本申请涉及从水溶液中除去具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法,其包含步骤a) 提供含有有机化合物的水溶液和包含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液,其中所述液体阳离子交换剂是疏水性的,b) 使所述水溶液与所述有机溶液接触,和c) 从所述水溶液中分离出所述有机溶液,其中所述有机化合物是式NH3 +-A-COOR1的化合物,以及涉及相应的反应混合物。
由再生原料出发以生物技术生产精细化学品(其传统上由化石燃料合成)时的根本问题在于将该一次性获得的通常为存在于大体积水相中的产物转移到有机相中。进行这种转移一方面由此以浓缩制成的中间体或最终产物和任选以使得在随后的反应步骤中的合成加工能够在有机溶液中进行,另一方面以通过去除所需产物改进水相中的反应收率或使该反应能够完全在工业上有意义的范围内进行。从大体积的水溶液中直接热浓缩通常以低浓度存在的产物通常是不合适的。
化合物在包含不混溶的亲水性水相和疏水性有机相的两相体系中的分配决定性地取决于各化合物的物理化学性质。具有高比例的未取代烃或仅由未取代烃构成的化合物主要富集在疏水相中,而具有高比例极性基团,如含杂原子的官能团的化合物,且非常特别是带电荷的化合物主要或几乎仅存在于水相中,这使得转移到有机相中变得困难。
工业上非常需要的带正电荷的有机化合物的一个实例是12-氨基月桂酸(ALS)及其衍生物,特别是甲酯(ALSME)。ALS是聚合物生产中的重要原材料,例如用于生产管道系统和尼龙。传统上,ALS由化石原材料起始以具有低收率的工艺经由十二内酰胺来制备,其通过三聚化丁二烯、随后氢化形成环十二烷、随后氧化成环十二酮、与羟基月桂酸甘油酯(Hydroxylaurin)反应并随后进行贝克曼重排来合成。在DE10200710060705中描述了ALS或ALSME的一种有前途的生物技术生产途径。
现有技术教导了通过使包含生物制剂的水性反应混合物与包含有机溶剂的有机相接触获得带正电荷的有机化合物。因此,例如,DE10200710060705描述了通过用乙酸乙酯振摇从水性反应混合物中获得产物ALSME。Asano等人(2008)公开了用甲苯从包含合成ALS的酶的水性反应溶液中萃取ALS。
因此,本发明的目的在于开发从水性反应混合物中除去具有至少一个正电荷的带正电的有机化合物,尤其是ω-氨基羧酸的方法,由此期望的是反应混合物和用作萃取剂的疏水性有机相之间的分配平衡的尽可能有利的位置,即该分配平衡应尽可能远地位于疏水性有机相侧。
本发明的另一目的在于开发使用疏水性有机相作为萃取剂从包含生物制剂的水溶液中除去具有至少一个正电荷的有机化合物,尤其是ω-氨基羧酸的方法,其中分配平衡尽可能远地位于疏水性有机相侧。
本发明的另一目的在于开发使用疏水性有机溶液作为萃取剂从水溶液中除去具有至少一个正电荷的有机化合物,尤其是ω-氨基羧酸的方法,其尽可能少地不利影响和/或减慢生物技术相关的微生物,特别是大肠杆菌的生长和/或由此尽可能少地减少可分化和/或可存活的和/或呼吸活性的和/或代谢-和合成活性细胞的数量。
最后,本发明的目的在于找出使用疏水性有机相作为萃取剂从包含生物制剂的水溶液中除去具有至少一个正电荷的有机化合物,尤其是ω-氨基羧酸的方法,其中考虑到总收率或更快的进程或在连续工艺的情况下,尽可能长的生物制剂可用性,整体优化对于基于生物工程合成方法的收率、总转化率和快速可完成性而言决定性的性质,特别是有机相对生物制剂的毒性和该化合物在有机萃取剂中的容纳性,特别是对于所述具有至少一个正电荷的有机化合物是在生物制剂的催化活性参与下合成的该合成方法的产物或中间体的情况而言。
通过本申请的主题,和特别是也通过所附独立权利要求的主题实现这些和其它目的,其中由从属权利要求得到实施方案。
第一方面通过从水溶液中除去具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法解决作为本发明的基础的目的,所述方法包括下列步骤
a) 提供含有有机化合物的水溶液和包含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液,
其中所述液体阳离子交换剂是疏水性的,
b) 使所述水溶液和所述有机溶液接触,和
c) 从所述水溶液中分离出所述有机溶液,
其中所述有机化合物是式I的化合物,
NH3 +-A-COOR1 (I),
其中R1 是氢、甲基、乙基或负电荷且A是未取代的具有至少3个、优选至少8个碳原子的直链烷基,
且其中所述液体阳离子交换剂是脂肪酸。
在第一方面的第一实施方案中,所述问题通过根据权利要求1之一的方法得以解决,其中步骤b)中的温度为28至70,优选30至37℃。
在第二实施方案(其也是第一方面的第一实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过根据权利要求1-2之一的方法得以解决,其中步骤b)中的pH-值为6至8,优选6.2至7.2。
在第三实施方案(其也是第一方面的第一至第二实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过其中液体阳离子交换剂与有机化合物的物质的量的比为至少1的方法得以解决。
