CN102727437A - 病毒感染的脂质体治疗 - Google Patents

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Abstract

通过递送pH敏感脂质体直接进入内质网(ER)膜可以治疗病毒感染例如乙型肝炎(HBV)感染、丙型肝炎(HCV)感染和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染。两种示例性的脂质体制剂是DOPE/CHEMS(DC脂质体)和DOPE/CHEMS/PEG-PE(DCPP脂质体)。DC和DCPP脂质体可优化N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)的细胞内递送，并因此增加该亚氨基糖的体内活性几个数量级，并可用于与其它的治疗剂例如干扰素和/或利巴韦林联合使用。优化的NB-DNJ直接释放进入ER内还可用于其中NB-DNJ已知是有效的抗病毒剂的其它病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)的治疗。

Description

病毒感染的脂质体治疗
相关申请
本申请要求由Dwek等人于2006年8月2日提交的美国临时申请60/834,797和由Dwek等人于2006年9月22日提交的美国临时申请60/846,344的优先权，两篇文献全文并入本文作为参考。
技术领域
本申请总地涉及用于治疗病毒感染的方法和组合物，更具体地说，涉及使用脂质体来治疗病毒感染的方法和组合物。
背景技术
乙型肝炎病毒。乙型肝炎病毒(HBV，HepB)是包括可导致一些患者死亡的肝纤维化、肝硬化、炎性肝病和肝癌在内的急性和慢性肝病的致病因素，例如，参见，Joklik，Wolfgang K.，Virology，第三版，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1988(ISBN0-8385-9462-X)。尽管获得了有效的疫苗，但是全世界超过280,000,000人，即，占世界人口的5％，仍然长期感染上病毒，例如，参见Locarnini，S.A.，等人，Antiviral Chemistry&Chemotherapy(1996)7(2)：53-64。这种疫苗对于已经感染上病毒的人没有治疗价值。在欧洲和北美洲，人口的0.1％到1％发生感染。据估计，获得感染的个体的15％到20％从HBV感染发展为肝硬化或另外的长期丧失劳动能力(chronic disability)。一旦形成肝硬化，发病率和死亡率相当大，具有约5年的患者生存时间，例如，参见Blume，H.，E.，等人，Advanced Drug Delivery Reviews(1995)17：321-331。
丙型肝炎病毒。全世界大约170,000,000人，即，占世界人口的3％，例如，参见WHO，J.Viral.Hepat.1999；6：35-47，和在美国大约400万人感染上丙型肝炎病毒(HCV，HepC)。急性感染上HCV的个体的约80％变成慢性感染。因此，HCV是慢性肝炎的主要致病因素。一旦发生慢性感染，如果不经治疗病毒几乎不被清除。在罕见病例中，HCV感染引起临床急性疾病和甚至是肝功能衰竭。慢性HCV感染可因个体之间的差异而显著不同，其中一些个体会罹患临床非显著性的或极微的肝疾病，并且从不发展成并发症，而其它个体会罹患临床显著的慢性肝炎并且可能接着发展成肝硬化。感染HCV并确实发展为肝硬化的个体的约20％会发展为晚期肝病并且具有增加的发展为原发性肝癌的风险。
抗病毒药物例如干扰素，其单独或与利巴韦林联合使用，在高达80％的患者中是有效的。(Di Bisceglie，A.M，和Hoofnagle，J.H.2002，Hepatology 36，S121-S127)，但是许多患者对这种联合治疗形式不耐受。
牛病毒性腹泻病毒。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分布于全世界范围内并且在大多数牛群中普遍存在。BVDV也通常被用作HCV的组织培养代用品。有两种BVDV的病毒生物型：非致细胞病变型(ncp)和致细胞病变型(cp)。病毒生物型的分类基于培养细胞中的致细胞病变作用并且与毒力无关。Ncp BVDV在牛中是常见的，而cp生物型相对少见，并且在病毒基因组中发生特异性突变后从ncp株产生。在组织培养中用cp BVDV株感染细胞以在细胞单层上形成凋亡细胞集簇(斑块)为特征，可在显微镜下容易地监控这一特征。
人类免疫缺陷病毒。人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和相关病症的致病因素。至少有截然不同的两类HIV：HIV-1和HIV-2。另外，大量的遗传异质性存在于每种这些类型的群体中。因为AIDS流行病的发病，大约2000万人已死亡，并且据估计，超过4000万人目前仍携带HIV-1/AIDS，在全世界内每天有14000人被感染。
已经开发了多种抗病毒治疗剂和诊断手段，使得至少对于获得所述手段的那些人而言已经大大地改善了数量和生活质量。这些药物中大多数干扰病毒蛋白质或诸如逆转录和蛋白酶活性的过程。不幸地是，这些疗法未能消除感染，许多疗法的不需要的作用是严重的，对于目前应用的每种抗病毒类型都存在耐药性HIV株。
作为治疗剂的N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)。NB-DNJ，又称N-丁基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇，抑制由ER葡糖苷酶I和II参与的过程，并且已经显示通过引起人类免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒特别是诸如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒等等病毒的糖蛋白的错折叠和/或ER-滞留而发挥有效的抗病毒作用。描述了合成NB-DNJ和其它N-取代的脱氧野尻霉素衍生物的方法，例如，在美国专利5,622,972，4,246,345，4,266,025 4,405,714和4,806,650中。讨论了NB-DNJ的抗病毒效果，例如在美国专利6,465,487；6,545,021；6,689,759；6,809,083中涉及肝炎病毒，和在美国专利4,849,430中涉及HIV病毒。
葡糖苷酶抑制剂如NB-DNJ已显示在细胞培养中和在使用旱獭动物模型中都有效地治疗HBV感染，例如，参见T.Block，X.Lu，A.S.Mehta，B.S.Blumberg，B.Tennant，M.Ebling，B.Korba，D.M.Lansky，G.S.Jacob和R.A.Dwek，Nat Med.1998May；4(5)：610-4。NB-DNJ抑制HBV粒子的分泌并引起HBV DNA的胞内滞留。
NB-DNJ已显示是对抗BVDV(一种用于HCV的细胞培养模型)的强抗病毒物质，例如，参见Branza-Nichita N，Durantel D，Carrouee-Durantel S，Dwek RA，Zitzmann N.，J Virol.2001Apr；75(8)：3527-36；Durantel，D.，等人，J.Virol.，2001，75，8987-8998；N.Zitzmann，等人，PNAS，1999，96，11878-11882。使用NB-DNJ进行治疗导致病毒后代的感染性降低，对被分泌的病毒的实际数量的影响较少。
NB-DNJ已显示是抗HIV的抗病毒剂；治疗导致对从HIV感染细胞释放的病毒粒子数的影响较低，然而，被释放的感染性病毒的量被大大降低，例如，参见P.B.Fischer，M.Collin，等人(1995)，J.Virol.69(9)：5791-7；P.B.Fischer，G.B.Karlsson，T.Butters，R.Dwek和F.Platt，J.Virol.70(1996a)，pp.7143-7152，P.B.Fischer，G.B.Karlsson，R.Dwek和F.Platt，.J.Virol.70(1996b)，pp.7153-7160。在HIV-1感染患者中进行了牵涉NB-DNJ的临床试验，结果表明抗病毒活性所需的浓度太高并且在患者中产生严重的副作用，例如，参见Fischl M.A.，Resnick L.，Coombs R.，Kremer A.B.，Pottage J.C.Jr，Fass R.J.，Fife K.H.，PowderlyW.G.，Collier A.C.，Aspinall R.L.，等人，J.Acquir.Immune.Defic.Syndr.1994 Feb；.7(2)：139-47。目前不存在对抗NB-DNJ治疗的突变HIV株。
ER蛋白质折叠以及葡糖苷酶I和II。由葡糖苷酶抑制显示的抗病毒效果被认为是病毒糖蛋白在ER内的错折叠或滞留的结果，主要通过阻断进入钙联接蛋白/肌钙网蛋白循环进行。在将三葡糖基化低聚糖(Glc3Man9GlcNAc2)转移到生长多肽链中的Asn-X-Ser/Thr共有序列之后，必要的是可以发生三个α-连接的葡萄糖残基在进一步加工成为成熟碳水化合物单位之前被释放。另外，两个靠外侧的葡萄糖残基必需经过修整以被允许进入钙联接蛋白/肌钙网蛋白循环用于适当折叠，例如，参见Bergeron，J.J.等人，Trends Biochem.Sci.，1994，19，124-128；Peterson，J.R.等人，Mol.Biol.Cell，1995，6，1173-1184。初步加工受位于ER的具有内腔取向的催化结构域的内在膜(integral membrane)酶(葡糖苷酶I)的影响，该酶特异性裂解α1-2连接的葡萄糖残基；接着是葡糖苷酶II发挥作用，该酶II释放α1-3连接的葡萄糖组分中的两个。
脂质体。脂质体可以直接递送水溶性化合物到细胞内，绕过作为分子屏障的细胞膜。pH敏感脂质体制剂可包含将磷脂酰乙醇胺(PE)或其衍生物(例如DOPE)与含有酸性基团的化合物(其在中性pH下可作为稳定剂)的组合。胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)与其它的体内两性分子稳定剂相比可以是良好的稳定化分子，因为其胆固醇基赋予包含PE的小泡以更高的稳定性。通过脂质体介导的递送的体内效力可强烈地依赖于与可以影响其药代动力学和生物分布的血清组分(调理素)的相互作用。pH敏感脂质体可以迅速地从血液循环中被清除，积聚在肝和脾内，然而脂质与共价连接的聚乙二醇(PEG)的内含物可以通过稳定DOPE∶CHEMS脂质体上的净负电荷来克服由网状内皮系统(RES)进行的清除。DOPE-CHEMS和DOPE-CHEMS-PEG-PE脂质体及其制备方法描述在例如V.A.Slepushkin，S.Simoes，P.Dazin，M.S.Newman，L.S.Guo和M.C.P.de Lima，J.Biol.Chem.272(1997)2382-2388；以及S.Simoes，V.Slepushkin，N.Duzgunes和M.C.Pedroso de Lima，Biomembranes 1515(2001)23-37中，两篇文献全文并入本文作为参考。
