CN103079585A - 经设计的成骨蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对关联受体具有改变的亲和性的新型经设计的成骨蛋白、编码该蛋白的核酸序列、以及使用其的方法。更优选地,所述新型经设计的成骨蛋白是经设计的BMP并且对关联BMP受体具有改变的亲和性。所述经设计的BMP显示出改变了的生物学特征并提供了潜在的新的有效疗法。
Description
发明领域
本申请涉及成骨蛋白(osteogenic protein)的领域,制备经改善的成骨蛋白的方法,及利用成骨蛋白治疗患者的方法。
发明背景
胱氨酸结细胞因子超家族分成数个亚家族,包括转化生长因子β(TGFβ)蛋白、糖蛋白激素、血小板衍生生长因子样(PDGF样)蛋白、神经生长因子(NGF)、及成神经细胞瘤中的分化筛选选择基因畸变(DAN)家族(例如Cerberus)。其中TGFβ超家族包含大约43个成员,分成三个亚家族,包括:TGFβ、活化素及骨形态发生蛋白/生长分化因子蛋白(BMP/GDF)。
TGF-β超家族成员包含典型的胱氨酸结拓扑。也就是说,胱氨酸结是六个半胱氨酸残基的非寻常排列的结果。所述结是由半胱氨酸1-4、半胱氨酸2-5之间的键以及形成环的间插序列所组成,在半胱氨酸3-6之间的双硫键通过该环。这些蛋白质的活性形式是同型二聚体或异二聚体。在各种情况中,单体拓扑是由半胱氨酸结及额外的半胱氨酸稳定,导致额外的链内键及/或介导与另一蛋白单位的二聚化。见Kingsley,1994,Genes Dev.8:133-146;Lander et al,2001,Nature409:860-921。
BMP/GDF是TGF-β蛋白超家族中为数最多的成员。BMP/GDF超家族包括但不限于BMP2、BMP3(成骨素)、BMP3b(GDF-10)、BMP4(BMP2b)、BMP5、BMP6、BMP7(成骨蛋白-1或OP1)、BMP8(OP2)、BMP8B(OP3)、BMP9(GDF2)、BMP10、BMP11(GDF11)、BMP12(GDF7)、BMP13(GDF6、CDMP2)、BMP15(GDF9)、BMP16、GDF1、GDF3、GDF5(CDMP1、MP52)及GDF8(肌肉抑制素(myostatin))。BMP有时是指成骨蛋白(OP)、生长分化因子(GDF)、或软骨衍生性型态发生蛋白(CDMP)。BMP也存在于其他动物物种。另外,在人族群的不同成员之间可能存在一些BMP序列的等位基因差异。
天然表达的BMP是原蛋白质(pro-protein),其包含长的原结构域、一或多个切割位点及成熟结构域。此原蛋白质接着藉由细胞机制处理以产生二聚体的成熟BMP分子。该原结构域被认为有助于BMP的正确折迭及处理。另外,在一些但非所有的BMP中,该原结构域可能与该成熟结构域非共价结合,且可能作为伴护子,也可能作为抑制子(例如Thics et a1.,Growth Factors18:251-9(2001))。
BMP信号传导是当BMP二聚体与二个I型及二个II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合时被启动。I型受体包括但不限于ALK-1(Activinrcccptor-Likc Kinase1(活化素受体样激酶1))、ALK-2(亦称为ActRla或ActRI)、ALK-3(亦称为BMPRIa)及ALK-6(亦称为BMPRIb)。II型受体包括但不限于ActRIIa(亦称为ActRII)、ActRIIb及BMPRII。人基因组包含12个受体丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员,包括7个I型及5个II型受体,所有这些受体皆与TGF-β传讯有关(Manning eta1.,Science298:1912-34(2002),该文献的揭示内容以参照方式纳入本发明)。因此,由12个受体及43个超家族成员可知,至少某些TGF-β超家族成员与相同受体结合。在BMP结合之后,该II型受体使该I型受体磷酸化,该I型受体使转录因子的Smad家族的成员磷酸化,且使该Smad转位至细胞核并活化数种基因的表达。
BMP是TGF-β超家族中为数最多的成员,他们控制一组广泛的细胞性及发育性过程,诸如胚胎模式形成及组织特异化,亦能促进伤口愈合及成人组织的修复过程。BMP最初是藉由彼等诱导骨及软骨形成的能力而被分离。BMP传讯可在骨折及相关组织伤害时被诱导,以导致骨再生及修复。改变对BMP受体的亲和性的BMP分子将具有相较于该原始蛋白质改善的生物活性。这些BMP包括具有增加活体内活性的蛋白质,且可能提供用于(除其它者外)组织再生、修复、及类似者的潜能改善的治疗剂,其中藉由在较低的蛋白量下提供较高或经改变的活性,以提供改善的蛋白质治疗剂。
发明概述
本发明包括一种经设计的骨形态发生蛋白(BMP),其在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于对应的野生型BMP与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经政变的与该I型或II型BMP受体的结合。
在一方面中,该蛋白选自BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8或BMP9。
在另一方面中,该蛋白在II型结合结构域A、II型结合结构域B、I型结合结构域及上述结构域的任何组合内包含至少一种突变。
本发明亦提供一种经设计的成骨蛋白,其包含氨基酸序列,该氨基酸序列在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于野生型BMP2与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。
在一方面中,该突变在II型结合结构域A内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:1序列的V33、P36、H39和F41处的突变。
在另一方面中,该突变是在II型结合结构域A内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:1序列的V33、P36K、P36R、H39A和F41N的突变。
在又一方面中,该突变是在II型结合结构域B内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:1序列的E83、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99处的突变。
在另一其他方面中,该突变是在II型结合结构域B内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:1序列的E83K、S85N、M89V、L92F、E94D、E96S、K97N和V99I的突变。
在另一方面中,该突变是在I型结合结构域内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:1序列的H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77和V80处的突变。
在又一方面中,该突变是在I型结合结构域内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:1序列的H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P和V80A的突变。
在另一其他方面中,该蛋白包含对应于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77和V80的突变。
在另一方面中,该蛋白包含对应于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77和V80的突变,其中这些突变是H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P及V80A。
在又一方面中,该蛋白包含对应于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99处的突变。
在另一方面中,该蛋白包含对应于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99处的突变,其中这些突变是V33I、P36K、H39A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N及V99I。
在另一其他方面中,该蛋白包含对应于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77、V80、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99的突变。
在又一方面中,该蛋白包含对应于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77、V80、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99的突变,其中这些突变是V33I、P36K、H39A、H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P、V80A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N及V99I。
在又一方面中,该蛋白包含对应于SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77、V80、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99的突变,其中这些突变是V33I、P36R、H39A、H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P、V80A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N及V99I。
在另一方面中,该蛋白以不超过约2nM的KD与ALK2受体结合,以不超过约2nM的KD与ALK3受体结合,以不超过约1nM的KD与ALK6受体结合,以不超过约2nM的KD与ActRIIA受体结合,以不超过约0.5nM的KD与ActRIIB受体结合,且以不超过约3.5nM的KD与BMPRIIA受体结合。
在一方面中,该蛋白另包含不位于该I型或II型结合区内的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。
本发明包括一种经设计的成骨蛋白,其包含对应于SEQ ID NO:8至73中任一者的氨基酸序列。
本发明包括一种经设计的成骨蛋白,其包含对应于SEQ IDNO:12的氨基酸序列。
本发明包括一种经设计的成骨蛋白,其包含对应于SEQ IDNO:14的氨基酸序列。
本发明包括一种经设计的成骨蛋白,其包含对应于SEQ IDNO:36的氨基酸序列。
本发明包括一种经设计的成骨蛋白,其包含对应于SEQ IDNO:37的氨基酸序列。
本发明包括一种生产经设计的BMP蛋白的方法,该BMP蛋白在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于对应的野生型BMP与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。该方法包括将编码该蛋白的核酸导入宿主细胞中、在生产该蛋白的条件下培养该细胞及纯化该蛋白。
在一方面中,该核酸包含选自SEQ ID NO:74至139中任一者的核酸序列的序列。
本发明包括一种经设计的BMP6蛋白,其包含氨基酸序列,该氨基酸序列在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于野生型BMP6与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。
在一方面中,该突变是在II型结合结构域A内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:4序列的I57、K60、G61、A63、N65、Y66和D68处的突变。
在另一方面中,该突变是在II型结合结构域B内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:4序列的K108、N110、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123和I124处的突变。
在又一方面中,该突变是在I型结合结构域内的突变,其中该突变是至少一种选自对应于SEQ ID NO:4序列的S72、N76、A77、H78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99和P100处的突变。
在另一方面中,该突变是对应于SEQ ID NO:4序列的各氨基酸残基I57、K60、G61、A63、N65、Y66和D68处的突变。
在另一其他方面中,该突变是氨基酸序列对应于SEQ ID NO:4的各氨基酸残基K108、N110、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123和I124处的突变。
在又一方面中,该突变是对应于氨基酸序列SEQ ID NO:4的各氨基酸残基S72、N76、A77、H78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99和P100处的突变。
在另一方面中,该经设计的BMP6蛋白包含氨基酸序列,该氨基酸序列在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于野生型BMP6与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合,该BMP6蛋白另包含不位于该I型或II型结合结构域内的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。
本发明包括一种经分离的核酸分子,其包含编码选自SEQ IDNO:8至73的序列的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一方面中,该核酸编码包含氨基酸序列的蛋白,该氨基酸序列选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的序列、本发明包括一种经分离的核酸分子,其包含编码选自SEQ IDNO:74至139的核苷酸序列。
在一方面中,该核酸包含选自SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103的核苷酸序列。
本发明包括一种生产经设计的BMP6蛋白的方法,该BMP6蛋白包含氨基酸序列,该氨基酸序列在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于野生型BMP6与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。
该方法包括将编码该蛋白的核酸导入宿主细胞中、在生产该蛋白的条件下培养该细胞及纯化该蛋白。
本发明包括一种在有治疗需要的患者中治疗骨流失相关性骨疾病的方法。该方法包括投予治疗有效量的经设计的BMP蛋白至患者藉以治疗该患者的骨疾病,该BMP蛋白在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于对应的野生型BMP蛋白与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。
本发明包括一种在有治疗需要的患者中治疗纤维化的方法。该方法包括投予治疗有效量的经设计的BMP蛋白至患者藉以治疗纤维化,该BMP蛋白在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于对应的野生型BMP与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。
本发明包括一种诱导组织中的骨形成的方法。该方法包括使该组织与经设计的BMP蛋白接触藉以诱导在该组织中的骨形成,该BMP蛋白在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于对应的野生型BMP与该I型或II型受体的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。
附图简述
为了说明本发明的目的,在图式中描绘本发明的某些实施方案。然而,本发明并不限于在图式中所描绘的实施方案的精确安排及仪器设备。
图1(包含A至C图)显示各种野生型及经设计的BMP氨基酸序列的排比,并显示(以方框框起)这些蛋白中可能与I型及II型受体交互作用有关的区域。图1A显示野生型BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8及BMP9的氨基酸序列排比。图1B显示各种经设计的BMP的氨基酸序列排比,其中该对应的野生型BMP是BMP2。图1C显示各种经设计的BMP6分子的氨基酸序列排比,其中该对应的野生型BMP是BMP6。
图2以结构模型显示与二个I型及二个II型BMP受体结合的野生型BMP2同型二聚体。
图3(包含A及B图)以结构模型显示在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(图3A)及大肠杆菌(E.coli)细胞(图3B)中生产的人BMP2的组氨酸门挡(doorstop)(H54)的位置。
图4(包含A及B图)说明聚糖系链基的位置及潜在的组氨酸(His)门挡。图4A显示皆在CHO生产的BMP2中的呈非门挡方向的聚糖系链基(在N56处的N-连接聚糖)及组氨酸54,以及该聚糖系链基与R16的交互作用。图4B显示在BMP6中的聚糖系链基(在N80处的N-连接聚糖)及H78处的非门挡构型的组氨酸,以及对应BMP2中的R16的R39。
图片上方是BMP2(11-KSSCKRHP)与BMP6(35-KTACRKHE)的序列排比,其显示BMP2与BMP6之间的对应氨基酸。
图5(包含A至D图)显示在纯化BMP及经设计的BMP的过程中的各种步骤。图5A的层析图显示使用ccllufine硫酸酯管柱的BMP的梯度洗脱液。图5B为含有来自ccllufinc硫酸酯管柱步骤的样本组分的考马斯(Coomassic)染色SDS-PAGE(左侧为非还原,右侧为还原)胶体。图5C的层析图显示来自制备型逆向纯化步骤的特性。图5D为藉由制备型逆相纯化步骤获得的含有BMP样本组分的考马斯(Coomassie)染色SDS-PAGE(左侧为非还原,右侧为还原)胶体。
图6(包含A至D图)显示经考马斯染色的SDS-PAGE蛋白胶体,其中包含经纯化的BMP2野生型及各种如各胶体图片上方所示的突变。这些胶体是于非还原(图6A及6B)及还原(图6C及6D)条件下进行分析。
图7显示在C2C12肌原母细胞中的碱性磷酸酶分析结果,其比较野生型BMP2及BMP2/6异二聚体与各种如图例所示的经设计的BMP的成骨活性。
图8显示表示Smad活性的C2C12BMP-反应元件萤光素酶(BRE-萤光素酶)分析的结果,其显示BMPE相较于BMP2具有更强的传讯及相当于BMP2/6的传讯。
图9(包含A及B图)显示由各种BMP媒介的异位骨形成。图9A显示异位骨的量(计算为羟磷灰石的毫克数;mg HA),其是由肛CT分析测定经植入所示剂量(0.1或0.5μg)的所示BMP(BMP2、BMPE、及BMP2/6)的各只肢体。图9B显示异位骨的量(计算为泾磷灰石的毫克数)、其是由μCT分析测定经植入所示剂量(0.1或0.5μg)的所示BMP(BMP2、BMPG、BMPA及BMPF)的各只肢体。呈现的资料是来自2个分开的实验。
图10(包含A至D图)是放射影像,其显示在4及8周的非人灵长动物(NHP)的腓骨切除模型的结果。放射影像显示7只代表性NHP的腓骨,这些动物分别接受0.5mg/ml(250μg总递送BMP/肢体)的BMPE及BMPGo每只NHP在对侧肢体接受相同剂量的WTBMP2。图10A及10B分别显示各图上方标明的NHP于4周及8周的放射影像,该影像显示BMPE相较于BMP2野生型的效应。图10C及10D分别显示各图上方标明的NHP于4周及8周的放射影像,该影像显示BMPG相较于BMP2野生型的效应。
图11显示BMP-E治疗肢与BMP-2治疗的对侧肢的骨体积比较。