在第三实施方案(其也是第一方面的第一至第三实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过其中有机溶液与水溶液的体积比为1:10至10:1的方法得以解决。
在第四实施方案(其也是第一方面的第一至第三实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过其中所述液体阳离子交换剂是具有多于12个,优选具有14至22个,还更优选16至18个碳原子的脂肪酸的方法得以解决。
在第五实施方案(其也是第一方面的第一至第四实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过其中所述液体阳离子交换剂是不饱和脂肪酸,优选油酸或芥酸的方法得以解决。
在第六实施方案(其也是第一方面的第一至第五实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过其中所述水溶液此外包含具有催化活性的生物制剂的方法得以解决。
在第七实施方案(其也是第一方面的第一至第六实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过其中所述其中所述生物制剂是细胞,优选是细菌细胞且所述细胞更优选具有重组的烷烃单加氧酶、重组的转氨酶以及优选此外具有至少一种选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和AlkL-基因产物或其变体的酶的方法得以解决。
在第八实施方案(其也是第一方面的第一至第七实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过其中所述有机化合物的存在对催化活性起不利作用的方法,优选通过所述有机化合物是对细胞有毒的化合物的方法得以解决。
在第九实施方案(其也是第一方面的第一至第八实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过其中所述有机溶液此外包含至少一种有机溶剂,优选脂肪酸和/或脂肪酸酯的方法得以解决。
在第十实施方案(其也是第一方面的第一至第九实施方案的一个实施方案)中,所述问题通过根据权利要求12的方法得以解决,其中所述有机溶液包含20至80体积%,优选25至75体积%的油酸作为液体阳离子交换剂,并包含月桂酸甲酯作为溶剂,且所述有机化合物是12-氨基月桂酸甲酯,且在所述水溶液中存在具有重组的烷烃单加氧酶、重组的转氨酶以及优选此外具有至少一种选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和AlkL-基因产物或其变体的酶的细菌细胞。
在第二方面中,作为本发明的基础的问题通过包含水溶液和疏水性有机溶液的反应混合物得以解决,
其中所述疏水性有机溶液包含脂肪酸,优选具有多于12个碳原子的脂肪酸,更优选不饱和脂肪酸作为阳离子交换剂,
且其中所述水溶液是式(I)化合物
NH3 +-A-COOR1 (I),
其中R1 是氢、甲基、乙基或负电荷且A 是未取代的具有至少3个、优选至少8个碳原子的直链烷基。
在第二方面的一个实施方案中,作为本发明的基础的问题通过根据第一方面的反应混合物得以解决,其中所述水溶液此外包含具有重组的烷烃单加氧酶、重组的转氨酶以及优选此外具有至少一种选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和AlkL-基因产物或其变体的酶的细胞
第二方面的其它实施方案包含第一方面的所有实施方案。
在第四方面中通过从水溶液中除去具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法实现作为本发明的基础的目的,其包含步骤:
a) 提供含有有机化合物的水溶液和包含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液,
其中所述液体阳离子交换剂是疏水性的,
且其中所述液体阳离子交换剂具有一个或多个负电荷和总负电荷,
b) 使所述水溶液和所述有机溶液接触,和
c) 从所述水溶液中分离出所述有机溶液。
在本发明的第四方面的第二实施方案(其也是本发明的第一实施方案的一个实施方案)中,该方法包含步骤:
d) 后处理所述有机溶液,优选通过将所述有机化合物反萃到另一水溶液中。
在本发明的第四方面的第三实施方案(其也是本发明的第一至第二实施方案的一个实施方案)中,根据本发明的方法的步骤b)中的温度为28至70℃,优选30至37℃。
在本发明的第四方面的第四实施方案(其也是本发明的第一至第三实施方案的一个实施方案)中,根据本发明的方法的步骤b)中的pH-值为3至8,优选6至8,特别优选6.2至7.2。
在本发明的第四方面的第五实施方案(其也是本发明的第一至第四实施方案的一个实施方案)中,在该方法中的液体阳离子交换剂与有机化合物的物质的量的比为至少1。
在本发明的第四方面的第六实施方案(其也是本发明的第一至第五实施方案的一个实施方案)中,有机溶液与水溶液的体积比为1:10至10:1。