包封在DOPE-CHEMS中的N3-DNJ(摩尔比为6∶4)的递送公开在美国专利申请US2003/0124160中。
发明概述
一个实施方案提供了治疗病毒感染的方法，该方法包括对有此需要的宿主给药组合物，该组合物包括(a)包含DOPE和CHEMS脂质的脂质体，和(b)包封在脂质体内的一种或多种治疗剂，其中病毒感染是ER膜出芽病毒感染或质膜出芽病毒感染；其中一种或多种治疗剂包括N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)，并且其中所述给药导致递送一种或多种治疗剂进入感染有引发感染的病毒的细胞的内质网内以及将脂质体的一种或多种脂质并入细胞的内质网膜内。
本发明的另一个实施方案提供了治疗病毒感染的方法，该方法包括对有此需要的宿主给药组合物，该组合物包括(a)包含DOPE、CHEMS和PEG-PE脂质的脂质体，和(b)包封在脂质体内的一种或多种治疗剂。该一种或多种治疗剂可包括N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)。
又一个实施方案提供了一种方法，该方法包括对有此需要的宿主给药组合物，该组合物包括(a)pH敏感脂质体，和(b)包封在脂质体内的抗原，其中给药导致由抗原递呈细胞的主要组织相容性分子1类进行的抗原递呈增加。
又一个实施方案提供了治疗HIV感染的方法，该方法包括对有此需要的宿主给药组合物，该组合物包括与gp120/gp41复合物靶向部分结合的脂质体。
又一个实施方案提供了一种组合物，该组合物包括包含DOPE、CHEMS和PEG-PE脂质的脂质体和包封在脂质体内的至少一种治疗剂如N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)。
又一个实施方案提供了一种组合物，该组合物包括pH敏感脂质体和包封在脂质体内的抗原。
又一个实施方案提供了一种组合物，该组合物包括与gp120/gp41复合物靶向部分结合的脂质体。
另一个实施方案提供了治疗或预防病毒感染的方法，该方法包括对有此需要的宿主给药组合物，该组合物包括(a)包含PI脂质的脂质体，和(b)包封在脂质体内的至少一种抗病毒治疗剂，其中所述接触导致递送至少一种治疗剂进入感染有引发感染的病毒的细胞的ER腔内，以及将脂质体的一种或多种脂质并入细胞的ER膜内。
又一个实施方案提供了一种组合物，该组合物包括包含PI脂质的脂质体以及包封在脂质体内的至少一种抗病毒治疗剂。
又一个实施方案提供了治疗病毒感染的方法，该方法包括对有此需要的宿主给药组合物，该组合物包括(a)包含PI脂质的脂质体，和(b)嵌入脂质体的脂质层内的至少一种抗病毒蛋白，其中所述接触导致将脂质体的一种或多种脂质并入感染有引发感染的病毒的细胞的内质网膜内。
又一个实施方案提供了一种组合物，该组合物包括(a)包含PI脂质的脂质体，和(b)嵌入脂质体的脂质层内的至少一种抗病毒蛋白。
又一个实施方案提供了一种组合物，该组合物包括包含PI脂质的脂质体以及包封在脂质体内的至少一种治疗剂。
又一个实施方案提供了治疗或预防生理学病况的方法，该方法包括对有此需要的受试者给药组合物，该组合物包括包含PI脂质的脂质体以及包封在脂质体内的至少一种治疗剂。
又一个实施方案提供了一种组合物，该组合物包括包含PI脂质的脂质体以及嵌入脂质体的脂质双分子层内的至少一种蛋白质。
又一个实施方案提供了治疗或预防生理学病况的方法，该方法包括对有此需要的受试者给药组合物，该组合物包括包含PI脂质的脂质体以及嵌入脂质体的脂质双分子层内的至少一种蛋白质。
附图说明
图1表示在经由DCPP-Rh脂质体递送后去淬灭的钙黄绿素和荧光标记脂质(Rh-PE)的内质网(ER)定位。
图2表示在CHO和MDBK细胞中DCPP脂质体的毒性。包封PBS的DCPP脂质体以最终脂质浓度为0-500μM被加入到CHO细胞中，以0-150μM的浓度被加入到MDBK细胞中。细胞和脂质体进行培养5天，然后通过锥虫蓝染色测量细胞生存率。结果用与未处理的对照相比的活细胞的百分数表示。
图3是表示在包封有脱氧野尻霉素(DNJ)、N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)和N-壬基脱氧野尻霉素(NN-DNJ)化合物的条件下在CHO细胞中DCPP-Rh脂质体的摄取和细胞内钙黄绿素去淬灭的图表。制备了包封有在两种不同浓度下的每个化合物的DCPP-Rh脂质体。通过并入细胞膜内的Rh-PE测量的脂质体摄取以及作为细胞内释放量度的钙黄绿素去淬灭在用脂质体进行5分钟脉冲然后在新鲜的培养基中进行30分钟追踪后进行测定。
图4表示包含各种DNJ分子的DCPP脂质体的pH敏感性。
图5是表示在用NB-DNJ治疗后BVDV分泌的图表：游离递送相对于用DCPP脂质体介导的递送。在用以游离形式或经由脂质体以最终脂质浓度为50μM被加入到培养基中的NB-DNJ治疗期间从被感染的MDBK细胞分泌的BVDV粒子，在3天培养后通过实时PCR测定。结果用通过实时PCR检测的RNA拷贝数与未处理的对照相比的百分数表示。
图6表示NB-DNJ对ncp BVDV感染性的效果：游离递送相对于用DCPP脂质体介导的递送。在以游离形式或经由脂质体以最终脂质浓度为50μM被加入到培养基中的NB-DNJ存在的条件下由被感染的MDBK细胞产生的ncp BVDV粒子的感染性，通过与原初MDBK细胞培养3天进行测量。使用DAPI复染色作为对照通过存在于MDBK细胞中的非结构BVDV蛋白的免疫荧光染色检测被感染细胞。得自BVDV分泌的数据(图2)用于最终百分感染性的归一化计算。
图7表示NB-DNJ针对cp BVDV的抗病毒效果：游离递送相对于用DC脂质体介导的递送。感染有cp BVDV的MDBK细胞在存在游离的或包含在DC脂质体内的NB-DNJ的条件下生长3天。包含被分泌的病毒的上清液用于感染原初MDBK。在3天后，在显微镜下计数得到的斑块(收率测定)。
图8表示在NB-DNJ存在的条件下对表达的HIV包膜蛋白gp120的聚糖加工的抑制：游离递送相对于用DCPP脂质体介导的递送。表达可溶形式的gp120的CHO细胞与NB-DNJ培养，NB-DNJ以游离形式或经由脂质体以最终脂质浓度微100μM被加入到培养基中。通过由ER葡糖苷酶进行的葡萄糖修整的抑制测定的NB-DNJ活性的测量如下进行：在捕获法ELISA中单克隆抗体2G12和b12与用NB-DNJ处理的gp120的结合。
图9(A-C)表示游离的NB-DNJ对八个单独的HIV-1初次分离物的抗病毒效果。图9A表示用不同浓度的NB-DNJ处理四周的八个分离物的平均p24分泌。误差棒显示对于每种治疗在分离物之间的标准偏差确定。图9B显示在用0-1mM浓度的游离的NB-DNJ进行初步处理后每个初次分离物的分泌。图9C表示在三周处理后个别的初次分离物对NB-DNJ的敏感性。所有值用未处理的对照的百分数表示，并且数据表示从两个独立实验的三个重复样品获得的平均值。关于每种处理的近似IC50和IC90通过图表中的灰色(点状)线表示。
图10A-H提供的数据显示脂质体如何增加NB-DNJ针对八个HIV-1的初次分离物的抗病毒活性。感染有每个分离物的PBMC(用图表A到H表示)用包封有各种浓度的NB-DNJ的脂质体(L)处理四周。用在培养基中的500μM的游离NB-DNJ(F)的处理作为关于抗病毒活性的参考被显示。图例指出对于每种处理NB-DNJ的最终浓度。所有值用未处理的对照的百分数表示，并且数据表示从两个独立实验的三个重复样品获得的平均值。
图11表示由感染有大量HIV-1分离物的细胞进行的sCD4-脂质体和免疫脂质体的摄取。sCD4-脂质体和MAb-脂质体结合物与感染有九个不同的初次分离物(括号内为进化枝)的PBMCs培养。增加的摄取通过在培养之后在细胞中的荧光脂质的增加来测量。所有值被归一化到“非感染的仅有脂质体”的对照，并且数据代表从一个实验的三个重复值获得的平均±标准误差。对于每个感染使用一系列单向方差分析然后是在此之后的Tukey试验以检验在不同靶分子的有效性之间的差异，检测相对摄取数据。在脂质体结合物和仅有脂质体对照之间的摄取的显著差异(P＜0.0001)用星号表示。
图12A-H表示包封NB-DNJ的sCD4-脂质体的强力的协同抗病毒活性。感染有每个分离物的PBMC(用图表A到H表示)用包封有各种浓度的NB-DNJ的sCD4-脂质体(CD4-L)处理四周。用在培养基中的500μM的游离NB-DNJ(F)的处理作为关于抗病毒活性的参考被显示。图例指出对于每种处理NB-DNJ的最终浓度。所有值用未处理的对照的百分数表示，并且数据表示从一个实验的三个重复样品获得的平均值。
图13A-E表示在用各种脂质体制剂脉冲15分钟后在MDBK细胞内的罗丹明标记PE的典型的荧光图像。特别地，图13A表示DOPE∶CHEMS∶Rh-PE(6∶4∶0.1)的数据；图13B表示DOPC∶CHEMS∶Rh-PE(6∶4∶0.1)的数据；图13C表示DOPE∶CHEMS∶PI∶Rh-PE(6∶4∶1∶0.1)的数据；图13D表示DOPE∶CHEMS∶PI∶Rh-PE(6∶4∶2∶0.1)的数据和图13E表示DOPE∶CHEMS∶PI∶Rh-PE(6∶4∶3∶0.1)的数据。在时间点：0、1、2、5、24和48小时观察每种脂质体制剂的Rh-PE的细胞内定位。使用DAPI复染色来目测所有细胞。
图14表示使用各种包含Rh标记的PE的脂质体制剂处理被cp-BVDV-感染的MDBK细胞和未被感染的MDBK细胞并且在培养3天后测量Rh-PE脂质的分泌的效果。在用相同脂质体组合物处理的被感染细胞和未被感染细胞之间的Rh-PE分泌的增加是由于包含Rh-PE脂质的病毒粒子的分泌所导致，该病毒粒子从ER膜出芽。
发明详述
除非另外说明，否则“一”或“一种”表示“一种或多种”。
术语的定义：
本文使用的术语“病毒感染”是指这样的患病状态，其中病毒侵入健康的细胞，使用细胞的再生机构进行繁殖或复制并最终使细胞裂解导致细胞死亡，释放病毒粒子并通过新产生的后代病毒感染其它细胞。某些病毒的潜伏性感染也是可能的病毒感染结果。
本文使用的术语“治疗或预防病毒感染”是指抑制特定病毒的复制，抑制病毒传播，或防止病毒在其宿主中自我创建，和改善或缓解由病毒感染引起的疾病的症状。如果病毒负荷下降、死亡率和/或发病率降低，则该治疗被认为具有治疗性。
术语“治疗剂”是指任何试剂，如分子或化合物，其可帮助治疗生理学病况，诸如病毒感染或由其引起的疾病。
本文使用的术语“协同效应”是指联合效果，其比任何一种或多种单个治疗剂的加合效果更有效。本文使用的协同效应是指使用较低量(剂量)的任一单一疗法(either single therapy)来治疗或预防生理学病况如病毒感染或由其引起的疾病的能力。更低剂量可导致治疗的毒性更低而效力不降低。另外，协同效应可导致效力改善，例如抗病毒活性的改善。最后，对于病毒感染，协同效应可导致避免或降低病毒针对单个治疗剂或单个疗法的抗性的改善。
脂质体可被定义为是包括球形双分子层构造的脂质的有机化合物。本文论述的脂质体可包括由以下缩写表示的一种或多种脂质：
CHEMS表示胆固醇半琥珀酸酯脂质。
