CN1032436A - 生物学生产酰胺的方法 - Google Patents

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Abstract

在用来源于微生物的腈水合酶作用下将腈水合 成相应酰胺的生物学生产方法中，其改进在于所用的 腈水合酶是从有钴离子存在下培养玫瑰色红球菌种 微生物得到的。
如氰基吡啶的芳香族腈及如丙烯腈的脂肪族腈 均可水合成相应酰胺。

Description

本发明是关于在来源于微生物的腈水合酶作用下将腈水合为相应酰胺的方法。更确切地说，本发明是关于其特征在于所用的微生物的生物学生产酰胺的方法及生产腈水合酶的方法。
通过水合诸如：丙烯腈等一种腈生产如丙烯酰胺的低级脂肪族酰胺已有很多酶作用的水合方法，诸如用微生物生产的腈水解酶或腈水合酶（见如：日本专利公开N.21519/87，美国专利N，4，001，081未审查公开日本专利申请NOs    162193/86和91189/87，EPC    NOs.188316和0204555;和日本专利公开NOs.17918/81和37951/84，美国专利NOs.4，248，968和4，637，982）。这些生物学生产酰胺的方法已经工业应用，特别是生产丙烯酰胺的优越方法已引起了人们的注意。
有很多微生物被建议用作生物生产酰胺的微生物。在本发明研究前的这些微生物虽然可有效水合低级脂肪腈，但对芳香腈并不总是有效的。因此，通过水合3-氰基吡啶水合生产菸酰胺产率太低，所以还不能用于工业生产。
已知先有技术是在有铁离子或锰离子存在下培养微生物。这个技术也用于生物学生产酰胺，在有铁离子参与下培养红球菌属（Rhodococcus）微生物的例子在未审查公开日本专利申请N.162193/86和91189/87中已有叙述。
作为本发明人的研究结果发现一种来自假单胞菌属的细菌的腈水合酶，在其活性中心中含Fe+++，因此培养基中铁离子的存在对该微生物的培养是必需的。在上述已知例子中可预见用于红球菌属微生物的培养基中的铁离子是生产腈水合酶所必需的。
本发明是基于下面发现而完成的，即红球菌属的一个特定株，玫瑰色红球菌种的J-1株在含铁离子培养基中不产生腈水合酶而在含钴离子培养基中则产生腈水合酶;而这样生产的腈水合酶可用芳香族腈作底物，将其转化为酰胺。
根据本发明生产酰胺的方法是生产酰胺的生物学方法，其中腈是通过来源于微生物的腈水合酶的作用水合成相应的酰胺，其特征在于该腈水合酶是通过钴离子存在下培养玫瑰色红球菌微生物得到的。
根据本发明，虽然在含铁离子的培养基中没有腈水合酶活性，但在含钴离子培养基中其活性增大。但令人意外的是这种特定微生物的腈水合酶的增长很大程度上取决于培养基中金属离子的类型。
此外，根据本发明有利于芳香腈的水合。本发明的用途特别由于菸酰胺而显得重要，它是3-氰基吡啶的水合产物，可作合成维生素的原料，而吡嗪酰胺是氰基吡嗪的水合产物，可用作抗结核药。
1.生物学生产酰胺方法的总构思
本发明是关于在来源于微生物的腈水合酶作用下将腈转化成相应酰胺的方法，该方法基本上包括培养一种微生物，诱导腈水合酶，使该酶作用于底物腈。
这些步骤本身作为单元操作是已知的，在本发明中是以它们合适的形式应用的。“在有钴离子存在下培养微生物得到腈水合酶”这种表达方式是把诱发腈水合酶看作一个天然的前提。
本发明的前提“在来源于微生物的腈水合酶作用下将腈水合为相应酰胺的方法”包括任何合适的实施方案或导致腈水合酶作用于腈的各种方法的修饰。作为一种实施方案，有一种收集由微生物产生的酶的方法，和用该酶作酶制品的方法。这种将该酶以酶制剂方式用于腈水合酶的方法也应理解为属本发明“生物学方法”范畴。
2.水合反应的细节
1）微生物
用于本发明的微生物是玫瑰色红球菌种的微生物，该种的代表菌株为J-1株。
J-1株的细节如下：
