CN1036639A - 荧光测监型电泳装置 - Google Patents

Abstract

一种用于分离和检测以荧光示踪的DNA或 RNA样品(32)的电泳装置中，采用了具有聚丙烯酰 胺浓度为2％至6％的凝胶板(4)，以便大大地缩短 测定所需的时间。

Description

本发明涉及一种测定脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）碱基顺序（base    sequences）的装置，更具体地说，涉及一种适合于缩短测量时间的荧光检测型电泳装置。

至今，测量DNA碱基顺序的方法是通过以放射性元素来将DNA碎片示踪，用放射自显影法将图形转移到照片上（此图形取决于按其长度（length）受到电泳凝胶的分离）再读出DNA带图形（band    pattern），但此方法烦琐并花费时间。所以，一种用实时分离和检测DNA碎片来确定碱基顺序的方法得到了发展，此方法是用荧光示踪而不是用放射性示踪的。用荧光示踪的实时检测方法以及用于此方法的荧光检测型电泳装置已经披露在一些杂志中;例如，1986年的“生物化学和生物物理方法”杂志（Journal    of    Biochemical    and    Biophysical    Methods    13，1986，pp.315-323）;1986年的“自然”杂志（Nature，vol    321，1986，pp.674-679）以及1987年“科学”杂志（Science，Vol，238，1987，pp.336-341）。

然而，根据上述的先有技术，从DNA碎片开始迁移到完成测量所需的时间长达5至10小时。

本发明的目的是提供一种荧光检测型电泳装置。这种装置能克服包括上述先有技术在测定DNA或RNA碱基顺序中的种种困难，在短的一段时间内进行测量。

本发明的上述目的是通过在电泳凝胶迁移的过程中优化各种条件来实现的。具体地说，本发明的目的是通过选择用于电泳分离器件的凝胶的聚丙烯酰胺浓度为2%至6%来实现的（聚丙烯酰胺的浓度在下文中以总的单体浓度的重量/体积（克/毫升）的百分比来表示）。

也就是说，为了测定该样品的碱基顺序，本发明的荧光检测型电泳装置包括一个用于电泳分离荧光示踪样品的电泳分离装置，一个用以激发该样品的激发光源，以及为了检测被激发样品发出的荧光的检测装置。其中，用一种聚丙烯酰胺浓度为2%至6%的凝胶板作为电泳分离装置。

在此电泳分离装置中，DNA或RNA碎片可以受到电泳，以完成根据碎片长度（length）的电泳分离。而且这种装置包括至少一层夹在两块透明平板（石英平板等等）之间的电泳凝胶，以及在迁移方向上加上电场的装置。

根据本发明的发明者的研究，一般的荧光检测型电泳装置的迁移时间要长达5到10小时的理由是尚未弄清楚电泳凝胶迁移现象的细节，因为荧光检测的位置分辨率比用视力观察放射自显影图读出DNA带（band）时的分辨率差，所以实时检测方法需要很长的迁移通道，而且除此事实外，测定是采用像一般在放射自显影法中所用的高到约8%的丙烯酰胺的浓度来进行。本发明是根据发明者的上述发现来实现的。

这里，如果有一碱基长度（base    length）为N的DNA碎片以υ（N）的速度迁移，迁移一个长度为l的迁移通道所需的时间t为：

t＝l/v（N）    ……（1）

迁移速度υ（N）随电场强度正比变化，而比例系数υ₀（N，C，T）是DNA碎片中碱基数目或碱基长度N、聚丙烯酰胺浓度C和温度T的函数，所以，方程（1）可再写为，

t＝l/E·vo（N，C，T）    ……（2）

时间t随着引起焦尔热产生的电场强度的增加而缩短。因此，凝胶板温度增加会使分离DNA带变得困难。如果在场强和温度不会妨碍测量的条件下鉴别DNA带，而且如果选择凝胶的浓度和迁移通道的长度l以使时间t被减至最小，则测量是可以在短的时间周期内进行的。