在本发明的第四方面的第七实施方案(其也是本发明的第一至第六实施方案的一个实施方案)中,所述有机化合物具有至少一个带正电荷的式(I)的取代基
–N+R2R3R4 (I)
或者,如果选自R2、R3和R4的至少一个取代基是氢,则为其非质子化形式,
其中R2、R3和R4彼此独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、苄基、羟基、取代或未取代的和/或直链或支链或环状的烷基或烯基。
在本发明的第四方面的第八实施方案(其也是本发明的第一至第七实施方案的一个实施方案)中,所述有机化合物具有式(II)
Z-A-N+R2R3R4 (II)
或者,如果选自R2、R3和R4的至少一个取代基是氢,则为其非质子化形式,
其中R2、R3和R4彼此独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、苄基、羟基、取代或未取代的和/或直链或支链或环状的烷基或烯基,
其中A是包含至少三个碳原子的烃链,优选是未取代的烯基,
且其中Z选自-COOH、-COOR5、-COH、-CH2OH且包括其非质子化形式,
其中R5选自氢、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、苄基、羟基、取代或未取代的和/或直链或支链或环状的烷基或烯基。
在本发明的第四方面的第九实施方案(其也是本发明的第一至第八实施方案的一个实施方案)中,所述有机化合物具有式III
NH3 +-A-COOR1 (III),
或其非质子化形式,其中R1是氢、甲基或乙基且A是具有至少三个碳原子的未取代的直链亚烷基。
在本发明的第四方面的第十实施方案(其也是本发明的第一至第九实施方案的一个实施方案)中,所述液体阳离子交换剂具有至少一个含有至少六个碳原子的烷基或烯基以及包含选自-COOH、-OSO2H、-OPO(OH)2-和-OPO(OH)O-及其非质子化形式的端位取代基。
在本发明的第四方面的第十一实施方案(其也是本发明的第一至第十实施方案的一个实施方案)中,所述液体阳离子交换剂是不饱和脂肪酸,优选油酸。
在本发明的第四方面的第十二实施方案(其也是本发明的第一至第十一实施方案的一个实施方案)中,所述水溶液此外包含具有催化活性的生物制剂。
在本发明的第四方面的第十三实施方案(其也是本发明的第一至第十二实施方案的一个实施方案)中,所述生物制剂是细胞,优选细菌细胞。
在本发明的第四方面的第十四实施方案(其也是本发明的第一至第十三实施方案的一个实施方案)中,所述有机化合物的存在对催化活性具有不利作用。
在本发明的第四方面的第十五实施方案(其也是本发明的第一至第十四实施方案的一个实施方案)中,所述有机溶液此外包含至少一种有机溶剂,优选脂肪酸和/或脂肪酸酯。
在本发明的第四方面的第十六实施方案(其也是本发明的第一至第十五实施方案的一个实施方案)中,所述有机溶液包含20至80体积%,优选25至75体积%的油酸作为液体阳离子交换剂并包含月桂酸甲酯作为溶剂,且所述有机化合物是12-氨基月桂酸甲酯,且在所述水溶液中存在具有参与12-氨基月桂酸甲酯合成的催化活性的细菌细胞。
在第五方面中,通过包含含生物制剂的水溶液和含液体阳离子交换剂的疏水性有机溶液的生物反应器解决作为本发明的基础的目的。在本发明的一个优选实施方案中,如本文所用的术语“生物反应器”被理解为是指在其中可在受控条件下培养生物技术上有用的微生物和/或可用于生物技术方法,优选用于合成有机化合物的所有容器。
在第五方面的第二实施方案(其也是本发明的第三方面的第一实施方案的一个实施方案)中,所述液体阳离子交换剂是脂肪酸,优选油酸。
在第五方面的第三实施方案(其也是本发明的第三方面的第一至第二实施方案的一个实施方案)中,所述疏水性有机溶液此外包含脂肪酸酯,优选月桂酸甲酯。
在第五方面的第四实施方案(其也是本发明的第二方面的第一至第三实施方案的一个实施方案)中,所述疏水性有机溶液包含油酸作为阳离子交换剂并包含25至75体积%的月桂酸甲酯作为溶剂。
在第五实施方案(其也是本发明的第五实施方案的第一至第四实施方案的一个实施方案)中,所述有机化合物是根据本发明的第一方面的实施方案之一的化合物。
在第六方面中,通过制备具有一个或多个正电荷的有机化合物的方法实现作为本发明基础的目的,其中所述有机化合物对细胞而言是有毒的,所述方法包括在包含液体阳离子交换剂和任选有机溶剂的疏水性有机溶液存在下,在水溶液中,培养参与有机化合物合成的细胞,优选催化该合成的至少一个步骤的细胞。
在本发明的第六方面的第二实施方案中,所述有机化合物是12-氨基月桂酸或12-氨基月桂酸甲酯,所述有机溶剂是月桂酸甲酯。
第四、五、六方面的其它实施方案包含本发明第一和第二方面的所有实施方案。
本发明的发明人已经发现,如果这种有机溶液包含液体阳离子交换剂,则可以令人惊讶地提高将具有一个或多个正电荷的有机化合物从水溶液移除到疏水性有机溶液中的效率。不希望与任何理论相关联,但本发明的发明人推测,所述液体阳离子交换剂的一个或多个负电荷与所述有机化合物的一个或多个正电荷以离子方式相互作用,且这种相互作用导致掩蔽至少一个正电荷,这提高了有机相中的溶解度。
