CN102482640B - 人胚胎干细胞的分化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素生成细胞的方法。具体地讲，本发明提供移植到动物体内后产生能够生成胰岛素的细胞的方法。

Description

人胚胎干细胞的分化
相关专利申请的交叉引用
本发明要求于2009年7月20日提交的系列号为61/226,936的专利申请的优先权。
技术领域
本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素生成细胞的方法。具体地讲，本发明提供移植到动物后产生能够生成胰岛素的细胞的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes49：157，2000)报道，小鼠胚胎干细胞衍生的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖恢复正常。
在一个例子中，Hori等人(PNAS99：16105，2002)公开了用磷酸肌醇3-激酶的抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。
又如，Blyszczuk等人(PNAS100：998，2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生产胰岛素的细胞。
Micallef等人报道，视黄酸可以调控胚胎干细胞定向形成PDX1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末期的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸在诱导Pdx1方面最有效(Diabetes54：301，2005)。
Miyazaki等人报道过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡糖激酶、神经元素3、p48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes53：1030，2004)。
Skoudy等人报道，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到了最大的效果。他们还观察到，胰岛素和Pdx1mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致了Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细胞(Genes Cells.2005年6月；10(6)：503-16)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury[阳性]/HNF3β[阳性]内胚层细胞(US2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006年)声称：“Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
在一个例子中，Benvenistry等人声称：“我们得出结论认为，Pdx1的过表达提高了胰腺富集基因的表达，胰岛素表达的诱导可能需要另外的仅存在于体内的信号”(Benvenistry等人，Stem Cells2006；24：1923-1930)。
又如，Grapin-Botton等人声称：“Ngn3的早期活化几乎完全诱导胰高血糖素阳性细胞，同时耗竭了胰腺祖细胞库。从E11.5开始，PDX-1祖细胞具备了分化成胰岛素[阳性]和PP[阳性]细胞的能力”(JohanssonKA等人，Developmental Cell12，457-465，2007年3月)。
NGN3在表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞中的表达可降低细胞进一步分化为胰岛素表达细胞的能力。以前的研究已表明，当经历进一步分化时，表达NGN3的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞更有可能产生胰高血糖素表达细胞，而不是胰岛素表达细胞。然而，NGN3表达对于形成胰腺内分泌细胞或胰腺内分泌前体细胞(可形成例如胰高血糖素表达细胞或胰岛素表达细胞的细胞)是必须的。因此，对NGN3的时间调控对于引导胰腺内分泌前体细胞向胰岛素表达细胞分化的最终命运是重要的。
因此，仍然非常需要开发用于建立能扩增以满足当前临床需要，同时又保持分化为胰岛素表达细胞的潜能的多能干细胞系的条件。本发明采取替代方法，通过产生表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群来提高使人胚胎干细胞向胰岛素表达细胞分化的效率，其中所述细胞群共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3。本发明的方法能维持最低水平的NGN3表达直至胰腺内胚层开始向胰腺内分泌前体细胞分化。
发明內容
在一个实施例中，本发明提供了表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群，该细胞群共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3。在一个实施例中，该细胞群移植到动物体内后能够产生C-肽。
在一个实施例中，本发明提供一种方法使多能干细胞群分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群，该细胞群共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3，所述方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
c.通过用补充有FGF7的第一培养基处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后将所述细胞在补充有FGF7、能够抑制BMP的因子、TGF-β受体激动剂、视黄酸和刺猬蛋白信号传导通路抑制剂的第二培养基中培养，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，这些细胞共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3。
附图说明
图1示出了在根据实例1所述方法处理过的细胞中，在第3阶段第4天时，激活素A对NKX6.1、NGN3、PDX1、PTF1α和ARX的表达的影响。收集重复样品用于实时PCR分析。该图表示各基因相对于对照组(浅灰色柱条)的诱导倍数。深灰色柱条表示用FGF7、环巴胺-KAAD、视黄酸、20ng/ml激活素A和成头蛋白处理的细胞。黑色柱条表示用FGF7、环巴胺-KAAD、视黄酸、50ng/ml激活素A和成头蛋白处理过的细胞。
