akt磷酸化的影响。细胞在25cm²瓶中的含2％胎牛血清(Lonza)的EGM-2培养基(Lonza，Walkersville，MD)中生长至接近会合。然后使用胰蛋白酶/EDTA使细胞从传代瓶中释放。对得到的悬浮液中的细胞进行计数并且以1×10⁴细胞/孔的浓度接种到96孔板上，在EGM-2培养基中。在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃温育24小时。然后，添加200μl EGM-2培养基(对照)或不同浓度的达那唑，然后再温育该平板2小时。在上述温育之后，立即用4％甲醛固定细胞、冷冻、按照制造商的说明书，使用Akt Cellular Activation of Signaling ELISA试剂盒(AKT S473的CASE^TM试剂盒；SABiosciences，Frederick，MD)确定Akt磷酸化的程度。AKT S473的CASE^TM试剂盒定量活化的(磷酸化的)Akt蛋白与总Akt蛋白的比例，在平行分析中使用利用比色法检测的传统的ELISA方式。Akt磷酸化位点为丝氨酸473，并且可以被用于两个平行分析的抗体中的一种识别，从而提供对于活化的Akt蛋白的检测。在另一个平行分析中使用的另一个抗体识别Akt以提供对于总Akt蛋白的检测。使用辣根过氧化物酶标记的二次抗体对两种一次抗体进行检测。加入制造商提供的展开溶液(Developing Solution)10分钟，然后加入制造商提供的终止溶液(StopSolution)，产生可以用比色分析法检测的结果。

下表7中列出结果。可以看出，所有浓度的达那唑均引起Akt磷酸化(活化)的增加。

表7

相信这些结果提供了对于实施例2中得到的血管通透性剂量响应曲线的可能的解释。如实施例2所示的，低剂量的达那唑降低渗透性，而高剂量则增加渗透性。相信在S473的一定水平的Akt磷酸化会减低渗透性(本实验中的0.5-5.0μM浓度)，而在S473的Akt的高度磷酸化会引起渗透性的增加(本实验中的10-50μM浓度)。

实施例6：达那唑和类固醇受体拮抗剂对于视网膜内皮细胞单层的TER的影响

进行分析以确定达那唑和类固醇受体拮抗剂对于人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(TER)的影响。为了进行，用5μg/cm²纤维连接蛋白(Sigma)包覆Greiner组织培养基孔植入物(Greiner tissue culture well insert)(Greiner BioOne24-well Thincert细胞培养植入物，#662610)。然后，将传代12次的人视网膜内皮细胞以每植入物120000个细胞的比例接种到孔上部的室中，在300μlEGM-2培养基(Lonza)中。下部的室的体积为700μl EGM-2培养基(Lonza)。在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养48小时以形成紧密的单层。在温育的末期，针对所有的植入物，使用附着在EVOM²伏欧表上的STX 2探针(两者均来自于World Precision Instruments)进行TER检测以确认内皮屏障的完整性。与无细胞的植入物相比，所有的植入物均显示出提高的电阻。

然后，缓慢地倾倒出培养培养基，并替换为具有以及不具有一些添加剂的新鲜的EGM-2。添加剂为达那唑、羟基氟他胺(雄激素受体拮抗剂)、氟维司群(雌激素受体拮抗剂)和PI3激酶抑制剂LY 294002(对照)。所有添加剂的储备溶液，除了达那唑之外，均配制成10mM在DMSO中。达那唑储备溶液为10mM在乙醇中。利用相同的溶剂制备所有添加剂的工作200μM稀释液。然后，在EGM-2培养基中配制每种添加剂的200nM稀释液，以及乙醇和DMSO的等量稀释液(对照)，将达那唑和其它添加剂中的每一种或培养基(对照)添加到孔中，且下表中示出了终浓度。然后将该平板放置在培养箱中，针对每个植入物在30分钟、60分钟、120分钟和24小时采用上述的方法进行TER检测。通过从植入物的读数中减去背景测量值并再除以植入物的表面积(0.33cm²)从而计算TER。结果列在下表8中。