DOPE表示二油酰磷脂酰乙醇胺脂质。
DOPC表示二油酰磷脂酰胆碱脂质。
PE表示磷脂酰乙醇胺脂质。
PEG-PE表示聚乙二醇(2000)-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺脂质。
Rh-PE表示丽丝胺罗丹明(lissamine rhodamine)B-磷脂酰乙醇胺脂质。
MCC-PE表示1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-N-[4-(对-马来酰亚胺基甲基)环己烷-甲酰胺]脂质。
PI表示磷脂酰肌醇脂质。
术语“胞内递送”是指被包封的物质从脂质体递送进入任何胞内隔室内。
IC50或IC90(抑制浓度50或90)是指为实现病毒感染分别降低50％或90％所使用的治疗剂的浓度。
DC脂质体是指包括摩尔比为6∶3的DOPE和CHEMS脂质的脂质体。
DCPP脂质体是指包括摩尔比为6∶4∶0.3的DOPE、CHEMS和PEG-PE脂质的脂质体。
PBMC表示外周血单核细胞。
sCD4表示可溶性CD4分子。“可溶性CD4”或“sCD4”或“D1D2”是指CD4分子或其片段，其位于含水溶液中并且其通过改变HIV Env的构造可模仿天然的膜锚定CD4的活性，这可由本领域普通技术人员所理解。可溶性CD4的一个实例是例如在Salzwedel等人.J.Virol.74：326333，2000中描述的双结构域可溶性CD4(sCD4或D1D2)。
MAb表示单克隆抗体。
DNJ表示脱氧野尻霉素。
NB-DNJ表示N-丁基脱氧野尻霉素。
NN-DNJ表示N-壬基脱氧野尻霉素。
BVDV表示牛病毒性腹泻病毒。
HBV表示乙型肝炎病毒。
HCV表示丙型肝炎病毒。
HIV表示人类免疫缺陷病毒。
Ncp表示非致细胞病变型。
Cp表示致细胞病变型。
ER表示内质网。
CHO表示中国仓鼠卵巢细胞
MDBK表示Madin-Darby牛肾细胞。
PCR表示聚合酶链反应。
FOS表示游离的低聚糖。
HPLC表示高效液相色谱法。
PHA表示植物血细胞凝集素。
FBS表示胎牛血清。
TCID50表示50％组织培养感染剂量。
ELISA表示酶联免疫吸附测定。
IgG表示免疫球蛋白(immunoglobuline)。
DAPI表示4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。
PBS表示磷酸盐缓冲盐水。
病毒感染的脂质体治疗
本发明人已经发现，当接触细胞时，包含DOPE、CHEMS和/或PEG-PE脂质的pH敏感脂质体，诸如DC脂质体或DCPP脂质体，能够绕过细胞的内吞作用之后的细胞的内体途径并递送包封在脂质体内的材料直接进入细胞的内质网(ER)，即，ER腔。脂质体的一种或多种脂质还可以并入细胞的ER膜内。这一发现可提供关于病毒感染(对于该病毒感染，病毒需要从ER膜出芽，诸如HBV、HCV和BVDV感染)的治疗的主要推断性结论：因为脂质体的脂质并入感染有病毒的细胞的ER膜可以改变出芽病毒粒子的被膜，并因此降低感染性。
本发明人还发现了N-丁基脱氧野尻霉素(NB-DNJ)包封在DCPP脂质体内，与其它脱氧野尻霉素化合物如脱氧野尻霉素(DNJ)或N-壬基脱氧野尻霉素(NN-DNJ)的DCPP包封相比，可以提供增加的细胞内递送。这种NB-DNJ的增加的细胞内递送可以导致NB-DNJ的体内活性增强。
另外，本发明人已经发现了包括DOPE、CHEMS和/或PEG-PE脂质的脂质体，诸如DCPP脂质体，自身可具有抗病毒效果，即，与包封在脂质体内的任何治疗剂无关，并且DCPP脂质体和包封在脂质体内的治疗剂诸如NB-DNJ针对病毒可以协同起作用。
因此，一个实施方案是治疗ER膜病毒出芽感染即病毒出芽可发生在ER膜处的病毒感染诸如HBV、HCV或BVDV感染。该方法可包括使感染有引发感染的病毒的细胞接触组合物，在该组合物中，NB-DNJ被包封在包含DOPE和CHEMS脂质的脂质体内。这种接触可提供协同治疗，导致递送脂质体的一种或多种脂质到被接触细胞的ER膜，改变该膜从而降低子代病毒的感染性，以及通过释放被包封的NB-DNJ直接进入细胞的ER腔内实现协同治疗。
另一个实施方案是通过使感染有引发感染的病毒的细胞接触组合物来治疗病毒感染的方法，该组合物包含1)包含DOPE、CHEMS和PEG-PE脂质的脂质体，和2)包封在脂质体内的治疗剂。病毒感染可以是，例如，HCV，HBV，BVDV，HIV，莫洛尼鼠科白血病病毒，鼠科肝炎病毒，1型和2型单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，辛德毕斯病毒，西门利克森林病毒，疱疹性口腔炎病毒，甲型流感病毒，麻疹病毒，登革热病毒或日本脑炎病毒，诸如在R.A.Dwek，等人，Nat.Rev.Drug Discov.2002Jan；1(1)：65-75中公开的。
在一些实施方案中，包封在脂质体内的治疗剂可以是α-葡糖苷酶抑制剂。在一些实施方案中，α-葡糖苷酶抑制剂可以是ERα-葡糖苷酶抑制剂。通常，任何依赖于与钙联接蛋白和/或肌钙网蛋白相互作用用于其病毒被膜糖蛋白的适当折叠的病毒可以作为ERα-葡糖苷酶抑制剂的靶标。
α-葡糖苷酶抑制剂可以是这样的试剂，与不存在该试剂的条件下的α-葡糖苷酶的酶活性相比，该试剂抑制宿主α-葡糖苷酶的酶活性至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％，或更高。术语“α-葡糖苷酶抑制剂”包括天然存在的和合成的抑制宿主α-葡糖苷酶活性的试剂。
适当的α-葡糖苷酶抑制剂包括但不限于脱氧野尻霉素和N-取代的脱氧野尻霉素，诸如以下的式II的化合物及其可药用盐：
Figure BDA0000087215190000141
其中R1选自：被取代的或未被取代的烷基，被取代的或未被取代的环烷基，被取代的或未被取代的芳基，或被取代的或未被取代的氧杂烷基，选自但不限于芳基烷基，环烷基烷基，支链或直链的烷基，和氧杂烷基；并且其中W、X、Y和Z各自独立地选自氢，烷酰基，芳酰基和卤代烷酰基。
在一些的这种实施方案中，R1选自：乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，新戊基，异戊基，己基，-(CH2)2O(CH2)5CH3，-(CH2)2O(CH2)6CH3，-(CH2)6OCH2CH3，和-(CH2)2OCH2CH2CH3。在其它的这种实施方案中，R1为丁基，并且W，X，Y和Z都为氢。
在一些实施方案中，式II的化合物选自但不限于：N-(正己基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(正庚基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(正辛基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(正辛基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(正壬基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(正癸基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(正十一烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(正壬基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(正癸基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(正十一烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(正十二烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(2-乙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(4-乙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(5-甲基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(3-丙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-戊基戊基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-丁基丁基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(7-甲基辛基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(8-甲基壬基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(9-甲基癸基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(10-甲基十一烷基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(6-环己基己基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(4-环己基丁基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(2-环己基乙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-环己基甲基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(1-苯基甲基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(3-苯基丙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(3-(4-甲基)-苯基丙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(6-苯基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇；N-(正壬基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(正癸基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(正十一烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(正十二烷基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(2-乙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(4