图2示出了免疫荧光图像，显示了NKX6.1(分图a、c和e)和NGN3(分图b、d和f)在下列细胞中的表达：用FGF7+成头蛋白+视黄酸+KAAD-环巴胺处理过的细胞(分图a和b)或用FGF7+成头蛋白+视黄酸+KAAD-环巴胺+20ng/ml激活素A处理过的细胞(分图c和d)，以及用FGF7+成头蛋白+视黄酸+KAAD-环巴胺+Alk5抑制剂II处理过的细胞。
图3示出了免疫荧光图像，显示了PDX1(分图a和c)、CDX2(分图b和d)在下列细胞中的表达：用补充有1％B27+FGF7+成头蛋白+视黄酸+KAAD-环巴胺+20ng/ml激活素A的DMEM-高葡萄糖处理过的细胞(分图a和b)，以及用补充有1％B27+FGF7+成头蛋白+视黄酸+KAAD-环巴胺+20ng/ml激活素A的DMEM/F12处理过的细胞(分图c和d)。
图4示出了在根据实例1所述方法处理过的细胞中，在第3阶段第4天时，激活素A、激活素B、TGFβ2、GDF11和GDF8对NKX6.1、NGN3和PDX1的表达的影响。收集重复样品用于实时PCR分析。该图表示各基因相对于用FGF7+环巴胺-KAAD+视黄酸+成头蛋白处理过的组的诱导倍数。
图5示出了在根据实例2所述方法处理过的细胞中，在第4阶段第3天时，成头蛋白和Alk5抑制剂II处理对NGN3、NEUROD、NKX2.2和PAX6的表达的影响(分图a)，以及对NKX6.1、PDX1和PTF1α(分图b)的表达的影响。收集重复样品用于实时PCR分析。该图表示各基因相对于仅使用基础培养基(DMEM-高葡萄糖+1％B27)的组(浅灰色柱条)的诱导倍数。深灰色柱条表示用成头蛋白和Alk5抑制剂II处理过的细胞。
图6示出了用FGF7+成头蛋白+视黄酸+KAAD-环巴胺+激活素A处理四天，然后用成头蛋白和Alk5抑制剂II处理三天的细胞的免疫荧光图像，如实例2所述。分图a示出了NKX6.1、NGN3的表达以及NKX6.1和NGN3叠加的表达。分图b示出了PDX1、NGN3的表达以及PDX1和NGN3叠加的表达。
图7示出了在实例3所述处理方案的第4阶段第3天(浅灰色柱条)或第5阶段第3天(深灰色柱条)或第5阶段第7天(黑色柱条)时，细胞中NGN3、PAX4、PDX1、NKX6.1、NEUROD、胰岛素和胰高血糖素的表达。收集重复样品用于实时PCR分析。该图表示各基因相对于第4阶段第1天检测的表达的诱导倍数。
图8示出了免疫荧光图像，显示了在实例3所述处理方案的第5阶段第7天时，细胞中胰岛素、胰高血糖素和NKX6.1的表达。还示出了胰岛素和胰高血糖素表达的叠加，以及胰岛素和NKX6.1表达叠加。
图9示出了在肾囊下接受了本发明细胞的STZ诱导糖尿病SCID-beige小鼠中，血循环人C-肽水平(分图a)和非空腹血糖水平(分图b)。在标示的时间检测了C-肽水平和血糖水平。
具体实施方式
为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多数的组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但所有细胞谱系都只分布于特定组织、器官或生理系统内(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括：HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能够产生比专能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”或“第1阶段细胞”或“第1阶段”是指表达至少一种下列标志物的细胞：SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Noda1、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4 CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
本文所用的“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：PDX1、HNF1β、PTF1α、HNF6、NKX6.1或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平，在所关注细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指能够表达下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可以表达一种或多种阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可使用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物(Thomson等人，Science282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述(Vector Laboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT，这可通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三个胚层的细胞类型。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括确立多能细胞系。非限制性例子是确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v(BresaGen，Athens，GA)。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。作为另一种选择，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行实质分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
Amit等人(Biol.Reprod68：2150-2156，2003)公开了衍生自人包皮的饲养细胞层。
又如，Inzunza等人(Stem Cells23：544-549，2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声称：“本发明包括从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以及用该调理培养基培养干细胞的方法”。
