CN102741395A - 人胚胎干细胞的分化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种促进多能干细胞分化为胰岛素生成细胞的方法。具体而言，本发明提供一种产生表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素的细胞的方法。

Description

人胚胎干细胞的分化
本申请要求2009年12月23日提交的美国临时申请No.61/289,671的权利，该申请通过引用的方式完整并入本文。
技术领域
本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素生成细胞的方法。具体而言，本发明提供一种方法，其产生表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞，所述细胞共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏，已使人们的注意力集中在开发适于移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。
定形内胚层分化成胰内胚层导致形成胰腺。胰内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在PDX1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了含有其他细胞类型，成熟的胰腺还含有外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，小鼠胚胎干细胞衍生的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖恢复正常。
在一个实例中，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)公开了用磷酸肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了与β细胞相似的细胞。
又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生产胰岛素的细胞。
Micallef等人报道，视黄酸可以调控胚胎干细胞定向形成PDX1阳性胰内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末期的期间，当将视黄酸加入胚胎干细胞分化第4天的培养物时，其最有效地诱导Pdx1表达(Diabetes 54：301，2005)。
Miyazaki等人报道了过量表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表明，外源Pdx1表达明显增强了所得到的分化细胞中胰岛素、促生长素抑制素、葡萄糖激酶、神经元素(neurogenin)3、p48、Pax6和Hnf6基因的表达(Diabetes 53：1030，2004)。
Skoudy等人报道，激活蛋白A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活蛋白A时观察到了最大的效果。他们还观察到胰岛素和Pdx1mRNA的表达水平不受视黄酸影响；然而，3nM FGF7处理导致了Pdx1转录物的水平增加(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGF-β2可再现地产生了更高比例的Pdx1阳性细胞(Genes Cells.2005Jun；10(6)：503-16.)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活蛋白连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury[阳性]/HNF3β[阳性]内胚层细胞(US 2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006年)声称：“Wnt和TGF-β/nodal/激活蛋白信号转导同时为前原条的产生所必需”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
Thomson等人从人胚泡分离出了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同时，Gearhart及同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须在非常特殊的条件下维持(美国专利No.6,200,806；WO99/20741；WO 01/51616)。
D’Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾包膜下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdx1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。
D’Amour等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我们已经开发了一种分化方法，其将人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰激素：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和生长素释放肽的内分泌细胞。该方法通过引导细胞经过通向表达内分泌激素的细胞的类似定形内胚层、肠管内胚层、胰内胚层和内分泌前体的各阶段，来模拟体内胰腺器官发生”。
又如，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。首先用丁酸钠和激活蛋白A的组合使人胚胎干细胞向内胚层分化。然后将细胞与TGF-β拮抗剂(如成头蛋白(Noggin))结合EGF或β细胞素一起进行培养，以产生Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个实例中，Benvenistry等人声称：“我们得出结论：PDX1的过量表达增强了胰腺丰富基因的表达，胰岛素表达的诱导可能需要仅在体内存在的额外信号”(Benvenistry等人，Stem Cells 2006；24：1923-1930)。
在另一个实例中，Grapin-Botton等人声称：“Ngn3的早期活化几乎专门诱导了胰高血糖素+细胞，同时耗尽胰腺祖细胞的库。从E11.5开始，PDX-1祖细胞具备了分化成胰岛素[阳性]和PP[阳性]细胞的能力”(Johansson KA等人，Developmental Cell 12，457-465，2007年3月)。
例如，Diez等人声称；“在9和10周，大部分胰高血糖素阳性细胞共表达了胰岛素，尽管在这些阶段可清楚检测到独特的仅表达胰岛素的细胞。在整个研究期间(9至21周)观察到共表达胰岛素和胰高血糖素的细胞，但是它们仅代表全部的表达胰岛素和胰高血糖素的细胞的一小部分”(JHistochem Cytochem.2009Sep；57(9)：811-24.2009Apr 13)。
在一个实例中，Chen等人声称“(-)-indolactam V[(ILV)]能活化蛋白激酶C信号转导并且指导已经定型成内胚层谱系的hESC的胰特化ILV和视黄酸通过相关的机制发挥作用ILV显示出比视黄酸更强烈地诱导PDX-1表达细胞(表达PDX-1的细胞的百分数)”(Nature Chemical Biology 5，195-196(April 2009)doi：10.1038/nchembio0409-195)。
Lyttle等人声称：“NKX6-1仅与胰岛素细胞共定位，这表明NKX6-1专门参与人β细胞发育”(Diabetologia 2008Jul：51(7)：1169-80，2008)。
因此，仍特别需要开发出用来产生与β细胞更密切相似的表达胰岛素的功能细胞的体外方法。本发明另辟蹊径，通过产生表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素的细胞群体，来改善使人胚胎干细胞分化成胰岛素表达细胞的效率。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素的细胞群体。