表8

从表8中可以看出，与对照相比(无治疗)，达那唑和氟维司群提高了TER测量值(降低了渗透性)，而羟基氟他胺降低了读数(提高了渗透性)。达那唑阻止了由羟基氟他胺引起的降低。上述结果可以是在这些细胞中达那唑占领雄激素受体的证据。在相同的时间点，达那唑和氟维司群显示出累加的效果。

实施例7：达那唑对于肌动蛋白张力丝形成的影响

细胞旁途径的IEJ包括AJ和TJ。肌动蛋白细胞骨架与每个连接(junction)结合并且通过肌动蛋白骨重塑控制连接的完整性。肌动蛋白丝重组到张力丝中在连接上施加机械力，将它们撕开，导致形态上的细胞收缩和变化。肌动蛋白的聚合过程是非常动态的，从而使得肌动蛋白结构快速重组并且由静止表型(quiescent phenotype)转换，静止表型的特征在于具有后的皮质的肌动蛋白环和不具有张力丝，而活化的细胞表型具有细或非皮质的肌动蛋白(nocortical actin)以及具有大量张力丝。看起来肌动蛋白细胞骨架还可能通过调节细胞膜穴样凹陷的移动涉及转胞吞作用。

将人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)接种到Falcon Optilux分析平板(BD Biosciences)上，以在总体积200μl EGM-2培养基(Lonza)中每个孔1000个细胞的浓度接种。在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养48小时。然后，去除培养基并替换为添加有0.1％胎牛血清的200μl IMDM培养基(均来自Lonza)，并且在这些生长因子下培养该细胞，以及在血清饥饿条件下抑制肌动蛋白聚合1小时。然后添加达那唑(0.1μM或10μM终浓度)或PI3激酶抑制剂LY294002(10μM终浓度)(日性对照)。在加入这些化合物后，立刻加入TNFα(50ng/ml终浓度)。在5％CO₂中、于37℃培养箱温育30分钟后，吸出培养基，在室温下，用在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的3.6％甲醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。用在PBS中的0.1％Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次，并且将PBS中的罗丹明标记鬼笔环肽(Invitrogen)1∶40稀释液50μl加入到细胞中，对F-肌动蛋白进行染色，并将该细胞放置在室温下20分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。之后，向每个孔中加入100μl PBS并且使用具有罗丹明过滤片(ex530/em590)的倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。

结果显示达那唑影响张力丝形成的能力。当用达那唑处理后，取决于剂量，细胞显示出不同的染色图案。在较低的达那唑剂量(0.1μM)时，观察到遍及细胞质的散开的染色，其可能表示稳定过程或休止的表型(restingphenotype)。在较高的达那唑剂量(10.0μM)时，观察到具有多个汇聚点的张力丝。这些发现与上述较低的达那唑剂量抑制渗透性而较高的达那唑提高渗透性的结果(参见上述实施例)相关。TNFα刺激细胞使得在浓烈染色的汇聚点张力丝较强的生长。达那唑和LY294002减少利用TNFα时显示张力丝形成的细胞的数量。