又如，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的条件培养基。WO2005014799声称：“通过鼠细胞(特别是分化并永生化的转基因肝细胞，称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本发明制备的培养基进行调理”。
又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。
一种备选的培养系统采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprodDOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，US20050233446公开了一种用于培养干细胞，包括未分化的灵长类原始干细胞的限定培养基。在溶液中，此培养基与培养中的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行实质上非分化性生长所必需的。
又如，US6800480声称：“在一个实施例中，提供了用于以基本上未分化状态培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包括低渗透压、低内毒素基础培养基，此培养基对于支持灵长类来源的原始干细胞的生长是有效的。该基础培养基混合了有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质。该培养基还包含非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子”。
又如，US20050244962描述：“在一个方面，本发明提供了一种培养灵长类胚胎干细胞的方法。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选也基本上不含任何动物血清)的培养物中，并在存在由不只是成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子情况下培养干细胞。在优选的形式中，通过添加足量的成纤维细胞生长因子，使得之前为维持干细胞培养物所需的成纤维细胞饲养层变为非必需的”。
在另外的例子中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养细胞和无血清的成分确定的等渗培养基，其包含：a.基础培养基；b.bFGF，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长；c.胰岛素，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长；和d.抗坏血酸，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基质是(Becton Dickenson)。是得自Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco货号11965-092；敲除达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco货号10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco货号15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma货号M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco货号13256-029。
由多能干细胞形成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞
在一个实施例中，本发明提供了由多能干细胞产生表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
c.使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX-2和NGN3。
多能干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的分化
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能细胞的分化。
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology23，1534-1541(2005)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development131，1651-1662(2004)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells25，29-38(2007)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology24，1392-1401(2006)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和血清一起培养，再然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在Nature Biotechnology23，1534-1541(2005)中进行了公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2005中进行了公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A和Wnt配体的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与激活素A和血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在Nature Biotechnology24，1392-1401(2006)中进行了公开。
例如，可根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/736,908的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/779,311的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为60/990,529的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为61/076,889的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为No.61/076,900的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为61/076,908的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为61/076,915的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞向表达胰腺内胚层谱 系特征性标志物的细胞的分化