在一个实施例中，本发明提供了使多能干细胞群体分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素的细胞群体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.通过用补充有蛋白激酶C激活剂的培养基处理表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，使表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素的细胞。
附图说明
图1示出TPB处理对本发明细胞中胰岛素和胰高血糖素表达的影响。小图a和b分别示出用TPB处理的细胞中胰岛素和胰高血糖素的表达。对照细胞群体在小图c和d中示出。
图2示出多个浓度的TPB对根据本发明方法处理的细胞中胰岛素和胰高血糖素表达的影响。小图a至d示出用TPB以所示剂量处理的细胞群体中胰岛素和胰高血糖素的表达。
图3示出蛋白激酶C抑制剂对根据本发明方法处理的细胞中胰岛素和胰高血糖素表达的影响。小图a描绘用TPB处理的细胞中胰岛素和胰高血糖素的表达，小图c描绘相应的DAPI染色。小图b描绘用TPB和
Figure BDA00001803268000051
处理的细胞中胰岛素和胰高血糖素的表达，小图d描绘相应的DAPI染色。
图4示出多种蛋白激酶C激活剂对根据本发明方法处理的细胞中胰岛素表达的影响。小图a示出用TPB处理的细胞中胰岛素的表达。小图b示出用ILV处理的细胞中胰岛素的表达。小图c示出用PMA处理的细胞中胰岛素的表达。
图5示出根据本发明方法处理的细胞中胰内分泌谱系特征性标志物的表达。各小图描绘胰岛素和NKX6.1(小图a)、胰岛素和PDX1(小图b)、胰岛素和NEUROD1(小图c)、胰岛素和促生长素抑制素(小图d)以及胰岛素和生长素释放肽(小图e)的表达。
图6示出根据本发明方法处理的细胞中胰岛素和胰高血糖素的表达。小图a至c示出用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/mL FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/mL成头蛋白(Noggin)+20ng/mL激活蛋白A+p38激酶抑制剂(在US6,214,830中公开，2.5μM)处理四天的细胞中的胰岛素表达(小图a)、胰高血糖素表达(小图b)和DAPI染色(小图c)(阶段3，处理8，实施例2)。小图d至f示出用DMEM-高葡萄糖+1％B27+0.25μM环巴胺-KAAD+2μMM视黄酸(RA)+100ng/mL成头蛋白处理四天的细胞中的胰岛素表达(小图d)、胰高血糖素表达(小图e)和DAPI染色(小图f)(阶段3，处理9，实例2)。
图7示出在葡萄糖攻击后，在接受本发明细胞后4、8和12周的(SCID)-beige(Bg)小鼠中检测到人C肽。
图8示出在多种蛋白激酶C抑制剂以所示浓度处理后获得的共表达PDX1和NKX6.1的细胞的百分比。
图9示出根据实例6中所述方法处理的细胞中NGN3、PDX1、NKX6.1和PTF1α的表达。
具体实施方式
为了以非限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列各个描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，所述子代细胞包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多数的组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
干细胞根据其发育潜能分类为：(1)全能，意指能够产生全部胚胎细胞和胚外细胞类型；(2)多能，意指能够产生全部胚胎细胞类型；(3)专能，意指能够产生细胞谱系子类，但是均处于特定组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞(HSC)可以产生子代，其包括(自我更新性)HSC、血液细胞限制性寡能祖细胞和作为血液正常组分的全部细胞类型和要素(例如，血小板)；(4)寡能，意指能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子类；和(5)单能，意指能够产生单一细胞谱系(例如，精子发生干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或分化诱导的细胞是已经在细胞的谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子类，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的位置的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞的谱系将该细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”或“第1阶段细胞”或“第1阶段”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9或PROX1。表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。就此而论，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平在所关注细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
本文所用的“胰内分泌细胞”或“胰激素表达细胞”或“表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞”指能够表达至少一种以下激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素和胰多肽。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可以表达一种或多种阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可使用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致SSEA-4、Tra 1-60和Tra1-81的表达(如果存在的话)的丧失，并导致SSEA-1的表达增加。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物按生产商所描述(Vector Laboratories，Burlingame Calif)进行显影来检测。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT，这通过RT-PCR检测到。
增殖的多能干细胞的另一期望的表型，是分化成所有以下三种胚层的细胞的潜能：内胚层、中胚层和外胚层组织。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自所述三种胚层的细胞类型。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中是否存在所述三种胚层相关的标志物来确定多能性。
可以使用标准的G带(G-banding)技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较，来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有的人染色体都存在并且没有明显被改变。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括从妊娠后形成的组织衍生而来的确立多能细胞系，包括在妊娠期间任何时间取得的胚前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常是但不一定是在大约10至12周妊娠前。非限制性例子是确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。还设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定化期间使用本发明的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代多能细胞。另外合适的是取自己经在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v(BresaGen，Athens，GA)。