（1）来源和保藏
菌株J-1是从日本京都Sakyo-ku的土壤中取得的样品，作为国际保藏物（根据国际承认为专利程序保藏微生物的布达佩斯条约）保藏在日本工业科技机构所属的发酵研究所，贮藏号为FERM    BP-1478。
（2）细菌学特性
（a）形态学
1细胞形态和大小：0.9-1.0μ×3-10μ。
2.细胞的多形性：初始培养阶段为长棒状，迅速生长时呈弯曲状，然后分裂成短杆菌。
3.游动性：无
4.芽孢：无
5.革兰氏染色：阳性
6.抗酸性：阴性
7.异染颗粒细胞：已测到
（b）不同培养基中的生长状态（30℃）
1.肉汤琼脂平板培养：直径1mm的环状（48小时），不规则和光滑，表面相当干燥，扁平，不透明，淡桔红-粉色。
2.肉汤琼脂斜面培养：平滑表面相当干燥的念珠状，轻度突起部分尤其干，呈淡桔红-粉色。
3.肉汤液体培养：繁茂生长，形成菌膜，中度混浊，随着生长形成沉淀。
4.肉汤明胶穿刺培养：表面生长良好，沿穿刺部分呈园锥形，但在底层不是此状，明胶中无液化现象。
5.石蕊乳：无变化。
（c）生理学性质
1.还原硝酸盐：阳性
2.反硝化：阴性
3.甲基红（MR）试验：阴性
4.VP试验：阴性
5.吲哚形成：阳性
6.硫化氢形成：阳性
7.淀粉水解：阴性
8.柠檬酸利用：Kocur培基阴性
Christenson培基阳性
9.利用无机氮源：硝酸盐阳性
铵盐阳性
10.成色反应：阳性
11.脲酶：阳性
12.氧化酶：阴性
13.过氧化氢酶：阳性
14.纤维素水解：阴性
15.生长范围：pH5-10，温度10-41℃。
16.对氧的需要：喜氧气
17.分解酪氨酸：阳性
18.分解腺嘌呤：阳性
19.磷酸酯酶：阳性
20.水解吐温80：阳性
21.O-F试验：阴性
22.抗热性（在10%的脱脂乳中，72℃，15分钟）：无
23.由糖产酸和气体：
酸气
L-阿拉伯糖    -    -
D-木糖    -    -
D-葡萄糖    +    -
D-甘露糖    -    -
D-果糖    +    -
麦芽糖    +    -
蔗糖    +    -
乳糖    -    -
海藻糖    -    -
D-山梨醇    +    -
D-甘露醇    +    -
甘油    +    -
+：阳性;-：阴性
24.在单一碳源中生长
肌醇    -
麦芽糖    +
D-甘露醇    +
鼠李糖    -
D-山梨糖    +
间-羟基苯甲酸    +
已二酸钠    +
苯甲酸钠    +
檬檬酸钠    +
乳酸钠    +
睾丸酮    +
L-酪氨酸    +
甘油（1%）（w/v）    （+）
海藻糖    （+）
对-羟基苯甲酸（1%）（w/v）    +
+：阳性，-：阴性，（+）;轻度阳性。
25.脂肪酸和细胞壁;含不饱合和饱合的直链脂肪酸和结核硬脂酸。分枝菌酸的薄层层析产生一个单斑。
按照Bergy的系统细菌学手册作为上述细菌学性质的分类结果，J-1菌株是一个好气，革兰氏阳性，弱抗酸，过氧化氢酶阳性和不生成内芽孢的杆菌，它不插入鞭毛。它在生长初期呈类似菌丝体的加长杆菌形，分枝生长，然后分裂成短杆菌。因此它被认为属于诺卡氏（Nocardia）类型细菌。
脂肪酸组分分析表明该菌含不饱和和包括结核硬脂酸的饱和直链脂肪酸。分枝菌酸的薄层层析分析得到一个单斑，其Rf值与标准玫瑰色红球菌（IFO3338）的Rf值相同，从而可与分枝杆菌属（Mycobacterium）分开。也由于其分枝菌酸组成（碳原子数）不同而与诺卡氏菌区分开。其它生化性质试验结果证实该细菌为玫瑰色红球菌。
微生物都倾向于突变，因此，不用说J-1株本身，即使是有效菌株J-1的突变体，只要它在有钴离子存在下培养能生成腈水合酶就可用于本发明。
2）底物/腈
如上所述微生物生产的腈水合酶将嬗米鞯孜铮庑╇媸欠枷阕澹咀宓ル婊蛩妫乇鹗堑ル妗?