在一个实施例中，通过在补充有FGF7的第一培养基中培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后将所述细胞在补充有FGF7、能够抑制BMP的因子、TGFβ受体激动剂、视黄酸和刺猬蛋白信号传导通路抑制剂的第二培养基中培养，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，这些细胞共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3。
在一个实施例中，FGF7可以按约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF7按50ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，能够抑制BMP的因子为成头蛋白。成头蛋白可以按约500ng/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，成头蛋白以100ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，TGFβ受体激动剂选自激活素A、激活素B、TGFβ-I、TGFβ-II、GDF-8和GDF-11。
激活素A可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，激活素A按20ng/ml的浓度使用。在一个备选实施例中，激活素A按50ng/ml的浓度使用。
激活素B可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，激活素B按20ng/ml的浓度使用。在一个替代实施例中，激活素B按50ng/ml的浓度使用。
TGFβ-I可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，TGFβ-I按20ng/ml的浓度使用。在一个替代实施例中，TGFβ-I按50ng/ml的浓度使用。
TGFβ-II可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，TGFβ-II以20ng/ml的浓度使用。在一个替代实施例中，TGFβ-II按50ng/ml的浓度使用。
GDF-8可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，GDF-8按20ng/ml的浓度使用。在一个替代实施例中，GDF-8按50ng/ml的浓度使用。
GDF-11可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，GDF-11按20ng/ml的浓度使用。在一个替代实施例中，GDF-11按50ng/ml的浓度使用。
视黄酸可以按约1nM至约1mM的浓度使用。在一个实施例中，视黄酸按1μM的浓度使用。
在一个实施例中，刺猬蛋白信号传导通路抑制剂为环巴胺-KAAD。环巴胺-KAAD可以按约0.025μM至约2.5μM的浓度使用。在一个实施例中，环巴胺-KAAD按0.25μM的浓度使用。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印迹、原位杂交(参见例如“Current Protocolsin Molecular Biology”(Ausubel等人编辑，2001年增刊))，以及免疫测定如切片材料的免疫组织化学分析、蛋白质印迹，以及对于可在完整细胞中接触到的标志物，有流式细胞分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且其他特征有待继续辨别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种如下物质的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(如CXCR4)来纯化分化的细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，Sweden)。同样适用于本发明的是表达至少一种下列多能细胞特征性标志物的细胞：ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、NODAL、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成
在一个实施例中，还可以使由本发明方法产生的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞(共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3)进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后除去含有毒蜥外泌肽-4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中进行了公开。
例如，通过在含有DAPT(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明方法获得的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中进行了公开。