-乙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(5-甲基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(3-丙基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(1-戊基戊基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(1-丁基丁基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(7-甲基辛基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(8-甲基壬基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(9-甲基癸基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(10-甲基十一烷基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(6-环己基己基-)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(4-环己基丁基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(2-环己基乙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(1-环己基甲基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(1-苯基甲基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(3-苯基丙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(3-(4-甲基)-苯基丙基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；N-(6-苯基己基)-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇，四丁酸酯；其可药用盐；和它们中任何两种或更多种的混合物。
适当的α-葡糖苷酶抑制剂还包括N-氧杂烷基化脱氧野尻霉素，诸如在US专利4,639,436中描述的N-羟基乙基DNJ(米格列醇(Miglitol)或
Figure BDA0000087215190000161
)。
适当的α-葡糖苷酶抑制剂还包括栗精胺和栗精胺衍生物，诸如在美国专利申请2006/0194835中公开的式(I)的化合物及其可药用盐，包括6-O-丁酰基栗精胺(西戈斯韦(celgosivir))，以及在PCT公报WO01054692中公开的式II的化合物及其可药用盐。
在一些实施方案中，α-葡糖苷酶抑制剂可以为阿卡波糖(0-4，6-二脱氧-4-[[(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羟基-3-(羟基甲基)-2-环己烯-1-基]氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-→-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-D-葡萄糖)，或
Figure BDA0000087215190000162
阿卡波糖公开在美国专利4,904,769中。在一些实施方案中，α-葡糖苷酶抑制剂可以为高度纯化形式的阿卡波糖(例如，参见美国专利4,904,769)。
在一些实施方案中，包封在脂质体内的治疗剂可以是离子通道抑制剂。在一些实施方案中，离子通道抑制剂可以是抑制HCV p7蛋白质活性的试剂。离子通道抑制剂及其鉴定方法在美国专利公报2004/0110795中详述。适当的离子通道抑制剂包括式I的化合物及其可药用盐，包括N-(7-氧杂-壬基)-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-7-氧杂-壬基6-MeDGJ或UT231B)和N-10-氧杂十一烷基(undecul)-6-MeDGJ。适当的离子通道抑制剂还包括但不限于N-壬基脱氧野尻霉素，N-壬基半乳糖脱氧野尻霉素(deoxynogalactonojirimycin)和N-氧杂壬基半乳糖脱氧野尻霉素(deoxynogalactonojirimycin)。
在一些实施方案中，包封在脂质体内的治疗剂可包括亚氨基糖。适当的亚氨基糖包括天然存在的亚氨基糖和合成的亚氨基糖。
在一些实施方案中，亚氨基糖可以是脱氧野尻霉素或N-取代的脱氧野尻霉素衍生物。适当的N-取代的脱氧野尻霉素衍生物的实例包括但不限于本申请的式II的化合物，美国专利6,545,021的式I的化合物，以及N-氧杂烷基化脱氧野尻霉素，诸如在美国专利4,639,436中描述的N-羟基乙基DNJ(米格列醇或
Figure BDA0000087215190000171
)。
在一些实施方案中，亚氨基糖可以是栗精胺或栗精胺衍生物。适当的栗精胺衍生物包括但不限于在美国专利申请2006/0194835中公开的式(I)的化合物及其可药用盐，以及在PCT公报WO01054692中公开的式II的化合物及其可药用盐。
在一些实施方案中，亚氨基糖可以是半乳糖脱氧野尻霉素(nogalactojirimycin)或其N-取代的衍生物，诸如在PCT公报WO99/24401和WO01/10429中公开的那些。适当的N-取代的半乳糖脱氧野尻霉素(deoxynogalactojirimycin)衍生物的实例包括但不限于N-烷基化半乳糖脱氧野尻霉素(deoxynogalactojirimycin)(N-烷基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇)，诸如N-壬基半乳糖脱氧野尻霉素，和N-氧杂-烷基化半乳糖脱氧野尻霉素(N-氧杂-烷基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇)，诸如N-7-氧杂壬基半乳糖脱氧野尻霉素。
在一些实施方案中，亚氨基糖可以是N-取代的1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-取代的MeDGJ)，包括但不限于以下的式I化合物：
其中R选自：被取代的或未被取代的烷基，被取代的或未被取代的环烷基，被取代的或未被取代的杂环基，或被取代的或未被取代的氧杂烷基。在一些实施方案中，被取代的或未被取代的烷基和/或被取代的或未被取代的氧杂烷基包含1到16个碳原子或4到12个碳原子或8到10个碳原子。在一些实施方案中，被取代的或未被取代的烷基和/或被取代的或未被取代的氧杂烷基包括1到4个氧原子，并且在其它实施方案中包括1到2个氧原子。在其它的实施方案中，被取代的或未被取代的烷基和/或被取代的或未被取代的氧杂烷基包括1到16个碳原子和1到4个氧原子。因此，在一些实施方案中，R选自但不限于：-(CH2)6OCH3，-(CH2)6OCH2CH3，-(CH2)6O(CH2)2CH3，-(CH2)6O(CH2)3CH3，-(CH2)2O(CH2)5CH3，-(CH2)2O(CH2)6CH3和-(CH2)2O(CH2)7CH3。N-取代的MeDGJs例如公开在PCT公报WO01/10429中。
在一些实施方案中，包封在脂质体内的治疗剂可包括下面式VIII的含氮化合物或其可药用盐：
Figure BDA0000087215190000182
其中R12为烷基诸如C1-C20或C1-C6或C7-C12或C8-C16并且还可包含1到5个或1到3个或1到2个氧，R12可以是被氧杂取代的烷基衍生物。被氧杂取代的烷基衍生物的实例包括：3-氧杂壬基，3-氧杂癸基，7-氧杂壬基和7-氧杂癸基。
R2为氢，R3为羧基或C1-C4烷氧羰基，或者R2和R3一起为
Figure BDA0000087215190000191
其中n为3或4，每个X独立地为氢，羟基，氨基，羧基，C1-C4烷基羧基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羟基烷基，C1-C6酰氧基，或芳酰氧基，并且每个Y独立地为氢，羟基，氨基，羧基，C1-C4烷基羧基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羟基烷基，C1-C6酰氧基，芳酰氧基，或被删除(即，不存在)；
R4为氢或缺失(即，不存在)；和
R5为氢，羟基，氨基，被取代的氨基，羧基，烷氧羰基，氨基羰基，烷基，芳基，芳烷基，烷氧基，羟基烷基，酰氧基，或芳酰氧基，或者R3和R5一起形成苯基并且R4缺失(即，不存在)。
在一些实施方案中，含氮化合物具有下式结构：
Figure BDA0000087215190000201
其中R6-R10各自独立地选自：氢，羟基，氨基，羧基，C1-C4烷基羧基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4羟基烷基，C1-C4酰氧基，和芳酰氧基；并且R11为氢或C1-C6烷基。含氮化合物可以为：N-烷基化哌啶，N-氧杂-烷基化哌啶，N-烷基化吡咯烷，N-氧杂-烷基化吡咯烷，N-烷基化苯基胺，N-氧杂-烷基化苯基胺，N-烷基化吡啶，N-氧杂-烷基化吡啶，N-烷基化吡咯，N-氧杂-烷基化吡咯，N-烷基化氨基酸，或N-氧杂-烷基化氨基酸。在某些实施方案中，N-烷基化哌啶，N-氧杂-烷基化哌啶，N-烷基化吡咯烷，或N-氧杂-烷基化吡咯烷化合物可以为亚氨基糖。例如，在一些实施方案中，含氮化合物可以为具有下式结构的N-烷基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-烷基-DGJ)或N-氧杂-烷基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-氧杂-烷基-DGJ)：
或具有下式结构的N-烷基-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-烷基-MeDGJ)或N-氧杂-烷基-1，5，6-三脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(N-氧杂-烷基-MeDGJ)：
Figure BDA0000087215190000211
本文中使用的基团具有以下特征，除非另外规定碳原子数。烷基具有1到20个碳原子并且是直链或支链的、被取代的或未被取代的。烷氧基具有1到16个碳原子并且是直链或支链的、被取代的或未被取代的。烷氧羰基是具有2到16个碳原子的酯基。烯基氧基具有2到16个碳原子、1到6个双键并且是直链或支链的、被取代的或未被取代的。炔基氧基具有2到16个碳原子、1到3个三键并且是直链或支链的、被取代的或未被取代的。芳基具有6到14个碳原子(例如苯基)并且是被取代的或未被取代的。芳烷基氧基(如苄基氧基)和芳酰氧基(如苯甲酰基氧基)具有7到15个碳原子并且是被取代的或未被取代的。氨基可以为伯、仲、叔或季氨基(即被取代的氨基)。氨基羰基是具有1到32个碳原子的酰氨基(如被取代的酰氨基)。被取代的基团可包括选自以下的取代基：卤素，羟基，C1-10烷基，C2-10烯基，C1-10酰基，或C1-10烷氧基。