在一个实施例中，人胚胎干细胞是如Thomson等人所述制备(美国专利No.5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.)38：133 ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995)。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。作为另一种选择，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但仍然支持多能干细胞的增殖而不使其发生实质分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和Thompson等人(Science 6November 1998：Vol.282.no.5391，第1145-1147页)公开了使用小鼠胚成纤维细胞饲养细胞层从人胚泡培养多能干细胞系。
Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)评价了一组11种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层支持人多能干细胞培养物的能力。Richards等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养细胞上培养的人胚胎干细胞系保持了人胚胎干细胞形态并仍为多能性的”。
US20020072117公开了能产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的介质的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间充质细胞系和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。
在另一个实例中，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了用于在源自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期培育人多能干细胞的方法。
在另一个实例中，Stojkovic等人(Stem Cells 200523：306-314，2005)公开了一种源自人胚胎干细胞的自发分化的饲养细胞系统。
在又一个实例中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞源。
Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了源自人包皮的饲养细胞层。
在另一个实例中，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的介质以及可用于产生这种介质的细胞系。US6642048声称：“本发明包括从胚胎组织获得的或从胚胎干细胞分化的间充质细胞系和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以及用该调理培养基培养干细胞的方法”。
又如，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞的维持、增殖和分化的调理培养基。WO2005014799声称：“根据本发明产生的培养基经鼠细胞的、尤其是那些命名为MMH(Met鼠肝细胞)的分化和永生化转基因肝细胞的细胞分泌活性调理”。
在另一个实例中，Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了从人胚胎干细胞衍生物获得的调理培养基，所述人胚胎干细胞衍生物已被遗传修饰而过量表达人端粒酶逆转录酶。
又如，US20070010011公开了用于维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。
一种另选的培养系统采用补充有能够促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprodDOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能够引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
在另一个实例中，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或调理培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。
在另一个实例中，US20050148070公开了一种在无血清和无成纤维细胞饲养细胞的确定成分培养基中培养人胚胎干细胞的方法，所述方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代物、至少一种胰岛素或胰岛素替代物的培养基中培养干细胞，该培养基基本上不含哺乳动物胎血清，并且含有至少约100ng/ml能够激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的成纤维细胞生长因子，其中提供该生长因子的来源不只是成纤维细胞饲养层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或调理培养基的情况下以未分化状态增殖。
又如，US20050233446公开了一种用于培养干细胞，包括未分化的灵长类原始干细胞的限定培养基。在溶液中，此培养基与培养中的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行实质上非分化性生长所必需的。
又如，US6800480声称：“在一个实施例中，提供了用于以基本上未分化状态培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包括低渗透压、低内毒素基础培养基，此培养基对于支持灵长类来源的原始干细胞的生长是有效的。该基础培养基混合了有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的底物(substrate)。该培养基还包含非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子”。
在另一个实例中，US20050244962声称：“在一个方面，本发明提供培养灵长类胚胎干细胞的方法”。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选也基本上不含任何动物血清)的培养物中，并在存在由不只是成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子情况下培养干细胞。在优选的形式中，通过添加足量的成纤维细胞生长因子，使得之前为维持干细胞培养物所需的成纤维细胞饲养层变为非必需的”。
在又一个实例中，WO2005065354公开了一种基本上不含饲养细胞和血清的确定成分的等渗培养基，其包含：a.基础培养基；b.一定量的bFGF，该量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长；c.一定量的胰岛素，该量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长；和d.一定量的抗坏血酸，该量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将多能干细胞接种至合适的培养底物上。在一个实施例中，合适的培养底物是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养底物是
Figure BDA00001803268000121
(Becton Dickenson)。
Figure BDA00001803268000122
是得自Engelbreth-HolmSwarm肿瘤细胞的可溶性制品，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持之理想特性的培养基的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述底物上。所有这些特性可得益于小心注意接种分布，并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可由下列组分制成，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)，Gibco货号11965-092；敲除达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Knockout Dulbecco′s modified Eagle′s medium，KO DMEM)，Gibco货号10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