例如，通在含有毒蜥外泌肽4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明方法获得的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中进行了公开。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/736,908的美国专利中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/779,311的美国专利中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为60/953,178的美国专利中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为60/990,529的美国专利中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、NGN3和PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰内分泌系特征性标志物的细胞为胰内分泌细胞。胰内分泌细胞可为表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰内分泌细胞可为分泌胰激素的细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞可表达PDX1和至少一种下列转录因子：NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4和PAX6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞移植到患者体内。在一个替代实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使多能干细胞体外分化成表达胰腺内胚层细胞谱系特征性标志物的细胞(共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3)，以及将所述共表达PDX1、NKX6.1但不表达CDX2和NGN3的胰腺内胚层谱系的细胞移植到患者体内。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病，或有发展2型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞移植到患者体内。在一个替代实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使多能干细胞体外分化成表达胰腺内胚层细胞谱系特征性标志物的细胞(共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3)，以及将所述共表达PDX1、NKX6.1但不表达CDX2和NGN3的胰腺内胚层谱系的细胞移植到患者体内。
如果合适，可用有利于该植入细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步处理。这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、高血糖素样肽-I(GLP-1)和高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂例如美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可使多能干细胞在移植进接受者前分化成胰岛素生成细胞。在一个特定的实施例中，在移植进接受者之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者中。可在该接受者中发生进一步分化。
可将定形内胚层细胞或，作为另一选择，胰腺内胚层细胞，或作为另一种选择，β细胞作为分散细胞进行移植，或可使这些细胞形成簇，可将这些细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞移植进接受者中的合适位置内。植入位点包括(例如)肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与之同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，利用生长因子使所施用的细胞在体内分化。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所施用的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。
移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞、使培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将该细胞掺入三维支持物中。在移植进患者前，可使细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将容纳有该细胞的支持物直接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成掺有药剂的支承体，可在形成支承体前将药剂与聚合物溶液混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂添加至支持物中以改变药剂的释放速率。在一个备选实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物(例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物(例如在美国专利6,793,945中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物(例如在美国专利6,331,298中所公开的化合物)掺入支持物中。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、nodal、成头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有粘附性细胞外基质蛋白例如纤粘蛋白和玻璃粘连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1Pt2)：3-9(1988))。已经发展了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。用于细胞接种的另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增强接种效率。例如，Yang等人开发了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定(Centrifugational Cell Immobilization，CCI)。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例
实例1
人多能干细胞向表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞(共表 达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3)的分化