图12显示于C2C12肌原母细胞中的碱性磷酸酶测试结果,其比较野生型BMP2及BMP-GER、BMP-GEP、及BMP2/6异二聚体的成骨活性。
图13显示异位骨的量(计算为羟磷灰石的毫克数),其是由扯CT分析测定经植入所示剂量(0.05或0.25μg)的所示BMP(BMP2、BMP2/6、BMP-E、BMP-GER及BMP-6)的各只肢体。
图14显示异位骨的量(计算为羟磷灰石的毫克数),其是由肚CT分析测定经植入所示剂量(o0.05或0.25μg)的所示BMP(BMP2、BMP2/6、BMP-E、BMP-GER及BMP-6)的各只肢体。这些结果来自与图13所示者分开的实验。
图15(包含A及B图)是放射影像及漫CT影像,其显示在5及10周的非人灵长动物(NHP)的腓骨楔形骨切除模型的结果。图15A显示得自NHP腓骨楔形骨切除模型的5周放射影像。图15A显示4只代表性NHP的腓骨影像,这些NHP的-肢体在5周接受0.5mg/ml(250μG总BMP递送/肢)的BMP-GER,对侧肢体接受WTBMP-2。图15B显示相同肢体在10周的uCT影像,其显示每只动物的BMP-GER治疗肢相较于BMP2治疗对侧肢具有大型骨痂。
图16(包含A至C图)说明比较BMP-GER治疗肢与BMP-2治疗对侧肢的强度(图16A)、硬度(图16B)及骨痂体积(图16C)。
图17(包含A至C图)显示3只非人灵长动物(NHP)经0.5mg/ml的BMP-GER治疗的腓骨随时间愈合的放射影像,对侧肢以1.5mg/ml的BMP-2治疗,在楔形缺损模型后使用磷酸钙基底骨水泥作为载剂。图17A(上图)显示1号NHP的左臂经0.5mg/ml GER治疗的下列结果:第1及2图分别显示在刚开始时间点的LAT(侧面)及AP(前后)影像:第3及4图分别显示在2周的LAT及AP影像;第5及6图分别显示在4周的LAT及AP影像;第7及8图分别显示在6周的LAT及AP影像;第9及10图分别显示在7周的LAT及AP影像;第11及12图分别显示在8周的LAT及AP影像:图17A(下图)显示1号NHP的右臂经1.5mg/ml BMP-2治疗的下列结果:第1及2图分别显示在刚开始时间点的LAT(侧面)及AP(前后)影像;第3及4图分别显示在2周的LAT及AP影像;第5及6图分别显示在4周的LAT及AP影像;第7及8图分别显示在6周的LAT及AP影像;第9及10图分别显示在7周的LAT及AP影像;第11及12图分别显示在8周的LAT及AP影像;图l7B显示2号NHP的结果,其说明如图17A中的1号NHP;及图17C显示3号NHP的结果,其说明如图17A中的1号NHP。
图18是结构模型图,其显示BMP-E及BMP-6WT晶体结构的代表图及比较。强调所解出的聚糖长度的差异,显示被解出的BMPE的聚糖是远长于BMP6所被解出者。这表示该BMPE聚糖相较于BMP6聚糖是更具有构型限制性,因此可在此模型中显像(rendcrcd)较多的聚糖。BMPE及BMP6二者的组氨酸门挡残基是呈现类似的非门挡构型。同样地,稳定该BMPE聚糖的精氨酸聚糖“系链”是以虚线表示,虚线代表该精氨酸与该聚糖的交互作用。
图19是图18所示的BMPE及BMP6的组氨酸门挡及精氨酸系链比较的放大图。此图显示BMPE的H54组氨酸残基与BMP6的相等组氨酸的类似构型,二者皆位于非门挡位置。此图亦显示该R16系链(经由该BMPE聚糖的交互作用)使该聚糖更为坚固因此由该模型提供更多细节,相较于BMP6的较为“松散”及较无限制的聚糖使较少的BMP6聚糖可见于此模型。此模型图亦显示呈现聚糖的N-连接的BMPE的天冬酰胺N56的类似位置,及在相等及类似位置的BMP6的天冬酰胺。该图亦说明BMPE E110的潜在的额外聚糖系链交互作用,由在该氨基酸残基与该聚糖远端之间的虚线表示。所解出的聚糖长度的差异是经强调,其显示相较于具有淡色阴影的BMPE的较长聚糖显像,较少的深色BMP6聚糖可被解出,这表示该BMPE聚糖是较为构型约束,因此在结构分析时显示较多细节。
图20显示使用C2C12肌原母细胞的碱性磷酸酶分析结果,比较BMP-2、BMPE及BMP-6与彼等的经Endo-H处理的去糖基化(Dcgly.)对应物的成骨活性。
图21说明显示BMPE的结构模型,其显示在R16处的聚糖系链基的位置,并显示在该精氨酸(R16)与谷氨酸(E110,对应BMP2的E109)残基之间的稳定交互作用。该图显示R16及E110二者皆与该第三(β-甘露糖)及第四(α-甘露糖)聚糖基团形成多重氢键。该图亦显示H54潜在“门挡”的位置及提供该聚糖的N-连接位点的天冬酰胺56(N56)。
图22显示使用C2C12肌原母细胞的碱性磷酸酶分析结果,该分析比较BMP-E与BMP-E-NR及BMP-GER与BMP-GER-NR在增加剂量的Noggin(BMP-2的天然抑制剂)存在时的成骨活性。该资料显示包含衍生自活化素的序列的BMP-GER-NR并不会受到即使高浓度的Noggin的抑制,但是BMP-GER对于Noggin的抑制敏感。因此,添加衍生自活化素的序列使BMP-GER变成具有Noggin抗性(NR)、这些结果显示至少在此活体外试验中,对Noggin具敏感性的BMP-GER及BMP正在经衍生自活化素的序列取代该蛋白的C端区域后变成具有Noggin抗性(NR)。
图23显示由免疫组织化学(IHC)测定的经特定剂量的所示BMP处理的大鼠异位植入物的骨得分。该资料显示当BMP.GER的C端序列被衍生自活化素的序列取代时(NR),该分子的骨形成活性是经大幅减低。因此,该资料显示BMP-GER-NR在活体内的活性远低于BMP-GER。
图24显示由免疫组织化学(IHC)测定的经特定剂量的所示BMP处理的大鼠异位植入物的骨得分。该资料显示当BMP-E的C端序列被衍生自活化素的序列取代时(NR),该分子的骨形成活性是经大幅减低,事实上该活性完全消失。
发明详述
本发明关于“经设计的”骨形态发生蛋白,在本文称为“经设计的BMP”、“经设计的成骨蛋白”及“经设计的蛋白”。本发明的经设计的BMP可能对应野生型未经修饰的BMP的氨基酸序列,诸如但不限于BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8及BMP9。在特定实施方案中,该经设计的BMP当与彼的对应野生型BMP比较时显示经改变的与I型及/或II型BMP受体的结合。在其他实施方案中,该经设计的BMP当与彼的对应BMP比较时可能经修饰以具有经改变的半衰期、免疫原性或任何药物动力学/药物药效学(PK/PD)参数。
定义
除非本文另外加以定义,关于本发明所使用的科学性及技术性用语应具有该领域的一般技术人员所通常了解的意义、另外,除非内文另外要求,单数用语应包括复数意义且复数用语应包括单数意义。一般来说,与本文所描述的细胞培养、组织培养.分子生物学、免疫学、微生物学、基因学以及蛋白质及核酸化学和杂交有关所使用的命名法及技术是该领域所广为周知且经常使用者。
本发明的方法及技术通常根据该领域所广为周知的方法进行,除非另外说明否则如同本说明书各处引述及讨论的各种一般性及更具体的参考文献所述。这些参照文献包括例如Sambrook and Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)、Ausubel et a1.,Current Protocols inMolecular Biology,John wiley&Sons,NY(2002)、及Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Co1d Spring Harbor,NY(1990),彼等以参照方式纳入本发明。酶反应及纯化技术是根据制造商说明书,以该领域经常完成或本文所描述的方式进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学、医学及制药化学有关所使用的命名和实验室方法及技术是该领域所广为周知且经常使用者。标准技术是用于化学合成、化学分析、医药制备、医药调制、医药递送及患者治疗。
如在本发明的使用,下列用语各具有与在本节中相关的意义。
冠词“a”及“an”在本文被用来指称一或超过一个(即至少一个)该冠词的文法对象。举例来说,“一元件”是指一个元件或超过一个元件。
在此申请案中,“或”的使用代表“及/或”、除非另外说明。
习用标记在本文是用来描述多肽序列:多肽序列的左手端是氨基端;多肽序列的右手端是羧基端。本发明所使用的该20种习用的氨基酸及彼等的缩写遵照习惯用法。见Immuno]ogy--A Synthesis(2ndEdition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))、其以参照方式纳入本文。本发明所使用的氨基酸是以彼等的全名、对应彼等的三字母代码或对应彼等的一字母代码表示,如下所示:
“保守性氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被另一具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的氨基酸残基取代的取代。通常,保守性氨基酸取代将不会显著改变蛋白质的功能特性。当二或多个氨基酸序列彼此之间具有保守性取代的差异时,该序列一致性百分比或类似程度可能向上调整以校正该取代的保守特性。进行此调整的方法是本领域技术人员所广为周知。见例如Pcarson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。
具有类似化学性质的侧链的氨基酸类别实例包括:1)脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸;2)脂肪族泾基侧链:丝氨酸及苏氨酸;3)含酰胺侧链:天冬酰胺及谷氨酰胺;4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸;5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸及组氨酸;6)酸性侧链:天冬氨酸及谷氨酸;及7)含硫侧链:半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代类别包括缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、及天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者,保守性取代是在Gonnct et a1.,Science256:1443-1445(1992)(以参照方式纳入本发明)所揭示的PAM250对数概似矩阵具有正值的任何改变。“中度保守性”取代是在PAM250对数概似炬阵中具有非负值的任何改变。
优选的氨基酸取代是这些:(1)减少对蛋白水解易感性的取代、(2)减少对氧化易感性的取代.(3)改变结合亲和性以形成蛋白质复合体的取代,及(4)赋予或修饰该类似物的其他物理化学或功能特性的取代。包含取代、删除及/或插入的类似物可包括除特定肽序列以外的序列的各种突变蛋白。举例来说,单一或多重氨基酸取代(优选地保守性氨基酸取代)可在该特定序列中发生(优选地在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分,例如在CDR或I型或II型受体结合部位以外),保守性氨基酸取代不应实质改变该母体序列的结构特征(例如取代氨基酸不应倾向破坏发生在母体序列中的螺旋,或破坏其他类型的二级结构,该二级结构为该母体序列的特征)该领域公认的多肽二级和三级结构的实例是描述于Protcins,Structurcs and MolecularPrinciples(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,NewYork(1984))、Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))、及Thornton et a1.,Nature354:105(1991),这些文献各以参照方式纳入本发明。
用语“多肽”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”及“寡核苷酸”是指在DNA及RNA中的一是列核苷碱基(亦称为“核苷酸”)、且代表任何二或多个核苷酸的链。这些多核苷酸可为单股或双股的嵌台性混合物或衍生物或彼等的经修饰的版本。寡核苷酸可在碱基、糖基、或磷酸主链处被修饰,以增进例如该分子的稳定性、彼的杂交参数等。核苷酸序列通常携带基因资讯,包括由细胞机制使用以制造蛋白质及酶的资讯。这些用语包括双股或单股基因组及cDNA、RNA、任何合成性及经基因操作的多核苷酸,包括同义及反义多核苷酸二者。此亦包括含有经修饰的碱基的核酸,例如硫基尿嘧啶、硫基鸟嘌昤、或氟基尿嘧啶,或含有碳水化合物或脂质的核酸。
在核苷酸序列的上下文中,用语“实质上一致”是用于本文以指称第一核酸序列包含足够或最少数量的与第二核酸序列中经排比的核苷酸一致的核苷酸,以使该第一及第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽,或编码共同结构多肽结构域或共同功能性多肽活性。举例来说,核苷酸序列与参照序列具有至少约85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性。
“经设计的BMP核酸”及本文的文法相等用语是指编码经设计的BMP的核酸。
用语“蛋白质”及“多肽”在本文可互相交换使用。这些用语是指经由肽键连在一起的氨基酸序列链。这些用语包括一或多种作为离散单位的蛋白质。若单一多肽是离散功能单位且不需要与其他乡肽永远或暂时性地物理相连以形成该离散功能单位,这些用语“多肽”及“蛋白质”可被交换使用。若该离散功能单位是由物理互相相连的多重多肽组成,本文所使用之用语“蛋白质”是指该经物理耦合且一起作为该离散单位的多重多肽、根据本发明所表达的蛋白质可为蛋白质治疗剂。蛋白质治疗剂是对于其所作用的身体区域或对于其经由中间物远端作用的身体区域具有生物功能的蛋白质。蛋白质治疗剂的实例将于下更详细地讨论。
本发明所使用之用语“经设计的BMP”是关于相较于不合突变的对应野生型BMP包含至少一种氨基酸突变的BMP蛋白,其中该经设计的BMP对于至少一个I型受体及/或至少一个II型受体的结合相较于该对应野生型BMP对于该I型及/或II型受体的结合具有可侦测的改变。
“对应的野生型蛋白质”是指该经设计的BMP在导入任何突变之前的野生型版本。举例来说,若该经设计的BMP是经设计的BMP2,该对应的野生型BMP是野生型BMP2。因此,在一实施方案中,经设计的BMP的设计可(但不需要)始于野生型BMP序列,其中突变(例如氨基酸取代、删除及/或插入)被导入该野生型序列中。因此,该经设计的BMP可对应野生型BMP,且这些突变的位置可被称为例如对应、相对于及/或各自关于该野生型对应或“参照/BMP序列的氨基酸序列。
本发明的蛋白质包括本文所描述的多肽的片段、衍生物、类似物或变体及彼等的任何组合。当“片段”、“变体”、“衍生物”及“类似物”是指本发明的蛋白质时,这些用语包括保留其所源自的蛋白质的至少一些功能特性的任何蛋白质。
本发明所使用之用语“片段”是指多肽且被定义为给定多肽的任何离散部分,其对于该给定多肽为独特或具特征性。本文所使用的该用语亦指给定多肽的任何离散部分,其保留该全长多肽的至少一部分的活性。在某些实施方案中,该经保留的活性部分是该全长多肽的活性的至少10%。在某些实施方案中,该经保留的活性部分是该全长多肽的活性的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些实施方案中,该经保留的活性部分是该全长多肽的活性的至少95%、96%、97%、98%或99%。在某些实施方案中,该经保留的活性部分是该全长多肽的活性的至少100%或100%以上。另外或额外地,本文所使用的该用语亦指给定多肽的任何部分,其包括在该全长多肽中发现的至少已建立的序列元件。在一些实施方案中,该序列元件包括该全长多肽的至少约4至5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多氨基酸。本发明的蛋白质的片段包括蛋白水解片段以及删除片段。
本发明的蛋白质的变体包括如上述的片段,亦包括具有因为氨基酸取代、删除或插入而经改变的氨基酸序列的多肽。变体可天然发生或非天然地发生。非天然发生的变体可利用该领域已知的突变形成技术制备。变体蛋白质可包含保守性或非保守性氨基酸取代、删除或添加。
本发明的蛋白质包括具有藉由侧功能基的反应而化学衍生的一或多个残基的蛋白质。本发明的蛋白质亦包括包含该二十种标准氨基酸的一或多个天然发生的氨基酸衍生物的多肽。举例来说,4-羟基脯氨酸可能取代脯氨酸,5-羟基赖氨酸可能取代赖氨酸,3-甲基组氨酸可能取代组氨酸,同丝氨酸可能取代丝氨酸,及鸟氨酸可能取代赖氨酸。
本发明所使用的“重组表达的多肽”及“重组多肽”是指由经操纵以表达该多肽的宿主细胞所表达的多肽。在某些实施方案中,该宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中,此操纵可包含一或多种基因修饰。举例来说,该宿主细胞可能藉由导入一或多种编码该所欲表达的多肽的异源性基因加以基因修饰。该异源性重组表达的多肽可与在该宿主细胞中正常表达的多肽相同或类似。该异源性重组表达的多肽亦可为该宿主细胞的外来物,例如与该宿主细胞中正常表达的多肽异源。在某些实施方案中,该异源性重组表达的多肽是嵌合的,举例来说,多肽的部分可包含与该宿主细胞中正常表达的多肽相同或类似的氨基酸序列,然而其他部分包含对该宿主细胞为外来物的氨基酸序列。额外或另外地,多肽可包含来自二或多个正常皆在该宿主细胞中表达的不同多肽的氨基酸序列。另外,多肽可包含来自二或多个皆属对该宿主细胞为外来物的多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中,该宿主细胞是藉由活化或上调一或多种内源性基因加以基因修饰。
序列间的同源性或序列一致性(这些用语在本文可交换使用)的计算是如下进行。为了测定二个氨基酸序列或二个核酸序列的一致性百分比,这些序列是经排比以达最佳比较的目的(例如缺口可被导入第一及第二氨基酸或核酸序列中的一或二者以最佳扫L比及非同源性序列可被忽略以供比较的目的)。在典型的实施方案中,经排比以供比较目的的参照序列的长度是该参照序列的长度的至少30%、至少40%、至少50%或60%、或至少70%、80%、90%、或100%。接着比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被和第二序列中的对应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时,则这些分子在该位置是一致(在本文所使用的氨基酸或核酸“一致性”是等于氨基酸或核酸“同源性”)。
为了测定二个氨基酸序列或二个核酸的一致性百分比,这些序列是经排比以达最佳比较的目的(例如缺口可被导入第一氨基酸或核酸序列的序列中以用于与第二氨基酸或核酸序列最佳排比)、该二个序列之间的一致性百分比取决于这些序列所共享的一致位置的数目(即同源性百分比、一致位置数目/位置总数x100)。测定二个序列之间的同源性百分比可利用数学演算法完成。被用于比较二个序列的数学演算法的优选、非限制性实例是Karlin et a1.,Proc Natl Acad Sci U S A87:2264-8(1990)的演算法,其在Karlin et al.,Proc Natl Acad Sci U SA90:5873-7(1993)中经过修饰。该演算法被加入Altschul et a1.,J MolBiol215:403-10(1990)的NBLAST及XBLAST程式中。BLAST核苷酸搜寻可利用NBLAST程式进行,得分(score)=100,字长(wordlcngth)=12。
BLAST蛋白质搜寻可利用XBLAST程式进行,得分(scorc)=50,字长(wordlcngth)=3。为了获得带缺口的排比以供比较目的,GappcdBLAST可如Altschul et a1.,Nucleic Acids Res25:3389-402(1997)中所述被使用。当利用BLAST及Gappcd BLAST程式时,个别程式(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数可被使用。
该二个序列之间的一致性百分比是取决于这些序列共享的一致位置的数量,并考虑缺口的数量及各缺口的长度,这些需要被导入以供该二个序列的最佳排比。