从多能干细胞形成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞
在一个实施例中，本发明提供了由多能干细胞产生表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.使表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素。
多能干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的分化
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成，可通过在进行特定方案之前或之后检测所述标志物的存在来确定。多能干细胞一般表达极微量的此类标记物。因而，当多能细胞开始表达它们时即检测到多能细胞的分化。
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活蛋白A但不存在血清的培养基中培养，然后将所述细胞与激活蛋白A和血清一起培养，再然后将所述细胞与激活蛋白A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在NatureBiotechnology 23，1534-1541(2005)中进行了公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活蛋白A但不存在血清的培养基中培养，然后将所述细胞与激活蛋白A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2005中进行了公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活蛋白A和Wnt配体但不存在血清的培养基中培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与激活蛋白A和血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中进行了公开。
例如，通过按照被转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/736,908中公开的方法处理多能干细胞，可将多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，通过按照被转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/779,311中公开的方法处理多能干细胞，可将多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，通过按照美国专利申请系列号60/990,529中公开的方法处理多能干细胞，可将多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，通过按照美国专利申请系列号61/076,889中公开的方法处理多能干细胞，可将多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，通过按照美国专利申请系列号61/076,900中公开的方法处理多能干细胞，可将多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，通过按照美国专利申请系列号61/076,908中公开的方法处理多能干细胞，可将多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，通过按照美国专利申请系列号61/076,915中公开的方法处理多能干细胞，可将多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞向表达胰内胚层谱系特征性 标志物的细胞的分化
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞可以根据D’Amour等人，Nature Biotechnol.24：1392-1401，2006中公开的方法分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞共表达PDX1、NKX6.1，但是共表达极微量的CDX2和NGN3。
在一个实施例中，通过在补充有FGF7的第一培养基中培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后将所述细胞在补充有FGF7、一种能够抑制BMP的因子、TGFβ受体激动剂、视黄酸和hedgehog信号转导途径抑制剂的第二培养基中培养，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物并共表达PDX1、NKX6.1但共表达极微量的CDX2和NGN3的细胞。
在一个实施例中，FGF7可以按约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF7按50ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，能够抑制BMP的因子为成头蛋白。成头蛋白可以按约500ng/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，成头蛋白以100ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，TGFβ受体激动剂选自激活蛋白A、激活蛋白B、TGFβ-I、TGFβ-II、GDF-8和GDF-11。
激活蛋白A可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，激活蛋白A按20ng/ml的浓度使用。在一个另选的实施例中，激活蛋白A按50ng/ml的浓度使用。
激活蛋白B可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，激活蛋白B按20ng/ml的浓度使用。在一个另选的实施例中，激活蛋白B按50ng/ml的浓度使用。
TGFβ-I可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，TGFβ-I按20ng/ml的浓度使用。在一个另选的实施例中，TGFβ-I按50ng/ml的浓度使用。
TGFβ-II可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，TGFβ-II以20ng/ml的浓度使用。在一个另选的实施例中，TGFβ-II按50ng/ml的浓度使用。
GDF-8可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，GDF-8按20ng/ml的浓度使用。在一个另选的实施例中，GDF-8按50ng/ml的浓度使用。
GDF-11可以按约2ng/ml至100ng/ml的浓度使用。在一个实施例中，GDF-11按20ng/ml的浓度使用。在一个另选的实施例中，GDF-11按50ng/ml的浓度使用。
视黄酸可以按约1nM至约1mM的浓度使用。在一个实施例中，视黄酸按1μM的浓度使用。
在一个实施例中，hedgehog信号转导途径抑制剂为环巴胺-KAAD。环巴胺-KAAD可以按约0.025μM至约2.5μM的浓度使用。在一个实施例中，环巴胺-KAAD按0.25μM的浓度使用。