本实例说明，激活素A可与成头蛋白和视黄酸联合使用来促进NKX6.1表达的上调。简言之，将人胚胎干细胞系H1的细胞在MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的平皿和补充有2％BSA、100ng/ml激活素A、20ng/ml WNT-3a、8ng/ml bFGF的RPMI培养基上培养一天，然后用补充有2％BSA、100ng/ml激活素A、8ng/ml bFGF的RPMI培养基再处理两天(第1阶段)，接下来
a.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/ml FGF7处理三天(第2阶段)，然后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/ml FGF7+0.25mM环巴胺-KAAD+2mM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+20ng/ml激活素A或50ng/ml激活素A处理四天(第3阶段)。
作为对照，用补充有1％B27、50ng/ml FGF7、0.25μM环巴胺-KAAD、2μM视黄酸(RA)和100ng/ml成头蛋白的高葡萄糖DMEM处理单独的细胞群。
在第3阶段的第4天对培养物进行取样，一式两份，然后用实时PCR对胰腺标志物的表达进行分析。
如图1所示出，在第3阶段第4天时，与从未接受激活素A的细胞获得的样品相比，NKX6.1表达有显著增加。由激活素A介导的NKX6.1的表达水平与激活素A的剂量成比例增加。在第3阶段的第4天也观察到了细胞中NGN3表达的下调。为了确定TGF-β通路是否涉及促进共表达PDX1和NKX-6.1的胰腺内胚层细胞的形成，下对细胞进行处理：
在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.在补充有2％BSA(目录号：152401，MP Biomedical，Ohio)和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(目录号：1324-WN-002，R&D Systems，MN)加8ng/ml bFGF(目录号：100-18B，PeproTech，NJ)的RPMI培养基(目录号：22400，Invitrogen，Ca)中培养一天，然后用补充有2％BSA和100ng/ml激活素A加8ng/mlbFGF的RPMI培养基再处理两天(第1阶段)，接下来
b.用DMEM/F12(目录号：11330，Invitrogen，Ca)+2％BSA+50ng/ml FGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.处理1：用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7、0.25μM环巴胺-KAAD、2mM视黄酸(RA)和100ng/ml成头蛋白处理四天(第3阶段)，或
d.处理2：用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7、0.25μM环巴胺-KAAD、2μM视黄酸(RA)、100ng/ml成头蛋白、20ng/ml激活素A处理四天(第3阶段)，或
e.处理3：用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7、0.25μM环巴胺-KAAD、2μM视黄酸(RA)、100ng/ml成头蛋白、1μM ALK5抑制剂II(Alexis Biochemical)处理四天(第3阶段)。
在第3阶段的第4天对培养物进行取样，一式两份，然后用实时PCR对胰腺标志物的表达进行分析。还平行固定培养物，以进行免疫荧光分析。
表1示出了用本实验的最低条件(处理1)进行归一化时NKX6.1、NGN3和PDX1在第3阶段第4天的相对表达水平。
表1
NGN3 NKX6.1 PDX1
处理1 1 1 1
处理2 0.02 5.97 1.13
处理3 5.64 0.02 0.65
处理1(FGF7、视黄酸和成头蛋白)诱导了NKX6.1和NGN3的表达。参见图2中的分图a和b。然而，添加激活素A(处理2)阻断了NGN3的表达，并显著增加了NKX6.1表达细胞的数量。参见图2中的分图c和d。这些数据表明，在形成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群期间，激活TGFβ受体通路将会得到表达胰腺内胚层谱系特征性标志物但不表达NGN3的细胞群。
通过用TGFβ受体抑制剂Alk5抑制剂II来温育细胞证实了这一假设(参见处理3)。将细胞在添加了1％B27(Invitrogen，CA)、50ng/mlFGF7、0.25mM环巴胺-KAAD、2mM视黄酸(RA)、100ng/ml成头蛋白、1mM ALK5抑制剂II的DMEM(高葡萄糖)中进行处理导致了NKX6.1表达水平降低。所观察到的表达水平低于在接受处理1的细胞中观察到的表达水平。参见表1和图2的分图e。另一方面，NGN3表达细胞的数量显著增加。参见表1和图2的分图f。观察到对PDX1表达无显著影响。这些结果表明，成头蛋白、视黄酸和激活素A的组合可协同作用来确定NKN6.1和PDX1表达阳性，而NGN3表达阴性的胰腺前体细胞群。
如图3的分图a和b所示，用DMEM(处理2-DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7、0.25μM环巴胺-KAAD、2μM视黄酸(RA)、100ng/ml成头蛋白、20ng/ml激活素A)所得到的大部分PDX1表达细胞在第3阶段第4天不表达CDX2。这与通过使用补充有1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7、0.25μM环巴胺-KAAD、2μM视黄酸(RA)、100ng/ml成头蛋白、20ng/ml激活素A的DMEM/F12而产生的PDX1表达细胞形成对照，其中大部分的PDX1表达细胞也表达CDX2。参见图3中的分图c和d。
对多种TGFβ受体激动剂进行了检测。在处理2中，用GDF-8、GDF-11、激活素B或TGFβ2替代激活素A都会产生类似的结果：用GDF-8、GDF-11、激活素B或TGFβ2处理四天会导致NKX6.1表达增加和NGN3下调。参见图4的分图a和c。未观察到对PDX1表达的显著影响。参见图4的分图b。
实例2
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物(共表达PDX1、NKX6.1，但 不表达CDX2和NGN3)的细胞向胰腺内分泌前体细胞的分化