最具有本发明的特征的腈是芳香族腈，特别是由4-10个碳原子组成其芳香环的芳香腈。典型的例子是由下面[Ⅰ]-[Ⅵ]通式表示的：
Figure 881067350_IMG4
它们中典型的化合物是4-，3-，和2-氰基吡啶。
其中R1-和R2-分别代表H，CH3，OH，OCH3，Cl，F，CN，NH2或NO2。
它们中典型化合物是苄腈，邻-，间-，和对-氯苄腈，邻-，间和对-氟苄腈，邻-，和间-硝基苄腈，对-氨基苄腈，邻-间和对-苄基氰，4-氰基苯酚，茴香腈，邻苯二甲腈，异邻苯二甲腈，对苯二腈，2，6-二氯苄腈，2，4-二氯苄腈和2，6-二氟苄腈。
Figure 881067350_IMG6
它们中的典型化合物是α-和β-萘甲腈。
其中X代表S或O
它们中的典型化合物是2-苯硫腈和2-氟腈。
Figure 881067350_IMG8
它们中的典型例子是5-氰基吲哚
它们中的典型例子是氰基吡嗪。
构成本发明对象的另一组腈优选的是脂肪族腈，较好的是具2-6个碳原子的单或双腈，最好为单腈。从生成酰胺的用途来判断，丙烯腈是典型的并具有良好的产率。
这些相应于腈的酰胺是由于将腈的氰基转化为酰胺基而得到的。在二腈情况下，至少有一个氰基转化为酰胺基。
3）腈水合酶的培养和生产
玫瑰色红球菌种的微生物的培养在钴离子存在于培养基的情况下可以于任何适宜的条件下进行。通常的作法是向培养基中加入随后将详述的一种酶诱导剂，以便使腈水合酶在细菌细胞内积聚。
（1）基础培养基
适合的培养基的例子阐述如下，本领域的普通技术人员能很容易地改变下述各成分的剂量，以另一种物质替换某成分，去除某些成分或加入某些成分等操作。
（1）培养基A
成分    剂量（每升培养基中）
维生素混合物＊1    0.1ml
K2HPO413.4g
KH2PO46.5g
NaCl    1.0g
MgSO4·7H2O 0.2g
蒸馏水    平衡（pH7.0）
＊1组分
生物素    2μg
泛酸钙    0.4mg
肌醇    2mg
尼克酸    0.4mg
盐酸硫胺    0.4mg
盐酸吡哆醇    0.4mg
对氨基苯甲酸    0.2ng
核黄素    0.2mg
叶酸    0.01ng
水    至1升
（ⅱ）培养基B
甘油    10g
胨    5g
麦芽汁    3g
酵母膏    3g
蒸馏水    平衡（pH7.2）
（ⅲ）培养基C
酵母膏    3g
KH2PO40.5g
K2HPO40.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
蒸馏水    平衡（pH7.2）
（2）酶诱导剂
用以诱导和产生玫瑰色红球菌微生物的腈水合酶的酶诱导剂可以是任一类适于此目的的物质。
典型的对本发明合适的诱导剂是腈和酰胺。
对J-1菌株已证实有效的酶诱导剂的例子如下：
巴豆酰胺（又称丁烯酰胺），乙腈，丙腈，苯酰胺，丙酰胺，乙酰胺，异戊腈，正丁腈，异丁腈，正己腈，3-戊烯腈，别戊腈，正丁酰胺，异丁酰胺，正戊酰胺，正己酰胺，异丁烯酰胺和苯乙酰胺。
（3）钴离子来源
即使上述的酶诱导剂存在于培养基中，也不能得到腈水合酶，根据本发明在培养基中加入钴离子是必需的。
如果培养基是液体，则向培养基中加入水溶性钴化合物来获得钴离子。水溶性钴化合物常见于化学辞典中，本领域的普通技术人员很易于从中选择和使用一种适宜的化合物（某些情况下，尚需做一个简单的预试验来决定）。典型的钴化合物应提供Co++或Co+++，特别是Co++。特殊的例子是氯化钴，硫酸钴，醋酸钴，溴化钴，硼酸钴等。维生素B12和金属钴是钴化合物的其它例子，它们在培养基中通过电离作用或在培养过程中经微生物氧化侵蚀可在原位产生钴离子。
（4）培养
为在细菌细胞内产生和积聚腈水合酶的培养可以通过于适宜条件下在上述培养基中培养所用微生物，如J-1株来完成。
所用酶诱导剂的剂量按顺序为2-6g/l培基。钴离子剂量按顺序为5-15mgCOCl2/l培基。
培养基组分的特殊例子特列于下：
（ⅰ）培养基A    1升
乙腈（诱导剂）    2g
COCl210mg
（ⅱ）培养基B    1升
异戊腈    2g
COCl210mg
（ⅲ）培养基C    1升
丁烯酰胺    2g
COCl210mg