实施例8：达那唑对肌动蛋白张力丝形成的影响

将人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)接种到由1μg/cm²纤维连接蛋白包覆的Falcon Optilux分析平板(BD Biosciences)上，以在总体积200μl EGM-2培养基(Lonza)中每个孔3000个细胞的浓度接种。在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养48小时。然后，去除培养基并替换为添加有2.0％胎牛血清的200μlUltraculture培养基(均来自Lonza)，并且在这些生长因子下培养该细胞，以及在血清饥饿条件下抑制肌动蛋白聚合过夜。然后除去培养基，并替换为添加有2.0％胎牛血清并含有达那唑(0.1μM、1μM或10μM)或PI3激酶抑制剂LY294002(10μM)(阳性对照)的新鲜的Ultraculture培养基。在5％CO₂中、于37℃培养箱温育30分钟后，添加血管内皮生长因子(VEGF)(终浓度25ng/ml)。在5％CO₂中、于37℃培养箱再温育30分钟后，吸出培养基，在室温下，用在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的3.6％甲醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。用在PBS中的0.1％Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次，并且将PBS中的罗丹明标记鬼笔环肽(Invitrogen)1∶40稀释液50μl加入到细胞中，对F-肌动蛋白进行染色，并将该细胞放置在室温下20分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。为了计算细胞核的染色，向每个孔中加入3μMDAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚，重复两次(Invitrogen))溶液100μl。在5分钟之后，用100μl PBS清洗细胞两次。然后向每个孔中添加100μl PBS并且使用具有罗丹明过滤片(ex530/em590)和DAPI过滤片(ex350/em460)的倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。

结果显示达那唑影响张力丝形成的能力。当用达那唑处理后，取决于剂量，细胞显示出不同的张力丝形成方式。在较低的达那唑剂量(0.1μM)时，观察到遍及细胞质的散开的F-肌动蛋白染色。在1.0μM达那唑，持续散开的染色，但是可以观察到张力丝和围绕细胞周边的汇聚点。在最高的达那唑剂量(10.0μM)时，不存在任何散开的染色，可以观察到张力丝的形成和汇聚点。在较低剂量的达那唑时观察到的染色显示为核周围的染色方式，显示出类似于利用紫杉醇(紫杉醇化合物，已知用来稳定和聚合微管)观察到的微管的稳定化。利用VEGF，具有较强的张力丝形成。达那唑以依赖于剂量的方式改变VEGF类型：(i)最低的0.1μM达那唑剂量使得张力丝不太清晰并且出现一些分散的染色；(ii)1.0μM剂量显示厚度较薄的张力丝，但那是在接触表面上可以观察到汇聚点；以及(iii)最高10.0μM达那唑剂量显示在汇聚点处的较强的张力丝形成。LY294002阻止了利用VEGF观察到的张力丝形成并且显示出散开的染色。

实施例9：达那唑对血管内皮钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白)磷酸化的影响

在37℃培养箱中具有5％CO₂的条件下，在使用EGM-2培养培养基(Lonza)的纤维连接蛋白包覆(1μg/cm²)10cm²组织培养基平板上使传代12次的人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)生长至会合。但达到完全会合时，用添加有0.5％胎牛血清和L-谷氨酰胺(均来自Lonza)的Ultraculture培养基替换上述培养基，在这些生长因子中培养上述细胞，并且在血清饥饿条件下进行24小时。然后，除去培养基并替换为添加有0.5％胎牛血清和L-谷氨酰胺含有达那唑(0.1μM、1μM或10μM)或乙醇(媒介对照)的新鲜的Ultraculture培养基。在5％CO₂中、于37℃培养箱温育15分钟后，添加血管内皮生长因子(VEGF)(终浓度为50ng/ml)，并在5％CO₂中、于37℃培养箱再温育该平板15分钟。

立刻处理该平板使得如下溶解细胞。将PBS和溶胞缓冲液(PBS含有1％Triton X-100，添加有磷酸酶抑制剂溶液1和2(Sigma)，蛋白酶抑制剂(Sigma)和原钒酸钠，终浓度2mM)冷却至4℃。用5ml冰冷PBS清洗细胞两次然后用500μl冰冷溶胞缓冲液溶解细胞。将得到蛋白质提取物转移的1.7ml微量离心管中，通过在4℃、10000rpm条件下离心10分钟除去细胞破碎物。然后，将450μl澄清的溶液转移到含有包覆有10μl C19抗-VE钙粘蛋白多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)(按照制造商的说明书进行包覆)的Protein Dynabeads(Invitrogen)的管中。然后在轨道摇床上在4℃过夜温育提取物与珠，以从提取物中捕获VE钙粘蛋白。然后用冰冷溶胞缓冲液冲洗珠四次。为了从珠上释放蛋白质，于75℃在含有20％还原染料(Invitrogen)的SDS上样染料中加热珠10分钟。