以前的研究表明，当经历进一步分化时，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞更有可能产生胰高血糖素表达细胞，而不是胰岛素表达细胞。这可能部分是由于NGN3在胰腺内胚层细胞中的表达。本发明的方法可产生不表达NGN3并因此将更可能分化成胰岛素表达细胞的胰腺内胚层细胞群。然而，NGN3表达对于形成胰腺内分泌细胞或胰腺内分泌前体细胞(可形成例如胰高血糖素表达细胞或胰岛素表达细胞的细胞)是必须的。因此，对NGN3的时间调控对于引导胰腺内分泌前体细胞的最终命运是重要的。
本发明假定NGN3表达应维持在最低水平直至胰腺内胚层开始向胰腺内分泌前体细胞分化。
简言之，将人胚胎干细胞系H1的细胞在含有RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+20ng/ml WNT-3a+8ng/ml bFGF的MATRIGELTM涂布的平皿(1∶30稀释)上培养一天，然后用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+8ng/ml bFGF再处理两天(第1阶段)，然后
a.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/ml FGF7处理三天(第2阶段)，然后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/ml FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+20ng/ml激活素A处理四天(第3阶段)，然后
c.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II处理三天(第4阶段)，或
d.只用DMEM-高葡萄糖+1％B27处理三天(第4阶段)。
上述分化方案设计用于测试表达胰腺内胚层谱系特征性标志物(共表达PDX1和NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3)的细胞进一步分化为胰腺内分泌前体细胞的能力。胰腺内分泌前体细胞表达NGN3。
在基础培养基(DMEM-高葡萄糖+1％B27)中简单培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物(共表达PDX1和NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3)的细胞不会导致NGN3表达的诱导。参见图5分图a的浅灰色柱条。相似地，未观察到NEUROD、NKX2.2和PAX6的表达。
与此相反，在存在Alk5抑制剂II的情况下温育的细胞中观察到NGN3表达的显著增加。参见图5分图a的深灰色柱条。还观察到NEUROD、NKX2.2、PAX4和PAX6表达的上调，以及PTF1α表达的增加。参见图5中的分图a和b。Alk5抑制剂II的存在似乎不会影响PDX1或NKX6.1的表达。参见图5中的分图b。
在存在Alk5抑制剂II的情况下PCR检测到的NGN3表达增加也反映在NGN3蛋白存在阳性的细胞的数量增加，如免疫细胞化学所检测到的。参见图6。对图像的分析揭示，大部分NGN3表达细胞也共表达PDX1，但不表达NKX6.1。此外，大部分NKX6.1细胞共表达PDX1。在该阶段，如胰岛素和胰高血糖素的示例性表达情况所证实的，内分泌细胞表达水平最低。我们的结果表明，激活TGF-β通路将有利于共表达PDX1和NKX6.1的细胞群的形成，并且对TGF-β通路的后续抑制将进一步诱导内胚层分化为内分泌前体细胞。
实例3
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物(共表达PDX1、NKX6.1，但 不表达CDX2和NGN3)的细胞向胰腺内分泌细胞的分化
本实例设计用于测试表达腺内胚层谱系特征性标志物(共表达PDX1和NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3)的细胞从胰腺内分泌前体细胞进一步分化为胰腺内分泌细胞的能力。
简言之，将人胚胎干细胞系H1的细胞在含有RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+20ng/ml WNT-3a+8ng/ml bFGF的MATRIGELTM涂布的平皿(1∶30稀释)上培养一天，然后用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+8ng/ml bFGF再处理两天(第1阶段)，然后
a.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/ml FGF7处理三天(第2阶段)，然后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/ml FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+20ng/ml激活素A处理四天(第3阶段)，或
c.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/ml FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+20ng/ml激活素A处理四天(第3阶段)，然后
d.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II处理三天(第4阶段)
e.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II+β细胞素20ng/ml处理五至七天(第5阶段)。
NGN3和PAX4的表达从它们在第4阶段第3天的最大水平下降达到第5阶段第7天的更低表达水平。在这段时间内，内分泌标志物，例如胰岛素和胰高血糖素的表达增加。参见图7。这些数据表明，本发明的细胞能够从内分泌前体细胞形成胰腺内分泌细胞。
观察到只表达胰岛素或只表达胰高血糖素，或同时表达胰岛素和胰高血糖素的细胞。参见图8和表2。通过在第5阶段第7天时对培养物进行FACS分析(表2)，大约60％的分化胰腺内胚层前体细胞(共表达PDX1和NKX6.1)表达泛内分泌标志物(pan-endocrine marker)突触素。单一胰岛素表达细胞的百分比为10.4％，单一胰高血糖素表达细胞的百分比为5.1％。此外，20％为胰岛素和胰高血糖素共表达细胞。在表达胰岛素而不表达其他胰腺激素的细胞中，60％共表达NKX6.1(成熟β细胞的标志物)。这些数据表明，通过本发明的方法形成了更成熟的胰岛素表达细胞。
表2
胰岛素
胰岛素+ 10.4％
胰高血糖素+ 5.1％
胰岛素+/胰高血糖素+ 20％
突触素+ 60％
NKX6.1+ 52％
NKX6.1+/胰岛素+ 6％
实例4
在STZ诱导的糖尿病重症联合免疫缺陷(SCID)-beige(Bg)小鼠 体内移植本发明的细胞