在一个优选实施方案中,本文所用的术语“液体阳离子交换剂”是指可溶于疏水性有机溶剂中的化合物,其由于一个或多个负的永久电荷而能与至少一个阳离子形成离子相互作用。通常,液体阳离子交换剂包含至少一个饱和或不饱和的烃链,其可以是直链或支链,以及带负电的基团,例如羧基。在一个优选实施方案中,所述液体离子交换剂是脂肪酸,在一个更优选的实施方案中是不饱和脂肪酸,例如油酸。在一个优选实施方案中,该液体离子交换剂是二(2-乙基己基)磷酸(也被称作DEHPA或D2EHPA)。
在一个优选实施方案中,该液体离子交换剂不仅具有负的总电荷,而且完全没有正电荷。在一个优选实施方案中,术语离子交换剂或其它分子的“总电荷”,如本文中所使用的,被理解为是指与该分子共价键合的所有官能团的电荷总和。例如,月桂酸在pH7时具有一个负电荷作为总电荷,不取决于水溶液中存在的其它分子或抗衡离子如钾离子的存在。
在本发明的一个优选实施方案中,本文所用的术语“接触”被理解为是指两相直接且尤其没有物理屏障,如膜的间隔而彼此相对暴露。在最简单的情况中通过将两相置于同一容器中并以合适的方式例如通过搅拌将它们彼此混合来进行所述接触。
在一个优选实施方案中,所述有机化合物具有正的总电荷。在另一优选的实施方案中,所述有机化合物没有负电荷。在一个优选实施方案中,所述有机化合物是ω-氨基羧酸。
在一个优选实施方案中,本文所用的术语“具有电荷”是指如此指出的化合物在pH 0至14,优选2至12,2至6,8至12,3至10,6至8,最优选在pH 7的水溶液中具有相应电荷。在一个优选实施方案中,其是永久存在的电荷。在另一优选的实施方案中,本文所用的术语“具有电荷”是指相应的官能团或化合物在pH 7主要具有相应电荷,即至少50,更优选90,还更优选99%。
在本发明的一个优选实施方案中,可将术语“包含”按“包括”的意义理解,即非封闭地。在此意义上,包含A的混合物可具有除A外的其它成分。表述“一个或多个”电荷是指至少一个相应电荷。
在一个优选实施方案中,本文所用的术语“疏水性”被理解为是指一种液体在水相存在下形成与水相清晰分界的其自身的液相的性质。后者可以是连续液相或乳状液。在另一优选的实施方案中,本文所用的术语“疏水性”被理解为是指化合物基本上不溶于水的性质。最后,如本文所用,该术语在另一优选的实施方案中如此理解,即是指如此提及的化合物具有十进对数大于0,更优选大于0.5,还更优选大于1和最优选大于2的P-值(J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Wiley Series in Solution Chemistry卷2, John Wiley & Sons, Chichester, 1997)。
在本发明的另一实施方案中,所述液体离子交换剂对生物技术相关的微生物没有或仅有适度毒效。本文所用的术语“毒效”在本发明的一个优选实施方案中被理解为是指化合物在与相应的微生物接触时降低它们的生长速率、降低它们的代谢活性、提高它们的能量消耗、降低它们的光学密度或能生长的细胞的数量和/或直接导致它们死亡和溶解的性质。在一个优选实施方案中,在毒性化合物的情况中,在低浓度下,优选在1000,更优选100,还更优选50或25,最优选5 mg/L的浓度下就已实现这些效应的至少一种。本领域技术人员已知许多可常规用于研究毒性的方法。这些包括例如经由O2-电极或微生物样品的对比析出和集落形成单位(cfus)的随后计数测量相应微生物的呼吸。在一个优选实施方案中,“适度毒效”被理解为是指位于生长期的微生物在该化合物存在下进一步生长和/或是代谢活性的,但程度低于在不存在相应化合物的相同条件下培养的对照物的情况,和/或具有延长的停滞期。
水溶液和有机溶液的接触在合适的条件下进行,特别经过足以使所述有机化合物从水相充分转移到有机相中,理想地甚至建立相应平衡的时期。本领域技术人员可以在常规实验范围内确定该时间和条件。
在一个特别优选的实施方案中,所述具有一个或多个正电荷的有机化合物是端位胺化的脂肪酸,特别优选12-氨基月桂酸或其酯或这两种化合物的混合物。本领域技术人员会认识到,在包含酯酶活性的生物体系存在下,脂肪酸的酯可以部分以相应的酸的形式存在,并且就此而言,这两种化合物在这方面被视为等效。因此,如本文所用,在一个特别优选的实施方案中脂肪酸或脂肪酸衍生物还包括相应的酯,优选甲酯,反之亦然。
在一个特别优选的实施方案中,本文所用的术语“亚烷基”是式-(CH2)n-的基团,即是具有两个开放的,优选端位的取代基的链烷。这两个取代基可以是例如氨基和羧基。在一个优选实施方案中,n至少为3,还更优选至少为6,还更优选为11。在“取代的亚烷基链”中,至少一个氢原子被非氢原子的取代基或烷基残基,优选非氢原子的原子替代。在一个具体实施方案中,与此相反,本文所用的术语“未取代的亚烷基”是指没有这种取代基的式– (CH2)n –的烃链。
步骤b)中的温度不仅取决于液体阳离子交换剂的性质,而且,特别对于随着反应进程在水相中发生水溶液与有机溶液的接触的情况而言,还取决于可能的在水相中发生的反应的温度要求。特别对于生物制剂,如活细胞在水相中具有催化活性的情况而言,该温度必须适合保持这种活性。在一个优选实施方案中,步骤b)中的温度为0至100℃,更优选20至80℃,28至70℃,30至37℃,35至40℃。