经在15-50℃，尤其是20-45℃，最好是30℃左右，pH7-9条件下振荡培养J-1菌株大约30小时或30小时以上，最好是40小时或40小时以上（上限不超过120小时）能使腈水合酶优势产生。最好是从培养的初始阶段就有酶诱导剂存在，为准备具高度活性的细菌细胞，要求不断补充诱导剂。例如，当需在28℃下振荡培养76小时时，在反应开始后26小时和56小时都添加额外量的丁烯酰胺，以使其浓度维持0.2%（w/v）。
4）腈的水合反应
本发明的前提“在来源于微生物的腈水合酶作用下将腈水合转变为相应酰胺的生产酰胺的生物学方法”包括如上所述的任何合适的突施方案和导致腈水合酶作用于腈的各种方法的修饰。
突施方案之一是在微生物培养基中有底物腈存在的情况下在培养基中生产酰胺。
导致腈水合酶作用于其底物的另一实施方案是将底物腈加入已积聚了腈水合酶的培养基中，以发生水合反应。对该实施方案的修饰是使用该微生物细胞已被破坏的培养基作为“腈水合酶已积聚的培养基”。
导致腈水合酶作用于其底物的进一步实施是从培养基中分离已积聚了腈水合酶的细胞，最好再将细胞加以适当的载体或“固定”它们，然后使其与底物接触。这种方法，特别是使用固定的细胞的最好突施方案据认为与上述第二种突施方案一样甚至更好地用于工业化生产。使用固定的细胞的这项技术在载体的类型，固定该微生物于载体上的方法，和在所谓的生物反应器中利用固定的微生物等技术细节都是本领域众所周知的。
使腈水合酶作用于其底物的另一实施方案是制备腈水合酶制剂的方法和腈被该酶制剂以非生物学方式水合的方法。不言而喻，以这种方式进行的水合反应最好是在不丧失酶活性的pH和温度下进行。这些条件可认为与上述“生物学方式”的条件一样。如上所述，在酶作用期间不存在微生物的实施方案也如本发明中“生物学生产方法”一样处理。
根据本发明，腈水合酶有一个适合的pH范围7-9，其中最适pH为8.0。如果反应液pH低于7，该酶活性趋向突然降低。据此，要求添加缓冲液于反应液中。即使使用如磷酸钾缓冲液，Tris/HCl缓冲液，Hepes/KOH缓冲液或硼酸钠缓冲液中任一种缓冲液，腈水合酶活性也不会改变。
在培养基中或水合反应溶液中底物的浓度范围通常为4-7克分子/每升，反应温度波动于10-30℃。
3.实验实施例
测定腈水合酶活性和下列实验实施例中酶活性单位的方法特规定如下：
（1）测定腈水合酶活性的方法
通过用含10mM苄腈，30mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）和一定量微生物细胞（由培养基中分离得到）的反应混合液2ml在10℃下反应5分钟，随后加入1N-HCl    2ml以终止反应来测定腈水合酶活性。
（2）单位的定义
1    单位腈水合酶活性被定义为苄腈在上述条件下以每分钟1微克分子速率产生苯酰胺所需的酶量。
参考例1
使用其组分特列于下的培养基在特列于下的培养条件下培养J-1菌株，腈水合酶活性的表达通过在培养期间向培养基中加入COCl和/或Fe SO4来检查。
（ⅰ）培养基组分
成分    剂量（每升培养基中）
维生素混合物    3.0ml
K2HPO40.5g
KH2PO40.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
丙腈    2ml
蒸馏水    平衡（pH7.2）
（ⅱ）培养条件
28℃/70-80小时
所获结果显示如下
可以看出，如果向基础培养基中加入Fe SO4将不出现腈水合酶活性，但加入COCl2时则出现腈水合酶活性，向已加有COCl2的系统中再加入Fe SO4将反向影响其结果。
加入金属离子
COCl20 0 0 0 0 10 10 10 10 10
（mg）
Fe SO40 5 10 20 40 0 5 10 20 40
（mg）
细胞量＊1
（mg/ml）    1.06    1.14    1.25    1.24    1.34    2.04    1.90    2.16    2.16    2.07
酶活性
U/mg    细胞＊2    0    0    0    0    0    0.59    0.26    0.34    0.32    0.16
U/ml    培养基    0    0    0    0    0    1.20    0.49    0.73    0.69    0.33
＊1    细胞量：以干重计