N-烷基化氨基酸可以为N-烷基化的天然存在的氨基酸，诸如N-烷基化的氨基酸。天然存在的氨基酸是20个常见α-氨基酸(Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Asp，Asn，Lys，Glu，Gln，Arg，His，Phe，Cys，Trp，Tyr，Met和Pro)和作为天然产物的其它氨基酸如正亮氨酸，乙基甘氨酸，鸟氨酸，甲基丁烯基-甲基苏氨酸和苯基甘氨酸之一。氨基酸侧链(如R5)的实例包括H(甘氨酸)，甲基(丙氨酸)，-CH2C(O)NH2(天门冬酰胺)，-CH2-SH(半胱氨酸)和-CH(OH)CH3(苏氨酸)。
N-烷基化化合物可以通过氨基(或亚氨基)化合物的还原烷基化制备。例如，氨基或亚氨基化合物可以与还原剂(如氰基硼氢化钠)一起暴露于醛下以将胺进行N-烷基化。类似地，N-氧杂-烷基化化合物可以通过氨基(或亚氨基)化合物的还原烷基化制备。例如，氨基或亚氨基化合物可以与还原剂(如氰基硼氢化钠)一起暴露于氧杂-醛下以将胺进行N-氧杂-烷基化。
含氮化合物可包括一个或多个保护基。各种保护基是公知的。通常，保护基的种类不是决定性的，条件是该保护基在化合物其它位置上随后进行的任何反应的条件下是稳定的并且在适当时间点被除去而不会不利地影响分子的其余部分。另外，保护基可在完成大体的合成转化之后替代另外的保护基。很显然，当化合物与本文公开的化合物的唯一区别仅在于该公开的化合物的一个或多个保护基已被不同的保护基替代时，则该化合物处在本发明的范围内。另外的实例和条件参见Greene，Protective Groups in Organic Chemistry，(1stEd.，1981，Greene&Wuts，2ndEd.，1991)。
含氮化合物可以通过例如结晶法或色谱法进行纯化。化合物可采用立体特异性的氨基或亚氨基化合物作为原料被立体特异性合成。
在制备长链N-烷基化化合物中用作原料的氨基和亚氨基化合物是市售的(Sigma，St.Louis，MO；Cambridge ResearchBiochemicals，Norwich，Cheshire，United Kingdom；TorontoResearch Chemicals，Ontario，Canada)，或者可通过已知的合成方法制备。例如，化合物可以是N-烷基化的亚氨基糖化合物或其被氧杂取代的衍生物。亚氨基糖可以为例如脱氧半乳糖野尻霉素(deoxygalactonojirmycin，DGJ)，1-甲基-脱氧半乳糖野尻霉素(MeDGJ)，脱氧野尻霉素(DNJ)，altrostatin，2R，5R-二羟基甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷(DMDP)，或其衍生物、对映体或立体异构体。
许多亚氨基糖化合物的合成已被描述。例如，合成DNJ衍生物的方法是已知的并且例如描述在以下文献中：美国专利Nos.5,622,972，5,401,645，5,200,523，5,043,273，4,994,572，4,246,345，4,266,025，4,405,714和4,806,650。合成其它亚氨基糖衍生物的方法是已知的并且例如描述在以下文献中：美国专利Nos.4,861,892，4,894,388，4,910,310，4,996,329，5,011,929，5,013,842，5,017,704，5,580,884，5,286,877，和5,100,797以及PCT公报WO01/10429。2R，5R-二羟基甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷(DMDP)的立体特异性合成由Fleet&Smith(Tetrahedron Lett.26：1469-1472，1985)描述。
被接触细胞可以是得自哺乳动物诸如人的细胞。在有些情况下，使被感染细胞接触脂质体组合物可通过给药该组合物至包含被感染细胞的受试者来进行。受试者可以是哺乳动物，诸如人。在一些实施方案中，脂质体组合物可以通过静脉内注射给药。然而在一些实施方案中，脂质体组合物可以通过除静脉内注射途径之外的非肠道途径给药，诸如腹膜内，皮下，皮内，表皮内，肌肉内或经皮途径。然而在一些实施方案中，脂质体组合物可以通过粘膜表面诸如眼、鼻内、肺、肠、直肠和泌尿道的表面给药。脂质体组合物的给药途径例如公开在A.S.Ulrich，Biophysical Aspects of Using Liposomes as DeliveryVehicles，Bioscience Reports，第22卷，第2期，Apr 2002，129-150中。
治疗剂诸如NB-DNJ经由脂质体递送进入ER腔，与非脂质体方法相比，可以降低抑制ER-葡糖苷酶所需的治疗剂的有效量。例如，对于NB-DNJ，IC90减少了至少100，或减少了至少500，和减少了至少1000，或减少了至少5000，或减少了至少10000，或减少了至少50000或减少了至少100000。这种NB-DNJ的有效抗病毒量的减少可导致在哺乳动物特别是人中被给药的NB-DNJ的最终浓度比毒性水平低一个或多个数量级。
在有些情况下，包含治疗剂诸如NB-DNJ的脂质体组合物可与一种或多种另外的治疗剂诸如抗病毒药组合接触被感染细胞。在有些情况下，这种另外的治疗剂可与NB-DNJ共同被包封在脂质体内。然而在有些情况下，使用这种另外的治疗剂接触被感染细胞可以是给药另外的治疗剂至包含细胞的受试者的结果。另外的治疗剂的给药可以通过附加治疗剂至组合物来进行。然而在有些情况下，另外的治疗剂的给药可与给药包含NB-DNJ的脂质体组合物分开进行。这种分开给药可以经由一定的给药途径来进行，该给药途径可与脂质体组合物所用的给药途径相同或不同。
联合治疗不仅降低抗病毒活性所需试剂的有效剂量，从而降低其毒性，而且还因为通过多重机制攻击病毒可改善绝对的抗病毒效果。例如，DCPP脂质体的脂质和NB-DNJ可以1)在病毒的被膜处起作用，其中使用包含NB-DNJ的脂质体的治疗可以通过外来脂质的加入而改变被膜组成2)通过病毒糖蛋白的错折叠起作用，从而降低感染性。因此，与一种或多种具有的靶标或作用机制不同于NB-DNJ的试剂组合使用的包封NB-DNJ的脂质体可以提供加合效果或协同效果。
另外，联合治疗可以提供规避或降低病毒抵抗力的发展的机会的手段。
可与包含NB-DNJ的脂质体联合使用的特定的另外的治疗剂可根据被治疗的病毒感染的不同而异。例如，对于肝炎感染，诸如HBV、HCV或BVDV感染，这种治疗剂可以为核苷类或核苷酸类抗病毒剂和/或免疫刺激剂/免疫调节剂。可与NB-DNJ联合使用用于治疗肝炎的多种核苷类药剂、核苷酸类药剂和免疫刺激剂/免疫调节剂在于2004年2月10日授权给Jacob等人的美国专利No.6,689,759中举例说明。例如，对于丙型肝炎感染的治疗，NB-DNJ可与作为核苷类药剂的1-b-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(利巴韦林)以及作为免疫刺激剂/免疫调节剂的干扰素如干扰素α联合被包封在脂质体内。使用利巴韦林和/或干扰素治疗肝炎感染例如在美国专利Nos.6,172,046；6,177,074；6,299,872；6,387,365；6,472,373；6,524,570和6,824,768中被讨论。
对于治疗HIV感染，可与包含NB-DNJ的脂质体联合使用的治疗剂可以为抗HIV剂，其可以为例如核苷类逆转录酶(RT)抑制剂，诸如(-)-2′-脱氧-3′-硫代胞苷-5′-三磷酸酯(3TC)；(-)-顺式-5-氟-1-[2-(羟基-甲基)-[1，3-氧硫杂环戊烷-5-基]胞嘧啶(FTC)；3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)和二脱氧-肌苷(ddI)；非核苷类RT抑制剂，诸如N11-环丙基-4-甲基-5，11-二氢-6H-二吡啶并[3，2-b：2’3’-e]-[1，4]二氮杂卓-6-酮(奈韦拉平)，蛋白酶抑制剂或其组合。抗HIV治疗剂可用于两联组合或三联组合，诸如AZT、DDI和奈韦拉平组合。
与gp120/gp41靶向部分结合的脂质
本发明还提供了包括与gp120/gp41靶向部分结合的脂质体的组合物以及通过使感染有HIV感染的细胞接触这种组合物来治疗HIV感染的方法。gp120/gp41靶向部分可包括sCD4分子或单克隆抗体，诸如IgG 2F5或IgG b12抗体。在一些实施方案中，脂质体可包括DOPE和CHEMS脂质。在一些实施方案中，脂质体可进一步包括PEG-PE脂质。在一些实施方案中，脂质体可进一步包括MCC-PE脂质。对于HIV感染的治疗，该组合物可进一步包括包封在脂质体内的另外的治疗剂，诸如NB-DNJ。
包含PI脂质的脂质体
本发明人还已发现包括磷脂酰肌醇(PI)脂质的脂质体，诸如pH敏感脂质体，与不含PI脂质的脂质体相比，可更有效地靶向细胞的ER膜。另外，包含PI脂质的脂质体可增加经由脂质体被递送有一种或多种脂质的细胞的生命期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包括包含PI脂质的脂质体和包封在脂质体内的至少一种治疗剂诸如抗病毒治疗剂，以及提供了用于靶向递送的方法，该方法包括给药这种组合物至受试者，受试者可以是哺乳动物，诸如人。这种靶向递送方法可用于治疗或预防受生理学病况影响的受试者中的生理学病况，诸如病毒感染或由其引起的疾病。
本发明人进一步相信将至少一种抗病毒蛋白并入ER靶向脂质体内可协同地降低病毒感染性，原因有：1)直接递送脂质体的脂质进入ER膜内，使得当ER膜被并入病毒被膜内时可降低病毒感染性，和2)直接递送至少一种抗病毒蛋白进入ER膜，ER膜可被并入出芽粒子的病毒被膜内并独立地降低感染性。至少一种治疗剂诸如抗病毒治疗剂被包封在脂质体内可提供另外的协同效果，原因为：3)直接递送治疗剂进入细胞内隔室诸如ER腔内。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包括包含PI脂质的脂质体和嵌入脂质体的脂质双分子层内的至少一种蛋白质诸如抗病毒蛋白，以及提供了用于靶向递送的方法，该方法包括给药这种组合物至受试者，受试者可以是哺乳动物，诸如人。这种靶向递送方法可用于治疗或预防受生理学病况影响的受试者中的生理学病况，诸如病毒感染或由其引起的疾病。
然而在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包括包含PI脂质的脂质体、包封在脂质体内的至少一种治疗剂诸如抗病毒组合物、以及嵌入脂质体的脂质双分子层内的至少一种蛋白质诸如抗病毒蛋白，以及提供了用于靶向递送的方法，该方法包括给药这种组合物至受试者，受试者可以是哺乳动物，诸如人。