本发明除了电泳分离装置中凝胶板的聚丙烯酰胺浓度为2%至6%外，采用的是一般的荧光检测型电泳装置的技术。

图1是根据本发明的一个实施例说明一种荧光检测型电泳装置的透视图;

图2是说明DNA碎片的碱基长度与具有各种聚丙烯酰胺浓度的凝胶板中的迁移时间之间关系的简图;

图3是聚丙烯酰胺浓度与凝胶板中各种碱基长度的DNA碎片的带隙之间的关系图;

图4是聚丙烯酰胺浓度与在凝胶板中各种碱基长度的DNA碎片的迁移时间之间的关系图;以及

图5是说明当采用具有3%的聚丙烯酰胺浓度和22厘米（cm）的迁移通道长度的凝胶板时的DNA碎片谱图。

现将本发明的一个实施例结合图1至5进行说明。

图1根据本发明图示出一种荧光检测型电泳装置。从激光源31发射出为激发用的激光束1，通过透镜2从侧面进入电泳凝胶板4。电泳凝胶板4是被石英板3夹持着的。样品32，例如荧光示踪的DNA，从凝胶板4的上端开始，向凝胶板4的下端进行迁移，同时受到电泳的分离作用。激光束1落到离开始迁移点一个预定距离处，从荧光示踪的DNA发出的荧光通过此处并被装有滤光器5的透镜6所收集，再经像放大器7放大和通过中继透镜8后被光导摄像管摄像机（Vidicon    camera）9（商标为RCA）所检测。获得的信号由计算机10处理后输出。激光束在扫过一段预先确定的通道时可以从前面射入，而不是落在侧面上。如同在方程式（2）中将会了解的那样，迁移时间是随开始迁移点至被激光束所辐射的部分的距离l、聚丙烯酰胺的浓度C以及在凝胶板上端和下端之间所加的电压V（或在凝胶板中的电场强度E）而变化的。

凝胶板的聚丙烯酰胺浓度从它激光束照射时的背景荧光量或从DNA碎片的迁移时间可容易地了解到。

当凝胶板维持在温度48℃和电场强度50伏/厘米时，一个100碱基长度的DNA碎片迁移22厘米的通道，在凝胶的聚丙烯酰胺浓度为6%时需要大约85分钟的时间;而当凝胶具有更高的浓度时，需要的时间更长。图4示出凝胶中聚丙烯酰胺浓度与迁移时间之间的关系（图4将在以后详细说明）。从迁移时间可了解到凝胶的聚丙烯酰胺浓度。

当凝胶板被激光束照射时背景荧光随聚丙烯酰胺浓度正比增加。所以制备具有6%聚丙烯酰胺浓度的凝胶来测量背景荧光的量，然后，测量一种新制备的凝胶的背景荧光的量，并与6%浓度的结果进行比较，这样新制备凝胶的聚丙烯酰胺浓度就可以知道了。

在图1中，参考数号30表示一个电泳分离装置（但是，这里用来加电场的装置是大家所熟知的一种，没有在图中示出），而参考数号33表示检测荧光的装置。

图2示出具有各种聚丙烯酰胺浓度的凝胶中DNA碎片的碱基长度（用碱基数N来表示）和迁移时间t之间的关系。在图2中，曲线11、12、13、14、15和16代表具有2%，3%，4%，5%，6%和8%聚丙烯酰胺浓度的凝胶的场合。根据DNA碎片的迁移速度正比于电场强度E的事实，以及图2曲线的轮廓，迁移时间t能表达成：

