CN103649331A - 用于mrna的定位的原位检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在细胞样品中RNA的检测。更具体地，本发明涉及定位的RNA原位检测。方法依靠在使用锁式探针的cDNA的靶向之前的RNA到互补DNA的转化。锁式探针的杂化依靠cDNA的核苷酸序列，其来源于相应的目标RNA的核苷酸序列。之后环化锁式探针的滚环扩增产生可以检测的滚环产物。有利地，这使得能够原位地检测RNA。

Description

用于MRNA的定位的原位检测的方法
本申请要求2011年4月8日提交的美国临时申请61/473,662号和2011年2月15日提交的美国临时申请61/442,921号的优先权，二者皆通过引用全部并入。
本发明涉及在细胞样品中的RNA、尤其是mRNA的检测。更具体地，本发明涉及定位的RNA、尤其是mRNA的原位检测。方法依靠在使用锁式探针的cDNA的靶向之前的RNA到互补DNA（cDNA）的转变。锁式探针的杂交依靠cDNA的核苷酸序列，其来源于相应的目标RNA的核苷酸序列。之后环化锁式探针的滚环扩增（RCA）产生使得能够检测RNA的滚环产物（RCP）。有利地，RCP可以定位到RNA，使得能够原位地检测RNA。还提供了用于实施这种方法的试剂盒。
一般希望的是在样品中，包括例如在固定的或新鲜的细胞或组织中能够灵敏地，尤其是定性地和/或定量地检测RNA，尤其是mRNA。可能尤其希望的是在单细胞中检测mRNA。例如，在分析大量细胞成分的基于群体的分析中，稀有细胞中的分子可能逃过检测。此外，这种分析不提供关于哪种所检测的分子源于哪种细胞的信息。单细胞中的表达可与在多种细胞群体中检测到的平均表达非常显著地不同。还希望的是可以利用单分子灵敏度进行单细胞研究，所述单分子灵敏度使得能够研究表达的转录物中的彷徨变异和序列变异。荧光原位杂交（FISH）先前已经用于原位地检测单mRNA分子。尽管能够在单独细胞中测定转录物复制数目，但是该技术不能分辨高相似的序列，所以其不能用于研究例如等位失活或拼接变异，并且不能区分基因家族成员。
唯一可用于对给定组织中单细胞分配转录物变异体的选择涉及激光捕获显微切割物质的聚合酶链反应（PCR），其费时且易于产生错误，因此不适合用于诊断。
作为基于PCR和基于杂交方法的替代，锁式探针（Nilsson等，1994）已经用于分析核酸许多年了。这些高选择性的探针在与目标序列杂交后通过取决于目标的连接转变为环形分子。环化的锁式探针可以通过原位地RCA扩增（Lizardi等，1998），从而可以用于提供与目标分子定位相关的信息，包括在单细胞水平的涉及DNA目标的位置。在Larsson等2004年的文献中描述了这种方案，其中目标DNA分子用于引发RCA反应，导致RCP锚定到目标分子，从而维持其定位并改进原位检测。
RNA分子还可以作为锁式探针连接的模板（Nilsson等，2000），而迄今为止利用锁式探针的原位RNA检测证实为比DNA检测更困难，并且受到限制（Lagunavicius等，2009）。例如，对于原位DNA检测的锁式探针所报道的高选择性和基因分型在原位RNA目标检测中没有重现。这可能是由在RNA模板上DNA分子连接的问题引起的，这是因为已知与在DNA模板上的连接相比，连接反应的效率和特异性都更低（Nilsson等，2000和Nilsson等，2001）。最近已经证明可以利用锁式探针和靶引发的RCA原位地检测RNA分子（Lagunavicius等，2009和Stougaard等，2007）。然而，迄今通过目标引发RCA的检测在很大程度上受限制于在3'端非多聚腺苷酸化的RNA的序列或邻接mRNA的多聚（A）-尾部的序列。由于RCA反应的目标引发取决于附近可以转变为RCA引物的游离3'端，认为该限制由RNA二级结构的形成导致，所述RNA二级结构的形成阻碍将RNA转变为反应引物所需的聚合酶作用（3'外切核酸降解）。利用锁式探针的直接mRNA检测的检测效率已经估计为低至1%（Nilsson等，2001）。对于非多聚腺苷酸化的RNA分子的检测，已经注意到使用内在发卡结构作为模板的探针的连接导致比使用RNA分子本身作为连接模板更高的检测效率（Stougaard等，2007）。这表示需要更好的连接条件以直接利用锁式探针原位有效地检测RNA和对RNA进行基因分型。
迄今存在的用于原位RNA检测的方法都没有提供在单核苷酸水平检测序列变异，尤其是基因分型转录物的可能性。在本发明中，通过将RNA目标分子转变为cDNA，避免锁式探针连接效率和特异性降低，并保存锁式探针提供的优秀的基因分型性质。另外，已经发现和许多先前描述的方法不同，该方法不限于在RNA分子中位于特定位点的序列的检测。
发明内容
本发明的方法有利地允许RNA的检测，尤其是RNA中单核苷酸变异的检测。例如，可以实现允许直接在组织中研究两种等位基因的转录物的相对表达差异的检测分辨率。最近认为这种研究在等位基因特异表达的大规模分析的情况下是重要的，这是因为已经显示出许多基因经过这类转录调节并且等位基因表达在组织之间可不同。此外，已经显示出大部分人类基因经过选择性剪接，所述选择性剪接目前可以使用本文所述的方法在单细胞水平研究。如今没有其他可以实施RNA中表达的单核苷酸序列变异的多重检测的原位方法。认为本方法可以满足该需求，其提供在细胞和组织中直接显现转录变异的能力在研究和诊断中都是有价值的，这提供了新的关于人类转录物组的见解。
根据本发明的一个方法，原位转录物检测通过首先将至少一个mRNA转变为用锁式探针和目标引发RCA检测的定位的cDNA分子来完成（图1）。在尤其适用于mRNA的同时，该方法可以用于细胞中存在的任何RNA分子的检测，包括但不限于病毒RNA、tRNA、rRNA、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、微RNA（miRNA）、小干扰RNA（siRNA）、与piwi相互作用的RNA（piRNA）、反义RNA和非编码RNA。RNA一般在包括逆转录酶和一种或更多种逆转录酶引物的逆转录酶反应中转变为cDNA。使用核糖核酸酶消化生成的RNA:DNA双链体中的RNA从而使cDNA链可以用于与锁式探针的杂交。锁式探针与cDNA的杂交允许通过直接或间接的探针端部的连接来环化探针。然后环化的锁式探针进行RCA，通过本领域可用的任何合适的手段检测RCP。在具体的实施方案中，该方法还可以用于定位超过一种目标RNA，例如2、3、4、5、6种或更多种目标RNA。这些目标RNA可以来源于相同的基因或不同的基因，或者来源于相同的基因组序列或不同的基因组序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于在一个或更多个细胞样品中原位检测至少一种目标RNA的方法，包括：产生与样品中RNA互补的cDNA；添加核糖核酸酶到所述样品中以消化杂交到所述cDNA的RNA；用一种或更多种锁式探针接触所述样品，其中所述锁式探针包括与所述cDNA上直接相邻区域互补的末端区域，在所述互补的末端区域将所述锁式探针与cDNA杂交；连接所述锁式探针的末端；使所述环化的锁式探针进行滚环扩增（RCA）；以及检测滚环扩增产物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于在生物样品的细胞中确定基因序列存在和定位的方法，包括：（a）将具有基因序列的DNA互补物与RNA杂交；（b）消化与DNA互补物杂交的RNA；（c）将第一锁式探针与至少部分DNA互补物杂交，其中所述锁式探针在与DNA互补物的不同但直接相邻的区域互补的两个末端之一上包含基因序列；（d）连接锁式探针的两个末端；（e）复制环化的探针以生成包含所复制探针的多拷贝的核酸分子；和（f）使用与核酸分子杂交的探针检测细胞中是否存在基因序列。在某些方面，该方法进一步包括生成与RNA杂交的DNA互补物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于鉴定组织样品中具有特定核酸序列的细胞的方法，包括：（a）用包含特定核酸序列的DNA互补物培养细胞以产生RNA-DNA杂交体；（b）在一定条件下培养RNA目标分子与核糖核酸酶以消化至少部分RNA-DNA杂交体；（c）在一定条件下用锁式探针培养DNA互补物以将锁式探针与包含特定核酸序列的DNA互补物杂交，其中所述锁式探针包含与DNA互补物的不同但直接相邻的区域互补的两个末端；（d）在一定条件下用连接酶培养DNA互补物与锁式探针以连接锁式探针的末端；（e）在一定条件下用聚合酶和核苷酸培养连接的锁式探针以引发锁式探针与DNA互补物的复制并产生具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸；和（f）用一种或更多种互补的寡聚核苷酸培养具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸寡聚核苷酸以检测是否存在特定的序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于鉴定细胞样品中具有特定核酸序列的细胞的方法，包括：（a）在一定条件下用固定到样品的抗核糖核酸酶引物和逆转录酶培养细胞样品以产生RNA的DNA互补物，其中所述DNA互补物包含特定的核酸序列；（b）在一定条件下用核糖核酸酶培养细胞样品以消化至少部分RNA；（c）在一定条件下用锁式探针培养DNA互补物以将锁式探针与包含特定核酸序列的DNA互补物杂交，其中所述锁式探针包含与DNA互补物的不同但直接相邻的区域互补的两个末端；（d）在一定条件下用连接酶培养DNA互补物与锁式探针以连接锁式探针的末端；（e）在一定条件下利用聚合酶和核苷酸培养连接的锁式探针以引发锁式探针与DNA互补物的复制并产生具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸；和（f）用一种或更多种核酸探针培养具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸以检测是否存在特定的序列。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于载玻片上的生物样品的细胞中核酸序列的原位定位方法，包括：（a）在一定条件下用逆转录酶和抗核糖核酸酶引物培养在固体支撑上的固定的生物样品以产生含有核酸序列并与细胞中的互补RNA分子杂交以形成RNA-DNA杂交体的核酸分子；（b）添加核糖核酸酶并在一定条件下培养核糖核酸酶以消化RNA-DNA杂交体中的RNA；（c）在一定条件下培养消化的RNA-DNA杂交体以将互补的锁式探针与消化的RNA-DNA杂交体的DNA部分杂交，其中所述锁式探针包含核酸序列并具有与DNA的不同但直接相邻的区域互补的两个末端；（d）在一定条件下用连接酶培养与RNA-DNA杂交体的DNA部分杂交的锁式探针以连接锁式探针的末端；（e）在一定条件下用聚合酶和核苷酸培养连接的锁式探针以由用于复制锁式探针的DNA制备引物和产生具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸；和（f）用一种或更多种互补的核酸探针培养核酸以检测是否存在特定的序列。
在本发明的用于鉴定组织样品中细胞的方法、用于鉴定细胞样品中细胞的方法或用于生物样品细胞中核酸序列的原位定位的方法的具体实施方案中，例如如上所述，样品是福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于细胞样品中至少一种RNA的定位的原位检测的方法，所述方法包括：（a）使所述样品与逆转录酶和逆转录酶引物接触以由样品中的RNA产生cDNA；（b）将核糖核酸酶添加到所述样品以消化杂交到所述cDNA的RNA；（c）使所述样品与一种或更多种锁式探针接触，其中所述锁式探针包含与所述cDNA互补的末端区域，在所述互补的末端区域将所述锁式探针杂交到cDNA；（d）通过直接地或间接地连接所述锁式探针的末端环化所述锁式探针；（e）使用具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶使所述环化的锁式探针滚环扩增（RCA），其中如果需要所述核酸外切酶活性消化cDNA以产生用作所述RCA引物的游离的3'端；和（f）检测滚环扩增产物。
该方法因而涉及检测滚环扩增产物（RCP）来作为检测目标RNA的手段。RCP由于与目标RNA互补的cDNA的锁式探针识别（即锁式探针通过与cDNA中的互补序列杂交与目标RNA的cDNA互补物结合）和锁式探针的连接以产生RCA反应的环形模板而产生。RCP因而可以看作cDNA的替代标记，检测所述替代标记以检测RNA。
如上所述，该方法可以用于细胞中存在的任何RNA分子类型或RNA序列的检测。在一些实施方案中，该方法用于mRNA的检测。样品中与RNA互补的cDNA可以通过使所述样品与取决于RNA的DNA聚合酶和引物接触而产生。取决于RNA的DNA聚合酶可以是例如逆转录酶，例如MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
在本发明的某些方面，用于第一链cDNA合成的引物是抗核糖核酸酶的。“抗核糖核酸酶的”引物表示其在相同序列的裸的、未修饰的引物上对核糖核酸酶作用（尤其对核糖核酸酶H的作用）展现某种程度增加的抗性。因此，引物至少部分免于被核糖核酸酶消化，或者更具体地，当引物与其RNA模板杂交时，引物/模板杂交体至少部分免受核糖核酸酶消化。在优选的实施方案中，至少50%，更优选至少60、70、80或90%，或者甚至100%免于核糖核酸酶处理。例如，引物可以包含2'O–甲基RNA、甲基磷酸酯或2'氟代RNA碱基、锁核酸残基或肽核酸残基，其使引物抗核糖核酸酶的消化。
在一个实施方案中，引物包含由引物序列中1个或更多个天然的或合成的核苷酸分隔的2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个锁核酸。在某些实施方案中，引物包含4到9个锁核酸，每一锁核酸与另外的锁核酸由引物序列中1个或更多个天然的或合成的核苷酸分隔开。
如本文所用的术语“逆转录酶引物”或“RT引物”（也被称为cDNA引物）是指能够在合适条件下作为通过RT的cDNA合成的起始点的寡聚核苷酸。因此，逆转录反应由RT引物引发。RT引物合适的长度一般为6到50个核苷酸，优选15到35个核苷酸。较短的引物分子通常需要较低的温度以形成与mRNA模板充分稳定的杂交复合物，但是仍可使用。将引物从30个核苷酸缩短到25个核苷酸不影响其功能。引物不需要反映精确的模板核酸序列，但是必须充分互补以与模板杂交。适合于cDNA合成的引物的设计在本领域是众所周知的。
一般地，RT引物设计用于结合RNA中感兴趣的区域，例如在希望检测的具体RNA内的区域，或在其中可能出现序列变异的区域（例如等位基因变异或拼接变异、多态性或突变等，例如SNP等）。因此，为了检测是否存在具体的突变等（例如在基因分型的情况下），RT引物可以设计用于在其中出现这种突变的区域之中或周围（例如接近这种区域，例如在这种区域的100、70、50、30、20、15、10或5个核苷酸之内）结合。这种突变或序列变异可以与疾病（例如癌症）或者疾病风险或易患状态有关，或者可以对应于治疗处理等。
RT引物可以包含额外的特征，其允许引物固定到样品的细胞上或样品的细胞内，而不改变引物作为cDNA合成起始点的基本性质。因此，预期引物可以具有功能化部分或用于在细胞或细胞组分上固定引物的手段。例如，这可以是能够结合细胞或细胞组分或者与细胞或细胞组分反应的部分，如上所述，这种细胞组分可以包含RNA。因此，功能化部分可以包含允许引物在模板RNA内保持与引物结合位点杂交的部分，也就是使引物抵抗核糖核酸酶消化的部分。
引物可以进行修饰以包含一个或更多个能够与细胞或细胞组分共价结合的反应性基团，例如化学偶联剂。这可以通过给引物提供化学基团或修饰的核苷酸残基实现，所述修饰的核苷酸残基通过EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）、NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）-酯等携带可以与细胞组分例如蛋白质等反应的化学基团，例如巯基、羟基或氨基团、磷酸基。这种化学偶联基团和将其引入核酸分子的手段在本领域是众所周知的。因此，潜在的反应性官能团包括亲核官能团（胺、醇、硫醇、酰肼），亲电官能团（醛、酯、乙烯基酮、环氧化物、异氰酸酯、马来酰亚胺），能发生环加成反应、形成二硫键或与金属结合的官能团。具体的实例包括伯胺和仲胺、氧肟酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、氧羰基咪唑、硝基苯基酯、三氟乙基酯、缩水甘油醚、乙烯基砜和马来酰亚胺。
可替代地或另外地，引物可以具有能够与细胞或细胞组分或其他样品组分结合的亲和性结合基团。这种亲和性结合基团可以是本领域已知的任何这种结合基团，其在细胞、组织、样品组分等之中或之上对相应结合配偶体具有特异结合活性。因此，代表性的结合基团包括抗体及其片段和衍生物（例如单链抗体等）、可以是天然的或合成的其他结合蛋白及其片段和衍生物（例如凝集素、受体等）、通过筛选技术获得或确定的结合配偶体（例如肽或噬菌体展示等）、适配体等等、或者结合蛋白质（例如在细胞上或细胞内的受体和其他蛋白质）的配偶体的事实上的小分子。这种固定化体系对于丰富的细胞组分例如肌动蛋白丝起最佳作用。
目标RNA或合成的cDNA可以与样品中合成的组分例如替代天然细胞基质的合成凝胶基质连接以保持检测信号的定位。细胞或组织可以浸入凝胶溶液，所述凝胶溶液在聚合后产生cDNA或目标可以与之连接的凝胶基质。例如，如果Acrydite修饰包含在cDNA引物的5'端，那么cDNA可以与聚丙烯酰胺基质共价连接（Mitra&Church，1999）。
可替代地或除了RT引物的前述修饰之外，可以使用上述修饰，其中引物的5'磷酸酯可以通过EDC介导的缀合与细胞基质中蛋白质上存在的胺连接，从而帮助保持RNA相对于其它细胞组分的定位。先前已经关于微RNA及其通过原位杂交的检测描述了这种技术（Pena等，2009）。
为了确保良好的核糖核酸酶抗性，在一些情况下，在RT引物中使用若干修饰的残基，举例来说例如连续的2、3、4、5或6个修饰的残基可以是有利的。优选地，修饰的残基可以每两个或每三个残基并入RT引物中。因此优选地，RT引物可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个修饰的残基。在文献中已经描述了给予核糖核酸酶抗性的各种核酸修饰，并且在该方法中包括任何防止或部分防止RT引物或与之杂交的RNA消化的修饰。
在一个实施方案中，修饰（例如修饰的残基）置于引物的5'端（在引物的5'区域内），而3'端保持未修饰。例如，在3'端的1、2、3、4、5个或最多6个残基是未修饰的。
优选的赋予核糖核酸酶抗性的修饰是将LNA残基并入RT引物中。因此，RT引物可以包含至少1个，优选至少2、3、4、5、6、7、8或9个LNA残基。除了赋予核糖核酸酶抗性，LNA单体还增强了互补RNA的杂交亲和力，从而可以用于提高杂交效率。
在本发明的一个代表性的实施方案中，RT引物每两个或每三个残基包含LNA残基。LNA是双环核苷酸类似物，其中核糖核苷通过亚甲基单元连结在2'-氧和4'-碳原子之间。包含LNA的引物对互补RNA展现出良好的热稳定性，其容许良好的错配识别。此外，LNA提供调整多重分析中引物和探针的Tm值的可能性。
产生的cDNA的长度可以是约10个核苷酸到约1000个核苷酸，在某些实施方案中长度可以是约10个到约500个核苷酸，包括约50个到约500个核苷酸的长度，举例来说约90个到约400个核苷酸的长度，例如约90个到约200个核苷酸的长度、约90个到约100个核苷酸的长度等。在某些代表性实施方案中，cDNA可以具有约10个到约100个核苷酸的长度、约30个到约90个核苷酸的长度、约14个到约70个核苷酸的长度、约50个到约80个核苷酸的长度以及所述范围之间的任意长度。
cDNA可以由脱氧核苷酸和/或能够参与Watson-Crick型或类似的碱基对相互作用的合成核苷酸残基制成。因此，用于并入合成cDNA的逆转录酶步骤的核苷酸可以包括任何能够参与逆转录酶反应（即能够通过逆转录酶并入）的核苷酸类似物或衍生物。
核糖核酸酶也称为RN酶，是一类催化RNA水解的酶。根据本发明的方法使用的核糖核酸酶将能够降解RNA:DNA双链体中的RNA。核糖核酸酶H是切开DNA:RNA双链体中RNA的3'-O-P键以生成3'-羟基和5'-磷酸酯末端的产物的核糖核酸酶家族。由于核糖核酸酶H特异地降解RNA:DNA杂交体中的RNA，而不会降解DNA或未杂交的RNA，其通常用于在通过逆转录的第一链cDNA合成后破坏RNA模板。因此，核糖核酸酶H代表一类优选使用的酶。几乎在所有的生物体中，从古生菌和原核生物到真核生物中都可以发现核糖核酸酶H家族的成员。此外，合适的核糖核酸酶，尤其核糖核酸酶H是众所周知的和广泛可用的酶。
在锁式探针与cDNA序列互补的末端区域杂交后，锁式探针通过连接“环化”。锁式探针的环化可以通过直接地或间接地连接所述锁式探针的末端实施。其过程、试剂和条件在本领域中是众所周知的并且进行了描述，可以根据选择挑选。合适的连接酶包括例如Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、嗜热球菌属（Thermococcus sp.）（菌株9°N）DNA连接酶（9°NTM DNA连接酶，New England Biolabs）、AmpligaseTM（Epicentre Biotechnologies）和T4DNA连接酶。在具体的实施方案中，在锁式探针环化的步骤中，锁式探针的末端区域可以杂交到cDNA的非邻接区域，使得所述末端区域之间有间隙。在该方法另外的具体实施方案中，间隙可以是1到60个核苷酸的间隙，优选1到40个核苷酸的间隙，更优选3到40个核苷酸的间隙。在具体的实施方案中，间隙可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57或60个核苷酸的间隙，以及在示出值之间任意整数个的核苷酸的间隙。在另外的实施方案中，间隙可以大于60个核苷酸。在另外的实施方案中，间隙尺寸可以大于60个核苷酸。在另外的实施方案中，所述末端区域之间的间隙可以通过间隙寡聚核苷酸或通过延伸锁式探针的3'端填充。相应地，间隙寡聚核苷酸的尺寸可以是1到60个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57或60个核苷酸，或在示出值之间任意整数个的核苷酸。在另外的实施方案中，间隙寡聚核苷酸尺寸可以大于60个核苷酸。
环化锁式探针的滚环扩增或“RCA”导致合成含有大量串联重复的探针核苷酸序列的多联体扩增产物。在文献中普遍地描述了RCA反应及其条件，可以适当地使用任何这种条件等。可以在RCA反应的步骤同时，即在相同的步骤中进行连接反应。在一些实施方案中，RCA反应由锁式探针与之杂交的cDNA链的3'端引发。在其他实施方案中，不是用cDNA的3'端引发RCA反应，而是引物杂交至锁式探针并引发RCA反应。在某些方面，该引物杂交至锁式探针的不同于该锁式探针的5'和3'端区域的区域。
在RCA反应由锁式探针与之杂交的cDNA链的3'端引发时，移除cDNA中任何未配对的3'核苷酸以产生用于RCA的引物。这可以通过使用具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶实现。这种靶引发的RCA过程在本领域中是已知的并且进行了描述，用于这种用途的适当的聚合酶同样如此。因此，举例来说，可以使用DNA聚合酶，例如phi29（Φ29）聚合酶、克莱努片段（Klenow fragment）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）DNA聚合酶（BST）、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I。技术人员可以容易地确定可能使用的其他合适的聚合酶，包括例如已经设计或突变为具有期望特征的DNA聚合酶。在RCA反应中，聚合酶从而使用环化的锁式探针作为模板延伸cDNA的3'端。由于RCA，生成含有大量串联重复的探针核苷酸序列的多联体扩增产物，并其可以作为样品中RNA的存在和/或性质的指示进行检测。或者，具有3'-5'核酸外切酶活性的单独的酶可以添加到反应以产生游离的3'端，在这种情况下缺乏3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶于是可以用于RCA。在一些情况下，根据杂交的锁式探针与目标cDNA的3'端的接近，可能不必消化cDNA以在合适的位置产生游离的3'端来使其作为用于RCA的引物。
术语“锁式探针”和“探针”及其复数形式是同义词，并在本说明书全文可交替地使用。在本发明方法的“单重”（与“多重”相对）实施方案的情况下，即当要检测单个RNA或RNA中的单个变异时，使用单个锁式探针。应该理解对于锁式探针或RNA所使用的术语“单个”表示“单种”意义上的单个，即多个相同类型的RNA分子可以存在于用于检测的样品中，可以使用对该RNA特异的多个相同的锁式探针，但是这种多个仅涉及唯一的RNA或锁式探针序列。在多重实施方案中，要检测细胞样品中的两种或更多种不同的目标RNA。在这种实施方案中，细胞样品与用于每一目标RNA的多个锁式探针接触，使得与样品接触的探针的数量可以是两种或更多种，例如三种或更多种，四种或更多种等。任选地，可以使用最多10、15或20种探针。这种方法在高通量应用中特别有用。例如，方法在单个反应中可以采用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40种，或者其中可推出的任意范围数量的锁式探针。
例如，在一个实施方案中，方法包括使样品与至少第一和第二锁式探针接触，其中第一锁式探针包含与所述cDNA上直接相邻区域互补的末端区域，其中第二锁式探针包含在该第二锁式探针的5'或3'端与所述第一锁式探针的末端区域仅差单个核苷酸的末端区域。这样，可以使用两种锁式探针检测RNA序列中单个核苷酸的差异。例如，第一锁式探针可以设置为与和野生型mRNA序列互补的cDNA杂交，第二锁式探针设置为与和mRNA序列的单核苷酸变异体互补的cDNA杂交。除了检测核酸替换之外，锁式探针可以设置为检测核酸序列的插入或缺失。