病毒感染可以为例如ER膜出芽病毒感染，即，病毒出芽发生在ER膜处的病毒感染，诸如HBV、HCV或BVDV感染，或为质膜出芽病毒感染，即，病毒出芽发生在质膜处的病毒感染，诸如HIV感染。
包含PI脂质的脂质体可进一步包含一种或多种脂质诸如DOPE、CHEMS和/或PEG-PE脂质。脂质体内的PI脂质的摩尔浓度可为约3％到约60％，或约5％到约50％，或约10％到约30％。
在一些实施方案中，包封在包含PI脂质的脂质体内的治疗剂可以是α-葡糖苷酶抑制剂，诸如上面讨论的的α-葡糖苷酶抑制剂中的任一种。
在一些实施方案中，包封在包含PI脂质的脂质体内的治疗剂可以是上面讨论的离子通道活性抑制剂。
在一些实施方案中，包封在包含PI脂质的脂质体内的治疗剂可以是亚氨基糖，诸如上面讨论的亚氨基糖中的任一种。
在一些实施方案中，包封在包含PI脂质的脂质体内的治疗剂可以是式VIII的含氮化合物。
在一些实施方案中，嵌入包含PI脂质的脂质体内的蛋白质可以是抗病毒蛋白。适当的抗病毒蛋白包括但不限于：已知与病毒被膜蛋白结合的病毒受体和/或病毒被膜蛋白的突变形式和/或已知干涉病毒被膜相互作用的蛋白质。例如，对于HIV感染，抗病毒蛋白可以是CD4蛋白。对于HCV、BVDV或HBV感染，抗病毒蛋白可以是其各自的病毒被膜蛋白之一诸如关于HCV/BVDV的E1或E2蛋白的突变形式。
本发明进一步通过以下实施例进行举例说明，然而决不限于以下实施例。
脂质体制备
所有实验中使用的脂质体如下被制备：将脂质的氯仿溶液置于玻璃管内，在氮气氛下蒸发溶剂，然后减压真空离心。脂质膜(10微摩尔的总脂质)通过在1ml PBS缓冲液，pH 7.4(有或者没有药物和/或80mM钙黄绿素，在PBS中)在室温下涡流1小时进行水合。所得的多层小泡在浴型声波仪中超声处理15分钟，然后挤压通过80纳米孔径的聚碳酸酯过滤器21次。
包封浓度的优化
将荧光分子钙黄绿素以80mM浓度包封在DCPP脂质体内，在该浓度下，其荧光自我淬灭。钙黄绿素从脂质体的渗漏及其在周围介质中的稀释导致去淬灭(dequenching)和可测量的/可观察的荧光的增加。通过在MES-缓冲盐水(pH 7.4)中稀释最终的包含钙黄绿素的脂质体制剂到0.5μM的最终磷脂浓度计算包封％，以及在加入Triton X-100到0.1％的最终浓度之前和之后在λex＝490nm和λem＝520nm下测量钙黄绿素。在添加清洁剂之后的荧光差作为脂质体内的包封％，并用于评价DNJ-化合物的量以确定每个实验中化合物的最终浓度。
脂质包封进入ER膜
脂质体能递送被包封的材料直接进入ER腔内，同时脂质被并入ER膜内。初步证据来自具有荧光标记的标记脂质体，其中与PE结合的罗丹明(Rh-PE)被并入DCPP脂质体内(1％的摩尔含量)，以便脂质内容物是摩尔比为6∶4∶0.3∶0.1的DOPE∶CHEMS∶PEG-PE∶Rh-PE(DCPP-Rh)。MDBK细胞用Rh-PE-标记的并包含钙黄绿素的pH敏感脂质体脉冲(pulsed)30分钟。除去未吸附的脂质体并且进一步追踪细胞3小时。在追踪时段的末期，细胞与ER-跟踪器(ER标记物)温育30分钟，洗涤并目测。图1中所示的合并图显示了钙黄绿素、Rh标记脂质和ER跟踪器的共同定位。基于此，可得出结论：在与ER膜初始融合步骤后，脂质体递送其含水内容物到ER，所述初始融合步骤由ER-跟踪器、并入ER膜内的染料对脂质体脂质共同定位显示。
脂质体毒性
脂质体的毒性在两个不同的细胞系中进行测量：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞。
将细胞接种在6孔板中到超过80％的汇合，将包封PBS的DCPP脂质体以对于CHO细胞为0-500μM的最终脂质浓度范围和对于MDBK细胞为0-150μM的最终脂质浓度范围加入到介质中。使细胞和脂质体在37℃下放置温育5天，然后收获细胞，并在用锥虫蓝染色后进行计数。结果表示为：与未经处理的对照(在X轴上＝100％)相比，在被处理样品中存在的活细胞的百分数，并且结果是得自三个单独实验的重复实验值的平均值±S.D.。
结果在图2中示出，其中在CHO细胞中的细胞毒性在存在150μM脂质浓度的条件下温育后逐渐显出。MDBK细胞似乎对DCPP脂质体更敏感，并在脂质浓度大于75μM下显示严重的细胞毒性。
亚氨基糖从DCPP脂质体的释放
在所有使用CHO细胞和MDBK细胞的实验中，添加DCPP脂质体至最终脂质浓度分别为100μM和50μM(二者都为＞95％的细胞存活率)。
在以下实施例中，NB-DNJ的丁基链表现为直接引起被包封材料从DCPP脂质体的胞内释放渐增。
当被包封在DCPP脂质体内时，不同的DNJ化合物对细胞摄取和细胞内释放的影响通过如前所述的在80-mM钙黄绿素中稀释化合物以及将Rh-PE并入脂质体膜内测量，最终的脂质体组成为DOPE∶CHEMS∶PEG-PE∶Rh-PE(DCPP-Rh，6∶4∶0.3∶0.1)。单独的包封钙黄绿素的脂质体，10-μM DNJ，1-mM DNJ，10-μM NB-DNJ，1-mM NB-DNJ，10-μMNN-DNJ或1-mM NN-DNJ与CHO细胞温育45分钟，然后除去脂质体，将细胞用1x PBS洗涤两次。然后在荧光计中分析细胞以测量钙黄绿素去淬灭(λex＝490nm和λem＝520nm)和罗丹明荧光(λex＝584nm和λem＝612nm)。数据代表从四个独立实验的一式三份的实验值获得的平均值±S.D.，其中平均罗丹明荧光值反映脂质体的结合和摄取，以及平均钙黄绿素荧光反映染料的细胞内去淬灭(即，染料从脂质体释放进入细胞内隔室)。结果表示为，与钙黄绿素/PBS-单独的脂质体对照(在x轴上＝100％)相比，与包含DNJ的脂质体温育后测量的荧光％。
如图3所示，DNJ和NN-DNJ二者对钙黄绿素去淬灭的量都没有影响，并因此对细胞内释放没有影响。然而，NB-DNJ在去淬灭的钙黄绿素中显示浓度依赖性增加，其中10μM和1mM的制剂分别导致约1.8倍和2.3倍增加。
计算的钙黄绿素对罗丹明荧光的比作为每个与细胞结合的脂质体中释放的含水标记物的量的量度，并代表细胞内递送效率。计算的关于每个被包封材料的效率列于表1中。结果显示10μM和1mM的包含NB-DNJ的脂质体增加从DCPP脂质体的细胞内递送效率分别为约2倍和3倍。
表1.通过得自图4的去淬灭钙黄绿素和Rh-PE并入的荧光测量而测定的从DCPP脂质体的细胞内释放的效率。
Figure BDA0000087215190000291
尽管本发明不受其操作理论的约束，但是NB-DNJ的丁基链促进被包封材料从DCPP脂质体的细胞内递送的增加所依赖的机制有可能是通过将丁基链嵌入脂质双分子层内而使脂质体不稳定所致。NN-DNJ的9碳烷基链还可将其自身嵌入脂质体的脂质双分子层内；然而，在这一长度下，该分子实际上可能使双层结构稳定，如所提供的结果所暗示的。尽管NN-DNJ脂质体导致细胞摄取增加，但是释放的钙黄绿素的量保持为可与对照比较，表明脂质体稳定性在细胞内增加。
DCPP脂质体的稳定性
在以下实施例中，NB-DNJ和NN-DNJ的烷基链经显示通过使DCPP脂质体在更低pH条件下更稳定而改变DCPP脂质体的性质。
在80mM钙黄绿素缓冲液中包封1mM DNJ、NB-DNJ或NN-DNJ的DCPP脂质体与空(仅有钙黄绿素)脂质体进行比较，以测定NB-DNJ和NN-DNJ的烷基链对pH敏感性的影响。将10μl的负载钙黄绿素的DCPP脂质体(最终磷脂浓度5μM)加入到处在5.0-7.4的多种pH值下的2ml的MES-缓冲盐水中，并在37℃下振摇温育15分钟。温育后，在加入Triton至最终浓度为0.1％之前和之后测量钙黄绿素荧光。对在酸性pH值下获得的荧光强度作pH对钙黄绿素荧光的轻度影响方面的校正。在每个pH下钙黄绿素释放百分数使用下式计算：泄漏％＝((In-I0)/(I100-I0))×100，其中I0是在中性pH下的荧光，In是在加入Triton之前在酸性pH下的校正强度，和I100是在中性pH下的总的去淬灭钙黄绿素。
结果在图4中示出，在图4中在仅有钙黄绿素的脂质体和DNJ被包封的脂质体之间没有观察到稳定性差异。然而，观察到NB-DNJ和NN-DNJ脂质体的pH敏感性显著降低，表明由于烷基链导致在低pH下稳定性增加。尽管NB-DNJ和NN-DNJ二者都在体外赋予DCPP脂质体以更大的稳定性，实际上在体内仅NN-DNJ抑制钙黄绿素递送(如图4和表1中观察到的)，突出了不同于pH敏感性的因素的存在该因素影响或控制细胞内负荷释放的过程。
基于图3、图4和表1的发现，可得出结论：当被包封在脂质体内时，不仅是DNJ分子上烷基链的存在，而且是DNJ分子上烷基链的长度，可以影响脂质体的性质。这些观察很可能是由于烷基链嵌入脂质体的脂质双分子层内并有效地改变脂质组成所导致。尽管在这些研究中仅使用了4碳链(NB-DNJ)和9碳链(NN-DNJ)，似乎仿佛更短的链可在体内使脂质体不稳定以增加负荷分子的细胞内释放，而更长的链可使相同的脂质组成稳定从而使释放受抑。
通过NB-DNJ包封在DCPP脂质体内减少BVDV分泌
在以下实施例中，包封在DCPP脂质体内的NB-DNJ经显示减少BVDV粒子从MDBK细胞的分泌。
被并入DC和DCPP脂质体内的NB-DNJ的组合抗病毒效果已经在感染有BVDV的cp株或ncp株的MDBK细胞中有显示。
在采用BVDV的ncp株的第一研究中，将NB-DNJ以游离形式加入到培养基中，以便最终浓度为0到750nM。在单独的培养中，加入NB-DNJ DCPP脂质体以便最终脂质浓度为50μM且最终NB-DNJ浓度为0到750nM。在6孔板内一式两份进行实验。在培养3天后测量分泌的BVDV病毒粒子的量。通过对从500μl的上清液中提取的病毒RNA进行定量PCR(实时PCR)进行病毒分泌分析。实时PCR使用针对ncpBVDV RNA的引物，其中正向引物序列为TAGGGCAAACCATCTGGAAG且反向引物序列为ACTTGGAGCTACAGGCCTCA。结果表示为，与未经处理的对照(在x轴上＝100％)相比，存在于被处理样品中的RNA拷贝的百分数。
图5表示游离的NB-DNJ和在DCPP脂质体内的NB-DNJ对ncp BVDV的分泌的影响的结果。使用最终浓度为750nM的NB-DNJ，在脂质体介导的递送条件下，分泌的病毒粒子的数目降低了2倍，并且在游离递送下无影响。可进一步优化试验以降低病毒分泌，甚至进一步通过增加脂质体或者被包封NB-DNJ的浓度。
尽管本发明不受其操作理论的约束，但是BVDV分泌受到抑制所凭借的机制可能是由于ER内葡糖苷酶抑制所导致的病毒糖蛋白诸如E1和E2的潴留所致。
BVDV感染性
在以下实施例中，空的DCPP脂质体以及包封NB-DNJ的DCPP脂质体，经显示降低MDBK细胞的BVDV粒子的感染性。DCPP脂质体和NB-DNJ也显示协同起作用。
使用从先前实验(包含分泌的BVDV的500μl的上清液)收集的BVDV病毒粒子，通过与原初MDBK细胞温育3天然后进行免疫荧光染色以鉴定被感染细胞中BVDV蛋白质来测定分泌的经NB-DNJ处理的BVDV的感染性。细胞在感染后使用抗BVDV NS2-NS3单克隆抗体染色，然后使用FITC标记第二抗体染色。使用6孔板一式两份进行实验。通过以非结构BVDV蛋白质的存在所识别的被感染细胞数目除以通过细胞核的DAPI染色所确定的总细胞计数来计算病毒感染性％。还将结果标准化，从而说明每个样品中病毒滴度的降低或增加(来自BVDV分泌实验的结果)。