＊2    U：按上述定义的酶活性单位，细胞量以干重计。
参考例2
各种腈和酰胺作为酶诱导物对J-1菌株的影响列于下表。
下表所列结果是通常对J-1菌株在上述培养基B中28℃下预先培养，并分别以0.1%（v/v）或0.2%（w/v）剂量加入腈或酰胺作为诱导剂，当该菌株已充分增殖后，再进一步转种于上述的培养基C之中，并添加COCl20.001%（w/v）来进行培养36至48小时，最后获得结果。
比活性    总活性    细胞量
（U/mg）    （U/ml）    （mg干细胞/ml）
巴豆酰胺    2.22    4.48    2.02
乙腈    1.41    3.47    2.46
丙腈    1.36    4.44    3.26
苯酰胺    0.84    2.75    3.26
丙酰胺    0.79    2.29    2.90
乙酰胺    0.71    1.55    2.18
正丁腈    1.40    0.38    3.70
异丁腈    0.41    1.24    3.06
异戊腈    0.34    1.05    3.07
正己腈    0.28    1.04    3.71
3-戊烯腈    0.32    1.42    4.49
别戊腈    0.35    0.24    0.69
正丁酰胺    0.43    1.55    3.62
异丁酰胺    0.09    0.33    3.48
异戊酰胺    0.44    1.08    1.81
正己酰胺    0.30    1.06    3.52
异丁烯酰胺    0.20    0.62    3.12
苯乙酰胺    0.29    0.28    0.95
实例1
在由上述培养基C和分别以每升培养基中0.01g和2g的比例加入的COCl2和巴豆酰胺所构成的培养基中培养该菌株得到J-1株的细胞与作为底物使用的各种腈反应。该反应使用包括从2ml培养基所得细胞，10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和200mM底物的反应混合液2ml在25℃下进行76小时后完成。加入1N-HCl 0.2ml以终止该反应。腈水合酶对各自底物的酶活性按经高压液相色谱（HPLC）测定的底物消耗量或反应产物对以3-氰基吡啶为底物测定的腈水合酶活性的比率排列于下，即比活性（%）。
结果如下
底物    比活性（%）
3-氰基吡啶    100
丙烯腈    106
4-氰基吡啶    129
2-氰基吡啶    64
5-氰基吲哚    9
2-苯硫腈    116
2-糠腈    71
苄腈    80
4-氰基苯酚    24
对-氨基苄腈    16
间-硝基苄腈    7
邻-硝基苄腈    16
间-氯苄腈    29
对-苄基氰    5
邻-苄基氰    46
间-苄基氰    32
茴香腈    20
邻-氯苄腈    41
对-氯苄腈    7
2，4-二氯苄腈    2
2，6-二氯苄腈    1
氰基吡嗪    80
实例2
在容量1升的锥形瓶内置入组成包括前述培养基C，并含COCl2（0.01g/l）和巴豆酰胺（2g/l的培养基400ml，28℃下振荡培养该混合物。开始培养后的30小时和60小时，向培基中分别加入0.2%（w/v）的巴豆酰胺（800mg/400ml），并继续培养至第80小时终止。
离子培养基以收集细菌细胞，条件为离子机（Hitachi    model    SCR    20    B），12，000g，15分钟，团块以0.85%    NaCl冲洗后再次离心，团块悬浮于上述溶液40ml内。一小部分悬液作为样品以测定悬液中的细菌干重。
将含有细胞的悬液（相当于2，33mg干细胞）加到4ml包含10mM酸钾缓冲液（pH8.0）昨4.57    M3-氰基吡啶的反应液中，在25℃下反应过夜，同时在反应3小时和6小时后分别向反应液中加入0.55M和0.49M3-氰基吡啶。从开始反应算起18小时之后，尼克酰胺的产率为5.58M。据此，转化率达99.5%。相当于产生了681g尼克酰胺。在此浓度下，作为尼克酰胺沉淀的结果，反应产物呈固态。
所产生的尼克酰胺经分离出结晶状产物，并通过元素分析，红外光谱，核磁共振波谱和质谱分析加以鉴定。未检测出尼克酸。