可通过将处理过的细胞群体暴露于能特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞所表达的蛋白质标志物的试剂(如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见，例如，Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人，编辑，2001增刊))以及免疫测定(例如切片材料的免疫组织化学分析)、Western印迹，对于在完整细胞中可接近(accessible)的标志物来说，有流式细胞术分析(FACS)(参见，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且多能干细胞的另外的特征继续得到鉴定。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种下列标志物的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60、Tra 1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群体暴露于能特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞所表达的蛋白质标志物(如CXCR4)来纯化分化的细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括(例如)人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)以及人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，瑞典)。表达下列多能细胞特征性标志物中的至少一种的细胞也适用于本发明：ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60和Tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4、CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞适用于本发明。在本发明的一个方面，表达定形内胚层系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
胰内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9和PROX1。表达至少一种胰内胚层谱系特征性标志物的细胞适用于本发明。在本发明的一个方面，表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞为胰内胚层细胞。
表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞向表达胰内分泌谱系标志物的 细胞的分化
在一个实施例中，使表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞共表达PDX1、NKX6.1，但是共表达极微量的CDX2和NGN3。
在一个实施例中，表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素。
在一个实施例中，通过在补充有能够抑制BMP的因子、TGFβ受体信号转导抑制剂和蛋白激酶C激活剂的培养基中培养表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，使表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素的细胞。
在一个实施例中，能够抑制BMP的因子为成头蛋白。成头蛋白可以按约500ng/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，成头蛋白以100ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，TGFβ受体信号转导抑制剂是ALK5的抑制剂。在一个实施例中，ALK5的抑制剂是ALK5抑制剂II。ALK5抑制剂II可以按约0.1μM至约10μM的浓度使用。在一个实施例中，ALK5抑制剂II按1μM的浓度使用。
在一个实施例中，蛋白激酶C激活剂选自(2S，5S)-(E，E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2，4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺、Indolactam V和佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯。在一个实施例中，蛋白激酶C激活剂是(2S，5S)-(E，E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2，4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺。(2S，5S)-(E，E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2，4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺可以按约20nM至约500nM的浓度使用。(2S，5S)-(E，E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2，4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺、Indolactam V和佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯在本文中称作“TPB”。
胰内分泌谱系特征性标志物选自NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、NKX2.2、PAX4和PAX6。在一个实施例中，表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，该方法包括培养多能干细胞，使多能干细胞在体外分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞，并且将表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞植入患者中。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病或有发展2型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，该方法包括培养多能干细胞，使多能干细胞在体外分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞，并且将表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞植入患者体内。
如果合适，可用有利于植入的细胞的存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步处理。这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多营养因子、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、胰高血糖素样肽-I(GLP-1)和高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体(mimetibody)、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂，例如美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可使多能干细胞在移植进接受者之前分化成胰岛素生成细胞。在一个具体的实施例中，在移植进接受者之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者中。可在该接受者中发生进一步分化。
可将定形内胚层细胞，或作为另一选择，胰内胚层细胞，或作为另一种选择，β细胞作为分散细胞进行移植，或可使这些细胞形成簇，而这些细胞簇可输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的作用。可将细胞移植进接受者中的合适部位内。植入部位包括(例如)肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入的细胞的进一步分化、存活或活性，可在给予细胞之前、之同时或之后给予额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，利用生长因子使所给予的细胞在体内分化。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所给予的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源给予的生长因子的任何组合来诱导植入的细胞进行分化。