步骤b)中的pH-值必须考虑可能的同时进行的反应的要求,原材料、产物、中间体或试剂的稳定性。在一个优选实施方案中,所述pH-值为3至8,更优选6至8,还更优选6.2至7.2。
为了将有机化合物尽可能完全地从水相转移到有机相中,需要足量的液体阳离子交换剂。在本发明的一个优选实施方案中,在至少一个步骤中,在连续工艺中在整个反应进程范围合计的液体阳离子交换剂与有机化合物的物质的量的比为至少1,即每分子有机化合物使用至少1分子液体阳离子交换剂。在还更优选的实施方案中,该比率大于2、3、5、10、15或20,优选1.5至3。
有机溶液与水溶液的体积比与阳离子交换剂/有机化合物物质的量的比一起,对高效过程均是重要的。在一个具体实施方案中,其为100:1至1:100,更优选20:1至1:20,还更优选10:1至1:10,4:1至1:4,3:1至1:3或最优选1:2至2:1。
在本发明的一个优选实施方案中,使用脂肪酸作为液体阳离子交换剂。在本发明的一个优选实施方案中,本文所用的术语“脂肪酸”被理解为是指具有至少6,优选8,还更优选10,最优选12个碳原子的羧酸,优选链烷酸。在一个优选实施方案中,它们是直链脂肪酸,在另一实施方案中是支链脂肪酸。在一个优选实施方案中,它们是饱和脂肪酸。在一个特别优选的实施方案中,它们是不饱和脂肪酸。在另一个优选的实施方案中,其是含有双键,优选在9位的具有至少12个碳原子的直链脂肪酸。在另一个优选的实施方案中,其是单不饱和脂肪酸,其中双键在9位和/或11位。在另一个优选的实施方案中,所述液体阳离子交换剂是选自油酸、棕榈油酸和鳕油酸和二十碳烯酸(Icosens?ure)的不饱和脂肪酸。在最优选的实施方案中,其是油酸。在一个特别优选的实施方案中,其是具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26. 27、28、29、30个碳原子,优选多于12个,还更优选多于14个碳原子,还更优选具有14至28,14至22,最优选16至18个碳原子的脂肪酸。
在另一个优选的实施方案中,使用不同脂肪酸的混合物作为液体离子交换剂,例如以大豆油或球蓟油形式存在的不同脂肪酸的混合物。在需要时,其包括事前的水解,如果所述脂肪酸作为酯存在的话。
在本发明的一个特别优选的实施方案中,使用两种液体阳离子交换剂的组合,优选其中至少一种是脂肪酸。
本发明的一个特别的优点在于本发明的方法与生物技术方法和其中所用的生物制剂的相容性。在本发明的一个具体实施方案中,本文所用的术语“具有催化活性的生物制剂”被理解为是指在从整个细胞到所分离的分子的所有提纯阶段中由细胞合成的生物催化剂。在一个优选实施方案中,其是表达具有催化活性的酶的细胞。该细胞可以是原核的,包括古生菌,或真核的,优选选自假单胞菌、棒状杆菌和大肠杆菌。在一个更优选的实施方案中,该制剂是细菌细胞,还更优选是革兰氏阴性细菌细胞,最优选是大肠杆菌。在另一个优选的实施方案中,其是真核细胞,更优选是真菌细胞,还更优选是酵母细胞,最优选是酵母属或假丝酵母属、毕赤酵母属,特别是热带假丝酵母。在具体实施方案中,术语“细胞”在本申请中与术语“微生物”同义并可互换使用。此外,该细胞可以是经分离的细胞或培养物的混合物。
用作生物制剂的细胞可以是活的,或者可以是其制品,例如是细胞的膜部分或细胞溶质部分或粗提物。
如果所述生物制剂是在各种提纯阶段中分离的分子,这可以是由细胞产生的所有催化活性分子。在一个特别优选的实施方案中,其是选自肽、多肽、碳水化合物、核酸或其混合形式的分子。在一个还更优选的实施方案中,其是催化有效的多肽。在另一个优选的实施方案中,其是固定化分子。
合成生物技术方法所需的催化功能是多种多样的。在一个优选实施方案中,本文所用的术语“催化活性”是合成活性,即催化包含形成至少一个新的共价键的化学反应。在另一个优选的实施方案中,其是转运活性,即一个分子将另一分子从一个隔室转运至另一隔室的能力,例如将物质从水性介质经过细胞膜吸收到细胞内部。
在一个特别优选的实施方案中,所述生物制剂是在液体阳离子交换剂存在下用于催化的活细胞,优选地,以合成具有一个或多个正电荷的有机化合物,所述有机化合物随后或同时借助液体阳离子交换剂被移除进入到疏水性有机相中。
在一个特别优选的实施方案中,所述有机化合物的存在对催化活性具有不利影响。在一个实施方案中,这会降低存在的活性的量,其可以以酶的较低kcat意义表述。在另一实施方案中,在酶的提高的KM的意义上可涉及具有催化活性的制剂的亲合力。在另一实施方案中,可改变催化活性的特异性,例如以优选使其转化或优选转化非所需底物分子的底物分子的方式。在另一实施方案中,所述有机化合物对作为生物制剂的细胞具有毒效。
在另一实施方案中,所述有机化合物是降低基本共底物或辅酶的可用性的有机化合物。例如如果所述有机化合物抑制相应的再生反应,则可以是这样的情况。
除液体阳离子交换剂外,所述疏水性有机相此外可包含疏水性溶剂。这可用于提高液体阳离子交换剂在疏水相中的吸收能力和防止不想要的行为,例如絮凝。在一个优选实施方案中,所述溶剂是在水溶液中进行的反应的原料,最优选是在水溶液中进行的酶催化反应的底物。在一个优选实施方案中,其是脂肪酸酯。在一个特别优选的实施方案中,该溶剂是充当液体阳离子交换剂的脂肪酸的脂肪酸酯,优选甲酯。