序列的比较及二个序列之间的一致性百分比的测定可利用数学演算法完成。在一实施方案中,二个氨基酸序列之间的一致性百分比是利用尼德曼-文施(Nccdlcman-wunsch)演算法测定(Nccdlcman et al.,J Mo1Biol48:443-53(1970)),该演算法被纳入GCG套装软体(可得自gcg.com网站)的GAP程式中,使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵,及16、14、12、10、8、6、或4的缺口加权及1、2、3、4、5、或6的长度加权。在另一实施方案中,二个核苷酸序列之间的一致性百分比是利用GCG套装软体(可得自网站gcg.com)中的GAP程式测定,使用NwSgapdna.CMP矩阵及40、50、60、70、或80的缺口加权及l、2、3、4、5、或6的长度加权。一组典型参数(且应被使用除非另外说明)是Blossum62计分矩阵,其缺口罚分为12,缺口延伸罚分4,及读框移位缺口罚分5。
二个氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比可利用E.Mycrs及W.Miller的演算法测定(Mycrs et a1.,Comput Appl Biosci4:11-7(1988)),该演算法被纳入ALIGN程式(2.0版)中,其使用PAM120加权残基表,缺口长度罚分为12及缺口罚分为4。
当用语“说明材料”用于本发明时,其包括公开资料、纪录、图示.或任何其他可被用于沟通本发明的化合物、组合及/或组成物于该试剂盒中用于影响、缓和或治疗本文所述的各种疾病或病症之用途的表达介质。可任意选择地或另外地,该说明材料可描述一或多种缓和在细胞、组织或哺乳动物中的疾病或病状的方法,包括本发明他处所揭示者。
该试剂盒的说明材料(举例来说)可被固定在包含本发明的化合物及/或组成物的容器上或与包含该化合物及/或组成物的容器一起运送。另外,该说明材料可与该容器分开运送,其意图是使接受者配合使用该说明材料及该化合物。
除非另外提及,用语“患者”或“个体”可交换使用,且是指哺乳动物诸如人患者及非人灵长动物,以及兽医对象诸如兔、大鼠及小鼠及其他动物。优选地,患者是指人。
用语“有效量”或“治疗有效量”在本文可交换使用,是指当投予至组织或哺乳动物(优选地人)时,相较于在无该化合物存在时所侦测到的反应,媒介可侦测的治疗反应的量。治疗反应(诸如但不限于抑制及/或减少纤维化、增加骨质量或骨密度、及类似者)可被轻易地利用该领域已知的许多方法评估,包括诸如本发明所揭示的方法。
本领域技术人员将了解本发明所投予的化合物或组成物主有效量不同,该有效量可轻易地根据多种因素决定,诸如将被治疗的疾病或状况、疾病的分期、将被治疗的哺乳动物的年龄、健康状况及身体状况、该疾病的严重性、将被投予的特定化合物及类似因素。
本发明所使用的“治疗”是指减少患者所经历的疾病症状(例如骨密度降低、骨折、纤维化及类似者)的频率。该用语包括投予本发明的化合物或剂以防止或延迟疾病的症状、并发症或生化征象的发生、缓和该症状或停止或抑制该疾病、状况或病状的进一步发展。治疗可能为预防性(以防止或延迟该疾病的发生,或防止彼等的临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或缓和该疾病表现后的症状。
本发明所使用之用语“特异性结合”是指辨识特定分子并与的结合的化合物(例如蛋白质、核酸、抗体及类似物),但该化合物实质上不辨识样本中的其他分子或与该其他分子结合。举例来说,BMP蛋白、抗体或肽抑制物辨识样本中的同源受体(例如BMPI型或II型受体、与彼的同源抗原结合的抗体及类似物)并与的结合,但实质上不辨识该样本中的其他分子或与该其他分子结合。因此,在指定分析条件下,该特定结合基团(例如BMP或彼的受体结合片段)优先地与特定标靶分子结合且不与存在于测试样本中的其他成份以显著量结合。各种分析格式可被使用以选择与感兴趣的分子特异性结合的抗体。举例来说,固相ELISA免疫分析、免疫沉淀、BIAcorc、FACS、Octet及西方墨点试验是可被用于识别与BMP受体特异性反应的BMP的多种分析。通常,特异性或选择性反应将至少为背景信号或噪音的两倍,更佳地至少超过背景信号或噪音的五倍,且更典型地超过10倍背景值,甚至更特异性地,当该平衡解离常数(KD)是≤100μM,更佳地≤10μM,甚至更佳地≤1μM,又更佳地≤100μM且最佳地≤10μM时,BMP被称为与BMP受体“特异性结合”。
用语“KD”是指特定配体-受体交互作用的平衡解离常数。
“结合亲和性”通常是指分子(例如BMP配体)的结合部位与彼的结合伴(例如BMPI型或II型受体)之间非共价交互作用的总和力。除非另外说明,本发明所使用的“结合亲和性”是指反应结合伴(例如BMP与彼的同源受体)的成员间1:1交互作用的固有结合亲和性。分子X对彼的结合伴Y的亲和性通常可藉由解离常数(Kd)表示。
亲和性可藉由该领域已知的常用方法测量,包括这些于本文描述者。低亲和性BMP通常与受体缓慢结合且倾向于快速解离,然而高亲和性BMP通常与受体较快速地结合且倾向于维持较长的结合。各种测量结合亲和性的方法是该领域所知,任何这些方法可被用于本发明的目的。特定说明性实施方案是于本发明他处描述。
本文所使用之用语“kon”是意图指称前述(或复合体形成)反应的结合速率常数或特定反应速率,以M-1sec-1的单位测量。
本文所使用之用语“koff”是意图指称抗体自该抗体/抗原复合体解离的解离速率常数或特定反应速率,以scc-1的单位测量。
本文所使用之用语“kd”是意图指称特定抗体-抗原交互作用的解离常数。其是由下式计算:koff/kon=kd
本文所使用之用语“经改变的结合”是指该经设计的BMP包含对至少I型受体及/或II型受体具有相较于对应的野生型BMP与该相同的I型及/或II型受体的结合不同的结合特异性。该经设计的BMP可能以相较于该野生型BMP与该受体的结合更高或更低的亲和性与该受体结合。举例来说,若该野生型BMP以特定结合亲和性与特定I型受体结合,该对应的经设计的BMP以相较于该野生型BMP更高或更低的亲和性与该受体结合。该经设计的BMP甚至可能将与野生型BMP无法侦测地结合的受体特异性结合或反过来使该经设计的BMP不再可侦测地与该野生型BMP所结合的受体结合。因此,经改变的结合包含经设计的BMP与I型或II型受体的结合相较于由该对应的野生型BMP与该受体的结合上的任何可侦测的改变。该经设计的BMP可能具有相较于对应野生型BMP的kon值更高或更低的kon值,及/或该经设计的BMP可能具有相较于该对应野生型BMP的koff值更高或更低的koff值,以使该经设计的BMP的Kd是大于或小于对应野生型对该相同BMP受体的Kd。因此,在经设计的BMP与对应的野生型BMP之间的任何结合特征及/或亲和性数值差异是由本发明所使用的“经改变的结合”之用语所包含。
本发明所使用之用语“表面电浆共振”是指藉由检测在生物感测器矩阵内蛋白浓度的变化,以允许即时生物特异性交互反应的分析的光学现象,例如使用BIAcore系统(瑞典鸟普萨拉市及及纽泽西州皮斯卡塔威法玛西亚生物检测公司(Pharmacia Bioscnsor AB))。其他说明见例如Johnsson,et a1.,Ann.Biol.C1in.51:19-26(1993)、Johnsson,et al.,Biotechniques11:620-627(1991)、Johnsson,et al.,J Mol.Recognit.8:125-131(1995)、及Johnnson,et a1.,Anal.Biochem.198:268-277(1991)。
本发明所使用的“实质上纯的”是指目的物种是存在的优势物种(即以莫耳数计算其是多过该组成物中的任何其他个别物种),且优选地实质上经纯化的组分是其中该目的物种(例如经设计的BMP)占所有存在的巨分子物种的至少约50%(以莫耳数计算)的组成物。通常,实质上纯的组成物将包含超过约80%的所有存在于该组成物中的巨分子物种,更佳地超过约85%、90%、95%.及99%。最佳地,该目的物种是经纯化至实质均质性(利用习用检测方法未检测到污染物种存在于该组成物中),其中该组成物实质上是由单一亘分子物种组成。
说明
骨形态发生蛋白(BMP)
如本发明先前所述,BMP是TGF-β蛋白超家族的成员,该超家族的所有成员皆具有6个保守性半胱氨酸残基(Lander et al,(2001)Nature,409:860-921)。该BMP/GDF亚家族包括但不限于BMP2、BMP3(成骨素)(见例如美国专利第6,177,406号)、BMP3b(GDF-10)(见例如美国专利第6,204,047号)、BMP4(BMP2b)(见例如美国专利第6,245,889号)、BMP5(见例如美国专利第5,543,394号)、BMP6(见例如美国专利第6,613,744号)、BMP7(成骨蛋白-1或OP1)(见例如美国专利第5,141,905号)、BMP8(OP2)(见例如美国专利第5,688,678号)、BMP8B(0P3)(见例如美国专利第5,854,071号)、BMP9(GDF2)(见例如美国专利第6,287,816号)、BMP10(见例如美国专利第5,703,043号)、BMP11(GDF11)(见例如美国专利第6,437,111号)、BMP12(GDF7)(见例如美国专利第6,027,919号)、BMP13(GDF6、CDMP2)(见例如美国专利第6,027,919号)、BMP15(GDF9)(见例如美国专利第6,034,229号)、BMP16(见例如美国专利第6,331,612号)、GDF1(见例如美国专利申请案第2004/0039162号)、GDF3(见例如美国专利第6,025,475号)、GDF5(CDMP1、MP52)(见例如美国专利第5,994,094号)、及GDF8(肌肉抑制素)(见例如美国专利第5,827,733号)。
BMPs与彼等的同源受体特异性结合,这些同源受体包括I型受体:ALK-1、ALK-2(亦称为ACtRla或ActRI)、ALK-3(又名BMPRIa)、及ALK-6(又名BMPRIb);及II型受体:ACtRIIa(亦称为ActRII)、ACtRIIb、及BMPRII。这些BMP-受体结合交互作用已受到广泛研究,各种野生型BMP与各种I型及/或II型受体的结合特异性是该领域普遍周知并列示于表1。见例如Nickcl et a1.,Cytokine Growth Factor Rev20:367-77(2009);Heinecke et a1.,BMC Biol7:59(2009)。
表1
ALK1 | ALK2 | ALK3 | ALK6 | ACTIIA | ACTIIB | BMPRII | |
BMP-2 | 不结合 | 不结合 | ++++ | ++++ | ++ | +++ | ++ |
BMP-4 | 不结合 | 不结合 | ++++ | ++++ | ++ | ++ | ++ |
BMP-6 | 不结合 | 不结合 | ++ | ++ | ++++ | ++++ | ++++ |
BMP-7 | 不结合 | 不结合 | ++ | ++ | ++++ | ++++ | ++++ |
BMP-9 | +++++ | 不结合 | 不结合 | 不结合 | ++ | +++ | ++++ |
具有提高成骨活性的经设计的骨形态发生蛋白
本申请案有部分是根据对各种BMP二聚体与四个BMP受体(二个I型受体及二个II型受体)结合的了解。各种BMP对各种受体的特异性是该领域所广为周知且列示于上表1、同样地,媒介BMP与各受体结合的各BMP的受体结合区已被定位并列于表2o举例来说,清楚了解野生型BMP2及BMP4以高亲和性与I型BMP受体Alk-3及ALK-6结合,并以较低的亲和性与II型BMP受体结合。一方面,野生型BMP6及BMP7已知可以高亲和性与II型受体ActrIIA、ActrIIB及BMPRII结合,但以较II型为低的亲和性与I型受体结合。一般相信来自大约43个TGFβ超家族成员经由与大约12个受体交互作用的传讯造成的不同细胞性反应被认为是因为各配体利用不同亲和性与特定受体库结合所致。I型及II型结合结构域是说明于表2
表2
合理氨基酸取代以改变经设计的BMP的受体结合
在一实施方案中,本发明包含在至少一个受体结合部位导入氨基酸突变,由此由经设计的BMP提供相较于该对应的野生型BMP与这些受体的结合经改变的与I型及II型BMP受体的结合。例如,该领域广为周知野生型BMP2显示对I型受体的相对高亲和性,然而野生型BMP6显示对II型受体的高亲和性.进一步为该领域所知的是,
野生型BMP2及BMP6的异二聚体以相对高亲和性与I型及II型受体二者结合,各BMP似乎对各自受体提供较高亲和性的结合部位。
见下表3。已知在活体外及活体内的二种骨形成试验中,BMP2/6异二聚体比BMP2或BMP6单独或同型二聚体更具活性。表3显示BMP2及BMP6与I型及II型受体的结合亲和性的实例。
表3
因此,本发明的目的是提供具有与I型及/或II型受体结合增加的经设计的BMP。如图1A及表2所示,每个BMP包含三个导致受体结合的结合部位。自N端至C端,每个BMP包含II型受体结合部位A、I型受体结合部位及II型受体结合部位B。虽然野生型BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8及BMP9的示范性排比是显示于图1,本领域技术人员将了解有广为周知的排比提供TGB夕超家族成员间的各种氨基酸的相对位置。这些排比是提供于(除其它者外)国际专利公开号WO2009/086131(例如图15至17、图31A)、WO2008/051526(图9至12)、WO2005/118636(图6)、WO2005/118635、WO2005/113585(图3)、WO2001/92298(图6A至6C)、Kirsch et a1.,EMBO J.19:3314-3324(2000)(图1)、美国专利申请公开号2007/0293425(图6)、Groppc et a1.,Nature420:636-642(2002)、Nickelet a1.,J.Bone Joint Surg.Am.83:7-14(2001)、及Weber et a1.,BMCStructural Biol.7:6(2007).因此,使用该领域众所周知的蛋白质序列排比演算法及工具包括排比各种TGFβ超家族成员的氨基酸序列,以及本发明所提供的揭示内容,可决定在一BMP/GDF蛋白中相对另一BMP/GDF蛋白的任何位置处的氨基酸的对应氨基酸。在一实施方案中,在BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8及BMP-9中的对应氨基酸残基是经显示(见例如图1A)。
在本发明的一些实施方案中,该经设计的BMP包含在I型结合结构域或II型结合结构域中的突变,其中这些突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。在一些实施方案中,该经设计的BMP在I型结合结构域及第一个(结合结构域A)或第二个(结合结构域B)II型结合结构域二者中包含一或多种突变。在其他实施方案中,该经设计的BMP在二个II型结合结构域中包含一或多种突变。在其他实施方案中,该经设计的BMP在第一个II型结合结构域、第二个II型结合结构域及I型结合结构域中包含一或多种突变。在一些实施方案中,该经设计的BMP在I型结合结构域中包含一或多种突变。
在一些实施方案中,这些突变增加与I型受体的结合。在其他实施方案中,这些突变增加与II型受体的结合。在其他实施方案中,这些突变减少与I型或II型受体的结合。在一些实施方案中,这些突变如下更加详述的产生或破坏聚糖系链基。在一些实施方案中,这些突变如下更加详述的产生或破坏His门挡。
由于BMP在该领域中是经广泛研究及了解,当可了解一旦提供本发明所揭示之内容,可使的产生突变而不进一步影响该经设计的BMP的活性的可能位置将被了解。因此,本发明的经设计的BMP包含变异体BMP,其与对应的野生型或经设计的BMP的不同处在于其包含额外的不影响该变异体BMP的受体结合亲和性的插入、删除或取代。在一些非限制性的实施方案中,本领域技术人员当能了解与半胱氨酸结形成有关的半胱氨酸及与受体交互作用有关的氨基酸不应发生突变或应以保守性取代加以改变,至于其他氨基酸可以被比较自由地取代、插入或删除而不附带影响该经设计的BMP的生物活性。
应注意的是除非另外说明,经设计或经修饰的BMP的所有位置编号是基于该成熟天然BMP的序列。经设计的BMP的特征在于该变异具有预定特性、此特性使彼等与该BMP序列的天然发生的等位基因或物种间变异有所不同。经设计的BMP的变异体必须保留该对应的野生型或经设计的BMP于一或多种细胞类型中的活性的至少50%,由下述的适当试验测定。保留至少75%、80%、85%、90%或95%的野生型活性的变异体是为更佳、相较于野生型更具活性的变异体则特别优选。经设计的BMP可能包含在N端、C端或内部的插入、删除、及/或取代。在优选的实施方案中,经设计或修饰的BMP具有至少一个与最类似的人BMP序列不同的残基,有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同残基是为更佳。
本发明的经设计的BMP与该对应的野生型BMP蛋白序列维持至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的一致性。
本发明的经设计的BMP可能与该对应的野生型BMP蛋白序列的C端区域的保守性半胱氨酸结构域维持至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的一致性。
经设计的BMP可能包含其他修饰,例如改变其他蛋白质性质诸如稳定性或免疫原性的突变,或使转译后修饰诸如PEG化或糖基化得以进行或无法进行的突变。经设计的BMP可能发生转译时或转译后修饰,包括但不限于合成性衍生化一或多个侧链或末端、糖基化、PEG化、环状排列、环合、与蛋白质或蛋白结构域融合.及添加肽标签或标记。
由于基因密码的简并性,可藉由不改变该经设计的BMP的氨基酸序列的方法简单地修饰一或多个密码子的序列以产生极大量的核酸,其中所有核酸皆编码本发明的经设计的BMP。本发明的经设计的BMP不包含专利WO2008/051526或WO2009/086131中所述的这些序列。
如上所述,BMP被天然地表达为包含长的原结构域,一或多个切割位点及成熟结构域的原蛋白质。此原蛋白质接着藉由细胞机制处理以产生二聚体的成熟BMP分子、在优选的实施方案中,本发明的经设计的BMP是以类似方式生产。该原结构域被认为有助于BMP的正确折迭及处理。另外,在一些但非所有的BMP中,该原结构域可能与该成熟结构域非共价结合,且可能作为伴护子及抑制子(例如Thies et a1.(2001)Growth Factors,18:251-259)。优选地,本发明的经修饰的BMP是以此形式生产及/或治疗性投予。或者,BMP可能被生产为其他形式,包括但不限于其中该成熟结构域是直接产生或由包涵体再折迭而成,或包含全长的完整原蛋白质。本发明的经设计的BMP可以这些及其他形式被使用。
在特定实施方案中,本发明的经设计的BMP包含主链BMP(即野生型BMP),其为该经设计的BMP所对应者。在特定实施方案中,此主链BMP可为野生型BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、或BMP9主链。
在本发明的一些实施方案中,该经设计的BMP包含在I型结合结构域及/或II型结合结构域中的至少一个突变,其中相较于对应的不包含该突变的野生型BMP的结合,该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。在一些实施方案中,该经设计的BMP在I型结合结构域中包含至少一个突变且在II型结合结构域中包含至少一个突变。在其他实施方案中,该经设计的BMP在II型结合结构域A及II型结合结构域B内包含至少一个突变。在其他实施方案中,该经设计的BMP在II型结合结构域A、II型结合结构域B、及I型结合结构域内包含至少一个突变。
在某些实施方案中,该突变可能包含氨基酸或核酸取代、删除及/或插入。在优选的实施方案中,该突变包含氨基酸取代。
在一些实施方案中,该主链BMP是野生型BMP且这些突变是于表4至6所列的突变中的一或多者。该经设计的BMP可能包含这些表中所列的任何组合及任何数量的突变。
在一些实施方案中,该主链BMP是野生型BMP且这些突变是于表4至6所列的突变中的一或多者。该经设计的BMP可能包含在这些表中所列或本发明他处所揭示的突变的排列及其中任一及所有突变。
表4
表5
表6
在一些实施方案中,这些突变增加与I型受体的结合。在其他实施方案中,这些突变增加与II型受体的结合。在其他实施方案中,这些突变减少与I型或II型受体的结合。
上表4至6提供本发明的示范突变的非限制性汇整,其中该突变的位置是参考该对应的野生型BMP氨基酸序列提供。因此,在一些实施方案中,该经设计的BMP包含下列优选的突变组合。