锁式探针可以具有任意合适的长度以作为RCA模板。例如，锁式探针的总长度（包括两臂和背部）可以是约50到150个核苷酸，优选约60到120个核苷酸，更优选约70到100个核苷酸。因此，例如锁式探针的长度可以是70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸。锁式探针的臂可以具有任意合适的长度，例如每个可以具有约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个，例如13、24、25、26、27、28、29、30、32、35、36、37、38、39或40个核苷酸的长度。在某些实施方案中，锁式探针两臂的长度可以是相同的或基本相同的，例如显示出约1-2个核苷酸的长度差。在另外的实施方案中，两臂的长度可以彼此相差多于两个核苷酸，例如一个臂具有约15个核苷酸的长度，而另一个具有约20个核苷酸的长度。长度差可以优选不超过5到7个核苷酸。除了与cDNA互补的末端区域之外，探针可以含有在RCA或RCA产物的其他扩展或检测中有用的特征或序列或部分。这种序列可以包含用于RCA引物、杂交探针和/或扩增或测序引物的结合位点。因此，锁式探针可以看作具有连接3'和5'目标互补区域的“背部”。通过在该背部或连结区域内包含特定的序列，当通过环化探针的RCA扩增时检测探针或引物可以在RCP中与所述特定的序列结合，锁式探针可以看作具有或更具体地看作提供用于RCP检测的检测位点。相应地，在多重分析的情况下，锁式探针可以含有任意的“标记”或“条形码”序列，其可以用于诊断地鉴定cDNA，以及通过延伸对应的mRNA，给定的RCA产物与其相关。这种序列仅仅是核苷酸的延伸，包括设计为仅在锁式探针中存在的序列，所述锁式探针“特异于”（即仅能够杂交于）特定的cDNA。因此，例如在用于基因分型的锁式探针的情况下，标记序列（或检测位点）对于设计为检测野生型序列及其突变/序列变异的锁式探针可以是不同的。
在本发明的某些方面，锁式探针包括“标记”或“检测探针结合区域”。检测探针结合区域可以用于将检测探针结合区域并入滚环扩增产物用于之后与标记的检测探针的杂交。不同的锁式探针可以具有不同的检测探针结合区域，使得不同标记的检测探针可以在滚环扩增产物的检测中使用。例如，第一锁式探针可以包括第一检测探针结合区域，第二锁式探针可以包括第二检测探针结合区域。然后，样品可以与包含与第一锁式探针的第一检测探针结合区域相同序列的第一标记的检测探针和包含与第一锁式探针的第二检测探针结合区域相同序列的第二标记的检测探针接触，使得第一和第二标记的检测探针与如果有的话通过第一和第二锁式探针产生的滚环扩增产物杂交。
本文广泛使用术语“检测”以包含任何在样品中测定或测量（例如定量地测定）至少一种RNA存在（即其是否存在，或到什么程度）的意思。“定位”检测表示RNA检测产生的信号定位到RNA。因此，RNA可以在样品中在其位置中或在其位置处检测。换句话说，可以测定（或“检测”）RNA在样品内的空间位置（或定位）。这表示RNA可以定位到其中表达它的细胞或在其中表达它的细胞内定位，或者定位到在细胞或组织样品内的位置。因此，“定位检测”可以包括以任何方式测定、测量、评估或分析RNA的存在或量和位置或不存在。包括定量和定性的测定、测量或评估，包括半定量。例如当在样品中检测到两种或更多种不同的RNA时，这种测定、测量或评估可以是相对的。
如本文所用，术语“原位”是指至少一种RNA在其原生的情况下的检测，即在其中其正常出现的细胞、器官、体液或组织中。因此，这可以是指RNA天然的或原生的定位。换句话说，RNA可以在其原生的环境或情况下在其出现的位置或原样进行检测。因此，RNA没有从其正常位置移走，即其未以任何方式分离或纯化，或转移到其他的位置或介质等。一般地，该术语是指RNA如其存在于细胞内或在细胞、器官、体液或组织样品内的原样，例如在细胞或组织内和/或在其正常或原生的细胞环境内的其原生的定位。
用于标记核酸的各种标记是已知的，并且可以用于滚环扩增产物的检测。这种标记的非限制性实例包括荧光标记、生色标记、放射性标记、发光标记、磁性标记和电子密度标记。标记可以直接并入扩增产物，例如在扩增过程中用修饰的或标记的dNTP。或者，扩增产物可以间接进行标记，例如通过与标记的探针的杂交。在多重反应中，期望对于反应中可能存在的每一不同的扩增产物可以使用不同的标记。
检测方法将取决于所使用标记的类型。在某些实施方案中，检测通过荧光或生色标记的成像或直接显示进行。相应地，本方法允许在目标RNA的位置原位检测扩增产物。该灵敏度使得能够例如在单细胞水平基因分型。
“样品”可以是其中可以出现RNA分子的任何细胞样品，达到这种样品可以接受原位检测的程度。典型地，样品可以是其中可以出现RNA的任何生物的、临床的或环境的样品，尤其是其中在样品中固定的、可检测的或可视的位置存在RNA的样品。样品从而是任何反映RNA正常或原生的（原位）定位的样品，即任何其中RNA正常地或原生地出现的样品。例如，样品可以来源于身体的组织或器官，或者来源于体液。这种样品会有利地是或包括细胞或细胞组，例如组织。例如，样品可以是结肠、肺、胰腺、前列腺、皮肤、甲状腺、肝、卵巢、子宫内膜、肾、脑、睾丸、淋巴液、血液、血浆、膀胱或乳房样品，或者包括结肠、肺、胰腺、前列腺、皮肤、甲状腺、肝、卵巢、子宫内膜、肾、脑、睾丸、淋巴液、血液、膀胱或乳房细胞、细胞组或组织部分。
尤其优选的是样品，例如培养的或收获的或活组织切除的细胞或组织样品，例如如上所述，其中可以检测RNA以揭示RNA的定性本质，即其是存在的，或者mRNA的核苷酸序列或mRNA中一种或更多种核苷酸的存在和/或鉴定，以及相对于细胞其他特征的定位。细胞样品可以是新鲜制备的，或者可以以任何方便的方式预处理的，例如通过固定或冷冻。相应地，可以使用新鲜的、冷冻的或固定的细胞或组织，例如FFPE的组织（福尔马林固定石蜡包埋的）。因此，可以使用处理的或未处理的组织切片。或者，可以使用组织的接触印迹样品。在该过程中，单层细胞印到表面（例如载玻片）上，形态与正常组织切片相似。使用新鲜的组织样品获得接触印迹。可以使用其他细胞学制备，例如在载玻片上固定或生长的细胞，或为流式细胞仪制备的细胞。
在具体的实施方案中，可以制备细胞或组织样品，例如新鲜地制备的，或可以以任何方便的方式预处理的，附带条件是制备不是新鲜冷冻组织的制备。在另外的具体实施方案中，可以制备细胞或组织样品，例如新鲜地制备的，或可以以任何方便的方式预处理的，附带条件是制备不是包括在正电荷防脱（Superfrost Plus）载玻片上接种的制备。在再一具体实施方案中，可以制备细胞或组织样品，例如新鲜地制备的，或可以以任何方便的方式预处理的，附带条件是制备不是如在Larsson等，Nature Methods，2010，7(5)卷，第395-397页中所公开的制备。在非常具体的实施方案中，可以制备细胞或组织样品，例如新鲜地制备的，或可以以任何方便的方式预处理的，附带条件是制备不是如在Larsson等，Nature Methods，2010，7(5)卷，第395-397页的在线方法的“组织切片的制备（Preparation of tissue sections）”和/或“用于原位实验的样品预处理（Sample pretreatment for in situexperiments）”章节中所公开的制备。
样品可以包括含有RNA的任何细胞类型，包括所有类型哺乳动物和非哺乳动物动物细胞、植物细胞、包括蓝-绿藻类的藻类、真菌、细菌、原生动物等。代表性实例因而包括临床样品，例如全血或源于血液的产物、血液细胞、组织、活组织切除、以及其他样品，例如细胞培养物和细胞悬液等。在本发明的某些方面，样品包含或疑似包含癌症细胞，例如结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、急性非淋巴细胞白血病、脊髓发育不良、膀胱癌、头颈癌或乳癌细胞。例如，样品可以是疑似生癌的或疑似包括在癌症或生癌细胞或者生癌细胞组或组织中发现的mRNA的结肠、肺、胰腺、前列腺、皮肤、甲状腺、肝、卵巢、子宫内膜、肾、脑、睾丸、淋巴液、血液、血浆、膀胱或乳房样品。
在一些实施方案中，样品从之前已知患有癌症的患者获得，所述癌症经过治疗或者变得缓解。在一些情况下，患者可能患有复发的癌症。在其他实施方案中，患者可能有转移或疑似有转移或处于转移的风险。处于癌症或转移风险的患者可能由于家族史或其他遗传易感性的确定而处于风险。在其他实施方案中，患者可能已经确定或者可能确定为具有展现出癌症病理学的细胞或癌症前期细胞。
在病理学命名法中，癌症“复发”是指癌症在原发肿瘤的位置处再次生长。对于许多癌症，这种复发是由不完全的手术移除或由手术区域外临近的血液或淋巴管中的微转移病变造成的。相反地，“转移”是指癌症在远离原发肿瘤的位置生长。据认为癌症的转移是由血管和/或淋巴渗透和肿瘤细胞在手术移除前从原发肿瘤位置的扩散造成的。用于癌症统计的普遍的临床命名法有些混乱，由于经历治疗癌症的第二阶段的患者被称为已经经历了“复发”，而这些病变通常是在远离原发癌症的位点的临时远程转移。本文中将要使用的该临床术语，即术语“复发”表示这些后出现的转移病变，除非需要特别的病理学命名法来分开临床复发的两种形式。
在某些实施方案中，样品含有生癌前的或恶化前的细胞，包括但不限于化生、发育异常和/或增生。其也可以用于鉴定不期望的但是良性的细胞，例如鳞状化生、发育异常、良性前列腺增生细胞和/或增生病变。
在另外的实施方案中，关于特定类型肺癌来实施方法和组合物。它们可以以诊断处于特定类型肺癌风险或显示特定类型肺癌症状的患者进行实施。在一些实施方案中，特定类型的肺癌是与小细胞肺癌（SCLC）有区别的非小细胞肺癌（NSCLS）。在其他的实施方案中，NSCLC是鳞状细胞癌（或表皮样癌）、腺癌、细支气管肺泡癌或大细胞未分化癌。
在某些实施方案中，关于特定类型结肠癌来实施方法和组合物。它们可以以诊断处于特定类型肺癌风险或显示特定类型结肠癌症状的患者进行实施。在一些实施方案中，特定类型的结肠癌是腺癌、平滑肌肉瘤、结肠直肠淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌瘤（攻击性或顽性的）。在腺癌的情况下，癌症可以进一步分为粘蛋白的或图章戒指细胞（signet ring）亚型。
术语“目标”、“目标序列”、“目标区域”和“目标核酸”等在本文中同义地使用，是指待检测的或在方法中所用试剂与之结合的核酸或其区域或序列，例如待检测的RNA或cDNA，或更具体地锁式探针与之杂交的其区域。因此，目标序列可以在cDNA内，在这种情况下应理解cDNA核苷酸序列来源自并且互补于目标RNA核苷酸序列。在某些实施方案中，目标可以是单个RNA分子。在其他实施方案中，目标可以是至少一种RNA分子，例如2、3、4、5、6种或更多种RNA分子的组。这些RNA分子的分子类型可以不同，和/或它们的序列可以不同。
如本文所使用的术语“杂交”是指两个单链核酸由于互补碱基配对形成双链体结构。杂交可以在完全互补的核酸链之间或在含有少数错配区域的“基本互补的”核酸链之间发生。非常优选完全互补核酸链的杂交的条件被称为“严格杂交条件”或“序列特异性杂交条件”。基本互补序列的稳定双链体可以在较不严格的杂交条件下获得；可接受的错配程度可以通过适当调整杂交条件进行控制。核酸领域的技术技术人员可以按照文献（参见例如Sambrook等，1989.；Wetmur，1991；和Owczarzy等，2008，其通过引用并入本文）提供的指导经验地考虑许多变量，包括例如寡聚核苷酸的长度和碱基对组成、离子强度和错配碱基对的发生率，来确定双链体稳定性。因此，适当引物和探针的设计以及它们与其各自目标杂交的条件完全在本领域技术人员的常规技术范围内。
KRAS中的突变在一些类型的癌症中是常见的。在某些实施方案中，本发明提供一种用于原位检测是否存在KRAS突变的方法。在具体的实施方案中，方法使用设置为与对应于选自12AGT、12CGT、12TGT、12GAT、12GCT、12GTT和13GAC（其中野生型序列是12GGT和13GGC）的一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和KRAS密码子61的突变体、KRAS密码子146的突变体和KRAS的3'未翻译区域的突变体的cDNA杂交的锁式探针。在一些实施方案中，方法使用设置为与对应于野生型KRAS序列的cDNA杂交的锁式探针。在另外的实施方案中,方法使用设置为与对应于选自12AGT、12CGT、12TGT、12GAT、12GCT、12GTT和13GAC（其中野生型序列是12GGT和13GGC）的一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和KRAS密码子61的突变体，KRAS密码子146的突变体和KRAS的3'未翻译区域的突变体；以及对应于选自12GGT和13GGC的一种或更多种野生型KRAS mRNA序列，KRAS密码子61的、KRAS密码子146的和KRAS的3'未翻译区域的野生型序列的cDNA杂交的锁式探针。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于检测在编码HER2、cMyc、TERT、APC、Braf、PTEN、PI3K和/或EGFR的mRNA中是否存在突变的方法。在具体的实施方案中，方法使用设置为与对应于一种或更多种变异体HER2、cMyc、TERT、Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的cDNA杂交的锁式探针。在另外的实施方案中，方法使用设置为与对应于一种或更多种野生型HER2、cMyc、TERT、Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的cDNA杂交的锁式探针。在另外的实施方案中，锁式探针设置为与对应于一种或更多种突变型Braf、PTEN和/或PI3K的mRNA序列和对应于一种或更多种野生型Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的cDNA杂交。本发明因此提供用于检测是否存在对应于一种或更多种突变型和野生型Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的滚环扩增产物的方法。
在另外一组实施方案中，锁式探针设置为与对应于一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型Braf mRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型APC mRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型PTEN mRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型PI3K mRNA序列的cDNA杂交。因此，本发明提供用于检测是否存在对应于突变型KRAS和突变型Braf mRNA序列，或者对应于突变型KRAS和突变型APC mRNA序列，或者对应于突变型KRAS和突变型PTEN mRNA序列，或者对应于突变型KRAS和突变型PI3K mRNA序列的滚环扩增产物的方法。
在另外的实施方案中，锁式探针设置为与对应于野生型KRAS和野生型Braf mRNA序列，或者对应于野生型KRAS和野生型APCmRNA序列，或者对应于野生型KRAS和野生型PTEN mRNA序列，或者对应于野生型KRAS和野生型PI3K mRNA序列的cDNA杂交。因此，本发明提供用于检测是否存在对应于野生型KRAS和BrafmRNA序列，或者对应于野生型KRAS和APC mRNA序列，或者对应于野生型KRAS和PTEN mRNA序列，或者对应于野生型KRAS和PI3K mRNA序列的滚环扩增产物的方法。
在另一组实施方案中，锁式探针设置为与（i）对应于一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型BrafmRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型APC mRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型PTENmRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型PI3K mRNA序列的cDNA；以及（ii）对应于野生型KRAS和Braf mRNA序列，或者对应于野生型KRAS和APCmRNA序列，或者对应于野生型KRAS和PTEN mRNA序列，或者对应于野生型KRAS和PI3K mRNA序列的cDNA杂交。因此，本发明提供用于检测是否存在对应于一种或更多种突变型和野生型KRAS和Braf mRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型和野生型KRAS和APC mRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型和野生型KRAS和PTEN mRNA序列，或者对应于一种或更多种突变型和野生型KRAS和PI3K mRNA序列的滚环扩增产物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种对KRAS基因突变特异的锁式探针的集合，包括：
(a)Y1-X1-Z1-A
(b)Y1-X1-Z1-T
(c)Y1-X1-Z1-C
(d)Y2-X1-Z2-A
(e)Y2-X1-Z2-T
(f)Y2-X1-Z2-C，和
(g)Y3-X1-Z3-A；
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
Y2+Z2=20到40个核苷酸；
Y3+Z3=20到40个核苷酸；
Y1是GTGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:1)、GTGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:2)、GTGGCGTAGGCAA(SEQ IDNO:3)、GTGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:4)、GTGGCGTAGGC(SEQ IDNO:5)、GTGGCGTAGG(SEQ ID NO:6)、GTGGCGTAG、GTGGCGTA、GTGGCGT、GTGGCG、GTGGC、GTGG、GTG、GT、G；
Y2是TGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG(SEQ IDNO:9)、TGGCGTAGGCAA(SEQ ID NO:10)、TGGCGTAGGCA(SEQID NO:11)、TGGCGTAGGC(SEQ ID NO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、TGGCGT、TGGCG、TGGC、TGG、TG、T；
Y3是TGGCGTAGGCAAGAGTGC(SEQ ID NO:13)、TGGCGTAGGCAAGAGTG(SEQ ID NO:14)、TGGCGTAGGCAAGAGT(SEQ ID NO:15)、TGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:9)、TGGCGTAGGCAA(SEQ IDNO:10)、TGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:11)、TGGCGTAGGC(SEQ IDNO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、TGGCGT、TGGCG、TGGC、TGG、TG、T；
Z1是TGGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:27)、GGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:28)、GTAGTTGGAGCT(SEQ IDNO:29)、TAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:30)、AGTTGGAGCT(SEQ IDNO:31)、GTTGGAGCT、TTGGAGCT、TGGAGCT、GGAGCT、GAGCT、AGCT、GCT、CT、T或键；
Z2是GGTAGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:16)、GTAGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:17)、TAGTTGGAGCTG(SEQ IDNO:18)、AGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:19)、GTTGGAGCTG(SEQ IDNO:20)、TTGGAGCTG、TGGAGCTG、GGAGCTG、GAGCTG、AGCTG、GCTG、CTG、TG、G或键；和
Z3是AGTTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:21)、GTTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:22)、TTGGAGCTGGGTG(SEQID NO:23)、TGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:24)、GGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:25)、GAGCTGGGTG(SEQ ID NO:26)、AGCTGGGTG、GCTGGGTG、CTGGGTG、TGGGTG、GGGTG、GGTG、GTG、TG、G或键。
在一些实施方案中，该KRAS探针的集合进一步包括：
(h)Y1-X2-Z1-G
(i)Y2-X2-Z2-G
(j)Y3-X2-Z3-G
其中X2是从10到50个核苷酸。
在一个具体的实施方案中，该KRAS探针的集合进一步包括：
(h)Y1-X2-Z1-G
(i)Y2-X2-Z2-G
(j)Y3-X2-Z3-G
其中X2是从10到50个核苷酸，并且与X1不同。
在另外的实施方案中，本发明提供一种对Braf基因突变特异性的锁式探针的集合，包括：
(k)Y1-X1-Z1-A
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
Y1是GAAATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:102)、AAATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:103)、AATCTCGATGGAG(SEQID NO:104)、ATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:105)、TCTCGATGGAG(SEQ ID NO:106)、CTCGATGGAG(SEQ ID NO:107)、TCGATGGAG、CGATGGAG、GATGGAG、ATGGAG、TGGAG、GGAG、GAG、AG、G；和
Z1是TGGTCTAGCTACAG(SEQ ID NO:108)、GGTCTAGCTACAG(SEQ ID NO:109)、GTCTAGCTACAG(SEQ IDNO:110)、TCTAGCTACAG(SEQ ID NO:111)、CTAGCTACAG(SEQID NO:112)、TAGCTACAG、AGCTACAG、GCTACAG、CTACAG、TACAG、ACAG、CAG、AG、G或键。
在一些实施方案中，Braf探针的集合进一步包括：
(l)Y1-X2-Z1-T
其中X2是从10到50个核苷酸。
在一个具体的实施方案中，Braf探针的集合进一步包括：
(l)Y1-X2-Z1-T
其中X2是从10到50个核苷酸，并且与X1不同。
在另外的实施方案中，本发明提供一种对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针的集合，包括：
(m)Y1-X1-Z1-W
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
其中，Y1包括5-20个3'对应APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变的核苷酸；
其中，Z1包括5-20个在5'对应APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变的核苷酸；和
其中，W是与APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变互补的核苷酸。
在一些实施方案中，该对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针的集合，进一步包括：
(n)Y1-X2-Z1-V
其中X2是从10到50个核苷酸；和
其中，V是与在APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变位点与野生型序列互补的核苷酸。
在具体的实施方案中，该对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针的集合，进一步包括：
(n)Y1-X2-Z1-V
其中X2是从10到50个核苷酸，并且与X1不同；和
其中，V是与在APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变位点与野生型序列互补的核苷酸。
在一些实施方案中，X1是从25到50个核苷酸。在一些实施方案中，X1包含至少一个标记的核苷酸。在一些实施方案中，各探针(a)-(g)具有相同的X1。在一些实施方案中，选自(a)-(g)、(k)和(m)的各探针具有相同的X2。
在本发明的某些方面，每一Y1+Z1、Y2+Z2和Y3+Z3是至少约25个核苷酸。
在本发明的某些方面，探针集合中的各探针具有至少40%的GC含量。
在一些实施方案中，本发明提供一种对KRAS基因突变特异、对Braf基因突变特异、对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针的集合，和任选地对相应野生型序列特异的锁式探针的集合，例如如上所限定的，所述集合能够检测(i)KRAS基因、(ii)KRAS基因和Braf基因、(iii)KRAS基因和APC基因、(iv)KRAS基因和PTEN基因或(v)KRAS基因和PI3K基因中的多个突变，其中所述多个突变构成至少40%与癌症有关的KRAS突变。