将人胚胎干细胞系H1的细胞在含有RPMI培养基+0.2％FBS+100ng/ml激活素A+20ng/ml WNT-3a的涂布的平皿(1∶30稀释)上培养一天，然后用RPMI培养基+0.5％FBS+100ng/ml激活素A再处理两天(第1阶段)，接下来
a.用DMEM/F12+2％FBS+50ng/ml FGF7处理三天(第2阶段)，然后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+0.25mM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+50ng/ml FGF7+20ng/ml激活素A处理四天(第3阶段)，然后
c.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II处理四天(第4阶段)。
五至六周龄雄性scid-beige小鼠(C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7)从Taconic Farms购得。将小鼠圈养在微隔离笼(microisolator cage)中，自由获得无菌食物和水。在手术准备中，小鼠通过耳部加标签来辨别，称量其体重，并使用手持式血糖仪(One Touch，LifeScan)来测定其血糖。
在移植前两周，对小鼠进行称重，并且连续五天每天给予80mg/kg溶于pH4.5的乙酸盐缓冲液的链脲佐菌素(Sigma)，以诱导糖尿病。监测血糖，只使用血糖＞300mg/dL的小鼠作为移植接受者。
用异氟烷和氧气的混合物麻醉小鼠，用小型动物剪毛剪给手术部位剃毛。在手术前经小鼠皮下给予0.1mg.kg Buprenex。使用70％异丙醇和10％聚维酮-碘进行连续清洗，以准备好手术部位。
使用1mg/ml分散酶对第4阶段末的细胞短暂处理5分钟，然后利用1ml玻璃吸管以机械方式刮取这些细胞，随后将它们转移到非贴壁板上培养过夜。在小鼠的手术前准备期间，将这些细胞在1.5mL离心管中离心，移除大部分上清液，留下的量刚好足以收集细胞沉淀物。将细胞收集进Rainin Pos-D正位移移液器中，并倒置该移液器以让细胞通过重力沉降。弃去过量的培养基，留下用于移植的浓集细胞制剂。
为了移植，将24G×3/4″静脉留置管用于穿透肾囊，移除针头。然后在肾囊下推进导管至肾脏的远极。将Pos-D移液枪头牢固置于导管的插孔中，将5百万个细胞从移液器通过肾囊下的导管分配，并递送至肾脏的远极。通过低温烧灼而封闭肾囊，使肾回复至其初始解剖位置。平行地，用Post-D移液枪头将含有5百万个细胞的细胞聚集体加载至50μl装置中。该50μl装置购自TheraCyte，Inc(Irvine，CA)。加入之后，用A型医用聚硅氧烷粘合剂(Dow Corning，目录号129109)对装置进行密封，然后皮下植入SICD/Bg小鼠(第3和4号动物)。通过用5-0vicryl缝线连续缝合来闭合肌肉，并用缝合夹闭合皮肤。在手术后给小鼠皮下给予1.0mg.kg Metacam。使小鼠脱离麻醉并让其完全恢复。
在移植之后，每周称重小鼠一次，每周测量血糖两次。在移植后的多个时间段，从眼眶后窦抽取血液到装有少量肝素的离心管中。离心血液，将血浆置于第二离心管中，在干冰上冷冻，然后在-80℃下保存直至进行人c肽测定。使用Mercodia/ALPCO Diagnotics超敏C肽ELISA(目录号80-CPTHU-E01，Alpco Diagnostics，NH)根据制造商的说明测定人C肽水平。
人C-肽最早在移植后4周的肾囊组的动物血清中检测到，并且其水平随着时间推移而增加(图9的分图a)。在两个月结束时，我们能够检测到显著量的血循环人C-肽，达1.1±0.5ng/ml(图9的分图a)。在移植后近两个月，它们的非空腹血糖水平始终高于400ng/dl。在本研究中，不需要施用胰岛素。移植物来源的胰岛素的血清水平逐渐上升(大于1ng/ml)使得高血糖症逐步减轻。在三个月时，我们在90％的STZ诱导的糖尿病动物中都能够检测到显著量的血循环人C-肽。平均的血循环人C-肽为2±0.96ng/ml(n＝8)(图9的分图a)。90％移植有hES细胞衍生的内分泌前体细胞的糖尿病小鼠的血糖水平低于200mg/dl，并且该水平保持不变。在我们通过手术移除移植物后，血糖水平在移植物移除后不久便上升到高血糖水平，这表明移植的人细胞独自负责维持STZ处理小鼠的血糖量正常(图9的分图b)。
本实例说明，PDX1和NKX6.1共表达的细胞群和衍生自PDX-1和NKX6.1共表达细胞群的内分泌祖细胞群，具有在体外进一步分化为胰岛素分泌细胞的潜能。
在整篇文档中引用的出版物据此全文以引用方式并入。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下恰当理解的权利要求书的限定。

Claims (5)

1. 一种使人多能干细胞群分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群的方法，所述人多能干细胞为确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系或取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞，所述表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞群共表达PDX-1、NKX-6.1，但不表达CDX-2和NGN-3，所述方法包括下列步骤：
a.  培养所述人多能干细胞，
b.  通过用补充有TGF-β受体激动剂的培养基处理所述多能干细胞，使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
c.  通过用补充有FGF7的第一培养基处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后将所述细胞在补充有FGF7、能够抑制BMP的因子、TGF-β受体激动剂、视黄酸和刺猬蛋白信号传导通路抑制剂的第二培养基中培养，使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，所述表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3，其中所述第二培养基是DMEM-高葡萄糖培养基。
2. 权利要求1的方法，其中能够抑制BMP的因子为成头蛋白。
3. 权利要求1的方法，其中步骤c)的TGF-β受体激动剂选自激活素A、激活素B、TGFβ-I、TGFβ-II、GDF-8和GDF-11。
4. 权利要求3的方法，其中TGF-β受体激动剂是激活素A。
5. 权利要求1的方法，其中刺猬蛋白信号传导通路抑制剂为环巴胺-KAAD。
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