在某些实施方案中,该经设计的BMP所对应的野生型BMP是BMP2。另外,在该II型受体结合结构域A内的至少一个突变是选自V33、P36、G37、H39、F4]、Y42或H44的突变。
在其他实施方案中,该经设计的BMP在该II型受体结合结构域A内包含至少一个突变且在I型受体结合结构域内另包含至少一个额外的突变。在该I型受体结合结构域内的突变是至少一个选自SEQ IDNO:1序列的P48、F49、A52、D53、H54、L55、N56、S57、N59、V63、T65、N68、S69、V70、N71、S72、K73、I74和P75处的突变。
在另外的其他实施方案中,该经设计的BMP在II型受体结合结构域A内包含至少一个突变,在I型受体结合结构域内包含至少一个突变,且在II型受体结合结构域B内另包含至少一个额外突变。在该II型受体结合结构域B内的突变是至少一个于SEQ ID NO:1序列的E83、S85、A86、M89、L92、E94、N95、E96、K97、V98、和V99处的突变。
在一些实施方案中,该经设计的包含SEQ ID NO:1序列的各氨基酸H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入P、或S72、K73、I74、A77和V80的突变。
在一实施方案中,该经设计的BMP包含下列突变:SEQ ID NO:1序列的H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、在N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P、及V80A。
在一些实施方案中,该经设计的BMP包含SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33、P36、H39、S85、M89、L92、E94、E96、K97或V99处的突变。
在一些实施方案中,该经设计的BMP包含SEQ ID NO:1序列的各氨基酸V33I、P36K、H39A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N或V99I的突变。
在其他实施方案中,该经设计的BMP包含下列突变:SEQ IDNO:1序列的V33I、P36K、H39A、H44D、P48S、A52N、L54M、S56M、N68H、V70M、S72E、K73E、在K73后插入Y、I74V、77AP、S85N、M89V、L92F、E94D、E96S、K97N、及V99I。
在仍其他实施方案中,该经设计的BMP包含下列突变:SEQ IDNO:1序列的V33I、P36R、H39A、H44D、P48S、A52N、L54M、S56M、N68H、V70M、S72E、K73E、在K73后插入Y、I74V、77AP、S85N、M89V、L92F、E94D、E96S、K97N、及V99I。
在某些实施方案中、该经设计的BMP所对应的野生型BMP是BMP4o在某些实施方案中、在该II型受体结合结构域A内的至少一个突变是于SEQ ID NO:2的V35、P38、G39、Q41、F43、Y44、或H46处。
在其他实施方案中,该经设计的BMP4在该II型受体结合结构域A内包含至少一个突变且在I型受体结合结构域内另包含至少一个额外的突变。在该I型受体结合结构域内的突变是至少一个在SEQ IDNO:2的P50、A54、D55、H56、L57、N58、S59、N61、V65、T67、N70、S71、V72、N73、S74、S75、176、或P77处的突变。
在另外的其他实施方案中,该经设计的BMP4在II型受体结合结构域A内包含至少一个突变,在I型受体结合结构域内包含至少一个突变,且在II型受体结合结构域B内另包含至少一个额外突变。在该II型受体结合结构域B内的突变是至少一个于SEQ ID NO:2序列的E85、S87、A88、M91、L94、E96、K97、V98、或V99处的突变。
在某些实施方案中,该经设计的BMP所对应的野生型BMP是BMP5。在某些实施方案中,在该II型受体结合结构域A内的突变是至少一个于SEQ ID NO:3的156、E59、G60、A62、F64、Y65、或D67处的突变。
在其他实施方案中,该经设计的BMP在该II型受体结合结构域A内包含至少一个突变且在I型受体结合结构域内另包含至少一个额外的突变。在该I型受体结合结构域内的突变是至少一个于SEQ IDNO:3的S71、F72、N75、A76、H77、M7s、N79、A80、N82、V86、T88、H91、L92、M93、F94、P95、D96、H97、V98、或P99处的突变。
在另外的其他实施方案中,该经设计的BMP在II型受体结合结构域A内包含至少一个突变,在I型受体结合结构域内包含至少一个突变,且在II型受体结合结构域B内另包含至少一个额外突变。在该II型受体结合结构域B内的突变是至少一个于SEQ ID NO:3的K107、N109、A110、V113、F116、D118、S119、S120、N121、V122、或I123处的突变。
在某些实施方案中,该经设计的BMP所对应的野生型BMP是BMP6.在某些实施方案中,在该II型受体结合结构域A内的突变是至少一个于SEQ ID NO:4的I57、K60、G61、A63、N65、Y66、或D68处的突变。
在其他实施方案中,该经设计的BMP6在该II型受体结合结构域A内包含至少一个突变且在I型受体结合结构域内另包含至少一个额外的突变。在该I型受体结合结构域内的突变是至少一个于SEQ IDNO:4的S72、N76、A77、H78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99或P100处的突变。
在另外的其他实施方案中,该经设计的BMP6在II型受体结合结构域A内包含至少一个突变,在I型受体结合结构域内包含至少一个突变,且在II型受体结合结构域B内另包含至少一个额外突变。在该II型受体结合结构域B内的突变是至少一个于SEQ ID NO:4的K108、N1l0、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123、或I124处的突变。
在某些实施方案中,该经设计的BMP所对应的野生型BMP是BMP7。在某些实施方案中,在该II型受体结合结构域A内的突变是至少一个于SEQ ID NO:5的I57、E60、G61、A63、Y65、Y66、或E68处的突变。
在其他实施方案中,该经设计的BMP7在该II型受体结合结构域A内包含至少一个突变且在I型受体结合结构域内另包含至少一个额外的突变。在该I型受体结合结构域内的突变是至少一个于SEQ IDNO:5的A72、F73、N76、S77、Y78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99或P100处的突变。
在另外的其他实施方案中,该经设计的BMP7在II型受体结合结构域A内包含至少一个突变,在I型受体结合结构域内包含至少一个突变,且在II型受体结合结构域B内另包含至少一个额外突变,在该II型受体结合结构域B内的突变是至少一个于SEQ ID NO:5的Q108、N110、A111、V114、F117、D119、S120、S121、N122、V123、或I124处的突变。
在某些实施方案中,该经设计的BMP所对应的野生型BMP是BMP8。在某些实施方案中,在该II型受体结合结构域A内的突变是至少一个于SEQ ID NO:6的I57、Q60、G61、S63、Y65、Y66、或E68处的突变。
在其他实施方案中,该经设计的BMP8在该II型受体结合结构域A内包含至少一个突变且在I型受体结合结构域内另包含至少一个额外的突变。在该I型受体结合结构域内的突变是至少一个于SEQ IDNO:6的S72、F73、D76、S77、C78、M79、N80、A82、N83、L87、S89、H92、L93、M94、M95、P96、D97、A98、V99或P100处的突变。
在另外的其他实施方案中,该经设计的BMP8在II型受体结合结构域A内包含至少一个突变,在I型受体结合结构域内包含至少一个突变,且在II型受体结合结构域B内另包含至少一个额外突变。在该II型受体结合结构域B内的突变是至少一个于SEQ ID NO:6的K108、S110、A1l1、V114、Y117、D118、S119、S120、N121、N122、V123、或I124处的突变。
在某些实施方案中,在该II型受体结合结构域A内的突变是至少一个于SEQ ID NO:7的127、K30、E31、E33、Y35、或E36处的突变。
在其他实施方案中,该经设计的BMP9在该II型受体结合结构域A内包含至少一个突变且在I型受体结合结构域内另包含至少一个额外的突变。在该I型受体结合结构域内的突变是至少一个于SEQ IDNO:7的F42、F43、A46、D47、D48、V49、T50、P51、K53、V57、T59、H62、L63、K64、F65、P66、T67、K68、V69、和G70处的突变。
在另外的其他实施方案中,该经设计的BMP9在II型受体结合结构域A内包含至少一个突变,在I型受体结合结构域内包含至少一个突变,且在II型受体结合结构域B内另包含至少一个额外突变。在该II型受体结合结构域B内的突变是至少一个于SEQ ID NO:7的K78、S80、P81、V84、K87、D89、M90、G91、V92、P93、或T94处的突变。
经设计的BMP的示范性氨基酸序列是如下表7所示。
表7显示该经设计的分子的名称及序列。
表7
虽然上表列示的经设计的BMP包含本发明的实施方案,但本发明并不以任何方式限至于任何特定分子。相反地,本发明包含任何具有经改变的受体结合的经设计的BMP,其中该经设计的BMP包含至少一个在II型受体结合结构域A内的突变,甚至更佳地,该经设计的BMP包含至少一个在I型受体结合结构域内的其他突变、最佳地,该经设计的BMP包含又另一个在II型受体结合结构域B内的至少一个其他突变。
在其他实施方案中,本发明的经设计的BMP包含与上述序列中的一者具有至少约70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性或完全一致的氨基酸序列。在另一实施方案中,该经设计的BMP包含与SEQ ID NO:8至73中的序列具有至少约70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性或完全一致的氨基酸序列。
在又一实施方案中,该经设计的BMP包含如SEQ ID NO:8至73中的任一者所述的氨基酸序列。在另一实施方案中,该经设计的BMP的氨基酸序列是由序列SEQ ID NO:8至73中的一者组成。
另外,在一实施方案中,该经设计的BMP包含与序列SEQ IDNO:12具有至少约70%、75%、8o%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性或完全一致的氨基酸序列。在另一实施方案中,该氨基酸序列是SEQ ID NO:12的序列。在又一实施方案中,该经设计的BMP是BMPE。
在额外的实施方案中,该经设计的BMP包含与序列SEQ IDNO:14具有至少约70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性或完全一致的氨基酸序列。在另一实施方案中,该氨基酸序列是SEQ ID NO:14的序列。在又一实施方案中,该经设计的BMP是BMPG。
在另一实施方案中,该经设计的BMP包含与序列SEQ ID NO:36具有至少约70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性或完全一致的氨基酸序列。在另一实施方案中,该氨基酸序列是SEQ ID NO:36的序列。在又一实施方案中,该经设计的BMP是BMPGE。
在另一实施方案中,该经设计的BMP包含与序列SEQ ID NO:37具有至少约70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%的一致性或完全一致的氨基酸序列。在另一实施方案中,该氨基酸序列是SEQ ID NO:37的序列。在又一实施方案中,该经设计的BMP是BMPGER。
本发明的经设计的BMP可能包含上述序列中的任一者的片段。在一实施方案中,经设计的BMP片段可能包含来自SEQ ID NO:8王73序列的任一序列中的至少不中断的20、22、24、25、26、27、28、30、32、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、47、50、53、54、56、58、60、62、66、68、70、71、74、77、80、83、85、88、90、91、93、95、97、99、100、102、105、108、110、112、115、117、119、120、121、122、或125个氨基酸的序列。
该领域所广为周知的是,BMP通常具有多变异性的蛋白质的氨基及/或羧基端。也就是说,本发明包含具有氨基酸删除/截短的氨基及/或羧基端的经设计的BMP,该删除/截短包含自该经设计的BMP的C端及/或N端删除至少10个氨基酸残基,优选地9个氨基酸残基,甚至更佳地8个氨基酸残基,又更佳地7个氨基酸残基,优选地6个氨基酸残基,甚至更佳地5个氨基酸残基,优选地4个氨基酸残基,更佳地3个氨基酸残基,甚至更佳地2个氨基酸残基,及最佳地1个氨基酸残基。
在另一实施方案中,本发明包含经设计的BMP蛋白,该经设计的BMP蛋白包含SEQ ID NO:8至73的序列中任一者的氨基酸序列且另包含自该蛋白的氨基及/或羧基端的删除/截短。在另一实施方案中,本发明包含衍生自具有SEQ ID NO:8至73序列中任一者的氨基酸序列的BMP蛋白的经设计的BMP蛋白,其中该经设计的BMP蛋白包含氨基酸删除/截短的氨基及/或羧基端,该删除/截短包含自该经设计的BMP蛋白氨基酸序列的C端及/或N端删除至少10个氨基酸残基,优选地9个氨基酸残基,甚至更佳地8个氨基酸残基,又更佳地7个氨基酸残基,优选地6个氨基酸残基,甚至更佳地5个氨基酸残基,优选地4个氨基酸残基,更佳地3个氨基酸残基,甚至更佳地2个氨基酸残基,及最佳地1个氨基酸残基。
具有由糖基化所媒介的经改变的受体亲和性的BMP的结构设计
本发明所揭示的资料显示,在大肠杆菌(E.co1i)中生产的未经糖基化的BMP2同型二聚体(在本文称为“E.coli BMP2”)相较于在哺乳动物细胞诸如CHO细胞(在本文称为“CHO BMP2”)中生产的糖基化BMP2具有较低的活性。此外,本发明所揭示的资料另外显示由E.coli生产的BMP6同型二聚体相较于由哺乳动物细胞培养所生产的BMP6同型二聚体实质上无功能。
本发明所揭示的资料显示,E.coli BMP2与CHO BMP2的I型受体结合区的晶体结构之间有显著差异。
在一实施方案中,该经设计的BMP包含由糖基化所媒介的经改变的构型,由此影响结合模体,该模体反过来媒介经改变的与I型受体的结合。此是根据本发明的发现,即在哺乳动物(例如CHO)细胞所生产的野生型BMP2中,D53朝向该受体界面,但是H54背对该受体。此与E.coli生产的BMP2相反,其中该D53残基背对该受体界面,而该H54残基朝向该受体排列,与如图3所示的脯氨酸残基交迭,似乎作为“门挡”之用。此外,本发明所揭示的资料首度显示,由CHO生产的经完全糖基化及活化的BMP6亦包含朝向该来袭受体的组氨酸残基,即组氨酸“门挡”。
不希望被任何特定理论限制,但本发明所揭示的资料首度显示,自该受体界面移除“门挡”残基可媒介该BMP配体与彼的受体之间的结合增加。该资料进一步显示,该门挡残基可能自己突变以移除该门挡或可能是其他残基发生突变以移动该门挡残基的位置。另外,本发明所揭示的资料进一步显示其他残基可能发生突变以提供“聚糖系链基”,该聚糖系链基可以转而引导聚糖以使该聚糖的系链重新引导该门挡残基的方向。
因此在一些实施方案中,经设计的BMP可藉由并入至少一个会影响该聚糖系链基及/或移除组氨酸门挡结构的氨基酸突变加以生产,由此提供具有经改变的受体结合的经设计的BMP。
总结来说,在一些实施方案中,本发明的经设计的BMP可能包含至少一个在该BMP的I型及/或II型结合结构域内的突变,该突变赋予经政变的与该I型及/或II型受体的结合。在一实施方案中,该BMP序列是经工程化以改变BMP的受体亲和性,这是为了改变及改善该经工程化或“经设计”的BMP的受体结合及/或成骨活性。在一实施方案中,此工程化涉及识别与I型及II型受体结合有关的残基,并取代这些残基以产生经设计的BMP分子,这些经设计的BMP分子相较于彼等所衍生自的母体BMP显示(除其它者外)对I型及II型受体二者皆具有较高的亲和性。
在其他实施方案中,本发明的经设计的BMP包含产生新的精氨酸“聚糖系链基”或破坏现有系链基以重新塑形该I型受体结合结构域的突变。也就是说,使在距离该第一半胱氨酸的C端二个残基位置的精氨酸发生突变(相当于BMP2的R16),似乎造成该聚糖链被“系链”于该BMP表面上,因此改变该前螺旋环区相较于缺乏该突变的野生型BMP的构型。在其他实施方案中,本发明的经设计的BMP可能包含至少一个突变,该突变改变、产生或破坏(取消)挡住I型受体使其无法与BMP进一步结合的“门挡”残基。也就是在该经设计的BMP中的H54(或彼的对应相等残基)的突变,该突变的方向性使其阻碍或增加该经设计的BMP与I型受体的交互作用,在一些实施方案中,该氨基酸突变影响该经设计的BMP的构型,以使该突变媒介该产生及或取消本来存在于该对应的野生型BMP中的精氨酸“聚糖系链基”、在一些实施方案中,该突变媒介经改变的构型,该构型产生或移除/取消在该经设计的BMP中的组氨酸门挡构型,其中在该对应的野生型BMP中该门挡构型分别为不存在或具有活性。
因此,本领域技术人员一旦了解本发明所杆供的揭示内容,当能理解精氨酸“聚糖系链基”及/或组氨酸“门挡”在TGFβ超家族成员中的存在与否可利用该领域已知之用于蛋白质结构分析的任何方法测定,包括但不限于本发明所例示的方法。一旦“门挡”残基的存在被确认后,至少一个突变可被导入该分子中以重新引导该组氨酸远离该受体结合界面的方向。或者,将产生或促进“聚糖系链基”的突变可被导入,以使该组氨酸“门挡”的抑制效果(若有的话)被降低或更佳地被消除。
在一实施方案中,当该TGFβ超家族成员是BMP2时,移除该组氨酸门挡的突变是以另一氨基酸取代H54。在一些实施方案中,该H54是由丙氨酸.甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。
虽然本发明揭示这些BMP2的“门挡”移除突变,技术人员当能根据该领域的知识了解如何识别其他TGFβ超家族成员的对应突变,并轻易地产生缺乏“门挡”的突变,即移除或重新引导原本将藉由面对或突出至该结合界面而干扰受体结合的残基。该突变对于蛋白质构型的影响可利用任何该领域公认之用于蛋白质结构分析的方法测定,诸如但不限于这些本发明所揭示的方法、或者,可移除该门挡及增加配体与该I型受体结合的突变可利用该领域可用的电脑模型方法于电脑上识别。因此,本发明包含具有增进的与该I型受体结合的TGFβ超家族成员的设计,其中这些成员缺乏原本将存在于该受体界面的组氨酸“门挡”残基。
本发明另提供本领域技术人员有关如何识别其他TGFβ家族成员的突变的了解,这些突变将产生或破坏该精氨酸聚糖系链基。添加该精氨酸聚糖系链基至缺乏该系链基的蛋白质的突变被本发明所考虑。因此,本发明包含具有增进的与该I型受体结合的TGFβ超家族成员的设计,其中这些成员包含改变该I型受体结合结构域的构型的精氨酸聚糖系链基。
在一些实施方案中,移除该组氨酸门挡因此移除对聚糖系链基的需求,提供一种可以不须糖基化的形式被生产且仍维持生物活性的经设计的BMP。举例来说,经设计的BMP可在具有与哺乳动物细胞不同的糖基化活性或不具糖基化活性的细胞中生产,例如细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞或粘液霉菌细胞。在特定实施方案中,该经设计的BMP可在大肠杆菌(E.coli)中生产并维持生物活性。
因此,在一些实施方案中,本发明提供设计及生产BMP的方法,这些BMP可于缺乏糖基化或包含经改变的糖基化的细胞内生产,以使与哺乳动物细胞所生产的聚糖不同的经改变的聚糖被生产。也就是说,本发明包含用于导入突变的方法、该突变移除原本将会妨害或抑制受体结合的门挡残基。本领域技术人员一旦了解本发明的揭示当能知道,侵犯该受体一配体界面的门挡残基可能发生突变以完全栘除该残基或其他突变可被导入以使该残基朝向远离该界面的方向。这些其他突变包括但不限于提供将改变聚糖的构型的聚糖系链基及由此改变该配体的构型以使该门挡残基的方向远离该结合界面。
编码经设计的BMP的核酸