在另外的实施方案中，本发明提供一种对KRAS基因突变特异，对Braf基因突变特异，对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针的集合，和任选地对相应野生型序列特异的锁式探针的集合，例如如上所限定的，其中(i)KRAS基因、(ii)KRAS基因和Braf基因、(iii)KRAS基因和APC基因、(iv)KRAS基因和PTEN基因或(v)KRAS基因和PI3K基因的突变的检测使得能够确定癌症或者癌症的易患状态的存在。
在一个具体的实施方案中，在至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，优选约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，更优选约80%、85%、90%或95%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者中确定所述癌症或癌症的易患状态。
在另外的实施方案中，本发明提供一种对KRAS基因突变特异，对Braf基因突变特异，对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针集合，和任选地对相应野生型序列特异的锁式探针的集合的用途，例如如上所限定的，用于在患者或患者组中确定是否存在KRAS突变体肿瘤或确定KRAS突变体肿瘤的易患状态。
在一个具体的实施方案中，在患者或患者组中确定是否存在KRAS突变体肿瘤或确定KRAS突变体肿瘤的易患状态使得能够在至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%，优选约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，更优选约80%、85%、90%或95%忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者中确定癌症的存在。
“忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者”或“忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组”是指个体或个体的组，其中每一患者或组成员包括至少一种KRAS基因中的突变（或对应的突变体），所述突变已经在科学文献中描述过或对技术人员是已知的，其与肿瘤发展有关，例如与肿瘤的表现或肿瘤的易患状态有关，与不同的肿瘤发展阶段有关或与完整生长的肿瘤或癌症有关。在具体的实施方案中，这些突变或突变体包括可以来源于与癌症或癌症前期相关的2012年2月15日的Sanger数据库（万维网sanger.ac.uk上）的突变。
在具体的实施方案中，患者组，即患者组的每一成员可能忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体以及Braf基因和/或APC基因和/或PTEN基因和/或PI3K基因中额外的突变。这些突变的组合可能促进与KRAS突变相关的肿瘤发展；或者它们可能构成与癌症或癌症前期形式或癌症的易患状态有关的突变组合。在另外的具体实施方案中，患者组，即患者组的每一成员可能忍受Braf基因和/或APC基因和/或PTEN基因和/或PI3K基因中的突变。这些与癌症或癌症前期形式或癌症的易患状态有关的突变可以来源于Sanger数据库（万维网sanger.ac.uk上）。在另外的具体实施方案中，患者组，即患者组的每一成员可能忍受EGFR基因和/或KRAS基因和/或Braf基因和/或APC基因和/或PTEN基因和/或PI3K基因中的突变。这些与癌症或癌症前期形式或癌症的易患状态有关的突变可以来源于Sanger数据库（万维网sanger.ac.uk上）。此外，根据本发明可以检测的或者在本发明的组合物的情况下可以采用的EGFR突变的实例列于表7中。
在一些实施方案中，所述癌症是结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、急性非淋巴细胞白血病、脊髓发育不良、膀胱癌、头颈癌或乳癌。在另外的实施方案中，所述癌症的易患状态是结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、急性非淋巴细胞白血病、脊髓发育不良、膀胱癌、头颈癌或乳癌的易患状态。
在另外的实施方案中，结肠直肠癌是转移性结肠直肠癌、腺癌、平滑肌肉瘤、结肠直肠淋巴瘤、黑素瘤或神经内分泌肿瘤。在其他实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌（NSCLC）或小细胞肺癌（SCLC）。
在另外的实施方案中，本发明提供对KRAS基因突变特异，对Braf基因突变特异，对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针集合，和任选地对相应野生型序列特异的锁式探针的集合，例如如上所限定的，或者其用途，例如如上所限定的，使得能够确定
(i)在至少约25到60%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中结肠直肠癌的存在；
(ii)在至少约25到60%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中肺癌的存在；
(iii)在至少约80到90%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中胰腺癌的存在；
(iv)在至少约5到25%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中前列腺癌的存在；
(v)在至少约5到25%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中皮肤癌的存在；
(vi)在至少约5到60%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中甲状腺癌的存在；
(vii)在至少约10到25%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中肝癌的存在；
(viii)在至少约5到50%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中卵巢癌的存在；
(ix)在至少约10到40%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中子宫内膜癌的存在；
(x)在至少约5到50%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中肾癌的存在；
(xi)在至少约5到15%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中脑癌的存在；
(xii)在至少约10到45%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中睾丸癌的存在；
(xiii)在至少约5到15%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中急性非淋巴细胞白血病的存在；
(xiv)在至少约5%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中膀胱癌的存在；
(xv)在至少约5到10%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中头颈癌的存在；
(xvi)在至少约5到10%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中乳癌的存在。在一些实施方案中，上述探针集合与一种或更多种以下物质一起在试剂盒中提供：
(ii)包括一个或更多个锁核酸并能够与所述目标RNA杂交的逆转录酶引物；
(iii)逆转录酶；
(iv)核糖核酸酶；
(v)连接酶；
(vi)具有3'核酸外切酶活性的聚合酶；
(vii)能够与所述锁式探针的互补物杂交的检测探针；或
(ix)核苷酸。
在另外的实施方案中，本发明提供一种用于载玻片表面上的细胞样品中编码一种或更多种KRAS基因突变的mRNA的定位的原位检测的方法，包括：
(a)由样品中的mRNA产生cDNA，其中引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分，或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团；
(b)添加核糖核酸酶到所述样品以消化杂交到所述cDNA的mRNA；
(c)使所述样品与一种或更多种对KRAS基因突变特异的锁式探针接触，其中每一锁式探针包括选自对KRAS基因突变特异，对Braf基因突变特异，对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针集合以及任选的对相应的野生型序列特异的锁式探针集合的序列，例如如上所限定的。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于载玻片表面上的细胞样品中编码一种或更多种KRAS基因突变的mRNA的定位的原位检测的方法，包括：
(a)由样品中的mRNA产生cDNA，其中引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分，或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团；
(b)添加核糖核酸酶到所述样品以消化与所述cDNA杂交的mRNA；
(c)使所述样品与一种或更多种对KRAS基因突变特异的锁式探针接触，其中每一锁式探针包括选自以下序列的序列：
(a)Y1-X1-Z1-A
(b)Y1-X1-Z1-T
(c)Y1-X1-Z1-C
(d)Y2-X1-Z2-A
(e)Y2-X1-Z2-T
(f)Y2-X1-Z2-C，和
(g)Y3-X1-Z3-A；
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
Y2+Z2=20到40个核苷酸；
Y3+Z3=20到40个核苷酸；
Y1是GTGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:1)、GTGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:2)、GTGGCGTAGGCAA(SEQ IDNO:3)、GTGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:4)、GTGGCGTAGGC(SEQ IDNO:5)、GTGGCGTAGG(SEQ ID NO:6)、GTGGCGTAG、GTGGCGTA、GTGGCGT、GTGGCG、GTGGC、GTGG、GTG、GT、G；
Y2是TGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG(SEQ IDNO:9)、TGGCGTAGGCAA(SEQ ID NO:10)、TGGCGTAGGCA(SEQID NO:11)、TGGCGTAGGC(SEQ ID NO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、TGGCGT、TGGCG、TGGC、TGG、TG、T；
Y3是TGGCGTAGGCAAGAGTGC(SEQ ID NO:13)、TGGCGTAGGCAAGAGTG(SEQ ID NO:14)、TGGCGTAGGCAAGAGT(SEQ ID NO:15)、TGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:9)、TGGCGTAGGCAA(SEQ IDNO:10)、TGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:11)、TGGCGTAGGC(SEQ IDNO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、TGGCGT、TGGCG、TGGC、TGG、TG、T；
Z1是TGGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:27)、GGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:28)、GTAGTTGGAGCT(SEQ IDNO:29)、TAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:30)、AGTTGGAGCT(SEQ IDNO:31)、GTTGGAGCT、TTGGAGCT、TGGAGCT、GGAGCT、GAGCT、AGCT、GCT、CT、T或键；
Z2是GGTAGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:16)、GTAGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:17)、TAGTTGGAGCTG(SEQ IDNO:18)、AGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:19)、GTTGGAGCTG(SEQ IDNO:20)、TTGGAGCTG、TGGAGCTG、GGAGCTG、GAGCTG、AGCTG、GCTG、CTG、TG、G或键；和
Z3是AGTTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:21)、GTTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:22)、TTGGAGCTGGGTG(SEQID NO:23)、TGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:24)、GGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:25)、GAGCTGGGTG(SEQ ID NO:26)、AGCTGGGTG、GCTGGGTG、CTGGGTG、TGGGTG、GGGTG、GGTG、GTG、TG、G或键；
(d)直接或间接地连接所述锁式探针的末端；
(e)使用具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶使所述环化锁式探针进行滚环扩增（RCA），其中如果需要所述核酸外切酶活性消化cDNA以产生作为用于所述RCA的引物的游离3'端；和
(f)检测滚环扩增产物。
在所述方法的一些实施方案中，步骤(c)进一步包括使所述样品与锁式探针(h)、(i)和(j)接触，其中各锁式探针(h)、(i)和(j)对野生型KRAS基因特异并具有以下序列：
(h)Y1-X2-Z1-G
(i)Y2-X2-Z2-G，和
(j)Y3-X2-Z3-G
其中X2是从10到50个核苷酸。
在所述方法的具体实施方案中，步骤(c)进一步包括使所述样品与锁式探针(h)、(i)和(j)接触，其中各锁式探针(h)、(i)和(j)对野生型KRAS基因特异并具有以下序列：
(h)Y1-X2-Z1-G
(i)Y2-X2-Z2-G，和
(j)Y3-X2-Z3-G
其中X2是从10到50个核苷酸，并且与X1不同。
在一个另外的实施方案中，本发明提供一种用于载玻片表面上的细胞样品中编码一种或更多种Braf基因的mRNA的定位的原位检测的方法，包括：
(a)由样品中的mRNA产生cDNA，其中引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分、或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团；
(b)添加核糖核酸酶到所述样品以消化与所述cDNA杂交的mRNA；
(c)使所述样品与一种或更多种对Braf基因突变特异的锁式探针接触，其中每一锁式探针包括选自以下序列的序列：
(k)Y1-X1-Z1-A
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
Y1是GAAATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:102)、AAATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:103)、AATCTCGATGGAG(SEQID NO:104)、ATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:105)、TCTCGATGGAG(SEQ ID NO:106)、CTCGATGGAG(SEQ ID NO:107)、TCGATGGAG、CGATGGAG、GATGGAG、ATGGAG、TGGAG、GGAG、GAG、AG、G；和
Z1是TGGTCTAGCTACAG(SEQ ID NO:108)、GGTCTAGCTACAG(SEQ ID NO:109)、GTCTAGCTACAG(SEQ IDNO:110)、TCTAGCTACAG(SEQ ID NO:111)、CTAGCTACAG(SEQID NO:112)、TAGCTACAG、AGCTACAG、GCTACAG、CTACAG、TACAG、ACAG、CAG、AG、G或键
(d)直接或间接地连接所述锁式探针的末端；
(e)使用具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶使所述环化锁式探针进行滚环扩增（RCA），其中如果需要所述核酸外切酶活性消化cDNA以产生作为用于所述RCA的引物的游离3'端；和
(f)检测滚环扩增产物。
在所述方法的一些实施方案中，步骤(c)进一步包括使所述样品与锁式探针(l)接触，其中各锁式探针(l)对野生型Braf基因特异并具有以下序列：
(l)Y1-X2-Z1-T
其中X2是从10到50个核苷酸。
在所述方法的具体实施方案中，步骤(c)进一步包括使所述样品与锁式探针(l)接触，其中各锁式探针(l)对野生型Braf基因特异并具有以下序列：
(l)Y1-X2-Z1-T
其中X2是从10到50个核苷酸，并且与X1不同。
在另外的实施方案中，本发明提供一种用于载玻片表面上的细胞样品中编码一种或更多种APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变的mRNA的定位的原位检测的方法，包括：
(a)由样品中的mRNA产生cDNA，其中引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分，或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团；
(b)添加核糖核酸酶到所述样品以消化与所述cDNA杂交的mRNA；
(c)使所述样品与一种或更多种对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针接触，其中每一锁式探针包括选自以下序列的序列：
(m)Y1-X1-Z1-W
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
其中，Y1包括5-20个3'对应APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变的核苷酸；
其中，Z1包括5-20个在5'对应APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变的核苷酸；和
其中，W是与APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变互补的核苷酸。
在所述方法的一些实施方案中，步骤(c)进一步包括使所述样品与锁式探针(n)接触，其中各锁式探针(n)对野生型APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR特异并具有以下序列：
(n)Y1-X2-Z1-V
其中X2是从10到50个核苷酸；和
其中，V是与在APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变位点与野生型序列互补的核苷酸。
在所述方法的具体实施方案中，步骤(c)进一步包括使所述样品与锁式探针(n)接触，其中各锁式探针(n)对野生型APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR特异并具有以下序列：
(n)Y1-X2-Z1-V
其中X2是从10到50个核苷酸，并且与X1不同；和
其中，V是与在APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146或者KRAS基因3'UTR中的点突变位点与野生型序列互补的核苷酸。
在一些实施方案中，X1和X2各自包含至少一个标记的核苷酸。在本发明的一些方面，标记是荧光的或生色的。在一些实施方案中，选自(a)-(g)、(k)和(m)的各探针具有相同的X1。在一些实施方案中，选自(h)-(j)、(l)和(n)的各探针具有相同的X2。
在所述方法的一些实施方案中，引物包括2'O-甲基RNA、甲基磷酸酯或2'氟化RNA碱基、肽基核酸残基或锁核酸残基。在一些实施方案中，样品包括固定的组织切片、新鲜冷冻的组织、接触印迹样品或包括一种或更多个细胞的细胞学制备。
预期本文所述的任何方法或组合物可以关于本文所述的任何其他方法或组合物来实施。
术语“包括”（任何形式）、“具有”（任何形式）、“含有”（任何形式）和“包含”（任何形式）是开放式连接动词。因此，一种“包括”、“具有”、“含有”或“包含”一个或更多个所述步骤或要素的方法、组合物、试剂盒或体系具有所描述的那些步骤和元素，但是不限于仅具有那些步骤和要素；其可以具有（即包括）未描述的要素或步骤。同样地，“包括”、“具有”、“含有”或“包含”一个或更多个所述特征的方法、组合物、试剂盒或体系的要素具有那些特征，但是不限于仅具有那些特征；其可以具有未描述的特征。
任何本发明方法、组合物、试剂盒和体系的任何实施方案可以由或基本由所描述的步骤和/或特征组成，而不是包括/包含/含有/具有所描述的步骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，可以用术语“由......组成”或“基本由......组成”替换任何上述开放式连接动词，以使给定权利要求的范围从其本来使用开放式连接动词的范围发生变化。
术语“或”在权利要求中的使用用于表示“和/或”，除非明确地说明是仅指替代选择，或选择是相互排斥的，尽管公开支持仅指选择和“和/或”的定义。
在本申请全文，术语“约”用于表明数值包括确定数值使用的装置或方法的误差的标准差。
根据长期存在的专利法，当在权利要求书或说明书中和词语“包括”一起使用不加数量词修饰时表示一个或更多个，除非明确地说明。
通过下面的详细描述本发明的其他目标、特征和优点会变得显而易见。然而，应该理解详细的说明和具体的实施例尽管表明本发明的具体实施方案，但是仅以举例说明的方式给出，这是因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改通过该详细说明对本领域技术人员会变得明显。
附图说明
以下附图形成本说明的一部分，包含以进一步说明本发明的某些方面。通过参照一个或更多个这些附图结合本文所提供的具体实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。
图1：利用锁式探针和靶引发的RCA原位检测单独的转录物的示意图。cDcDNA使用锁核酸（LNA）修饰的引物产生，并在mRNA被核糖核酸酶H降解后结合探针。RCP通过荧光检测探针的杂交来鉴定。
图2a到2d：在癌症和原始人类细胞系中癌症相关转录物的多重原位检测。以柱状图显示不同细胞系中RCP的定量：(a)人类卵巢癌细胞（SKOV3）；(b)人类乳癌细胞（SKBR3）；(c)TERT固定的人类成纤维细胞（BJhTERT）；和(d)原始人类成纤维细胞培养物GM08402。
图3：LNA碱基并入用于cDNA原位合成的引物的效果。利用不同LNA取代的cDNA引物与仅由DNA碱基（未修饰）构成的未修饰的用于cDNA原位合成的引物进行比较。合成的cDNA利用锁式探针和靶引发的RCA进行检测，并通过计数RCP/细胞进行定量。所研究的引物具有五、七或九个位于引物5'端每两个或每三个位置的LNA碱基。引物总长度为25nt（核苷酸）或30nt（在括号中表明）。
图4：cDNA合成长度的研究。比较位于离mRNA的5’端不同距离的PLP-βe1锁式探针所位于的目标位点的位置的引物用于利用锁式探针和靶引发的RCA原位检测β-肌动蛋白转录物以研究cDNA合成的效率。当不添加任何引物进行逆转录时，每个细胞平均检测到七个RCP（图中未示出）。
图5：在培养的人类成纤维细胞中单个β-肌动蛋白转录物的检测。在GM08402细胞中探针结合β-肌动蛋白转录物上外显子1和6中的目标位点。不添加逆转录酶进行阴性对照。
图6a和6b：单个培养细胞中RCP的定量。直方图显示(a)GM08402培养物的134个细胞中的β-肌动蛋白RCP和(b)A-427培养物的77个细胞中的KRAS的RCP的定量。
图7：利用锁式探针和RCA原位基因分型细胞系中KRAS密码子12突变。在杂合细胞系A-427中原位检测的RCP/细胞数目的定量，显示单细胞中野生型（浅灰色）和突变型（深灰色）KRAS-RCP的等位基因表达。插图代表来自77个计数细胞的总体等位基因的比例。
图8a和8b：关于利用锁式探针和靶引发的RCA的原位基因分型的示意图图。KRAS的cDNA（黑色）通过利用LNA-引物的逆转录产生。目标mRNA（灰色）通过核糖核酸酶H降解，除了保护避免降解的与引物的LNA部分杂交的区域，其将所产生的cDNA锚定到目标。除了单点突变的碱基（GGT→AGT）之外具有相似目标位点的KRAS基因型特异锁式探针与cDNA杂交并通过取决于目标的连接进行环化。靶向的KRAS转录物作为用于RCA的引物，生成的RCP用荧光标记的检测探针标记，并在细胞或组织中作为亮点可视化。