图6表示游离的NB-DNJ和在DCPP脂质体内的NB-DNJ对ncp BVDV的感染性的影响的结果。这些结果显示了未经处理的BVDV、以及用高达750nM最终浓度的游离NB-DNJ处理的BVDV产生病毒后代，其能够感染约20％的原初MDBK细胞。然而，与750nM的经由DCPP脂质体递送的NB-DNJ温育的被感染细胞显著降低病毒后代的感染性(不到1％的原初细胞被感染)。令人惊讶地是，所有的用DCPP脂质体(有或者没有被包封的NB-DNJ)处理的被感染MDBK细胞使被病毒后代感染的细胞数降低了约7％。因此，仅包封1xPBS的DCPP脂质体与未经处理的病毒相比使BVDV感染性降低了几乎3倍，然而，与750nM NB-DNJ组合时，抗病毒效果增加到高于对照20倍。在750nM的相同浓度下以游离形式被加入到培养基中的NB-DNJ几乎不具有影响。可进一步优化试验以通过增加脂质体或者被包封NB-DNJ的浓度完全消除病毒感染性。
尽管本发明不受其操作理论的约束，但是病毒感染性受使用包封有NB-DNJ的DCPP脂质体处理的影响所凭借的机制可以是被并入ER膜内的DCPP脂质以及抗病毒剂NB-DNJ被直接靶向递送到其作用部位导致活性增强和病毒糖蛋白的错折叠的组合效果。结果是，用这些脂质体处理的病毒后代在其病毒被膜内除了病毒糖蛋白之外还可存在DCPP脂质，所述病毒糖蛋白由于在ER中缺乏聚糖加工而是有缺陷的。
用脂质体包封的NB-DNJ的抗病毒效果
还试验了包含在脂质体内的NB-DNJ对抗cp BVDV的抗病毒效果，使用收率减少(yield reduction)试验，该方法利用能够在被感染细胞的单层上形成斑块的cp株。
图7表示游离的NB-DNJ相对于用DC脂质体包封的NB-DNJ对感染性cp BVDV的分泌的影响。感染有cp BVDV的MDBK细胞用游离的NB-DNJ或用DC脂质体包封的NB-DNJ处理3天，以便最终的NB-DNJ浓度为0到500μM且总脂质浓度为100μM。然后取得上清液并用于在六孔板内感染新鲜的MDBK单层。3天后在显微镜下计数斑块(斑块法)，并且结果用作为用不含药物的上清液进行感染(＝100％)(x轴)所得的斑块数的百分数表示。y轴表示在斑块法中使用的游离的NB-DNJ的浓度或包含在DC脂质体内的NB-DNJ的浓度。IC50在曲线的底部被标明。结果显示了被包含在DC脂质体内的NB-DNJ导致对感染性BVDV的分泌的抑制高8倍(IC50为20μM，与游离药物IC50为175μM相比)。可通过将NB-DNJ并入DCPP脂质体内优化在cp BVDV上进行的试验，NB-DNJ在细胞培养基中更稳定并因此具有改善的抗病毒效果。
通过游离低聚糖分析测量的被DCPP包封的NB-DNJ的增加的活性
对在游离的NB-DNJ或被DCPP脂质体包封的NB-DNJ存在的条件下产生的游离低聚糖(FOS)进行表征并用作葡糖苷酶抑制的细胞标记物以测量由细胞内递送所致的药物活性的增强。已经表明FOS通过细胞溶质肽：N-聚糖酶(PNGase)对从ER输出的错折叠糖蛋白的作用而产生，用于经由ER膜内包含Sec61的通道的蛋白水解酶降解。存在于FOS中的聚糖的鉴定揭示了蛋白质折叠在什么阶段被阻止。在该实验中，糖基化FOS的分布用作被NB-DNJ葡糖苷酶抑制的量度，其中Glc1Mann-FOS和Glc2Mann-FOS形式是葡糖苷酶II抑制的结果，并且Glc3Mann-FOS是葡糖苷酶I抑制的结果。
CHO细胞在抗病毒浓度为0.5mM的游离NB-DNJ存在的条件下进行温育，或与100μM的用DCPP脂质体包封的NB-DNJ在最终浓度为0-75nM下进行温育。细胞放置培养5天并使用如Mellor等人(2004).Biochem J.2004August 1；381(Pt 3)：861-866所述的标准化到500μg的总蛋白的细胞匀浆进行FOS的分离。在用2-氨基苯甲酰胺标记低聚糖后通过正相HPLC检测FOS。对FOS的组成进一步表征并通过用包括内切糖苷酶H、刀豆α-甘露糖苷酶和α-葡糖苷酶I和II的糖苷酶进行消化来测定。计算每个样品的非葡萄糖基化的和葡萄糖基化的低聚甘露糖FOS的百分数(由Mann-FOS、Glc1Mann-FOS、Glc2Mann-FOS和Glc3Mann-FOS表示)，并且结果如表2所示。结果代表四个单独的实验的平均值±S.D.。
表2.在CHO细胞中在游离的NB-DNJ或通过DCPP脂质体递送的NB-DNJ存在的条件下产生的FOS的分布。
Figure BDA0000087215190000341
在抗病毒浓度为0.5mM的游离NB-DNJ存在的条件下进行温育的CHO细胞主要产生FOS的三葡萄糖基化形式，表明在此浓度下葡糖苷酶I的抑制。这可暗示出葡糖苷酶I的抑制决定着先前报导的NB-DNJ对HIV的抗病毒效果。在NB-DNJ浓度增加的条件下从用脂质体处理的样品中分离的FOS揭示了葡萄糖基化FOS的分布从主要为Glc1Man-FOS向Glc3Man-FOS逐渐移动，分别伴有葡糖苷酶II和I的抑制。当经由DCPP脂质体递送时，用最终浓度为750nM NB-DNJ处理的样品显示了与对于在0.5mM下进行游离培养的葡糖苷酶I的抑制相当的水平，暗示由于细胞内递送所致的抗病毒活性增强约600到700倍。
尽管本发明不受其操作理论的约束，但是实现NB-DNJ活性增加所凭借的机制可通过直接递送该抗病毒剂至其作用部位(即ER腔)进行。直接ER递送可允许抗病毒剂绕过血浆和ER膜二者，它们二者当NB-DNJ以游离方式被加入到周围介质中时可充当屏障。当NB-DNJ用于包封时所观察到的细胞内递送水平的增加还可促进由于NB-DNJ在ER腔内的浓度高于其它化合物所致的活性的增强。
通过2G12抗体结合测定的用DCPP包封的NB-DNJ的活性增加
在以下实施例中，在游离的NB-DNJ或用DCPP脂质体包封的NB-DNJ存在的条件下，在CHO细胞中表达后，通过测量对HIV被膜蛋白gp120的聚糖加工的抑制而测定NB-DNJ的活性。
表达可溶形式的HIV gp120的CHO细胞在培养基中的浓度为0-5mM的游离NB-DNJ存在的条件下或最终浓度为0到750nM的用脂质体包封的NB-DNJ存在的条件下进行培养。将细胞放置培养5天，然后收集包含被处理的gp120的细胞上清液。为了测量在NB-DNJ(游离的或在脂质体内)存在的条件下对表达的gp120的聚糖加工的抑制，通过捕获ELISA测定MAb 2G12的结合。2G12识别gp120的富含碳水化合物的表面上的甘露糖残基集簇，在NB-DNJ存在的条件下结合的丧失归因于在形成表位的低聚甘露糖聚糖上的葡萄糖的潴留。然而，结合亲合力的丧失还可归因于蛋白质的错折叠，并且为了区别这两种可能性，还测量了所有样品对中和MAb，b12的亲和力。b12抗体识别构象敏感表位-CD4结合位点，其不与2G12的重叠。位于细胞上清液内的可溶gp120被捕获在采用D7324抗体(结合gp120的C5结构域)的ELISA板中并用10μg/ml的2G12或b12处理。两种抗体对用NB-DNJ处理的样品的结合与对未经处理的gp120的结合相关，其中数据用结合％表示并且代表从四个单独的实验进行一式三份实验获得的平均值±S.D.。
图8显示了在培养基中用0.5mM游离NB-DNJ处理后与2G12的gp120结合丧失(1.2±0.1％结合)，同时保持与b12的结合为100％。通过脂质体介导的最终浓度为7.5nM的NB-DNJ的递送导致与2G12的结合为9.8±4.8％，对b12结合无显著影响(96.3±3.2％)，显示了由于细胞内递送所致的IC90有60,000到70,000倍增强。
免疫增强肽的脂质体递送
本发明人还发现了通过使抗原呈递细胞接触组合物可以增加由主要组织相容性分子1类进行的呈递，所述组合物包含pH敏感脂质体如包含DOPE、CHEMS和/或PEG-PE脂质的脂质体以及包封在脂质体内的抗原诸如免疫增强肽。这种接触可以是给药该组合物至包含抗原呈递细胞的受试者的结果。组合物给药至受试者可用于给受试者接种。
免疫增强肽的实例可以为：酪氨酸酶肽-YMDGTMSQV，其被发现是由在表达全长酪氨酸酶的细胞上的主要组织相容性分子1类HLA-A0201所呈递。其是由对应于酪氨酸酶氨基酸369-377并包含N-连接的糖基化位点6的酪氨酸酶肽YMNGTMSQV产生的转化肽。尽管本发明不受其操作理论的约束，但是转化肽可能出现，这是由于从细胞溶质中通过酶肽：N-聚糖酶的去糖基化的结果所致。N-聚糖酶肽与将肽转运进入ER内的抗原加工相关转运蛋白(TAP)结合。YMDGTMSQV肽被包封进入DCPP脂质体使肽的ER递送降低了一个数量级。
使用游离的NB-DNJ和用脂质体包封的NB-DNJ治疗被HIV-1感染的PBMCs。
使用植物血细胞凝集素(PHA)活化的外周血单核细胞(PBMCs)作为指示剂细胞并测定作为终点的p24抗原生成来评价由NB-DNJ实现的得自被感染人的HIV-1初次分离物的清除率。
从四个正常的(未感染)供体中分离了PBMCs，混合并用PHA(5μg/ml)刺激48小时，然后用PHA+白细胞介素-2(40U/ml)在RPMI1640培养基中刺激72小时，该RPMI 1640medium包含10％的热失活胎牛血清(FBS)，100U的青霉素/ml，100μg的链霉素/ml，和2mM L-谷氨酰胺。所有的实验在96孔微量滴定板中进行。为了感染细胞，向每孔加入100μl的PHA活化的PBMCs(5×105/ml)，然后加入等体积的包含100μl的50％组织培养感染剂量(TCID50)的初次分离原液。在过夜培养后，细胞用组织培养基洗涤三次，最后被重悬在包含适当的脂质体治疗剂或游离NB-DNJ的培养基中。第7天，使用约10-30％的包含被分泌的HIV-1病毒粒子的培养基体积感染原初PBMCs用于第二轮感染和治疗(转移的体积经过计算为该分离物的未经治疗的对照以TCID50＝100感染原初细胞所必需的体积)。在4周内进行多轮原初细胞的治疗和感染，并且在每个时间点分离包含被分泌的病毒粒子的细胞上清液并在捕获ELISAs中用于测定p24浓度(分泌的量度)。另外，在整个治疗期间在每个时间点分离的上清液用于感染原初细胞(TCID50＝100)达二周，没有进一步的处理，这便于观察病毒活性的反弹。
用8个初次分离物(列于表3中)感染的PBMCs在游离NB-DNJ(浓度为0-1mM)或用脂质体包封的NB-DNJ(0-3.75μM，最终脂质浓度为50μM)存在的条件下进行培养。
表3.在试验中使用的HIV-1初次分离物的列表，包括进化枝鉴定和向性。
Figure BDA0000087215190000371
从用游离NB-DNJ处理的PBMCs获得的结果证实了抗HIV-1的抗病毒浓度为500μM。这是在四周处理内在所有分离物中清除病毒活性的最低浓度(图9a)。所有分离物显示病毒活性至少有90％降低(IC90)，暗示了NB-DNJ能有效地靶向于大范围的HIV-1。
游离NB-DNJ对病毒分泌的效果可从第一周处理后获得的p24量度来确定。在最高浓度的NB-DNJ下，在培养基中为1mM的游离的NB-DNJ，大多数分离物作出病毒分泌有约30-40％降低的反应(图9b)。特别感兴趣的是，三个进化枝b分离物：89.6，JR-FL和92HT599，其中分泌降低了50％，并且在89.6的情况中，降低了75％。93IN101，作为进化枝c分离物，也具有50％的分泌降低。