如果存在,疏水性有机相的溶剂的比例在一个优选实施方案中为1至99体积百分比(体积%)。在一个优选实施方案中,该溶剂比例为10至90,还更优选20至80,最优选25至75体积%。
在该方法的最优选实施方案中,该机化合物是如DE10200710060705中所公开的在水相中由重组的大肠杆菌-菌株通过月桂酸甲酯的端位碳原子的逐步氧化制成的12-氨基月桂酸和/或12-氨基月桂酸甲酯,且该疏水相包含25至75%油酸作为液体阳离子交换剂,其溶解在作为反应底物的月桂酸甲酯中。
本发明的教导不仅可使用精确的这里所述生物大分子的氨基酸-或核酸序列进行,而且也可以使用这种大分子可通过删除、加成或取代一个或多于一个氨基酸或核酸而得到的变体。在一个优选的实施方案中,在此处使用的术语核酸序列或氨基酸序列的"变体",与在下文中使用的术语"同源物"意义相同或可互换,表示另外的核酸序列或氨基酸序列,其具有相对于相应的原始野生型-核酸序列或-氨基酸序列70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性,这里用作与同一性意义相同,其中优选不同于形成催化活性中心的氨基酸或者对于结构或折叠而言必要的氨基酸被删除或取代或者后者仅被保守取代,例如谷氨酸代替天门冬氨酸或亮氨酸代替缬氨酸。现有技术描述了可以使用的算法,以计算两个序列的同源性的程度,例如Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第三版。在本发明另一优选的实施方案中,氨基酸-或核酸序列的变体,优选除了上述序列同源性而外,基本上具有与野生型分子或原始分子相同的酶活性。例如,作为蛋白酶的酶活性多肽的一个变体具有该多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性,催化肽键水解的能力。在一个具体的实施方案中,术语"基本上相同的酶活性"表示,明显高于本底活性和/或与考虑相同底物的野生型多肽具有的KM和/或kcat-值相差少于3、优选2、还更优选1个数量级的考虑野生型-多肽的底物的活性。在另一优选的实施方案中,术语核酸序列或氨基酸序列的"变体"包含至少一个氨基酸-或核酸序列的活性部分/或片段。在另一优选的实施方案中,如这里所使用的术语"活性部分"表示,具有比该氨基酸序列的全长小的长度或编码比该氨基酸序列的全长小的长度的氨基酸序列或核酸序列,其中具有比野生型-氨基酸序列更小的长度的所述氨基酸序列或被编码的氨基酸序列基本上具有与野生型多肽或其变体相同的酶活性,例如作为醇脱氢酶、单加氧酶或转氨酶。在一个具体的实施方案中,术语核酸的"变体"包括其互补链,优选在严格的条件下,键接在野生型-核酸上的核酸。该杂交反应的严格性对于本领域技术人员来说是易于确定的,且通常取决于探针长度、洗涤时的温度和盐浓度。一般而言,较长的探针需要较高的温度用于水解,而对较短的样品低的温度就足够了。是否发生水解,通常取决于变性DNA融合在存在于其周围的互补链上的能力,而且在熔点以下。杂交反应的严格性和相应的条件详细描述在Ausubel等1995中。在一个优选的实施方案中,如这里使用的术语核酸的"变体"包括与原始的核酸编码相同氨基酸序列或编码在遗传密码的简并范围内该氨基酸序列的变体的任意核酸序列。
可用于产生式(I)的有机化合物的合适的多肽,尤其是烷烃单加氧酶、AlkL、转氨酶、 醛脱氢酶和丙氨酸脱氢酶描述于现有技术中,例如在 DE10200710060705、EP11004029中或在PCT/EP2011/053834中。
在最优选的实施方案中,所述烷烃单加氧酶是AlkB-型的烷烃单加氧酶。AlkB是得自恶臭假单胞菌的AlkBGT-体系的氧化还原酶,其因其羟化酶活性而众所周知。这依赖于两种另外的多肽,AlkG 和 AlkT。AlkT被表征为FAD-依赖性红氧还蛋白还原酶(红氧还蛋白-Reductase),其将电子从NADH传递到AlkG上。AlkG是红氧还蛋白,是含铁的氧化还原蛋白,其作为 AlkB 的直接电子供体起作用。在一个优选的实施方案中,将这里所使用的术语"alkB-型的烷烃单加氧酶"理解为膜结合的烷烃单加氧酶。在另一优选的实施方案中,将同一术语"alkB-型的烷烃单加氧酶"理解为具有与恶臭假单胞菌 Gpo1 (数据库编码: CAB54050.1)的AlkB的序列愈加优选地至少75、80、85、90、92、94、96、98或99%的序列同源性的多肽。在另一优选的实施方案中,将该术语理解为非细胞色素-依赖性单加氧酶。在另一优选的实施方案中,将术语"alkB-型的烷烃单加氧酶"5理解为非细胞色素-依赖性单加氧酶,其使用至少一种红氧还蛋白或同源物作为电子供体。在一个特别优选的实施方案中,将该术语理解为膜结合的非细胞色素-依赖性烷烃单加氧酶,其具有愈加优选地至少60、70、80、80、85、90、92、94、96、98或99% 的恶臭假单胞菌 Gpo1的AlkB的序列 ,其至少需要AlkG (CAB54052.1)作为电子供体,但优选AlkG与还原酶AlkT (CAB54063.1)的组合,其中AlkG和/或AlkT也可以是各自多肽的同源物。这里所使用的术语"序列"可涉及多肽的氨基酸序列和/或编码它们的核酸序列。在另一优选的实施方案中,这里使用的" alkB-型的烷烃单加氧酶"是非细胞色素-依赖性氧化还原酶,即未包含细胞色素作为辅因子的氧化还原酶。