图9：关于利用锁式探针和靶引发的RCA的原位基因分型的示意图。除了单点突变的碱基（G/C→A/T）之外具有相似目标位点的KRAS基因型特异锁式探针与cDNA杂交并通过取决于目标的连接进行环化。靶向的KRAS转录物作为用于RCA的引物，生成的RCP用荧光标记的检测探针标记，并在细胞或组织中作为亮点可视化，允许野生型KRAS和突变型KRAS之间的分化。
图10a到10c：使用锁式探针和RCA靶向基因分型新鲜冷冻的结肠和肺组织中的12GAT KRAS点突变。组织显示新鲜冷冻的(a)突变型结肠组织、(b)野生型结肠组织、(c)突变型肺组织和(d)野生型肺组织中KRAS突变型（红色）和野生型（绿色）的信号。细胞核以灰色显示。比例尺，50μm。
图11a到11f：在新鲜冷冻的结肠和肺组织上在（a、c、e）使用完美锁式配对的靶向基因分型和（b、d和f）通过施加所有KRAS探针的多重基因分型之间的比较。组织显示KRAS突变型（红色）和野生型（绿色）的信号，细胞核以灰色显示。在（a、b）具有确认的12GAT KRAS突变的结肠样品、（c、d）具有报道的12GTT KRAS突变的肺组织上和在（e、f）KRAS野生型肺组织中试验和比较两种基因分型方法。比例尺，50μm。
图12a到12d：在未知的结肠和肺的接触肿瘤印迹中的盲法基于锁式探针的基因分型，显示KRAS突变型（红色）和野生型（绿色）的信号。所有密码子12和13锁式探针的混合物多重地应用于在具有（a）12GAT、（b）12CGT KRAS突变或（c）野生型KRAS的结肠肿瘤印迹和在（d）具有野生型KRAS的肺肿瘤印迹样品中可能的KRAS突变的检测。细胞核以灰色显示。比例尺，50μm。
图13a到13d：人类FFPE组织中KRAS转录物的原位密码子12和13基因分型。在具有（a）12TGT或（b）13GAC突变型FFPE结肠组织上靶向的KRAS基因分型。红色RCP代表突变型KRAS，绿色RCP显示野生型KRAS。在未知的肺FFPE组织上盲法原位KRAS基因分型在（c）突变型12TGT组织中显示红色（突变型）和绿色（野生型）的信号两者，而在（d）野生型肺组织中仅检测到绿色RCP。细胞核以灰色显示。比例尺，50μm。
图14a到14f：使用锁式探针和靶引发的RCA在突变特定细胞系上原位靶向基因分型KRAS密码子12和13的点突变。在（a）野生型细胞系ONCO-DG-1、（b）杂合突变型细胞系A-427（12GAT）、（c）纯合突变型细胞系SW-480（12GTT）、（d）杂合突变型细胞系HCT-15（13GAC）、（e）纯合突变型细胞系A-549（12AGT）和（f）杂合突变型细胞系HUP-T3（12CGT）中KRAS野生型（绿色RCP）和突变型（红色RCP）的检测。细胞核以灰色显示。比例尺，20μm。
图15a到15j：利用锁式探针和RCA基因分型的所有新鲜冷冻的（图15a-e）结肠和（图15f-j）肺组织的系列。组织代表每一组织类型的（a、f）野生型样品以及（b-e、g-j）在KRAS的密码子12和13突变中报道的七种突变的六种（b:12GAT、c:12GCT、d:12TGT、e:13GAC、g:12GAT、h:12GTT、i:12AGT和j:12TGT）。红色信号代表突变型KRAS，野生型信号显示为绿色点。图像以合并的形式以及分别的颜色呈现以显示目标转录物的分布。另外，在相同的组织中靶向ACTB，其表达以蓝色显示。细胞核以灰色显示。比例尺，100μm。
图16a到16h：对可能的KRAS突变基因分型的所有肿瘤印迹的系列。基因型是未知的，因此所有用于KRAS的锁式探针的混合物施加到样品上。组织由六个（a-f）野生型结肠和两个（g、h）突变型结肠印迹（g:12GAT和h:12CGT）构成。红色RCP代表突变型KRAS，野生型信号显示为绿色点。图像以合并的形式以及分别的颜色呈现以显示目标转录物的分布。另外，在相同的组织中靶向ACTB，其表达以蓝色显示。细胞核以灰色显示。比例尺，50μm。
图17a到17m：使用合适锁式探针对的靶向KRAS基因分型应用到代表在KRAS的密码子12和13突变中报道的七种突变的六种的FFPE结肠样品上。（a、b）12GAT、（c-e）12GTT、（f、g）12GCT、（h）12AGT、（i、j）12TGT和最终（k-m）13GAC代表13FFPE组织的突变。图像以合并的形式以及分别的颜色呈现以显示目标转录物的分布。红色信号显示突变型KRAS，野生型RCP显示为绿色点。另外，在相同的组织中靶向ACTB，其表达以蓝色显示。细胞核以灰色显示。比例尺，50μm。
图18a到18h：用于KRAS的具有未知基因型的所有FFPE肺组织的系列。使用靶向在KRAS的密码子12和13突变中报道的所有七种突变的所有锁式探针的混合物进行盲法基因分型。八个肺中的五个发现为（a-e）野生型，而最后三个显示（f-h）突变型KRAS基因型。基因型通过焦磷酸测序确定，两个突变型报道为（f、g）12TGT，而最后的组织携带七种突变中最稀有的（h）12CGT。红色点显示突变型KRAS，野生型RCP显示为绿色点。另外，在相同的组织中靶向ACTB，其表达以蓝色显示。图像以合并的形式以及分别的颜色呈现以显示目标转录物的分布。细胞核以灰色显示。比例尺，50μm。
图19：用于Braf突变型和野生型序列的锁式探针的实例。
具体实施方式
A.由RNA目标定位地原位合成cDNA
如上所述，本发明涉及在细胞中RNA尤其是mRNA的检测。方法涉及在利用锁式探针对cDNA靶向前RNA到互补DNA（cDNA）的转变。cDNA在模板RNA的位置原位地合成。可以修饰逆转录酶（RT）引物以能够固定化，尤其是固定化到细胞。因此，期望引物可以具有功能部分，或功能手段（即“官能度”），其允许引物或者使引物能够固定到样品的组分中，例如细胞或细胞组分。例如这可以是能够与细胞或样品或细胞组分结合或反应的功能部分。固定到样品（例如固定到细胞或固定在细胞中）的这种引物的使用带来cDNA产物（所述cDNA产物通过RT引物的延伸产生并因此与其邻接）也固定到样品（例如固定到细胞或固定在细胞中）的结果。
由于进行以产生最后检测的RCP的RCA使用cDNA作为引物实施（即是靶引发的RCA），RCA邻接cDNA，从而RCP也锚定或连接到样品（例如细胞）。因此，这种引物的使用确保或允许RCP保持定位到样品中（例如在细胞中）RNA的位点。换句话说，保持了RCP对目标RNA原始位点的定位。这样，保持了报道目标RNA的信号的定位，由此可见这有利于并促进定位的原位检测。
RT引物各种这样的修饰在本文中进行了描述，并且包括例如在RT引物中反应性基团或部分的提供，举例来说化学偶联剂，例如巯基、NHS酯等，其能够共价连接到细胞或者细胞组分或其他样品组分，例如到细胞中的蛋白质或其他生物分子，或到样品中的组分，例如样品中的基质组分。可替代地或另外地，引物可以具有能够与细胞或者细胞组分或样品组分结合的亲和性结合基团。
尽管细胞或细胞组分提供方便的RT引物连接点或固定化位点，但是本发明的该方面不限于在细胞上或在细胞内的固定化，RT引物可以固定到样品中存在的其他组分，例如细胞外的组分。实际上组分可以是天然的或合成的，合成组分可以添加到样品以补充或取代原生的细胞组分。例如，可以给细胞或组织样品提供合成的基质以保持方法中的信号定位（即保持检测的RCP产物的定位）。实际上，替代固定化RT引物（作为固定化cDNA的手段），合成的cDNA本身或目标RNA可以固定在为样品提供的合成的基质中。
因此，例如目标RNA或合成的cDNA可以与替代天然细胞基质的合成凝胶基质连接以保持检测信号的定位。这可以通过在凝胶溶液中浸入样品（例如样品的细胞或组织）实现，所述凝胶溶液在聚合后会产生cDNA或目标RNA可以与之连接的凝胶基质。为了实现这种连接，RT引物可以例如在其5'端具有能与基质材料反应的反应性基团或部分。这在下文中进一步描述。
然而，在优选的修饰中，使引物对核糖核酸酶有抵抗力。因此引物可以修饰为抗核糖核酸酶的。利用核糖核酸酶消化RNA:DNA双链体中与cDNA杂交的RNA。如下文所述，核糖核酸酶可以优选地是核糖核酸酶H或能够消化RNA:DNA双链体中的RNA的核糖核酸酶。在本发明一个优选的实施方案中，逆转录酶引物的固定化凭借其为抗核糖核酸的来实现。在这种情况下，核糖核酸酶不能降解与RT引物杂交的RNA。因此，RT引物保护RNA中的引物结合位点不受降解。相应地，RT引物保持与细胞中的RNA结合，并以这种方式固定在细胞中。可以对引物进行的使其抗核糖核酸酶的修饰在下文中进行描述，并具体地包括使用修饰的核苷酸或核苷酸类似物，例如包含2'O-甲基RNA、甲基磷酸酯或2'氟化RNA碱基等的核苷酸，当所述修饰的核苷酸或核苷酸类似物并入引物时使引物至少部分地对核糖核酸酶消化有抵抗力。可替代地或另外地，引物可以包含锁核酸（LNA）或肽核酸（PNA）。因此，在本发明的一个实施方案中，设想cDNA的5'端通过抗核糖核酸的逆转录酶引物保持与目标RNA分子结合。
“逆转录反应”是其中RNA使用“逆转录酶”（“RT”）转变为cDNA导致其核苷酸序列与RNA模板的核苷酸序列互补的单链cDNA分子生成的反应。然而，逆转录产生在所有尿嘧啶出现在RNA互补物的情况下包含胸腺嘧啶的cDNA。逆转录反应典型地被称为“第一链反应”，由于单链cDNA之后可以通过DNA聚合酶的作用转变为原始RNA的双链DNA拷贝（即第二链反应）。然而，在本方法中，形成单cDNA链作为序列特异的锁式探针的目标。逆转录反应由作为依赖RNA的DNA聚合酶起作用的酶催化。这种酶通常被称为逆转录酶。逆转录酶在本领域是众所周知的并且广泛可得的。可以使用任何合适的逆转录酶，合适酶的选择完全在本领域技术人员的技术范围内。
B.锁式探针
如上所述，cDNA作为锁式探针的目标。锁式探针是众所周知和广泛使用的，并且在现有技术中是广泛报道和描述过的。因此，锁式探针测量的原理被很好地理解，锁式探针的设计和使用在本领域中是已知的并进行了描述。例如可以参考WO99/49079。锁式探针基本上是具有可用于连接的游离5'端和3'端的线性可环化的寡聚核苷酸，以导致采用环形构型。应理解为了发生环化（连接），锁式探针具有游离的5'磷酸基团。为了使得锁式探针的末端能够毗邻用于连接，锁式探针设计为在其5'和3'端具有与其目标序列（在该情况下，待分析的细胞样品中合成的cDNA分子）互补的区域。这些互补区域从而使锁式探针能够凭借与目标中特定序列的杂交与其目标序列特异性结合。锁式探针从而可以设计为特异地结合到希望的或具体的目标。在本发明方法的情况下，cDNA目标的序列通过目标RNA，即希望检测的RNA分子的序列限定。通过与cDNA目标的杂交，锁式探针的末端进入用于连接的毗邻状态。如下文中更详细描述的，连接可以是直接或间接的。换句话说，锁式探针的末端可以直接彼此连接，或它们可以连接到介于中间的核酸分子/核苷酸序列。因此，锁式探针的末端区域可以与步骤（a）的cDNA产物中毗邻的或邻接的区域互补，或它们可以与cDNA的非毗邻（非邻接）区域互补（在这种情况下，为了发生连接，杂交的锁式探针的两个末端之间的“间隙”由介于中间的分子/序列填充）。
在添加到样品后，锁式探针的末端杂交至cDNA分子中的互补区域。在杂交之后，锁式探针可以通过凭借连接酶的锁式探针末端的直接或间接连接进行环化。然后，环化的锁式探针进行由cDNA的3'端引发的RCA（即RCA是靶引发的）。使用具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。这允许cDNA链在3'-5'方向上的消化进行到毗邻结合的锁式探针的点。或者，cDNA可以具有合适的长度，并可以作为用于DNA聚合酶介导的扩增反应的引物而没有这种消化。这样，RCP的5'端有利地与cDNA分子是连续的。作为另外的选择，替代用cDNA分子引发RCA，可以在反应中使用与锁式探针杂交的单独的引物。
技术人员会理解RNA的核糖核酸酶消化、锁式探针与cDNA的杂交、锁式探针的连接和RCA可以顺序地或同时地进行。因此，例如核糖核酸酶、锁式探针、连接酶和用于RCA的DNA聚合酶可以顺序地或基本同时加入样品。此外，所述方法的步骤的任意组合可以同时进行，并且预期在本发明的范围内，以使通过所述方法生成的RCP能够被检测并且表示样品中RNA的存在、不存在和/或本质。例如，RNA的核糖核酸酶消化和锁式探针的杂交可以同时进行或在相同的步骤中进行，或者锁式探针的连接和RCA可以同时进行或在相同的步骤中进行。
锁式探针的“互补区域”对应于与cDNA杂交的探针的5'和3'端区域。锁式探针从而设计为与cDNA以靶特异的方式结合。锁式探针可以设计为检测具体RNA的存在，例如确定是否表达具体的基因。其也可以设计用于基因分型应用，例如检测细胞或组织样品中具体序列变异体或突变体的存在-可以设计对具体已知的基因突变体（例如如下文所进一步描述的KRAS基因中已知的突变）或对野生型序列特异的锁式探针，相应地其可以用于检测或确定具体突变或序列变异体等的存在或分布（在组织样品的情况下）。
相应地，基于本领域已知的原理，锁式探针可以设计为与cDNA在选择检测相应RNA中具体序列或序列变异体的存在的位点结合。探针可以设计并用于验证或确定具体突变或序列变异的存在（例如靶向的基因分型）或它们可以在样品上以未知的突变/变异体状态用于检测突变/或变异体是否存在，和/或突变/变异体的特定本质（盲法基因分型）。例如可以使用锁式探针的混合物，一种设计为检测野生型，一种其他的设计为检测特定的突变/变异体。对于这种基因分型应用，锁式探针可以设计为除了3'和/或5'端的最后核苷酸之外具有相同的互补区域，所述最后的核苷酸根据探针所设计检测的基因型而不同；用于锁式探针环化的DNA连接酶当接合锁式探针的末端时不接受错配，因此连接仅会在探针与其在所述末端核苷酸“匹配”的序列杂交时发生。这样，可以辨别单核苷酸的差异。
在杂交反应中，锁式探针的两个末端与cDNA相应的部分或区域结合，以使它们直接或间接地彼此连接，导致探针的环化。在该步骤中的杂交不需要但是的确包含锁式探针和cDNA中所述区域之间100%的互补。因此，如本文所使用的，“互补的”表示“功能互补的”，即足够介导生产性杂交的互补水平，其包括低于100%的互补度。因此，在cDNA和锁式探针区域之间的互补区域的长度可以是至少5个核苷酸，优选10个或更多个核苷酸，例如6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50个等核苷酸。其长度可以例如高达30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
如上所述，锁式探针的末端可以直接或间接地连接。锁式探针末端的“直接连接”表示探针的末端在cDNA链上直接相邻地杂交以形成导致其彼此连接的连接酶的底物（分子内连接）。或者，“间接的”表示探针的末端不相邻地与cDNA杂交，即由一个或更多个介于中间的核苷酸分隔开。在这种实施方案中，所述末端不是直接彼此连接的，而是通过一个或更多个介于中间的核苷酸（所谓“间隙”或“间隙填充”的（寡聚）核苷酸）或通过探针3'端的延伸以“填充”对应于所述介于中间的核苷酸的“间隙”发生探针的环化（分子间连接）。因此，在前者情况下，锁式探针杂交的末端之间的一个或更多个核苷酸的间隙可以由与cDNA介于中间的部分互补的一个或更多个“间隙”（寡聚）核苷酸“填充”。间隙可以是1到60个核苷酸的间隙，优选1到40个核苷酸的间隙，更优选3到40个核苷酸的间隙。在具体的实施方案中，间隙可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57或60个核苷酸的间隙，在示出值之间任意整数个的核苷酸的间隙。在另外的实施方案中，间隙尺寸可以大于60个核苷酸。在另外的实施方案中，所述末端区域之间的间隙可以由间隙寡聚核苷酸或通过延伸锁式探针的3'端填充，例如如上文所限定的间隙寡聚核苷酸。锁式探针的环化从而涉及探针末端与至少一个间隙（寡聚）核苷酸的连接，使得间隙（寡聚）核苷酸并入生成的环化探针中。因此，在这种实施方案中，用于RCA的模板含有锁式探针和所述间隙（寡）核苷酸。在这种实施方案中，介于中间的cDNA部分可以是足够允许与间隙寡聚核苷酸的生产性杂交的任意长度，其中通过“生产性杂交”表示能够模板化锁式探针末端的间接连接（即通过间隙寡聚核苷酸）的杂交。锁式探针应该设计为使得其不含任何与介于中间的cDNA部分（即杂交的探针末端之间的间隙）互补的序列。间隙寡聚核苷酸可以含有对最终的RCA产物的扩增或检测或测序等有用的序列。另外地或可替代地，间隙寡聚核苷酸可以含有一种或更多种标记或条形码序列（下文所讨论的）。可见在相关的实施方案中，可以使用多于一种间隙寡聚核苷酸，所述间隙寡聚核苷酸与介于中间的cDNA部分杂交使得它们和锁式探针的末端在连接步骤期间末端到末端地连接在一起。在后一种情况下，与cDNA杂交的锁式探针的末端之间的间隙可以通过聚合酶介导的锁式探针的3'端的延伸填充。合适的聚合酶在本领域中是已知的。一旦所述3'端延伸到远至锁式探针的5'端，这些末端就可以在连接反应中连接。探针和/或（寡聚）核苷酸与cDNA的杂交有利地依赖于cDNA的核苷酸序列，从而允许一种或更多种cDNA的灵敏的、特异性的、定性的和/或定量的检测，并且通过对应的RNA核苷酸序列的延伸。
C.样品
本文所公开的方法和组合物可以用于评估其中存在RNA分子的任何细胞样品中的RNA，只要样品适于原位检测。代表性的样品可以包括固定的组织切片、新鲜冷冻的组织或包括一种或更多种细胞的细胞学制备。样品可以是透化处理的以使得RNA可进入。透化处理细胞的合适手段在本领域是众所周知的，包括例如表面活性剂的使用，例如适当稀释的曲通（Triton）X-100溶液，例如0.1%的曲通X-100，或吐温（Tween），0.1%的吐温，或酸处理，例如用0.1M的HCl。组织样品的透化处理还可以包括利用一种或更多种酶的样品处理，例如胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶原或链酶蛋白酶等。另外，可以如本领域所描述的实施样品的微波处理。
还可以处理样品以将细胞中所含的RNA固定到样品，例如将其固定到细胞基质。这种过程在本领域中是已知的并进行了描述。例如，在原位杂交的领域，用于将mRNA固定到细胞的试剂是已知的。具体地，RNA中的5'磷酸基可以通过EDC介导的缀合（EDC：1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺）连结到细胞基质中蛋白质上存在的胺，从而有助于保持RNA相对于其他细胞组分的定位。先前已经关于微RNA及其通过原位杂交的检测描述了这种技术（Pena等（2009）Nat.Methods，6(2):139-141）。可以制备细胞或组织的样品，例如新鲜制备的，或可以以任何方便的方式预处理，附带条件是制备不是新鲜冷冻组织的制备。也可以制备细胞或组织样品，例如新鲜制备的，或可以以任何方便的方式预处理，附带条件是制备不是包括在正电荷防脱载玻片上接种的制备。此外，可以制备细胞或组织的样品，例如新鲜制备的，或可以以任何方便的方式预处理，附带条件是制备不是如在Larsson等，Nature Methods，2010，7(5)卷，第395-397页中所公开的制备。或者，可以制备细胞或组织的样品，例如新鲜制备的，或可以以任何方便的方式预处理，附带条件是制备不是如在Larsson等，Nature Methods，2010，7(5)卷，第395-397页的在线方法的“组织切片的制备（Preparation of tissue sections）”和/或“用于原位实验的样品预处理（Sample pretreatment for in situ experiments）”章节中所公开的制备。
D.定位的原位检测
所述方法在RCA步骤之后的下一步是确定反应混合物中延伸产物（即RCA产物或RCP）的存在以在样品中检测目标RNA。换句话说，样品对任何生产的RCP的存在进行筛选等（即分析、评估、评价、试验等）以检测试验样品中目标RNA的存在。通过本文所述方法生成的RCP从广义上讲可以使用任何方便的方案检测。具体的检测方法可以根据需要的灵敏度和在其中实施方法的应用改变。在一个实施方案中，RCP检测方案可以包括扩增组分，其中RCP产物（或其部分）的拷贝数增加，例如以增加具体分析的灵敏度，但是这通常不是必须的。因此，RCP可以不用任何扩增直接检测。
定位检测可以看作为包括两个步骤，首先可检测信号的发展，其次信号的读出。关于第一步，可以预期以下检测方法。信号可以包含但不限于荧光的、生色的、放射性的、发光的、磁性的、电子密度或基于粒子的信号。因此，可以使用直接或间接地提供这种信号的标记。所述信号可以通过在扩增时并入标记的核苷酸以生成标记的RCP、使用能够与RCP杂交的互补标记的寡聚核苷酸（“检测探针”）、或以序列非特异的方式标记产生的核酸获得。标记可以是直接的（例如但不限于：荧光团、生色团、放射性同位素、发光分子、磁性颗粒或Au颗粒）或间接的（例如但不限于酶或支化的寡聚核苷酸）。酶可以以连续的或同时的酶的步骤产生信号。例如可以提供辣根过氧化酶作为在与合适的底物接触时产生信号的标记。若干方法在文献中广泛地描述，并且已知用于产生通过（可以在第二步中使用的）各种手段，例如显微镜（亮场的、荧光的、电子的、扫描探针的）、流式细胞仪（荧光的、颗粒的、磁性的）或扫描装置可检测的信号。
在一个具体的实施方案中，检测依靠标记的寡聚核苷酸探针（“检测探针”），所述标记的寡聚核苷酸探针具有互补性，从而与RCP杂交。这种标记可以通过本领域已知的任何手段，例如包括比例标记的荧光标记、放射性标记、利用生色的或发光的底物或者利用酶例如辣根过氧化物酶的标记等。优选的是荧光标记探针。标记产生的信号可以通过任何合适的手段进行检测，例如可见的，包括用显微镜可见的。由于RCP由重复的对应于锁式探针的“单体”构成（如上所述的任选地具有额外并入的核苷酸或间隙寡聚核苷酸），寡聚核苷酸探针与之杂交的序列会是“重复的”，即假设RCA反应超过模板的单复制进行，寡聚核苷酸探针杂交的多个位点会在每一RCP内存在。这样，来自寡聚核苷酸探针上标记的信号强度可以通过延长RCA反应以产生含有许多杂交位点的长的RCA产物来增加。信号强度和定位由于RCP自发的螺旋进一步增加。生成的含有多个杂交的寡聚核苷酸探针的螺旋体给出集中的信号，其通过例如显微可视化可以容易地相对于未杂交的寡聚核苷酸探针的背景进行识别。因此，可定性地或定量地检测样品中的RNA而不实施移除未杂交的寡聚核苷酸探针的清洗步骤。
多重检测可以通过使用对不同RNA不同标记的寡聚核苷酸探针促进，其中各自的寡聚核苷酸探针设计为对仅在各自RNA的RCP中存在的“唯一”序列（对应于仅在锁式探针中存在的序列）具有互补性。如上所述，这种序列可以是条形码或标签序列。在一个具体的实施方案中，两种或更多种不同标记的检测寡聚核苷酸可以用于检测一种或更多种RCP，一种标记的检测寡聚核苷酸报道基因的野生型变异体，其他标记的检测寡聚核苷酸报道基因的一种或更多种突变型变异体。可以使用不同的荧光团作为标记。多重检测还可以通过原位应用测序技术，例如通过连接测序、通过合成测序或通过杂交测序实现。
本方法能够实现RNA核苷酸序列检测中的单核苷酸分辨率。本方法从而可以用于RNA中一个或更多个点突变或实际上任何单核苷酸变异体的检测。因此，所述方法可以用于等位基因变异体或可变剪接等的检测中。所述方法所提供的出众的灵敏度和定位还意味着其可以用于检测单细胞中的RNA。例如，凭借本发明方法的mRNA转录物的多重检测可以有利地用于表达谱，包括在单细胞中。
如技术人员会理解的，本方法可以用于各种诊断应用，尤其是需要单核苷酸灵敏度的那些应用。例如，该方法可以用于检测与疾病、疾病风险或易患状态相关，或与对治疗的响应例如激活致癌基因中的突变相关等的点突变。
本发明的方法可以适于自动化，例如应用如传统自动化FISH分析中所使用的过程。
E.KRAS
如本文中更详细描述的，本发明的方法可以用于检测编码KRAS的mRNA序列中的点突变。KRAS是最常见的激活的致癌基因之一。如本文所使用的，“KRAS”是指v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物。在本领域中KRAS也被称为NS3、KRASl、KRAS2、RASK2、KI-RAS、C-K-RAS、K-RAS2A、K-RAS2B、K-RAS4A和K-RAS4B。该基因，来自哺乳类ras基因家族的Kirsten ras致癌基因同系物，编码小GTP酶超家族成员的蛋白质。单氨基酸替换可以是激活突变的原因。生成的转化蛋白可以与各种恶性肿瘤，包括肺癌、结肠癌、甲状腺癌和胰腺癌有关，并且与对表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂治疗的抗性非常相关。例如，在转移性结肠直肠癌中，常规地分析KRAS基因中突变的存在，阳性的突变状态表示肿瘤不会响应于EGFR抗体治疗。在肺腺癌中，KRAS突变与抽烟、不良预后和对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的不响应相关，而具有EGFR突变的KRAS野生型肿瘤与不抽烟、良好预后和对EGFR-TKI治疗的响应有联系。
肿瘤可以具有KRAS中的一种或更多种突变（例如激活突变）、KRAS的不希望的表达（例如超过野生型的过表达）、KRAS缺陷和/或KRAS基因的扩增（例如具有超过两个的KRAS基因功能拷贝）。在密码子12和密码子13中有七个点突变，它们一起占全部KRAS突变的超过95%。传统的KRAS分析基于从天然肿瘤组织中提取的DNA，在外显子1上热点区域的PCR扩增后，密码子12和13中的序列畸变通过直接双脱氧测序或通过更灵敏的靶向分析，例如焦磷酸测序或等位基因特异的PCR进行表征。因此，肿瘤样品中存在的所有不同细胞类型-正常薄壁细胞、基质细胞、炎症细胞、不同的肿瘤前和肿瘤的亚克隆-为这些分析贡献其野生型和突变的KRAS等位基因。在常规的诊断设置中，肿瘤细胞可以通过手动的显微切割富集，但是为了对确定的肿瘤亚区室注释突变，所需的切割是费力的。尽管如此，单细胞分辨率非常难实现。这在结肠直肠癌中可能不是问题，因为激活KRAS突变被认为是肿瘤发生中的早期事件并大概均匀地分布在肿瘤中。然而，对于其他类型的癌症，以及对于其他致癌基因中的突变，关于癌症亚克隆之间的不均匀性以及其对肿瘤生物学和治疗反应的影响知道的很少。因此，直接在组织切片上提供基因分型的方法是高度有保证的。因此，需要灵敏的KRAS突变分析以确定对患者最合适的治疗。