t＝ (l)/(E) （f（C，T）N+g（T）） ……（3）

式中f（C，T）是聚丙烯酰胺浓度C和温度T的函数，g（T）是温度T的函数，而l代表迁移通道的长度。

当碱基长度趋于零时，在方程（3）中，不论浓度C为多大，迁移时间t₀等于l·g（T）/E₀。

从方程（1）和（3），DNA碎片的迁移速度υ（N）可表达成：

V（N）＝ (E)/(f（C，T）N+g（T）) ……（4）

在迁移过时间t后，相邻带之间的间隙由下式给出：

d＝（V（N）-V（N+1））t

＝l/（N+g（T）/f（C6T））    ……（5）

从此方程可明白：当碱基长度N大时，带隙d趋于l/N，而不是主要取决于凝胶中聚丙烯酰胺的浓度C。

图3示出实际测出的在不同碱基长度下的带隙与浓度的关系曲线，迁移距离为22厘米。在图3中，曲线17，18，19和20表示DNA碎片的碱基长度（以碱基数N来表示）为100，200，300和400场合下的曲线。当碱基长度短至大约100时，带隙d随凝胶的浓度C的增加而增加。但是，当碱基长为300或400时，如果凝胶的浓度C大于4%，带隙几乎是不变的。另一方面，通过实验已得到肯定，DNA带宽ω的变化大致正比于 $\sqrt{1}$ ，而几乎不取决于凝胶的浓度。因此，DNA带宽ω由下式给出，

${\mathrm{\omega \; =\omega }}_O\mathrm{(N,T)}\sqrt{l}\mathrm{\dots \dots (6)}$

式中，比例常数ω₀（N，T）是碱基数N和温度T的函数。

图4是各种碱基长度的迁移时间与凝胶中聚丙烯酰胺浓度的关系曲线图，其中曲线17，18，19和20代表DNA碎片的碱基长度（以碱基数N来表示）为100，200，300和400时的曲线。从图4可以认识到，迁移时间几乎随浓度C的平方幂而增加。当温度保持恒定时，迁移时间t是迁移通道长度l和凝胶浓度C的函数。为了区分两相邻带，至少d≧ω的关系必须成立。因此，使迁移时间t为最小时的凝胶浓度是在d＝ω和让迁移时间t仅为凝胶浓度的函数时找到。

由d＝ω和方程式（6），长度l，即，

l＝ωo²（N，T）（N+g（T）/f（C，T））³……（7）

可得到并将它代入方程式（3）得到下列方程式：

$\mathrm{t=}\frac{{\omega }_O{}^2{\mathrm{(N,T)(f(C,T)N+g(T))}}^3}{{\mathrm{Ef}}^2\mathrm{(C,T)}}\mathrm{\dots \dots (8)}$

由方程式（8），作为αt/αc＝0的解得到的C值代表凝胶的浓度，即，使迁移时间t最小的C值代表要找到的凝胶的浓度。

从下列方程式，

$\frac{\mathrm{dt}}{\mathrm{dc}}=\frac{{\omega }_O{}^2\mathrm{(N,T)}}{E}·\frac{{\mathrm{3(f(C,T)N+g(T))}}^2{\mathrm{f(C,T)N-2(f(C,T)N+g(T))}}^3}{{\mathrm{f(C,T)}}^4}\mathrm{xf\; (C,T)\; ·}\frac{\mathrm{df(C,T)}}{\mathrm{dc}}\mathrm{=\; 0\; \dots (9)}$

那里可得到f（C，T）N＝2g（T）。

也就是说，在图4中，

（t-t₀）＝ (l)/(E) f（C，T）N＝ (l)/(E) ·2g（T）＝2t₀

成立时的凝胶浓度C才使迁移时间t为最小;当碱基长度为100，200，300和400时，凝胶的浓度为6.2%，4.3%，3.2%和2.6%。在实际的分析中，许多情况是碱基长度处于200至300。在此情况下，凝胶的浓度C应是从3.2%至4.3%。在图4的情况中，迁移时间t₀是28分钟。因此，在t-t₀＝2t₀的条件成立时的时间t是1小时24分钟。

把f（C，T）＝2g（T）代入方程（7），发现对于分离所必需的凝胶迁移长度l为：

l＝ 9/4 N²w₀ ²（C，T） ……（10）

根据方程式（6），当迁移通道长度为l₀时，利用由测得的带隙ω_obs而来的ω_obs/ $\sqrt{1}$ ，可找到ω₀（C，T）。

表1示出当凝胶板厚度为0.3毫米、电场强度为50伏/厘米时，不同碱基长度条件下的聚丙烯酰胺浓度C（使迁移时间减至区分相邻两带所需的最小值）、迁移通道长度l和迁移时间t。