本发明亦包括编码本文所描述的BMP的核酸。编码本发明所描述的这些经设计的BMP的核酸可根据该领域已知的各种方法制备。
在一种方法中,编码经设计的BMP的核酸是藉由全基因合成,或藉由使编码野生型或经修饰的BMP的核酸定点突变加以制备。可利用包括模板引导连接、递回PCR、卡匣突变形成.定点突变形成或其他该领域众所周知的方法(见例如Strizhov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:15012-15017(1996)、Prodromou and Perl,Prot.Eng.5:827-829(1992)、Jayaraman and Puccini,Biotechniques12:392-398(1992)、及Chalmers et a1.,Biotechniques30:249-252(2001))。
因此,本发明的实施方案可包含编码本发明的经设计的BMP的核酸分子。在某些实施方案中,本发明提供编码SEQ ID NO:8至66的氨基酸序列中的一者的核酸分子。
在其他实施方案中,该核酸分子编码包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70%、75%、8o%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的氨基酸序列的经设计的BMP蛋白。在一些实施方案中,该核酸分子编码包含SEQID NO:12的氨基酸序列的经设计的BMP蛋白。在另一实施方案中,该核酸分子编码如表8所示的BMPE的氨基酸序列、在其他实施方案中,该核酸分子编码包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的氨基酸序列的经设计的BMP蛋白。在一些实施方案中,该核酸分子编码包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的经设计的BMP蛋白。在另一实施方案中,该核酸分子编码如表8所示的BMPG的氨基酸序列。
在其他实施方案中,该核酸分子编码包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的氨基酸序列的经设计的BMP蛋白。在一些实施方案中,该核酸分子编码包含SEQID NO:36的氨基酸序列的经设计的BMP蛋白。在另一实施方案中,该核酸分子编码如表8所示的BMPGE的氨基酸序列。
在其他实施方案中,该核酸分子编码包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的氨基酸序列的经设计的BMP蛋白。在一些实施方案中,该核酸分子编码包含SEQID NO:37的氨基酸序列的经设计的BMP蛋白。在另一实施方案中,该核酸分子编码如表8所示的BMPGER的氨基酸序列。
编码经设计的BMP的示范性核苷酸序列是如下表8所示。表8显示该经编码的蛋白质的名称及编码该蛋白质的核苷酸序列。通常,该成熟蛋白质编码序列始于下列序列的核苷酸847。
表8
在其他实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含与SEQID NO:74至139所示的核酸序列中的一者或彼的片段具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的核酸序列。在其他实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含与表8所示的核酸序列中的一者或彼的片段具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的核酸序列。在另一实施方案中、该编码、经设计的BMP的核酸分子包含如SEQ ID NO:74至139所示的任何序列的核酸序列。在又一实施方案中,该核酸分子是由SEQ ID NO:74至139的核酸序列中任一者的核酸序列所组成。
在另一实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含与SEQID NO:78的核酸序列或彼的片段具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的核酸序列。在另一实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含SEQ ID NO:78的核酸序列。在又一实施方案中,该核酸分子是由编码BMPE的SEQIDNO:78的核酸序列组成。
在另一实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含与SEQID NO:80的核酸序列或彼的片段具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、8o%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的核酸序列。在另一实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含SEQ ID NO:80的核酸序列。在又一实施方案中,该核酸分子是由编码BMPG的SEQ ID NO:80的核酸序列组成。
在另一实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含与SEQID NO:102的核酸序列或彼的片段具有至少40%、50%、6o%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的核酸序列。在另一实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含SEQ ID NO:102的核酸序列。在又一实施方案中,该核酸分子是由编码BMPGE的SEQ ID NO:102的核酸序列组成。
在另一实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含与SEQID NO:103的核酸序列或彼的片段具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的核酸序列。在另一实施方案中,编码经设计的BMP的核酸分子包含SEQ ID NO:103的核酸序列。在又一实施方案中,该核酸分子是由编码BMPGER的SEQ ID NO:103的核酸序列组成。
生产经设计的BMP的方法
BMP被天然地表达为包含长的原结构域、一或多个切割位点及成熟结构域的原蛋白质。此原蛋白质接着藉由细胞机制处理以产生(通常为)二聚体的成熟BMP分子;在一些实施方案中,该经设计的BMP是以类似的方式生产。该原结构域被认为在BMP的折迭及处理上有其作用。另外,在一些BMP中,该原结构域可能与该成熟蛋白共价结合,并具有增强、伴护或抑制溶解性的作用。在一些实施方案中,BMP可能被生产为直接由内涵体生产或再折迭的成熟结构域。在其他实施方案中,这些BMP是经由化学合成或任何其他用于蛋白质生产的已知方法生产。
在一实施方案中,该经设计的BMP是利用化学合成方法生产,诸如但不限于该领域广为周知的合成方法。
在一些实施方案中,编码经设计的BMP的核酸是藉由全基因合成,或藉由使编码野生型、经设计或变异体BMP的核酸定点突变加以制备。方法包括模板引导连接、PCR、卡匣突变形成、定点突变形成、限制酶消化及连接或其他该领域广为周知的技术(见例如Prodromouet a1.,Protein Eng5:827-9(1992)、Jayaraman et a1.,Biotechniques12:392-8(1992)、Chalmcrs et a1.,Biotcchniques30:249-52(2001)、及Sambrook and Russell,In:Molecular Cloning,A Laboratory Approach,Co1d Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2001))。
在一些实施方案中,包含编码经设计的BMP的基因的表达载体是经制备。用于各种宿主细胞的各种类型的适当表达载体及适当调节序列是该领域所知。这些表达载体可包含转录及转译调节序列,包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录终止信号、聚腺苷酸化信号及增强子或活化子序列。在一些实施方案中,该调节序列包括启动子及转录起始及终止序列。此外,该表达载体可包含额外元件,诸如二种复制系统以允许其被维持于两种有机体中。该表达载体可为染色体外载体或嵌入宿主细胞的基因组中的载体。在一些实施方案中,该表达载体包含至少一种与宿主细胞的基因组同源的序列,以促进整合至该基因组内。用于整合载体的建构体是该领域所广为周知。在一些实施方案中,该表达载体包含可筛选的标志基因以允许筛选经稳定转形的宿主细胞。筛选标志基因是该领域众所周知,将随所使用的宿主细胞而异。
该表达载体可包括分泌前导序列或信号肽序列,以用于自该宿主细胞分泌该经设计的BMP。适当的分泌前导序列及信号肽是为该领域所知。编码经设计的BMP的核酸可被单独导入或与表达载体组合导入宿主细胞,以使该经设计的BMP由该核酸表达。导入的方法主要取决于该宿主细胞的种类。示范性转染/转形的方法包括磷酸钙(CaPO4)沉淀、脂质体融合、电穿孔、病毒感染、葡聚糖媒介转染.凝聚胺媒介转染、原生质体融合、直接显微注射及其他该领域已知的方法。编码经设计的BMP的核酸可能被稳定嵌入该宿主细胞的基因组中或可能暂时或稳定地存在于细胞质中。
用于表达经设计的BMP的适当宿主细胞包括任何适合用于表达野生型或天然BMP的细胞,包括但不限于酵母菌、细菌、古细菌、真菌、昆虫及动物细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞是啤酒酿母菌(Saccharomyccs cercvisiae)或大肠杆菌(Eschelia coli)。在一些实施方案中,该宿主细胞是哺乳动物细胞诸如293(例如293-T及293-EBNA)、BHK、CHO(例如CHOK1及DG44)、COS、Jurkat、NIH3T3、或C2C12细胞。其他适当细胞可见于ATCC目录。经设计的BMP可于更复杂的有机体中制备,包括但不限于植物及动物。在一实施方案中,这些细胞可能经额外的基因工程化,即除了包含该经设计的BMP核酸的表达载体以外还包含外源性核酸。
在一些实施方案中,经设计的BMP是藉由培养经表达载体转形的宿主细胞加以生产,该表达载体包含编码经设计的BMP的核酸、该培养在适当条件下进行以诱导或造成该经设计的BMP的表达。适合经设计的BMP表达的条件是与已知适用于表达天然或野生型BMP的条件相同。这些条件将随表达载体及宿主细胞的选择而异,且可轻易地由本领域技术人员经由例行实验加以确定。
在一些实施方案中,该经设计的BMP可在表达后纯化或分离。标准纯化方法包括电泳、分子、免疫及层析技术,包括离子交换层析、疏水性层析、亲和性层析、逆相HPLC层析及色层集焦。适当纯化技术的一般指南可见于Scopes,In:Protein Purification,Springer-Verlag,NY,3rd Ed.(1994)。所需的纯化程度将随该所欲之用途而定,在一些情况中将不需要纯化。
自细菌细胞纯化可能导致BMP于内涵体中表达及于CHAPS/高盐系统中再折迭之后续步骤。自哺乳动物细胞纯化可能涉及经由Cellufine硫酸盐及逆相层析管柱的二步骤纯化。
在一些实施方案中,该经设计的BMP可经共价或非共价的修饰。共价修饰可藉由使蛋白质的目标氨基酸残基与有机衍生剂反应而被导入该蛋白质中,该有机衍生剂能与经选择的侧链或末端残基反应。用于修饰的理想位点可利用各种标准选择,包括但不限于目视检查、结构分析、序列分析及分子模拟。
在一些实施方案中,经设计的BMP可利用至少一种元件、同位素或化学化合物标示。该标记可为同位素标记,诸如放射性或重同位素。在一些实施方案中,该标记可为免疫标记诸如抗体或抗原。在一些实施方案中,该标记可为彩色或萤光标记,诸如萤光素。在一些实施方案中,该标记可为生物素、标签(例如FLAG、Myc、His)。
该经设计的BMP可利用双宫能剂衍生化,以使该经设计的BMP与用于纯化与蛋白质结合的抗体或蛋白质的支持基材或表面交联,或于筛选试验中检测结合。常用的交联剂包括但不限于1,,1-双(二偶氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如具有4-迭氮基水杨酸的酯)、同型双宫能性亚胺酸酯(包括二琥珀酰亚胺酯诸如3,3’-二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯))、双宫能性顺丁烯二酰亚胺(诸如双-N-顺丁烯二酰亚氨基-1,8-辛烷)。其他修饰包括分别脱去谷酰氨基及天冬酰氨基的酰胺成为该对应的谷酰胺基及天冬氨酰基、脯氨酸及赖氨酸的羟化、丝氨酰基或苏氨酰基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸及组氨酸侧链的氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Stluctureand Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))、N端胺的乙酰化及任何C端羧基的酰胺化。这些衍生化可改善溶解性、吸收性、通过血脑屏障、血清半衰期及类似者。或者,经设计的BMP的修饰可能消除或减轻该蛋白质的任何可能的非所欲的不良反应。可媒介该效应的基团是经揭示于例如Rcmington’sPharmaceutical Sciences,16th ed.,Mack Pub]iShing Co.,Easton,PA(1980)。
另一类型的经设计的BMP的共价修饰包含连接该蛋白质与各种非蛋白质性聚合物中的一者,例如聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯,以美国专利第4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所阐述的方式进行。如该领域所广为周知,各种耦合化学可被用于达成PEG连接。
在另一实施方案中,该经设计的BMP包含经由CovX抗体(CovX-body)连接子连接该蛋白质至CovX抗体,诸如但不限于于美国专利第5,733,757号及美国专利公开号US2009/0098130中所述的CovX抗体。这些CovX抗体可能呈现经改善的特征、包括但不限于经改善的稳定性及延长的血清半衰期。
检测经设计的BMP的受体结合活性的方法
经设计的BMP的受体结合活性可利用任何用于检测野生型BMP的活性的方法检测。
经设计的BMP对于一或多种BMP受体的亲和性可藉由受体结合试验测定。举例来说,可测定对ALK-2、ALK-3、ALK-6、ActRII、ActRIIb、或BMPRII的亲和性。适当的结合试验包括但不限于ELISA-萤光异向性及强度、邻近闪烁检测(SPA)、Biacore(Pearce et a1.,Biochemistry38:81-89(1999))、DELFIA试验及Alpha ScrecnrTM(可自珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司购得:Bossc R.,Illy C,and ChelskyD(2002))。
在一些实施方案中,使用Biacore或表面电浆共振试验。见例如McDonnell,Curr.Opin.Chem.Biol.5:572-577(2001)、Biacore实验先前曾被用来特征化TGF-β异构体与彼等的受体的结合(De Cresccnzo eta1.,J.Biol.Chem.,276:29632-29643(2001);De Cresccnzo et al.,J.Mol.Bio1.328:1173-1183)(2003)。
在其他实施方案中,盘式直接结合试验被用于测定一或多种经修饰的BMP对一或多种BMP受体的亲和性。此方法是经改良的三明治式ELISA,其中利用抗。BMP单株抗体捕捉BMP、接着使用BMP受体-Fc融合蛋白检测。
在其他实施方案中,AlphaScrcenTM试验(Bossc R.et al.,Principlesof AlphaScreenTM,PerkinElmer Literatule Application Note Ref#4069,http://lifesciences.perkineImer.com/Notes/S4069-0802.pdf(2002))可被用于特征化受体与抑制剂的结合。萤光试验亦可被用于特征化受体与抑制剂的结合。举例来说,不是BMP2就是BMP2受体或抑制剂可利用萤光染料标示(适当染料的实例见Molecularar Probes catalog)。另外,邻近闪烁检测(SPA)可被用于测定受体结合亲和性。举例来说,BMP受体-Fc融合可与经蛋白质A包覆的SPA珠或闪光板结合,并经S35标记的BMP处理,该结合事件导致光的产生。
在特定实施方案中,特定BMP突变对I型或II型受体的KD可藉由利用受体细胞外结构域与人IgG-Fc融合测定。该受体可利用抗人IgG-Fc感应器与octct感应器结合,且该BMP可与溶液中的受体胞外结构域结合以测定Kon及Koff速率。该Octet系统利用专用BioLaycr干涉仪(BLI)以使能进行生物分子交互作用的即时、无标记分析及提供亲和性、动力学及浓度的资料。当蛋白质与octet感应器结合时、通过该感应器的光线具有可利用分光光度计测量的波长位移。该位移的速率是在该分析物与该感应器结合及当其失去结合时测量。
检测经设计的BMP的成骨活性的方法
经设计的BMP的成骨活性可利用任何用于检测野生型BMP的活性的方法检测。
BMP促进多种类型的细胞的生长及分化、分化可利用例如碱性磷酸酶的发光报道分子或量热试剂诸如亚尔襄蓝(Alcian Blue)或PNPP监测(Asahina et a1.(1996)Exp.Cell Res,,222:38-47;Inada etal.(1996)Biochem.Biophvs.Res.Commun..222:317-322;Johtikkaeta1.(1998)Life ScL62:2359-2368;Cheng et a1.(2003)J.BoneJoint Surgery95A:1544-1552)。
大鼠肢芽软骨分化试验亦可被用来监测初代细胞中的活性。在选择性实施方案中,报道分子基因或激酶试验可被使用。由于BMP活化该JAK-STAT信号传导途径,包含STAT反应性报道分子诸如GFP或萤光素酶的BMP反应性细胞是可被使用(Kusanagi et al.(2000)MoI Biol.Ccll.,11:555-565)。举例来说,在肾细胞中的BMP活性可利用细胞基底试验测定,见例如Wang and Hirschbcrg(2004)J.Biol.Chem..279:23200-23206。
成骨活性可在细胞基底试验中测量,诸如碱性磷酸酶、BRE萤光素酶或茜素红(Alizarinred)矿物化试验,所有皆于Isaacs et a1.,MolEndoclinol.24:1469-1477(2010)中描述。
成骨活性亦可经由大鼠异位骨试验或哺乳动物骨生长模型在活体内测量。在一些实施方案中,成骨活性是于非人灵长动物模型中测量。这些模型是于Isaacs et a1.,Mol.Endocrin1.24:1469-1477(2010)中描述。
评估骨质量及品质的方法是该领域所知,包括但不限于X光绕射、DXA、DEQCT、pQCT、化学分析、密度分离、组织测光法、及例如于Lanc et a1.,J.Bone Min.Rcs.18:2105-2115(2003)中所描述的组织化学分析。一种测定皮质骨密度的方法是MicroCT试验。在pQCT测量之后,可利用例如Scanco mCT40(Scanco Medical AG)进行股骨的microCT评估。
任何已知或稍后发展出之用于检测骨生长/密度/强度的活体外或活体内方法可被用于评估本发明的经设计的BMP的成骨活性。
医药组成物
本发明的经设计的BMP可经调制以用于投予至哺乳动物,优选地需要其作为医药组成物的一部分的人。该组成物可藉由任何适当的手段投予,例如非经肠.经口或局部。当该经设计的BMP将藉由注射被局部投予至所欲的组织部位,或藉由诸如静脉内、皮下、肌肉内、眼框内、经眼、脑室内、颅内、囊内(intracapsular)、脊柱内、脑池内、腹膜内、经颊、经直肠、经阴道、鼻内或气雾投予的系统性投予时,该组成物优选地包含水性溶液。该溶液优选地具有生理相容性,以使彼的投予至哺乳动物不会不良地影响该哺乳动物的正常电解质及流体体积平衡。该水性溶液因此可包含例如等张生理食盐水(0.9%NaCl,0.15M),pH7-7.4。