实例3
将实例2中得到的含细胞的悬液（相当于2.33mg的干细胞）加于含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和各种浓度的氰基吡嗪的反应液4ml之中。反应在25℃下进行。反应6小时后，4克分子的氰基吡嗪转化为吡嗪酰胺，转化率达100%，9小时后有6克分子氰基吡嗪转化。另一方面，当以相当于干重4.66mg的细菌细胞悬液代替上述2.33mg干重的细菌细胞时，悬液加于同样的反应液（4ml）中，反应6小时后，以100%的转化率，7克分子氰基吡嗪转化为吡嗪酰胺，9小时后有8克分子氰基吡嗪转化。未检出吡嗪羧酸产物。
吡嗪酰胺从溶液中结晶析出。直接收集结晶状沉淀物，并以甲醇重结晶，经元素分析，红外光谱，核磁共振波谱，和质谱分析证实结晶物是吡嗪酰胺。
使用高效液相色谱方法对氰基吡嗪，吡嗪酰胺和吡嗪羧酸进行分析。
在下列实例中也用此例的方法进行同样的分析。
实例4
从例2所获细菌细胞悬液（相当于细胞干重4.66mg）加入含10m    M磷酸钾缓冲液（pH8.0）和3M异丁腈的反应液4ml之中，25℃下反应，并于1小时和3小时后分别向反应液中加入3M异丁腈。反应12小时后9M异丁烯酰胺以100%的转化率产生。
在上述反应中，在反应后5小时再加1M异丁腈的情况下，反应后24小时将以100%的转化率产生10克分子异丁烯酰胺。10克分子浓度相当于产生并积累851g异丁烯酰胺/每升反应液。
反应液以水稀释，离心（12，000g，15分钟）弃除细菌细胞。无细胞溶液在旋转蒸发器上浓缩并结晶。然后，将结晶物复溶和以水重结晶，得到异丁烯酰胺结晶品。
实例5
从例2所获细菌细胞悬液（相当于细胞干重4.66mg）加入含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和1M巴豆腈的反应液4ml之中，25℃下反应，并每隔1小时向反应液中加入1M部分的异丁腈共5次。反应开始6小时后以100%的转化率产生6克分子巴豆酰胺。当在反应6小时和10小时后分别多加1M部分的巴豆腈时，在10小时和22小时后，以100%转化率分别产生7克分子和8克分子的巴豆酰胺。8克分子浓度相当于每升反应液生产和积聚了681g巴豆酰胺。
巴豆酰胺结晶化操作同例4。
实例6
从例2所获细菌细胞悬液（相当于细胞干重4.66mg）加入含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和3M乙腈的反应液4ml之中，25℃下反应，并于反应开始后的1小时和3小时再加乙腈3M，6小时后5M。反应12小时后，以100%的转化率获得14克分子的乙酰胺。换言之，每升反应液中产生和积聚827g乙酰胺。
反应液以水稀释，再离心弃除细菌细胞。上清液在旋转蒸发器上浓缩至干，复溶于甲醇中并重结晶以得到乙酰胺的结晶品。
实例7
从例2所获细菌细胞悬液（相当于细胞干重4.66mg）加入含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和3M3-羟基丙腈的反应液4ml之中，25℃下反应，反应开始后每隔1小时向反应液中加入3M部分的3-羟基丙腈，共4次。反应后5小时，以100%的转化率产生15克分子3-羟基丙酰胺。当在此阶段中，多加入3M3-羟基丙腈时，则在反应11小时后以100%的转化率产生18克分子3-羟基丙酰胺。这意味着每升反应液中产生和积聚1600g3-羟基丙酰胺。
反应液以水稀释，离心弃除细菌细胞。无细胞上清液置旋转蒸发器上浓缩并于-20℃下结晶。结晶物复溶于异丙醇中并重结晶以得到3-羟基丙酰胺结晶品。
实例8
在容量1升的锥形瓶内置入组成包括前述培养基C，并含COCl20.01g/l）和巴豆酰胺（2g/l）的培养基400ml，28℃下振荡培养该混合物。开始培养后的26小时和56小时，向培养基中分别加入0.2%（w/v）的巴豆酰胺（800mg/400ml），并继续培养至第76小时终止。
用离心机（Hitachi    model    SCR    20B），以10，000g离心培养基20分钟以收集细菌细胞，用0.85%Na    Cl洗涤，再次离心，并悬浮于40ml上述溶液中，一小部分悬液作为样品以测定悬浮中的细菌干重。