表1

碱基长度N	聚丙烯酰胺浓度C	迁移通道长度1	迁移时间t
				100200300400	6.2%4.3%3.2%2.6%	6厘米15厘米28厘米41厘米	22分钟56分钟106分钟156分钟

上面表中所列出的数值只是大致的说明它们的变化范围，这取决于迁移电压、迁移凝胶的温度和凝胶的厚度。但是，为了实现高速迁移，可以看出聚丙烯酰胺浓度应是2%至6%，这比常用技术中所采用的浓度低得多。

可以进一步看出，当碱基长度是100至200，200至300，以及300至400时，凝胶浓度最好应为4.3%至6.2%，3.2%至4.3%以及2.6%至3.2%。

在以上所述的条件下，在约1.5小时内可测量高达300个碱基（bases）。

根据表1中所示相应于碱基长度的迁移条件，不用说具有更短碱基长度的DNA碎片也是可以测出来的。

图5示出采用具有3%聚丙烯酰胺浓度的凝胶和22厘米的迁移通道的测量结果。因为迁移通道的长度比28厘米短，所以分离是不充分的。但是，可以认为能鉴别高到约300个碱基。碱基长300的DNA碎片的迁移时间是77分钟。

在图5中，谱56是从一个DNA碎片组得到的，组中端部的核酸基是乌嘌呤;谱57是从一组DNA得到的，组中端部的核酸基是胸腺嘧啶。

在这实施例中，按现有技术中相同的方法制备了具有各种聚丙烯酰胺浓度的凝胶。下面描述一种制备具有6%聚丙烯酰胺浓度的凝胶的工艺。加水于一混合物中，该混合物是由1.14克的丙烯酰胺单体、0.06克的N，N′-亚甲双丙烯酰胺（丙烯酰胺单体的总量为1.2克）、0.16克的三羟基氨甲烷，0.08克硼酸，0.014克乙二胺四醋酸二钠盐和6.3克尿素组成;这样的混合物的总量为20毫升（即丙烯酰胺单体和N，N′-亚甲双丙烯酰胺的总量在1毫升中为0.06克）。这是0.06克/毫升的聚丙烯酰胺浓度，它以6%来表示。然后，加15%浓度的过硫酸铵64微升和N，N，N′，N-四甲基乙烯二胺10.7微升;将此混合物置于室温下，因而产生聚合作用形成具有6%浓度的凝胶。

根据如上述实施例所表明的本发明，以前测量DNA碎片时所需的时间为5至10小时，而现在测量所需时间仅比1小时稍多一点。这样，荧光检测型电泳装置所需的测量时间明显地减少。此外，在荧光测量系统中，凝胶散射产生的光以及来自杂质或凝胶的背景荧光给检测定出了下限。而用低浓度的凝胶，背景荧光也减少了，所以可以实现高灵敏度的检测。

虽然，上述实施例所处理的是DNA的情况，但实质上对RNA的情况也可得到同样的结果。

Claims (5)

1、一种用于测定样品碱基顺序的荧光检测型电泳装置，所述荧光检测型电泳装置包括一个以电泳分离荧光示踪所述样品(32)的电泳分离装置(30)，一个用于激发所述样品的激发光源(31)以及用于检测受激的所述样品发出的荧光的检测装置(33)；其特征在于：采用了具有2%至6%聚丙烯酰胺浓度的凝胶板(4)作为所述电泳分离装置。

2、一种根据权利要求1的荧光检测型电泳装置，其中所述样品（32）是DNA或RNA。

3、一种根据权利要求2的荧光检测型电泳装置，其中所述聚丙烯酰胺浓度为4.3%至6.2%。

4、一种根据权利要求2的荧光检测型电泳装置，其中所述聚丙烯酰胺浓度为3.2%至4.3%。

5、一种根据权利要求2的荧光检测型电泳装置，其中所述聚丙烯酰胺浓度为2.6%至3.2%。

Images