可用于经口或非经肠系统性投予的溶液可藉由制药领域中广为周知的任何方法加以制备,例如于“Rcmington’s PharmaceuticalSciences”中描述者(Gennaro,A.,ed.,Mack Pub.,1990,彼的揭示内容是以参照方式纳入本文)。调制剂可包括例如聚伸烷基二醇诸如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘及类似者。特别是用于直接投予的调制剂可包括甘油及其他具高粘性的组成物。
生物相容性优选地生物可吸收性聚合物(包括例如玻糖醛酸、胶原蛋白、磷酸三钙、聚丁酯(polybutyratc)、聚交酯、聚乙交酯及乳交酯/乙交酯共聚物)可为有用的赋形剂以控制该经设计的BMP于活体内的释放。用于本发明的经设计的BMP的其他潜在有用的非经肠递送系统可包括乙烯醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵.可植入的输注系统及脂质体。用于吸入投予的调制剂可包含赋形剂例如乳糖,或可为包含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐或去氧胆酸盐的水性溶液,或用于以鼻滴剂形式投予的油性溶液或被施用于鼻内的胶。
或者,本发明的经设计的BMP包括如本文所述的识别的经设计的BMP2及BMP6可经口投予。举例来说,经设计的BMP的液体调制剂可根据标准方法制备,诸如这些于”Remington’s PharmaceuticalSciences”(同上)中所述者。这些液体调制剂接着可被加至饮料或其他食物补充剂以供投予。经口投予亦可利用这些液体调制剂的气雾剂达成。或者,利用该领域广知的乳化剂制备的固体调制剂可被制作成适用于经口投予的锭剂、胶囊或含锭。
可任意选择地,该经设计的BMP可被调制于包含用于促进由所欲组织摄取该蛋白质的装置的组成物中。举例来说,已知当于哺乳动物体内系统性提供四环素及二膦酸盐(双膦酸盐)时,它们可与骨矿物质结合,特别是在骨重塑的区域。因此,这些成份可被用于促进递送本发明的经设计的BMP至骨组织。或者,与该所欲的标靶组织的特异性相关的易接近物质(诸如细胞表面抗原)特异性结合的抗体或彼的部分亦可被使用。若有需要,这些特异性靶向分子可与本发明的经设计的BMP共价结合,例如藉由化学交联或藉由使用标准基因工程化技术以产生例如不耐酸键诸如Asp-Pro键接。可用的靶向分子可根据例如美国第5,091,513号专利的揭示内容加以设计。
亦考虑的是,某些经设计的BMP当与载剂基体(即不可溶的聚合物基体)结合时可能展现最高量的活体内活性。见例如美国第5,266,683号专利,其揭示内容以参照方式纳入本发明。目前优选的载剂基体在本质上是异种性、异体性或自体性。然而所考虑的是,合成性材料包含聚乳酸、聚乙醇酸、聚丁酸、彼等的衍生物及共聚物亦可被用于生产适当的载剂基体。优选的合成性及天然衍生性基体材料、彼等的制备、调制彼等与本发明的经设计的BMP的方法及投予方法是该领域所广为周知,因此不在此详细说明。见例如美国专利第5,266,683号。
在某些实施方案中,该经设计的BMP可被单独投予或与另一已知对组织形态发生具有利效应的物质组合投予至需要该BMP的哺乳动物。这些物质(本文称为辅因子)的实例包括促进组织修复及再生及/或抑制发炎或纤维化的物质。可用于刺激骨质疏松症个体的骨组织生长的辅因子实例包括但不限于例如维生素D3、降钙素、前列腺素、副甲状腺素、地塞米松(dcxamcthasonc)、雌激素及IGF-I或IGF-II。可用于神经组织修复及再生的辅因子可包括神经生长因子。其他有用的辅因子包括症状减轻辅因子,包括抗菌剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、止痛剂及麻醉剂。
经设计的BMP是优选地藉由与医药上可接受的非毒性赋形剂及载剂混合而调制成医药组成物。如上所述,这些组成物可被制备以用于系统性例如非经肠投予,特别是呈液体溶液或悬浮液形式:用于经口投予,特别是呈锭剂或胶囊的形式:或用于经鼻投予,特别是呈粉剂、鼻滴剂或气雾剂的形式。当粘附于组织表面是为所欲时,该组成物可包含纤维蛋白原一凝血酶分散液或其他生物粘着剂诸如于例如PCT US91/09275中所揭示者,该揭示内容以参照方式纳入本发明。接着该组成物可被涂布、喷洒或以其他方式施用于该所欲的组织表面。
当投予时,本发明的医药组成物通常是以无致热原、生理可接受的形式递送。另外,该组成物可能刻意地被包封或以粘性形式注射以递送至骨软骨或组织伤害的部位。局部投予可能适合用于伤口愈合及组织修复。对于骨及/或软骨形成优选地是,该组成物包括能递送BMP蛋白至骨及/或软骨伤害的部位的基体,该基体提供发展骨及软骨的结构且理想地能够被身体吸收。这些基体可由目前用于其他植入式医学应用的材料形成。
基体材料的选择是根据生物相容性、可生物降解性、机械性质、化妆品外观及界面性质。本发明的经设计的BMP的特定应用将定义该适当的调制剂。用于这些组成物的潜在基体可能为可生物降解及化学定义的硫酸钙、磷酸三钙、泾磷灰石、聚乳酸及聚酐。其他潜在材料是可生物降解及具有清楚的生物定义,诸如骨或皮肤的胶原蛋白。其他基体是由纯的蛋白质或胞外基体成份组成,其他潜在的基体是非生物可降解且具有化学定义,诸如经烧结的羟磷灰石、生物玻璃、铝酸酯或其他陶瓷。基体可由任何上述材料类型的组合组成,诸如聚乳酸及羟磷灰石或胶原蛋白及磷酸三钙。该生物陶瓷可在组成物中被改变,诸如于钙-铝酸酯-磷酸酯中及经处理以政变孔洞大小、颗粒大小、颗粒形状及生物降解性。
该给药方案将由主治医师考虑各种影响该经设计的BMP蛋白的作用的因素后决定。这些因素包括但不限于所希望形成的骨重量的量、骨损伤的部位、该损伤的骨的状况、伤口大小、受损组织的类型、患者年龄、性别及饮食、任何感染的严重性、给药时间及其他临床因素。剂量可视重构中所使用的基体类型而定。添加其他已知的生长因子诸如IGF I(胰岛素样生长因子I)至该最终组成物可能也会影响剂量。进展可藉由周期性评估骨生长及/或修复加以监测。在该领域中许多广知的方法中的一种评估骨生长或修复的方法是藉由x光摄影及/或CT扫描。
该组成物可被调制成以治疗有效量非经肠或经口投予至人或其他哺乳动物,例如提供适当浓度的该经设计的BMP至标靶组织一段足以诱导该所欲效应的时间的量。优选地,本发明的组成物缓和或减轻哺乳动物对于形态发生因子相关性生物反应的需要,诸如维持衰老组织(例如骨量减少的骨组织)的组织特异性功能或恢复组织特异性表型,或抑制或回复组织中的纤维化反应。
如本领域技术人员所将了解的,在治疗性组成物中所描述的化合物的浓度将视一些因素而定,包括要被投予的药物的剂量、所使用的化合物的化学特征(例如疏水性)、及投予途径。将被投予的药物的优选剂量亦有可能取决于一些变异因素,诸如疾病的类型及程度、组织丧失或缺陷、特定患者的整体健康状况、该选择的化合物的相对生物疗效、该化合物的调制、在调制剂中赋形剂的存在及类型、及投予途径。
总体而言,本发明的化台物可被提供于包含大约0.1至10%w/v化合物的水性生理缓冲溶液中以用于非经肠投予。典型剂量范围是介于每天约10ng/kg体重至约1g/kg体重,优选的剂量范围是介于约0.1mg/kg体重至100mg/kg体重。
治疗用途
经设计的BMP可被用于任何野生型BMP可用的适应症,或用于其中TGFβ超家族成员可被使用的任何方法中。
经设计的BMP能够诱导骨及软骨形态发生的发育级联及诱导或媒介Smad传讯途径。经设计的BMP诱导较高的骨增量及修复,包括但不限于相较于对应的野生型BMP产生较高的骨质量、骨硬度及骨密度。因此,经设计的BMP可被用于诱导组织中的骨形成。另外,经设计的BMP可被用于在体内的不同位置诱导骨及软骨的增生。举例来说,经设计的BMP可被用于修复关节,诸如膝关节、肘关节、踝关节及指关节。举例来说,经设计的BMP可被用于使罹患关节炎或其他软骨退化性疾病的患者的软骨再生。另外,经设计的BMP的使用适应症是治疗因为伤害造成的软骨撕裂。此外,经设计的BMP可用于诱导患者的骨生长。举例来说,经设计的BMP的使用适应症是治疗骨折或断裂、或骨质疏松症的患者、或需要进行脊椎融合或修复脊椎、椎骨或类似者的患者。
在另一实施方案中,本发明包括骨增量及/或修复的方法。因此,本发明包含投予治疗有效量的经设计的BMP至某部位,其中该BMP媒介可侦测的骨增量或修复。
在另一实施方案中,本发明包括诱导或增加Smad表达的方法。该方法包括使含有Smad媒介的表达途径的细胞与本发明的经设计的BMP接触。
经设计的BMP可诱导骨形态发生的发育级联及哺乳动物体内和骨或骨软骨不同的多种组织的组织形态发生。此形态发生活性包括诱导祖细胞增生及分化的能力,及经由事件的进展支持及维持该经分化的表型的能力,该活性导致骨、软骨、非钙化的骨胳或结缔组织及其他成人组织的形成。
举例来说,经设计的BMP可被用于治疗以预防代谢性骨疾病中的骨质量丧失及/或增加骨质量。使用成骨蛋白以预防在代谢性骨疾病中的骨质量丧失及/或增加骨质量的一般性治疗方法是揭示于美国专利第5,674,844号,该专利的揭示内容是以参照方式纳入本文。经设计的BMP亦可被投予以取代或修复在受伤部位的骨或软骨,诸如断骨、骨折、及软骨撕裂。本发明的经设计的BMP可被用于牙周组织再生。使用成骨蛋白以使牙周组织再生的一般方法是揭示于美国专利第5,733,878号,该揭示是以参照方式纳入本文。
经设计的BMP可被用于肝脏再生。使用成骨蛋白以使肝脏再生的一般方法是揭示于美国专利第5,849,686号,该揭示是以参照方式纳入本文。经设计的BMP可被用于治疗慢性肾衰竭。使用成骨蛋白以治疗慢性肾衰竭的一般方法是揭示于美国专利第6,861,404号,该揭示是以参照方式纳入本文。经设计的BMP可被用于促进中枢神经系统缺血或创伤后的功能恢复。使用成骨蛋白以促进中枢神经系统缺血或创伤后的功能恢复的一般方法是揭示于美国专利第6,407,060号,该揭示是以参照方式纳入本文。
经设计的BMP可被用于诱导树突生长。使用成骨蛋白以诱导树突生长的一般方法是揭示于美国专利第6,949,505号,该揭示是以参照方式纳入本文。
经设计的BMP可被用于诱导神经细胞粘附。使用成骨蛋白以诱导神经细胞粘附的一般方法是揭示于美国专利第6,800,603号,该揭示是以参照方式纳入本文。
经设计的BMP可被用于治疗及预防帕金森氏症。使用成骨蛋白以治疗及预防帕金森氏症的一般方法是揭示于美国专利第6,506,729号,该揭示是以参照方式纳入本文。
该领域的一般技术人员当能使用本发明的经修饰的BMP以改良该一般用于上述各种治疗用途的方法。本发明的经修饰的BMP的治疗应用的示范性实施方案是于下进一步描述。
经设计的BMP可被用于修复有病变或受损的哺乳动物组织。欲经修复的组织是优选地加以评估,视需要藉由手术、化学、烧蚀或其他该医学领域中的已知方法移除多余的坏死或干扰结痂组织。然后该经设计的BMP可作为无菌、生物相容性组成物的一部分,藉由手术植入或注射被直接提供王该组织部位。或者,包含受到经修饰的BMP刺激的祖细胞的无菌、生物相容性组成物可被提供至该组织部位。在该部位的不论有病变或受损的现有组织提供适当基材以允许祖细胞的增生及组织特异性分化。此外,受损或有病变的组织部位特别是已进一步经手术手段处理者提供形态发生允许环境。在一些组织中,设想由系统性提供该经修饰的BMP将为足够。
经设计的BMP可被用于预防或实质上抑制伤害后的结痂组织形成。若经设计的BMP被提供至新近受伤的组织部位,其可诱导该部位的组织形态发生,防止移动的纤维母细胞聚集至非分化的结缔组织。该经设计的BMP优选地是以在受伤5小时内被注射至该组织部位的无菌医药制剂提供。
举例来说,该经设计的BMP可被用于蛋白质诱导的实质上受损的肝脏组织在部分肝切除后的形态发生。此常规方法的变化形可被用于其他组织。该常规方法涉及切开组织的实质上不再生的部分,提供优选地呈可溶性医药制剂的该经修饰的BMP至该切开的组织部位,关闭该伤口并在未来日期检查该部位。和骨类似,肝脏在胎后生命期间受到伤害时具有再生的潜力。
在另一实例中,经设计的BMP亦可被用于诱导牙本质形成。到目前为止、牙髓组织对伤害的不可预期的反应是牙科的基本临床问题。使用标准牙科手术技术,藉由移除珐琅质及在牙髓上的牙本质(钻洞)可手术暴露样本牙的小区域(例如2mm)牙髓,进行部分冠髓组织切断术,诱导止血,施用牙髓治疗,并以标准程序封闭及填充该空腔。
本发明的经设计的BMP可被用于治疗纤维化。纤维化可能位于身体的不同部位且可能为特定种类,举例来说,纤维化可能发生在下列部位:肾脏,例如在肾小球性肾炎、糖尿病肾病、异体移植排斥及HIV肾病中观察到的纤维化;肝脏,例如肝硬化及肝静脉闭锁症;肺脏,例如自发性纤维化(及自体免疫性纤维化);皮肤,例如全身性硬化症、蟹足肿、疤痕、及嗜酸性球增多一肌痛症候群:中枢神经系统,例如眼内纤维化;心血管系统,例如血管再狭窄;鼻,例如鼻息肉:骨或骨髓;内分泌器官;及胃肠道系统。
在一实施方案中,具有BMP7的结合特性或彼等的有用修饰(延长半衰期、相较于野生型BMP7对相同或不同受体的结合亲和性增加、对BMP7拮抗剂诸如但不限于Noggin及类似者的抑制具抗药性)的经设计的BMP可被用于治疗、改善或反转纤维化。因为最近的回顾文献weiskirchen et a1.,2009,Frontiers in Biosci.14:4992-5012指出,TGFβ1媒介导致纤维化增加的级联,包括但不限于上皮转间质的转化。该TGFβ1的纤维化诱导效应可被BMP7抑制或反转。亦见Loureiro et al.,2010,Ncphrol.Dial.Transplant.25:1098-1108。另外,某些纤维化状况亦可藉由投予BMP4加以治疗或改善(见Pegoricr et a1.,2010,Resp.Res.11:85)。因此,本发明包含以BMP7骨架为基础及/或并入本发明他处所揭示的I型及II型突变的经设计的BMP,以改变受体结合及提供潜在有用的治疗剂以用于治疗需要治疗患者的纤维化。
纤维化疾病可能由多种原因诱发,包括:化学治疗,例如由博来霉素(blcomycin)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamidc)、甲胺喋昤(mcthotrcxatc)、氮芥(mustinc)、或甲基苄肼(procarbazinc)治疗所造成的肺纤维化;意外或在放射治疗中有目的的放射线暴露,例如由放射线造成之间质性肺疾病(ILD);环境或工业因素或污染物诸如化学物、烟雾.金属、蒸气、气体等,例如由石绵或煤灰造成的ILD;药物或药物的组合,例如抗生素(例如青霉素、磺酰胺等)、心血管药物(例如肼屈嗪(hydralazinc)、乙型阻断剂等)、CNS药物(苯妥英(phcnytoin)、氯丙嗪(chlorpromazine)等)、抗发炎药物(例如金盐、苯基丁氮酮等)等可造成ILD;免疫反应疾病,例如慢性移植物抗宿主病中的皮肤纤维化;疾病状态诸如已知会造成ILD的吸入性肺炎及寄生虫诱导的纤维化;及伤口、例如钝伤、手术切口、战争伤口等如CNS的穿刺伤。
在特定实施方案中,具有增加的与I型受体ALK2结合的经设计的BMP(诸如BMPE)可被用于治疗与ALK2相关的疾病。
试剂盒
本发明包括各种试剂盒,这些试剂盒包含治疗有效量的本发明的经设计的BMP,以及施用器及描述使用该经设计的BMP以进行本发明的方法的说明材料。虽然在下面描述示范性试剂盒,其他可用试剂盒之内容将为本领域技术人员鉴于本揭示内容而显而易见。这些试剂盒皆分别被包括于本发明之内。
本发明包括用于治疗的试剂盒,以在需要该治疗的患者中预防代谢性骨疾病的骨质量流失及/或增加骨质量。该试剂盒包括本发明的经设计的BMP。该试剂盒另包含施用器以用于投予该试剂盒的成份至患者,包括但不限于针筒、骨水泥混合装置及类似者。另外,该试剂盒包含说明使用该试剂盒以治疗或预防患者的骨流失及/或增加骨质量的相关资讯的说明材料。
更佳地,该试剂盒包含至少一种选自具有氨基酸序列的抗体的经设计的BMP,该氨基酸序列选自SEQ ID NO:8至73的氨基酸序列,甚至更佳地,该经设计的BMP包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:36或SEQ ID NO:37的氨基酸序列。优选地,该经设计的BMP是BMPE、BMPG、BMPGE或BMPGER。
该试剂盒可包含任何数量的额外治疗剂以用于治疗或预防骨流失及/或增加骨质量。这些剂是如前所述,包括治疗性化合物、细胞因子、维生素、TGFβ超家族的其他成员等许多其它者。
本发明亦关于制造物品(例如适合静脉注射或经口投予的剂型)、其包含有效量的经设计的BMP以预防骨流失及/或增加骨质量(例如超过10mg/kg、至少15mg/kg、或15mg/kg)、在某些实施方案中,该制造物品包含容器或多个容器,该(等)容器包含经设计的BMP及标签及/或治疗或预防骨流失及/或增加骨质量的使用说明。
本发明亦包括用于治疗或预防有其需要的患者的组织或器官纤维化的试剂盒。该试剂盒包括本发明的经设计的BMP。该试剂盒另包含施用器以用于投予该试剂盒的成份至患者,包括但不限于针筒或递送该蛋白质的装置、混合装置及类似者。另外,该试剂盒包含说明使用该试剂盒以治疗或预防患者的纤维化的相关资讯的说明材料。
更佳地,该试剂盒包含至少一种选自具有氨基酸序列的蛋白质的经设计的BMP,该氨基酸序列选自SEQ ID NO:8至73的氨基酸序列,甚至更佳地,该经设计的BMP包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的氨基酸序列。优选地,该经设计的BMP是BMPE、BMPG、BMPGE或BMPGER。
该试剂盒可包含任何数量的额外治疗剂以用于治疗或预防骨流失及/或增加骨质量或治疗或预防纤维化。这些剂是如前所述,包括治疗性化合物、细胞因子、维生素、TGFβ超家族的其他成员等许多其它者。
本发明亦关于制造物品(例如适合静脉注射或经口投予的剂型),其包含有效量的经设计的BMP以预防骨流失及/或增加骨质量或治疗或预防纤维化(例如超过1mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、或15mg/kg)。在某些实施方案中,该制造物品包含容器或多个容器,该(等)容器包含经设计的BMP及标签及/或治疗或预防骨流失及/或增加骨质量或治疗或预防纤维化的使用说明。
本发明另详细描述于下列实验实施例。这些实施例是仅用于说明的目的,并无限制本发明的意图除非另外说明。因此,本发明不应被视为被下列实施例所限制,反而应被视为包含任何及所有因本文所提供的揭示而变得明显的变异。
实施例
实施例1
经设计的BMP蛋白的生产及纯化
利用哺乳动物细胞培养生产
生产及分泌野生型及经设计的BMP的重组宿主CHO细胞是利用标准重组DNA技术制备。条件培养基是由贴壁式细胞培养制备。简言之,CHO细胞被接种于含有10%dFBS的培养基中,允许细胞生长3至4天至近满状态。在此生长期后,生长培养基被丢弃,这些细胞以PBS-CMF润洗一次,接着被换至不合血清的添加200ug/ml硫酸葡聚糖、2mM丁酸钠及10mM HEPES的培养基。接着使细胞于31℃的温度下培养7天。收集条件培养基,并利用0.2uM无菌过滤使的澄清。储存该条件培养基于-20℃直到纯化。
经设计的BMP的纯化
为了要从CHO细胞条件培养基中纯化该新颖的经设计的BMP分子,该BMP是藉由二步骤的习用层析捕捉,结果如图5A至5D所示。本文仅显示BMPE的纯化细节,因为所有其他新颖的经设计的BMP是以实质上类似的方式纯化。
CHO条件培养基(CHO CM)(以1.0M Tris pH8.0将pH调整至8.0)被装载至经20mM MES pH8.0平衡的Ccllufine硫酸酯管柱(65ml,2.6x12.3cm)、该管柱是以10倍管柱体积(CV)的20mM Tris、pH8.0、10CV的50mM MES pH5.6及10CV的缓冲液A(6.0M尿素,50mMMES、pH5.6)冲洗。该BMP是经5CV的线性0至1.0M NaCl梯度洗脱(缓冲液B=6.0M尿素,50mM MES,1.0M NaCl、pH5.6)。当添加氯化钠梯度时,观察到导电度在30至45mS/cm之间为BMP2的特征的宽峰(图5A)。组分是由考马斯染色的SDS-PAGE胶体分析,汇合收集包含BMP的组分。在组分中的BMP被识别为在SDS-PAGE非还原胶体上的可还原二聚体(图5B的左图)。自该Cellufinc硫酸酯层析步骤汇合收集的BMP进一步利用制备型逆相HPLC纯化,使用10x250mm Vydac15μm C8管柱(溶剂A:0.1%TFA,溶剂B=90%乙腈,0.1%TFA),BMP在约32%乙腈时被洗脱出来。逆相层析步骤的图是如图5C所示。利用spccdvac离心浓缩机将该蛋白质浓缩及移除乙腈,该浓缩液经由透析被调制于MFR-169缓冲液。该经纯化的BMP藉由SDS-PAGE、A280及LAL试验(内毒素)加以特征化。显示该相同胶体组分(F13至F18)的非还原SDS-PAGE胶体(图5D的左侧)及还原SDS-PAGE胶体(图5D的右侧)的照片是经显示。总共16种经设计的BMP蛋白是经纯化至实质上相同程度的纯度,表达/纯化产量介于0.3至1.4mg/L CM,结果于图6的照片显示(图6)。简言之,野生型BMP2(WT)及经设计的BMP类BMPSE、BMPE、E109R、BMPD、BMPS85R、BMPSNE、BMPB及BMP-EN是显示于非还原胶体(图6A)及还原SDS-PAGE(图6B)的照片,经设计的BMP类ai(BMPA的变异体)、aii(BMPA的变异体)、c(BMPC)、hi(BMPI的变异体)、hii、i、f及g是显示于非还原SDS-PAGE(图6C)及还原SDS-PAGE(图6D)的照片。