用4-20％聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)，在120V分离释放的蛋白质1小时。为了确定凝胶中总蛋白质的磷酸化，按照制造商的说明书，依次进行Pro-Q diamond(Invitrogen)和SYPRO ruby(Invitrogen)蛋白质染色。对凝胶进行拍照并使用Kodak影像工作站进行密度测定。结果如下表9所示。

表9

VE-钙粘蛋白

可以看出，达那唑引起VE-钙粘蛋白磷酸化的增加。VEGF引起VE-钙粘蛋白磷酸化更高程度的增加(高度磷酸化)，这一点被达那唑逆转。VE-钙粘蛋白是AJ的成分，取决于其残基(residue)，VE-钙粘蛋白的磷酸化能够具有很多影响。通常来说，VE-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化导致AJ分解并且增加渗透性。而丝氨酸665磷酸化与降低的屏障功能相关，引起VE-钙粘蛋白快速的但可逆的内化。似乎存在反馈回路，其中内化的(internalized)VE-钙粘蛋白驱动细胞质p120(与AJ复合的支架蛋白)的增加。这样的向上调节引起活性RhoA的降低，与屏障-稳定化GTPase的增加相关，例如Rac1、Rap-1和Cdc42。相信在本实验中观察到的在低剂量达那唑处理中的VE-钙粘蛋白磷酸化的增加导致屏障稳定GTPase的活化。此外，达那唑可以阻止由VEGF导致的磷酸化的去稳定化。

实施例10：达那唑和类固醇受体拮抗剂对于视网膜内皮细胞单层的TER的影响

进行分析以确定达那唑和类固醇受体拮抗剂对于人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(TER)的影响。为了进行，用5μg/cm²纤维连接蛋白包覆Greiner组织培养基孔植入物(Greiner BioOne 24-well Thincert细胞培养植入物，#662610)。然后，将传代13次的人视网膜内皮细胞以每植入物120000个细胞的比例接种到孔上部的室中，在300μl EGM-2培养基(Lonza)中。下部的室的体积为700μl EGM-2培养基(Lonza)。在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养48小时以形成紧密的单层。在温育的末期，针对所有的植入物，使用附着在EVOM²伏欧表上的STX 2探针(两者均来自于WorldPrecision Instruments)进行TER检测以确认内皮屏障的完整性。与无细胞的植入物相比，所有的植入物均显示出提高的电阻。

然后，缓慢地倾倒出培养培养基，并替换为具有以及不具有一些添加剂的新鲜的EGM-2。添加剂为达那唑、羟基氟他胺(雄激素受体拮抗剂)、氟维司群(雌激素受体拮抗剂)、睾酮、雌二醇和PI3激酶抑制剂LY 294002(对照)。所有添加剂的储备溶液，除了达那唑之外，均配制成10mM在DMSO中。达那唑储备溶液为10mM在乙醇中。利用相同的溶剂制备所有添加剂的工作200μM稀释液。然后，在EGM-2培养基中配制每种添加剂的200nM稀释液，以及乙醇和DMSO的等量稀释液(对照)，将达那唑和其它添加剂中的每一种或培养基(对照)添加到孔中，且下表中示出了终浓度。然后将该平板放置在培养箱中，针对每个植入物在5分钟、30分钟、60分钟和24小时采用上述的方法进行TER检测。通过从植入物的读数中减去背景测量值(空白植入物)并再除以植入物的表面积(0.33cm²)从而计算TER。结果列在下表10中。

从表10中可以看出，与对照相比(无治疗)，达那唑提高了TER测量值，羟基氟他胺降低了读数，睾酮稍稍降低了读数，以及氟维司群基本没有影响。达那唑阻止了由羟基氟他胺引起的降低，而稍微降低睾酮中的结果。如实施例6中的结果，这些结果可以是在这些细胞中达那唑占领雄激素受体的证据。