移植中所用的细胞的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病或有发展糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞、使培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将细胞掺入三维支持物中。在移植进患者前，可使细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将容纳有细胞的支持物直接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入的细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构的形式的合成材料和天然材料，适用于实施本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成掺有药剂的支持物，可在形成支持物前将药剂与聚合物溶液混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载体的情况下进行。药剂可以液体、微细固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂添加至支持物以改变药剂的释放速率。在一个另选的实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物(例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物(例如在美国专利6,793,945中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物(例如在美国专利6,331,298中所公开的化合物)掺入支持物中。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多营养因子、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、胰高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、nodal、成头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、生腱蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有粘附性胞外基质蛋白(例如纤连蛋白和玻连蛋白)的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过简单地将细胞沉积在支架上来实现将本发明细胞掺入该支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1Pt 2)：3-9(1988))。已经开发了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶(spinner flask)用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。另一种用于细胞接种的方法是利用离心，这对接种的细胞产生的应力极小并增强接种效率。例如，Yang等人开发了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称作离心细胞固定法(CCI)。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例
实例1
表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达胰岛素和NKX6.1以及极微量 的胰高血糖素的细胞群体的形成
将人胚胎干细胞系H1的细胞在
Figure BDA00001803268000211
(1∶30稀释度)(BDBiosciences；目录号356231)包被的平皿上，用RPMI培养基(Invitrogen；目录号：22400)+0.2％FBS+100ng/ml激活蛋白A(PeproTech；目录号120-14)+20ng/ml WNT-3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)培养1日，随后用RPMI培养基+0.5％FBS+100ng/mL激活蛋白A再处理两日(阶段1)，随后，
a.用DMEM/F12(Invitrogen；目录号11330-032)+2％FBS+50ng/mlFGF7(PeproTech；目录号100-19)处理三日(阶段2)，随后
b.DMEM-高葡萄糖(Invitrogen；目录号10569)+1％B27+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD(Calbiochem；目录号239804)+100ng/ml成头蛋白(R&D Systems；目录号3344-NG)处理四日(阶段3)，随后
c.用DMEM-高葡萄糖+1％B27(Invitrogen；目录号0791)+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II(Axxora；目录号ALX-270-445)+500nM TBP((2S，5S)-(E，E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2，4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺)(Calbiochem；目录号565740)处理6日(阶段4)。
作为对照，将另外的细胞群体用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II处理六日(阶段4，对照组)。
如图1所示，在阶段4的TBP处理导致了表达胰岛素的细胞增加(图1小图a)。应当指出，约60％的这些表达胰岛素的细胞是单一表达内分泌激素的细胞，其中所述细胞表达胰岛素并且不表达胰高血糖素、促生长素抑制素和生长素释放肽(图1小图a和b；图5小图d和e)。还在接受TBP处理的培养物中发现表达胰高血糖素的细胞。大多数表达胰高血糖素的细胞也共表达胰岛素(图1小图a和b)。对于对照组，大部分细胞共表达胰岛素和胰高血糖素(图1小图c和d)。
在一个单独实验中，将人胚胎干细胞系H1的细胞在
Figure BDA00001803268000221
(1∶30稀释)包被的平皿上用RPMI培养基+0.2％FBS+100ng/mL激活蛋白A+20ng/mL WNT-3a培养1日，随后用RPMI培养基+0.5％FBS+100ng/mL激活蛋白A再处理两日(阶段1)，随后，
a.用DMEM/F12+2％FBS+50ng/ml FGF7处理三日(阶段2)，随后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白处理四日(阶段3)，随后
c.进行处理1：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+500nM TBP处理六日(阶段4，处理1)，或
d.进行处理2：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+100nM TBP处理六日(阶段4，处理2)，或
e.进行处理3：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+20nM TBP处理六日(阶段4，处理3)，或
f.进行处理4：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II处理六日(阶段4，处理4)。
用免疫细胞化学分析来评估不同浓度的TPB对本发明细胞的形成的影响。在500nM和100nM TPB处理组中都观察到单一表达胰岛素的细胞的数目显著增加(图2小图a和b)。FACS分析证实两种处理均在体外产生12％单一表达胰岛素的细胞，并且该细胞群体的15％还表达NKX6.1(表1-表达NKX6.1/INS的细胞占总细胞群体的2.4％)。在20nM TPB情况下，与对照组相似，大部分细胞共表达胰岛素和胰高血糖素(图2小图c和d)。
表1：胰内分泌谱系特征性标志物的表达，以占总细胞群体的百分比示 出
Figure BDA00001803268000231
为了进一步证实对表达内分泌激素的细胞的形成的影响是由蛋白激酶C的活化介导，将人胚胎干细胞系H1的单独细胞群体在
Figure BDA00001803268000232
(1∶30稀释)包被的平皿上用RPMI培养基+0.2％FBS+100ng/mL激活蛋白A+20ng/mL WNT-3a培养1日，随后用RPMI培养基+0.5％FBS+100ng/mL激活蛋白A在处理两日(阶段1)，随后，