实施例2
利用活体外及活体内试验显示经设计的BMP的成骨活性碱性磷酸酶试验
大约8000个C2C12细胞/孔于96孔盘是经该所示BMP的所示剂量的处理。在处理后24小时,这些盘是经处理以测量碱性磷酸酶,其为该领域公认的成骨活性测试。该培养基是经移除、以不合钙/镁的PBS清洗孔盘二次。在每孔中加入50μl的4-甲基伞型酮磷酸酯(4-MUP液体碱性磷酸酶受质:西格玛(Sigma)公司产品编号M3168),使该孔盘在暗处于37℃培养15分钟。在Victor冶光仪(设定:激发波长355nM:发射波长460nM:Cw灯能量为1120)上测量萤光,每孔1秒。在读取完成后,50μl的2倍蛋白质分析溶解缓冲液(200mM Tris-HCl、pH9.8/0.4%Triton X-100)被添加至各孔,该蛋白质浓度是利用BCA蛋白分析(皮尔斯(Pierce)公司)根据制造商的微量盘操作程序测定。接着该碱性磷酸酶测量值被正常化至该总蛋白浓度(即每微克的蛋白质的萤光单位)。如图7的折线图显示,相较于野生型BMP2的处理(小圆点粗线),C2C12肌原母细胞在经多种经设计的BMP分子处理后显示显著增加的碱性磷酸酶活性(其为成骨细胞分化的标记)。相较于WTBMP2展现增加的AP活性的经设计的BMP包括经设计的BMPA、BMPF、BMPG、及BMPE。令人意外的是,经设计的BMPE展现与野生型BMP2/6异二聚体(方点粗线)相同的活性,已知该野生型BMP2/6以高亲和性与BMP2的I型受体及BMP6的II型受体二者结合。经设计的BMPE是导入BMP6的低亲和性I型结合区域至BMP2的结果。该经设计的BMPE分子极高的活性非常令人意外,因为原本预期BMPE将以低亲和性与I型及II型受体二者结合。有趣的是,其他经设计的BMP分子如经设计的BMPA、经设计的BMPF及经设计的BMPG具有被导入BMP2中的与BMP6的II型(高亲和性)受体结合的野生型BMP6的区域(见图1B),这些经设计的BMP显示相较于BMP2增加的活性,但是不像野生型BMP2/6异二聚体那么高(图7)。
BRE萤光素酶试验
稳定表达BMP-反应-元件萤光素酶报道分子(元件来自Id1启动子)的C2C12细胞被以8000细胞/孔接种于96孔盘,并以该所示的BMP及剂量处理。在处理后48小时,该细胞被溶解并利用Promcga Dual-Glo试验试剂盒读取萤光素酶活性。
本文揭示的资料显示,BMPE的活性不仅在碱性磷酸酶试验中与BMP-2/6的活性相等,彼等在C2C12细胞的BRE萤光素酶试验中的活性亦为相等(如图8所示)。另外,BMPE相较于野生型BMP2在BRE萤光素酶试验中显示大约高出10至20倍的活性(图8)。因此,在BRE萤光素酶(BRE-luc)试验中观察到的结果与在此相同细胞类型中进行的碱性磷酸酶(Alk-phos)活性试验获得的这些结果有强烈相关性(比较图7及图8)。来自Alk-pbos及BRE-1uc二种试验的野生型BMP2及该所示的经设计的BMP的结果亦显示于表10。
虽然不希望被任何特定理论束缚,但这些资料显示添加ALK-2作为BMPE的高亲和性受体可能是彼的成骨活性增加的原因。这是因为ALK-2突变已被发现会造成进行性肌肉骨化症(FOP),一种幼童发生不当异位性骨形成的疾病。因此,ALK-2结合的突变是与成骨作用增加有关,且可能与BMPE的成骨活性增加有关。因此,BMPE是新类型的对I型受体ALK-2、3及6具有高亲和性的BMP分子。
细胞矿物化的茜素红染色
C2C12细胞以4x104cells/cm2的密度被接种于6孔组织培养盘,并于37℃的5%CO2/95%增湿空气培养器中隔夜培养。在回收期之后,该培养基是以新鲜制备的成骨分化培养基更换:含50ug/ml L-抗坏血酸磷酸酯(L-抗坏血酸磷酸镁盐水合物,和光纯药WAKO PureChcmical Industrics),产品编号013-12061)的生长培养基;β-甘油磷酸酯(β-甘油磷酸二钠盐,10mM五水合物,Fluka生化,产品编号50020);及100nM亚硫酸氢钠甲萘醌(维生素K3、西格玛(Sigma)公司,产品编号M25l8)。该所示的BMP以该所欲浓度被添加至适当孔槽.该盘是于37℃培养约15天,每隔2至3天更换一次培养基。细胞是遵照标准公开的程序以茜素红染色。
如下表9所示,经设计的BMPE所诱导的C3H10T-1/2小鼠间质干细胞的矿物化程度远高于对应的野生型BMP2,如茜素红染色所示。也就是说,如下更清楚地说明,在野生型BMP-2无法诱导C3H10T-1/2细胞矿物化的剂量(5、25、50及100ng/m1)下,BMPE同型二聚体诱导类似BMP-2/6异二聚体的强烈矿物化(如表9所示)。因此,该茜素红染色试验的结果进一步与先前所述的Alk-phos及BRE-luc试验所获得的结果相关。
表9
处理 | BMP2 | BMP2/6 | BMPE |
5ng/ml | - | - | - |
25ng/ml | - | ++ | + |
50ng/ml | - | ++++ | ++ |
100ng/ml | - | ++++ | +++ |
大鼠肌肉内异位骨试验
为了测定在活体外所观察到的该经设计的BMP较强成骨活性是否对应活体内的类似活性增加,进行大鼠异位骨形成试验。简言之,浸有在160微升缓冲液中的该所示总量的经设计的BMP的ACS(可吸收的胶原蛋白海绵)被植入8周龄Long Evans公鼠的大腿肌肉。具体地说,三个利用组织穿孔切割器取下的8mm ACS盘片利用不可吸收的丝线缝在一起。利用160微升的含有图9的图表所示的BMP的量(即0.1μg或0.5μg)的BMP溶液使该海绵湿润。使该润湿海绵于室温中平衡20分钟。接着手术置入该海绵于各鼠双侧的大腿肌肉中。每种BMP(野生型及经设计的分子)被置入4只大鼠的双腿。在植入后二周,这些动物被牺牲,大腿肌肉被切下并置于10%福马林中,利用μCT(Scanco公司)扫描以测定存在的异位骨的量。该经治疗的动物的肢体中存在的踁磷灰石的毫克量(mg HA)是于图9显示。图9A显示BMP2、BMPE及BMP2/6异二聚体的结果。图9B显示BMP2、BMPG、BMPA及BMPF的结果。以各种经设计的BMP而言,异位骨是于野生型BMP2无法形成可侦测的骨质量的剂量下形成。在野生型BMP2与经设计的BMPE的头对头比较中,BMPE所能诱导的异位骨形成和野生型BMP2/6异二聚体的程度类似,密切符合先前揭示的活体外实验所得到的结果。经设计的BMP如BMPG、BMPA及BMPF亦显示相较于野生型BMP2显著较高的异位骨形成(图9B)。此试验的结果是显示于图9及表10。
表10
名称 | Alk-phos | BRE-luc | 人鼠异位骨形成 |
BMP2WT | ++ | ++ | ++ |
BMPA | ++++ | ++++ | ++++ |
BMPB | ++ | ++ | ++ |
BMPC | ++ | ++ | ++ |
BMPD | ++ | ++ | ++ |
BMPE | ++++++ | ++++++ | ++++++ |
BMPF | ++++ | ++++ | ++++ |
BMPG | +++++ | +++++ | +++++ |
BMPH | ++ | ++ | ++ |
BMPI | +++ | +++ | +++ |
BMPJ | + | + | + |
BMPD-P | ++ | ++ | ++ |
BMP6-短 | ++++ | ++++ | ++++ |
实施例3
BMP受体结合
为了进一步阐明该经设计的BMP成骨活性增加的机转,利用Octet系统(ForteBio,Mcnlo Park,CA)进行每种经设计的BMP与各种BMP受体的结合动力学分析。该Octet QK分析是于含有O.1%Twccn-20的TBS中进行。样本是以1000rpm搅动。抗人IgG Octet尖端是以10 ug/mL的各种受体-人IgGl-Fc融合蛋白饱和20分钟,此通常导致在一排8支尖端内经饱和的受体的捕捉量。各种BMP是以7倍连续稀释(通常200-3 nM单倍)加缓冲空白液制备。各种受体/BMP结合对是经至少二次测试。结合是经10分钟的监测,分离至仅缓冲液中是经30分钟监测。动力学参数(kon及koff)及亲和性(KD)是利用Octet资料分析软体6.O计算,依照制造商的说明使用部分结合1:1模型。
在表12中的资料显示,野生型BMP2及BMP6蛋白分别显示预期的与I型受体(ALK-3及ALK-6)及II型受体(ActRIIA、ActRIIB及BMPRII)的高亲和性结合。野生型BMP2/6异二聚体展现与I型及II型二种受体的高亲和性结合,经设计的BMPG亦同,其中BMP2的II型结合结构域A及B已被野生型BMP6的结构域取代。经设计的BMPE如预期地显示和野生型BMP2类似的II型受体亲和性,因为在该II型结合区域中未发生突变。意外的是,具有BMP6的I型结合结构域以取代BMP2中的该位置的经设计的BMPE维持对I型受体ALK-3及ALK-6的高亲和性结合,同样意外的是其以2nm的KD与I型受体ALK-2结合。因此,BMPE意外地获得未见于野生型BMP2或野生型BMP6的非常高的与ALK-2的亲和性结合。
表12
如表13所示,结合BMPG及BMPE的突变(包含相对于如SEQ IDNO:1所示的野生型BMP2的氨基酸序列的氨基酸残基36处的脯氨酸或精氨酸(P36R))以分别生产BMP-GEP(亦称为BMPGE P36)及BMP-GER(亦称为BMPGE P36R),该生产的经设计的BMP对所有I型及II型BMP受体包括ALK-2显示高亲和性及低nM KD。
表13
因此,本文揭示的资料显示,新颖的经设计的BMP诸如但不限于BMP-GER及BMP-GEP结合BMP-G及BMP-E的特性,以使得这些新颖的经设计的BMP显示对广泛种类的I型及II型受体的高亲和性结合,包括但不限于ALK2、ALK3、ALK6、ActRIIA、ActRIIB及BMPRIIA。该资料进一步显示,取代wTBMP2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的残基编号36的脯氨酸成为精氨酸产生和其中该氨基酸未经取代的其他完全相同的BMP一样有效的经设计的BMP。这些新颖的成骨性BMP如BMP-GER所示,提供高量的生物活性因此允许较低剂量,在一些情况中更快速的成骨反应强烈显示这些分子将成为高度有效的治疗剂。
实施例4
非人灵长动物的活体内成骨活性
NHP腓骨切除模型
为了进一步评估本发明的新颖经设计的BMP的潜在治疗效力,经设计的BMPE及BMPG的活性是于NHP(非人灵长动物)腓骨切除模型中与野生型BMP2比较。
在平均体重(及标准差)7.5±0.2kg及年龄介于7至10岁的成年公马来猴(长尾猕猴(Macaca fascicularis)),以震动锯的1mm刀片进行双侧腓骨中段骨干切除。在先前描述的腓骨切除模型加上小型髓内K线(Kirschncr wire)固定,以维持近端与远端骨末端的对齐,以进行比较一致的扭转生物力学测试,此模型的二项主要优点在于因为该试验程序的低发病率因此能够利用双侧试验设计,及能够移除6至8-cm的包含该骨切除部位的腓骨区段以用于后续生物力学及组织学评估而无须牺牲该动物。含0.5mg/ml的野生型或经设计的BMP的500μL溶液被加至30mmxl5mm ACS海绵。在手术后将海绵包裹于缺损周围、骨成熟NHP的二支腓骨的大约2mm骨折是经ACS海绵包裹,该海绵包含0.5mg/ml剂量的经设计的BMP分子(共递送250μg),或在对侧肢的该相同量的野生型BMP2。因此,每只动物的一肢接受野生型BMP,对侧肢接受经设计的BMP。
在此模型中,选用经设计的BMPE及BMPG因为它们各自代表不同类型的经设计的分子,经设计的BMPG显示对I型及II型二种受体的高亲和性,而BMPE除了以高亲和性与I型受体ALK-3及ALK-6结合以外,还以高亲和性与I型受体ALK-2结合。每二周进行一次放射线摄影以比较各动物中以该经设计的BMP分子治疗的肢体的愈合与以野生型BMP2治疗的对侧肢的愈合。如图10A至10C所示,包括各组的7只动物的资料显示,相较于以野生型BMP2治疗的肢体中所观察到的骨形成,以各种经设计的BMP(图10A所示的BMPE及图10B至10C所示的BMPG)分子治疗的肢体的骨痂形成较早且较为强固。
下表14及15的资料提供在野生型BMP2治疗肢体与经设计的BMPE治疗肢体之间所观察到的骨质量及骨体积差异的定量评估。如图11所示、当与野生型BMP2治疗肢体的骨体积增加比较时,BMPE投予导致骨体积(mm3)平均增加33%、此μCT分析包括所有具有骨痂的天然骨,因此在相同动物中BMP-E是远比BMP-2更为有效。
表14
表15
以精氨酸取代相对于野生型BMP2的P36不影响BMPGE的活性
在相对于野生型BMP2如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的位置36处的脯氨酸被声称是授与Noggin抗药性的重要残基,并提供野生型BMP2增加的成骨活性(见例如WO2009/086131)。因此,为了评估以非保守性氨基酸取代替换P36对该BMPGE的新颖活性的影响,BMPGEP的P36是经突变为精氨酸以产生BMPGER并于活体外评估这二种经设计的分子的成骨活性。图12所揭示的资料显示,以精氨酸取代P36(P36R)不会影响这些新颖的BMP-GE设计的BMP的结合亲和性,且BMPGEP及BMPGER是和BMP2/6异二聚体一样有效。
BMP-GER具有和BMP2/6异二聚体相同的活体内活性如图13及14所示,大鼠异位实验显示,BMP-GER在非常低剂量的0.25ug总BMP的所有分子皆在ACS海绵上递送时,与BMP-2/6一样有效地驱使异位骨形成。图13显示,只有BMP-2/6及BMP-GER(不包括BMPE或BMPG)在此低剂量下具有显著高于BMP-2的活性,其中在异位形成的HA的毫克数是以μCT分析定量。
该相同样本经去矿物化处理,并由组织学评分骨形成(骨得分),结果显示于图14。此评分方法显示,低剂量递送0.25ug的BMP-2不具骨形成,BMP-GER及2/6具有最高得分。BMP-G及BMP-E的活性亦显著高于BMP-2,但不似BMP-GER的有效。
于活体内成骨及组织修复模型中比较BMP-GER及BMP-2图15及16显示严重NHP腓骨切除模型的结果,其比较BMP-2及BMP。GER的活性。在此模型中,移除NHP的每支腓骨宽度约4至6mm的楔形骨,再放回原位并以鈇钉固定。该缺损接着以含有250ug总BMP(剂量为0.5mg/m1)的ACS海绵包裹。在每只NHP中,一肢接受BMP-2及对侧肢接受BMP-GER。图15A显示在第5周拍摄的放射影像,其显示6只动物中4只的缺损。该BMP-GER肢体相较于BMP-2肢体显示显著较多的骨形成。图15B(该图的下排)显示该相同的4只动物在第10周牺牲后的腓骨的μCT影像。可见的是,在BMP-GER肢体中的骨形成的量是远高于以BMP2治疗的对侧肢。
图16A至C显示比较每只动物的BMP-2及BMP-GER治疗肢体的强度、硬度及骨痂骨体积的肢体比较分析。平均来说,相较于对侧的BMP-2治疗肢,BMP-GER治疗肢需要高出21%的扭力才能折断(图16A),硬度高出24%(图16B),骨痂体积平均高出55%(图16C)。所有这些比较以成对分析显示小于.01的p值。这些资料显示在相同动物中,BMP-GER相较于BMP-2显著较早且更有效地诱发骨折修复及骨形成。
BMP-GER于NHP模型中以3倍较低的剂量诱导相当于BMP-2的骨形成
为了进一步于NHP中评估BMPE骨形成的有效性,BMPE在楔形缺损试验中诱发成骨作用的能力是与BMP2的该能力比较。图17A至C显示三只非人灵长动物在楔形骨缺损模型后的骨形成的放射影像,其中1.5mg/ml的BMP-2被用于一肢,仅0.5mg/ml的BMP-GER被用于另一肢,使用以磷酸钙骨水泥为基底的载剂,在放射线学上,每只动物的愈合及骨形成皆相等,不论该治疗是高剂量的BMP-2或较低剂量的BMP-GER、因此,即使使用三分的一的剂量,BMP正在诱导骨形成的效果上与BMP2相等,这显示此经设计的BMP的活性相较于野生型BMP2显著较高。
实施例5
BMP结构分析
结晶化BMP-2及BMP-6分别于哺乳动物细胞中生产的经纯化.全糖基化的野生型BMP2/6异二聚体、野生型BMP2/2同型二聚体及野生型BMP6/6同型二聚体是于10mM醋酸钠中(pH3.5)经浓缩至6至10mg/ml,结晶化是利用“mosquito”自动化机器人设备于18℃进行(TTPLabTcch Inc.Cambridgc,MA)。先获得每个二聚体的初始结晶阳性物,接着最佳化结晶条件以得到良好绕射品质的晶体。
野生型BMP2/6、BMP2/2及BMP6/6的晶体被暂时冷冻保护,在以同步加速器光源(先进光子源(Advanced Photon Sourcc)SER-CAT的ID射束线)收集X光绕射资料之前于液态氮中冷冻。资料是利用Mosflm/Scala程式处理及按比例计算以推导出正确的晶体品格类型及积分/比例资料。解析度及单位晶胞参数列示如下:BMP2/6属于P43212的空间群,每个非对称单位有二个异二聚体;在一方向的绕射解析度达另二方向达单位晶胞参数为α=β=γ=90°。BMP2/2属于P31的空间群,每个非对称单位有二个同型二聚体;绕射解析度达单位晶胞参数为α=β=90°,γ=120°。BMP6/6属于P3121的空间群,每个非对称单位有一个同型二聚体;绕射解析度达单位晶胞参数为α=β=90°,γ=120°。由于BMP2/6晶体的异向绕射特性,该资料是经椭球性截短及异向性比例计算以保留高解析度资料的贡献。
CHO BMP2/6、BMP2/2及BMP6/6的结构是使用Phaser程式由分子置换方法测定,利用E coli BMP2(PDB登录号:1REW)及E.coliBMP6(PDB登录号:2R52)作为搜寻模型。在获得正确分子置换解法及证实空间群后,由Phascr计算的电子密度图被用于评估该搜寻模型的品质,将有问题的区域(特别是与I型及II型受体结合有关的区域)自原始模型剥离以用于重建以避免模型偏差。
该结构模型经过刚体优化,之后进行模拟退火法、位置及温度因子优化。被剥离的区域利用omit图重建,该过程随着TLS优化而重复直到优化稳定。最终优化的统计数据如下:以BMP2/6而言,Rw/Rf、0.2231/0.2775、rmsd键=0.008、rmsd角=1.545:以BMP2/2而言、Rw/Rf、0.2114/0.2659、rmsd键、0.005、rmsd角=0.982;以BMP6/6而言,Rw/Rf、0.2170/0.2510、rmsd键、0.006、rmsd角=1.182。所有三种结构根据Prochcck结果皆呈现非常好的几何形状。
CHO BMP2/6晶体结构显示广泛的糖基化。特别是,由CHO生产的BMP2之前螺旋环是I型受体的重要结合模体,其与大肠杆菌(E.coli)生产及再折迭的BMP2的对应区域不同。当糖基化存在时,该CHOBMP2环相较于经细菌再折迭的BMP2的相同区域具有独特的“多环”构型,其更为螺旋(Keller et a1.,Nat Struct Mol Biol11:481-488(2004))、该资料显示CHO生产的BMP2的D53指向该受体界面、而H54远离该受体,如图3A所示。在E.coli BMP2中,该D53远离该受体且该H54朝向该受体排列(在本文被称为“组氨酸门挡”),其如图3B所示的交迭在该BMP2I型受体Alk3上的脯氨酸残基(P45)(H54另外被标记为H336)。不希望被任何特定理论束缚,但此交迭可能防止该I型受体与E.coli再折迭的BMP2完全结合,因此解释E.coli BMP2相较于CHO BMP2的降低结合活性。此结构特色是以图3A至B表示。在此图中,组氨酸54(H54)被编号为H336,天冬酰胺56(N56)被标记为N338,ALK3的P45是以深灰色显示。