表10

实施例11：达那唑对于肌动蛋白张力丝形成的影响

将传代6次的人肾脏的血管小球的微血管内皮细胞(ACBRI 128，CellSystems Corporation(Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)以及传代12次的人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Cell SystemsCorporation(Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)接种到由5μg/cm²纤维连接蛋白包覆的16-室载玻片中，以在总体积200μl EGM-2培养基(Lonza)中每个孔2000个细胞的浓度接种。在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养48小时。然后，将用Hanks平衡盐溶液(HBSS；Lonza)稀释的测试化合物(达那唑，TNFα和S1P)添加并得到以下终浓度：达那唑(1μM)(Sigma)，TNFα(1ng/ml)(Sigma)，以及S1P(1μM)(Sigma)。将该载玻片与测试化合物一起温育15分钟、30分钟、或24小时，在具有5％CO₂的37℃培养箱中。在上述温育后，吸出培养基，在室温下，用在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的3.6％甲醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。用在PBS中的0.1％Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次，并且将PBS中的罗丹明标记鬼笔环肽(Invitrogen)1∶40稀释液50μl加入到细胞中，对F-肌动蛋白进行染色，并将该细胞放置在室温下20分钟。所有的孔均用100μl PBS清洗两次。之后，向每个孔中加入100μl PBS并且使用具有罗丹明过滤片(ex530/em590)的倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。

结果显示达那唑影响张力丝在人肾脏的血管小球的微血管内皮细胞中形成的能力。当用达那唑单独处理时，在15分钟细胞展示出核周围染色，在3小时，许多细胞中出现遍及具有褶皱边缘的细胞散开的染色，并且在24小时，其具有与未处理的对照类似的染色。单独利用TNFα，在所有时间观察到张力丝，展示张力丝的细胞数量和纤维的厚度随时间增加。在所有时刻，达那唑降低张力丝的形成并且降低纤维的厚度，在3小时，开始观察到皮质肌动蛋白环和有褶皱的边缘。单独用S1P处理细胞，显示出肌动蛋白皮质环(cortical ring)，其在15分钟开始形成并且在3小时时最强。在24小时，细胞重新返回到与未处理的对照相似的形态。达那唑似乎增强了皮质环。此外，观察到了散开的染色，尤其是在15分钟和24小时。

利用达那唑单独处理视网膜内皮细胞，在15分钟，细胞显示出核周围染色，在3小时，许多细胞中出现遍及具有褶皱边缘的细胞散开的染色，并且在24小时，其具有与未处理的对照类似的染色。单独利用TNFα，在所有时间观察到张力丝，展示张力丝的细胞数量和纤维的厚度从15分钟增加至3小时，并在24小时温育后开始降低。在所有时刻，达那唑降低张力丝的形成并且降低纤维的厚度。在15分钟和24小时，观察到散开的染色，在3小时可以看到皮质肌动蛋白环。单独用S1P处理细胞，显示出肌动蛋白皮质环，其在15分钟开始形成并且在3小时时最强。在24小时，细胞重新返回到与未处理的对照相似的形态。在3小时，达那唑似乎增强了皮质环。此外，观察到了散开的染色，尤其是在15分钟和24小时。

S1P(鞘氨醇-1磷酸盐)在血管内皮的形成和保持上起着非常重要的作用。S1P是构成的信号输入(constitutive signaling input)，其通过对于肌动蛋白细胞骨架的影响促进血管内皮的组构和屏障功能。尤其是，S1P涉及皮质肌动蛋白纤维的形成以及粘附连接的组构。S1P的缺失会导致血管泄露和水肿，以及S1P可以逆转内皮功能障碍和修复屏障功能。

在本实验中，达那唑显示出强化在视网膜和血管小球的内皮细胞两者中的S1P的保护效果的能力。达那唑还可以逆转在这些内皮细胞类型中由TNFα引起的张力丝的形成。在单独用达那唑处理的细胞中观察到散开的核周围染色。