将含有细胞的悬液（相当于2.96mg干细胞）加到4ml包括10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和各种浓度的3-氰基吡啶的反应溶液中。25℃下进行反应。反应9小时后有8克分子3-氰基吡啶以100%转化率转化为尼克酰胺，反应22小时后有9克分子3-氰基吡啶转化。另一方面，当以相当于5.92mg干重的细菌细胞悬液代替上述2.96mg干重的细菌细胞时，悬液加于同样的反应液（4ml）中，反应5小时后，以100%的转化率，9克分子3-氰基吡啶转化为尼克酰胺，反应9小时后，有12克分子3-氰基吡啶转化。未检出尼克酸产物。
12克分子浓度相当于每升反应溶液中产生并积聚了1.46g尼克酰胺。
尼克酰胺从溶液中结晶析出，收集结晶并以甲醇重结晶。
实例9
从例8所获细菌细胞悬浮液（相当于5.92mg干细胞）加入含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和1M苄腈的4ml反应液中，25℃下进行反应，并于1，2，3，4，5和7小时后分别向反应液中加入1M苄腈，反应24小时后7M（848g/l）苯甲酰胺以100%转化率产生。
实例10
从例8所获细菌细胞悬浮液（相当于5.92mg干细胞）加入含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和0.5M2，6-二氟苄腈的4ml反应液中，25℃下进行反应，并于2，4，6和8小时后分别向反应液中加入1M2，6-二氟苄腈，反应22小时后2.5M（393g/l）2，6-二氟苯甲酰胺以100%转化率产生。
实例11
从例8所获细菌细胞悬浮液（相当于5.92mg干细胞）加入含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和1M2-苯硫腈的4ml反应液中，25℃下进行反应，并于1小时后向反应液中加入1M2-苯硫腈，反应5小时后2M（254g/l）2-苯硫苯甲酰胺以100%转化率产生。
实例12
从例8所获细菌细胞悬浮液（相当于5.92mg干细胞）加入含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和1M2-糠腈的4ml反应液中，25℃下进行反应，并于1，2，4，6，8，11和23小时后分别向反应液中加入1M2-糠腈，反应23小时后8M（888g/l）2-糠酰胺以100%转化率产生。
实例13
从例8所获细菌细胞悬浮液（相当于5.92mg干细胞）加入含10mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）和4M3-吲哚乙腈的4ml反应液中，25℃下进行反应，反应24小时后，4M（697g/l）3-吲哚乙酰胺以100%转化率产生。

Claims (9)

1、生产酰胺的生物学方法，其中的腈通过来源于微生物的腈水合酶作用水合成相应的酰胺，此方法特征在于在钴离子存在下培养玫瑰色红球菌种微生物，得到腈水合酶并用该酶催化水合反应。
2、根据权利要求1生产酰胺的生物学方法，其中所述微生物是玫瑰色红球菌种的J-1菌株，FERM  BP-1478。
3、根据权利要求1和2中任一项生产酰胺的生物学方法，其中所述腈是其芳香核中具有4-10个碳原子的芳香腈。
4、根据权利要求3生产酰胺的生物学方法，其中所述芳香腈选自下面[Ⅰ]-[Ⅵ]式所示化合物：
Figure 881067350_IMG1
其中R1和R2分别代表H，CH3，OH，OCH3，Cl，F，CN，NH2或NO2;
其中x代表S或O;
Figure 881067350_IMG3
5、根据权利要求4生产酰胺的生物学方法，其中所述芳香腈是2-氰基吡啶，3-氰基吡啶或4-氰基吡啶。
6、根据权利要求5生产酰胺的生物学方法，其中所述芳香腈是3-氰基吡啶。
7、根据权利要求4生产酰胺的生物学方法，其中所述芳香腈是氰基吡嗪。
8、根据权利要求1和2中任一项生产酰胺的生物学方法，其中所述腈是具2-6个碳原子的脂肪族腈。
9、根据权利要求8生产酰胺的生物学方法，其中所述具2-6个碳原子的脂肪族腈是丙烯腈。
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