此外通过下列附图和非限制性实施例说明本发明,它们可以揭示本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
图1显示用于证实LSME没有毒效的对照实验,其用大肠杆菌W3110-菌株研究并与作为阴性对照的磷酸钾缓冲液(Kpi)进行比较。
图2以该菌株在不存在液体阳离子交换剂的情况下和存在不同液体阳离子交换剂的情况下在0 h、4 h和24 h后可形成的cfus数的形式显示菌株大肠杆菌W3110的存活力。
图3借助大肠杆菌-W3110菌株在ALSME 0.2%、用氨调节的DEHPA(“D2EHPNH3 2%”)或在存在ALSME 0.2%的DEHPA/LSME混合物(2%/98%) (“D/L”)存在下的活细胞数的变化显示使用液体阳离子交换剂对毒性的影响。
图4显示不同液体阳离子交换剂对生产氨基月桂酸甲酯的大肠杆菌菌株的OTR的影响。如实施例4中所述进行该实验。
图5显示不同液体阳离子交换剂对具有合适基因变异的大肠杆菌菌株产生的氨基月桂酸甲酯收率的影响。如实施例4中所述进行该实验。
实施例4:各种液体阳离子交换剂对产生ω-氨基月桂酸(ALS)和甲酯(ALSME)的微生物的毒性的对比实验
在8个DasGip的平行发酵系统中用不同的离子交换剂测试月桂酸甲酯生成氨基月桂酸甲酯的生物转化。
该发酵使用1升反应器。使用两点校正法用pH 4.0和pH 7.0的测量溶液校正pH-探针。在反应器中装入300毫升水并在121℃下高压灭菌20分钟以确保无菌。然后将pO2-探针极化过夜(至少6小时)。第二天早晨,在净化工作台下除去水并换成含有50 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素的高细胞密度介质。随后,用一点校正法(搅拌器:600转/分钟/充气:10 sL/h空气)校正pO2-探针,并借助就地清洗清洁进料、校正剂和诱导剂段(Induktionsmittelstrecken)。为此,用70% 乙醇,然后用1 M NaOH、然后用无菌软化水冲洗软管,最后装入各自的培养基。
产生ALS和ALSME的大肠杆菌菌株BL21 (DE3) T1r pBT10 pACYC:Duet[TAcv]首先在LB培养基(25毫升,在100毫升振荡烧瓶中)中由低温培养物用50 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素在37℃和200转/分钟下培养过夜大约18小时。然后,在每种情况下将2毫升转接种在含有50 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素的高细胞密度培养基(葡萄糖15 g/L (30 mL/L的单独高压灭菌的500 g/L原液,其含有1% MgSO4*7H2O和2.2% NH4Cl)、(NH4)2SO4 1.76 g/L、K2HPO4 19.08 g/L、KH2PO4 12.5 g/L、酵母提取物 6.66 g/L、二水合柠檬酸三钠11.2 g、单独高压灭菌的1%的原液的柠檬酸铵铁溶液17 mL/L、单独高压灭菌的原液(HCl (37%) 36.50 g/L的痕量元素溶液5 mL/L, MnCl2*4H2O 1.91 g/L, ZnSO4*7H2O 1.87 g/L, 二水合乙二胺四乙酸0.84 g/L, H3BO3 0.30 g/L。Na2MoO4*2H2O 0.25 g/L, CaCl2*2H2O 4.70 g/L, FeSO4*7H2O 17.80 g/L, CuCl2*2H2O 0.15 g/L))(3 x 25 mL,在100毫升振荡烧瓶中)中并在37℃/200转/分钟下温育另外6小时。
在摇瓶中合并3个培养物并测定光学密度为7.2。为了以0.1的光学密度接种反应器,在每种情况下在5毫升注射器中吸入4.2毫升并经由隔膜借助套管接种反应器。
使用下列标准程序:
工序 |
|
触发灵敏度(Trigger sharp) |
31% DO (1/60h) |
诱导IPTG |
进料开始后2 h |
进料触发 |
50% DO |
进料速率 |
3 [mL/h] |
所进行的实验可以分成两个阶段:培养,在此过程中细胞应达到一定的光学密度,和随后的生物转化,在此过程中诱导表达用于制备ALSME的生物技术法所需的基因。一方面用氨(12.5%)将pH-值调节至pH 6.8。在培养和生物转化过程中,经由搅拌器转速和充气速率将培养物中的溶解氧(DO,溶解的氧气)调节为30%。进料分批进行发酵,其中进料开始,经由DO-峰触发5 g/Lh葡萄糖进料(500 g/L葡萄糖,含有1% MgSO4*7H2O和2.2% NH4Cl)。随着进料开始,温度也从37℃降至30℃。在进料开始后2小时经由IPTG的自动添加(1 mM)诱导转氨酶的表达。在进料开始后10小时通过手动添加DCPK (0.025% v/v)进行alk-基因的诱导。在生物转化开始前,测定培养液的光学密度。