实施例12：达那唑对ECIS的影响

进行分析以确定达那唑对人肾脏血管小球的微血管内皮细胞(ACBRI128，Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)或人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Cell SystemsCorporation(Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(TER)的影响。使用细胞阻抗测试传感器(ECIS)系统(ECISZθ，由Applied Biophysics获得)，具有8孔多电极板(8W10E)测定电阻。如下利用在HBSS中的5μg/cm²纤维连接蛋白包覆板的每个孔：向每个孔中加入100μl的纤维连接蛋白并且在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养30分钟。除去纤维连接蛋白溶液，向每个孔中加入400μlEGM-2培养培养基(Lonza)。将该平板与ECISZθ系统连接并且使其电稳定。吸出每个孔的EGM-2培养基并替换为200μl含100000个细胞的EGM-2培养培养基。将该平板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱温育24小时。吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为400μl新鲜的EGM-2培养培养基。将该平板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱温育6小时。准备HBSS中的测试化合物的浓缩溶液并且放置在培养箱中使其平衡。然后按照下述浓度将测试化合物加入到合适的孔中：达那唑(1μM)(Sigma)和S 1P(1μM)(Sigma)。检测ECIS(阻抗)90小时。

在视网膜内皮细胞中，在进行处理之后的约1.5-2.0小时，与未处理细胞相比，单独的1.0μM达那唑显示ECIS的增加，并且持续5小时。在进行处理之后的第一个15分钟内，与未处理细胞相比，单独的S1P显示ECIS的增加，并且持续约3小时。与S1P单独和未处理的细胞相比，达那唑和S1P结合增加了ECIS，该增加的ECIS持续约90小时。因此，达那唑显示提高S1P早期效果的能力，以及当S1P存在时在整个实验中保持更高的阻抗的能力。

血管小球的内皮细胞显示出不同的模式。单独的达那唑对于ECIS没有影响直到处理之后约30小时。与未处理的细胞相比，从约30小时～约90小时，单独的达那唑增加ECIS，并且在约60-90小时出现最大增加。单独的S1P也对于ECIS没有影响直到处理之后约30小时。与未处理的细胞相比，从约30小时～约60小时，单独的S1P增加ECIS。达那唑和S1P的结合对于ECIS没有影响直到处理之后约30小时。与未处理的细胞、S1P单独和达那唑单独相比，上述结合增加了ECIS。具体来说，与未处理的细胞相比，该结合从约30～约70小时增加ECIS，与S1P单独相比，该结合从约30～约75小时增加ECIS，与达那唑单独相比，该结合从约30～约50小时增加ECIS。

实施例13：达那唑对ECIS的影响

进行分析以确定达那唑对人肾脏血管小球的微血管内皮细胞(ACBRI128，Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(TER)的影响。使用细胞阻抗测试传感器(ECIS)系统(ECISZθ，由Applied Biophysics获得)，具有8孔多电极板(8W10E)测定电阻。如下利用在HBSS中的5μg/cm²纤维连接蛋白包覆板的每个孔：向每个孔中加入50μl的纤维连接蛋白并且在存在5％CO₂的条件下，将该平板在37℃培养箱中培养30分钟。除去纤维连接蛋白溶液，向每个孔中加入200μl EGM-2培养培养基(Lonza)。将该平板与ECISZθ系统连接并且使其电稳定。吸出每个孔的EGM-2培养基并替换为200μl含40000个传代6次的细胞的EGM-2培养培养基。将该平板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱温育24小时。吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为200μl新鲜的EGM-2培养培养基。将该平板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱温育24小时。吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为200μl没有地塞米松的新鲜EGM-2培养基。将该平板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱温育过夜。最终，吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为200μl没有地塞米松的新鲜EGM-2培养基。将该平板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱温育2小时。准备HBSS中的测试化合物的浓缩溶液并且放置在培养箱中使其平衡。然后按照下述浓度将测试化合物加入到合适的孔中：达那唑(1μM)(Sigma)和地塞米松(1μM)(Sigma)。检测ECIS(阻抗)90小时。