NB-DNJ对不同的初次分离物的抗病毒活性的程度(药物敏感性)从三个轮的处理后从p24量度来评价。在该点，观察了每个分离物的p24分泌的连续曲线，并因此可计算IC50和IC90。供试的8个分离物的数据如图9c所示，其中6个分离物的IC50和IC90经计算分别为400μM和500μM，以及两个分离物的IC50和IC90分别为250μM和375μM。两个显示对NB-DNJ处理最敏感的分离物89.6和93BR3020也是被包括在这些试验中的已知显示双向性(dual tropism)的仅有的分离物，而其它6个分离物为R5或者X4(单)向性。
在同样的8个分离物中测量了被包封在DOPE∶CHEMS∶PEG-PE脂质体内的NB-DNJ的抗病毒活性，以测定在细胞内递送条件下的增强的活性。图10显示在供试的8个不同的分离物(曲线A-H)中使用最终浓度为0-3.75μM的NB-DNJ处理4周内p24分泌的水平。当将病毒减少与使用500μM游离NB-DNJ的结果相比时，所有的分离物显示在3.75-37.5nM的最终NB-DNJ浓度的条件下具有类似的抗病毒活性模式，有约104-105倍的增强。另外，在不同分离物中存在对使用NB-DNJ脂质体进行治疗的敏感性的差异，因为除了药物敏感性之外存在新的变量，如脂质体摄取速率和细胞内递送效率。
使用sCD4-脂质体和免疫脂质体靶向于被HIV-1感染的PBMCs
使用可溶性CD4分子(sCD4)和若干已知与gp120/gp41复合物结合的单克隆抗体在9个不同的初次分离物中评价了通过使脂质体靶向于在被HIV-1感染的细胞的表面上表达的gp120/gp41复合物进行的细胞摄取的增加。
sCD4-脂质体结合物如下生成：首先将sCD4的伯胺与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯起化学反应以得到被保护的巯基，然后通过使用盐酸羟胺进行脱乙酰化作用进行脱保护。免疫脂质体如下制备：首先用2-巯基乙醇胺还原IgG分子，该2-巯基乙醇胺试剂特异性还原在两个重链之间的绞链区内的二硫键，得到两个各自包含游离巯基的半个IgG分子。脂质体的制备如前所述，然而，将包含马来酰亚胺基的PE脂质(MCC-PE)并入双分子层内以便最终的脂质体组成为DOPE∶CHEMS∶PEG-PE∶MCC-PE∶Rh-PE(摩尔比为6∶4∶0.3∶0.3∶0.1)。未被保护的sCD4分子和被还原的IgG分子与脂质体在室温下放置温育过夜。使用空间排阻色谱法将脂质体从游离的sCD4或IgG纯化出来。
将荧光标记脂质(Rh-PE)并入脂质体双分子层内，并在温育后从在细胞中检测到的荧光的增加计算增加的胞吞作用。如前所述将PBMCs纯化、培养和在96孔微量滴定板中进行感染。将PBMCs与初次分离物(TCIC50＝100)放置温育5天，然后细胞用组织培养基洗涤三次，并最终重悬在包含适当的脂质体治疗剂(最终脂质浓度为50μM)的培养基中。24小时温育后，分离PBMCs，用200μl PBS洗涤两次，并重悬在50μl的含1％(vol/vol)Empigen的PBS中。在λex＝520nm和λem＝590nm下测量荧光。
在研究中引入6个单独的单克隆抗体：IgGs b6、b12、2G12、2F5、X5和4E10，然而，b6和4E10不能结合脂质体，因为它们都引起脂质聚集。
图11表示使用包封有1mM NB-DNJ的sCD4-脂质体和b12免疫脂质体、2G12免疫脂质体、2F5免疫脂质体和X5免疫脂质体获得的结果，该结果用相对于对照的脂质体摄取的百分数表示。对于每个感染，在靶分子和作为唯一对照的脂质体之间的摄取有显著差异(P＜0.0001)。与sCD4结合的脂质体能靶向供试的所有9个分离物并导致相对于作为唯一对照的脂质体细胞摄取显著增加。2F5免疫脂质体和b12免疫脂质体在分别用5个和6个不同的初次分离物感染的PBMCs中能增加脂质体摄取。2G12免疫脂质体和X5免疫脂质体不靶向于供试的任何初次分离物，并且没有靶分子通过非特异性相互作用引起显著的脂质体摄取。
因此，sCD4-脂质体可能是用于使脂质体靶向于被HIV感染的细胞的最好的分子。不仅sCD4成功地靶向于大范围的HIV-1初次分离物，而且sCD4便于经由受体介导的胞吞作用增加在被感染细胞中脂质体的摄取。
使用被sCD4-脂质体包封的NB-DNJ治疗HIV-1PBMCs
因为sCD4-脂质体经显示具有最宽泛的靶向能力，因此该脂质体制剂用于p24分泌试验中，以将NB-DNJ的抗病毒活性与使用裸脂质体或游离递送所观察到的抗病毒活性比较。使用最终NB-DNJ浓度为0-375nM进行了包括相同组的8个初次分离物的试验。结果如图12所示，其中sCD4-脂质体经显示提供了另外的中和能力，以便所有的sCD4-脂质体治疗，甚至是不包含NB-DNJ那些sCD4-脂质体处理，完全中和每个初次分离物(曲线A-H)。
HIV-1病毒活性的反弹
表4总结了表示在撤除所有的NB-DNJ处理后病毒活性反弹的数据。在所有的情况下，当病毒活性被降低至0(或接近于0)时，当撤除处理达两周时不发生反弹。
表4.使用在培养基中以游离方式、在脂质体内或在sCD4-脂质体内递送的NB-DNJ处理4周内，从被HIV-1感染的PBMCs中获得的所有的平均p24分泌数据。为了测量病毒活性的反弹(-rb)，在测量p24分泌之前撤除处理达两周。
Figure BDA0000087215190000411
Figure BDA0000087215190000421
Figure BDA0000087215190000431
Figure BDA0000087215190000441
将磷脂酰肌醇并入DOPE∶CHEMS脂质体内
将从牛肝细胞纯化得到的磷脂酰肌醇(PI)以最终的摩尔浓度为10-30％并入先前进行试验的脂质体组成DOPE∶CHEMS∶Rh-PE中。DOPC∶CHEMS∶Rh-PE脂质体作为阴性对照被包含在该研究中。脂质体的制备如前所述。将MDBK细胞生长至50％汇合，然后培养基被交换并用包含最终脂质浓度为100μM的脂质体的新鲜培养基替换。在15分钟培养后，除去脂质体，细胞在PBS中洗涤两次。细胞在新鲜的培养基中培养0、1、2、5、24或48小时，然后将细胞固定的2.5％多聚甲醛中并在荧光显微镜下目测。在目测分析前用DAPI将细胞染色。
图13显示了典型的荧光图像，在每个脂质体制剂用MDBK细胞进行15分钟脉冲后的时间点0、1、2、5、24和48小时取得图像。结果显示包含最终浓度为10到30％的PI脂质的脂质体在细胞内具有增加的生命期，这意味着经由这种方法被递送的脂质更有效地保留在细胞内，或者说，更少地被有效降解。在DOPE∶CHEMS∶Rh-PE脂质体与MDBK细胞培养后取得的荧光图像显示了这些脂质主要在5小时到24小时之间的某时发生降解，并且在48小时前完全降解。在48小时后，包含PI的脂质体在被处理细胞中仍然很明显，并且观察到更加弥散的Rh-PE图形。这一结果表明了在该时间点大多数脂质被并入细胞膜内并且不再浓集在小泡中(点状的荧光图形)。
将DOPE∶CHEMS脂质体并入ER-出芽病毒粒子的被膜内
为了研究脂质体是否能与细胞膜如ER融合，使用包含Rh-PE的脂质体来监控被从ER膜出芽的病毒粒子的摄入。将持续地感染有致细胞病变BVDV(NADL，MOI＝0.01)的MDBK细胞和原初(未被感染的)MDBK在DOPE∶CHEMS∶Rh-PE、DOPE∶CHEMS∶PI∶Rh-PE或DOPC∶CHEMS∶Rh-PE脂质体存在的条件下在最终脂质浓度为50μM下培养两天。培养后，除去包含脂质体的培养基，细胞在PBS中洗涤两次，然后添加新鲜的培养基，并将细胞另外培养三天。三天后，取得每组被处理细胞(被感染以及未被感染)的上清液样品，并使用设定在λex＝550nm和λem＝590nm下的荧光分光计进行荧光测量。一式三份进行试验，结果表示为三次读数的平均值。
与用相同脂质体制剂处理的未被感染的细胞相比，在被感染细胞的上清液中的荧光的任何增加是由于在其被膜内包含Rh-PE脂质的病毒粒子的分泌所致。图14显示了使用三个不同的脂质组成获得的结果，并且这些数据表明包含DOPE(PE)的脂质体能并入ER膜内，并随后并入出芽的病毒被膜。得自用DOPE脂质体处理的被感染细胞的上清液全部显示了与未被感染细胞相比有荧光的显著增加。用作阴性对照的包含DOPC(PC)的脂质体(不靶向于ER)在被感染样品和未被感染样品之间没有显示荧光差异。令人惊讶的并且根据图13中的数据，包含作为脂质组成的一部分的10-30％PI的脂质体能以相对于不含PI的脂质体几乎为5倍的更有效方式并入病毒被膜内。这表明PI引起脂质体被ER膜摄取的增加。该结果可提供对于治疗从ER出芽的病毒如BVDV、HCV和HBV的治疗的推断性结论。
在开发使用ER靶向脂质体的抗病毒疗法中的下一步可以是将抗病毒蛋白并入脂质体的脂质双分子层内用于递送进入ER膜内。抗病毒蛋白包括但不限于已知与病毒被膜蛋白结合的受体和/或病毒被膜蛋白的突变形式和/或已知干扰病毒被膜相互作用的蛋白质。
将抗病毒蛋白并入包封有抗病毒药物的ER靶向脂质体制剂中可以提供三种单独的抗病毒策略的组合，三种策略可协同地起作用以降低病毒感染性：1-直接递送脂质进入ER膜内，当ER膜被并入病毒被膜时将降低病毒感染性，2-直接递送蛋白质进入ER膜内，ER膜将被并入出芽粒子的病毒被膜内并降低感染性，3-直接递送抗病毒药进入细胞内隔室内。
尽管上文说明了具体的优选方案，但是显然本发明不限于这些方案。本领域普通技术人员可对所公开的实施方案作出多种修改，并且这些修改处在本发明的范围内。
本说明书中引述的所有的公开、专利申请和专利全文并入本文作为参考。

Claims (15)

1.一种组合物，其包括：
(a)包含PI脂质的脂质体，和
(b)至少一种i)包封在脂质体内的至少一种治疗剂；和ii)嵌入脂质体的脂质双分子层内的至少一种蛋白质；其中脂质体内PI脂质的摩尔浓度为5到50％。
2.权利要求1的组合物，其中脂质体进一步包含DOPE和CHEMS脂质。
3.权利要求1或2的组合物，其中脂质体内PI脂质的摩尔浓度为10到30％。
4.权利要求1-3任一项的组合物，用于治疗或预防病毒感染。
5.权利要求4的组合物，其中病毒感染是ER膜出芽病毒感染。
6.权利要求5的组合物，其中ER出芽病毒感染是HBV、HCV或BVDV感染。
7.权利要求4的组合物，其中感染是质膜出芽感染。
8.权利要求7的组合物，其中质膜出芽感染是HIV感染。
9.权利要求4-8任一项的组合物，其中至少一种治疗剂包括抗病毒剂。
10.权利要求9的组合物，其中抗病毒剂包括α-葡糖苷酶抑制剂。
11.权利要求10的组合物，其中α-葡糖苷酶抑制剂包括NB-DNJ。
12.权利要求9的组合物，其中抗病毒剂包括离子通道抑制剂。
13.权利要求9的组合物，其中抗病毒剂包括亚氨基糖。
14.权利要求4-8任一项的组合物，其中至少一种蛋白质是抗病毒蛋白。
15.权利要求4的组合物，用于治疗或预防人的病毒感染。
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