a.用DMEM/F12+2％FBS+50ng/ml FGF7处理三日(阶段2)，随后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白处理四日(阶段3)，随后
c.进行处理5：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+500nM TBP处理六日(阶段4，处理5)，或
d.进行处理6：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂
Figure BDA00001803268000241
处理六日(阶段4，处理6)，或
e.进行处理7：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II处理(阶段4，处理7)，随后
f.用DMEM-高葡萄糖+1％B27处理四日(阶段5)。
Figure BDA00001803268000242
已知能选择性抑制Ca2+依赖性蛋白激酶C同工型。在单独接受TPB(图3，小图a)和接受TPB和(图3，小图b)的培养物中表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞的数目显著减少。FACS分析证实TPB处理(处理6)产生了30.6％表达突触小泡蛋白的细胞，12％单一表达胰岛素的细胞和4.6％表达胰高血糖素的细胞。另一方面，TBP和
Figure BDA00001803268000244
处理(处理7)产生了10.6％的表达突触小泡蛋白但没有表达可检测水平的单一胰岛素的细胞(表2)。在处理6和处理7之间观察到的细胞总数不存在差异。(参见图3，小图c和d，其示出DAPI染色，反映处理6和处理7中的总细胞数目)。这些结果表明，蛋白激酶C信号转导对于形成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞可能是重要的。
还试验了其他蛋白激酶C激活剂。它们是Indolactam V(ILV)(Axxora；目录号ALX-420-011-C300)和佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)(Calbiochem；目录号524400)。然而，仅TPB显示出形成单一表达胰岛素的细胞(图4，小图a)。500nM的ILV(图4，小图b)和PMA(图4，小图c)在六日后均产生了共表达胰岛素和胰高血糖素的细胞。FACS分析证实TPB处理产生了12％单一表达胰岛素的细胞和4.6％表达胰高血糖素的细胞，以及7.1％共表达胰岛素和胰高血糖素的细胞。另一方面，ILV处理产生了3％单一表达胰岛素的细胞和12％表达胰高血糖素的细胞以及12％共表达胰岛素和胰高血糖素的细胞(表2)。免疫细胞化学分析显示，在用TPB处理的培养物中，20％表达胰岛素的细胞共表达NKX6.1(图5小图a)和PDX1(图5的小图b)。大部分表达胰岛素的细胞共表达NEUROD，后者是一种内分泌标志物(图5小图c)非常少的表达胰岛素的细胞共表达促生长素抑制素或生长素释放肽(GHRL)(图5小图d和e)。
表2：胰内分泌谱系特征性标志物的表达，以占总细胞群体的百分比示 出
实例2
用于形成表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达胰岛素和NKX6.1以 及极微量的胰高血糖素的细胞群体的一种另选方法
在一个独立实验中，将人胚胎干细胞系H1的细胞在
Figure BDA00001803268000252
(1∶30稀释)包被的平皿上用RPMI培养基+0.2％FBS+100ng/mL激活蛋白A+20ng/mL WNT-3a培养1日，随后用RPMI培养基+0.5％FBS+100ng/mL激活蛋白A再处理两日(阶段1)，随后，
a.用DMEM/F12+2％FBS+50ng/ml FGF7处理三日(阶段2)，随后
b.进行处理8：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/mL FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+20ng/ml激活蛋白A+p38激酶抑制剂(在US6,214,830中公开，2.5μM)处理四日(阶段3，处理8)，或
c.进行处理9：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白处理四日(阶段3，处理9)，随后
d.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+500nM TPB处理六日(阶段4)。
阶段3，处理8导致了形成表达胰内胚层谱系特征性标志物并共表达PDX1和NKX6.1但不表达CDX2和NGN3的细胞群体。另一方面，阶段3，处理9导致了形成表达胰内胚层谱系特征性标志物并共表达PDX1、NKX6.1和NGN3的细胞群体。检查了蛋白激酶C激活剂处理对这些细胞群体的影响(上文的阶段4)。
进行了FACS分析以确定胰岛素单一阳性细胞、胰高血糖素单一阳性细胞、胰岛素/胰高血糖素双阳性细胞、表达NKX6.1阳性的细胞、胰岛素/NKX6.1阳性细胞和突触小泡蛋白(一种泛内分泌标记物)阳性细胞的百分比。
如表3中所示，处理8所形成的细胞群体产生了较大百分比的内分泌细胞，如突触小泡蛋白表达所表示：总细胞群体的49.7％表达了突触小泡蛋白。总细胞群体的27.8％是胰岛素单一阳性细胞。
另一方面，处理9所形成的细胞群体仅产生了25.7％表达突触小泡蛋白的细胞。总细胞群体的7.6％是单一表达胰岛素的细胞。在两种处理中没有观察到单一表达胰高血糖素的细胞的显著差异，并且表达胰高血糖素的细胞的百分比显著地低于表达胰岛素的细胞的百分比。
大量的表达胰岛素的细胞也共表达NKX6.1。在接受处理8的细胞群体中，总细胞群体的11％表达了胰岛素和NKX6.1。在接受处理9的细胞群体中，总细胞群体的2％表达了胰岛素和NKX6.1。
免疫荧光分析证实以上结果(图6)。与处理9相比，处理8导致了表达胰岛素的细胞增加(图6小图a和d)。大部分表达胰高血糖素的细胞是多激素性细胞(图6，小图a、b、d和e)。这些结果提示，处理8所产生的细胞群体(表达胰内胚层谱系特征性标志物并共表达PDX1和NKX6.1但不表达CDX2和NGN3的细胞)可以通过本发明的方法更有效地诱导，以变为成熟和有功能的表达胰岛素的细胞。
表3：胰内分泌谱系特征性标志物的表达，以占总细胞群体的百分比示 出
Figure BDA00001803268000261
实例3
用于形成表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达胰岛素和NKX6.1以 及极微量的胰高血糖素的细胞群体的另选方法
在另一个实验中，将人胚胎干细胞系H1的细胞在(1∶30稀释)包被的平皿上用RPMI培养基+0.2％FBS+100ng/mL激活蛋白A+20ng/mL WNT-3a培养1日，随后用RPMI培养基+0.5％FBS+100ng/mL激活蛋白A再处理两日(阶段1)，随后，
a.用DMEM/F12+2％FBS+50ng/ml FGF7处理三日(阶段2)，随后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/ml FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+20ng/ml激活蛋白A+激酶抑制剂(JNJ3026582，2.5μM)处理四日(阶段3)，随后
c.进行处理10：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+500nM TPB处理六日(阶段4，处理10)，或
d.进行处理11：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+500nM TPB处理九日(阶段4，处理11)，或
e.进行处理12：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+500nM TPB处理12日(阶段4，处理12)。
如表4中所示，当蛋白激酶C激活剂处理的持续时间延长至九日(处理11)或12日(处理12)时，没有观察到额外的益处。用处理10处理六日后，单一表达胰岛素的细胞占总细胞群体的27.8％。相反，在处理九日(处理11)后，表达胰岛素的细胞降至10％，并且在处理十二日(处理12)后进一步降至4％。并行地，共表达胰岛素和NKX6.1的细胞群体的总百分比也在延长处理后显著地降低。这些结果提示，用Noggin、Alk5抑制剂II和蛋白激酶C激活剂处理六日足以形成本发明的细胞。
表4：胰内分泌谱系特征性标志物的表达，以占总细胞群体的百分比示 出
Figure BDA00001803268000281