在进料开始后14小时开始生物转化期。为此,将150 mL得自月桂酸甲酯和各自的离子交换剂(10% w/w)的混合物作为批料添加到发酵液中。所用离子交换剂是二(2-乙基己基)磷酸(DEHPA)、月桂酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和来自球蓟油皂化的游离脂肪酸的混合物。为了为转氨酶提供氨基供体,在添加有机相的同时,将10.7毫升丙氨酸溶液(125 g/L)添加到发酵液中。为了取样,从反应容器中取出2毫升发酵液,将其一部分在丙酮-HCl-混合物(c(HCl) = 0.1 mol/L)中稀释1/20并萃取。在生物转化开始后在1.25 h、3 h、5 h、20 h、22 h和25 h时从所有8个反应器中取样。在发酵过程中经由在DasGip系统上的废气分析测定氧和碳的传递速率(OTR = 氧传递速率)(CTR = 碳传递速率)。在生物转化开始后22小时结束发酵。
借助LC-ESI/MS2根据对所有被分析物的外部校准和使用内标氨基十一烷酸(AUD)进行发酵样品中的ALS、ALSME、DDS、DDSME、LS、LSME、HLS、HLSME、OLS和OLSME的量化。
为此,使用下列仪器:
·HPLC仪器1260 (Agilent;B?blingen),带有自动采样器(G1367E)、二元泵(G1312B)和柱式炉(G1316A)
·带有ESI源的质谱仪TripelQuad 6410 (Agilent;B?blingen)
·HPLC柱: Kinetex C18, 100 x 2.1 mm, 粒度: 2.6 μm, 孔径100 ? (Phenomenex;Aschaffenburg)
·预柱: KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter;0.5 μm过滤器深度和0.004毫米内径(Phenomenex;Aschaffenburg)
通过将1900微升溶剂(丙酮/0.1 N HCl混合物= 1:1)和100微升样品吸移到2毫升反应容器中来制备样品。将该混合物涡旋大约10秒,然后以大约13 000转/分钟离心5分钟。用移液管取出清澈的上清液并在用稀释剂(80% (v/v) ACN, 20%双蒸馏H2O (v/v), + 0.1%甲酸)适当稀释后分析。向每个900微升样品中移入100微升ISTD(对于90微升样品体积,使用10微升)。
使用上述柱或预柱进行HPLC分离。注射体积为0.7微升,柱温50℃,流速0.6 mL/min。流动相由洗脱剂A(0.1%的(v/v)甲酸水溶液)和洗脱剂B(含0.1% (v/v)甲酸的乙腈)构成。使用下列梯度分布。
用ESI源的下列参数以正模式进行ESI-MS2-分析:
·气体温度280℃
·气流11 L/min
·喷雾器压力50 psi
·毛细管张力4000 V。
用下列参数进行各化合物的检测和量化,其中在每种情况下使用一个产物离子作为定性离子(Qualifier),一个作为定量离子(Quantifier):
结果:
如果使用如现有技术中描述的DEHPA作为阳离子交换剂,在将该化合物添加到培养物中后立即导致OTR降低。该曲线在短时间内降至0,这表明培养物中不再存在代谢活性细胞。DEHPA因此对细胞具有高等级毒效。
如果使用月桂酸代替DEHPA作为液体阳离子交换剂,则尽管这同样造成OTR降低,但这不那么严重,在接下来22小时的过程中,细胞恢复并表现出提高的代谢活性。因此,月桂酸的毒性明显低于DEHPA。
在使用具有更长碳链的饱和脂肪酸时,观察到还明显还要更好的结果。如果使用棕榈酸和硬脂酸,OTR曲线比使用月桂酸或甚至DEHPA的情况明显更浅地下降。由此可以断定,这些脂肪酸具有明显更低的毒效。
不饱和脂肪酸,如棕榈油酸、皂化球蓟油(主要含有亚油酸)和油酸的使用令人惊讶地导致明显还要更好的结果。这些脂肪酸令人惊讶地表现出比饱和脂肪酸更低的毒性。
文献来源:
J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentaland Physical Chemistry, Wiley Series in Solution Chemistry卷 2, John Wiley & Sons, Chichester, 1997
Asano, Y., Fukuta, Y., Yoshida, Y., 和 Komeda, H. (2008): The Screening, Characterisation, and Use of w-Laurolactam Hydrolase: A New Enzymatic Synthesis of 12-Aminolauric Acid, Biosc. Biotechn. Biochem., 72 (8), 2141-2150
DE10200710060705 (2007): Recombinant cells producing ω-aminocarboxylic acids or lactams thereof
F. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.
A. M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版