如本文所述，本方法可以在基因分型分析中使用，所述基因分型分析通过使用多突变特异锁式探针和滚环扩增在组织样品上原位靶向密码子12和13中的KRAS突变。这种原位技术直接提供在组织中的单转录物分析，从而避免传统的来自不均匀的肿瘤组织的DNA提取。另外，或者可替代地，可以靶向KRAS的密码子61和/或密码子146中的突变（关于具体的信息，另见Loupakis等，2009，Br JCancer，101(4):715-21，其通过引用全部并入本文）。此外，可以靶向KRAS转录物的3'UTR中的突变（关于具体的信息，另见Graziano等，2010，Pharmacogenomics J.，doi10.1038/tpj.2010.9，其通过引用全部并入本文）。这些突变可以结合密码子12、13、61和/或146的突变的检测进行检测，或者它们可以单独，或结合密码子12的突变，或结合密码子13的突变，或结合密码子61的突变，或结合密码子146的突变，或结合密码子12、13、61和146的突变的任何亚组进行检测。所述方法可以优选地在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织中，或在接触印迹样品中的组织中实施。组织样品可以优选是癌症组织，例如结肠或肺组织。所述方法也可以利用新鲜冷冻的组织实施。在某些实施方案中，所述方法可以利用细胞或组织样品实施，所述样品可以是制备的，或可以以任何方便的方式预处理，附带条件是制备不是新鲜冷冻组织的制备。在另外的具体实施方案中，细胞或组织的样品可以是制备的，或可以以任何方便的方式预处理，附带条件是制备不是包括在正电荷防脱载玻片上接种的制备。在再一具体的实施方案中，细胞或组织的样品可以是制备的，或可以以任何方便的方式预处理，附带条件是制备不是如在Larsson等，Nature Methods，2010，7(5)卷，第395-397页中所公开的制备。在非常具体的实施方案中，细胞或组织的样品可以是制备的，或可以以任何方便的方式预处理，附带条件是制备不是如在Larsson等，Nature Methods，2010，7(5)卷，第395-397页的在线方法的“组织切片的制备（Preparation oftissue sections）”和/或“用于原位实验的样品预处理（Samplepretreatment for in situ experiments）”章节中所公开的制备。
在一些实施方案中，方法和组合物涉及KRAS突变，尤其是已经在癌症细胞中发现的那些突变。术语“与癌症相关的KRAS突变”或“与肿瘤发展相关的KRAS突变”是指在KRAS基因或相应的突变体中的突变，其已经在2012年2月15日的Sanger数据库（万维网sanger.ac.uk上）中鉴定为与癌症或癌症前期相关。在某些实施方案中，所述方法和组合物涉及检测多个突变。在一些实施方案中，多个突变是指在与癌症相关的基因中至少或至多以下百分比的突变：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%，或其间任何可推出的范围。
F.EGFR
表皮生长因子受体（EGFR）是一些癌症治疗中重要的靶。抗EGFR抗体与化学疗法的组合因而通常使用在这些癌症的治疗中。KRAS蛋白质是由EGFR调节的信号传导级联中重要的介质。KRAS基因中的突变在针对EGFR靶向的分子生物学治疗选项的选择中是非常重要的因素。研究已经显示如果存在突变，抗EGFR的药物，例如西妥昔单抗（Erbitux）和帕尼单抗（Vectibix）不能充分有效地保证其用途。因此，如本文所述，本方法可以有利地用于检测编码KRAS的mRNA中是否存在点突变，其中KRAS野生型mRNA的鉴定表明癌症可以用EGFR抑制剂治疗。
另外，本方法可以用于检测在编码EGFR的mRNA中是否存在突变。可以根据本发明检测的EGFR突变的实例示于表7中。
G.Braf、APC、PTEN、PI3K
本发明的方法可以进一步用于检测编码Braf、APC、PTEN或PI3K的mRNA序列中的一个或更多个点突变。合适的Braf突变对技术人员是已知的，并且在Rajagopalan等，2002，Nature，418(29)，934和Monticone等，2008，Molecular Cancer，7(92)中进行描述，其通过引用全部并入本文。尤其优选的是突变V600E的检测（另见实施例18）。本发明的方法进一步设想检测KRAS和Braf中一个或更多个点突变。Braf和KRAS的突变描述为关于下游路径元素的功能相互排斥。因此，通过同时确定KRAS和Braf中的突变，可以说明路径功能是否因基因突变而损害。
合适的APC突变对技术人员是已知的，并且例如在Vogelstein和Fearon，1988，N Engl J Med，319(9):525-32中进行描述，其通过引用全部并入本文。
合适的PTEN突变对技术人员是已知的，并且例如在Laurent-Puig等，2009，J Clon Oncol，27(35)，5924-30或Loupakis等，2009，J clinOncol，27(16)，2622-9中进行描述，其通过引用全部并入本文。
合适的PI3K突变对技术人员是已知的，并且例如在Satore-Bianchi等，2009，Cancer Res.，69(5)，1851-7或Prenen等，2009，Clin Cancer Res.，15(9)，3184-8中进行描述，其通过引用全部并入本文。
在一些实施方案中，方法和组合物涉及Braf、APC、PTEN或PI3K的突变。在另外的实施方案中，方法和组合物涉及与Braf突变组合的，和/或与APC突变组合的，和/或与PTEN突变组合的，和/或与PI3K突变组合的KRAS突变，尤其是已经在癌症细胞中发现的突变。这种突变可以来源于合适的文献资源，例如上文所述的那些，或可以根据合适的数据库鉴定，例如2012年2月15日的Sanger数据库（万维网sanger.ac.uk上）。在某些实施方案中，所述方法和组合物涉及检测多个所述突变。在一些实施方案中，多个突变是指在与癌症相关的所述基因或基因组合中至少或至多以下百分比的突变：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%，或其间任何可推出的范围。
H.试剂盒
本发明还提供用于在本发明的方法中使用的试剂盒。试剂盒可以包括至少一种如上所述对特定cDNA特异的锁式探针。这种试剂盒还可以包括RT引物、RT酶、核糖核酸酶、DNA聚合酶、连接酶和/或检测RCA产物的手段。
试剂盒可以任选地进一步包括一个或更多个与靶cDNA位于非邻近杂交的锁式探针末端之间的部分有互补性的间隙寡聚核苷酸，或可以包括用于当锁式探针的末端与cDNA杂交时另外填充任何存在的间隙的试剂，例如聚合酶、核苷酸和必需的辅助因子。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包括用于引发锁式探针RCA的引物寡聚核苷酸。在某些方面，引物在除了锁式探针与靶cDNA互补的区域之外的位置与锁式探针杂交。
可替换地或另外地，试剂盒可以包括用于环化锁式探针的连接酶（其可以存在或不存在与试剂盒中）或用于进行RCA的聚合酶，例如phi29聚合酶（和任选地必需的辅助因子，以及核苷酸）。用于检测RCA产物的试剂也可以包含在试剂盒中。这种试剂可以包含对试剂盒中存在的锁式探针的部分或对试剂盒中存在的间隙寡聚核苷酸的部分具有互补性的标记的寡聚核苷酸杂交探针。
试剂盒可以设计用于在本发明方法的多个实施方案中使用，相应地可以包括上文所限定的用于多于靶RNA的组分的组合。如果对多个cDNA物质分别具有结合特异性的探针存在于试剂盒中，那么试剂盒可以额外地包括允许多个RNA平行检测以进行区分的组分。例如，试剂盒可以含有用于不同cDNA靶的锁式探针，其中所述cDNA靶具有仅用于与探针的特定序列杂交的“唯一”序列。这种锁式探针可以例如携带允许检测不同的RNA以进行区分的不同的标签或标识序列；
试剂盒可以设计用于编码KRAS的mRNA的检测。试剂盒可以优选地含有一种或更多种靶向由野生型KRAS的mRNA逆转录的cDNA的锁式探针，和/或一种或更多种靶向由包括点突变的KRAS的mRNA分子逆转录的cDNA的锁式探针。
除了以上组分之外，试剂盒可以进一步包括用于实行本发明方法的说明。这些说明可以以各种形式存在于试剂盒中，其中的一种或更多种可能存在于试剂盒中。这些说明可以存在的一种形式是如在合适的介质或基材上打印的信息，例如上面打印了信息的纸，在试剂盒的包装中，在包装插入物中等。另一种方式是计算机可读的介质，例如磁盘、CD等，其上记录有信息。另一种可以存在的方式是可以通过因特网使用的在远程站点获取信息的网站地址。任何方便的方式可以存在于试剂盒中。
因此，在另外的方面，本发明提供一种用于样品中靶RNA定位的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包括一种或更多种选自包括以下的列表的组分：
(i)包括与由所述靶RNA转录的cDNA具有互补性的3'和5'末端区域的锁式探针（这种区域可以选择地限定为在序列上对应于所述靶RNA的区域，如上文所述的该区域可以是邻近的或非邻近的）；
(ii)能够与所述靶RNA杂交的逆转录酶引物（例如能够与所述RNA特异地杂交）；
(iii)逆转录酶；
(iv)核糖核酸酶；
(v)连接酶；
(vi)具有3'核酸外切酶活性的聚合酶；
(vii)能够与由所述靶RNA转录的cDNA的部分杂交的间隙寡聚核苷酸；
(viii)能够与(i)的锁式探针的互补物，或与(vii)的间隙寡聚核苷酸的互补物杂交的检测探针；
(ix)用于并入例如dNTP的核苷酸。
(viii)的检测探针可以是能够与扩增产物杂交的标记的检测寡聚核苷酸（所述扩增产物将含有(i)的锁式探针的互补物或(vii)的间隙寡聚核苷酸的互补物）。例如，检测寡聚核苷酸可以是荧光标记的或可以用辣根过氧化酶标记。
在一个实施方案中，试剂盒可以含有(i)的锁式探针和任选地一种或更多种选自(ii)到(iX)中任一项的另外组分。试剂盒组分的其他组合也是可能的。例如，试剂盒可以含有(i)的锁式探针和(ii)的逆转录酶引物、(iii)的逆转录酶和(iv)的核糖核酸酶中的至少一种，任选地具有一种或更多种选自(ii)或(iii)或(iv)到(ix)中任一项的另外的组分。本发明的其他代表性试剂盒可以包含(ii)的逆转录酶引物和组分(iii)到(ix)中的至少一种，更具体地(ii)的引物与组分(iii)到(vi)中的至少一种，任选地具有一种或更多种选自(i)或(vii)到(x)中任一项的另外的组分。作为代表性的实例还包括的是包括组分(iii)到(vi)中至少两种，或至少三种，或全部四种，任选地和一种或更多种选自(i)、(ii)、或(vii)到(ix)的另外的组分的试剂盒。包括选自(iii)到(iv)的两种或三种组分的所有可能组合。例如，这种实施方案可以包括(iii)、(iv)、和(v)，或(v)和(vi)，或(iii)、(iv)和(vi)等等。
I.表格
表1：寡聚核苷酸序列
Figure BDA0000367062380000561
Figure BDA0000367062380000571
表2：用于LNA含量研究的cDNA引物的序列
Figure BDA0000367062380000581
寡聚核苷酸按5′-3′的顺序给出。+符号表示LNA碱基。
所有含有LNA的寡聚核苷酸都购自Integrated DNA Technology。未修饰的引物购自Biomers。
表3：用于研究cDNA合成长度的cDNA引物的序列
Figure BDA0000367062380000582
寡聚核苷酸按5′-3′的顺序给出。+符号表示LNA碱基
寡聚核苷酸购自Integrated DNA Technology。
引物名称表示对于各自的cDNA引物产生的cDNA的最大长度。
表4：用于KRAS突变的基因分型的寡聚核苷酸序列
Figure BDA0000367062380000591
Figure BDA0000367062380000611
Figure BDA0000367062380000621
Figure BDA0000367062380000631
表7：基于COSMIC数据库中情况的EGFR突变和发生率。
# 突变 发生率
1 L858R 1258 45,48084%
2 2335_2349del15 560 20,24584%
3 2336_2350del15 314 11,35213%
4 2340_2357del18 110 3,97686%
5 T790M 104 3,75994%
6 2339_2348TTAAGAGAAG>C 71 2,56688%
7 2337_2355>T 43 1,55459%
8 2340_2354del15 41 1,48228%
9 L861Q 34 1,22921%
10 2339_2356del18 28 1,01229%
11 G719S 24 0,86768%
12 G719A 23 0,83153%
13 S768I 22 0,79537%
14 2339_2351>C 19 0,68691%
15 2337_2351del15 18 0,65076%
16 2339_2347del9 18 0,65076%
17 2339_2353del15 18 0,65076%
18 G719C 16 0,57845%
19 2307_2308ins9 8 0,28923%
20 2339_2358>CA 7 0,25307%
21 2340_2351del12 7 0,25307%
22 2310_2311insGGT 4 0,14461%
23 2337_2354del18 4 0,14461%
24 2338_2355del18 4 0,14461%
25 2338_2348>GC 4 0,14461%
26 2319_2320insCAC 2 0,07231%
27 2335_2352>AAT 2 0,07231%
28 2338_2352>GCA 2 0,07231%
29 2336_2353del18 1 0,03615%
J.实施例
现在将参照以下非限制性实施例进一步描述本发明。应理解这些实施例表明本发明的实施方案，并且仅以举例说明的方式给出。由上文的叙述和这些实施例，本领域技术人员可以确定该发明的基本特征，并且可以对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件而不脱离其精神和范围。因此，除了本文所显示和描述的那些之外，根据前面的描述本发明的各种修改对本领域技术人员会是明显的。这种修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。本文所参考的所有文件通过引用并入。
材料和方法
细胞培养物：
细胞系GM08402（Coriell Cell Repositories）和BJhTERT在用10%FBS（Sigma）、1×非必需氨基酸（Gibco）、2mM l-谷氨酰胺（Sigma）和1×青霉素-链霉素（PEST，Sigma）补充的没有酚红和l-谷氨酰胺的MEM（Gibco）中培养。小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）在用10%FBS、2mM l-谷氨酰胺和1×PEST补充的没有酚红和l-谷氨酰胺的DMEM（Gibco）中培养。ONCO-DG-1、SW-480、A-427和HCT-15（四个都来自DSMZ）、SKOV3和SKBR3在用10%FBS、2mMl-谷氨酰胺和1×PEST补充的RPMI培养基（Sigma）中培养。A-549（DSMZ）在用10%FBS、2mM L-谷氨酰胺和1×PEST补充的没有酚红和L-谷氨酰胺的DMEM（Gibco）中培养。HUP-T3（DSMZ）在用10%FBS、2mM L-谷氨酰胺和1×PEST补充的MEM-Eagle培养基（Sigma）中培养。
组织切片的制备：
E14.5小鼠胚胎新鲜冷冻的9-μm切片置于正电荷防脱金载玻片（ThermoScientific）上。完全匿名的来自HER2-阳性乳癌的新鲜冷冻的人类组织切片根据瑞典生物银行法律从在乌普萨拉大学医院（Uppsala University Hospital）病理学部的新鲜组织生物银行获得。4μm厚的乳房组织切片置于Starfrost显微镜载玻片（Instrumedics）上。
用于原位实验的样品预处理：
细胞接种在正电荷防脱载玻片（Thermo Scientific）上并允许附着。当细胞达到希望的融合时，它们在室温（20-23℃）下在PBS中3%（w/v）的多聚甲醛（Sigma）中固定30分钟。固定之后，载玻片在DEPC处理的PBS（DEPC-PBS）中清洗两次，并通过一系列70%、85%和99.5%的乙醇每种脱水3分钟。在连接到载玻片的Secure-seals（Grace Bio-Labs，直径9mm和深0.8mm）中进行分子反应。对每一样品使用50-μl的反应体积。为了使RNA可以更容易地用于cDNA的合成，0.1M HCl在室温下施加到细胞10分钟。在这之后是在DEPC-PBS中的两次简单的清洗。除了一些例之外，与细胞系相似地处理组织。组织固定在PBS中2%（w/v）的多聚甲醛中进行。然后，组织在37℃下在0.1M HCl中用0.01%胃蛋白酶（Sigma）透化处理两分钟。分子反应在固定到组织上的Secure-seals（直径13mm，深0.8mm；Grace Bio-Labs）中以100μl的反应体积进行。逆转录实施过夜，用于连接、RCA和检测探针杂交的培养时间加倍。对于小鼠组织，用T4DNA连接酶实施连接。
寡聚核苷酸序列：
寡聚核苷酸序列（表1–3）设计使用基因库存取编号NM_001101.3（ACTB）、NM_007393.3（Actb）、NM_198253.2（TERT）、NM_002467（MYC）、NM_001005862.1（ERBB2）、NM_009606（Acta1）、NM_009609（Actg1）和NM_033360（KRAS）。所有锁式探针在制造商的缓冲液A中在2μM的浓度下用0.2U μl-1T4多聚核苷酸激酶（Fermentas）加1mM ATP在37℃下5'磷酸化30分钟，然后在65℃下5'磷酸化10分钟。对于在培养细胞中的β-肌动蛋白转录物的检测，除非另外说明，使用引物P-βe1用于利用锁式探针PLP-βe1检测，使用引物P-βe6用于利用锁式探针PLP-βe6检测，使用引物P-βhum用于利用锁式探针PLP-βhum检测，和使用引物P-βmus用于利用锁式探针PLP-βmus检测。TERT用引物P-TERT和锁式探针PLP-TERT检测，cMyc用引物P-cMyc和锁式探针PLP-cMyc检测，以及HER2用引物P-HER2和锁式探针PLP-HER2检测。对于小鼠组织中转录物的检测，引物P-α1βmus与锁式探针PLP2-βmus一起用于β-肌动蛋白，与锁式探针PLP-α1mus一起用于α1-肌动蛋白，引物P-γ1mus与锁式探针PLP-γ1mus一起用于γ1-肌动蛋白的检测。对于KRAS基因分型，引物P-KRAS与锁式探针PLP-KRAS-wtGGT、PLP-KRAS-mutGGT和PLP-KRAS-mutGAT组合使用。
用于KRAS基因分型实验的样品制备：
细胞系ONCO-DG-1、A-427、SW-480、HCT-15、A-549和HUP-T3（全来自DSMZ）接种到胶原I8-孔培养载玻片（BD BioCoat）并允许附着。当细胞达到希望的融合时，它们在室温（20-23℃）下在DEPC处理的PBS（DEPC-PBS）中3%（w/v）的多聚甲醛（Sigma）中固定30分钟。固定后，载玻片在DEPC-PBS中清洗两次，塑料孔从载玻片上移除。然后，载玻片通过70%、85%和99.5%乙醇的乙醇系列每种脱水1分钟。
来自结肠直肠癌和肺癌患者的新鲜冷冻的和FFPE的人类肿瘤组织根据瑞典生物银行法律和伦理审查法案从在乌普萨拉大学医院病理学和细胞学部的生物银行获得（乌普萨拉伦理审查委员会（Uppsala Ethical Review Board）批准，参考号2006/325和2009/224）。
从在Starfrost显微镜载玻片（Instrumedics）上胶带转移的新鲜冷冻的组织切片（4μm）从储存在-80℃下的新鲜冷冻的肿瘤样品制备。载玻片在室温下在DEPC-PBS中3%（w/v）的多聚甲醛中固定45分钟，然后在37℃下在0.1M HCl中用0.01%胃蛋白酶（Sigma，#P0609）透化处理两分钟，之后在DEPC-PBS中简单地清洗。
在正电荷防脱显微镜载玻片上制备的接触印迹从新鲜手术的直肠结肠癌和肺癌标本中获得。载玻片制备之后，载玻片风干1分钟，然后在-80℃下储存。载玻片在室温下在DEPC-PBS中3%（w/v）的多聚甲醛中固定30分钟，之后在DEPC-PBS中简单地清洗。
FFPE的组织切片（4μm）置于正电荷防脱显微镜载玻片上（Menzel），并在60℃下烘焙30分钟。然后，载玻片通过浸入二甲苯脱石蜡化15+10分钟，之后通过乙醇系列逐渐补充水分（在100%中2×2分钟，在95%中2×2分钟，在70%中2×2分钟，最终在DEPC-H2O中5分钟）。在室温下用4%（w/v）多聚甲醛在DEPC-PBS中固定10分钟之前，载玻片在DEPC-PBS中清洗2分钟，固定之后再用DEPC-PBS清洗2分钟。然后，FFPE组织载玻片在37℃下在0.1M HCl中用2mg ml-1胃蛋白酶（Sigma，#P7012）透化处理两分钟。通过在DEPC处理的H2O（DEPC-H2O）中的清洗停止消化，然后在DEPC-PBS中清洗2分钟。最后，载玻片第二次在室温下用4%（w/v）多聚甲醛在DEPC-PBS中固定10分钟，并在DEPC-PBS中清洗2分钟。在组织完整的预处理之后，载玻片通过70%、85%和99.5%乙醇的乙醇系列每种脱水1分钟。
组织的KRAS突变状态如前所述（Sundstrom等，(2010)，BMC Cancer，10，660）通过焦磷酸测序分析（Pyromark Q24KRAS，德国希尔登QiagenGmbH）。
原位的cDNA检测过程：
样品在M-MuLV反应缓冲液中预培养。然后，1μM的cDNA引物添加到M-MuLV反应缓冲液中具有20U μl-1的RevertAid H minus M-MuLV逆转录酶（Fermentas）、500nM dNTP（Fermentas）、0.2μg μl-1BSA（NEB）和1U μl-1RiboLock核糖核酸酶抑制剂（Fermentas）的载玻片。载玻片在37℃下培养3h过夜。培养之后，载玻片在PBS-T（具有0.05%吐温-20（Sigma）的DEPC-PBS）中简单清洗，然后是在室温下在DEPC-PBS中3%（w/v）多聚甲醛中30分钟的后固定步骤。后固定之后，样品在PBS-T中清洗两次。为了使目标cDNA链可以用于锁式探针杂交，产生的RNA-DNA杂交体的RNA部分用核糖核酸酶H降解。这在与锁式探针杂交和连接相同的步骤中进行。对于大部分反应，Ampligase（Epicentre）用于连接。样品首先在Ampligase缓冲液（pH8.3的20mM Tris-HCl、25mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM NAD和0.01%曲通X-100）中预培养。然后，用100nM的各锁式探针在0.5U μl-1Ampligase、0.4U μl-1核糖核酸酶H（Fermentas）、1U μl-1RiboLock核糖核酸酶抑制剂、Ampligase缓冲液、50mM KCl和20%甲酰胺的混合物中进行连接。培养首先在37℃进行30分钟，然后在45℃进行45分钟。对于小鼠胚胎组织切片中肌动蛋白转录物同种型的检测，替代地使用T4DNA连接酶（Fermentas）进行连接。样品从而首先在T4DNA连接酶缓冲液（Fermentas）中预培养。然后，100nM的各锁式探针添加了以0.5mM ATP和250mM NaCl补充的T4DNA连接酶缓冲液中的0.1U μl-1T4DNA连接酶、0.4U μl-1核糖核酸酶H、1U μl-1RiboLock核糖核酸酶抑制剂和0.2μg μl-1BSA。然后，载玻片在37℃培养30分钟。利用Ampligase或T4DNA连接酶连接后，载玻片在37℃下在具有0.05%吐温-20的DEPC处理的2×SSC中清洗5分钟并在PBS-T中漂洗。载玻片在Φ29DNA聚合酶缓冲液（Fermentas）中简单地预培养。然后用在具有1U μl-1RiboLock核糖核酸酶抑制剂、250μM dNTP、0.2μg μl-1BSA和5%甘油的供给的反应缓冲液中的1U μl-1Φ29DNA聚合酶（Fermentas）进行RCA。培养在37℃下进行60分钟。培养之后在PBS-T中清洗。RCP在37℃下使用100nM的各相应检测探针在2×SSC和20%甲酰胺中可视化30分钟。然后，载玻片在PBS-T中清洗，移除Secure-seals，载玻片使用70%、85%和99.5%的乙醇的系列每种脱水3分钟。干燥的载玻片装配含有100ng ml-1DAPI的Vectashield（Vector）以复染细胞核。图5中细胞膜复染的方案在下文的“WGA染色”下描述。
WGA染色：
对于细胞质的复染，在1×PBS中稀释的2.5μg ml-1WGA488（Invitrogen）在室温下添加60分钟。在这之后，如前所述在PBS-T中清洗两次并在固定和用DAPI核染色前脱水。
单细胞定量：
对于图6中的单细胞定量，定制的MatLab脚本用于标记单个细胞并在标记的区域内对RCP计数。RCP在MatLab中的定量相比于在本文其他实施例中用于定量的BlobFinder软件在如何定义RCP方面不同。因此，结果显示相比于BlobFinder分析少～30%的RCP。
图像获取和分析：
培养细胞的图像使用装备有100W汞灯、CCD摄像机（C4742-95，滨松（Hamamatsu））和具有激发和发射滤光器的计算机控制的滤光轮用于DAPI、FITC、Cy3、Cy3.5和Cy5的可视化的Axioplan II表面荧光显微镜（蔡司（Zeiss））获取。×20（Plan-Apocromat，蔡司）、×40（Plan-Neofluar，蔡司）或×63（Plan-Neofluar，蔡司）物镜用于捕捉图像。图像使用Axiovision软件（发布4.3，蔡司）收集。细胞图像的曝光时间对于DAPI为260–340ms（×20放大）、10–80ms（×40）或220ms（×63）；对于FITC为40ms（×40）或220ms（×63）；对于Cy3为560–640ms（×20）、110–160ms（×40）或200ms（×63）；对于德克萨斯红（Texas Red）为110ms（×40）或250ms（×63）；和对于Cy5为6350ms（×20）、180ms（×40）或350ms（×63)。对于SKBR3和SKOV3细胞，图像收集为列光切图像（z-stacks）以确保所有RCP成像。实施例3中新鲜冷冻的小鼠胚胎组织切片中α1-肌动蛋白和β-肌动蛋白的成像使用装备有CCD摄像机（AxioCam MRm，蔡司）和×20Plan-Apochromat物镜的Mirax Midi载玻片扫描仪（3D Histech）进行成像。载玻片扫描仪中的曝光时间对于DAPI为45ms、对于Cy3为270ms、对于德克萨斯红为340ms和对于Cy5为3200ms。对于定量，图像中RCP和细胞核的数目使用BlobFinder软件（版本3.0β）数字地计数。对于培养的细胞，定量在五个20×显微镜图像（对于每个样品近似20-30个细胞）上完成。RCP的总数除以每个图像细胞核的数量。然后从五个图像的结果中计算出每个样品的平均值并报道为每细胞的RCP。在上文的“单细胞定量”中描述了图6中所用的单细胞定量的过程。