实例4
本发明细胞向重度联合免疫缺陷(SCID)-beige(Bg)小鼠
中的植入将人胚胎干细胞系H1的细胞在
Figure BDA00001803268000282
(1∶30稀释)包被的平皿上用RPMI培养基+0.2％FBS+100ng/mL激活蛋白A+20ng/mLWNT-3a培养1日，随后用RPMI培养基+0.5％FBS+100ng/mL激活蛋白A再处理两日(阶段1)，随后，
a.用DMEM/F12+2％FBS+50ng/ml FGF7处理三天(第2阶段)，然后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/ml FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+100ng/ml成头蛋白处理四日(阶段3)，随后
c.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+500nM TBP处理六日(阶段4)。
用1ml的玻璃吸管以机械方式刮取(score)第4阶段末的细胞，随后将其转移到非贴壁板进行培养过夜。收集所得到的细胞聚集物，并且将含有5百万个细胞的聚集物移植至免疫受损小鼠(SCID/Bg，动物代号47、48、49、50和51)的肾包膜中。参见图7。
在四周后，通过用葡萄糖注射动物以诱导胰岛素分泌，检验产生胰岛素的细胞在这些移植物中的功能。使动物禁食约15-20小时，此后以眶后方式抽取血样(给予葡萄糖前)。每只动物随后接受30％右旋糖溶液中的约3g/kg的葡萄糖腹膜内注射给药，并且在葡萄糖输注后约60分钟抽取血液。使用超灵敏人特异性C肽ELISA板(目录号80-CPTHU-E01，AlpcoDiagnostics，NH)，在小鼠血清中检测到循环中的人C肽。人C肽的检测表明从移植细胞产生了胰岛素分泌。
人C肽最早在移植后4周在动物血清中检测到，并随时间推移而增加。图7中汇总移植数据。在1个月结束时，我们能够在研究组中60％的动物中检测到响应葡萄糖给予而产生的人C肽(小于0.2ng/mL)。四周后，在四只小鼠的三只中葡萄糖刺激的人C肽血清水平增加5至10倍。在植入后12周，移植的小鼠中葡萄糖刺激的平均人c肽血清水平大于1mg/ml(n＝4)。
实例5
用于形成表达胰内胚层谱系特征性标志物并共表达PDX1和NKX6.1的 细胞群体的另选方法
简单地说，将人胚胎干细胞系H1的细胞在
Figure BDA00001803268000291
(1∶30稀释)包被的平皿上用补充有0.2％FBS、100ng/mL激活蛋白A和20ng/mL WNT-3a的RPMI培养基培养1日，随后用补充有0.5％FBS和100ng/mL激活蛋白A的RPMI培养基再处理两日(阶段1)，随后，
a.用DMEM/F12+2％FBS+50ng/ml FGF7处理三日(阶段2)，随后
b.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白处理四日(阶段3)，随后
c.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II+20nM PMA或100nM TPB或20nM佛波醇12，13-二丁酸酯(PDBu)(Calbiochem，目录号524390)处理6日(阶段4)。
作为对照，独立的细胞群体用补充有1％B27、100ng/m成头蛋白和1μM ALK5抑制剂II的DMEM-高葡萄糖处理六日(阶段4)。
在阶段4第6日对培养物取样一式二份，然后使用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)进行成像。每孔从100个视野获取图像，以补偿生物测定和后续染色过程中的任何细胞损失。使用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件，从每个孔获得总细胞数、表达PDX1的总细胞和表达NKX6.1的总细胞的测量值。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。将表达PDX1和NKX6.1蛋白的总细胞以占总细胞群体的百分比报道。如图8所示，与从对照处理获得的样品相比，在较低的有效浓度(大约20nM)下，在蛋白激酶C激活剂处理组中表达NKX6.1/PDX1的细胞群体急剧增加。截至阶段4的第6日，在接受蛋白激酶C激活剂或对照处理的细胞群体中，该群体的92％±4％表达了PDX1。在蛋白激酶C激活剂处理组中，75％±5％的表达PDX1的细胞表达了NKX6.1。然而，在仅用Noggin和TGF β受体抑制剂(对照)处理的群体中，仅58％±5％的表达PDX1的细胞表达了NKX6.1。在蛋白激酶C激活剂存在下，20％的表达NKX6.1的细胞为与增殖标记物EdU Imaging Kit，Invitrogen，目录号C10337)共阳性的。
本实例表明，蛋白激酶C激活剂可以与Noggin和TGF β受体抑制剂以相对较低的有效浓度(～20nM)组合使用，以促进Nkx6.1表达的上调并增加表达PDX1和NKX6.1的细胞的百分比。
实例6
用蛋白激酶C激活剂处理表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞
简单地说，将人胚胎干细胞系H1的细胞在
Figure BDA00001803268000302
(1∶30稀释)包被的平皿上用补充有0.2％FBS、100ng/mL激活蛋白A和20ng/mL WNT-3a的RPMI培养基培养1日，随后用补充有0.5％FBS和100ng/mL激活蛋白A的RPMI培养基再处理两日(阶段1)，随后，
a.用DMEM/F12+2％FBS+50ng/ml FGF7处理三日(阶段2)，随后
b.T1：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+FGF1050ng/mlL处理四日(阶段3，T1)或，
T2：用DMEM-高葡萄糖+1％B27+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+FGF1050ng/ml+100nM TPB处理四日(阶段3，T2)，随后
c.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μM ALK5抑制剂II处理六日(阶段4)。
如图9所示，与对照组(T1)相比，在用TPB(T2)处理的细胞中观察到胰内胚层标志物PDX1、NKX6.1和PTF1α的明显下调。通过免疫组织化学检测不到NKX6.1。这些数据表明，在阶段3的蛋白激酶激活剂处理没有促进共表达PDX1/NKX6.1的细胞的产生。
在本说明书通篇中引用的出版物以引用方式全文并入本文。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下恰当理解的权利要求书的限定。

Claims (7)

1. 表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞的群体，所述细胞共表达NKX6.1和胰岛素并且其中所述群体中小于10%的所述细胞表达胰高血糖素。
2. 根据权利要求1所述的细胞群体，其中至少30%的所述细胞表达NKX6.1。
3. 根据权利要求1所述的细胞群体，其中至少40%的所述细胞表达NKX6.1。
4. 根据权利要求1所述的细胞群体，其中至少50%的所述细胞表达NKX6.1。
5. 根据权利要求1所述的细胞群体，其中至少60%的所述细胞表达NKX6.1。
6. 根据权利要求1所述的细胞群体，其中至少5%的所述细胞表达胰岛素。
7. 一种产生表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞的群体的方法，所述细胞共表达NKX6.1和胰岛素并且其中所述群体中小于10%的所述细胞表达胰高血糖素，所述方法包括以下步骤：
a. 培养多能干细胞，
b. 使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c. 使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d. 通过在补充有能够抑制BMP的因子、TGFβ受体信号转导抑制剂和蛋白激酶C激活剂的培养基中培养所述表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，使所述表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素的细胞。
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