在约3小时，与未处理的细胞相比，单独的达那唑增加ECIS并持续约90小时。该增加在约12～约15小时最大。与地塞米松相比，达那唑显示相似的形式，但是ECIS(TER)的增加没有地塞米松显著。

实施例14：达那唑对于RhoA的影响

内皮细胞细胞骨架的骨再塑对于内皮的许多功能是重要的。Rho家族小GTP-结合蛋白被认为是F-肌动蛋白细胞骨架动力学(cytoskeletal dynamics)的关键调节剂。Rho家族包括三个亚型：RhoA、RhoB和RhoC。RhoA活性的活化导致在内皮细胞中张力丝明显形成。利用凝血酶刺激内皮细胞增加Rho GTP以及肌球蛋白磷酸化，其与增加的细胞收缩性一致。RhoA的抑制阻断该响应，以及屏障功能的丧失显示Rho在血管通透性的关键作用。

使用从Cytoskeleton，Denver，Colorado购买的可商购的Rho活化分析(GLISA)，按照制造商的说明书进行该实验。简单来说，在纤维连接蛋白-包覆的(1μg/cm²)6-孔组织培养基板上，使用EGM-2培养培养基(Lonza)，在具有5％CO₂的37℃培养箱中，培养了传代8次或12次的人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)24小时(30000个细胞/每个孔具有3ml的总体积)。然后，吸出培养基并替换为添加有0.1％胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素和ITSS(胰岛素，运铁蛋白亚硒酸钠(transferrin sodium selenium))(所有均来自Lonza)的Ultraculture培养基，得到血清饥饿细胞并且减少RhoA的背景值。在具有5％CO₂的37℃培养箱中培养该细胞24小时。在加入到细胞中之前，将在HBSS中稀释的测试化合物放置在培养箱中使其平衡。然后，将150μl每种测试化合物加入到合适的培养孔中，然后在培养箱中再温育该平板15分钟。然后，将凝血酶加入到适当的孔中。1分钟之后，用1.5ml磷酸盐缓冲盐溶液清洗细胞1次，并且然后用100μl添加有蛋白酶抑制剂的GLISA溶胞缓冲液溶解细胞。刮下提取物，并转移到微量离心管中并转移到冰上以保存RhoA的活性形式。通过在4℃、10000rpm条件下离心10分钟除去细胞破碎物得到澄清的所有提取物。然后将上清液转移的新的管子中并且放回到冰上。取出每个提取物的等量样品用于GLISA分析和蛋白质测定。所有的蛋白质浓度均在10％以内，以及以所获得浓度(相当于每孔15μg总蛋白质)使用该提取物。GLISA分析通过使用试剂盒中提供的试剂来进行。

表11列出了传代12次的视网膜内皮细胞的结果。如所预料的，由凝血酶诱导的活性RhoA水平非常高。所有的测试化合物均抑制了Rho A的凝血酶-诱导活化。

表12列出了传达8次的视网膜内皮细胞的结果。如所预料的，由凝血酶诱导的活性RhoA水平非常高。所有的测试化合物均抑制了Rho A的凝血酶-诱导活化。

表11

*由Sigma获得

表12

实施例15：血管通透性过高的动物模型

每天新西兰白兔口服接受0.215mg/kg达那唑两次，共7天。然后在玻璃体内向所述兔子注射血管内皮生长因子A(VEGF-A)以在视网膜中产生血管泄露。然后，24小时之后，注射荧光素钠，使用Fluorotron(Ocumetrics)测量眼部的荧光(5次测量取平均)。一只对照(安慰剂)兔子在视网膜中具有250荧光单位，说明其中血管泄露。单独达那唑处理的兔子具有16荧光单位，显示达那唑使得血管泄露降低了94％。