用于细胞中β-肌动蛋白转录物定量的qPCR：
细胞系GM08402的两个单独的传代在细胞计数后收集，全部RNA利用用于从总的细胞裂解物分离RNA的方案使用PARIS试剂盒（Ambion）从细胞中提纯。痕量的DNA使用无DNA的试剂盒（Ambion）从提纯的RNA中移除。第一链cDNA合成利用700ng模板RNA在含有相应的酶缓冲液中的20URevertAid H minus M-MuLV逆转录酶（Fermentas）、0.5μg寡聚(dT)引物（20-聚体）、1mM dNTP和1U μl-1RiboLock核糖核酸酶抑制剂的混合物中实施。样品在37℃下培养5分钟，然后42℃下培养60分钟。反应通过加热到70℃10分钟停止。实施制备PCR以合成用于标准曲线建立的模板。对于该PCR，来自细胞传代之一的1μl的cDNA在总体积50μl的0.02Uμl-1Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen）、PCR缓冲液、2mM MgCl2、200μM dNTP、200nMACTBfwd引物和200nM ACTBrev引物的混合物中扩增。PCR在95℃下实施2分钟，之后循环45次（95℃下15秒、50℃下15秒和72℃下1分钟），并以72℃下5分钟完成。PCR产物根据用于从溶液中提纯DNA的方案使用IllustraGFX PCR和凝胶带提纯试剂盒（GE健康护理）进行提纯。提纯的PCR产物的浓度使用Nanodrop1000分光光度计（Thermo Scientific）测量并计算每微升的分子数。qPCR用2μl的模板cDNA或稀释的标准曲线PCR产物和总体积30μl的SYBR Green（Invitrogen）、0.02U μl-1Platinum Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、2mM MgCl2、200μM dNTP、200nM ACTBfwd引物和200nM ACTBrev引物一起运行。qPCR使用与用于制备PCR相同的程序运行。标准曲线样品用相同样品一式两份地运行，来自两个细胞传代的cDNA样品一式三份地运行。两个细胞传代的转录物拷贝数的计算基于收获时计数细胞的数量。然后确定细胞系平均β-肌动蛋白mRNA拷贝数。通过用于原位多重检测实验的qPCR效率估计的方案如下：
细胞系GM08402、SKBR3和BJhTERT在细胞计数后收获，全部RNA使用RiboPure试剂盒（Ambion）从细胞中提纯。DNA痕量物使用无DNA试剂盒（Ambion）从提纯的RNA中移除。RNA的浓度和品质在安捷伦（Agilent）生物分析仪上使用RNA6000Pico芯片（安捷伦）研究。第一链cDNA合成使用高容量cDNA逆转录试剂盒（应用生物系统公司（Applied Biosystems））实施。制备的cDNA在用TaqMan qPCR分析前4×稀释。PCR引物和TaqMan探针以验证的20×TaqMan基因表达分析试样从应用生物系统公司购买（分析试样序号对于β-肌动蛋白为Hs99999903_m1、对于TERT为Hs00972650_m1和对于HER2为Hs99999005_mH）。用于不同基因标准曲线的模板通过PCR产生。对于该PCR，来自BJhTERT细胞系的1μl的cDNA在对于不同基因的各自反应中在0.02U μl-1Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen）、1×PCR缓冲液、2mMMgCl2、200μM dNTP和0.01×各引物混合物（每种引物0.2μM）的混合物中扩增。总的PCR体积是50μl，PCR在95℃下实施2分钟，然后循环45×（95℃下15秒和60℃下1分钟），以60℃下5分钟完成。PCR产物使用Illustra GFXPCR和凝胶带提纯试剂盒（GE健康护理）提纯。提纯的PCR产物的浓度使用Nanodrop1000分光光度计（Thermo Scientific）测量，并计算每μl分子数。qPCR用4μl的模板cDNA或标准曲线PCR产物在总体积20μl的具有1×TaqMan基因表达分析引物和探针混合物的1×TaqMan Universal PCR Master Mix，NoAmpErase UNG（应用生物系统公司）中运行。qPCR程序在95℃下运行10分钟，之后循环40×，95℃下15秒和60℃下1分钟。所有样品都一式两份地运行，并用标准曲线的连续稀释、连续稀释的cDNA样品、来自细胞系的RNA对照和非模板对照来表征。转录物拷贝数的计算基于收获时计数细胞的数目。
细胞系和组织上KRAS的原位基因分型：
所有分子原位反应在Secure-seal（Grace Bio-Labs Inc.）中实施，用于组织或印迹的反应体积根据样品的尺寸是100μl（尺寸：直径13mm，深0.8mm）或350μl（尺寸：直径22mm，深0.8mm）。用于细胞的Secure-seal总体积为50μl（尺寸：直径9mm，深0.8mm）。Secure-seal固定在细胞或组织上，孔通过用PBS-T（具有0.05%吐温-20的DEPC-PBS（Sigma））简单冲洗来脱水。
之后，样品以相同的方式处理，只有少数例外。新鲜冷冻或FFPE组织的后固定相比于对于细胞系和肿瘤印迹的30分钟进行45分钟。另外，对于FFPE组织的后固定，使用3.7%的甲醛代替3%（w/v）的多聚甲醛。最后，在组织上进行的RCA培养时间比在培养细胞和肿瘤印迹（2h）上进行的更长（5h）。对于所有的反应，载玻片在湿度箱内培养。
用于KRAS基因分型实验的寡聚核苷酸序列：
寡聚核苷酸序列（表4）使用基因库存取编号NM_033360（KRAS）、NM_005228（EGFR）、NM_001126114.1（TP53）和NM_001101.3（ACTB）设计。所有锁式探针在10μM的浓度下用PNK缓冲液A中的0.2Uμl-1T4PNK（Fermentas）和1mM ATP在37℃下5'磷酸化30分钟，然后在65℃下5'磷酸化10分钟。在不同组织样品和细胞系上应用的引物、锁式探针和检测探针总结在表6中。
1μM的cDNA引物添加到具有中M-MuLV反应缓冲液中的20Uμl-1的RevertAid H minus M-MuLV逆转录酶（Fermentas）、500μM dNTP（Fermentas）、0.2μg μl-1BSA（NEB）和1U μl-1RiboLock核糖核酸酶抑制剂（Fermentas）的载玻片。载玻片在37℃下培养3小时。
培养后，载玻片通过在PBS-T中冲洗孔简单地清洗，之后是在室温下在DEPC-PBS中的3%多聚甲醛（w/v）中45（新鲜冷冻和FFPE的组织）或30（印迹）分钟的后固定步骤。后固定之后，样品通过用PBS-T冲洗Secure-seal室来清洗。
核糖核酸酶H消化、锁式探针杂交和用于KRAS基因分型实验的连接：为了产生可用于锁式探针杂交的单链目标cDNA，生成的RNA-DNA杂交体的RNA部分用核糖核酸酶H降解。这在与锁式探针的杂交和连接相同的步骤中进行。反应用100nM的各锁式探针在Ampligase缓冲液中的1U μl-1Ampligase（Epicentre）、0.4U μl-1核糖核酸酶H（Fermentas）、1U μl-1RiboLock核糖核酸酶抑制剂、50mM KCl和20%甲酰胺的混合物中进行。培养首先在37℃下进行30分钟，之后在45℃下进行45分钟。连接之后，载玻片通过用PBS-T冲洗室来清洗。对于未知组织样品的预期KRAS突变检测，所有KRAS密码子12和13锁式探针的混合物以10nM的最终浓度混合。
用于KRAS基因分型实验的环化锁式探针的扩增和检测：
用在具有1U μl-1RiboLock核糖核酸酶抑制剂、250μM dNTP、0.2μgμl-1BSA和5%甘油的供给的反应缓冲液中的1U μl-1Φ29DNA聚合酶（Fermentas）进行RCA。培养对于肿瘤印迹以及对于细胞系在37℃下实施2h，对于新鲜冷冻和FFPE的组织在37℃下实施5h。RCA后，样品通过用PBS-T冲洗Secure-seal室清洗。RCP使用100nM的各相应检测探针在37℃下在2×SSC和20%甲酰胺中可视化15分钟。然后，载玻片再次通过在PBS-T中冲洗室来清洗，移除Secure-seal，载玻片使用70%、85%和99.5%乙醇的系列每种脱水30秒。干燥的载玻片装配含有100ng ml-1DAPI的Vectashield（Vector）以复染细胞核。
用于KRAS基因分型实验的图像获取和分析：
图像使用装备有100W汞灯、CCD摄像机（C4742-95，滨松）和具有激发和发射滤光器的计算机控制的滤光轮用于DAPI、FITC、Cy3和Cy5的可视化的AxioplanII表面荧光显微镜（蔡司）获取。对于捕捉图像，×10（Plan-Apocromat，蔡司）物镜用于新鲜冷冻和FFPE的组织，×20（Plan-Apocromat，蔡司）物镜用于肿瘤印迹，最后×63（Plan-neofluar，蔡司）物镜用于细胞。图像使用Axiovision软件（发布4.8，蔡司）收集。为了说明所显示的图像为了印刷清楚而使用图像编辑软件处理。不同颜色通道的阈值使用ImageJ1.42q设定，为了Cy3和Cy5中KRAS信号更清楚的可视化，使用最大的滤光器。
实施例1：
使用锁式探针检测培养的人类细胞中的β-肌动蛋白（ACTB）转录物
为了检测培养的人类细胞中的β-肌动蛋白（ACTB）转录物，分别使用两种不同的锁式探针在第一和最后的外显子中靶向序列。可以看见定位到细胞的细胞质的许多亮点状的信号，与该转录物的先前观测一致，与关于该转录物的先前报道一致。两种锁式探针的检测效率相似，表明在该情况下检测不是高度依赖于沿着转录物的目标位置（图5）。相反，当逆转录酶从cDNA合成反应中去掉后，检测不到信号，证明信号是依赖cDNA的（图5）。在与对GM08402中β-肌动蛋白mRNA的定量PCR（qPCR）数据细胞系（每细胞2000拷贝）比较的基础上，估计总的原位检测效率为可用转录物的～30%。在细胞中信号的数量有明显的变化（图6），与β-肌动蛋白mRNA表达的细胞间变化的其他报道一致。
实施例2：
在培养细胞中转录物单核苷酸变异的原位检测
为了证实检测的高选择性，采用分析以原位检测转录物的单核苷酸变异。表达的多态性在β-肌动蛋白中是稀有的，因此人类与小鼠β-肌动蛋白序列之间的单碱基差异用作基因分型目标。共培养的人类和小鼠成纤维细胞使用锁式探针PLP-βhum（人类）和PLP-βmus（小鼠（Mus musculus））和目标引发的RCA进行cDNA的原位基因分型。在共培养物中两种细胞的亚种群之间观察到清晰的区别。在环化步骤中完美匹配锁式探针的偏好确保通过连接酶区分两种目标。
实施例3：
在新鲜冷冻的组织中转录物单核苷酸变异的原位检测
为了在固定的组织切片中试验方法，在来自在颈部水平横切的E14.5小鼠胚胎的新鲜冷冻组织中靶向密切相关的骨骼肌α1-肌动蛋白（Acta1）和细胞质β-肌动蛋白（Actb）转录物。在组织中使用设计具有单碱基不同的目标序列的锁式探针成功地检测到两种肌动蛋白转录物。α1-肌动蛋白信号主要分布于骨骼肌，而β-肌动蛋白信号广泛地分布，但是在非肌肉组织中显示略微更多的信号。从相同基因家族中区分三种转录物的能力通过包含一种对细胞质α1-肌动蛋白（Acta1）转录物特异的探针来证实。
实施例4：
用于表达谱的转录物的检测
为了试验方法用于表达谱的转录物的多重检测的能力，对三种癌症相关的转录物HER2（也称为ERBB2）、cMyc（也称为MYC）和TERT设计锁式探针。使用β-肌动蛋白作为对比转录物，在四种细胞系（人类卵巢癌细胞系、人类乳癌细胞系、TERT固定的人类包皮成纤维细胞细胞系和原始成纤维细胞细胞培养物）中分析这些转录物。癌症相关基因的表达水平在细胞系间不同（图2a-d）。卵巢癌和乳癌细胞系显示HER2和cMyc转录物相似的表达模式，而TERT固定的成纤维细胞是唯一具有可检测水平的TERT转录物的细胞类型。所有四种细胞系都表达β-肌动蛋白，在正常的成纤维细胞中，这是在可检测水平表达的唯一的研究转录物。这些结果与qPCR的数据和可用的文献比较，发现在不同的细胞系中与预期的相对表达水平良好的相关性以及不同的转录物间检测效率显著的一致性。注意到对于所有研究的转录物表达中大的细胞到细胞的变异，其与培养物单细胞中表达的先前研究一致。
实施例5：
人类细胞系中癌症相关的转录物的表达
三种癌症相关的转录物TERT、HER2和cMyc在如实施例4中所述的四种细胞系中分析。所有细胞系都表达看家基因β-肌动蛋白，但是根据原位数据在癌症相关转录物的表达上不同。然后，进行qPCR测量以量化GM08402、BJhTERT和SKBR3细胞系中不同的转录体，以能够评价原位实验中检测效率的变化。TERT表达的qPCR测量显示在BJhTERT细胞系（247分子/细胞）中相对高的表达，以及在SKBR3乳癌细胞系（6分子/细胞）中低的表达。通过qPCR在正常原始成纤维细胞中没有检测到TERT表达。TERT的qPCR数据很好地与文献（对于BJhTERT220分子/细胞和对于SKBR30.57分子/细胞（Yi等，2001）中发现的TERT的mRNA表达水平对应。在BJhTERT中每个细胞检测的39个RCP的原位的结果从而对应基于qPCR数据的16%的检测效率。已知HER2转录物在卵巢癌和乳癌细胞系中过表达。在SKBR3细胞系中，HER2mRNA/细胞的数目报道为168-336分子，本文所述的qPCR测量终止在177分子/细胞。原位检测的HER2mRNA/细胞的数目是25。这给出对于SKBR3细胞中HER2转录物14%的检测效率。HER2表达通过qPCR在正常原始成纤维细胞中或在BJhTERT细胞系中不可以检测到。SKOV3细胞中cMyc的表达水平估计为在相同细胞系中约四分之一HER2转录物的数目，这很好地与本文所述的原位测量对应。当单独分析时，培养的成纤维细胞中β-肌动蛋白的检测效率基于qPCR测量和转录物的原位检测估计为30%。在这些多重实验中，基于相同qPCR估计的检测效率稍低，大约为15%。在癌症转录物间观察到相似的效果，其在多重实验中显示约15%的检测效率，而它们单独地进行得更好。很可能对于多重实验中目标观察的较低的检测效率是由于不同锁式探针和/或cDNA引物之间的相互作用，尤其是由于cDNA引物的LNA修饰的碱基具有非常强的彼此结合的能力。用于多重反应的检测方案可以通过优化探针和/或引物的浓度改进。此外，qPCR测量显示与细胞系之间相对β-肌动蛋白表达水平的原位测量良好的相关性。合起来这些数据表明RCP在不同细胞类型中的相对水平是细胞群体中真实相对转录物水平的良好估计。因此，相信所述方法适合于不同样品的相对表达谱。虽然已知逆转录反应在通过qPCR的mRNA定量中引入变异，但是对于原位逆转录的情况很可能也是如此。
实施例6：
在新鲜冷冻的HER2阳性人类乳癌组织中转录物分布的检测
本发明的技术也用于评估在新鲜冷冻的HER2阳性人类乳癌组织切片中HER2转录物的分布。表达在细胞间差别很大，与肿瘤组织中预期的癌症细胞和和正常基质的存在一致。
实施例7：
在KRAS野生型和突变型细胞中KRAS点突变的基因分型
本发明的方法还用于在KRAS野生型和突变型细胞中基因分型KRAS点突变（图7）。不同的细胞类型基于其相应RCP的颜色可以清楚地区分。在17%-25%的所有人类肿瘤中发现KRAS致癌基因的激活突变，在组织试样中原位监测这些突变和其他肿瘤细胞特异的标记的分析对于临床病理学研究有重大价值。用于等位基因表达研究的潜能通过分析来自KRAS中点突变的杂合的细胞系的77个细胞进一步研究。平均等位基因比例为48%的野生型转录物观测到具有显著的细胞到细胞的变异（图6b和7），表明平衡的等位基因转录。在该实验中，与超过七种RCP杂合的所有细胞显示来自两种等位基因的信号。对于显示少于七个信号的细胞，很难在单细胞中确定用于双等位基因表达的潜能和不平衡的等位基因表达的程度。
实施例8：
LNA碱基并入cDNA引物的效果
为了提高逆转录步骤的效率，使用具有并入的锁核酸（LNA）碱基的RT引物。LNA修饰的寡聚核苷酸先前已经用于FISH，每两个或三个碱基替换为LNA的DNA/LNA混合体表现最佳。除了提高的与目标的杂交效率之外，引物的LNA含量可以设计为保护目标RNA免受核糖核酸酶H分解。这意味着在本方法中，原位合成的cDNA可以通过cDNA引物的杂交保持定位到细胞中检测的mRNA分子（图1）。具有不同LNA替换的cDNA引物（表2）原位地试验用于之后PLP-βe1锁式探针目标位点的检测。发现在5'端每两个碱基替换为LNA的引物表现得比具有每三个碱基替换的引物好（图3）。也研究了总共具有五、七或九个LNA碱基的引物，发现添加九个LNA碱基导致原位信号的量稍微减少。为了确保LNA不干扰逆转录酶由引物合成cDNA的能力，LNA碱基置于引物的5'侧，保持3'端未修饰。发现引物的总长度从30个核苷酸缩短到25个核苷酸不影响结果，因此得出引发不受引物中LNA碱基的存在干扰的结论。
实施例9：
cDNA合成效率
为了确保杂交cDNA的引物和锁式探针的目标序列之间最佳的距离，研究了细胞中生成的cDNA分子的长度。原位检测实验设置使用位于距β-肌动蛋白mRNA的5'端不同距离的cDNA引物。然后原位地进行逆转录，生成的cDNA分子用在逆转录的cDNA的3'端附近具有目标序列的PLP-βe1检测。然后对于不同引物定量每个细胞形成的RCP的数目。试验的引物会导致生成从引物位点的起点到转录物的终点测量的长度为从约90nt到500nt的cDNA分子（关于引物序列参见表3）。发现主要形成短分子并且cDNA引物位点应该位于接近锁式探针目标位点的位置（图4）。还提供如何设计逆转录引物的细节，关于有限的cDNA合成长度的知识与RCA反应的执行有实际的关联。在该方案中，使用目标引发的策略，其最先描述用于原位内生的线粒体DNA分子（Larsson等（2004）Nat.Methods，1，227-232）。目标引发利用单链DNA上Φ29DNA聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性从附近的目标分子的3'端产生引物。RCA反应的效率已经显示为随着线粒体DNA伸出的3'端的长度从0增加到130个核苷酸而降低。由于在该方法中产生非常短的cDNA分子，目标引发的RCA方法可以有效地应用于信号放大以及应用于没有另外目标链制备的cDNA检测。
实施例10：
不同的用于锁式探针连接的连接酶
主要有两种先前已经用于锁式探针连接的酶；依赖ATP的T4DNA连接酶和依赖NAD+的AmpligaseTM。试验两种酶用于利用锁式探针的cDNA的原位检测，获得好的检测效率。然而，当进行用于在人类和小鼠细胞中以单核苷酸分辨率检测序列的实验时，发现Ampligase导致较低比例的来自未匹配探针的信号。使用T4DNA连接酶的正确信号的比例对于人类细胞为87%（人类RCP/总RCP），对于小鼠细胞为98%（小鼠RCP/总RCP）。这与AmpligaseTM相反，其对于人类目标序列具有非常更高的选择性（98%正确），而小鼠目标序列相比于T4DNA连接酶不变。由于不同肌动蛋白同种型的转录物共同具有高比例的相似性并且存在许多假基因，人们相信这些不期望的阳性信号中的一些源于与锁式探针目标序列相似的序列，当进行简单的模拟序列分析时其不出现。除了这些观察之外，已知AmpligaseTM对匹配的底物比T4DNA连接酶更有特异性。
实施例11：
用于原位突变检测的分析设计
锁式探针设计用于密码子12和13（G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V和G13D）和密码子61（Q61H）中KRAS的点突变以及用于EGFR（G719A、G719C、S768I和L858R）和TP53（S127F和P190S）。还设计了用于不同目标的野生型形式的锁式探针。突变特异的锁式探针设计具有相同目标序列，除了3'端中最后的核苷酸根据基因型不同。在该位置的错配不被所使用的DNA连接酶接受，因此有效地区分单核苷酸差异，例如点突变。此外，对于用于野生型和突变型锁的检测探针有两个不同的位点以使用标记有不同荧光染料例如绿色和红色的检测探针彼此区分RCP。在这些分析中还包括通过额外的荧光团进行检测的ACTB转录物的检测，其作为内参比在细胞类型之间具有相对恒定的表达。样品间ACTB信号的比较提供不同样品中检测效率的估计。ACTB数据在该研究的开发阶段期间是有用的，但是对于突变评分和组织分类证明是可有可无的。
实施例12：
在具有已知KRAS状态的新鲜冷冻的结肠和肺组织中的突变检测
锁式探针的选择性首先在野生型特异和突变特异的KRAS细胞系中原位地试验。在确定探针的品质后，我们的原位基因分型方法应用在具有已知的KRAS状态的新鲜冷冻的人类结肠和肺癌组织上。在该验证阶段，各探针对（一个探针用于特定的突变，一个用于相应的野生型变异体）在具有已知的KRAS状态的新鲜冷冻的组织样品的集合上单独地试验。野生型探针设计为产生绿色荧光RCP，突变特异的探针产生红色荧光RCP。除了最稀有的G12R之外，样品代表所有密码子12和13的突变。然而，仍然在试验的细胞系之一上对于特异性验证了用于G12R突变的锁式探针对的表现。因此，KRAS野生型肿瘤组织可以通过与常规荧光原位杂交（FISH）相似的方式通过显微可视化从具有携带激活KRAS突变的肿瘤中区分出来。具有KRAS突变的结肠和肺切片显示源于锁式探针对中两个探针的信号的混合，而正常组织显示仅来自野生型锁式探针的信号。通过视觉检查十个样品，在组织内和组织之间都可以清楚地看到KRAS表达水平中的变化。总的来说，相比于结肠在肺中注意到稍微更高的KRAS表达水平。结果显示大部分情况在肿瘤细胞区域显示野生型和突变型KRAS信号两者，表明杂合的表达。相反，一个肺样品在肿瘤区域几乎仅显示突变体信号，而几乎不存在属于正常的周围基质的野生型信号。这可以反映KRAS杂合突变或杂合度损失（LOH）。
实施例13：
FFPE组织中的突变检测
试验原位锁式探针技术以评价其是否可以用在FFPE组织上。除了预处理过程之外，应用到该类型组织材料的方案基本上与用于新鲜冷冻组织的相同。KRAS突变分析应用各自的锁式探针对在具有已知的密码子12和13中的KRAS突变的14个结肠直肠FFPE癌症组织的集合上进行。所有组织显示原子野生型和突变型锁式探针两者的信号的混合，然而，组织之间信号数量的变化（对于KRAS和ACTB两者）明显，这可能反映FFPE样品中预料的组织品质的差异。此外，还观察到野生型和突变型信号之间的比例在携带相同KRAS突变的组织之间不同，这可能反映肿瘤特异的特征。探针还设计用于密码子61（Q61H）中最常见的突变，并在成功评分为突变体的两个结肠肿瘤FFPE样品中试验。
实施例14：
在预期具有未知突变状态的临床样品上KRAS突变的原位检测
在锁式探针是选择性的初始验证后，所有探针组合到单个反应中，所述单个反应能解答病例是否是KRAS阳性的基本诊断问题。这通过比较使用单个KRAS突变特异的锁式探针的原位突变检测和使用含有所有用于KRAS密码子12和13突变的探针的锁式探针混合物的多重检测方法试验。基于组织视觉检查的结果表明当多个探针竞争两种密码子的目标位点时，效率和选择性都不损失。因此，分析提供肿瘤是否窝藏激活KRAS突变的快速解答。然而，如果有要求，仍然有可能用该技术通过在连续的切片上对所有突变单独地简单试验来揭示精确的序列改变。
之后，多重突变检测在八个预期具有未知KRAS突变状态的肺FFPE组织上证明。所有肺癌案例的约15-30%具有激活KRAS突变。在用锁式探针和RCA进行突变分析后，推断八个案例中的三个是突变的。结果与相同组织上的焦磷酸测序比较，确认提出的基因型对每个案例是正确的。
为了在涉及细胞学制备的诊断设定中试验方法，肿瘤印迹载玻片由八个预期具有未知KRAS突变状态的新鲜结肠癌试样制备。使用锁式探针和目标引发的RCA的多重KRAS突变检测使用用于不固定组织的方案进行准备。通过印迹的显微镜检查，在原位突变分析中发现两个案例为阳性，而其他六个肿瘤印迹仅显示野生型信号。之后，来自相同案例中相应FFPE肿瘤切片的DNA通过焦磷酸测序对KRAS突变进行试验。焦磷酸测序结果与原位分析完全一致。
实施例15：
在组织微阵列上的高通量突变筛选
组织微阵列（TMA）可以用于在一个载玻片上分析数百个患者的FFPE肿瘤样品，并且已经用于在大的患者群众表征蛋白质表达（通过免疫组织化学（IHC））和基因拷贝数变化（通过FISH）。在此，含有25个FFPE结肠样品的TMA（一式两份）对可能的KRAS密码子12和13的突变进行分析。阵列由来自正常结肠粘膜、管状腺瘤、锯齿状腺瘤、原发性肿瘤和匹配的转移的样品组成，它们全都具有未知的KRAS的突变状态。所有样品中的七个发现为KRAS阳性的-两个腺瘤、一个锯齿状腺瘤、四个原发性肿瘤及其匹配的转移。通过焦磷酸测序在相应FFPE区组上的突变分析与原位的数据完全一致。
实施例16：
与肿瘤进展和组织学不均匀性有关的突变致癌基因等位基因的差异表达
在肿瘤上突变致癌基因的可变表达可以潜在地导致在单个癌症病变的不同区域中靶向治疗的可变响应。因此，案例利用对表达突变不同模式的原位分析进行筛选。在一个具有密码子61突变的结肠癌案例中，从正常结肠粘膜到低级和高级发育异常和浸润性癌的组织学进展可以在单个载玻片上可视化。随着肿瘤进展，突变的表达有明显的增加。因此，可以推测在不同的肿瘤区室中对EGFR抑制剂抵抗的水平是否遵循表达水平。
另外，在一组九个FFPE肺组织中靶向EGFR L858R突变，其中八个已知为阳性的。来自原位突变分析的结果与DNA测序数据完全一致。尽管一些肺样品在超过十年以前收集，但是仍然观察到具有高数量的信号，尤其是突变型信号的高检测效率，所述信号可以反映肿瘤中来自扩增的EGFR的高mRNA表达。在一个肺样品中，关于肿瘤生长模式观察到大的组织学不均匀性。野生型EGFR仅在正常支气管上皮中表达。在具有细支气管/鳞屑生长模式的区域中，突变EGFR的表达低，等于野生型等位基因的表达。突变型等位基因的表达在更加分化不良的腺区域在绝对数量上和相对于野生型等位基因都增加。突变型EGFR的表达在具有稳健生长模式的区域达到峰值。因此，如果L858R的表达水平影响EGFR-TKI治疗的肿瘤克隆的灵敏度，则预期在该单个肿瘤中肿瘤的分化不良区域会比良好分化区域更好地响应。
实施例17：
具有多个突变的肿瘤中的表达模式