如图4所示,完全糖基化的CHO BMP6亦具有指向该受体结合部位的此“门挡”组氨酸残基。此门挡His结构模体是BMP中常见的结构特色(不包括CHO BMP2)(见例如Keller et a1.,Nat Struct Mol Biol11:481-8(2004);Kotzsch et a1.,EMBO J28:937-47(2009)。不希望被任何特定理论束缚,CHO BMP2的特定聚糖可能是经由多个氢键与精氨酸16连接(“该聚糖系链基”亦被命名为R298)。此聚糖系链基是显示于图4A,其与该聚糖的交互作用是利用该聚糖与此系链基R298之间的虚线表示,该系链基R298在本文亦被称为R16。因此,虽然不希望被任何特定理论束缚,但该聚糖系链基可能被用来稳定该BMP2分子之前螺旋环的构型,以使该组氨酸门挡(若另外存在的话)反过来朝向远离该I型受体界面的方向,由此允许该配体以大于该组氨酸门挡存在时的范围与该受体接触。换言的,在CHO BMP2中观察到的组氨酸门挡的重新导向最有可能是聚糖系链基的结果。不希望被任何特定理论束缚,本文揭示的资料显示、当该组氨酸门挡存在时,在缺乏糖基化时移除该门挡(即藉由导入改变His的方向性以远离该受体界面的突变)增加该BMP配体与该I型受体的结合。
经设计的BMPE(包含低亲和性的BMP2的II型结合结构域及低亲和性的与BMP6类似的I型结合结构域)显示(1)在活体外及活体内二种试验中增加成骨活性:及(2)不预期地获得与I型受体Alk2结合的功能,虽然具有低亲和性的I型受体结合结构域。不希望被任何特定理论束缚,此意外的发现有可能是由在该聚糖基团与该BMPE的I型受体结合结构域的R16(“聚糖系链基”)之间形成的多个氢键所媒介。此系链交互作用可能媒介在该BMPE分子之前螺旋区域的结构重排,藉由使H54(“门挡”)的位置远离该界面以允许该BMP与该受体之间更靠近的交互作用,以呈现适当的Alk2结合界面。相反地,如图4B所示,BMP6(亦具有和BMPE类似的低亲和性I型结合结构域)不与Alk2结合,因为彼的需要系链彼的聚糖基团的“聚糖系链基”(R413)与该BMPE系链基(R298/R16)相比时有位置的移动。因此在BMP6中,该聚糖不被系链,且该门挡(H454)并不位于远离该配体一受体界面。该“聚糖系链基”似乎是野生型糖基化BMP2的独特现象(以在CHO细胞中生产的BMP2为例),藉由导入(或移除)“聚糖系链基”以使BMP之前螺旋环结构重构现可首次被使用以调节其他BMP的I型受体结合能力。因此,本领域技术人员现有了本发明所提供的揭示,将能了解如何藉由导入突变使该H54远离或藉由影响该聚糖系链基以使该系链媒介H54的位移,使该BMP产生突变以使该门挡远离该受体界面,另外将了解这些揭示可被用于设计具有增加(或减少若突变导入使H54进入门挡位置)与彼的受体结合的BMP,或产生具有获得功能突变的经设计的BMP以使它们与本来不结合的新颖受体结合。如以下更详细地说明,本发明显示如何使用此新颖的门挡/系链设计方法以设计经改善的成骨蛋白。因此,本发明提供新的合理设计经改善的成骨蛋白的方法,该成骨蛋白包含经改变的受体结合。
为了更清楚地了解导致BMP-E及BMP-GER与ALK-2结合的原因,及进一步阐述此利用门挡/聚糖系链基影响受体结合的新颖机转、BMP-E的晶体结构被解出并与BMP-2及BMP-6的晶体结构比较。主要结构发现是显示于图18及19。如图18所示,BMP-E维持BMP-2的有次序的糖,同时维持BMP-6的中心螺旋结构。图18所示的结构显示BMP-E(可能还有BMP-GER)是与BMP-2及BMP-6二者在I型受体结合的关键区域中不同。图19是比较BMPE(浅灰)与BMP6(深灰)的潜在His门挡周围区域的放大图。该图显示该二个分子中组氨酸及天冬酰胺的排比类似性,亦显示聚糖位置的差异及显示由R16(系链基)系链该BMPE聚糖,该R16亦造成更坚固的聚糖构型,以使BMPE在分析时显像较长的聚糖,相较于BMP6所显像的较短聚糖(深灰)。
为了测定BMP-E的聚糖是否造成与ALK-2的交互作用及彼的较高活性,BMP-2、BMP-6及BMP-E是经EndoH处理以剪切该糖为二个GlcNac单位。BMP-E对ALK-2的结合亲和性下降至400nM,然而其对ALK-3及ALK-6的亲和性仍在3至6nM的范围,因此显示该完整糖对此交互作用极为重要。此去糖基化突变体的活性亦显著降低。如图20所示,此实验中经Endo H处理的去糖基化BMP-E的活性向右移动,几乎等于BMP-6WT。该EC-50自3nM移至大约50nM。这些资料显示BMP-E的糖是彼的活性所必须,此应适用于BMP-GER因为其具有完全相同之用以取代BMP-2的BMP-6区域,只有该指状结构域不同。由于该糖是增加受体结合及成骨活性所必须,这些结果显示在E.coli或任何其他缺乏糖基化的系统中生产BMP-E或BMP-GER将无法产生活性高于BMP-2WT的BMP。
结晶化BMP-E及BMP-GER
经纯化、全糖基化的BMP-E是于25mM醋酸钠中(pH3.5)经浓缩至8.7mg/ml,结晶化是利用“mosquito”自动化机器人设备于18℃进行(TTP LabTcch Inc.,Cambridge,MA)。先获得每个二聚体的初始结晶阳性物,接着最佳化结晶条件以得到良好绕射品质的晶体。
BMP-E的晶体被暂时冷冻保护,在以同步加速器光源(先进光子源(Advanccd Photon Sourcc)SER-CAT的ID射束线)收集X光绕射资料之前于液态氮中冷冻。资料是利用CCP4套装软体中的Mosflm/Scala程式处理及按比例计算以推导出正确的晶体品格类型及积分/比例资料。解析度及单位品胞参数列示如下:BMPE属于P43212的空间群,每个非对称单位有二个BMPE;绕射解析度达单位晶胞参数为α=β=γ90°。
BMPE的结构是使用Phascr程式由分子置换方法测定,利用皆在辉瑞(Pfizcr)药厂测定的完全糖基化的CHO BMP2及BMP6作为搜寻模型。在获得正确分子置换解法及证实空间群后,由Phaser计算的电子密度图被用于评估该搜寻模型的品质,将有问题的区域(特别是在I型受体结合及糖基化周围的区域)自原始模型剥离以用于重建以避免模型偏差。
该BMPE的结构模型经过刚体优化,之后利用Phenix程式进行模拟退火法、位置及温度因子优化。被剥离的区域利用。mit图重建,该过程随着TLS优化而重复直到优化稳定。最终优化的统计数据如下:Rw/Rf=0.2252/0.2840,rmsd键=0.006、rmsd角=0.935。该结构根据Prochcck结果呈现非常好的几何形状。
BMPE是一种经设计的分子,其中BMP2的残基44至80被来自BMP6的对应区域取代,其维持BMP2的整体骨架但具有BMP6的I型受体结合区段。如图21所示,该晶体结构显示该移植区段仍保留在BMP6中的类似构型,在前螺旋环中形成小型螺旋,其中该“门挡”H54指向该受体。然而,虽然不希望被任何特定理论束缚,有可能因为在R16及E110*(BMP-2的E109)处有“聚糖系链基”存在,此二者与第三及第四聚糖基团(分别为β-甘露糖及α-甘露糖)形成多个氢键,该延伸的糖基化链是附着于该蛋白表面,正如CHO BMP2所示。该聚糖链的系链亦使该前螺旋环相较于该整体骨架移位约不希望被任何特定理论束缚,可能意外发现该类BMP6前螺旋环与该类BMP2糖基化的组合表达用于Alk2受体的结合表位,该Alk2受体通常不与BMP2或BMP6交互作用。去糖基化使BMPE无法与Alk2结合,此强调糖基化媒介BMPE的Alk2辨识的重要性。
实施例6
Noggin抗药性
为了探讨对经分泌的BMP抑制剂Noggin的抗药性是否能增加BMP-GER或BMP-E的活性、这些潜在治疗分子被进一步修饰以可能地增加彼等对Noggin的抗药性。最近,研究指出在E.coli生产的蛋白质中,将活化素A的C端部分并入野生型BMP2增加对Noggin抑制的抗药性。见WO2010/099219的例如图15及16。因此,为了测定本发明所揭示的新颖经设计的蛋白质是否能藉由并入活化素A序列而更进一步地改善,以该Noggin抗药性(NR)氨基酸序列取代BMP-E(SEQ IDNO:12)及BMP-GER(SEQ ID NO:37)以产生BMP-E-NR(SEQ ID NO:70)及BMP-GER-NR(SEQ ID NO:71)。如图22所示,BMP-E-NR及BMP-GER-NR在碱性磷酸酶活性试验中具有和BMP-E及BMP-GER相同的活体外活性,且具有对Noggin的完全抗药性,然而BMP-E及BMP-GER则对Noggin敏感。
为了了解由BMPE-NR及BMP-GER-NR在活体外显示的Noggin抗药性的可能基础,评估这些分子对II型活化素受体ActRIIB的结合亲和性。如下表16所示,活化素A无法与Noggin结合,但Noggin抗药性BMP-E-NR及BMP-GER-NR可与Noggin结合,但亲和性不像BMP-2、BMP-E、或BMP-GER那么高。这些资料亦显示这些Noggin抗药性BMP以极高的亲和性与II型BMP受体ActRIIB结合,甚至高于BMP-GER的亲和性。在不希望被任何特定理论束缚之前提下,这些资料指出BMP-GER。NR及BMP-E-NR对于Noggin的抗药性是因为彼等对BMPII型受体的亲和性远高于对Noggin的亲和性,因此即使在高量的Noggin存在时仍能与BMP受体结合。
表16
虽然包含活化素A的Noggin抗药性部分的BMP-E及BMP-GER分子在活体外显示Noggin抗药性,这些结果并不关于改善的活体内活性。也就是说,当在大鼠异位试验中比较这些BMP-E-NR及BMP-GER-NR的成骨活性与BMP-E及BMP-GER的成骨活性时,这些NR分子的活性远远较低。此资料是显示于图23及24。更具体地说,当比较所有测试浓度(0.125μg、0.25μg、0.5μg及1.0μg)的BMP-GER及BMP-GER-NR的骨得分时,BMP-GER的表达显著优于BMP-GER-NR(如图23所示)。类似地,图24显示BMP-E在此活体内试验中的骨得分远高于BMP-E-NR。因此,就BMP-E及BMP-GER而言,该据称为Noggin抗药性的版本在活体内的活性远低于彼等的NR(Noggin抗药性)相对物,在BMP-E的例中,几乎所有活体内活性皆因并入活化素A的序列而丧失(见图24比较BMP-E-NR与BMP-E)。
这些资料显示,并入可能授与Noggin抗药性的序列虽然增加与某些II型受体(例如ActRIIB)的结合,但并不增加该经设计的BMP的活体内成骨活性。
另外,虽然添加Noggin并不促进该经设计的BMP于活体内的成骨活性,事实上其似乎降低彼等的活体内活性,但即使不具有活体外的Noggin抗药性,本发明的新颖经设计的BMP相较于野生型BMP显示大幅增加的成骨活性,并提供可能用于各种广泛应用的潜在新颖治疗剂、因此,本发明的经设计的BMP提供优异的新颖潜在治疗剂,其(除其他用途外)在骨增量及修复上显示大幅提升的临床特性。
本发明引述的各项专利、专利申请案及公开资料的揭示内容现以参照方式整体纳入本发明。
虽然本发明已参照特定实施方案加以揭示,显而易见的是,本发明的其他实施方案及变异可由该领域的其他技术人员设计而不背离本发明的真实精神及范围。该随附的权利要求是意图被视为包括所有这些实施方案及对等变异。
Claims (26)
1.经设计的BMP蛋白,其在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于相应的野生型BMP与I型或II型受体的结合,所述突变赋予经改变的与I型或II型BMP受体的结合。
2.权利要求1的蛋白,其中所述蛋白选自BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8和BMP9。
3.权利要求1的蛋白,其在下列结构域内包含至少一种突变:
a.II型结合结构域A;
b.II型结合结构域B;
c.I型结合结构域;及
d.上述结构域的任何组合。
4.经设计的成骨蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于野生型BMP2与所述I型或II型受体的结合,所述突变赋予经改变的与所述I型或II型BMP受体的结合。
5.权利要求4的蛋白,其中所述突变选自:
a.在II型结合结构域A内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:1序列的V33、P36、H19和F41处的突变;
b.在II型结合结构域A内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:1序列的V33I、P36K、P36R、H39A和F41N;
c.在II型结合结构域B内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:1序列的E83、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99处的突变;
d.在II型结合结构域B内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:1序列的E83K、S85N、M89V、L92F、E94D、E96S、K97N和V99I;
e.在I型结合结构域内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:1序列的H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77和V80处的突变;及
f.在I型结合结构域内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:1序列的H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P和V80A的突变。
6.权利要求4的蛋白,其中该蛋白包含选自如下的多种突变:
a.对应于SEQ ID NO:1序列的H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77和V80的各个氨基酸处的突变;
b.(a)的蛋白,其中所述多种突变是H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P和V80A;
c.对应于SEQ ID NO:1序列的V33、P36、H39、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99的各个氨基酸处的突变;
d.(c)的蛋白,其中所述多种突变是V33I、P36K、H39A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N和V99I:
e.对应于SEQ ID NO:1序列的V33、P36、H39、H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77、V80、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99的各个氨基酸处的突变;
f.(e)的蛋白,其中所述多种突变是V33I、P36K、H39A、H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P、V80A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N和V99I;及
g.(e)的蛋白、其中所述多种突变是V33I、P36R、H39A、H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P、V80A、S85N、M89、L92F、E94D、E96S、K97N和V99I。
7.权利要求1的蛋白,其中所述蛋白以不超过约2nM的KD与ALK2受体结合,所述蛋白以不超过约2nM的KD与ALK3受体结合,所述蛋白以不超过约1nM的KD与ALK6受体结合,所述蛋白以不超过约2nM的KD与ActRIIA受体结合,所述蛋白以不超过约0.5nM的KD与ActRIIB受体结合,且所述蛋白以不超过约3.5nM的KD与BMPRIIA受体结合。
8.权利要求1的蛋白,其还包含不位于I型或II型结合区内的l、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。
9.经设计的成骨蛋白,其选自包含SEQ ID NO:8至73中的任意氨基酸序列的蛋白。
10.经设计的成骨蛋白,其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
11.经设计的成骨蛋白,其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
12.经设计的成骨蛋白,其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
13.经设计的成骨蛋白,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
14.生产权利要求1的蛋白的方法,所述方法包括将编码所述蛋白的核酸导入宿主细胞中,在生产所述蛋白的条件下培养所述细胞,以及纯化所述蛋白。
15.权利要求14的方法,其中所述核酸包含选自SEQ ID NO:74至139中的任一核酸序列的序列。
16.经设计的BMP6蛋白,其包含氨基酸序列,所述氨基酸序列在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变,其中相较于野生型BMP6与I型或II型受体的结合,所述突变赋予经改变的与I型或II型BMP受体的结合。
17.权利要求16的蛋白,其中所述突变选自:
a.在II型结合结构域A内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:4序列的I57、K60、G61、A63、N65、Y66和D68处的突变;
b.在II型结合结构域B内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:4序列的K108、N110、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123和I124处的突变;
c.在I型结合结构域内的突变,其中所述突变是至少一种选自如下的突变:对应于SEQ ID NO:4序列的S72、N76、A77、H78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99和P100处的突变;
d.对应于SEQ ID NO:4序列的I57、K60、G61、A63、N65、Y66和D68处的各个氨基酸残基的突变;
e.对应于氨基酸序列SEQ ID NO:4的K108、N110、A111、V114、F117、D119、N120、S121、N122、V123和I124处的各个氨基酸残基的突变;及
f.对应于氨基酸序列SEQ ID NO:4的S72、N76、A77、H78、M79、N80、A81、N83、V87、T89、H92、L93、M94、N95、P96、E97、Y98、V99或P100处的各个氨基酸残基的突变。
18.权利要求16的蛋白,其还包含不位于所述I型或II型结合结构域内的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。
19.分离的核酸分子,其包含编码选自SEQ ID NO:8至73的氨基酸序列的核苷酸序列。
20.权利要求19的核酸,所述核酸编码包含氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的序列。
21.分离的核酸分子,其包含选自SEQ ID NO:74至139的核苷酸序列。
22.权利要求21的核酸,所述核酸包含选自SEQ ID NO:78、SEQID NO:80、SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103的序列的核苷酸序列。
23.生产权利要求16的蛋白的方法,所述方法包括将编码所述蛋白的核酸导入宿主细胞中,在生产所述蛋白的条件下培养所述细胞,以及纯化所述蛋白。
24.治疗有需要的患者中与骨流失相关的骨疾病的方法,所述方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1的经设计的成骨蛋白,由此治疗所述患者中的骨疾病。
25.治疗有需要的患者中纤维化的方法,所述方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1的经设计的成骨蛋白,由此治疗纤维化。
26.诱导组织中的骨形成方法,所述方法包括将所述组织与权利要求1的经设计的成骨蛋白接触,由此诱导所述组织中的骨形成。
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