Claims

1.一种在有需要的动物中抑制血管通透性过高的方法，其包括向所述动物给药血管-通透性过高-抑制量的达那唑化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物因为存在由血管通透性过高引起的疾病或病症而需要达那唑化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，一旦诊断出所述疾病或病症，立即开始给药达那唑化合物。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述疾病或病症为糖尿病。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述疾病或病症为动脉粥样硬化。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述疾病或病症为高血压。

7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述疾病或病症为急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征，老化相关性黄斑变性、脑水肿、脉络膜水肿、脉络膜炎、冠状微血管疾病、脑微血管疾病、伊尔斯氏病、由损伤引起的水肿、与高血压相关的水肿、血管小球的血管泄露、失血性休克、欧文-加斯综合征、缺血、黄斑水肿、肾炎、肾病、肾病水肿、肾病综合征、神经病、组织水肿引起的器官衰竭、先兆子痫，肺水肿、肺高血压、肾功能衰竭、视网膜水肿、视网膜出血、视网膜静脉阻塞、视网膜炎、视网膜病变、无症状性脑梗死、全身炎症反应综合征、移植肾肾小球病、葡萄膜炎、血管泄露综合征、玻璃体出血或Von Hipple Lindau病。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述疾病或病症为黄斑水肿。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述疾病或病症为神经病。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述疾病或病症为视网膜病。

11.根据权利要求2所述的方法，其中，所述疾病或病症为糖尿病的血管并发症。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述血管并发症为水肿、低密度脂蛋白在内皮下空间聚集、加速的动脉粥样硬化、脑血管壁的加速老化、心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍、糖尿病性心肌病、在患糖尿病的母亲中胎儿肺部发育的滞后、一种或多种肺部生理学参数的变化、感染敏感性增加、肠系膜中的血管增生、糖尿病性神经病变、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、以及皮肤的发红、变色、干燥和溃疡。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述血管并发症为水肿。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述血管并发症为糖尿病性心肌病。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述血管并发症为糖尿病性神经病变。

16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述血管并发症为糖尿病性黄斑水肿。

17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述血管并发症为糖尿病性视网膜病。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述糖尿病性视网膜病为非增生性糖尿病性视网膜病。

19.根据权利要求12所述的方法，其中，所述血管并发症为糖尿病性肾病。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物因有一种或多种发生由血管通透性过高引起的疾病或病症的早期表现或倾向，而需要达那唑化合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述疾病或病症为糖尿病、高血压或动脉粥样硬化。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述血管通透性过高是下述部位或下述部位周围发现的连续性内皮的血管通透性过高，所述部位为：脑、膈、十二指肠、脂肪、心脏、肾脏、大血管、肺部、肠系膜、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤或睾丸。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，在下述部位或下述部位周围发现所述连续性内皮，所述部位为：脑、心脏、肺部、神经或视网膜。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述血管通透性过高是在下述部位或下述部位周围发现的开窗内皮的血管通透性过高，所述部位为：肾脏、胰脏、肾上腺、内分泌腺或肠。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，在肾脏中发现开窗内皮。

26.根据权利要求1～25中任一项所述的方法，其中，所述达那唑化合物是达那唑。

27.根据权利要求1～26中任一项所述的方法，其中，所述达那唑化合物口服给药。

28.根据权利要求1～27中任一项所述的方法，其中，所述动物是人。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述血管-通透性过高-抑制量是每天1ng～100mg达那唑化合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述血管-通透性过高-抑制量是每天1mg～100mg达那唑化合物。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述血管-通透性过高-抑制量是每天10mg～90mg达那唑化合物。

32.一种调节动物中内皮细胞的细胞骨架的方法，其包括向动物给药有效量的达那唑化合物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述调节细胞骨架包括抑制肌动蛋白张力丝形成。

34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述调节细胞骨架包括引起、增加或延长皮质肌动蛋白环的形成。

35.根据权利要求32所述的方法，其中，所述调节细胞骨架包括抑制RhoA。