为了进一步研究肿瘤内的不均匀性，探针设计用于已知窝藏多个点突变的肿瘤。个体化用药意味着对患者的个体特征定制的治疗。下一代测序技术的出现现在逐渐地为研究者和可能不久后临床医生提供合起来可以为个人治疗提供改善机会的单个肿瘤的突变谱。测序由肿瘤的部分制备的DNA将揭示样品中的所有突变，除非它们存在于肿瘤不同的亚克隆中。作为基因间肿瘤不均匀性可以用我们的技术研究的概念验证，建立个人的原位突变分析用于筛选携带EGFR、KRAS和TP53中突变的独特组合的FFPE案例。
一个肺癌案例对于激活EGFR突变G719C以及与对抗EGFR治疗的抵抗有关的EGFR S678I突变为阳性。两种突变变异体都用基于锁式探针的原位技术成功检测到，并鉴定了其单独的表达模式。在整个肿瘤切片中G719C突变的表达与S768I突变相比是高的。可以预期该表达的突变等位基因之间的平衡，这是因为该情况代表未接受抗EGFR治疗所以对于抵抗突变的增加的表达不存在选择压力的患者。
另一个肺FFPE样品对与肿瘤抑制基因TP53的S127F突变组合的G719AEGFR突变进行分析。该组织的原位分析显示基质区域中仅表达野生型TP53的细胞，而不能检测到任何EGFR等位基因的表达。该组织样品的苏木精和曙红（HE）染色确认具有野生型TP53的细胞群为淋巴细胞。TP53S127F突变阳性肿瘤区域显示来自野生型EGFR和G719A锁式探针两者的信号，但是没有来自野生型TP53锁式探针的信号，表明TP53LOH。
一组锁式探针应用在具有报道的KRAS G12C和TP53P190S突变的FFPE肺组织样品上。与之前的情况相反，其中野生型和突变型TP53信号位于不同区室（分别地基质和肿瘤），在这种情况下突变型和野生型TP53转录物在肿瘤区室中以杂合的方式表达。相似地，野生型和突变型KRAS信号在肿瘤区域上均匀地分布，与野生型KRAS等位基因相比突变型的表达更高。除非包含原位技术作为DNA测序的补充，否则不能鉴定在两种情况下该野生型和突变型等位基因的表达模式的差异。此外，由于该原位分析揭示单细胞水平上的信息，独特的信息（例如在相同细胞中多于一种突变的表达）可以详细地鉴定和研究。在相同细胞中不同等位基因的共同定位提供其在肿瘤细胞中共同存在的有力证据，而不存在共同定位不证明它们不在特定的细胞家族中共同表达。尽管在任何这些细胞中没有检测到所有四个等位基因，但是染色模式最可能的解释是因为KRAS突变由所有TP53突变阳性细胞携带。
实施例11到17的讨论
实施例11到17记载了特异地靶向肿瘤组织切片和细胞学制备物上点突变的多重原位分析的确立。通过mRNA逆转录原位合成的转录物用突变型和野生型特异的锁式探针靶向，并用RCA扩增到可检测的水平。之后，生成的野生型和突变的产物用不同颜色的荧光团标记。该基于锁式探针的分析第一次证实用于分子癌症诊断的突变分析可以直接在肿瘤细胞切片上实施。多重原位分析被开发并验证作为对于在结肠直肠癌中与对抗EGFR治疗的抵抗有关的KRAS密码子12和13中激活点突变的概念验证。首先单独地试验探针的选择性。在KRAS突变型和野生型样品之间有清晰的区别，基因型通过相应荧光信号的显微可视化容易地确定。对于多重检测，单个相应锁对与所有密码子12和13的KRAS锁式探针的混合物之间的并排比较显示两种方法的效率和特异性相似。在未固定的组织制备物上发展锁式策略，这是由于新鲜冷冻的组织含有高品质的DNA和RNA并且用作分子研究的黄金标准。然而，在新鲜冷冻的组织上诊断的实施需要大量和昂贵的生物库成果。作为替代，在来自新鲜切出的肿瘤表面的接触印迹上使用未固定的肿瘤细胞。KRAS突变状态因而可以在样品到达日确定，并与我们常规的焦磷酸测序分析一致。
FFPE组织块在常规外科病理学中广泛使用，并且可以在组织档案室内保存多年。然而，福尔马林引发的生物分子的交联导致DNA和RNA的碎片化。然而，锁式探针短的长度结合双识别位点和连接的需要使该分析对于固定的组织病理学试样是理想的。使用为福尔马林固定的组织优化的方案，实现常规FFPE切片中的原位检测，并且成功表征预期具有未知KRAS状态的外科手术的癌症试样。对于该分析有希望的前景是在TMA中可以同时筛选数百个FFPE癌症样品中突变的存在。因此，对于利用可用的TMA在回顾性患者群中的生物标记发现，点突变的高通量筛选可以随着用于蛋白质表达的IHC和用于染色体畸变的FISH分析一起进行。原位的方案可以适合如任何常规的FISH分析的自动化，促进常规用途分析的实施。此外，荧光读出如果需要可以改为用于亮场成像的组织化学染色。
肿瘤不均匀性是复杂的概念。一个方面是具有获得的体细胞突变的癌症细胞和基因正常的基质和炎症细胞的多变的混合物。第二个方面是关于肿瘤出现前的相对于侵入的部分、高级的相对于低级的区域、入侵前沿的相对于中心的肿瘤区域、和多变的分化模式，例如肉瘤样的、腺状的、鳞状的或神经内分泌的等在肿瘤区室内形态学和可能的基因的变异。第三个方面是突变等位基因的表达在肿瘤的不同部分可以受启动子和拼接突变、外遗传改变或基因拷贝数畸变，例如扩增、缺失和LOH的影响。这些可能是对在基因组水平上分析的挑战。所述原位技术允许研究肿瘤不均匀性的所有这些挑战性特征。突变和野生型等位基因的杂合和纯合表达可以在肿瘤细胞中鉴别，并且证实关于具体的组织试样一种形式的基本信息，所述信息利用基于PCR的技术很可能会检测不到，得到突变型肿瘤和野生型细胞提取混合物的平均值。该分析显示突变的KRAS密码子61等位基因随着结肠癌样品中的肿瘤进展而增加的表达。在肺腺癌的情况下，激活EGFR突变的表达证实为在具有独特的组织学构造的区域中不同。此外，技术允许详细研究多个不同的突变是如何在肿瘤病变中分布和联系，如由两个肺癌案例说明的，其中突变的TP53等位基因可以与分别在EGFR和KRAS中的激活突变一起可视化。因此，原位的突变分析可以有助于解剖过程例如癌症发生、肿瘤进展和转移。对于未来的研究，引起兴趣的应用会是响应靶向治疗的抵抗突变的出现的研究。提出具有EGFR中双重突变的一个情况，其中在与治理响应有关的突变表达平行地看到抵抗突变的低表达，如在具有重新的抵抗突变的患者中可能预期的。EGFR治疗后的随访样品的分析可以揭示在组织学水平上关于两种突变表达的患者特异响应。
尽管事实是该研究中分析的79个患者样品在过去二十年中在不同的时间点收集，以及在各种条件下处理，但是它们都能够作为本方法的合适的组织材料。此外，特别设计的锁式探针成功地应用于全部14种不同点突变的原位检测，这给予该突变分析提供鲁棒性并且可以容易地适合于来自各种源的组织材料上其他突变的检测的自信。总之，认为本发明的锁式探针和RCA技术是用于在用于诊断分子病理学和转化型癌症研究的复杂肿瘤组织中研究组织学-基因型相关性的重要的分析。
实施例18：
Braf突变的检测
BRAF呈现不同种类的肿瘤中的体细胞突变，主要在恶性黑素瘤、在微卫星（MSI）中显示错配修复缺陷的散发性结肠直肠肿瘤、低级卵巢浆液性癌和甲状腺乳头状癌中。80%的这些突变对应于导致氨基酸替代V600E的热点颠换突变T1799A。
V600E突变中最常见的突变（替代-错义）
目标cDNA区域（变异的碱基）：
5′-GCATATACATCTGACTGAAAGCTGTATGGATTTTTATCTTGCATTCTGATGACTTCTGGTGCCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTA-3′(SEQ ID NO:100)
BRAF锁式探针目标区域（臂：15+15nt）：
5′-CTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCA-3′(SEQ ID NO:101)
参考文献
以下参考文献在一定程度上提供示例性程序或对本文所陈述那些的其他细节补充，它们通过引用明确地并入本文。
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Figure IDA0000367062420000011
Figure IDA0000367062420000021
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Claims (115)

1.一种用于一个或更多个细胞的样品中至少一种目标RNA的定位的原位检测的方法，包括：
产生与样品中的RNA互补的cDNA；
添加核糖核酸酶到所述样品以消化与所述cDNA杂交的RNA；
使所述样品与一种或更多种锁式探针接触，其中所述锁式探针包含与所述cDNA互补的末端区域，所述锁式探针在所述互补的末端区域与所述cDNA杂交；
通过直接或间接地连接所述锁式探针的末端环化所述锁式探针；
使所述环化的锁式探针进行滚环扩增（RCA）；
检测滚环扩增产物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
3.权利要求1或2所述的方法，其中产生与样品中RNA互补的cDNA包括使所述样品与逆转录酶和逆转录引物接触。
4.权利要求3所述的方法，其中所述逆转录引物是抗核糖核酸酶的。
5.权利要求3或4所述的方法，其中修饰所述逆转录引物以便能够固定在所述细胞内。
6.权利要求5所述的方法，其中所述逆转录引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分，或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团。
7.权利要求4到6中任一项所述的方法，其中所述逆转录引物包含2'O-甲基RNA、甲基磷酸酯或2'氟化RNA碱基、锁核酸残基或肽核酸残基。
8.权利要求7所述的方法，其中所述逆转录引物包含一个或更多个锁核酸残基。
9.权利要求7所述的方法，其中所述逆转录引物包含由引物序列中1个或更多个天然的或合成的核苷酸分隔开的2个或更多个锁核酸。
10.权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸酶是核糖核酸酶H。
11.权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述滚环扩增使用具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶，其中如果需要所述核酸外切酶活性消化cDNA以产生作为用于所述RCA的引物的游离3'端。
12.权利要求11所述的方法，其中所述DNA聚合酶是Φ29聚合酶。
13.权利要求1到12中任一项所述的方法，进一步包括使所述样品与核酸外切酶接触以消化cDNA来产生作为用于所述RCA的引物的游离3'端。
14.权利要求1到13中任一项所述的方法，其中在所述接触步骤中，所述样品与至少第一锁式探针和第二锁式探针接触，其中所述第一锁式探针包含与所述cDNA上直接相邻区域互补的末端区域，其中所述第二锁式探针包含在所述第二锁式探针的5'或3'端与所述第一锁式探针的末端区域仅差单个核苷酸的末端区域。
15.权利要求14所述的方法，其中所述第一锁式探针可以设置为与和野生型mRNA互补的cDNA杂交，所述第二锁式探针设置为与和mRNA的单核苷酸变异互补的cDNA杂交。
16.权利要求14或15所述的方法，其中所述第一锁式探针包括第一检测探针结合区域，所述第二锁式探针包括第二检测探针结合区域。
17.权利要求16所述的方法，进一步包括使所述样品与包含与所述第一锁式探针的第一检测探针结合区域相同的序列的至少第一标记的检测探针、和包含与所述第一锁式探针的第二检测探针结合区域相同的序列的第二标记的检测探针接触，和使所述第一标记的检测探针和第二标记的检测探针与所述滚环扩增产物杂交。
18.权利要求17所述的方法，进一步包括检测来自与所述滚环扩增产物杂交的所述第一标记的检测探针的信号，或检测来自与所述滚环扩增产物杂交的所述第二标记的检测探针的信号，或检测来自与所述滚环扩增产物杂交的所述第一标记的检测探针和第二标记的检测探针两者的信号，其中所述第一标记的检测探针的检测表明细胞中野生型mRNA的存在，所述第二标记的检测探针的检测表明细胞中变异型mRNA的存在。
19.权利要求17或18所述的方法，其中所述标记的检测探针包括不同的荧光笔记、生色标记、放射性标记、发光标记、磁性标记或电子密度标记。
20.权利要求1到19中任一项所述的方法，其中多种不同的RNA使用多种不同的锁式探针检测。
21.权利要求1到20中任一项所述的方法，其中在单细胞中检测RNA。
22.权利要求1到21所述的方法，其中所述样品包括固定的组织切片、接触印迹样品、福尔马林固定石蜡包埋的组织切片或包括一种或更多种细胞的细胞学制备。
23.权利要求1到21中任一项所述的方法，其中所述样品包括新鲜冷冻的组织。
24.权利要求22所述的方法，其中所述样品是福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
25.权利要求1到24中任一项所述的方法，其中所述样品来源于身体的组织或器官，或来源于体液。
26.权利要求25所述的方法，其中所述样品是结肠、肺、胰腺、前列腺、皮肤、甲状腺、肝、卵巢、子宫内膜、肾、脑、睾丸、淋巴液、血液、血浆、膀胱或乳房样品。
27.权利要求1到26中任一项所述的方法，其中所述样品疑似包含癌症细胞中发现的RNA。
28.权利要求27所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、急性非淋巴细胞白血病、脊髓发育不良、膀胱癌、头颈癌或乳癌，或其任何早期发展阶段，或其任何表现。
29.权利要求1到28中任一项所述的方法，其中所述RNA是选自包括编码KRAS、HER2、cMyc、TERT、APC、Braf、PTEN、PI3K、EGFR和β-肌动蛋白的mRNA的组或由编码KRAS、HER2、cMyc、TERT、APC、Braf、PTEN、PI3K、EGFR和β-肌动蛋白的mRNA组成的组中的至少一种mRNA。
30.权利要求29所述的方法，其中所述RNA是编码KRAS的mRNA。
31.权利要求30所述的方法，其中所述锁式探针设置为与对应于选自12AGT、12CGT、12TGT、12GAT、12GCT、12GTT和13GAC的一种或更多种突变型KRAS mRNA序列，KRAS密码子61的突变体，KRAS密码子146的突变体和KRAS的3'未翻译区域的突变体的cDNA杂交。
32.权利要求31所述的方法，包括检测是否存在对应于一种或更多种所述突变型KRAS mRNA序列的滚环扩增产物。
33.权利要求30所述的方法，其中所述锁式探针设置为与对应于选自12GGT和13GGC的一种或更多种野生型KRAS mRNA序列，KRAS密码子61、KRAS密码子146和KRAS的3'未翻译区域的野生型序列的cDNA杂交。
34.权利要求33所述的方法，包括检测是否存在对应于一种或更多种所述野生型KRAS mRNA序列的滚环扩增产物。
35.权利要求30到34中任一项所述的方法,其中所述锁式探针设置为与对应于选自12AGT、12CGT、12TGT、12GAT、12GCT、12GTT和13GAC的一种或更多种突变体KRAS mRNA序列，KRAS密码子61的突变体，KRAS密码子146的突变体和KRAS的3'未翻译区域的突变体；以及对应于选自12GGT和13GGC的一种或更多种野生型KRAS mRNA序列，KRAS密码子61、KRAS密码子146和KRAS的3'未翻译区域的野生型序列的cDNA杂交。
36.权利要求35所述的方法，包括检测是否存在对应于一种或更多种所述突变型和野生型KRAS mRNA序列的滚环扩增产物。
37.权利要求29所述的方法，其中所述RNA是编码EGFR的mRNA。
38.权利要求37所述的方法，包括检测是否存在对应于一种或更多种变异EGFR mRNA序列的滚环扩增产物。
39.权利要求38所述的方法，其中一种或更多种所述变异EGFR mRNA序列包括插入突变和缺失突变。
40.权利要求29所述的方法，其中所述RNA是编码Braf、APC、PTEN或PI3K的mRNA。
41.权利要求40所述的方法，其中所述锁式探针设置为与对应于一种或更多种突变型Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的cDNA杂交。
42.权利要求41所述的方法，包括检测是否存在对应于一种或更多种突变型Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的滚环扩增产物。
43.权利要求40所述的方法，其中所述锁式探针设置为与对应于一种或更多种野生型Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的cDNA杂交。
44.权利要求43所述的方法，包括检测是否存在对应于一种或更多种野生型Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的滚环扩增产物。
45.根据权利要求40到44中任一项所述的方法，其中所述锁式探针设置为与对应于一种或更多种突变型Braf、PTEN和/或PI3K的mRNA序列和对应于一种或更多种野生型Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的cDNA杂交。
46.权利要求45所述的方法，包括检测是否存在对应于一种或更多种所述突变型和野生型Braf、APC、PTEN和/或PI3K的mRNA序列的滚环扩增产物。
47.权利要求29所述的方法，其中所述RNA是编码Braf和KRAS的mRNA，或编码KRAS和APC的mRNA，或编码KRAS和PTEN的mRNA，或编码KRAS和PI3K的mRNA。
48.权利要求47所述的方法，其中所述锁式探针设置为与对应于一种或更多种如权利要求31中所限定的突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型Braf mRNA序列；或者对应于一种或更多种如权利要求31中所限定的突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型APC mRNA序列；或者对应于一种或更多种如权利要求31中所限定的突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型PTEN mRNA序列；或者对应于一种或更多种如权利要求31中所限定的突变型KRAS mRNA序列，和对应于一种或更多种突变型PI3K mRNA序列的cDNA杂交。
49.权利要求48所述的方法，包括检测是否存在对应于所述突变型KRAS和Braf mRNA序列；或者对应于所述突变型KRAS和APC mRNA序列；或者对应于所述突变型KRAS和PTEN mRNA序列；或者对应于所述突变型KRAS和PI3K mRNA序列的滚环扩增产物。
50.权利要求47所述的方法，其中所述锁式探针设置为与对应于野生型KRAS和Braf mRNA序列；或者对应于野生型KRAS和APC mRNA序列；或者对应于野生型KRAS和PTEN mRNA序列；或者对应于野生型KRAS和PI3KmRNA序列的cDNA杂交。
51.权利要求50所述的方法，包括检测是否存在对应于所述野生型KRAS和Braf mRNA序列；或者对应于所述野生型KRAS和APC mRNA序列；或者对应于所述野生型KRAS和PTEN mRNA序列；或者对应于所述野生型KRAS和PI3K mRNA序列的滚环扩增产物。
52.根据权利要求47到51中任一项所述的方法，其中所述锁式探针设置为与（i）对应于一种或更多种如权利要求31中所限定的突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型Braf mRNA序列；或者对应于一种或更多种如权利要求31中所限定的突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型APC mRNA序列；或者对应于一种或更多种如权利要求31中所限定的突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型PTEN mRNA序列；或者对应于一种或更多种如权利要求31中所限定的突变型KRAS mRNA序列和对应于一种或更多种突变型PI3K mRNA序列的cDNA；以及（ii）对应于野生型KRAS和Braf mRNA序列；或者对应于野生型KRAS和APC mRNA序列；或者对应于野生型KRAS和PTEN mRNA序列；或者对应于野生型KRAS和PI3K mRNA序列的cDNA杂交。
53.权利要求52所述的方法，包括检测是否存在对应于一种或更多种所述突变型和野生型KRAS和Braf mRNA序列；或者对应于一种或更多种所述突变型和野生型KRAS和APC mRNA序列；或者对应于一种或更多种所述突变型和野生型KRAS和PTEN mRNA序列；或者对应于一种或更多种所述突变型和野生型KRAS和PI3K mRNA序列的滚环扩增产物的方法。
54.一种对KRAS基因的突变特异的锁式探针的集合，包括：
(a)Y1-X1-Z1-A
(b)Y1-X1-Z1-T
(c)Y1-X1-Z1-C
(d)Y2-X1-Z2-A
(e)Y2-X1-Z2-T
(f)Y2-X1-Z2-C，和
(g)Y3-X1-Z3-A；
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
Y2+Z2=20到40个核苷酸；
Y3+Z3=20到40个核苷酸；
Y1是GTGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:1)、GTGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:2)、GTGGCGTAGGCAA(SEQ ID NO:3)、GTGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:4)、GTGGCGTAGGC(SEQ ID NO:5)、GTGGCGTAGG(SEQ IDNO:6)、GTGGCGTAG、GTGGCGTA、GTGGCGT、GTGGCG、GTGGC、GTGG、GTG、GT、G；
Y2是TGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:9)、TGGCGTAGGCAA(SEQ ID NO:10)、TGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:11)、TGGCGTAGGC(SEQ IDNO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、TGGCGT、TGGCG、TGGC、TGG、TG、T；
Y3是TGGCGTAGGCAAGAGTGC(SEQ ID NO:13)、TGGCGTAGGCAAGAGTG(SEQ ID NO:14)、TGGCGTAGGCAAGAGT(SEQID NO:15)、TGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:9)、TGGCGTAGGCAA(SEQ ID NO:10)、TGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:11)、TGGCGTAGGC(SEQ IDNO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、TGGCGT、TGGCG、TGGC、TGG、TG、T；
Z1是TGGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:27)、GGTAGTTGGAGCT(SEQID NO:28)、GTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:29)、TAGTTGGAGCT(SEQ IDNO:30)、AGTTGGAGCT(SEQ ID NO:31)、GTTGGAGCT、TTGGAGCT、TGGAGCT、GGAGCT、GAGCT、AGCT、GCT、CT、T或键；
Z2是GGTAGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:16)、GTAGTTGGAGCTG(SEQID NO:17)、TAGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:18)、AGTTGGAGCTG(SEQ IDNO:19)、GTTGGAGCTG(SEQ ID NO:20)、TTGGAGCTG、TGGAGCTG、GGAGCTG、GAGCTG、AGCTG、GCTG、CTG、TG、G或键；和
Z3是AGTTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:21)、GTTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:22)、TTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:23)、TGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:24)、GGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:25)、GAGCTGGGTG(SEQ IDNO:26)、AGCTGGGTG、GCTGGGTG、CTGGGTG、TGGGTG、GGGTG、GGTG、GTG、TG、G或键。
55.权利要求54所述的集合，进一步包括：
(h)Y1-X2-Z1-G
(i)Y2-X2-Z2-G
(j)Y3-X2-Z3-G
其中X2是从10到50个核苷酸。
56.一种对Braf基因的突变特异的锁式探针的集合，包括：
(k)Y1-X1-Z1-A
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
Y1是GAAATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:102)、AAATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:103)、AATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:104)、ATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:105)、TCTCGATGGAG(SEQ ID NO:106)、CTCGATGGAG(SEQID NO:107)、TCGATGGAG、CGATGGAG、GATGGAG、ATGGAG、TGGAG、GGAG、GAG、AG、G；和
Z1是TGGTCTAGCTACAG(SEQ ID NO:108)、GGTCTAGCTACAG(SEQID NO:109)、GTCTAGCTACAG(SEQ ID NO:110)、TCTAGCTACAG(SEQ IDNO:111)、CTAGCTACAG(SEQ ID NO:112)、TAGCTACAG、AGCTACAG、GCTACAG、CTACAG、TACAG、ACAG、CAG、AG、G或键。
57.权利要求56所述的探针的集合，进一步包括：
(l)Y1-X2-Z1-T
其中X2是从10到50个核苷酸。
58.一种对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针的集合，包括：
(m)Y1-X1-Z1-W
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
其中，Y1包括5-20个3'对应APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变的核苷酸；
其中，Z1包括5-20个在5'对应APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变的核苷酸；和
其中，W是与APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变互补的核苷酸。
59.权利要求58所述的探针的集合，进一步包括：
(n)Y1-X2-Z1-V
其中X2是从10到50个核苷酸；和
其中，V是与在APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变位点与野生型序列互补的核苷酸。
60.权利要求55、57或59中任一项所述的探针的集合，其中X2与X1不同。
61.权利要求54到60中任一项所述的探针的集合，其中各探针具有至少40%的GC含量。
62.权利要求54到61中任一项所述的探针的集合，其中X是25到50。
63.权利要求54到62中任一项所述的探针的集合，其中X包含至少一个标记的核苷酸。
64.权利要求54到63中任一项所述的探针的集合，其中选自(a)-(g)、(k)和(m)的各探针具有相同的X1。
65.权利要求54到64中任一项所述的探针的集合，其中选自(h)-(j)、(l)和(n)的各探针具有相同的X2。
66.权利要求54到65中任一项所述的探针的集合,其中每一Y1+Z1、Y2+Z2和Y3+Z3是至少约25个核苷酸。
67.权利要求54到66中任一项所述的探针的集合，所述集合能够检测(i)KRAS基因、(ii)KRAS基因和Braf基因、(iii)KRAS基因和APC基因、(iv)KRAS基因和PTEN基因、或(v)KRAS基因和PI3K基因中的多个突变，其中所述多个突变构成至少40%的与癌症有关的KRAS突变。
68.权利要求54到66中任一项所述的探针的集合，其中(i)KRAS基因、(ii)KRAS基因和Braf基因、(iii)KRAS基因和APC基因、(iv)KRAS基因和PTEN基因、或(v)KRAS基因和PI3K基因中的突变的检测使得能够确定癌症或癌症的易患状态的存在。
69.权利要求68所述的探针的集合，其中在至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变的患者中确定癌症或癌症的易患状态的存在。
70.权利要求54到69中任一项所述的探针的集合在患者或患者组中用于确定是否存在KRAS突变体肿瘤或用于确定KRAS突变体肿瘤的易患状态的用途。
71.权利要求70所述的用途，允许在至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中确定癌症的存在。
72.权利要求67到69所述的探针的集合或权利要求70或71所述的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、急性非淋巴细胞白血病、脊髓发育不良、膀胱癌、头颈癌或乳癌，和其中所述癌症的易患状态是所述癌症之一的易患状态。
73.权利要求72所述的探针的集合或用途，允许确定
(i)在至少约25到60%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中结肠直肠癌的存在；
(ii)在至少约25到60%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中肺癌的存在；
(iii)在至少约80到90%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中胰腺癌的存在；
(iv)在至少约5到25%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中前列腺癌的存在；
(v)在至少约5到25%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中皮肤癌的存在；
(vi)在至少约5到60%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中甲状腺癌的存在；
(vii)在至少约10到25%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中肝癌的存在；
(viii)在至少约5到50%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中卵巢癌的存在；
(ix)在至少约10到40%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中子宫内膜癌的存在；
(x)在至少约5到50%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中肾癌的存在；
(xi)在至少约5到15%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中脑癌的存在；
(xii)在至少约10到45%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中睾丸癌的存在；
(xiii)在至少约5到15%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中急性非淋巴细胞白血病的存在；
(xiv)在至少约5%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中膀胱癌的存在；
(xv)在至少约5到10%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中头颈癌的存在；或
(xvi)在至少约5到10%的忍受与肿瘤发展相关的KRAS突变体的患者组中乳癌的存在。
74.一种用于载玻片表面上细胞样品中编码一种或更多种KRAS基因的突变的mRNA的定位的原位检测的方法，包括：
(a)由样品中的mRNA产生cDNA，其中引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分，或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团；
(b)添加核糖核酸酶到所述样品以消化与所述cDNA杂交的mRNA；
(c)使所述样品与一种或更多种对KRAS基因突变特异的锁式探针接触，其中每一锁式探针包括选自权利要求54到66任一项中所限定的锁式探针的集合的序列。
75.一种用于载玻片表面上细胞样品中编码一种或更多种KRAS基因突变的mRNA的定位的原位检测的方法，包括：
(a)由样品中的mRNA产生cDNA，其中引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分，或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团；
(b)添加核糖核酸酶到所述样品以消化与所述cDNA杂交的mRNA；
(c)使所述样品与一种或更多种对KRAS基因突变特异的锁式探针接触，其中每一锁式探针包括选自以下的序列：
(a)Y1-X1-Z1-A
(b)Y1-X1-Z1-T
(c)Y1-X1-Z1-C
(d)Y2-X1-Z2-A
(e)Y2-X1-Z2-T
(f)Y2-X1-Z2-C，和
(g)Y3-X1-Z3-A；
其中：
X1是从5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
Y2+Z2=20到40个核苷酸；
Y3+Z3=20到40个核苷酸；
Y1是GTGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:1)、GTGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:2)、GTGGCGTAGGCAA(SEQ ID NO:3)、GTGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:4)、GTGGCGTAGGC(SEQ ID NO:5)、GTGGCGTAGG(SEQ IDNO:6)、GTGGCGTAG、GTGGCGTA、GTGGCGT、GTGGCG、GTGGC、GTGG、GTG、GT、G；
Y2是TGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:9)、TGGCGTAGGCAA(SEQ ID NO:10)、TGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:11)、TGGCGTAGGC(SEQ IDNO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、TGGCGT、TGGCG、TGGC、TGG、TG、T；
Y3是TGGCGTAGGCAAGAGTGC(SEQ ID NO:13)、TGGCGTAGGCAAGAGTG(SEQ ID NO:14)、TGGCGTAGGCAAGAGT(SEQID NO:15)、TGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA(SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG(SEQ ID NO:9)、TGGCGTAGGCAA(SEQ ID NO:10)、TGGCGTAGGCA(SEQ ID NO:11)、TGGCGTAGGC(SEQ IDNO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、TGGCGT、TGGCG、TGGC、TGG、TG、T；
Z1是TGGTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:27)、GGTAGTTGGAGCT(SEQID NO:28)、GTAGTTGGAGCT(SEQ ID NO:29)、TAGTTGGAGCT(SEQ IDNO:30)、AGTTGGAGCT(SEQ ID NO:31)、GTTGGAGCT、TTGGAGCT、TGGAGCT、GGAGCT、GAGCT、AGCT、GCT、CT、T或键；
Z2是GGTAGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:16)、GTAGTTGGAGCTG(SEQID NO:17)、TAGTTGGAGCTG(SEQ ID NO:18)、AGTTGGAGCTG(SEQ IDNO:19)、GTTGGAGCTG(SEQ ID NO:20)、TTGGAGCTG、TGGAGCTG、GGAGCTG、GAGCTG、AGCTG、GCTG、CTG、TG、G或键；和
Z3是AGTTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:21)、GTTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:22)、TTGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:23)、TGGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:24)、GGAGCTGGGTG(SEQ ID NO:25)、GAGCTGGGTG(SEQ IDNO:26)、AGCTGGGTG、GCTGGGTG、CTGGGTG、TGGGTG、GGGTG、GGTG、GTG、TG、G或键；
(d)直接或间接地连接所述锁式探针的末端；
(e)使用具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶使所述环化锁式探针进行滚环扩增（RCA），其中如果需要所述核酸外切酶活性消化cDNA以产生作为用于所述RCA的引物的游离3'端；和
(f)检测滚环扩增产物。
76.权利要求75所述的方法，其中步骤(c)进一步包括使所述样品与锁式探针(h)、(i)和(j)接触，其中各锁式探针(h)、(i)和(j)对野生型KRAS基因特异并具有以下序列：
(h)Y1-X2-Z1-G
(i)Y2-X2-Z2-G，和
(j)Y3-X2-Z3-G
其中X2是从10到50个核苷酸。
77.一种用于载玻片表面上细胞样品中编码一种或更多种Braf基因突变的mRNA的定位的原位检测的方法，包括：
(a)由样品中的mRNA产生cDNA，其中引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分，或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团；
(b)添加核糖核酸酶到所述样品以消化与所述cDNA杂交的mRNA；
(c)使所述样品与一种或更多种对Braf基因突变特异的锁式探针接触，其中每一锁式探针包括选自以下的序列：
(k)Y1-X1-Z1-A
其中：
X1是5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
Y1是GAAATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:102)、AAATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:103)、AATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:104)、ATCTCGATGGAG(SEQ ID NO:105)、TCTCGATGGAG(SEQ ID NO:106)、CTCGATGGAG(SEQID NO:107)、TCGATGGAG、CGATGGAG、GATGGAG、ATGGAG、TGGAG、GGAG、GAG、AG、G；和
Z1是TGGTCTAGCTACAG(SEQ ID NO:108)、GGTCTAGCTACAG(SEQID NO:109)、GTCTAGCTACAG(SEQ ID NO:110)、TCTAGCTACAG(SEQ IDNO:111)、CTAGCTACAG(SEQ ID NO:112)、TAGCTACAG、AGCTACAG、GCTACAG、CTACAG、TACAG、ACAG、CAG、AG、G或键，
(d)直接或间接地连接所述锁式探针的末端；
(e)使用具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶使所述环化锁式探针进行滚环扩增（RCA），其中如果需要所述核酸外切酶活性消化cDNA以产生作为用于所述RCA的引物的游离3'端；和
(f)检测滚环扩增产物。
78.权利要求77所述的方法，其中步骤(c)进一步包括使所述样品与锁式探针(l)接触，其中各锁式探针(l)对野生型Braf基因特异并具有以下序列：
(l)Y1-X2-Z1-T，
其中X2是从10到50个核苷酸。
79.一种用于载玻片表面上细胞样品中编码一种或更多种APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR的突变的mRNA的定位的原位检测的方法，包括：
(a)由样品中的mRNA产生cDNA，其中引物具有能够与细胞或细胞组分结合或反应的功能部分，或者能够与细胞或细胞组分结合的亲和性结合基团；
(b)添加核糖核酸酶到所述样品以消化与所述cDNA杂交的mRNA；
(c)使所述样品与一种或更多种对APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR的突变特异的锁式探针接触，其中每一锁式探针包括选自以下的序列：
(m)Y1-X1-Z1-W，
其中：
X1是5到50个核苷酸；
Y1+Z1=20到40个核苷酸；
其中，Y1包括5-20个3'对应APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变的核苷酸；
其中，Z1包括5-20个在5'对应APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变的核苷酸；和
其中，W是与APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变互补的核苷酸。
80.权利要求79所述的方法，其中步骤(c)进一步包括将所述样品与锁式探针(n)接触，其中各锁式探针(n)对野生型APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR特异并具有以下序列：
(n)Y1-X2-Z1-V，
其中X2是从10到50个核苷酸；和
其中，V是与在APC基因、PTEN基因、PI3K基因、KRAS基因密码子61或密码子146、或者KRAS基因3'UTR中的点突变位点与野生型序列互补的核苷酸。
81.权利要求76、78或80中任一项所述的方法，其中X2与X1不同。
82.权利要求74到81中任一项所述的方法，其中所述引物包含2'O-甲基RNA、甲基磷酸酯或2'氟化RNA碱基、肽核酸残基、或锁核酸残基。
83.权利要求74到82中任一项所述的方法，其中所述引物包括一个或更多个锁核酸残基。
84.权利要求83所述的方法，其中所述引物包含由引物序列中1个或更多个天然的或合成的核苷酸分隔开的2个或更多个锁核酸。
85.权利要求74到84中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸酶是核糖核酸酶H。
86.权利要求74到85中任一项所述的方法，其中X1和X2各自包含至少一个标记的核苷酸。
87.权利要求74到86中任一项所述的方法，其中选自(a)-(g)、(k)和(m)的各探针具有相同的X1。
88.权利要求74到87中任一项所述的方法，其中选自(h)-(j)、(l)和(n)的各探针具有相同的X2。
89.权利要求74到88中任一项所述的方法，其中所述标记的核苷酸包括荧光团或生色团。
90.权利要求74到89中任一项所述的方法，其中所述样品包括固定的组织切片、接触印迹样品、福尔马林固定石蜡包埋的组织切片或包括一种或更多种细胞的细胞学制备。
91.权利要求74到89中任一项所述的方法，其中所述样品包括新鲜冷冻的组织。
92.一种试剂盒，包括(i)如权利要求54到66任一项中所限定的锁式探针的集合以及以下中的一种或更多种：
(ii)包括一个或更多个锁核酸并能够与所述目标RNA杂交的逆转录酶引物；
(iii)逆转录酶；
(iv)核糖核酸酶；
(v)连接酶；
(vi)具有3'核酸外切酶活性的聚合酶；
(vii)能够与所述锁式探针的互补物杂交的检测探针；
(ix)核苷酸。
93.一种用于在生物样品的细胞中确定基因序列存在和定位的方法，包括：
（a）使具有所述基因序列的DNA互补物与RNA杂交；
（b）消化与所述DNA互补物杂交的RNA；
（c）使第一锁式探针与至少部分的DNA互补物杂交，其中所述锁式探针包括在与DNA互补物的不同但直接相邻的区域互补的两个末端之一上的基因序列；
（d）连接所述锁式探针的两个末端；
（e）复制环化的探针以生成包含所复制探针的多拷贝的核酸分子；和
（f）使用与所述核酸分子杂交的探针检测细胞中是否存在所述基因序列。
94.权利要求93所述的方法，进一步包括产生所述DNA互补物。
95.权利要求94所述的方法，其中所述DNA互补物通过包括引物和逆转录酶的方法产生。
96.权利要求93到95中任一项所述的方法，其中所述引物是抗核糖核酸酶的。
97.权利要求93到96中任一项所述的方法，其中所述引物固定在细胞中。
98.权利要求93到97中任一项所述的方法，其中所述环化的探针使用具有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶进行复制。
99.权利要求98所述的方法，其中所述环化的探针在一定条件下培养以在所述DNA互补物上产生作为用于所述环化的探针的复制引物的游离3'端。
100.权利要求93到99中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是phi29。
101.权利要求93到100中任一项所述的方法，进一步包括添加与第二基因序列互补的第二锁式探针。
102.权利要求93到101中任一项所述的方法，其中所述基因序列是点突变。
103.权利要求93到102中任一项所述的方法，其中所述基因序列是野生型序列。
104.一种用于鉴定组织样品中具有特定核酸序列的细胞的方法，包括：
（a）利用包含所述特定核酸序列的DNA互补物培养所述细胞以产生RNA-DNA杂交体；
（b）在一定条件下利用核糖核酸酶培养RNA目标分子以消化至少部分所述RNA-DNA杂交体；
（c）在一定条件下利用锁式探针培养所述DNA互补物以将所述锁式探针与包括所述特定核酸序列的所述DNA互补物杂交，其中所述锁式探针包括与所述DNA互补物的不同但直接相邻的区域互补的两个末端；
（d）在一定条件下利用连接酶培养所述DNA互补物和锁式探针以连接所述锁式探针的末端；
（e）在一定条件下利用聚合酶和核苷酸培养连接的锁式探针以引发所述锁式探针利用所述DNA互补物的复制并产生具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸，和
（f）利用一种或更多种互补的寡聚核苷酸培养所述具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸以检测是否存在所述特定的序列。
105.一种用于鉴定细胞样品中具有特定核酸序列的细胞的方法，包括：
（a）在一定条件下利用固定到所述样品的抗核糖核酸酶的引物和逆转录酶培养所述细胞样品以产生RNA的DNA互补物，其中所述DNA互补物包括所述特定的核酸序列；
（b）在一定条件下利用核糖核酸酶培养所述细胞样品以消化至少部分所述RNA；
（c）在一定条件下利用锁式探针培养所述DNA互补物以将所述锁式探针与包括所述特定核酸序列的所述DNA互补物杂交，其中所述锁式探针包括与所述DNA互补物的不同但直接相邻的区域互补的两个末端；
（d）在一定条件下利用连接酶培养所述DNA互补物和锁式探针以连接所述锁式探针的末端；
（e）在一定条件下利用聚合酶和核苷酸培养连接的锁式探针以引发所述锁式探针利用所述DNA互补物的复制并产生具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸，和
（f）利用一种或更多种核酸探针培养所述具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸以检测是否存在所述特定的序列。
106.一种用于载玻片上生物样品的细胞中核酸序列的原位定位的方法，包括：
（a）在一定条件下利用逆转录酶和抗核糖核酸酶引物培养在固体支撑上的固定生物样品以产生含有核酸序列并与细胞中互补的RNA分子杂交以形成RNA-DNA杂交体的核酸分子；
（b）添加核糖核酸酶并在一定条件下培养所述核糖核酸酶以消化所述RNA-DNA杂交体中的RNA；
（c）在一定条件下培养消化的RNA-DNA杂交体以使互补的锁式探针与所消化的RNA-DNA杂交体的DNA部分杂交，其中所述锁式探针包括所述核酸序列并具有与所述DNA的不同但直接相邻的区域互补的两个末端；
（d）在一定条件下利用连接酶培养与所述RNA-DNA杂交体的DNA部分杂交的所述锁式探针以连接所述锁式探针的末端；
（e）在一定条件下利用聚合酶和核苷酸培养连接的锁式探针以从用于复制所述锁式探针的DNA制备引物和产生具有所复制锁式探针的多拷贝的核酸；和
（f）利用一种或更多种互补的核酸探针培养所述核酸以检测是否存在所述特定的序列。
107.权利要求104到106中任一项所述的方法，其中所述样品是福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
108.权利要求1到53中任一项所述的方法，其中在步骤（c）中，所述锁式探针的末端区域与所述cDNA的非邻接区域杂交，使得所述末端区域之间存在间隙。
109.权利要求108所述的方法，其中所述间隙是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸的间隙，或11到60个核苷酸的间隙，优选3到40个核苷酸的间隙。
110.权利要求108或109所述的方法，其中所述末端区域之间的间隙由间隙寡聚核苷酸或通过延伸所述锁式探针的3'端填充。
111.权利要求28到53中任一项所述的方法，或权利要求73或74所述的探针的集合或用途，其中所述结肠直肠癌是转移性结肠直肠癌、腺癌、平滑肌肉瘤、结肠直肠淋巴瘤、黑素瘤或神经内分泌肿瘤。
112.权利要求28到53中任一项所述的方法，或权利要求72或73所述的探针的集合或用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌（NSCLC）、小细胞肺癌（SCLC）。
113.权利要求1到53、74到91或93到106中任一项所述的方法，其中所述样品可以包括组织切片，附带条件是所述组织切片不是或不包含新鲜冷冻组织的制备物。
114.权利要求1到53、74到91或93到106中任一项所述的方法，其中所述样品可以包括组织切片，附带条件是所述组织切片不是或不包含在正电荷防脱载玻片上的接种的制备物。
115.权利要求1到53中任一项所述的方法，其中在步骤（c）中所述锁式探针的末端区域与所述cDNA上直接相邻的区域杂交。
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